JP2022100201A - 感染性植物ラブドウイルスベクターおよび植物における非トランスジェニックのゲノム部位特異的編集の方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物ラブドウイルスベクターを用いて植物染色体ＤＮＡを部位特異的修飾する方法およびウイルスベクターの組成物を提供する。【解決手段】植物ラブドウイルスベクターを用いて植物を全身感染し、配列特異的ヌクレアーゼを発現し、配列特異的ヌクレアーゼが、感染された植物ゲノム標的サイトを標的とし、標的サイトを切断するステップと、植物のＤＮＡ修復メカニズムにより標的サイトに対する部位特異的編集を完了するステップを含む。この植物ゲノム目的ＤＮＡを部位特異的編集する方法は、選択的マーカー遺伝子を導入する必要がない。植物ラブドウイルス発現ベクターを用いて配列特異的ヌクレアーゼを送達することにより、標的サイトに対する編集効率を向上させるだけでなく、非トランスジェニックの安定に遺伝可能な編集植株を獲得することができる。【選択図】図1
Description
新規性喪失の例外適用申請有り
本発明は、植物遺伝子工学技術分野に関し、特に、組換え型ラブドウイルスベクターを用いて植物に対して部位特異的編集を行う方法に関し、具体的には、本発明は、組換え型ラブドウイルスベクターを用いてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ成分を非トランスジェニック送達することで植物に対して部位特異的編集を行う方法に関する。
近年、ゲノム部位特異的編集技術（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ）の出現は、作物の精密育種のために新規ルートを開拓し、小麦、水稲、トウモロコシなどの多種の作物の機能ゲノム学研究および性状の遺伝改良において非常に広い応用展望を有する。現在、ゲノム部位特異的編集技術は、主に配列特異的ヌクレアーゼ（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， ＳＳＮｓ）に依存して完成している。配列特異的ヌクレアーゼとは、部位特異的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ ｂｉｎｇｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と非特異的のＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ）とを組み合わせ、ゲノム特定領域を標的かつ改造可能なドメインである。配列特異的ヌクレアーゼを細胞に導入された後に、ゲノムにおける特異配列を識別し、当該配列を切断してＤＮＡの二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋｓ、ＤＳＢｓ）を形成することができ、それによって細胞内の非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）または相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）を活性化して修復し、遺伝子機能の欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）或いは置換（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を引き起こす。現在よく使われる配列特異的ヌクレアーゼは、主にジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な短い配列の回文配列リピートおよびＣＲＩＳＰＲ関連システム（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）という３種類を含む。そのうちのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、操作が簡便で、迅速かつ効率が高い利点があり、ゲノム編集ツールとして現在最も広く応用されている。
現在の植物ゲノム編集のキーテクノロジーの１つは、配列特異的ヌクレアーゼの植物送達技術であり、すなわち、配列特異的ヌクレアーゼを含む核酸分子および／又はタンパク質分子を標的細胞、組織、器官又は植株個体に導入する方法と手段である。理想的な送達技術として、以下の条件を満たさなければならない：（１）完全な配列特異的ヌクレアーゼ核酸やタンパク質分子を植物材料に導入することができる；（２）送達される受容体植物材料が獲得しやすく、導入過程が簡単で操作しやすい；（３）植物材料中に導入した配列特異的ヌクレアーゼは、高効率の編集効率を発揮できる；（４）編集後の突然変異再生植株が獲得しやすい。（５）獲得した編集植株は、外来核酸の統合を含まない。
従来技術では、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを植物に送達することは、主に遺伝子組換え方法、すなわち、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓを含む組換え遺伝子を受容体植物細胞に導入して植物のゲノムに統合し、発現産生されたヌクレアーゼがゲノム標的配列に対して予想可能な指向性遺伝的変化を産生することに依存する。現在、植物において最もよく使われている技術は、アグロバクテリウム介在法と遺伝子銃法などを含み、ゲノムに関する外来ＤＮＡ挿入ということはすべて遺伝子組換えとして見なされる。当該方法は、ヌクレアーゼの植物への送達を実現することができるが、依然として、育種応用において以下の問題が存在する：（１）植物ゲノムにおける外来遺伝子の統合に関し、また、形質転換の過程では抗生物質や除草剤を用いてマーカーをスクリーニングする必要がある；（２）獲得した編集植株に予期できない表現型変異が存在する可能性がある。（３）自配または戻し交配などの手段により組換え遺伝子を分離する過程周期が長く、特に、育種周期が長く、倍数体、および無性生殖の植物である場合；（４）ある国や地区では、組換え遺伝子を除去した編集植株の子の世代およびその製品は、遺伝子組換え製品の監督管理対象となる可能性がある。
遺伝子組換え送達方式に問題が存在する状況に鑑み、非トランスジェニックＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの送達方式を構築する必要がある。植物ウイルスベクターは、もう一つの将来性のあるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ送達方法である。全身感染能力を有するウイルスベクターは、接種された細胞または組織から他の未接種組織および細胞に拡張することができ、かつ植株個体レベルで外来遺伝子の全身送達を達成することができる。全身感染能力を有さないウイルスベクターは、初感染細胞から他の細胞に拡散することができず、したがって、全身送達を達成することができない。全身感染能力を有するウイルスベクター、特に感染性ＲＮＡウイルスベクターは、その複製過程がＤＮＡ段階に関連しないため、外来核酸が寄主ゲノムに統合される可能性が存在しなく、ヌクレアーゼの非トランスジェニック送達応用において特殊な価値を有する。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子分子量が比較的大きく、４．２千塩基対（Ｋｂ）に達するため、プロモーターエレメントを加えて５－７ ｋｂに達することが可能性があり、現在のウイルスベクターのパッケージング能力に対して極めて大きな挑戦を提出した。外来遺伝子の長さが感染性ウイルスベクターの限界負荷能力を超えた場合、外来遺伝子フラグメントの紛失、欠失をもたらすか、またはウイルスの全身感染能力を喪失する（Ａｖｅｓａｎｉら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ、２００７、１６：５８７－５９７）。
