JP4827335B2 - Scanning laser microscope - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は染色した標本上をレーザ光により走査することにより、得られる標本からの光を分光し、分光データを得ることのできる走査型レーザ顕微鏡に関する。
【0002】
【従来の技術】
細胞や組織を観察し易くするために、染色用の試薬で染色することが行われている。染色用の試薬には種々のものがあり、生体組織は成分により、染まり易い試薬と、染まり難い試薬とがある。これを利用して、目的に応じた所望の試薬により試料(標本)を染色して、顕微鏡観察に供することが行われている。そして、現在では更に一歩進めて、複数種の蛍光試薬で染色した試料にレーザ光を照射し、このレーザ光照射により試薬から励起された蛍光放射を分光して得られたスペクトルのデータを収集し、分析に用いることが行われている。
【0003】
そのために用いるのが走査型レーザ顕微鏡であり、これは、レーザ光を対物レンズを介して集光して走査装置により標本上を走査し、標本からの光を分光器に与えて分光するとともに、前記走査装置からの走査信号に同期して分光データを得ることで、試料におけるレーザ照射位置からの光のスペクトル情報を得るものである。
【0004】
(従来技術1)
走査型レーザ顕微鏡の一例をあげると、特表平9−502269号公報に示す如きの技術がある。ここに開示された技術は蛍光光束をプリズム等のスペクトル分解手段により分光し、一方では第一スペクトル範囲を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分を反射して第二スペクトル範囲をなす二つの光路を構成し、それぞれの光路に対して光検出器を設けて構成した共焦点走査型レーザ顕微鏡である。
【0005】
図5は、上記共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。レーザ光源202から出射されたレーザ光束203は、方向変更ミラー204、レーザラインフィルタ205、レンズ206、絞り207を介してダイクロイックミラー208に導かれて、ここで反射させ、レンズ209、X−Y走査光学系210、瞳投影レンズ211、対物レンズ212を経て試料213に達する。
【0006】
試料213からの反射光および蛍光からなる光束214は、対物レンズ212、瞳投影レンズ211、X−Y走査光学系210、レンズ209を経てダイクロイックミラー208に戻る。そして、光束214のうち、蛍光分はダイクロイックミラー208を透過して蛍光光束217となり、このうち、共焦点絞り215を通過したものが分光器216へと入射する。
【0007】
図6は、分光器216の構成を示す図である。選択装置225は、光束217を分解するスペクトル分解手段227と、一方では第一スペクトル範囲229を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分230を反射する手段228とを有している。光検出器226は、絞り込まれた第一スペクトル範囲229の光路に配置された第一光検出器231と、反射されたスペクトル範囲の光路に設置された第二光検出器232とを有している。
【0008】
さらに選択装置225は、反射されたスペクトル範囲230の光路に設置され、第二スペクトル範囲234を絞り込む手段233を有する。第二光検出器232は、絞り込まれた第二スペクトル範囲234の光路に設置されている。
【0009】
(従来技術2)
また、別の例として、特開2000−56244号公報には、反射光や蛍光のような、分散しながら分割される照明光と対象物からの光との両方または一方を波長選択するための、照明と検出工程との両方または一方に、選択的に切り替え可能な少なくとも1基の微小鏡配列(DMD)を持つ走査型レーザ顕微鏡が開示されている。
【0010】
この公報に開示された走査型レーザ顕微鏡の構成は図7に示す如きである。すなわち、この構成において、レーザ光源Lsからのレーザ光LBは走査手段Scnにより間欠的に位置を移動させるかたちで走査されることにより試料Smp上をX−Y走査され、その走査位置にある試料Smpからレーザ光LBにより励起された蛍光が放射される。
【0011】
試料Smpから放出される(蛍光)放射は対象物と共役な平面内に位置する共焦点ピンホールPh上へ焦点を結ぶ。このピンホールPhは同時に分光装置の開口部でもあり、プリズムPを用いた分光器は当該プリズムPの分散作用によって試料放射をそのスペクトル成分へ分離する。試料放射の焦点面には1次元のDMDがあり、ここに試料スペクトルが光学的に結像される。
【0012】
1次元のDMDは個別に駆動可能な多数の切り替え鏡からなる。そして、レーザ光源Lsからのレーザ光LBが試料Smpの上に留まる間、逐次的に鏡が1つずつ個別に駆動(そしてこれにより切り替え)されることにより、その位置に分光されて到達した光を検出器Dtcに送る。こうして試料放射の個々のスペクトル成分が逐次的に検出器Dtcにて検出され、試料Smpから放出される(蛍光)放射の全スペクトルデータが得られる。
【0013】
また別の方法として、複数の鏡を同時に駆動して、試料からの所望のスペクトル域の光を選択的に検出器に導くこともできる。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
近年蛍光観察においては、単染色のみならず多重染色が多用されている。もとより、蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために行われる。このため多重染色観察では、各染色部位が明確な色の差、すなわち、蛍光波長の違いとして検出されなければならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)を効率良く除去して検出する必要がある。
【0015】
さらに、細胞機能の研究を行う上で、細胞内のカルシウムイオン濃度を検出するための蛍光プローブが広く利用されるようになった。カルシウムイオンは細胞の活動状況に密接な関係を持つためである。カルシウムイオンの染色には蛍光試薬として“INDO−1”が良く知られているが、この“INDO−1”を用いることで、定量的に細胞内カルシウムイオン濃度を測定できる。
【0016】
“Indo−1”で染色した試料(標本)は、UV光(紫外線)を照射することにより、蛍光を発する。そして、発生した当該蛍光を2つの異なる波長域(中心波長405[nm]と480[nm])で検出し、検出光量の比(中心波長405[nm]の蛍光/中心波長480[nm]の蛍光)を演算して求めることにより、カルシウムイオン濃度を測定できる。
【0017】
走査型レーザ顕微鏡を用いて試料に対し、レーザ光の走査を繰り返し行い、前記演算により細胞内カルシウムイオン濃度の時間変化を測定する。なお、一般的には特定波長帯の光を反射し、他は透過させる光学特性を持つダイクロイックミラーにより、試料からの蛍光を450[nm]で二つの光路に分岐し、一方は中心波長405[nm]、バンド幅約20[nm]、他方は中心波長480[nm]、バンド幅約20[nm]のバンドパスフィルタBPF1,BPF2を使用して検出波長領域を絞るようにしている。
【0018】
しかしながら、前記蛍光の中心波長は細胞の状態、例えばpH(ペーハー;水素イオン濃度)によりシフトする。例えば、上記Ca2+maxおよびCa2+minなる蛍光が図8に示すようにその中心波長がO1,O2にシフトしたとすると、この場合、バンドパスフィルタBPF1,BPF2の中心波長BPF1o,BPF2oと蛍光Ca2+maxおよびCa2+minの中心波長O1,O2との間にズレが生じ、その結果、本来得られるべき光量が得られなくなるので、データのS/N(信号/雑音)が劣化するだけでなく、光量比で表わされる演算結果も本来得られるべき値とは違ったものとなる可能性がある。
【0019】
つまり、従来技術1における前述したようなフィルタのセットは常に最良であるとは限らない。
【0020】
一方、特表平9−502269号公報の装置は各検出器に導く試料からの蛍光の波長域を自由に変更できるので、従来技術1における上記のような問題点を解決する上で、有効と考えられる。事実、多重染色観察において蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)を効率良く除去して検出する目的においては、繰り返し走査して画像を確認しながらスリットを制御することにより、試料からの蛍光スペクトルを自由に選択できるので、光学的なバンドパスフィルタを利用する方式より遙かに良い。但し、繰り返しレーザ走査を行うことにより試料は退色するのでレーザ走査は可能な限り少なくできることが望ましい。
【0021】
しかしながら、上記細胞内カルシウムイオン濃度を測定する例では、細胞の状態、例えば、pHは検査者にとっては未知であり、蛍光の中心波長がどこにあるのか、蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)がどのレベルであるかを事前に正確に知る術はないことから、得られた結果が最善か否かがわからないと言う問題がある。
【0022】
すなわち、カルシウムイオン濃度の変化を捉えることができたとしても、その結果が最善のものであるかどうかは検査者は全くわからないということであり、最善の結果が得られている保証はないわけである。
【0023】
試行錯誤的に繰り返し試験を行うことが可能であれば、得られる結果を最適なものに近づけることは可能ではある。しかし、この種の試験は一度データ取得を行うと、基本的には試料を交換しなければならず(一般的には薬品で刺激を与えることにより試験を開始するが、一旦刺激を与えると2度目の刺激は効果がない。)、したがって、細胞の準備等に莫大な手間と費用が必要であり、現実的には困難と言わざるを得ない。
【0024】
このように、上記従来技術の根本的な欠点は、試料の像を作るために、あらかじめ設定したスペクトル、つまり、スリットを通過する蛍光の平均強度だけしか利用できない点にある。
【0025】
一方、特開2000−56244号公報の技術は、試料からの蛍光の分光データを得るに際して、全分光データを収集しようとする場合、DMDのミラー素子を一枚ずつ駆動して光検出器に試料からの蛍光の分光スペクトルを導かなければならないので、全スペクトル領域のスペクトルデータを得るには時間がかかるという欠点がある。
そのため、細胞内カルシウムイオン濃度のような変化の速い現象を観察、測定するには不向きな装置となる。従って、従来技術では、細胞内カルシウムイオン濃度のような変化の速い現象を観察、測定の対象とすることはできなかった。故に、これを打開する技術の早急な開発が嘱望されている。
【0026】
従って、本発明の目的とするところは、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような場合のように、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行うに当たり、最適な解析結果を確実に得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【0027】
また、本発明の目的とするところは、染色した試料の放出する光の全スペクトルを一度にデータ収集できるようにした走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【0028】
また、本発明の目的とするところは、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、所望のスペクトルについて反映された画像を表示できるようにした走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【0029】
また、本発明の目的とするところは、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、望ましくは1回の走査で蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)を効率良く除去して画像表示することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【0030】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し、目的を達成するために、本発明の走査型レーザ顕微鏡は以下のように構成する。
【0031】
[1] レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、
入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を直線的に配列させた1次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とすることにより画素単位でスペクトルのデータを得る検出器と、
前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して画素単位でのスペクトル分布データとして記憶保存する手段と、
画像表示するためのスペクトル域の指示を受け付ける手段と、
前記記憶保存されたデータのうち、前記指示されたスペクトル域に対応するデータを抽出して加算し、前記スペクトル域の画像を生成する手段と、
前記生成された画像を表示する手段を備え、
スペクトル域の前記指示入力とそれに対応したスペクトル域の画像生成と表示を、前記記憶保存された同じデータに基づいて繰り返して実施可能にしたことを特徴とする。
[2] また、[1]項の構成において、前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、画面上で表示されたスペクトル分布の中から所望の前記スペクトル域を指示するためのインターフェースを備えたことを特徴とする。
【0032】
レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させ、検出手段で検出することにより、試料における1地点毎のスペクトルデータを得るが、スペクトルデータは例えばプリズム等による分光手段を用い、この分光手段により分光して1次元光検出手段に入射させることで得る。1次元光検出手段は、複数の微小受光素子を直線的(1次元的)に配列させた構成であり、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが対応関係を以て入射される配置関係としてあることから、微小受光素子はその位置がどこであるかにより、入射される波長域が定まる。従って、特定位置の微小受光素子にはスペクトルの特定波長域の光が入射する構成となるから、この各微小受光素子よりその入射光量対応の信号を得てこれを受光素子個別にディジタルデータ化し、受光素子の並び順に収集すると波長成分が特定できるデータ、すなわち、全てのスペクトル分布がわかるデータとして収集されると言う効果がある。
【0033】
しかも、試料に照射するレーザ光は、試料上を移動走査させるので、その時々で収集される上記データは試料に対するレーザ光の照射点における放出光のデータであり、走査範囲で定まる画面を構成する画素単位でのスペクトル分布データとなる。そのため、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集できる。
【0034】
従って、本発明によれば、試料からの蛍光の分光データを短時間に一度に全て取得することが可能な技術が確立する。また、本発明によれば、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような場合のように、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行うに当たり、最適な解析結果を確実に得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【0035】
また、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、必要な蛍光スペクトルのデータを収集できるようになる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【0037】
この構成によれば、前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して得たデータを画面構成分収集し、記憶保存し、この保存データを用いて画像を生成するが、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集されていることから、所望にスペクトル範囲を種々指定してその指定範囲のスペクトルによる画像を表示でき、従って、1度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な画像を見付けることができる。
【0038】
従って、本発明によれば、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、所望のスペクトルについて反映された画像を表示できるようになる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【0039】
[3] また、[1]項の構成において、前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、前記レーザ光源の出力レーザ波長より長い波長である少なくとも二種のスペクトル域の指示を受け付け、
前記スペクトル域の画像を生成する手段は、前記保持されたデータのうち、前記指示された二種のスペクトル域に対応するデータをそれぞれ抽出して加算するとともに、両者の比を求めて当該比に基づく画像を生成し、次の画像を生成するまでの間、前記生成した画像を出力し、
前記表示する手段が前記出力された画像を表示することを特徴とする。
【0040】
この構成においては、1画面分の走査を終えると時間をおいて再びレーザ光による試料の1画面分の走査を実施する間欠走査において、一つの走査が終了するたびに画像表示されるので、検査者は画像の変化の様子を確認できる。そのため、もし、試験が上手くいっていないようなら、そこで試験を中止する等の対応ができ、時間の浪費をせずに済むようになる。
【0041】
その他、本発明は次のような態様が包含され得る。
【0042】
(1)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を対物レンズを介して集光して走査装置により試料上を走査し、試料からの光を分光器に投射するとともに、前記走査装置からの走査信号に同期して所定のスペクトル帯に対応する分光データを得ることのできる走査型レーザ顕微鏡であって、前記分光データにおいて、所望のスペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、走査終了後に画像表示を行うものである。
【0043】
(2)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、所望のスペクトル域を変更することによりデータの演算を再度行い、この演算結果をもとに再度画像表示を行うものであり、またこのシーケンスを繰り返し行うものである。
【0044】
(3)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)、(2)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光データにおいて、複数の所望のスペクトル域を指定し、これら各スペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、少なくとも1枚の画像プレーンに画像表示するものである。
【0045】
(4)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)、(2)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光データにおいて、複数の所望のスペクトル域を指定し、これら各スペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、前記指定された複数のスペクトル域に対応する画像をそれぞれ各画像プレーンに表示するものである。
【0046】
(5)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)〜(4)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、所望のスペクトル域のデータ(光強度データ)の合計値をもとに行うものである。
【0047】
(6)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(3)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、2つの所望のスペクトル域を指定し、各スペクトル域のデータのみを抽出して、それぞれの合計値を演算するとともに、これら合計値の比を演算し、この演算結果をもとに画像表示するものである。
【0048】
(7)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)〜(6)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、レーザ波長を除く全スペクトル域のデータ(光強度データ)の合計値またはレーザ波長を除く、これよりも長いスペクトル域のデータ(光強度データ)の合計値をもとに行うことが、あらかじめ設定されている。
【0049】
(8)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)〜(6)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、レーザ波長を除く全スペクトル域のデータ(光強度データ)の合計値またはレーザ波長を除く、これよりも短いスペクトル域のデータ(光強度データ)の合計値をもとに行うことが、あらかじめ設定されている。
【0050】
(9)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光器は1次元、または2次元のCCD配列を含んでいる。
【0051】
(10)本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記(1)に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、時間経過観察のために試料走査は所定回数だけ間欠的に行われ、前記画像表示は走査後に所定回数行われる。
【0052】
【発明の実施の形態】
本発明は、試薬により染色された試料からの蛍光の分光データを全スペクトル範囲に亙り、短時間に全て取得することができるようにし、この取得した全スペクトル範囲の分光データの中から、所望のスペクトル領域の分光データを用いて解析や画像表示を行えるようにしたもので、以下、図面を参照して本発明の実施例の詳細を説明する。
【0053】
(第1の実施形態)
図1は、本発明の第1の実施形態に係わる共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。図において、1は所望の波長のレーザ光を発振出力するレーザ光源であり、測定対象を例えば、Indo−1で標識された細胞内カルシウムイオン濃度とする場合にはレーザ光源1として、351[nm]の発振線を有するアルゴンレーザ光源を用いる。2はこのレーザ光源1から出射されたレーザ光束(レーザビーム)である。
【0054】
3はビームエキスパンダであり、レーザ光源1から出射されたレーザ光束2を、対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径を拡大させるための光学系である。4はレーザラインフィルタであって、予め設定した所望の波長の光を選択的に透過させるフィルタである。測定対象をIndo−1で標識された細胞内カルシウムイオン濃度とする場合には、351[nm]の波長を選択的に透過させる光学フィルタとする。また、5はダイクロイックミラーであって、特定波長帯の光を反射し、他は透過させる光学特性を持つハーフミラーである。測定対象物を細胞内カルシウムイオン濃度とする場合には、351[nm]の波長を選択的に反射させ、他は透過させる光学特性を持つミラーを用いる。
【0055】
また、6はX−Y走査光学系であって、7は瞳投影レンズ、8は結像レンズ、9は対物レンズ、10は試料である。試料10は目的に応じた試薬で染色してある。対物レンズ9は試料10に近接して進退調整可能であって、試料10に対する光学系の焦点を合わせるためのレンズであり、結像レンズ8および瞳投影レンズ7はその光軸を対物レンズ9の光軸に一致させて配されている。
【0056】
また、11は共焦点レンズ、12は共焦点絞り、13はコリメートレンズ、15はプリズムであって、これら共焦点レンズ11、共焦点絞り12、コリメートレンズ13は試料10からの光をプリズム15に導く光学経路上にその光軸を一致させて配置されている。
【0057】
プリズム15は、入射された各波長の光を分光するためのものである。
【0058】
ダイクロイックミラー5は試料10からの光をプリズム15に導く光学経路上であって共焦点レンズ11とX−Y走査光学系6との間の光路にその面を斜めにして配置され、レーザラインフィルタ4を介してレーザ光源1から導かれたレーザ光束2を、ここで反射させて試料10側に導くと共に、試料10側からの光を共焦点レンズ11側に導くよう、レーザ光源1の光軸上との交点に配置してある。
【0059】
共焦点レンズ11は試料10に対する対物レンズ9の焦点位置と共役な焦点位置を持つレンズであり、共焦点絞り12はこの共焦点レンズ11の共焦点位置に配置された絞りである。共焦点絞り12はピンホールの役割を担うものであり、抽出対象の光の持つ波長により理想のピンホール径は異なるので、調整できるよう、絞りとしての機能も備えている。
【0060】
試料10から放出される蛍光は試料における観察対象物部分と共役な平面内に位置するこの共焦点絞り12上へ焦点を結ぶので、この共焦点絞り12を通った光が分光器14に入射し、当該分光器14のプリズム15に入射されて分光される仕組みである。
【0061】
X−Y走査光学系6はダイクロイックミラー5と、瞳投影レンズ7との間の光路中に配され、所定の範囲内で光路を光学的に移動させることができるものである。16は集光レンズ、17は1次元CCD(画素が一列に配列された固体撮像素子)であって、集光レンズ16はプリズム15により分光された光を所定範囲に集めるためのレンズであり、1次元CCD 17上に集光するためのものである。なお、1次元CCD 17は集光レンズ16の焦点位置に配置されている。
【0062】
図2に示すように、1次元CCD 17は画素に相当する複数の受光セルを一列に密に配列してなるラインイメージセンサであり、プリズム15により分光された光を集光レンズ16により1次元CCD 17の受光セル配列範囲内に集めることにより、特定のスペクトルの光は特定のセル位置に入射して検出される構成となっている。そして、CCD 17は光の入射によってそのセルに生成された電荷による画素信号(輝度信号)を、読み出し時にはセルの並ぶ順番に直列データで出力する構成であるから、画素信号の直列データの位置がそれぞれ特定スペクトルの検出信号となる対応関係を持つ構成である。
【0063】
尚、プリズム15、集光レンズ16、1次元CCD 17で分光器14を構成している。レーザ光はX−Y走査光学系6により試料10に対してX−Y走査するものであり、ある瞬間でのレーザ光により励起された蛍光のプリズム15による分光後の1次元CCD 17出力は、レーザ光が照射された位置での励起蛍光(或いは反射光)に含まれる全てのスペクトル分を個別に含む検出画素信号ということになる。
【0064】
