JP2004184379A - Method of reading microarray - Google Patents
Method of reading microarray Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004184379A JP2004184379A JP2002355133A JP2002355133A JP2004184379A JP 2004184379 A JP2004184379 A JP 2004184379A JP 2002355133 A JP2002355133 A JP 2002355133A JP 2002355133 A JP2002355133 A JP 2002355133A JP 2004184379 A JP2004184379 A JP 2004184379A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microarray
- image
- fluorescent substance
- fluorescence
- excitation light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブを固定化して配列したマイクロアレイに、蛍光物質を付与した検体を反応させ、励起光を照射して、励起した蛍光の量を読取るマイクロアレイ読取方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。この解析方法においては、例えば、基板の表面、凹部、凸部またはキャピラリーの内壁部あるいはキャピラリー中空部に保持された高分子ゲル状物の区画の何れかに、例えば、異なる遺伝子ペプチド、タンパク質、抗体等の生体関連物質をプローブとして数十から数万個固定化したマイクロアレイを使用する。このプローブに対して、各種特異的反応を利用することにより、プローブとして使用された物質とその生体機能発現との関係を調べることができる。このような方法は、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするDNAマイクロアレイ法(DNAチップ法)と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論として開発されてきた。
【0003】
プローブと検体の反応物を検出する方法においては、まず、蛍光標識した検体と、マイクロアレイにプローブとして固定化された生体関連物質とを反応させる。次いで、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出することにより、蛍光標識された検体が、どのプローブと反応物を形成したかを検出することができる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光レーザースキャナーのような装置は、蛍光物質を励起するための励起光源としてレーザーを使用しているため、励起光波長帯が狭く、蛍光の波長帯との分離が比較的容易である。このため、蛍光を検出したときのS/Nとしては高い物が得られる。しかし、レーザーをスキャンするための機構が必要であり、比較的高価になりやすいと共に、メンテナンス性にも問題がある。
【0005】
これに対して、蛍光顕微鏡のような装置は、白色光源を使用して、光学フィルタによって励起光と蛍光の分離を行う。このため、例えば蛍光物質を変更したような場合、光学フィルタの組合せを変更するという、比較的容易な手法で対応が可能であり、メンテナンスも容易である。しかし、励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合、光学フィルタの特性から励起光と蛍光を完全に分離することが困難であり、このためにS/N及びダイナミックレンジの低下を招く。
【0006】
本発明は、励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合でもS/N及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施することができるマイクロアレイの読取方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を行った結果、マイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像し得られた画像をバックグランドとすることにより、S/N及びダイナミックレンジが高く、蛍光強度の低いアレイにおいても、精度良く蛍光強度の測定を実施できることを見いだし本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する第2のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる画像から減算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【0009】
また、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数回、撮像する第2のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、
第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を加算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【0010】
さらに、本発明は、プローブを固定化した区画に、蛍光物質が付与された検体を反応させたマイクロアレイから、蛍光物質が発する蛍光を読み取るマイクロアレイの読取方法であって、所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数の露光時間で撮像する第2のステップと、上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を、1/露光時間に比例した値で正規化し、得られた複数枚の画像からデータを抽出すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法、である。
【0011】
【発明の実施形態】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。
【0012】
図1は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロアレイの読取を行う装置の概略構成図である。
【0013】
図1に示すように、蛍光顕微鏡16を用いてマイクロアレイの読取を行うマイクロアレイの読取装置1は、蛍光物質を励起させるための光をマイクロアレイAに照射する励起用光源6と、マイクロアレイA上の検体に付与された蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する撮像手段であるCCDカメラ4と、このCCDカメラ4によって撮像された画像に基づいて、検体を解析する検出手段5と、を有する。
【0014】
また、蛍光顕微鏡16は、所定の光を透過し又は反射させるダイクロックミラー8、吸収用フィルタ10、励起用フィルタ12、及び、マイクロアレイAに対する対物レンズ14から構成される光学系を有する。さらに、マイクロアレイの読取装置1は、マイクロアレイAを保持し、水平面内で所望の位置に移動させるXYステージ18と、CCDカメラ4に写されるマイクロアレイAの像のピントを調節するため、XYステージ18又は対物レンズ14を上下動させるフォーカスステージ(図示せず)、及び、XYステージ18等を制御する制御装置20とを有する。
【0015】
