JP2022107068A - Observation system and observation method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、観察システムおよび観察方法に関する。 The present invention relates to an observation system and an observation method.
イオンコンダクタンス顕微鏡は、非接触で高精度に形状の情報を取得でき、特に生物試料などに対する非侵襲の測定手段として知られている。特許文献1には、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法であって、スペクトル拡散変調信号を用いてイオン電流を前記電解液内に誘導するために、マイクロピペット内で前記電解液に浸された第1電極と、前記マイクロピペット外の第2電極との間の電位を制御し、前記試料を支持するステージに対して前記マイクロピペットが動くように制御している間の前記イオン電流を記録し、前記記録されたイオン電流を復調し、復調されたイオン電流及び較正データから、前記試料の表面高さプロファイルを決定する方法が開示されている。 The ion conductance microscope can acquire shape information with high accuracy without contact, and is known as a non-invasive measuring means for biological samples and the like. Patent Document 1 is a method of examining the surface of a sample immersed in an electrolytic solution by using a scanning ion conductance microscopy, in order to induce an ion current in the electrolytic solution by using a spectral diffusion modulation signal. In addition, the electric potential between the first electrode immersed in the electrolytic solution in the micropipette and the second electrode outside the micropipette is controlled so that the micropipette moves with respect to the stage supporting the sample. Disclosed is a method of recording the ion current during control, demodating the recorded ion current, and determining the surface height profile of the sample from the demodulated ion current and calibration data. ..
特許文献1に記載されている発明では、物質の同定ができない。 In the invention described in Patent Document 1, the substance cannot be identified.
本発明の第1の態様による観察システムは、金属を付加したピペットと、前記ピペットと試料との間隔に応じて増減するイオン電流を測定する演算装置と、励起光を照射する光源と、前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器と、を備える。
本発明の第2の態様による観察方法は、金属を付加したピペット、励起光を照射する励起光照射部、前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器を備える観察システムを用いて実行される観察方法であって、前記ピペットを用いて細胞の細胞質を吸い上げることと、前記ピペットの先端に前記励起光を照射し、前記検出器を用いてラマン分光を検出することと、を含む。
The observation system according to the first aspect of the present invention includes a metal-added pipette, an arithmetic device for measuring an ion current that increases or decreases according to the distance between the pipette and a sample, a light source for irradiating excitation light, and the excitation. It is provided with a detector which is Raman spectroscopy obtained by irradiating the sample with light and detects Raman spectroscopy locally enhanced by the metal.
The observation method according to the second aspect of the present invention is a pipette to which a metal is added, an excitation light irradiation unit that irradiates excitation light, and Raman spectroscopy obtained by irradiating the sample with the excitation light, which is locally enhanced by the metal. An observation method performed using an observation system including a detector for detecting the Raman spectroscopy, wherein the pipette is used to suck up the cytoplasm of cells, and the tip of the pipette is irradiated with the excitation light. Includes detecting Raman spectroscopy with the detector.
本発明によれば、測定対象の形状情報を取得するだけでなく物質を同定できる。 According to the present invention, it is possible to identify a substance as well as acquire shape information of a measurement target.
―第1の実施の形態―
以下、図1~図7を参照して、本発明に係る観察システムの第1の実施の形態を説明する。
-First Embodiment-
Hereinafter, the first embodiment of the observation system according to the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 7.
(構成)
図1は観察システムS1の構成図である。観察システムS1は、ピペット11と、第1電極12と、IV変換回路13と、第2電極14と、定電圧源15と、XYスキャナ21と、Zスキャナ22と、HVアンプ23と、PC24と、コントローラ26と共焦点測定部51とラマン測定部52とを備える。XYスキャナ21の上には、透明な容器Lが配される。容器Lには、生理食塩水などの電解質Qに浸された細胞900が配置される。