31は制御装置であって、X−Y走査光学系6を駆動制御するものであり、30は信号処理装置であって、1次元CCD 17で検出された入射光強度対応の信号を、制御装置31のサンプリング信号に同期して、ディジタル信号に変換して出力するものであり、32はコンピュータであって、信号処理装置30の出力するデータを受けてこれをファイルとして記憶手段に保存すると共に、保存されたこれらファイルを用いてスペクトル画像を生成したり、スペクトルのグラフ表示をしたり、スペクトル範囲を指定することで、その指定したスペクトル範囲の画像を生成したりするといった機能を有する。33はモニタ装置であり、コンピュータ32の出力画面を表示する画像表示装置である。
【0065】
尚、コンピュータ32は、画像生成のアプリケーションと、検査者の操作や指示を行い易くサポートするインタフェースであるGUI(Graphical User Interface;画面上に表示されたアイコンやウインドウなどのグラフィカルな要素を、マウスなどのポインティング・デバイスを用いてコンピュータを操作する方式のインタフェース)を持ち、画像毎に収集された全てのスペクトル分布を画面に表示したり、表示されたスペクトル分布の中から、所望のスペクトル範囲を少なくとも1つ以上個別に指定したり、その指定スペクトル領域についてのデータを記憶手段から抽出して画像を生成して表示したりすると云った機能を有する。
【0066】
次にこのような構成の本装置の作用を説明する。いま、細胞内カルシウムイオン濃度に関する測定を実施しようとする場合を考える。この場合、試料10の染色には蛍光試薬として“INDO−1”を用いる。また、この場合、レーザ光源1としてはアルゴンレーザ光源を用いる。“INDO−1”により染色された試料10を対物レンズ9の下に置き、対物レンズ9の焦点を合わせる。
【0067】
その後、レーザ光源1からレーザ光を出射させる。レーザ光源1は351[nm]の発振線(レーザ光)を有するアルゴンレーザ光源であり、当該レーザ光源1から出射された351[nm]のレーザ光束2は、ビームエクスパンダ3により対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径が拡大される。そして、レーザラインフィルタ4を介してダイクロイックミラー5へと導かれる。
【0068】
レーザラインフィルタ4では351[nm]の発振線を選択的に透過させる。レーザラインフィルタ4を透過した351[nm]の波長を有するレーザ光はダイクロイックミラー5で反射され、X−Y走査光学系6、瞳投影レンズ7、結像レンズ8、対物レンズ9を経て試料10に達する。
【0069】
ここで、試料10に対するレーザ光集束点は対物レンズ9で定まり、試料10上でのレーザ光集束位置はレーザ光をX−Y走査するためのX−Y走査光学系6によるX−Y走査位置により定まる。
【0070】
試料10は蛍光試薬“INDO−1”で標識されており、351[nm]の波長を有するレーザ光が試料10に照射されることにより、その照射点となった試料10からは反射光もしくはレーザ光による励起によって蛍光が生じる。試料10からの反射光および蛍光からなる光束20は、対物レンズ9、結像レンズ8、瞳投影レンズ7、X−Y走査光学系6、を経てダイクロイックミラー5に戻る。そして、光束20はダイクロイックミラー5を透過し、ここで、元のレーザ光波長成分の光が除去されて、蛍光成分の光のみとなり、これはさらに共焦点レンズ11を透過し、前記試料10の前記照射点となった位置からの光が集束されて共焦点絞り12の側に焦点を結ぶ。そして、その集束点にある共焦点絞り12により、前記試料10の前記照射点となった位置からの光が取り出され、それ以外は共焦点絞り12の絞り開口部(ピンホール)から外れることにより除去される。共焦点絞り12を通過した光はコリメートレンズ13によりコリメート(平行光線化)され、分光器14に入る。
【0071】
分光器14はプリズム15、集光レンズ16、および1次元CCD 17からなり、共焦点絞り12を通過してコリメートレンズ13により平行光線化された光束はプリズム15でスペクトル分解され、集光レンズ16を介して1次元CCD 17上に集光される。1次元CCD 17は集光レンズ16の焦点位置に配置されており、しかも、微少なサイズの複数の受光セルが、リニアに、且つ、密に配列されたものであって、分光されるスペクトルの分布範囲が1次元CCD 17における受光セルの配列範囲に見合うように、集光レンズ16により集光される。
【0072】
従って、各受光セルの配列位置と、分光されるスペクトルの波長域は特定の関係にある。分光されて得られたスペクトルの波長と1次元CCD 17におけるその波長のスペクトルを検出する受光セルの位置が定まっているわけである。
【0073】
従って、プリズム15によりスペクトル分解されることにより、各波長別に分離された光は、1次元配列された1次元CCD 17上における分光光路対応位置の受光セルに入射する。そして、1次元CCD 17には試料10におけるその時点でのレーザ光照射位置における出力光の持つスペクトル成分が、その成分対応の受光セルに入射する結果、その受光セルは入射光量相当の電荷を生成する。
【0074】
このようにして生成された電荷は受光セルの並び順にしたがって順番に読み出され、受光セル単位で連なる光強度信号として信号処理装置30に与える。信号処理装置30は制御装置31からのサンプリング信号に同期して1次元CCD 17で検出された光強度信号をディジタル信号に変換処理し、そして、例えば、パソコンの標準バスであるPCIバスを経由してコンピュータ32に転送する。
【0075】
コンピュータ32では、これを受け取って記憶手段に記憶する。この記憶した1ライン分の各受光セルのディジタル信号は、試料10における特定走査位置での出力光の持つ全スペクトル成分の成分別データ(スペクトル分布特性のデータ)である。そのため、試料10における特定走査位置での出力光の持つ全スペクトル成分の成分別データが一度に収集できることになる。
【0076】
一地点でのデータ収集が終わったならば、制御装置31は自己の発生するサンプリング信号に同期させながらX−Y走査光学系6を駆動制御して次の画素のスペクトルデータを取得すべく、試料10に対するレーザ光2の位置を移動させる。そして、上述のようにその位置からの光をプリズム15により分光してその位置での試料10のスペクトル成分の全データ(スペクトル分布特性のデータ)を収集する。
【0077】
制御装置31はサンプリング信号に同期させながらX−Y走査光学系6を駆動制御して試料10に対するレーザ光2の位置を移動させることで、試料10の各位置を網羅するようにX−Y走査し、各位置での試料10のスペクトル成分の全データを収集していくことになる。
【0078】
上述した1次元CCD 17は、例えば、受光セル数が256素子相当のラインイメージセンサであり、最短波長350[nm]、1素子あたり約1[nm]に相当するようにプリズム15と集光レンズ16の焦点距離が光学的に設定されていたとすると、この場合、1次元CCD 17は350[nm]から605[nm]までの範囲のスペクトルが検出可能な構成となる。
【0079】
そして、信号処理装置30は1次元CCD 17の出力を各素子毎に、例えば、8ビット分解能でディジタル化処理する構成であったとする。するとこの場合には、制御装置31の一つのサンプリング信号毎に(つまり画像上の1ピクセル(1画素)に対して)、256[Byte](バイト)の容量のデータ(スペクトル分布特性のデータ)が収集されることになる。X−Y走査光学系6は256×256ピクセルに亙り、走査するものとすれば、1画面当たり、256×256回分のサンプリング信号が出力されることになるので、画像1枚(256×256ピクセル)につきデータ容量は17[MByte]の容量を持つことになる。
【0080】
256×256ピクセル構成の1枚の画像を1秒で取得するものとする場合、信号処理装置30からコンピュータ32にデータ転送する転送レートは17[MByte/秒]程度であるから、一般的なコンピュータに搭載されているPCIバス経由で十分に転送可能である。
【0081】
また、コンピュータ32に1[GByte]のメモリを搭載しておくことにより、少なくとも画像50枚分のピクセル別のスペクトル分布特性のデータをコンピュータに転送し、コンピュータメモリ上に記録することが可能である。
【0082】
以上のことから、観察対象の試料について、ピクセル毎に、全スペクトルに亙り、各成分別の光強度のデータ(ピクセル別のスペクトル分布特性のデータ)を含んだ50秒間(画像50枚)分の経時観察データを得ることができるようになる。
【0083】
ここで、以下に示すように、各画像ピクセル(Xi,Yj)n(但し、(Xi,Yj)は画素位置、nはn枚目の走査画像を指す)についての全スペクトルデータ列を、そのスペクトル成分別にI(K1)n,I(K2)n,I(K3)n,…,…, …,I(Km)n、例えば、I(350)n,I(351)n,I(352)n,…,…,…,I(605)nと表記することにする(n=1〜50、また、K1,K2,…は波長を示していて、I(350)nならば、n枚目の画像の波長350[nm]の入射光量値,I(351)nならば、n枚目の画像の波長351[nm]の入射光量値,…であることを示している)。
【0084】
以上が、本発明の走査型レーザ顕微鏡におけるスペクトル成分のデータ収集である。次に画像表示方法について説明する。
【0085】
データ取得後、検査者は画像表示するためのスペクトル範囲を選択する。これはコンピュータ32の持つソフトウエアにより実施する。
【0086】
コンピュータ32は、画像生成のアプリケーションと、検査者の操作や指示を行い易くサポートするインタフェースであるGUIや操作手段等を持つ。そして、これらのソフトウエアによるメニュー画面をモニタ装置33に表示して検査者に何の処理を行わせたいのか、指示させる。今、収集されたスペクトルのデータから検査者が所望のスペクトル成分の画像を生成する指示をしたとすると、この指示を受けてコンピュータ32は、そのスペクトル範囲の指定画面を生成し、モニタ装置33に送って表示させる。そして、検査者は所望のスペクトル範囲を指示する。
【0087】
例えば、収集されたスペクトルのデータからスペクトル特性の分布図をグラフ表示し、その表示された分布図上で所望のスペクトル範囲を指定する。その結果、図3(a)において符号p,qを付したハッチング領域で示すように、2つのスペクトル範囲を指定したとする。すなわち、一つは波長390[nm]から420[nm]までの範囲(p)、他方は465[nm]から485[nm]までの範囲(q)である。
【0088】
この指定情報を受けてコンピュータ32は、その指定範囲のスペクトルデータ積算値ΣI(K)nをそれぞれピクセル単位で求める。上述の例の場合、
【数1】
として演算するわけである。そして、画面全体の構成ピクセルそれぞれについての当該演算を行い、その結果を反映させた画像を生成する。
【0089】
390[nm]から420[nm]のスペクトルに対応する画像をA、465[nm]から485[nm]のスペクトルに対応する画像をBとする。カルシウムイオン濃度の上昇とともに試料10からの蛍光スペクトルはそれまでの図3(a)のような特性から図3(b)に示すように、短波長側に移動したとすると、これにより、画像Aは明るさを増し、画像Bは暗くなることが認められる。
【0090】
そして、カルシウムイオン濃度を求めるために、
【数2】
但し、αは検査者が定めることのできる適宜な定数である。
を演算する。
【0091】
例えば、“INDO−1”で染色した試料(標本)は、UV光(紫外線)を照射することにより、当該試料から励起される蛍光を2つの異なる波長域(中心波長405[nm]と480[nm])で検出し、検出光量の比(中心波長405[nm]の蛍光/中心波長480[nm]の蛍光)を演算して求めることにより、カルシウムイオン濃度を測定できる。
【0092】
従って、このことを利用して[数2]の演算をコンピュータ32にて行うことで、カルシウムイオン濃度を求めることができる。
【0093】
各ピクセル別にこのようなカルシウムイオン濃度を求め、1画面全てのピクセルについてこのような演算を終えたならば、次にコンピュータ32はピクセル毎に求めたカルシウムイオン濃度を反映させた画像を生成する。
【0094】
そして、得られたカルシウムイオン濃度を表わす画像表示のためのデータをCとすれば、1画像毎に図1(b)に示すように、画像A,B,Cが得られるので、上記の例では50枚分それぞれにおけるA,B,Cの画像が得られることになる。得られたこれらの画像はモニタ装置33に表示させ、検査者はこの表示画像を観察することになる。
【0095】
尚、上述の例では50枚分の画像を得ているので、これら50枚の画像を順次表示すれば、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を動画として表示することができる。
【0096】
本実施形態に示した走査型レーザ顕微鏡装置は、もとになる全てのスペクトル成分のデータを、コンピュータ32のメモリ上に保持させてあるので、選択するスペクトル範囲はコンピュータ32に対して指定することにより、何度でも再設定できる。そのため、選択するスペクトルの範囲を種々変更して画像の状態を比較することにより、カルシウムイオン濃度の変化を表わす最善の画像を得ることができる。
【0097】
以上、この実施形態に示したものは、レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、前記検出器は入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を密に直線的に配列させた1次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とするようにしたものである。
【0098】
また、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を持つよう集光させる光学系を設けて構成した。
【0099】
また、前記1次元光検出手段の各微小受光素子の出力電気信号をディジタル信号化して微小受光素子配列順のデータを得る信号処理手段(信号処理装置30)と、この得られたデータを保持する保持手段とを設けた。
【0100】
更には、保持手段に保持したデータを用いて指定のスペクトル範囲のデータを抽出しその指定範囲のスペクトル成分による画像を生成する構成とした。