また、励起用光源6は、蛍光顕微鏡16の鏡筒の側面から鏡筒内に光を射出するように配置されている。好ましくは、励起用光源6として、マイクロアレイA上の蛍光物質を励起することができる波長成分の光を多く含む光源を選択する。本実施形態に置いては、励起用光源6として、高圧水銀ランプが使用されている。
【0016】
励起用フィルタ12は、励起用光源6から射出された光の中の、マイクロアレイA上の蛍光物質を励起させることができる波長成分だけを透過し、それ以外の波長成分を遮断するように構成されている。また、吸収用フィルタ10は、マイクロアレイAから発せられる蛍光の波長の光を透過させ、蛍光物質を励起させる波長成分の光を透過させないように構成されている。ダイクロックミラー8は、励起用フィルタ12を透過した、蛍光物質を励起させることができる波長成分の光を反射してマイクロアレイAの方に差し向けるように構成され、配置されている。また、このダイクロックミラー8は、マイクロアレイA上の蛍光物質から発せられた蛍光の波長の光を透過させるように構成されている。
【0017】
本実施形態においては、蛍光物質としてCy3を使用した。吸収用フィルタ10、励起用フィルタ12、ダイクロックミラー8としては、市販のCy3用フィルタセットを使用し、それぞれ、吸収用フィルタ10として、中心波長610nm、半値幅75nmのバンドパスフィルタが、励起用フィルタ12として、中心波長545nm、半値幅30nmのバンドパスフィルタが、ダイクロックミラー8として、約570nm以下の波長の光を反射し、それ以上の波長の光を透過させるミラーを使用した。なお、ダイクロックミラー8、吸収用フィルタ10、及び、励起用フィルタ12は、使用する蛍光物質の励起波長及び蛍光物質が発する蛍光の波長に合わせて選択、構成し、複数の蛍光物質を使用する場合には、蛍光顕微鏡16において、容易に切替え可能に構成するのが良い。
【0018】
CCDカメラ4は、その光軸が蛍光顕微鏡16の光軸と整合するように、蛍光顕微鏡16の鏡筒の、対物レンズ14の反対側端部に取り付けられている。好ましくは、CCDカメラ4として、マイクロアレイAから発せられる微弱な蛍光を、少ないノイズで撮像することができるように、カメラの冷却機能を備えた冷却CCDカメラを使用する。本実施形態においては、1392×1040有効画素を有し、−30℃に冷却して使用するCCDカメラが用いられている。また、本実施形態においては、蛍光顕微鏡16は落射蛍光顕微鏡であり、倍率2倍の対物レンズを使用し、CCDカメラの手前に0.5倍の結像レンズを挿入して、等倍の光学系を使用している。
【0019】
XYステージ18は、CCDカメラ4によってマイクロアレイAの各部を撮像するため、マイクロアレイAを水平面内で移動させることができるように構成されている。フォーカスステージ(図示せず)は、CCDカメラ4に写されるマイクロアレイAの像のピントを調節するため、XYステージ18又は対物レンズ14を上下動させるように構成されている。また、制御装置20は、CCDカメラ4による撮像、XYステージ18の移動、励起用光源6のON/OFF、フォーカスステージの移動等を制御する。或いは、励起用光源6として、頻繁にON/OFFを繰り返すような使用に適さない種類の光源を使用する場合には、励起用光源6の前に光を遮断するためのシャッター(図示せず)を設け、このシャッターの開閉を制御装置20によって制御する。制御装置20は、例えば、各装置を作動させるアクチュエータと、このアクチュエータに信号を送るパーソナルコンピュータ等によって構成することができる。
【0020】
次に、図2を参照して、本発明の実施形態によるマイクロアレイの読取に使用するマイクロアレイAを説明する。
【0021】
図2に示すように、マイクロアレイAは、区画Cが貫通穴により形成されており、且つ区画Cが複数個、整然と配列されたマイクロアレイである。そのようなマイクロアレイは、例えば、WO 00/53736号、特開2000−60554号、特開2000−78998号公報記載の方法により作成される。
【0022】
各区画には、区画の内壁部に直接、又はゲルを介してプローブとなりうる生体関連物質が固定されている。
【0023】
区画以外の基材部分Bは、区画Cと光透過率が異なれば、その構成に特に限定はない。また基材部分Bと区画Cは、光透過率に差があれば良く、どちらが透明であるかは問題ではない。
【0024】
好ましくは、基材部分Bが不透明材料で構成されている。ここで「不透明」とは、マイクロアレイAのプローブが固定された区画よりも光を透過しにくい性質を意味し、必ずしも、光の透過率が0%であることを意味するものではない。
【0025】
図2では、区画Cとして中空円形状物を例示しているが、区画の外形は円形に限定されるものではない。区画Cの構造内径は170μm、外径は220μmである。
【0026】
また、図2では区画Cの肉厚部分及びそれを包含する樹脂製の基材部分Bにおいて、光透過率が1%以下になる材料で構成されているマイクロアレイを例示している。区画Cの肉厚部分は、カーボンブラックを2%混合したPMMA又はポリカーボネート樹脂により成形されている。この区画Cは、並行に縦横5列ずつ420μmピッチで等間隔に配置しており、その周囲は、カーボンブラックを2.5%混合したウレタン樹脂で包含されている。
【0027】
次に、本発明の実施形態によるマイクロアレイの読取方法について説明する。
【0028】
まず、各区画Cにプローブを含む高分子ゲル状物が充填されたマイクロアレイAを用意する。また、適用によっては、各区画Cの内壁に直接プローブを固定することもできる。一方、解析すべき検体には蛍光物質を付与し、この検体を、マイクロアレイAに作用させる。或る検体が、所定の構造のプローブに作用すると、プローブと検体が反応し、反応物が形成されるので、検体に付与された蛍光物質が、マイクロアレイAの区画Cの中に固定される。従って、解析すべき検体とハイブリッドを形成することができる構造のプローブが固定されている区画Cの中にのみ蛍光物質が存在することになる。
【0029】
マイクロアレイAの読取を開始する前に、マイクロアレイの読取装置1のXYステージ18の上には何も置かず、励起用光源6から光を照射し、この状態で検出される光をCCDカメラ4によって撮像する。このとき、XYステージ18の、対物レンズ14から励起光が照射される部分は、励起光が遮断されず、透過する構造になっていることが望ましい。撮像された画像の情報は、励起用光源6の光量斑を表す情報であると共に、マイクロアレイAの蛍光測定を実施する際、マイクロアレイAから発せられる蛍光以外の光としてCCDカメラ4によって撮像されるノイズ光を表す情報となり、検出手段5に補正用画像100として記憶させておく。また、CCDカメラ4の暗電流等によるノイズを除去するために、上記補正用画像100としては、励起用光源6をOFF又はシャッターを閉にして、励起光を照射しないようにした状態で、励起光を照射してCCDカメラ4で撮像したときと同じ露光時間だけ露光してCCDカメラ4で撮像した画像を減算した画像を使用することが望ましい。図3にCCDカメラ4によって撮像された補正用画像100の一例を示す。
【0030】
次に、マイクロアレイAをXYステージ18にセットする。XYステージ18にマイクロアレイAをセットする時のXYステージ18の位置と、マイクロアレイAの測定を行う時のXYステージ18の位置が異なる場合、XYステージ18を測定位置に移動する。
【0031】
次にXYステージ18上にセットされているマイクロアレイAに、励起用光源6から励起光を照射し、マイクロアレイAに配置されている各区画Cに充填されているゲル状物に固定化された蛍光物質からの蛍光を、CCDカメラ4によって撮像する。撮像された画像は、蛍光画像101として検出手段5に記憶させておく。また、CCDカメラ4の暗電流等によるノイズを除去するために、蛍光画像101としては、励起用光源6をOFF又はシャッターを閉にして、励起光を照射しないようにした状態で、励起光を照射してCCDカメラ4で撮像したときと同じ露光時間だけ露光してCCDカメラ4で撮像した画像を減算した画像を使用することが望ましい。図4にCCDカメラ4によって撮像された蛍光画像101の一例を示す。