(Constitution)
FIG. 1 is a block diagram of the observation system S1. The observation system S1 includes a
ピペット11はガラス製の中空ピペットである。ピペット11の内部は、溶液Qで満たされ、ピペット11の内部には第1電極12が挿入される。ピペット11はスキャナ22に固定され、Zスキャナ22により図示上下方向に移動される。
The
図2はピペット11の先端を示す概念図である。ピペット11の先端部は直径が数ナノm~数100nm程度、たとえば100nmであり、架橋剤111によりダイヤモンド粒子112が固定される。架橋剤111は様々なものが使用できるが、たとえば図3に示す手法でダイヤモンド粒子112をピペット11に固定できる。このダイヤモンド粒子は、格子欠陥の一種であるダイヤモンド窒素-空孔中心(Diamond Nitrogen Vacancy Center)を含む。ダイヤモンド窒素-空孔中心は、窒素-空孔中心やNVセンターとも呼ばれる。本明細書では、ダイヤモンド窒素-空孔中心を「ダイヤモンドNV」と呼ぶ。
FIG. 2 is a conceptual diagram showing the tip of the
ピペット11の先端部分には、金属コーティング112Aが付されている。金属コーティング112Aは、ピペット11の先端だけでなくピペット11の側面であって先端に近い領域にも付されてもよい。金属コーティング112Aはピペット11の先端部の一部の領域には付されていなくてもよい。この金属コーティング112Aはたとえば、金、銀、およびプラチナなどである。この金属コーティング112Aは任意の方法でピペット11に塗布できる。
A
図3はダイヤモンド粒子112をピペット11に固定する手法の一例を示す図である。ただし図3に示す例では、ダイヤモンド粒子112とピペット11との間に金属コーティング112Aが存在しない場合を示している。図3に示すように、ダイヤモンドにカルボジイミド架橋剤113を結合させ、ピペット11の先端にアミノシランカップリング剤114を結合させる。そしてカルボジイミド架橋剤113とアミノシランカップリング剤114とを結合させることで、ピペット11にダイヤモンド粒子112を固定する。図1に戻って説明を続ける。
FIG. 3 is a diagram showing an example of a method of fixing the
ダイヤモンド粒子112とピペット11との間に金属コーティング112Aが存在する場合は、上述した手法を次のように変更すればよい。すなわち、アミノシランカップリング剤114の代わりに、アミノ末端アルカンチオールを用いればよい。その他の点は、ダイヤモンド粒子112とピペット11との間に金属コーティング112Aが存在しない場合と同様である。図4は、6-アミノ、1-ヘキサンチオールを用いる場合を示す例であり、図4における金属コーティング112Aは金である。
When the
第1電極12は、ピペット11に挿入され、ピペット11の内部に満たされた溶液Qに浸されている。IV変換回路13は、第1電極12と第2電極14の間に流れる微弱な電流、すなわちイオン電流を電圧に変換してコントローラ26に出力する。第2電極14は、XYスキャナ21の上に設置された容器Lに満たされた溶液Qに浸されている。定電圧源15は一定の電圧を印加する。
The
XYスキャナ21には、ピエゾ素子が内蔵される。XYスキャナ21は、HVアンプ23から出力される高電圧によりピエゾ素子が駆動されることで、X方向とY方向、すなわち図示左右方向および奥行き方向に移動する。XYスキャナ21の上には細胞900および第2電極14が入った容器Lが配される。容器Lにはピペット11が差し込まれ、容器L内の溶液Qおよびピペット11内の溶液Qにより、第1電極12および第2電極14の間に電流が流れる。XYスキャナ21にはマイクロ波発生部25が取り付けられる。マイクロ波発生部25は、後述するダイヤモンドNVモードの測定において利用するマイクロ波を出力する。XYスキャナ21は、中央部に穴または透過性の板を有し、共焦点顕微鏡30による下部からの細胞900の観察を可能としている。
The XY
HVアンプ23は高電圧を出力するハイボルテージアンプである。HVアンプ23は、コントローラ26、XYスキャナ21、およびZスキャナ22と接続される。HVアンプ23はコントローラ26による動作指令、具体的には動作指令信号である電圧信号または電流信号に基づきXYスキャナ21およびZスキャナ22に高電圧を供給する。なお、Zスキャナ22およびXYスキャナ21は、ピペット11と細胞900との位置関係を決定するので、Zスキャナ22およびXYスキャナ21をまとめて「移動部」と呼ぶこともできる。
The
コントローラ26は、AD/DAコンバータ27を備える。コントローラ26は、PC24の動作指令に基づきAD/DAコンバータ27を動作させる。具体的にはコントローラ26は、IV変換回路13から出力される電圧の値をAD/DAコンバータ27から取得してPC24に出力する。またコントローラ26は、PC24の動作指令に従い、電流または電圧のアナログ信号をHVアンプ23に出力する。たとえばコントローラ26は、PC24からZ軸方向に+10nmの移動指令を受けると、HVアンプ23のZ軸に対応するチャンネルに+10nmに対応する電圧を出力する。
The
XYスキャナ21の下部には、対物レンズ41と、ビームスプリッタ42と、ダイクイロックミラー43と、ローパスフィルタ44と、第1ピンホール板45と、第2ピンホール板46と、第3ピンホール板47と、ノッチフィルタ48と、カメラ31と、光源32と、検出器33とが配される。このうち、対物レンズ41、ビームスプリッタ42、ダイクロイックミラー43、第2ピンホール板46、第3ピンホール板47、ノッチフィルタ48、カメラ31、および光源32が共焦点測定部51である。また、対物レンズ41、ダイクイロックミラー43、第3ピンホール板47、ノッチフィルタ48、光源32、および検出器33がラマン測定部52である。
At the bottom of the
光源32は可変波長のレーザーを出力する。ダイクロイックミラー43は、光源32が出力するレーザーの波長の光を反射し、それ以外の波長の光を透過させる。光源32が出力するレーザー光は、第3ピンホール板47およびノッチフィルタ48を通過し、ダイクロイックミラー43で反射され、ビームスプリッタ42を透過した後に対物レンズ41を介して細胞900に照射される。その反射光がビームスプリッタ42で分岐されて、カメラ31および検出器33により検出される。ダイクロイックミラー43では光源32が出力するレーザーの波長以外の波長の光が透過するので、検出器33ではラマンスペクトルを測定できる。なお検出器33は分光器であり、たとえば約500nm~約1000nmを分光できる。
The
第1ピンホール板45、第2ピンホール板46、および第3ピンホール板47は、ピンホールを有する板であり焦点位置からのみの散乱光を通過させる。対物レンズ41はたとえばサーボモータを内蔵し、PC24の動作指示により図示上下方向に移動する。対物レンズ41が図示上下方向に移動することにより、細胞900の任意の深度における像を取得できる。さらに共焦点測定部51は、XYスキャナ21を動作させて光軸と細胞900の位置関係を変化させることで、細胞900の全域における任意の深度の像を取得できる。
The
PC24は、演算部241および記憶部242を備える。演算部241はたとえば、不図示のCPU、ROM、およびRAMを備え、ROMに格納されるプログラムをCPUがRAMに展開して実行することにより後述する機能を実現する。ただし演算部241は、CPU、ROM、およびRAMの組み合わせの代わりに書き換え可能な論理回路であるFPGA(Field Programmable Gate Array)や特定用途向け集積回路であるASIC(Application Specific Integrated Circuit)により実現されてもよい。また演算部241は、CPU、ROM、およびRAMの組み合わせの代わりに、異なる構成の組み合わせ、たとえばCPU、ROM、RAMとFPGAの組み合わせにより実現されてもよい。