【0101】
レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、試料における1地点毎のスペクトルデータを得るが、スペクトルデータは例えばプリズム等による分光手段を用い、この分光手段により分光して1次元光検出手段に入射させることで得る。1次元光検出手段は、複数の微小受光素子(受光セル)を密に直線的(1次元的)に配列させた構成であり、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが関係を以て入射される配置関係としてあることから、微小受光素子はその位置がどこであるかにより、入射される波長域が定まる。従って、特定位置の微小受光素子にはスペクトルの特定波長域の光が入射する構成となる。そのため、この各微小受光素子よりその入射光量対応の信号を得てこれを受光素子個別にディジタルデータ化し、受光素子の並び順に収集すると波長成分が特定できるデータ、すなわち、全てのスペクトル分布がわかるデータとして収集されると言う効果がある。
【0102】
しかも、試料に照射するレーザ光は、試料上をX−Y走査させるべく移動させるので、その時々で収集される上記データは試料に対するレーザ光の照射点における放出光のデータであり、X−Y走査範囲で定まる画面を構成する画素単位でのスペクトル分布データとなる。そのため、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集できる。このデータを画面構成分収集し、記憶保存し、この保存データを用いて画像を生成するが、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集されていることから、所望にスペクトル範囲を種々指定してその指定範囲のスペクトルによる画像を表示でき、従って、1度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な画像を見付けることができる。
【0103】
蛍光試薬による試料染色した試料(蛍光染色試料)の蛍光観察においては、単染色のみならず多重染色が多用されており、特に、蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために行われることが多い。このため、多重染色観察では、各染色部位が明確な色の差、すなわち、蛍光波長の違いとして検出されなければならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)を除去して検出する必要がある。
【0104】
本発明では画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集でき、このデータを画面構成分収集して記憶保存し、この保存データを用いて所望のスペクトル範囲の画像を生成するが、データが保存されているので、スペクトル範囲を繰り返し何度でも種々指定し直して画像を表示できることから、1度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な状態の画像を見付けることができるようになる。
【0105】
また、スペクトル領域の範囲指定は同時に複数可能であり、しかも、指定したスペクトル領域内のスペクトル成分のデータを加算してその指定領域のスペクトル成分による画像を生成し、さらにそれを利用してイオン濃度などを演算にて求めることができ、その求めたイオン濃度の画像を表示したり他の画像と合成したりして表示できるので、検査者に試験結果についての詳細な情報を提供できる効果もある。
【0106】
なお、上記例では2次元画像を対象としたが、ライン走査(1次元)であってもよいことは言うまでもない。この場合には画像の横方向には走査の空間軸が、縦軸には時間(または走査回数)がとられる。また、分光にはプリズムを用いた例を示したが、これは回折格子を利用しても良く、分光可能な手段であれば利用することができる。
【0107】
以上は、ピクセル毎のスペクトル分布のデータを収集して保持しておき、その保持データを用いて所望のスペクトル領域を定めてその領域の成分による画像を求める方式であったが、試験を実施しながらその状況を把握できるようにし、状況如何により試験継続か中止かを判断できるようにして、もし、試験が上手くいっていないようであるならば、そこで試験を中止する等の対応ができて、時間の浪費をせずに済むようにした実施形態を次に第2の実施形態として説明する。
【0108】
(第2の実施形態)
この実施形態では、スペクトルデータの収集時に、あらかじめレーザ光源の出力レーザ波長成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像表示するように構成するとともに、試料に対する1画面分のレーザ走査終了のたびに画像表示を更新するようにして経過を逐次、把握できるようにするものである。
【0109】
図4(a)は、本発明の第2の実施の形態に係わる共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。この実施形態においても、基本構成は第1の実施形態で説明したものと同じで良い。但し、第2の実施形態では、レーザ光源1として442[nm]の発振線を有するヘリウムカドミウムレーザ光源を用いている点、X−Y走査光学系6は512×512ピクセルに亙り、走査するようにした点、1次元CCD 17は例えば、1024素子相当のラインセンサであり、最短波長430[nm]、1画素当たり約0.25[nm]に相当するように、プリズム15と集光レンズ16の焦点距離が光学的に設定されていて、1次元CCD 17は400[nm]から685[nm]のスペクトルが検出可能に構成されている点、コンピュータ32は予めレーザ波長(442[nm])成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を求めるとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像を生成し、モニタ装置33に画像表示するように設定されており、X−Y走査光学系6による1画面分の画素範囲のレーザ光走査終了のたびにモニタ装置33に対する画像表示の更新をするようにした点が第1の実施形態と異なる。尚、34はコンピュータ32に接続されたハードディスクなどの大容量記憶装置である。
【0110】
このような本実施形態で開示した構成の装置の作用を説明する。ここで観察対象とする試料10は2種類の蛍光蛋白(例えば、CFPとYFPの2種類の蛍光蛋白)を遺伝子発現させた細胞であるとする。
【0111】
442[nm]の発振線を有するヘリウムカドミウムレーザ光源1から出射されたレーザ光束2は、ビームエクスパンダ3により対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径が拡大されレーザラインフィルタ4に導かれる。レーザラインフィルタ4は442[nm]の発振線を選択的に透過させる。
【0112】
レーザラインフィルタ4を透過した442[nm]の波長を有するレーザ光束はダイクロイックミラー5で反射され、X−Y走査光学系6、瞳投影レンズ7、結像レンズ8、対物レンズ9を経て試料10に達する。
【0113】
試料10は、CFPとYFPの2種類の蛍光蛋白を遺伝子発現させた細胞であり、細胞内カルシウムイオン濃度の変化により、CFPからYFPへのエネルギ移動の変化が生じ、これにより蛍光量が変化するもので、この光量の比を測定することで細胞内カルシウムイオン濃度を測定することができる。
【0114】
試料10に到達したレーザ光によってその到達位置での蛍光蛋白を励起し、または反射光を生じる。
【0115】
ここで、試料10に対するレーザ光集束点は対物レンズ9で定まり、試料10上でのレーザ光集束位置はレーザ光をX−Y走査するためのX−Y走査光学系6によるX−Y走査位置により定まる。
【0116】
試料10からの反射光および蛍光からなる光束20は、対物レンズ9、結像レンズ8、瞳投影レンズ7、X−Y走査光学系6、を経てダイクロイックミラー5に戻る。そして光束20はダイクロイックミラー5、共焦点レンズ11を透過し、共焦点絞り12、コリメートレンズ13を介して分光器14に入る。
【0117】
分光器14はプリズム15、集光レンズ16、および1次元CCD17からなり、ダイクロイックミラー5を透過した光束はプリズム15でスペクトル分解され、集光レンズ16を介して1次元CCD 17上に集光される。なお1次元CCD 17は集光レンズ16の焦点位置に配置されている。
【0118】
X−Y走査光学系6を駆動制御する制御装置31のサンプリング信号に同期して、信号処理装置30は1次元CCD 17で検出された光強度信号をディジタル信号に変換し、PCIバス経由でコンピュータ32に転送する。
【0119】
1次元CCD 17は例えば、受光セルが1024素子相当のラインセンサであり、最短波長430[nm]、1画素当たり約0.25[nm]に相当するように、プリズム15と集光レンズ16の焦点距離が光学的に設定されている。したがって、受光セル1024素子は、順に400[nm]から685[nm]のスペクトル範囲をカバーしている。そして、その各受光セルは、自己の対応する波長成分の光の強度に対応する電気信号を発生することになる。すなわち、1次元CCD17は400[nm]から685[nm]のスペクトルが検出可能に構成されているわけである。
【0120】
信号処理装置30は1次元CCD 17の出力を各素子毎に8ビット分解能で処理し、その並び順に並ぶデータとして出力する。
【0121】
したがって、この信号処理装置30の出力するデータは、制御装置31の一つのサンプリング信号に対して(つまり画像上の1ピクセルに対して)、1[KByte](キロバイト)のデータ容量を有する。
【0122】
X−Y走査光学系6によるX−Y走査の範囲は、1画像当たり512×512ピクセル相当であるから、制御装置31はこれに対応するサンプリング信号を出力することとなるので、画像1枚(512×512ピクセル)につき268[MByte]のデータ容量となる。
【0123】
1枚の画像を60秒おきに取得する場合、信号処理装置30からコンピュータ32に必要な転送レートは、一般的なコンピュータに搭載されているPCIバス経由で十分に対応可能である。また、このデータをコンピュータ32に接続されたハードディスクなどの大容量記憶装置34に、試料に対する1画面分のレーザ走査終了ごとに書き込むことにより、少なくとも画像50枚分のデータを記録することが可能である。信号処理装置30からコンピュータ32へのデータ転送時間とハードディスク(大容量記憶装置34)ヘの書き込み時間の合計が画面毎のレーザ走査間隔時間に対して小さければ良いことになる。
【0124】
この実施形態では、コンピュータ31での処理は、あらかじめレーザ波長(442[nm])成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像を生成して画像表示するように設定されており、レーザ走査終了のたびに画像表示を更新するようになっている。
【0125】
すなわち、二つのスペクトル範囲をあらかじめ指定しておく。一つは465[nm]から495[nm]までを、他方は520[nm]から550[nm]までである。
【0126】
この指定情報を受けてコンピュータ32は、その指定範囲のスペクトルデータ積算値ΣI(K)nを、それぞれピクセル単位で求める。上述の例の場合、
【数3】
として演算するわけである。そして、画面全体の構成ピクセルそれぞれについての当該演算を行い、その結果を反映させた画像を生成する。
【0127】
465[nm]から495[nm]のスペクトルに対応する画像をA、520[nm]から550[nm]のスペクトルに対応する画像をBとする。カルシウムイオン濃度の上昇とともに試料からの蛍光スペクトルはエネルギ移動により、画像Bは明るさを増し、画像Aは暗くなる。
【0128】
そしてカルシウムイオン濃度を求めるために、
【数4】
但し、αは検査者が定めることのできる適宜な定数である。
を演算する。
【0129】
そして、演算により求めたカルシウムイオン濃度を表わす画像表示のためのデータによる画像をCとすれば、1画像毎に図4(b)に示すように、画像A,B,Cが得られるので、例えば、n=1の画像のための走査が終了段階でそのn=1の画像は生成が可能であるから、その生成画像を表示するようにする。
得られたこれらの画像は大容量記憶装置34に保存させ、また、モニタ装置33に表示させるので、検査者はこの表示画像を観察することになる。
【0130】
n=2の画像のためのレーザ走査が終了した段階で、n=2の画像を生成し、大容量記憶装置34に保存し、また、n=1の画像に代えてそのn=2の画像を表示し、n=3の画像のためのレーザ走査が終了した段階でn=3の画像を生成し、大容量記憶装置34に保存し、また、n=2の画像に代えてそのn=3の画像を表示し、…と云う具合に、画像A,B,Cを走査終了の度に画像の生成とその生成した画像のモニタ装置33への更新表示を実施する。これにより試験の状況を把握しながら、時間経過観察ができることになる。
【0131】
また、生成画像は大容量記憶装置34に保持させてあるので、所定回(前記例では50画面に亘って)のレーザ走査終了後に当該保持させてある所定枚(前記例では50枚)の画像を順次表示すれば細胞内カルシウムイオン濃度の変化を動画として表示して時間経過観察することができる。
【0132】
すなわち、この実施形態においては時間経過観察のために試料走査は所定回数だけ間欠的に行われ、前記画像表示は各レーザ走査終了毎にあるいは全枚数分の画像取得のためのレーザ走査全てが完了した後に所定回数行われるようにした。
【0133】
また、レーザ走査によって収集された各ピクセル毎のスペクトル分布のデータは保存されているので、選択するスペクトル範囲は何度でも再設定し直して画像表示できることから、カルシウムイオン濃度の変化を表わす最善の画像を得ることができる。
【0134】