【0032】
蛍光画像101は、励起用光源6の光量斑及び、蛍光顕微鏡16で構成している各部レンズ等の反射による迷光を含み、特に励起光波長と蛍光波長が近接しているような場合、励起用フィルタ12、ダイクロックミラー8、吸収用フィルタ10の特性により、励起光と蛍光の完全な分離が困難となり、上記迷光によるバックグランドの上昇が大きくなり、結果としてS/Nが悪くなる。図4の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを図5に示す。
【0033】
ここで、上記迷光は、特に対物レンズ14を構成するレンズ群による励起光の反射光がダイクロックミラー8及び吸収用フィルタ10の特性により低減されるものの、完全に除去できずにCCDカメラ4に入る光が主たる要因と考えられ、その強度分布は補正用画像100にほぼ比例している。また補正用画像100は対物レンズ14からマイクロアレイAに照射される励起光の強度分布にもほぼ比例している。
【0034】
次に、蛍光画像101から、補正用画像100に所定の値を乗算した画像を減算し、迷光補正蛍光画像102として検出手段5に記憶させておく。この操作により、上記迷光に相当する部分を画像から除去する。
【0035】
次いで、励起光の斑による蛍光発光斑を補正するため、迷光補正蛍光画像102を補正用画像100で除算し、更に補正用画像100の平均値を乗算し、迷光及び励起光斑補正蛍光画像103として検出手段5に記憶させておく。上記画像の演算は、それぞれの画像を浮動小数点形式の画像として実施することが望ましい。また、上記手法では補正用画像100の平均値を乗算したが、これに限る物ではない。例えば最大値、最小値、一定値とすることができ、一定値とした場合、励起用光源6が経時変化によってその強度が低下したような場合でも、同一レベルの励起光が照射された形の値に補正することができる。
【0036】
図6に、図4の蛍光画像から、図3の補正用画像に、[(図4の蛍光画像の露光時間)/(図3の補正用画像の露光時間)]に相当する値を乗算した画像を減算し、次いで図3の補正画像で除算し、更に図3の画像の平均値を乗算した、迷光及び励起光斑補正蛍光画像を示す。また、図6の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを図7に示す。ここで、図3の補正用画像に、[(図4の蛍光画像の露光時間)/(図3の補正用画像の露光時間)]に相当する値を乗算しているが、乗算する値としてはこれに限った物ではなく、補正用画像100と迷光強度との関係によって設定することができる。
【0037】
以上の操作によって、迷光及び励起光照射斑の影響を除去し、S/Nを向上させた画像を得ることができる。しかし、迷光のレベルが大きい場合、CCDカメラ4の飽和によって、十分な露光時間が得られず、蛍光強度の弱い区画の測定が困難な場合がある。そこで、CCDカメラ4が飽和しない範囲の露光時間で、複数n枚の蛍光画像101−1,101−2,…,101−nを撮像し、それぞれについて上記迷光及び励起光照射斑の補正を行い、更にそのn枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像を加算することによって、見かけ上の露光時間を延ばし、それによって蛍光強度の弱い区画の測定を可能にすることができる。n枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像を加算した画像は、n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−nとして検出手段5に記憶させておく。図8に、n=5として、図4の蛍光画像を撮像した条件と同一条件で5枚の蛍光画像を撮像し、上記手法による処理を実施したときの、5枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像をに示す。また、図8の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを図9に示す。ここで、上記手法においてはCCDカメラ4が飽和しない範囲の露光時間で複数枚の蛍光画像を取り込むようにしたが、蛍光強度が強い区画についてはCCDカメラ4の飽和を許容し(測定値は無視する)、蛍光強度の低い区画について精度良く測定したい場合には、蛍光強度が強い区画の飽和が、他の測定したい区画に影響しない範囲で露光時間を長くして複数枚の蛍光画像を取り込むこともできる。
【0038】
更に、蛍光強度が強い区画についてCCDカメラ4が飽和しない範囲の露光時間(X)で撮像した蛍光画像101−1(X),101−2(X),…,101−n(X)と、蛍光強度の弱い区画を精度良く測定するための露光時間(Y)で撮像した蛍光画像101−1(Y),101−2(Y),…,101−n(Y)とを撮像して、それぞれについて上記迷光及び励起光照射斑の補正、及びn枚の迷光及び励起光斑補正蛍光画像の加算処理を行い、複数露光時間n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n(X),104−n(Y)として検出手段5に記憶させておく。
【0039】
マイクロアレイAの読取は、マイクロアレイAのそれぞれの区画について、実施する。読取を実施する画像は、迷光及び励起光斑補正蛍光画像103、または、n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n、または、複数露光時間n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n(X),104−n(Y)であり、複数露光時間n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n(X),104−n(Y)の読取にあたっては、露光時間(Y)で撮像した蛍光画像101−m(Y),m=1,2,…,nが読み取る区画内で飽和していなければ、複数露光時間n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n(Y)から読み取り、また読み取る区画内で飽和していれば、複数露光時間n枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像104−n(X)から読み取り、CCDカメラ4は露光時間に対してリニアな特性を示すことから、その値をY/X倍して読み取り値とする。ここで、複数露光時間としてX,Yの2つの露光時間の場合について説明したが、更に多くの露光時間に分割して実施することも可能である。
【0040】
【発明の効果】
本発明のマイクロアレイの読取方法によれば、蛍光強度の低い検体を用いたマイクロアレイにおいても、プローブを固定化した検出すべき区画の情報を感度良く正確に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】蛍光顕微鏡を用いたマイクロアレイの読取装置の一例を示す概略構成図である。
【図2】マイクロアレイの読取装置に使用されるマイクロアレイの一例を示す平面図である。
【図3】CCDカメラによって撮像された補正用画像の一例を示す画像である。
【図4】CCDカメラによって撮像された蛍光画像の一例を示す画像である。
【図5】図4の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【図6】図3及び図4の画像に対して、本発明の手法を適用した、迷光及び励起光斑補正蛍光画像を示す画像である。
【図7】図6の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【図8】本発明の手法を適用した、5枚加算迷光及び励起光斑補正蛍光画像の一例を示す画像である。
【図9】図8の画像上の直線Dにおけるラインプロファイルを示すグラフである。