The
PC24は不図示のディスプレイおよび入力装置と接続され、入力装置から入力されたオペレータの動作指令をコントローラ26に伝達する。またPC24は、演算部241の演算に基づく動作指令もコントローラ26に伝達する。PC24は、検出器33から撮影画像が入力される。またPC24は、コントローラ26からピペット11の座標が入力される。演算部241は、検出器33から入力される撮影画像、および検出器33から入力されるラマンスペクトルを記録する。
The
PC24は、ピペット11の先端位置であるXYZ座標を常に把握している。PC24はたとえば、コントローラ26へ移動指令を出力するたびにPC24の内部に保持しているXYZ座標値を、出力した移動指令に基づき更新する。ただしXYZ座標の管理はコントローラ26が行ってもよいし、XYスキャナ21およびZスキャナ22のそれぞれが行ってもよい。
The
演算部241は、記録したXYZ座標とラマンスペクトルを用いて図5のような表示を不図示のディスプレイに出力する。図5では、細胞900の任意のZ方向の高さの断面図を表示しており、スライダー912を操作することで断面図の高さを変更できる。オペレータが図5における細胞900の任意の位置を選択すると、選択した位置におけるラマンスペクトルが表示される。さらに演算部241は、ラマンスペクトルに基づきその位置に存在するタンパク質などを同定する。
The calculation unit 241 outputs a display as shown in FIG. 5 to a display (not shown) using the recorded XYZ coordinates and the Raman spectrum. In FIG. 5, a cross-sectional view of the height of the
(動作)
測定システムS1は、4つの手法で測定が可能である。ここではそれぞれの測定手法を「モード」として説明する。測定システムSは、共焦点モード、SICMモード、ラマンモード、およびNVモードを有する。共焦点モードとは、図1の下部に示す共焦点測定部51を用いる測定である。SICMモードとは、Scanning ion-conductance microscopeすなわち走査イオンコンダクタンス顕微鏡としての機能を用いる測定である。ラマンモードとは、ラマン測定部52を用いてラマン散乱を観察する測定である。NVモードとは、ダイヤモンドNVを励起させスピンの状態を観察することで細胞900や周囲環境を観察する測定である。
(motion)
The measurement system S1 can measure by four methods. Here, each measurement method will be described as a "mode". The measurement system S has a confocal mode, a SIMM mode, a Raman mode, and an NV mode. The confocal mode is a measurement using the confocal measuring
それぞれのモードの切り替えはPC24により行われる。ただしオペレータの操作によりモードが切り替えられてもよいし、PC24に内蔵されるプログラムにより自動的に、たとえばバッチ処理により順次切り替えられてもよい。ただし上述した「モード」は概念的なものであり、複数のモードを同時に実行してもよい。なお光源32が出力するレーザー光の周波数は同一でもよいし同一でなくてもよい。またレーザー光の周波数は、使用する機器の特性に合わせて微調整してもよい。
Each mode is switched by the
(動作 共焦点モード)
PC24は、共焦点モードでは、光源32からレーザー光を照射し、対物レンズ41を移動させて焦点距離を調整し、任意のZ位置で細胞900を観察する。以下では、共焦点モードにおいて撮影して得られる画像を「撮影画像」と呼ぶ。なお焦点距離を適切に設定することで、撮影画像にはピペット11の先端を含めることができる。
(Operation confocal mode)
In the confocal mode, the
(動作 SICMモード)
SICMモードでは、ピペット11の先端と細胞900との間隔が狭くなることにより第1電極12と第2電極14との間に流れるイオン電流が減少することを利用する。PC24は、IV変換回路13が出力する電圧値が一定になるように、すなわちピペット11の先端と細胞900との隙間を流れるイオン電流が一定になるようにZスキャナ22の位置、すなわちピペット11の高さを調整する。XYスキャナ21を用いてピペット11の直下に位置する細胞900を移動することで、SICMモードでは細胞900の表面全体の形状を非接触で詳細に観察できる。ただしピペット11が細胞900に接触すると、第1電極12と第2電極14との間にはイオン電流が流れないので、SICMモードでの観察は、ピペット11の先端が細胞900と接触しない状態に限定される。
(Operation SIMM mode)
In the SIMM mode, it is utilized that the ion current flowing between the
なおSICMモードにおいて、ピペット11が細胞900に接触するとイオン電流が流れなくなることを利用して、次のことが可能である。すなわちSICMモードでは、ピペット11が細胞900の表面に接触するピペット11のZ位置を高精度に測定できる。
In the SIMM mode, when the
(動作 ラマンモード)
ラマンモードでは、光源32が出力するレーザー光をピペット11の先端付近に照射し、散乱光f2を検出器33により測定する。そして、レーザー光の周波数f1と散乱光f2の関係によりピペット11の先端に存在する物質の組成を特定する。ただし散乱光f2は、様々な周波数および様々な強度の光の総称として用いている。散乱光f2は、検出器33により検出される。
(Operation Raman mode)
In the Raman mode, the laser light output from the
一般に、励起光の多くは波長の変化がないレイリー散乱として散乱されるが、一部の散乱光はエネルギーの収受によりストークス散乱やアンチストークス散乱として観察される。ストークス散乱光やアンチストークス散乱光の周波数f2と、励起光であるレーザー光の周波数f1との関係、すなわちラマン散乱の波長シフト量であるラマンシフトは分子ごとに既知である。そのため、既知の分子構造やラマンスペクトルデータベースを参照することで、ピペット11の先端に存在する分子の構造や種類を特定できる。さらに本実施の形態では、探針増強効果により散乱光が増強されて検出が容易になり、短時間での観察を可能とする。
Generally, most of the excitation light is scattered as Rayleigh scattering with no change in wavelength, but some scattered light is observed as Stokes scattering or anti-Stokes scattering due to energy reception. The relationship between the frequency f2 of Stokes scattered light and anti-Stokes scattered light and the frequency f1 of laser light which is excitation light, that is, the Raman shift which is the wavelength shift amount of Raman scattering is known for each molecule. Therefore, by referring to a known molecular structure or Raman spectrum database, the structure and type of the molecule existing at the tip of the