このようにこの実施形態に示したものは、レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、スペクトルデータの収集時に、あらかじめレーザ光源の出力レーザ波長成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとにした画像を表示するように構成したものであり、レーザ光による試料の走査終了のたびに画像表示を更新するようにして経過を逐次、把握できるようにしたものである。
【0135】
そのため、試験を実施しながらその状況を把握できるので、状況如何により試験継続か中止かを判断できるようになり、もし、試験が上手くいっていないようであるならば、そこで試験を中止する等の対応ができて、時間の浪費をせずに済むようになる等の効果が得られる。
【0136】
従って、この実施形態においては、1画面分の走査を終えると時間をおいて再びレーザ光による試料の1画面分の走査を実施する間欠走査において、一つの走査が終了するたびに画像表示されるので、検査者は試験途中でCFP,YFPそれぞれの画像と、カルシウムイオン濃度の変化を確認できる。そのため、もし、試験がうまくいっていないようならば、そこで試験を中止する等の対応をとることができ、時間の浪費をせずに済むようになる。
【0137】
尚、上記例ではレーザ光源としてヘリウムカドミウムレーザ光源を用いて1光子励起で観察を行っているが、モードロックチタンサファイヤレーザ等の赤外域の波長を有する超短パルスレーザ光源を用いて、2光子励起観察を行い、これよりも短い2つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像表示するように設定し、走査終了のたびに演算結果の画像表示を更新するようにしてもよい。ここで、2光子励起(2光子励起法)とは吸収波長の何倍化の波長を有する長波長のレーザ光を高密度で照射することにより、焦点面で局所的に蛍光分子を励起する方式で多光子励起法とも呼ばれるものであり、ピンホールなしで共焦点観察法と同等なセクショニング画像を得ることができる手法である。
【0138】
そして、このような超短パルスの長波長レーザ光を用いて、2光子励起によりデータを取得する方法は細胞に対する光毒性が少なく、より長時間に亙る観察が可能になる。
【0139】
また、この例では1次元のCCDを用いたが、試料からの光束が集光レンズ16により集光され、ここで形成される回折スポット径がCCDの画素サイズよりも大きい場合は2次元CCDを用いる構成としてもよい。これにより、スポット径が大きい場合に、試料からの光を効率良く検出でき、S/Nの良いデータを取得することができるようになる。
【0140】
なお、本発明は上述した実施形態に示す例に限定されるものではなく、種々変形して実施可能である。
【0141】
また、本発明において、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出され得るものである。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題の少なくとも1つが解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果の少なくとも1つが得られる場合には、当該実施形態での構成要件が一部削除された構成についても発明として成立し得るものである。
【0142】
【発明の効果】
本発明によれば、走査ピクセル毎にスペクトルデータを有しており、画像表示のためのスペクトル域を自由に選択することができ、しかも何度でもスペクトル域の指定を変更できるので、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行う場合でも、最適な解析結果を得ることのできる、自由度の高い走査型レーザ顕微鏡を提供することができる。
【0143】
さらに、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で蛍光波長の部分的な重なり(クロスオーバ部分)を効率良く除去して画像表示することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施形態を説明するための図である。
【図2】本発明を説明するための図であって、本発明の走査型レーザ顕微鏡における分光器の構成例を説明するための図である。
【図3】得られたスペクトルの例とスペクトル範囲指定の例およびその遷移状況の例を説明するための図である。
【図4】本発明の第2の実施形態を説明するための図である。
【図5】従来技術を説明するための図である。
【図6】従来技術を説明するための図である。
【図7】従来技術を説明するための図である。
【図8】従来技術を説明するための図である。
【符号の説明】
1…レーザ光源、 2…レーザ光束
3…ビームエクスパンダ、
4…レーザラインフィルタ
5…ダイクロイックミラー、6…X−Y走査光学系
7…瞳投影レンズ、 8…結像レンズ
9…対物レンズ、 10…試料
11…共焦点レンズ、 12…共焦点絞り
13…コリメートレンズ、14…分光器
15…プリズム、 16…集光レンズ
17…1次元CCD、 20…試料からの光束
30…信号処理装置、 31…制御装置
32…コンピュータ、 33…モニタ装置
34…ハードディスク装置(HDD)[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a scanning laser microscope capable of obtaining spectral data by spectrally scanning light from a specimen obtained by scanning a stained specimen with laser light.
[0002]
[Prior art]
In order to facilitate observation of cells and tissues, staining with a staining reagent is performed. There are various types of reagents for staining, and there are a reagent that is easily dyed and a reagent that is difficult to be dyed depending on components. Utilizing this, a sample (specimen) is stained with a desired reagent according to the purpose and used for microscopic observation. Now, one step further, we irradiate a sample stained with multiple types of fluorescent reagents with laser light, and collect the spectral data obtained by spectroscopically analyzing the fluorescent radiation excited from the reagents by this laser light irradiation. It is used for analysis.
[0003]
For this purpose, a scanning laser microscope is used, which condenses laser light through an objective lens, scans the sample with a scanning device, applies light from the sample to a spectroscope, and performs spectroscopy. By obtaining spectral data in synchronization with the scanning signal from the scanning device, spectral information of light from the laser irradiation position on the sample is obtained.
[0004]
(Prior art 1)
As an example of a scanning laser microscope, there is a technique as shown in JP-T-9-502269. The technique disclosed here splits the fluorescent light beam by spectral decomposition means such as a prism, narrows the first spectral range on the one hand, and reflects at least a part of the spectral range that does not pass through the diaphragm to form the second spectral range. This is a confocal scanning laser microscope configured with two optical paths and a photodetector provided for each of the optical paths.
[0005]
FIG. 5 is a diagram showing a configuration of the confocal scanning laser microscope. The
[0006]
A
[0007]
FIG. 6 is a diagram showing the configuration of the
[0008]
Furthermore, the
[0009]
(Prior art 2)
As another example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-56244 discloses wavelength selection for both or one of the illumination light and the light from the object that are divided while being dispersed, such as reflected light and fluorescence. A scanning laser microscope is disclosed having at least one micromirror array (DMD) that can be selectively switched for illumination and / or detection step.
[0010]
The configuration of the scanning laser microscope disclosed in this publication is as shown in FIG. That is, in this configuration, the laser light LB from the laser light source Ls is scanned in an XY manner on the sample Smp by being scanned by the scanning means Scn so as to move the position intermittently, and the sample Smp at the scanning position is scanned. Emits fluorescence excited by the laser beam LB.
[0011]
The (fluorescent) radiation emitted from the sample Smp is focused onto the confocal pinhole Ph located in a plane conjugated with the object. The pinhole Ph is also an opening of the spectroscopic device, and the spectroscope using the prism P separates the sample radiation into its spectral components by the dispersion action of the prism P. There is a one-dimensional DMD at the focal plane of the sample radiation, where the sample spectrum is optically imaged.
[0012]
A one-dimensional DMD is composed of a number of switching mirrors that can be individually driven. Then, while the laser beam LB from the laser light source Ls stays on the sample Smp, the mirrors are sequentially driven one by one (and switched by this), so that the light that has been split and reached at that position To the detector Dtc. In this way, the individual spectral components of the sample radiation are sequentially detected by the detector Dtc and the total spectral data of the (fluorescence) radiation emitted from the sample Smp is obtained.