【符号の説明】
A マイクロアレイ
B 基材部分
C 区画
D 画像上のラインプロファイルを表示する直線
1 マイクロアレイの読取装置
4 CCDカメラ
5 検出手段
6 励起用光源
8 ダイクロックミラー
10 吸収用フィルタ
12 励起用フィルタ
14 対物レンズ
16 蛍光顕微鏡
18 XYステージ
20 制御装置[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a microarray reading method in which a sample provided with a fluorescent substance is caused to react with a microarray in which probes are immobilized and arranged, and irradiation with excitation light is performed to read the amount of excited fluorescence.
[0002]
[Prior art]
In recent years, genome projects for various organisms have been promoted, and a large number of genes, including human genes, and their base sequences have been rapidly elucidated. The function of the sequenced gene can be examined by various methods. As one of the promising methods, gene expression analysis using the revealed base sequence information is known. In this analysis method, for example, a different gene peptide, protein, antibody, or the like, in any of the surface of the substrate, the concave portion, the convex portion, the inner wall portion of the capillary, or the section of the polymer gel held in the hollow portion of the capillary. A microarray in which tens to tens of thousands of biologically-related substances such as biomaterials are immobilized is used. By utilizing various specific reactions to this probe, the relationship between the substance used as the probe and its biological function expression can be examined. Such a method is a DNA that enables simultaneous expression analysis of a large number of genes in order to perform comprehensive and systematic analysis of a very large number of genes at the level of one individual, which is being clarified through today's genome project. It has been developed as a new analytical method or methodology called a microarray method (DNA chip method).
[0003]
In the method of detecting a reaction product between a probe and a sample, first, a fluorescently labeled sample is reacted with a biological substance immobilized as a probe on a microarray. Then, by detecting the amount of fluorescence with a fluorescence measuring device such as a fluorescence laser scanner or a fluorescence microscope, it is possible to detect which probe and a reactant the fluorescently labeled sample has formed.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Since an apparatus such as a fluorescent laser scanner uses a laser as an excitation light source for exciting a fluorescent substance, the wavelength band of the excitation light is narrow and the separation from the wavelength band of the fluorescence is relatively easy. For this reason, a high S / N when fluorescence is detected can be obtained. However, a mechanism for scanning the laser is required, which tends to be relatively expensive, and has a problem in maintainability.
[0005]
In contrast, an apparatus such as a fluorescence microscope uses a white light source to separate excitation light and fluorescence by an optical filter. For this reason, for example, when the fluorescent substance is changed, it is possible to respond by a relatively easy method of changing the combination of the optical filters, and maintenance is easy. However, when the wavelengths of the excitation light and the fluorescence are close to each other, it is difficult to completely separate the excitation light and the fluorescence from the characteristics of the optical filter, which causes a reduction in S / N and dynamic range. .