(動作 NVモード)
NVモードでは、光源32が出力するレーザー光を用いてピペット11の先端のダイヤモンドNVを励起する。さらに、マイクロ波発生部25が出力するマイクロ波をダイヤモンドNVに照射してスピンを制御する。このスピンは周囲環境の影響を受け、スピンが特定の状態にあることはカメラ31でダイヤモンドNVの発光を観察することにより確認できるので、既知の手法により磁場や温度などを測定できる。さらに、ダイヤモンドNVはピペット11の先端に付加されているので空間分解能が向上し、探針増強効果により信号強度が向上する。
(Operation NV mode)
In the NV mode, the laser beam output from the
すなわちNVモードでは、光源32が出力するレーザー光およびマイクロ波発生部25が出力するマイクロ波をピペット11の先端に照射し、検出器33で得られるスペクトルを解析することで磁場や温度などを測定する。なお、他のモードと同様に、XYスキャナ21およびZスキャナ22を動作させることで、細胞900の任意の位置を測定可能である。
That is, in the NV mode, the laser light output from the
(動作例)
図6を参照して、観察システムSを用いた細胞900の一連の観察を説明する。ただし以下に説明する動作の順番は一例にすぎず、測定の順番をどのように変化させてもよい。図6(a)に示すように、PC24は、XYスキャナ21を動作させてピペット11の先端をXY方向に移動させ、イオン電流が一定になるようにZスキャナ22を移動させる。すなわちPC24は、SICMモードにおいて細胞900の表面を走査して詳細な三次元形状を取得する。またPC24は、図6(b)に示すように細胞900の細胞膜を対象としてラマンモードの観察、すなわち光源32が出力するレーザー光によるラマンスペクトルを取得し、細胞質に存在する分子の振動モードの局所観察を行う。さらにPC24は、光源32が出力するレーザー光およびマイクロ波発生部25が出力するマイクロ波を用いてNVモードの測定を行う。
(Operation example)
A series of observations of the
次にPC24は、Zスキャナ22を操作してイオン電流がゼロになるまでピペット11をさらに細胞900に接近させる。イオン電流がゼロとは、細胞900の表面にピペット11の先端が接触している状態である。そしてPC24は、ピペット11の先端がフォーカス範囲に含まれるように対物レンズ41を移動させる。そしてPC24は、撮影画像を連続的に取得して、ピペット11の先端が撮影画像に鮮明に撮影されるようにZスキャナ22を制御する。
The
撮影画像にピペット11の先端が鮮明に撮影されると、ピペット11の先端が細胞質に到達したことになる。撮影画像においてピペット11の先端が鮮明に表示されているか否かは、PC24を操作するオペレータが判断してもよいし、プログラムにより判断してもよい。プログラムにより判断する場合には、ピペット11が鮮明に撮影された画像とのパターンマッチングを利用する方法や、ピペット11が鮮明に撮影された画像を用いた機械学習を利用する方法などを採用できる。ただし、細胞質の膜が弾性変形する場合を想定し、たとえば予め細胞質の内部に存在する観察対象に撮影画像のピントを合わせておき、ピペット11の先端が鮮明に撮影される位置までピペット11を移動させてもよい。
When the tip of the
この状態で図6(c)に示すように細胞質におけるラマンモードおよびNVモードの観察を行う。なお、ピペット11をさらに細胞の内部に侵入させて再度ラマンモードおよびNVモードの観察を行ってもよく、侵入と観察を複数回繰り返してもよい。すなわち、Z方向の位置を変えて細胞質の複数の個所においてラマンモードの観察を行ってもよい。その後、Zスキャナ22を用いてピペット11を引き上げてピペット11の先端を細胞900の細胞膜の表面、すなわち細胞900の外部まで戻す。そしてXYスキャナ21を動作させてXY平面での測定位置を変更する。以上の処理を繰り返すことにより、必要に応じて細胞900の全域を観察する。なおこの繰り返し処理は一例として記載しているにすぎず、必要な個所のみ観察を行ってもよい。
In this state, the Raman mode and NV mode in the cytoplasm are observed as shown in FIG. 6 (c). The
SICMモードおよびラマンモードの観察結果は、ピペット11の先端のXYZ座標とともにPC24に保存されている。そのため、図5に示すように測定結果をわかりやすく図示することができる。
The observation results of the SIMM mode and the Raman mode are stored in the
(フローチャート)
図7は、上述した動作例に対応する演算部241の処理を示すフローチャートである。以下に説明する各ステップの実行主体は演算部241である。まず演算部241は、所定のXY座標に移動する(S601)。次に演算部241は、Zスキャナ22を用いてSICM測定、すなわちSICMモードにおける測定を行う(S602)。SICMモードではPC24はイオン電流が一定値A0になるようにZスキャナ22を移動させる。イオン電流が一定値A0になると、PC24はフラグを付したXYZ座標をPC24に送る。そのためPC24は、このXYZ座標が(x1、y1、z1)の場合にXY座標が(x1、y1)における細胞900の表面の高さはz1であることを認識する。
(flowchart)
FIG. 7 is a flowchart showing the processing of the calculation unit 241 corresponding to the above-mentioned operation example. The execution subject of each step described below is the arithmetic unit 241. First, the calculation unit 241 moves to a predetermined XY coordinate (S601). Next, the calculation unit 241 uses the
次に演算部241はラマン測定およびNV測定、すなわちラマンモードおよびNVモードにおける測定を行う(S603)。次に演算部241は、対物レンズ41を移動させ、細胞900の細胞質の内部に存在する観察対象とする細胞に焦点をあわせる。次に演算部241は、ピペット11の先端がカメラ31の撮影画像において合焦するようにピペットを移動させる(S605)。次に演算部241は、ラマンモードおよびNVモードでの測定を行う(S606)。ただし演算部241は、次のS607に進む前に、ピペット11のZ方向へのさらなる移動とラマンモードおよびNVモードでの測定を、1回以上繰り返して実行してもよい。
Next, the calculation unit 241 performs Raman measurement and NV measurement, that is, measurement in Raman mode and NV mode (S603). Next, the arithmetic unit 241 moves the
最後に演算部241は、全ての測定点での測定が終了したか否かを判断し(S607)、終了したと判断する場合は図7に示す処理を終了し、未測定の点があると判断する場合はS601に戻る。なおS601に戻った場合には、演算部241は未測定のいずれかの点にピペット11を移動する。