[0013]
As another method, a plurality of mirrors can be simultaneously driven to selectively guide light in a desired spectral range from the sample to the detector.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
In recent years, not only single staining but also multiple staining is frequently used in fluorescence observation. Naturally, fluorescent staining is performed to make it possible to visually recognize a specific target in a cell or tissue. For this reason, in the multiple staining observation, each stained part must be detected as a clear color difference, that is, a difference in fluorescence wavelength. Moreover, it is necessary to efficiently remove and detect a partial overlap (crossover portion) of the fluorescence wavelengths.
[0015]
Furthermore, fluorescent probes for detecting intracellular calcium ion concentration have been widely used for studying cell functions. This is because calcium ions are closely related to cell activity. For staining calcium ions, “INDO-1” is well known as a fluorescent reagent. By using “INDO-1”, the intracellular calcium ion concentration can be quantitatively measured.
[0016]
A sample (specimen) stained with “Indo-1” emits fluorescence when irradiated with UV light (ultraviolet rays). Then, the generated fluorescence is detected in two different wavelength ranges (center wavelength 405 [nm] and 480 [nm]), and the ratio of detected light quantity (fluorescence of center wavelength 405 [nm] / center wavelength 480 [nm] By calculating (fluorescence), the calcium ion concentration can be measured.
[0017]
The sample is repeatedly scanned with laser light using a scanning laser microscope, and the time change of the intracellular calcium ion concentration is measured by the above calculation. In general, fluorescence from a sample is branched into two optical paths at 450 [nm] by a dichroic mirror having an optical characteristic that reflects light in a specific wavelength band and transmits others, and one has a center wavelength of 405 [ nm], a band width of about 20 [nm], and the other is a bandpass filter BPF1, BPF2 having a center wavelength of 480 [nm] and a band width of about 20 [nm], thereby narrowing the detection wavelength region.
[0018]
However, the central wavelength of the fluorescence shifts depending on the state of the cell, for example, pH (pH; hydrogen ion concentration). For example, if the central wavelengths of the Ca2 + max and Ca2 + min fluorescence are shifted to O1 and O2 as shown in FIG. 8, the center wavelengths BPF1o and BPF2o of the bandpass filters BPF1 and BPF2 and the fluorescent Ca2 are used in this case. Deviation occurs between the central wavelengths O1 and O2 of + max and Ca2 + min. As a result, the amount of light that should be originally obtained cannot be obtained, and not only the S / N (signal / noise) of the data deteriorates. The calculation result represented by the light quantity ratio may be different from the value that should be originally obtained.
[0019]
That is, the filter set as described above in the
[0020]
On the other hand, since the apparatus of Japanese Patent Publication No. 9-502269 can freely change the wavelength range of fluorescence from the sample guided to each detector, it is effective in solving the above-mentioned problems in the
[0021]
However, in the above-described example of measuring the intracellular calcium ion concentration, the state of the cell, for example, pH is unknown to the examiner, and where the central wavelength of the fluorescence is located, a partial overlap of the fluorescence wavelengths (crossover portion) ) Has no way of knowing in advance exactly what level it is, there is a problem of not knowing whether the results obtained are the best.
[0022]
That is, even if the change in calcium ion concentration can be captured, the inspector never knows whether the result is the best, and there is no guarantee that the best result will be obtained. is there.
[0023]
If it is possible to repeat the test by trial and error, it is possible to bring the obtained result closer to the optimum one. However, in this type of test, once the data is acquired, the sample must basically be exchanged (generally, the test is started by applying a stimulus with a chemical. Stimulation of the second time is ineffective.) Therefore, enormous labor and cost are required for cell preparation and the like, and it must be said that it is difficult in practice.
[0024]
Thus, the fundamental drawback of the above-described prior art is that only a preset spectrum, that is, the average intensity of fluorescence passing through the slit, can be used to form an image of the sample.
[0025]
On the other hand, in the technique disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2000-56244, when collecting all spectral data when obtaining fluorescence spectral data from a sample, the DMD mirror elements are driven one by one and the sample is applied to the photodetector. Therefore, it is necessary to derive the spectral spectrum of the fluorescence from the light source, so that it takes a long time to obtain the spectral data of the entire spectral region.
Therefore, it is an unsuitable device for observing and measuring a phenomenon that changes rapidly such as intracellular calcium ion concentration. Therefore, in the prior art, it is impossible to observe and measure a phenomenon that changes rapidly such as intracellular calcium ion concentration. Therefore, the rapid development of technology to overcome this is eagerly desired.
[0026]
Therefore, the object of the present invention is to obtain an optimal analysis result when performing a test or imaging in which the fluorescence spectrum from the sample cannot be accurately known as in the case of measuring the intracellular calcium ion concentration. An object of the present invention is to provide a scanning laser microscope that can be obtained reliably.
[0027]
Another object of the present invention is to provide a scanning laser microscope that can collect data at once for the entire spectrum of light emitted from a stained sample.
[0028]
In addition, an object of the present invention is to provide a scanning laser microscope capable of displaying an image reflected on a desired spectrum with a small number of scans in order to prevent fading of a sample in multiple staining observation. There is to do.
[0029]
In addition, the purpose of the present invention is to prevent partial discoloration of the fluorescence wavelength by a small number of scans, preferably one scan, in order to prevent discoloration of the sample in multiple staining observation. An object of the present invention is to provide a scanning laser microscope capable of efficiently removing images and displaying images.
[0030]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems and achieve the object, the scanning laser microscope of the present invention is configured as follows.
[0031]
[1] The laser light from the laser light source is focused on the sample to be observed and irradiated, and the laser light is moved and scanned with respect to the sample, and the light obtained from the sample is dispersed by the spectroscopic means.InspectionIn a scanning laser microscope that obtains spectral data by
EnterUsing a one-dimensional light detection means in which a plurality of minute light receiving elements that generate an electrical signal corresponding to the amount of incident light are linearly arranged, the spectral output of the spectroscopic means is placed in the minute light receiving element arrangement range of the one-dimensional light detection means. Spectral data is obtained in units of pixels by making the incident relationship between the incident position and the wavelength range incident with a predetermined relationship.A detector;
Means for collecting and storing electrical signals obtained from each micro light receiving element of the detector as spectral distribution data in pixel units;
Means for receiving an instruction of a spectral range for image display;
Means for extracting and adding data corresponding to the designated spectral range from the stored data, and generating an image of the spectral range;
Means for displaying the generated imageWith,
The instruction input of the spectral range and the image generation and display of the corresponding spectral range can be repeatedly performed based on the same stored and stored data.It is characterized by that.
[2] In addition, in the configuration of the item [1], the means for receiving an instruction for the spectral range includes an interface for specifying the desired spectral range from the spectral distribution displayed on the screen. Features.
[0032]
By focusing and irradiating a laser beam from a laser light source on a sample to be observed, moving and scanning the laser beam with respect to the sample, spectrally separating the light obtained from the sample by a spectroscopic unit, and detecting it by a detecting unit Spectral data for each point in the sample is obtained. For example, spectral data is obtained by using a spectroscopic means such as a prism, and spectrally splitting the spectroscopic means so as to enter the one-dimensional light detecting means. The one-dimensional light detecting means has a configuration in which a plurality of minute light receiving elements are arranged linearly (one-dimensionally), and the spectral output of the spectroscopic means is incident on the minute light receiving element array range of the one-dimensional light detecting means. Since the position and the wavelength range are arranged so as to be incident with a corresponding relationship, the incident wavelength range is determined depending on where the minute light receiving element is located. Therefore, since the light of a specific wavelength region of the spectrum is incident on the minute light receiving element at the specific position, a signal corresponding to the incident light amount is obtained from each minute light receiving element, and this is converted into digital data for each light receiving element, If the light receiving elements are collected in the order of arrangement, there is an effect that the wavelength components can be specified, that is, the data can be collected as data in which all the spectral distributions are known.
[0033]
In addition, since the laser light applied to the sample is moved and scanned over the sample, the data collected at that time is the data of the emitted light at the laser light irradiation point on the sample, and constitutes a screen determined by the scanning range. It becomes spectral distribution data in pixel units. Therefore, it can be collected as data from which all spectral distributions can be grasped for each pixel.
[0034]
Therefore, according to the present invention, a technique is established that can acquire all fluorescence spectral data from a sample at once in a short time. In addition, according to the present invention, an optimal analysis result is reliably obtained when performing a test or imaging in which the fluorescence spectrum from a sample cannot be accurately known, as in the case of measuring intracellular calcium ion concentration. It is possible to provide a scanning laser microscope.
[0035]
Further, in the multiple staining observation, it is possible to provide a scanning laser microscope capable of collecting necessary fluorescence spectrum data with a small number of scans in order to prevent discoloration of the sample.
[0037]
According to this configuration, the data obtained by collecting the electrical signals obtained from the micro light receiving elements of the detector are collected for the screen configuration, stored and stored, and an image is generated using the stored data. Since all spectrum distributions are collected as data that can be grasped every time, various spectrum ranges can be specified as desired, and images based on the spectra in the specified ranges can be displayed. Therefore, once data is collected, An optimal image can be found by generating various images using the data.
[0038]
Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a scanning laser microscope capable of displaying an image reflected on a desired spectrum with a small number of scans in order to prevent fading of a sample in multiple staining observation.
[0039]
[3] In the configuration of the item [1],The means for accepting an indication of the spectral range accepts an indication of at least two types of spectral ranges that are longer than the output laser wavelength of the laser light source,
The means for generating an image of the spectral range extracts and adds data corresponding to the two specified spectral ranges from the held data, and calculates a ratio between the two to obtain the ratio. An image based on the generated image, and output the generated image until the next image is generated,
The display means displays the output image.
[0040]
In this configuration, when scanning for one screen is completed, an image is displayed every time one scanning is completed in intermittent scanning in which scanning for one screen of the sample by laser light is performed again after a while. The person can check how the image changes. For this reason, if the test does not go well, it is possible to take measures such as stopping the test there, so that time is not wasted.
[0041]
In addition, the present invention may include the following aspects.
[0042]
(1) The scanning laser microscope of the present invention condenses laser light through an objective lens, scans the sample with a scanning device, projects the light from the sample onto the spectroscope, and emits light from the scanning device. A scanning laser microscope capable of obtaining spectroscopic data corresponding to a predetermined spectral band in synchronization with a scanning signal, wherein in the spectroscopic data, only data in a desired spectral region is extracted and calculated, and the calculation result Based on the above, an image is displayed after the scanning is completed.
[0043]
(2) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope described in (1) above, and again performs data computation by changing a desired spectral range, and again based on the computation result. An image is displayed, and this sequence is repeated.
[0044]
(3) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope according to (1) or (2) above, wherein a plurality of desired spectral regions are designated in the spectral data, and Only data is extracted and calculated, and an image is displayed on at least one image plane based on the calculation result.