[0006]
The present invention relates to a microarray capable of accurately measuring fluorescence intensity even in an array having a high S / N and a high dynamic range and a low fluorescence intensity even when the excitation light wavelength and the fluorescence wavelength are close to each other. It is an object to provide a reading method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made intensive studies and as a result, have obtained an image obtained by capturing light obtained by irradiating excitation light in the absence of a microarray and obtaining an S / S The present inventors have found that it is possible to accurately measure the fluorescence intensity even in an array having a high N and a dynamic range and a low fluorescence intensity, and have completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides a microarray reading method for reading fluorescence emitted by a fluorescent substance from a microarray in which a specimen to which a fluorescent substance has been applied is reacted on a section on which a probe is immobilized, wherein the microarray is provided at a predetermined sample holding position. A first step of preparing a microarray, a second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance present in a section of the macroarray, and imaging fluorescence emitted from the fluorescent substance, A third step of capturing light obtained by irradiating the excitation light with the microarray not at the holding position, wherein the image obtained in the third step is used as a background and the image obtained in the second step is used. From a microarray reading method.
[0009]
The present invention also provides a microarray reading method for reading fluorescence emitted from a fluorescent substance from a microarray obtained by reacting a sample to which a fluorescent substance has been applied to a section on which a probe is immobilized, wherein the method comprises the steps of: A first step of preparing a microarray, and a second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance present in a section of the macroarray, and imaging fluorescence emitted from the fluorescent substance a plurality of times. A third step of imaging light obtained by irradiating excitation light with no microarray at the sample holding position,
Using the image obtained in the third step as a background, subtracting each of the plurality of images obtained in the second step, and adding the plurality of images obtained by the subtraction, Reading method.
[0010]
Furthermore, the present invention provides a method for reading a microarray that reads fluorescence emitted from a fluorescent substance from a microarray in which a specimen to which a fluorescent substance has been applied is reacted on a section on which a probe is immobilized, wherein the method includes the steps of: A first step of preparing a microarray, and a second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance existing in a section of the macroarray, and capturing fluorescence emitted from the fluorescent substance at a plurality of exposure times. And a third step of imaging light obtained by irradiating the sample with the excitation light in a state where the microarray is not present at the sample holding position, and using the image obtained in the third step as a background, Each of the images obtained in the step is subtracted from each other, and the obtained images are subtracted by a value proportional to 1 / exposure time. And-normalized, to extract data from the obtained plurality of images, a reading method, the microarray characterized by.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0012]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an apparatus for reading a microarray using a fluorescence microscope.
[0013]
As shown in FIG. 1, a
[0014]
The
[0015]
Further, the excitation light source 6 is arranged so as to emit light from the side of the lens barrel of the
[0016]
The excitation filter 12 is configured to transmit only wavelength components that can excite the fluorescent substance on the microarray A in the light emitted from the excitation light source 6, and block other wavelength components. ing. In addition, the absorption filter 10 is configured to transmit light having a wavelength of fluorescence emitted from the microarray A and not transmit light having a wavelength component that excites the fluorescent substance. The dichroic mirror 8 is configured and arranged to reflect light having a wavelength component capable of exciting a fluorescent substance, which has passed through the excitation filter 12, and direct the light toward the microarray A. The dichroic mirror 8 is configured to transmit light having a wavelength of fluorescence emitted from a fluorescent substance on the microarray A.
[0017]
In the present embodiment, Cy3 was used as the fluorescent substance. A commercially available filter set for Cy3 is used as the absorption filter 10, the excitation filter 12, and the dichroic mirror 8, and a bandpass filter having a center wavelength of 610 nm and a half-value width of 75 nm is used as the absorption filter 10, respectively. As the filter 12, a band-pass filter having a center wavelength of 545 nm and a half value width of 30 nm was used. As the dichroic mirror 8, a mirror that reflects light having a wavelength of about 570 nm or less and transmits light having a wavelength longer than that is used. The dichroic mirror 8, the absorption filter 10, and the excitation filter 12 are selected and configured according to the excitation wavelength of the fluorescent substance to be used and the wavelength of the fluorescence emitted from the fluorescent substance, and use a plurality of fluorescent substances. In such a case, it is preferable that the
[0018]
The CCD camera 4 is attached to the end of the lens barrel of the
[0019]
The XY stage 18 is configured to be able to move the microarray A in a horizontal plane because the CCD camera 4 captures an image of each part of the microarray A. The focus stage (not shown) is configured to move the XY stage 18 or the objective lens 14 up and down in order to adjust the focus of the image of the microarray A captured on the CCD camera 4. Further, the
[0020]
Next, a microarray A used for reading a microarray according to the embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
[0021]
As shown in FIG. 2, the microarray A is a microarray in which the sections C are formed by through holes, and a plurality of the sections C are orderly arranged. Such a microarray is prepared, for example, by the method described in WO 00/53736, JP-A-2000-60554, and JP-A-2000-78998.
[0022]
In each section, a bio-related substance that can serve as a probe is fixed directly on the inner wall of the section or via a gel.
[0023]
The configuration of the substrate portion B other than the section is not particularly limited as long as the section C has a different light transmittance. Further, it is sufficient that there is a difference in light transmittance between the base portion B and the section C, and it does not matter which is transparent.