Finally, the calculation unit 241 determines whether or not the measurement at all the measurement points has been completed (S607), and if it determines that the measurement has been completed, ends the process shown in FIG. When determining, the process returns to S601. When returning to S601, the calculation unit 241 moves the
上述した第1の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
(1)観察システムS1は、金属112Aを付加したピペット11と、ピペット11と試料である細胞900との間隔に応じて増減するイオン電流を測定するPC24と、励起光であるレーザー光を照射する光源32と、励起光を細胞900に照射して得られるラマン分光であって金属112Aにより局所増強されたラマン分光を検出する検出器33とを備える。そのため、観察システムS1は、イオン電流を測定するイオンコンダクタンス顕微鏡としての働きにより細胞900の表面の形状を計測でき、さらにピペット11の表面に付加した金属112Aにより非侵襲にラマン分光を感度よく検出し物質を同定できる。
According to the first embodiment described above, the following effects can be obtained.
(1) The observation system S1 irradiates the
(2)ピペット11の先端にはダイヤモンドNV112が付されている。細胞900の影響を受けているダイヤモンドNV112のスピン状態を観察する観察部であるカメラ31を備える。そのため、スピン状態を観察して細胞900の表面や内部の環境を測定できる。
(2) A diamond NV112 is attached to the tip of the
(3)観察システムS1は、ピペット11と細胞900との位置関係を操作する移動部、すなわちZスキャナ22およびXYスキャナ21を備える。検出器33は、Zスキャナ22およびXYスキャナ21による位置関係の操作の前後において、細胞900の表面および試料の内部のラマン分光を検出する。そのため、細胞900の表面だけでなく細胞の内部を観察できる。
(3) The observation system S1 includes a moving unit that manipulates the positional relationship between the
(4)カメラ31は、XYスキャナ21やZスキャナ22による位置関係の操作の前後において、細胞900の表面および細胞900の内部の影響を受けているスピン状態を観察する。そのため、細胞900の表面だけでなく細胞900の内部の環境も測定できる。
(4) The
(5)Zスキャナ22は、ピペット11をイオン電流がゼロとなる位置(図7のS604)から細胞900の細胞膜の厚みに相当する量以上移動させる(図7のS607)ことにより、ピペット11の先端を細胞900の内部に移動させる。そのため位置分解能が高いイオンコンダクタンス顕微鏡の原理を利用して細胞900の表面の位置を特定し、細胞900の内部にピペット11の先端を挿入できる。
(5) The
(変形例1)
観察システムS1の観察対象は細胞に限定されない。観察システムS1は、細胞以外の様々な物質を観察対象とすることができる。
(Modification example 1)
The observation target of the observation system S1 is not limited to cells. The observation system S1 can observe various substances other than cells.
(変形例2)
上述した第1の実施の形態では、ピペット11を移動させるのはZスキャナ22のみであり、XYスキャナ21が細胞900を移動させることでピペット11と細胞900の位置関係を三次元に自在に設定した。しかしピペット111と細胞900の位置関係を三次元に自在に設定可能であればよく、装置の構成は任意である。たとえば細胞900の移動機構を用意せず、ピペット11をXYZ方向に任意に移動可能な構成としてもよい。
(Modification 2)
In the first embodiment described above, only the
(変形例3)
上述した第1の実施の形態では、ピペット11の金属コーティング112Aは特に限定しなかった。しかし金属コーティング112Aは次のものに限定してもよい。すなわち本変形例では、ピペット11にまず銀をコーティングし、その上に金をコーティングする。ラマン散乱を生じさせる増強効果だけに注目すると銀が有用である。しかし銀は細胞に対する毒性があり、観察対象である細胞900に悪影響を与える。これを防止するために、化学的に不活性にさせる効果を有する金を用いて銀の表面をコーティングする。
(Modification example 3)
In the first embodiment described above, the
(変形例4)
光源32は、カメラ31と接続され、カメラ31が撮影を行うタイミングでレーザー光を出力してもよい。
(Modification example 4)
The
(変形例5)
上述した第1の実施の形態では、観察システムS1は4つの測定モードを有したが、ラマンモードおよびNVモードのいずれかを備えなくてもよい。観察システムS1がラマンモードを備えない場合は、ピペット11に金属コーティング112Aが付されなくてもよい。観察システムS1がNVモードを備えない場合は、ピペット11にダイヤモンド粒子112が付されなくてもよい。
(Modification 5)
In the first embodiment described above, the observation system S1 has four measurement modes, but may not include either Raman mode or NV mode. If the observation system S1 does not have Raman mode, the
―第2の実施の形態―
図8~図9を参照して、本発明に係る観察システムの第2の実施の形態を説明する。以下の説明では、第1の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第1の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、細胞質を吸い出して解析する点で、第1の実施の形態と異なる。
-Second embodiment-
A second embodiment of the observation system according to the present invention will be described with reference to FIGS. 8 to 9. In the following description, the same components as those in the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the differences will be mainly described. The points not particularly described are the same as those in the first embodiment. The present embodiment differs from the first embodiment mainly in that the cytoplasm is sucked out and analyzed.