[0045]
(4) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope according to the above (1) or (2), wherein a plurality of desired spectral regions are designated in the spectral data, and each of these spectral regions is specified. Only data is extracted and calculated, and based on the calculation result, images corresponding to the plurality of designated spectral regions are displayed on each image plane.
[0046]
(5) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope according to any one of (1) to (4) above, and the image display shows a total value of data (light intensity data) in a desired spectral region. This is what we do.
[0047]
(6) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope described in (3) above, wherein two desired spectral regions are designated, and only data in each spectral region is extracted, A value is calculated, a ratio of these total values is calculated, and an image is displayed based on the calculation result.
[0048]
(7) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope according to the above (1) to (6), and the image display includes data (light intensity data) of the entire spectral region excluding the laser wavelength. It is set in advance to perform based on the total value of data (light intensity data) in a longer spectral range excluding the total value or laser wavelength.
[0049]
(8) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope according to the above (1) to (6), and the image display is data (light intensity data) of the entire spectral region excluding the laser wavelength. It is set in advance to perform based on a total value of data (light intensity data) in a shorter spectral range excluding the total value or laser wavelength.
[0050]
(9) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope described in (1) above, wherein the spectroscope includes a one-dimensional or two-dimensional CCD array.
[0051]
(10) The scanning laser microscope of the present invention is the scanning laser microscope described in (1) above, in which the sample scan is intermittently performed a predetermined number of times for time-lapse observation, and the image display is performed after scanning. It is performed a predetermined number of times.
[0052]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention allows spectral data of fluorescence from a sample stained with a reagent to be acquired over the entire spectral range in a short time, and from the acquired spectral data of the entire spectral range, a desired value can be obtained. Analysis and image display can be performed using spectral data in the spectral region, and details of embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
[0053]
(First embodiment)
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a confocal scanning laser microscope according to the first embodiment of the present invention. In the figure,
[0054]
A
[0055]
6 is an XY scanning optical system, 7 is a pupil projection lens, 8 is an imaging lens, 9 is an objective lens, and 10 is a sample. The
[0056]
Further, 11 is a confocal lens, 12 is a confocal stop, 13 is a collimating lens, and 15 is a prism. The
[0057]
The
[0058]
The
[0059]
The
[0060]
Since the fluorescence emitted from the
[0061]
The XY scanning
[0062]
As shown in FIG. 2, the one-
[0063]
The
[0064]
31 is a control device for driving and controlling the XY scanning
[0065]
The
[0066]
Next, the operation of this apparatus having such a configuration will be described. Let us consider a case in which a measurement relating to intracellular calcium ion concentration is to be carried out. In this case, “INDO-1” is used as a fluorescent reagent for staining the
[0067]
Thereafter, laser light is emitted from the
[0068]
The
[0069]
Here, the laser beam focusing point with respect to the
[0070]
The
[0071]
The
[0072]
Therefore, the arrangement position of each light receiving cell and the wavelength range of the spectrum to be dispersed have a specific relationship. The wavelength of the spectrum obtained by the spectrum and the position of the light receiving cell for detecting the spectrum of that wavelength in the one-
[0073]
Therefore, the light separated for each wavelength by being spectrally resolved by the
[0074]
The electric charges generated in this way are read in order according to the arrangement order of the light receiving cells, and are given to the
[0075]
The
[0076]
When the data collection at one point is finished, the
[0077]
The
[0078]
The above-described one-
[0079]
The
[0080]
When one image having a 256 × 256 pixel configuration is acquired in one second, the transfer rate for transferring data from the
[0081]
Further, by mounting a 1 [GByte] memory in the
[0082]
From the above, for the sample to be observed, for every pixel, it covers the entire spectrum, and includes light intensity data for each component (data of spectral distribution characteristics for each pixel) for 50 seconds (50 images). Time-lapse observation data can be obtained.
[0083]
Here, as shown below, the entire spectrum data sequence for each image pixel (Xi, Yj) n (where (Xi, Yj) is the pixel position and n is the nth scanned image) For each spectral component, I (K1) n, I (K2) n, I (K3) n,..., I (Km) n, for example, I (350) n, I (351) n, I (352 ) N,...,..., I (605) n (n = 1 to 50, and K1, K2,... Indicate wavelengths. If I (350) n, n. The incident light amount value at the wavelength 350 [nm] of the first image, and I (351) n indicates the incident light amount value at the wavelength 351 [nm] of the nth image).
[0084]
The above is the data collection of spectral components in the scanning laser microscope of the present invention. Next, an image display method will be described.
[0085]
After acquiring the data, the examiner selects a spectral range for displaying an image. This is performed by software of the
[0086]
The
[0087]
For example, a distribution chart of spectral characteristics is displayed in a graph from collected spectrum data, and a desired spectral range is designated on the displayed distribution chart. As a result, it is assumed that two spectral ranges are designated as shown by hatched areas denoted by symbols p and q in FIG. That is, one is a range (p) from a wavelength of 390 [nm] to 420 [nm], and the other is a range (q) from 465 [nm] to 485 [nm].
[0088]
Receiving this designation information, the
[Expression 1]
Is calculated as follows. Then, the calculation is performed for each pixel constituting the entire screen, and an image reflecting the result is generated.
[0089]
An image corresponding to a spectrum from 390 [nm] to 420 [nm] is A, and an image corresponding to a spectrum from 465 [nm] to 485 [nm] is B. Assuming that the fluorescence spectrum from the
[0090]
And to find the calcium ion concentration,
[Expression 2]
Here, α is an appropriate constant that can be determined by the examiner.
Is calculated.
[0091]
For example, a sample (specimen) stained with “INDO-1” irradiates UV light (ultraviolet rays) to emit fluorescence excited from the sample in two different wavelength ranges (central wavelengths 405 [nm] and 480 [ nm]) and calculating the ratio of the detected light quantity (fluorescence with central wavelength 405 [nm] / fluorescence with central wavelength 480 [nm]), the calcium ion concentration can be measured.
[0092]
Therefore, the calcium ion concentration can be obtained by performing the calculation of [Equation 2] using the
[0093]
Such a calcium ion concentration is obtained for each pixel, and when such calculation is completed for all pixels on one screen, the
[0094]
Then, assuming that the data for image display representing the obtained calcium ion concentration is C, images A, B, and C are obtained for each image as shown in FIG. Then, images of A, B, and C for 50 sheets are obtained. These obtained images are displayed on the
[0095]
In the above example, since 50 images are obtained, if these 50 images are sequentially displayed, a change in intracellular calcium ion concentration can be displayed as a moving image.
[0096]
In the scanning laser microscope apparatus shown in the present embodiment, since all the data of the spectrum components that are the base are stored in the memory of the
[0097]
As described above, in this embodiment, the laser light from the laser light source is focused on the sample to be observed and irradiated, and the laser light is moved and scanned with respect to the sample, and the light obtained from the sample is spectroscopic means. In the scanning laser microscope in which spectrum data is obtained by performing spectroscopy with a detector and detecting with a detector, the detector densely and linearly arranges a plurality of minute light receiving elements that generate an electrical signal corresponding to the amount of incident light. The arrayed one-dimensional light detecting means is used, and the spectral output of the spectroscopic means is arranged so that the incident position and the wavelength region are incident on the minute light receiving element array range of the one-dimensional light detecting means with a predetermined relationship. It is what I did.
[0098]
Further, an optical system for condensing the spectral output of the spectroscopic means in the micro light receiving element array range of the one-dimensional photodetecting means so that the incident position and the wavelength range have a predetermined relationship is provided.
[0099]
Further, the signal processing means (signal processing device 30) for obtaining the data in the order of the arrangement of the micro light receiving elements by converting the output electric signal of each micro light receiving element of the one-dimensional light detecting means into a digital signal, and holding the obtained data And holding means.
[0100]
Further, the data held in the holding means is used to extract data in a designated spectral range, and an image is generated using spectral components in the designated range.
[0101]
By focusing and irradiating laser light from a laser light source on the sample to be observed, moving and scanning the laser light on the sample, and separating the light obtained from the sample with a spectroscopic means and detecting it with a detector Spectral data for each point in the sample is obtained. For example, spectral data is obtained by using a spectroscopic means such as a prism, and spectrally splitting the spectroscopic means so as to enter the one-dimensional light detecting means. The one-dimensional light detecting means has a configuration in which a plurality of minute light receiving elements (light receiving cells) are arranged densely and linearly (one-dimensionally), and the spectral output of the spectroscopic means is received by the minute light receiving of the one-dimensional light detecting means. Since the incident position and the wavelength range are related to each other in the element arrangement range, the incident wavelength range is determined depending on where the minute light receiving element is located. Accordingly, the light receiving element at a specific position is configured to receive light in a specific wavelength region of the spectrum. Therefore, the data corresponding to the amount of incident light is obtained from each minute light receiving element, converted into digital data for each light receiving element, and collected in the order in which the light receiving elements are arranged, that is, data in which the wavelength component can be specified, that is, data in which all spectral distributions are known. It has the effect of being collected as.
[0102]
Moreover, since the laser light applied to the sample is moved so as to perform XY scanning on the sample, the data collected at that time is data of emitted light at the irradiation point of the laser light on the sample, and XY This is spectral distribution data in units of pixels constituting a screen determined by the scanning range. Therefore, it can be collected as data from which all spectral distributions can be grasped for each pixel. This data is collected for each screen configuration, stored and saved, and an image is generated using this saved data. Since all the spectral distribution is collected for each pixel, it is collected in various desired spectral ranges. It is possible to designate and display an image with a spectrum in the designated range. Therefore, once data is collected, an optimum image can be found by generating various images using the data.
[0103]
In fluorescence observation of a sample stained with a fluorescent reagent (fluorescent stained sample), not only single staining but also multiple staining is frequently used. In particular, fluorescent staining is used to make it possible to visually recognize specific objects in cells and tissues. Often done. For this reason, in the multiple staining observation, each stained part must be detected as a clear color difference, that is, a difference in fluorescence wavelength. In addition, it is necessary to detect by removing a partial overlap (crossover portion) of the fluorescence wavelength.
[0104]
In the present invention, it is possible to collect all the spectral distribution for each pixel as data that can be grasped. This data is collected and stored for the screen configuration, and an image in a desired spectral range is generated using the stored data. Since it is saved, the spectrum range can be repeatedly specified and displayed again and again, so the image can be displayed. Once data has been collected, it is optimal to generate various images using that data. It becomes possible to find an image in a proper state.