[0024]
Preferably, the base portion B is made of an opaque material. Here, “opaque” means that the probe of the microarray A transmits light less easily than the fixed section, and does not necessarily mean that the light transmittance is 0%.
[0025]
FIG. 2 illustrates a hollow circular object as the section C, but the outer shape of the section is not limited to a circle. The structural inner diameter of the section C is 170 μm, and the outer diameter is 220 μm.
[0026]
FIG. 2 illustrates a microarray made of a material having a light transmittance of 1% or less in the thick portion of the section C and the resin base material B including the thick section. The thick portion of the section C is formed of PMMA or polycarbonate resin mixed with 2% of carbon black. The sections C are arranged in parallel at regular intervals of 5 rows and 5 rows at a pitch of 420 μm, and the periphery thereof is covered with a urethane resin mixed with 2.5% of carbon black.
[0027]
Next, a method for reading a microarray according to an embodiment of the present invention will be described.
[0028]
First, a microarray A in which each section C is filled with a polymer gel containing a probe is prepared. Further, depending on the application, the probe can be directly fixed to the inner wall of each section C. On the other hand, a fluorescent substance is provided to the sample to be analyzed, and this sample is caused to act on the microarray A. When a certain sample acts on the probe having a predetermined structure, the probe and the sample react with each other to form a reactant, so that the fluorescent substance given to the sample is fixed in the section C of the microarray A. Therefore, the fluorescent substance is present only in the section C where the probe having a structure capable of forming a hybrid with the sample to be analyzed is fixed.
[0029]
Before starting reading the microarray A, nothing is placed on the XY stage 18 of the
[0030]
Next, the microarray A is set on the XY stage 18. When the position of the XY stage 18 when setting the microarray A on the XY stage 18 is different from the position of the XY stage 18 when measuring the microarray A, the XY stage 18 is moved to the measurement position.
[0031]
Next, the microarray A set on the XY stage 18 is irradiated with excitation light from the light source 6 for excitation, and the fluorescence immobilized on the gel material filled in each section C arranged in the microarray A The fluorescence from the substance is imaged by the CCD camera 4. The captured image is stored in the detection unit 5 as the fluorescence image 101. In addition, in order to remove noise due to dark current or the like of the CCD camera 4, the excitation light is used as the fluorescence image 101 in a state where the excitation light source 6 is turned off or the shutter is closed so that the excitation light is not irradiated. It is desirable to use an image obtained by irradiating and exposing for the same exposure time as when imaging with the CCD camera 4 and subtracting the image captured with the CCD camera 4. FIG. 4 shows an example of a fluorescence image 101 captured by the CCD camera 4.
[0032]
The fluorescence image 101 includes light spots of the excitation light source 6 and stray light due to reflections from the lenses and the like included in the
[0033]
Here, although the reflected light of the excitation light by the lens group constituting the objective lens 14 is reduced by the characteristics of the dichroic mirror 8 and the absorption filter 10, the stray light cannot be completely removed, but the stray light cannot be completely removed. Incident light is considered to be the main factor, and its intensity distribution is almost proportional to the
[0034]
Next, an image obtained by multiplying the
[0035]
Next, in order to correct the fluorescence emission spot due to the spot of the excitation light, the stray light correction fluorescence image 102 is divided by the
[0036]
In FIG. 6, the correction image of FIG. 3 is multiplied by a value corresponding to [(exposure time of the fluorescence image of FIG. 4) / (exposure time of the correction image of FIG. 3)] from the fluorescence image of FIG. FIG. 4 shows a stray light and excitation light spot corrected fluorescent image in which the image has been subtracted, then divided by the corrected image of FIG. 3, and further multiplied by the average value of the image of FIG. FIG. 7 shows a line profile of a straight line D on the image of FIG. Here, the correction image in FIG. 3 is multiplied by a value corresponding to [(exposure time of the fluorescent image in FIG. 4) / (exposure time of the correction image in FIG. 3)]. Is not limited to this, and can be set based on the relationship between the
[0037]
Through the above operation, the effects of the stray light and the excitation light irradiation spots can be removed, and an image with improved S / N can be obtained. However, when the level of stray light is large, a sufficient exposure time cannot be obtained due to saturation of the CCD camera 4, and it may be difficult to measure a section having a weak fluorescence intensity. Therefore, a plurality of n fluorescence images 101-1, 101-2,..., 101-n are imaged with an exposure time in a range where the CCD camera 4 is not saturated, and the stray light and the excitation light irradiation spot are corrected for each of the images. Further, by adding the n pieces of the stray light and the excitation light spot corrected fluorescence images, the apparent exposure time can be extended, thereby enabling measurement of a section having a weak fluorescence intensity. The image obtained by adding the n pieces of the stray light and the excitation light spot corrected fluorescence image is stored in the detection unit 5 as the n-piece added stray light and the excitation light spot corrected fluorescence image 104-n. In FIG. 8, when n = 5, five fluorescent images are captured under the same conditions as the conditions under which the fluorescent image of FIG. 4 is captured, and the processing using the above-described method is performed. The image is shown in. FIG. 9 shows a line profile of a straight line D on the image of FIG. Here, in the above-described method, a plurality of fluorescent images are captured with an exposure time in a range where the CCD camera 4 does not saturate. However, the saturation of the CCD camera 4 is allowed for a section having a high fluorescence intensity (measurement values are ignored). ), When it is desired to accurately measure a section with a low fluorescence intensity, the exposure time should be extended within a range where saturation of a section with a high fluorescence intensity does not affect other sections to be measured, and a plurality of fluorescence images should be captured. You can also.