(構成)
図8は第2の実施の形態における観察システムS2の構成図である。第1の実施の形態との相違点は、電圧源15の代わりに電圧源15Aが備えられる点である。電圧源15Aは、正の電圧だけでなく負の電圧も印加できる。本実施の形態では、電圧源15Aは、コントローラ26を介してPC24から指示される電圧を出力する。
(Constitution)
FIG. 8 is a block diagram of the observation system S2 according to the second embodiment. The difference from the first embodiment is that a
なお本実施の形態では、後述するようにピペット11の先端がXYスキャナ21から離れた位置での計測を行う。この場合に、レーザー光やマイクロ波の照射、および試料900の観察に支障がある場合には、適切な位置にマイクロ波発生部25、カメラ31、光源32、および検出器33を移動させてもよい。また、XYスキャナ21から離れたピペット11の位置に応じて、新たにマイクロ波発生部、カメラ、光源、検出器を設けてもよい。さらにミラー等の光学系を追加してピペット11の位置の変更に対応してもよい。
In the present embodiment, as will be described later, the measurement is performed at a position where the tip of the
(動作概要)
図9は、第2の実施の形態における観察システムS2の動作概要を示す図である。観察システムS2は、第1の実施の形態における動作により、細胞900の内部も含めた全域におけるラマンスペクトルを取得した後に、次の動作を行う。まずオペレータが調査対象点を決定し、不図示の入力装置を用いてPC24に入力する。PC24の演算部241は、図9(a)に示すように入力された調査対象点にピペット11の先端を移動させる。そして演算部241は、コントローラ26を介して電圧源15Aに負の電圧を印加させ、図9(b)に示すようにピペット11の内部に調査対象点の電解質を吸い上げる。
(Outline of operation)
FIG. 9 is a diagram showing an outline of operation of the observation system S2 according to the second embodiment. The observation system S2 performs the following operation after acquiring the Raman spectrum in the entire area including the inside of the
そして演算部241は、図9(c)に示すようにZスキャナ22を動作させてピペット11を細胞900から引き抜く。次に演算部241は、図9(d)に示すようにピペット11の内部の溶液を加圧して、ピペット11の先端に液滴913を形成する。なお液滴913は微小量、たとえばピコリットル単位でよい。そして演算部241は、この液滴913にレーザー光およびマイクロ波を照射し、ラマンモードおよびNVモードの測定を行う。ただし電圧源15Aに正の電圧を印加させず、ピペット11の先端に付着した電解質にレーザー光およびマイクロ波を照射し、ラマンモードおよびNVモードの測定を行ってもよい。
Then, the calculation unit 241 operates the
図9(e)は、ピペット11の先端に形成された液滴913の拡大図である。液滴913の中の分子は、局所的に増強された電場領域914に自由に出入りする。一定の時間にわたって観察を続けることにより、液滴に含まれるすべての分子を対象としたラマンモードおよびNVモードの測定が行われる。
FIG. 9E is an enlarged view of the
細胞膜は脂質二重層なので、電解質を細胞900の外部に抜き出してから測定することで、細胞膜などのほかのシグナルの影響を受けることなく、電場領域914により観察対象の分子のシグナルを増大させて観察できる。
Since the cell membrane is a lipid bilayer, by extracting the electrolyte from the outside of the
上述した第2の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
(6)IV変換回路13Aは次に説明する吸引部および排出部として機能する。吸引部は、負の電圧を印加することでピペット11の内部に試料900の一部を吸い上げる。排出部は、正の電圧を印加することで吸引部が吸い上げた試料900の一部の少なくとも一部を排出して液滴913を形成する。
According to the second embodiment described above, the following effects can be obtained.
(6) The IV conversion circuit 13A functions as a suction unit and a discharge unit, which will be described next. The suction unit sucks a part of the
(7)上述した観察方法は、先端に金属を付加したピペット11、励起光であるマイクロ波を照射するマイクロ波発生部25と、励起光を細胞900に照射して得られるラマン分光であって金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器33とを備える観察システム1を用いて実行される観察方法である。この観察方法は、ピペット11Aを用いて細胞900の細胞質を吸い上げることと、ピペット11Aの先端に励起光を照射し、検出器33を用いてラマン分光を検出することとを含む。そのため、細胞膜などのほかのシグナルの影響を受けることなく、電場領域914により観察対象の分子のシグナルを増大させて観察できる。
(7) The above-mentioned observation method is a
(第2の実施の形態の変形例)
第2の実施の形態では、液滴913を対象としたラマンスペクトルの計測を行った。しかしラマンスペクトルの計測を行う代わりに、レーザーアブレーションによるTOF質量分析などを行ってもよい。
(Modified example of the second embodiment)
In the second embodiment, the Raman spectrum of the
―第3の実施の形態―
図10を参照して、本発明に係る観察システムの第3の実施の形態を説明する。以下の説明では、第1の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第1の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、酸素同位体を用いて細胞の活性を検出する点で第1の実施の形態と異なる。本実施の形態では、酸素の同位体として中性子が17個であるO-17を用いる。
-Third embodiment-
A third embodiment of the observation system according to the present invention will be described with reference to FIG. In the following description, the same components as those in the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the differences will be mainly described. The points not particularly described are the same as those in the first embodiment. This embodiment differs from the first embodiment mainly in that the activity of cells is detected by using oxygen isotopes. In this embodiment, O-17 having 17 neutrons is used as an isotope of oxygen.