[0105]
Multiple spectral region ranges can be specified at the same time. In addition, the spectral component data in the specified spectral region is added to generate an image based on the spectral component in the specified region. Etc. can be obtained by calculation, and the image of the obtained ion concentration can be displayed or synthesized with other images, so that it is possible to provide detailed information about the test result to the inspector. .
[0106]
In the above example, a two-dimensional image is targeted, but it goes without saying that line scanning (one-dimensional) may be used. In this case, a horizontal axis of scanning is taken in the horizontal direction of the image, and time (or the number of scans) is taken in the vertical axis. Moreover, although the example which used the prism for the spectroscopy was shown, this may use a diffraction grating and can be used if it is a means which can carry out spectroscopy.
[0107]
The above is a method that collects and holds spectral distribution data for each pixel, determines the desired spectral region using the stored data, and obtains an image based on the components of that region. However, the situation can be grasped, it can be judged whether the test is continued or stopped depending on the situation, and if the test does not seem to be successful, the test can be stopped there, etc. Next, an embodiment that eliminates the need for wasting will be described as a second embodiment.
[0108]
(Second Embodiment)
In this embodiment, when spectral data is collected, the total value of data in two spectral regions longer than this, excluding the output laser wavelength component of the laser light source, is calculated, and the ratio for each pixel is calculated. An image is displayed based on the calculation result, and the image display is updated every time one screen of the sample is scanned with the laser so that the progress can be grasped sequentially.
[0109]
FIG. 4A is a diagram showing a configuration of a confocal scanning laser microscope according to the second embodiment of the present invention. Also in this embodiment, the basic configuration may be the same as that described in the first embodiment. However, in the second embodiment, a helium cadmium laser light source having an oscillation line of 442 [nm] is used as the
[0110]
The operation of the apparatus having the configuration disclosed in this embodiment will be described. Here, it is assumed that the
[0111]
A
[0112]
The laser beam having a wavelength of 442 [nm] that has passed through the
[0113]
[0114]
The fluorescent protein at the arrival position is excited by the laser beam reaching the
[0115]
Here, the laser beam focusing point with respect to the
[0116]
A
[0117]
The
[0118]
In synchronism with the sampling signal of the
[0119]
For example, the one-
[0120]
The
[0121]
Therefore, the data output from the
[0122]
Since the range of XY scanning by the XY scanning
[0123]
When one image is acquired every 60 seconds, the transfer rate required from the
[0124]
In this embodiment, the processing in the
[0125]
That is, two spectrum ranges are designated in advance. One is from 465 [nm] to 495 [nm], and the other is from 520 [nm] to 550 [nm].
[0126]
Receiving this designation information, the
[Equation 3]
Is calculated as follows. Then, the calculation is performed for each pixel constituting the entire screen, and an image reflecting the result is generated.
[0127]
An image corresponding to a spectrum from 465 [nm] to 495 [nm] is A, and an image corresponding to a spectrum from 520 [nm] to 550 [nm] is B. As the calcium ion concentration increases, the fluorescence spectrum from the sample increases in brightness due to energy transfer, and the image A becomes darker.
[0128]
And to find the calcium ion concentration,
[Expression 4]
Here, α is an appropriate constant that can be determined by the examiner.
Is calculated.
[0129]
Then, if an image based on data for image display representing the calcium ion concentration obtained by calculation is C, images A, B, and C are obtained for each image as shown in FIG. For example, since the n = 1 image can be generated at the end of scanning for the n = 1 image, the generated image is displayed.
These obtained images are stored in the large-
[0130]
When the laser scanning for the image of n = 2 is completed, an image of n = 2 is generated and stored in the
[0131]
Further, since the generated image is held in the large-
[0132]
That is, in this embodiment, the sample scan is intermittently performed a predetermined number of times for the time lapse observation, and the image display is completed at the end of each laser scan or all of the laser scans for acquiring all the images. After a certain number of times.
[0133]
In addition, since the spectral distribution data for each pixel collected by laser scanning is stored, the selected spectral range can be reset and displayed again and again, so that the best representation of changes in calcium ion concentration is possible. An image can be obtained.
[0134]
As described above, in this embodiment, the laser light from the laser light source is focused on the sample to be observed and irradiated, and the laser light is moved and scanned with respect to the sample, and the light obtained from the sample is dispersed. In a scanning laser microscope in which spectral data is obtained by spectroscopically detecting and detecting with a detector, when collecting spectral data, the output laser wavelength component of the laser light source is removed in advance. It is configured to calculate the total value of data in the spectral range, calculate the ratio for each pixel, and display an image based on these calculation results. As the image display is updated, the progress can be grasped sequentially.
[0135]
Therefore, since the situation can be grasped while conducting the test, it becomes possible to judge whether the test is continued or stopped depending on the situation, and if the test does not seem to be successful, the test is stopped there. Can be obtained, and the effect of not wasting time can be obtained.
[0136]
Therefore, in this embodiment, when scanning for one screen is completed, an image is displayed every time one scanning is completed in intermittent scanning in which scanning for one screen of the sample by laser light is performed again after a while. Therefore, the inspector can check the images of CFP and YFP and the change of the calcium ion concentration during the test. For this reason, if the test is not successful, it is possible to take measures such as stopping the test there, so that time is not wasted.
[0137]
In the above example, a helium cadmium laser light source is used as a laser light source for observation by one-photon excitation. However, an ultrashort pulse laser light source having an infrared wavelength such as a mode-locked titanium sapphire laser is used for two-photon excitation. Excitation observation is performed, the total value of data in two shorter spectral ranges is calculated, the ratio for each pixel is calculated, and an image is displayed based on these calculation results. You may make it update the image display of a calculation result each time. Here, the two-photon excitation (two-photon excitation method) is a method in which fluorescent molecules are excited locally at the focal plane by irradiating a long-wavelength laser beam having a wavelength multiple of the absorption wavelength at a high density. It is also called the multiphoton excitation method, and is a technique that can obtain a sectioning image equivalent to the confocal observation method without a pinhole.
[0138]
A method of acquiring data by two-photon excitation using such an ultrashort pulsed long-wavelength laser beam has less phototoxicity to cells and enables observation over a longer time.
[0139]
In this example, a one-dimensional CCD is used. However, when the light beam from the sample is collected by the
[0140]
The present invention is not limited to the examples shown in the above-described embodiments, and can be implemented with various modifications.
[0141]
In the present invention, the above embodiment includes inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent elements. For example, even if some constituent elements are deleted from all the constituent elements shown in the embodiment, at least one of the problems described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and is described in the column of the effect of the invention. When at least one of the effects is obtained, a configuration in which the configuration requirements in the embodiment are partially deleted can also be realized as an invention.
[0142]
【The invention's effect】
According to the present invention, the spectral data is provided for each scanning pixel, the spectral range for image display can be freely selected, and the designation of the spectral range can be changed any number of times. To provide a scanning laser microscope with a high degree of freedom that can obtain optimal analysis results even when performing tests or imaging in which the fluorescence spectrum from a sample cannot be accurately known, such as measuring the ion concentration Can do.
[0143]
In addition, in order to prevent fading of the sample during multiple staining observation, a scanning laser microscope that can efficiently remove partial overlaps (crossover portions) of fluorescence wavelengths and display images with a small number of scans is provided. can do.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram for explaining a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining the present invention and a diagram for explaining a configuration example of a spectroscope in a scanning laser microscope of the present invention.
FIG. 3 is a diagram for explaining an example of an obtained spectrum, an example of spectrum range designation, and an example of a transition state thereof.
FIG. 4 is a diagram for explaining a second embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a diagram for explaining a conventional technique.
FIG. 6 is a diagram for explaining a conventional technique.
FIG. 7 is a diagram for explaining a conventional technique.
FIG. 8 is a diagram for explaining a conventional technique.
[Explanation of symbols]
1 ... laser light source, 2 ... laser beam
3 ... Beam expander,
4 ... Laser line filter
5 ... Dichroic mirror, 6 ... XY scanning optical system
7 ... Pupil projection lens, 8 ... Imaging lens
9 ... Objective lens, 10 ... Sample
11 ... Confocal lens, 12 ... Confocal stop
13 ... Collimating lens, 14 ... Spectroscope
15 ... Prism, 16 ... Condensing lens
17 ... one-dimensional CCD, 20 ... luminous flux from sample
30 ... Signal processing device, 31 ... Control device
32 ... Computer, 33 ... Monitor device
34. Hard disk drive (HDD)
Claims (3)
入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を直線的に配列させた1次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの1次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とすることにより画素単位でスペクトルのデータを得る検出器と、
前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して画素単位でのスペクトル分布データとして記憶保存する手段と、
画像表示するためのスペクトル域の指示を受け付ける手段と、
前記記憶保存されたデータのうち、前記指示されたスペクトル域に対応するデータを抽出して加算し、前記スペクトル域の画像を生成する手段と、
前記生成された画像を表示する手段を備え、
スペクトル域の前記指示入力とそれに対応したスペクトル域の画像生成と表示を、前記記憶保存された同じデータに基づいて繰り返して実施可能にしたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。Moving to scan the laser beam to the sample with is irradiated by focusing the laser beam to a sample to be observed from the laser light source, by detect by divided by the spectral means the light obtained from a sample, the spectrum In a scanning laser microscope that can obtain the data of
Using a one-dimensional light detection means linearly are arranged a plurality of micro-light-receiving element for generating an electric signal to the input Shako amount corresponding the spectral output of the spectroscopic unit to the micro light-receiving element array range of the one-dimensional light detection means A detector that obtains spectral data in pixel units by adopting an arrangement relationship in which the incident position and the wavelength region are incident with a predetermined relationship ;
Means for collecting and storing electrical signals obtained from each micro light receiving element of the detector as spectral distribution data in pixel units;
Means for receiving an instruction of a spectral range for image display;
Means for extracting and adding data corresponding to the designated spectral range from the stored data, and generating an image of the spectral range;
Means for displaying the generated image ;
A scanning laser microscope characterized in that the instruction input of a spectral range and image generation and display of the corresponding spectral range can be repeatedly performed based on the same stored and stored data .
前記スペクトル域の画像を生成する手段は、前記保持されたデータのうち、前記指示された二種のスペクトル域に対応するデータをそれぞれ抽出して加算するとともに、両者の比を求めて当該比に基づく画像を生成し、次の画像を生成するまでの間、前記生成した画像を出力し、The means for generating an image of the spectral range extracts and adds data corresponding to the two specified spectral ranges from the held data, and calculates a ratio between the two to obtain the ratio. An image based on the generated image, and output the generated image until the next image is generated,
前記表示する手段が前記出力された画像を表示することを特徴とする請求項1記載の走査型レーザ顕微鏡。2. The scanning laser microscope according to claim 1, wherein the display means displays the output image.
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