[0038]
Further, fluorescent images 101-1 (X), 101-2 (X),..., 101-n (X) captured in sections having a high fluorescent intensity with an exposure time (X) in a range where the CCD camera 4 is not saturated, .., 101-n (Y) are captured at the exposure time (Y) for accurately measuring a section having weak fluorescence intensity. Correction of the stray light and the excitation light irradiation spot and addition processing of the n pieces of the stray light and the excitation light spot correction fluorescence image are performed for each of them, and a plurality of n exposure light and excitation light spot correction fluorescence images 104-n (X), 104 for which n exposure times are added. −n (Y) is stored in the detection means 5.
[0039]
The reading of the microarray A is performed for each section of the microarray A. The image to be read is a stray light and excitation light spot corrected fluorescent image 103, or an n-number added stray light and excitation light spot corrected fluorescent image 104-n, or a multi-exposure time n-number added stray light and excited light spot corrected fluorescent image 104-n. (X), 104-n (Y), and the exposure time (Y) is used to read the stray light and the excitation light spot corrected fluorescent images 104-n (X), 104-n (Y) for the n exposure times for a plurality of exposure times. If the captured fluorescent image 101-m (Y), m = 1, 2,..., N is not saturated in the section to be read, n-multiple exposure time added stray light and excitation light spot corrected fluorescent image 104-n (Y) If the image is saturated in the section to be read, and the image is saturated in the section to be read, the stray light and the excitation light spot corrected fluorescence image 104-n (X) are added for a plurality of exposure times, and the CCD camera 4 shows a linear characteristic with respect to the exposure time. thing Et al., Its value Y / X times the readings. Here, the case of two exposure times X and Y has been described as a plurality of exposure times, but it is also possible to divide the exposure time into more exposure times.
[0040]
【The invention's effect】
According to the method for reading a microarray of the present invention, even in a microarray using a specimen having a low fluorescence intensity, it is possible to accurately and accurately obtain information on a section to be detected in which a probe is immobilized.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an example of a microarray reader using a fluorescence microscope.
FIG. 2 is a plan view showing an example of a microarray used in a microarray reader.
FIG. 3 is an image showing an example of a correction image captured by a CCD camera.
FIG. 4 is an image showing an example of a fluorescence image captured by a CCD camera.
FIG. 5 is a graph showing a line profile of a straight line D on the image of FIG. 4;
FIG. 6 is an image showing a stray light and excitation light spot corrected fluorescent image obtained by applying the method of the present invention to the images of FIGS. 3 and 4;
FIG. 7 is a graph showing a line profile of a straight line D on the image of FIG. 6;
FIG. 8 is an image showing an example of a five-image addition stray light and excitation light spot corrected fluorescence image to which the method of the present invention is applied.
FIG. 9 is a graph showing a line profile of a straight line D on the image of FIG. 8;
[Explanation of symbols]
Reference Signs List A Microarray B Substrate portion C Section D Straight line displaying line profile on
Claims (3)
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を撮像する第2のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、
第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる画像から減算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。A method of reading a microarray that reads fluorescence emitted by a fluorescent substance from a microarray in which a specimen to which a fluorescent substance has been applied is reacted with a section in which a probe is immobilized,
A first step of preparing the microarray at a predetermined sample holding position;
A second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance present in the section of the macroarray, and capturing an image of fluorescence emitted from the fluorescent substance;
A third step of imaging light obtained by irradiating excitation light with no microarray at the sample holding position,
A method for reading a microarray, comprising subtracting an image obtained in the second step from an image obtained in the third step as a background.
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数回、撮像する第2のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、
第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を加算すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。A method of reading a microarray that reads fluorescence emitted by a fluorescent substance from a microarray in which a specimen to which a fluorescent substance has been applied is reacted with a section in which a probe is immobilized,
A first step of preparing the microarray at a predetermined sample holding position;
A second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance present in a section of the macroarray, and capturing fluorescence emitted from the fluorescent substance a plurality of times;
A third step of imaging light obtained by irradiating excitation light with no microarray at the sample holding position,
Using the image obtained in the third step as a background, subtracting each of the plurality of images obtained in the second step, and adding the plurality of images obtained by the subtraction, Reading method.