(概念図)
図10は、第3の実施の形態における動作を示す概念図である。第3の実施の形態では、まず図10(a)に示すように、細胞900を一定時間にわたってO-17環境下に置く。これにより、細胞900に蓄積されるグルコース(C6H12O6)中の酸素がO-17となる。
(Conceptual diagram)
FIG. 10 is a conceptual diagram showing the operation in the third embodiment. In the third embodiment, first, as shown in FIG. 10 (a), the
次に、図10(b)に示すように、細胞900をO-16環境下に置く。細胞900はグルコースを用いた酸素代謝を行い、O-17を含む酸素を排出するので、ピペット11を用いてNVモードの測定をすることにより、このO-17を検出する。O-17の排出を詳述すると、細胞900が酸素代謝により排出するCO2およびH20は、O-17を含むグルコースから生成されたものである。そのため、このCO2およびH20を構成する酸素は、雰囲気中と同じO-16だけでなく雰囲気中には含まれないO-17も含まれる。したがって、O-17を検出することで細胞の酸素代謝を検出し、O-17の濃度を評価することで細胞900の活性度合いを評価できる。
Next, as shown in FIG. 10 (b), the
(構成)
観察システムの構成は第1の実施の形態と同様なので説明を省略する。
(Constitution)
Since the configuration of the observation system is the same as that of the first embodiment, the description thereof will be omitted.
(同位体の検出)
細胞900にマイクロ波を照射することで電子にスピンが生じ、同位体ごとにスピンが異なる。具体的にはO-16とO-17はスピンの態様が異なる。そのため、ラマン分光ではO-16とO-17を区別することが可能である。
(Isotope detection)
Irradiation of
上述した第3の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
(8)観察システムにおける観察対象の試料は細胞900である。NVモードにおける観察を行う観察部、すなわち検出器33は、細胞900の代謝に関する酸素同位体であるO-17を検出する。そのため、O-17を用いて非侵襲に細胞の活性度を評価できる。たとえば蛍光試料を用いることで代謝の様子を観察することも可能であるが、蛍光試料を細胞に投与することにより細胞が影響を受けることが避けられない。しかし本実施の形態によれば非侵襲で細胞の代謝や活性を測定できる。
According to the third embodiment described above, the following effects can be obtained.
(8) The sample to be observed in the observation system is
(第3の実施の形態の変形例)
上述した第3の実施の形態では、O-17を気体として細胞900に取り込ませた。しかしO-17を液体、すなわち水として細胞900に取り込ませてもよい。
(Modified example of the third embodiment)
In the third embodiment described above, O-17 was taken up by
―第4の実施の形態―
本発明に係る観察システムの第4の実施の形態を説明する。以下の説明では、第1の実施の形態と同じ構成要素には同じ符号を付して相違点を主に説明する。特に説明しない点については、第1の実施の形態と同じである。本実施の形態では、主に、時間分解機能をさらに有する点で、第1の実施の形態と異なる。
-Fourth Embodiment-
A fourth embodiment of the observation system according to the present invention will be described. In the following description, the same components as those in the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the differences will be mainly described. The points not particularly described are the same as those in the first embodiment. The present embodiment is different from the first embodiment mainly in that it further has a time decomposition function.
本実施の形態では、ラマンモードおよびNVモードでは時間分解、すなわちポンプ-プローブ法による測定が可能である。ただし共焦点モードおよびSICMモードの動作は第1の実施の形態と同様である。ラマンモードおよびNVモードのいずれも、ポンプ光およびプローブ光には様々な周波数の光を用いることができる。ポンプ光およびプローブ光は、位相を制御してもよいし、信号測定の感度を向上させるためにロックイン検出を行ってもよい。ポンプ光の照射タイミングとプローブ光の照射タイミングの差である遅延時間を複数通りに変化させる。 In the present embodiment, time decomposition, that is, measurement by the pump-probe method is possible in Raman mode and NV mode. However, the operation of the confocal mode and the SIMM mode is the same as that of the first embodiment. In both Raman mode and NV mode, light of various frequencies can be used for the pump light and the probe light. The pump light and the probe light may control the phase, or lock-in detection may be performed to improve the sensitivity of signal measurement. The delay time, which is the difference between the irradiation timing of the pump light and the irradiation timing of the probe light, is changed in a plurality of ways.
遅延時間の制御には様々な手法を用いることができ、たとえば遅延時間を制御するステージの移動やミラーの駆動などの機械的な動作により光路長を変化させてもよいし、ポッケルスセルを利用してもよい。また、ポンプ光の出力源およびプローブ光の出力源が、入力されるパルス信号に応じて光を出力する場合には、2つの出力源にパルス信号を入力するタイミングを変化させることで遅延時間を制御してもよい。 Various methods can be used to control the delay time. For example, the optical path length may be changed by mechanical operation such as moving the stage for controlling the delay time or driving a mirror, or a Pockels cell is used. You may. Further, when the output source of the pump light and the output source of the probe light output light according to the input pulse signal, the delay time is increased by changing the timing of inputting the pulse signal to the two output sources. You may control it.
ラマンモードでは、たとえばポンプ光として紫外線を用いて、プローブ光として第1の実施の形態と同様に光源32が出力するレーザー光を用いてもよい。ポンプ光を照射することで細胞900内の振動モードが変化するので、振動モードの緩和の様子がラマンスペクトルを測定することで観察できる。NVモードでは、スピンの緩和の様子を観察できる。
In the Raman mode, for example, ultraviolet rays may be used as the pump light, and laser light output from the
以上説明した第4の実施の形態では、局所領域における、ラマンモードおよびNVモードの時間分解測定ができる。 In the fourth embodiment described above, the time-resolved measurement of the Raman mode and the NV mode can be performed in the local region.
上述した各実施の形態および変形例は、それぞれ組み合わせてもよい。上記では、種々の実施の形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。 Each of the above-described embodiments and modifications may be combined. Although various embodiments and modifications have been described above, the present invention is not limited to these contents. Other aspects conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included within the scope of the present invention.
S1、S2、S3、S4…観察システム
11…ピペット
12…第1電極
13、13A…IV変換回路
14…第2電極
21…XYスキャナ
22…Zスキャナ
22…スキャナ
26…コントローラ
24…PC
25…マイクロ波発生部
30…共焦点顕微鏡
31…光源
32…カメラ
33…検出器
112…ダイヤモンド粒子
112A…金属片
241…演算部
242…記憶部
900…細胞
913…液滴
914…電場領域
S1, S2, S3, S4 ...
25 ... Microwave generator 30 ...
Claims (9)
前記ピペットと試料との間隔に応じて増減するイオン電流を測定する演算装置と、
励起光を照射する光源と、
前記励起光を前記試料に照射して得られるラマン分光であって前記金属により局所増強されたラマン分光を検出する検出器と、
を備える観察システム。 With a pipette with metal added,
An arithmetic unit that measures the ion current that increases or decreases according to the distance between the pipette and the sample,
A light source that irradiates excitation light,
A detector that detects Raman spectroscopy locally enhanced by the metal, which is Raman spectroscopy obtained by irradiating the sample with the excitation light.
Observation system equipped with.
前記ピペットの先端にはダイヤモンドNVが付されており、
前記試料の影響を受けている前記ダイヤモンドNVのスピン状態を観察する観察部をさらに備える観察システム。 In the observation system according to claim 1,
A diamond NV is attached to the tip of the pipette.
An observation system further comprising an observation unit for observing the spin state of the diamond NV influenced by the sample.
前記ピペットと前記試料との位置関係を操作する移動部をさらに備え、
前記検出器は、前記移動部による位置関係の操作の前後において、前記試料の表面および前記試料の内部のラマン分光を検出する観察システム。 In the observation system according to claim 1 or 2.
A moving part for manipulating the positional relationship between the pipette and the sample is further provided.
The detector is an observation system that detects Raman spectroscopy on the surface of the sample and inside the sample before and after the operation of the positional relationship by the moving portion.
前記観察部は、前記移動部による位置関係の操作の前後において、前記試料の表面および前記試料の内部の影響を受けている前記スピン状態を観察する観察システム。 In the observation system according to claim 3, which is subordinate to claim 2.
The observation unit is an observation system that observes the spin state affected by the surface of the sample and the inside of the sample before and after the operation of the positional relationship by the moving unit.
前記試料は細胞であり、
前記細胞の任意の深度における光学像である撮影画像を取得する共焦点測定部をさらに備え、
前記移動部は、前記撮影画像において前記細胞の内部に存在する観察対象に合焦している場合に、前記ピペットの先端が前記撮影画像において合焦するように移動させる観察システム。 In the observation system according to claim 3 or 4.
The sample is a cell
Further, a confocal measuring unit for acquiring a captured image which is an optical image at an arbitrary depth of the cell is provided.
The moving unit is an observation system that moves the tip of the pipette so as to focus on the photographed image when the observation target existing inside the cell is focused on the photographed image.
前記ピペットの内部に前記試料の一部を吸い上げる吸引部と、
前記吸引部が吸い上げた前記試料の一部の少なくとも一部を排出する排出部とをさらに備える観察システム。 In the observation system according to any one of claims 1 to 5.
A suction part that sucks up a part of the sample inside the pipette,
An observation system further including a discharge unit that discharges at least a part of the sample sucked up by the suction unit.
前記試料は細胞であり、
前記観察部は、前記細胞の代謝に関する酸素同位体であるO-17を検出する観察システム。 In the observation system according to any one of claims 3 to 6, which is dependent on claim 2 and claim 2.
The sample is a cell
The observation unit is an observation system that detects O-17, which is an oxygen isotope related to the metabolism of the cells.
前記ピペットには銀および金がコーティングされ、銀は金に覆われている観察システム。 In the observation system according to claim 1,
An observation system in which the pipette is coated with silver and gold, and the silver is covered with gold.
前記ピペットを用いて前記細胞の細胞質を吸い上げることと、
前記ピペットの先端に前記励起光を照射し、前記検出器を用いてラマン分光を検出することと、を含む観察方法。
An observation system including a pipette to which a metal is added, an excitation light irradiation unit that irradiates excitation light, and a detector that detects Raman spectroscopy locally enhanced by the metal, which is Raman spectroscopy obtained by irradiating cells with the excitation light. Is an observation method performed using
Using the pipette to suck up the cytoplasm of the cells,
An observation method comprising irradiating the tip of the pipette with the excitation light and detecting Raman spectroscopy using the detector.
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