所定のサンプル保持位置に上記マイクロアレイを準備する第1のステップと、
上記マイクロアレイに励起光を照射してマクロアレイの区画に存在する蛍光物質を励起し、この蛍光物質から発せられる蛍光を複数の露光時間で撮像する第2のステップと、
上記サンプル保持位置にマイクロアレイが無い状態で励起光を照射して得られる光を撮像する第3のステップとを有し、
第3のステップで得られる画像をバックグランドとして、第2のステップで得られる複数枚の画像からそれぞれ減算し、減算して得られた複数枚の画像を、1/露光時間に比例した値で正規化し、得られた複数枚の画像からデータを抽出すること、を特徴とするマイクロアレイの読取方法。A method of reading a microarray that reads fluorescence emitted by a fluorescent substance from a microarray in which a specimen to which a fluorescent substance has been applied is reacted with a section in which a probe is immobilized,
A first step of preparing the microarray at a predetermined sample holding position;
A second step of irradiating the microarray with excitation light to excite a fluorescent substance present in a section of the macroarray, and capturing fluorescence emitted from the fluorescent substance at a plurality of exposure times;
A third step of imaging light obtained by irradiating excitation light with no microarray at the sample holding position,
Using the image obtained in the third step as a background, each is subtracted from the plurality of images obtained in the second step, and the plurality of images obtained by the subtraction are calculated with a value proportional to 1 / exposure time. A method for reading a microarray, which comprises normalizing and extracting data from a plurality of obtained images.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002355133A JP2004184379A (en) | 2002-12-06 | 2002-12-06 | Method of reading microarray |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002355133A JP2004184379A (en) | 2002-12-06 | 2002-12-06 | Method of reading microarray |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004184379A true JP2004184379A (en) | 2004-07-02 |
Family
ID=32755910
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002355133A Pending JP2004184379A (en) | 2002-12-06 | 2002-12-06 | Method of reading microarray |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2004184379A (en) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006337245A (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Fluorescence reading device |
JP2010197251A (en) * | 2009-02-25 | 2010-09-09 | Fujitsu Ltd | Image capturing apparatus, method and program |
US7858382B2 (en) | 2005-05-27 | 2010-12-28 | Vidar Systems Corporation | Sensing apparatus having rotating optical assembly |
JP2012154826A (en) * | 2011-01-27 | 2012-08-16 | Sony Corp | Light emission intensity measuring apparatus |
CN102985809A (en) * | 2010-05-12 | 2013-03-20 | 利康股份有限公司 | High dynamic range scanning with reduced channel cross-talk |
JP2013531221A (en) * | 2010-04-28 | 2013-08-01 | フェーイーベー フェーゼットウェー | Method and apparatus for imaging of labeled biological samples |
JP2014089193A (en) * | 2007-04-04 | 2014-05-15 | Olympus Corp | Long-term monitoring method and analysis method by using photoprotein |
-
2002
- 2002-12-06 JP JP2002355133A patent/JP2004184379A/en active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7858382B2 (en) | 2005-05-27 | 2010-12-28 | Vidar Systems Corporation | Sensing apparatus having rotating optical assembly |
JP2006337245A (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Fluorescence reading device |
JP2014089193A (en) * | 2007-04-04 | 2014-05-15 | Olympus Corp | Long-term monitoring method and analysis method by using photoprotein |
JP2010197251A (en) * | 2009-02-25 | 2010-09-09 | Fujitsu Ltd | Image capturing apparatus, method and program |
JP2013531221A (en) * | 2010-04-28 | 2013-08-01 | フェーイーベー フェーゼットウェー | Method and apparatus for imaging of labeled biological samples |
US9569828B2 (en) | 2010-04-28 | 2017-02-14 | Vib Vzw | Method and apparatus for the imaging of a labeled biological sample |
CN102985809A (en) * | 2010-05-12 | 2013-03-20 | 利康股份有限公司 | High dynamic range scanning with reduced channel cross-talk |
JP2012154826A (en) * | 2011-01-27 | 2012-08-16 | Sony Corp | Light emission intensity measuring apparatus |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1228354B1 (en) | Apparatus and method for calibration of a microarray scanning system | |
JP2019520574A (en) | Hyperspectral imaging method and apparatus | |
US8759790B2 (en) | Fluorescence image producing method, fluorescence image producing apparatus, and fluorescence image producing program | |
JP2010517056A (en) | Time-resolved fluorescence imaging system | |
JP5746161B2 (en) | Method for evaluating fluorescence in microscopic images | |
JP3824135B2 (en) | Biochip reader | |
JP2006071611A (en) | Fluorescence microscope, and fluorescence correlated spectroscopic analyzer | |
US20100278399A1 (en) | Method of fluorescence imaging | |
EP1283416A2 (en) | Biochip reader and fluorometric imaging apparatus | |
JP4724126B2 (en) | Biochemical inspection apparatus and biochemical inspection method | |
JP2007003323A (en) | Photographing system | |
JP4979516B2 (en) | Image reading method and apparatus | |
JP2008508537A (en) | Biological reaction support device for reading plates supporting micro-adhesives | |
JP2021113806A (en) | Device for thermocycling biological samples, monitoring instrument comprising the same, and method of thermocycling biological samples using such device | |
JP4043925B2 (en) | Biological material microarray reader and method | |
JP2004184379A (en) | Method of reading microarray | |
JP4260115B2 (en) | Absorbance reader, absorbance reader control method, and absorbance calculation program | |
JP2002005834A (en) | Distribution measuring apparatus for fluorescence labeled substance | |
JP2001194303A (en) | Device for analyzing diffusion motion of fluorescent molecule | |
US20230221178A1 (en) | Apparatus and a method for fluorescence imaging | |
US7446867B2 (en) | Method and apparatus for detection and analysis of biological materials through laser induced fluorescence | |
JP3395468B2 (en) | Fluorescence detector | |
JP2003232733A (en) | Method and device for fluorescent image detection and method and device for dna inspection | |
JP2003028798A (en) | Fluorescence acquisition device | |
JP4321716B2 (en) | Fluorescence image correction method, apparatus, and program |