パッケージング能力の制約のため、一部の感染性植物ウイルスベクターは、長さ約１００～２００塩基対（ｂｐ）のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの比較的小さいヌクレアーゼ成分を送達するためにのみ使用され、このようなベクターは、例えば、植物ＤＮＡウイルス中のキャベツ葉巻ウイルス（Ｙｉｎら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、２０１５、５：１４９２６）、プラスセンスＲＮＡウイルス中のタバコ茎壊疽ウイルス（Ａｌｉら、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ、２０１５、８：１２８８－１２９１；ＷＯ ２０１５１８９６９３）、タバコモザイクウイルス（Ｃｏｄｙら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１７、１７５：２３－３５）、エンドウ豆早期褐変ウイルス（Ａｌｉら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ、２０１８、２４４：３３３－３３７）、テンサイそう根病（Ｊｉａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ、２０１９、１７：１３０２－１３１５）などがある。これらのウイルスベクターは、Ｃａｓ９遺伝子組換え植株を介してゲノム部位特異的編集を実現するのに必要とされるため、このようにして獲得した編集植株のゲノムにＣａｓ９核酸配列の挿入がまだ含まれている。
論文（Ｍｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ、２０１９、３：１－１６）では、約７００ｂｐの緑色蛍光タンパク質遺伝子を持つ場合、感染した上部葉で外来挿入フラグメントが完全欠失し、１００～２００ｂｐのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを発現するためにのみ利用可能となり、遺伝子組換え発現のＣａｓ９タンパク質に依存して遺伝子編集を実現可能なプラスセンスＲＮＡウイルスに属するオヒゲシバモザイク ウイルスウイルスベクターが開示される。論文（Ｚｈａｎｇら、Ｆｕｎｃｔ＆Ｉｎｔｅｇｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０２０、２０：４７１－４７７）および中国特許ＣＮ １１１９７９２６２ Ａと同様に、当該ウイルスベクターを用いて植物ゲノム編集を行う方法が開示される。パッケージング能力の制約のため、当該がＣａｓ９とｇＲＮＡをそれぞれ２つのウイルスベクターに挿入し、植物を共同に感染するときに低頻度の遺伝子編集を実現した。
もう１つのプラスセンスＲＮＡウイルスに属するジャガイモＸウイルスの外来フラグメントに対する許容能力は、２ ｋｂ未満であった（Ｌａｒｓｅｎら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１２、１２：２１；Ａｖｅｓａｎｉら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ、２００７、１６：５８７－５９７）。論文（Ａｒｉｇａら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０２０、６１：１９４６－１９５３）では、当該ベクターを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子を送達する方法が開示される。当該ウイルスベクターは、接種葉で完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを発現し、遺伝子編集を実現することができるが、未接種組織でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ全身送達と遺伝子編集を実現することができない。
ウイルスレプリコン（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）システムは、ウイルスを複製するために必要とされるエレメントを保留しているが、ウイルスパッケージおよび／または運動に関連するエレメントを除去したベクターである。当該種類のベクターは、効率的に複製できるが、全身感染することができないため、かなり大きい（＞１０ ｋｂ）の外来挿入フラグメントを収容することができる。論文（Ｂａｌｔｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２０１４、１５１－１６３）では、一本鎖ＤＮＡジェミニウイルス科に属するダイズわい化ウイルスレプリコンを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを送達することが開示されており、論文（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ、２０１７、１０：１００７－１０１０）および中国特許ＣＮ １０９８８０８４６ Ａは、ジェミニウイルス科のコムギ萎縮ウイルスレプリコンベクターシステムを用いてＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびＤＮＡ修復テンプレートを送達することが開示される。しかし、ウイルスレプリコンベクターが、実質的に運動欠陥ウイルス（Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）であり、アグロバクテリウム介在または遺伝子銃などの手法を利用してウイルスベクターを含むＤＮＡコンストラクトを細胞に導入する必要があるので、受容体細胞に外来ＤＮＡ統合可能性の存在は避けられない。
現在すでに開発された植物ウイルスベクターに欠陥が存在する課題に鑑み、感染性を有し、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを全身に送達できる植物ウイルスベクターシステム、特に、複製過程でＤＮＡ段階に関しない感染性ＲＮＡウイルスベクターシステムを開発する必要がある。
ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスは、非分節一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスに属する。論文（Ｗａｎｇら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ、２０１５、１１：ｅ １００５２２３）および特許ＣＮ １０５０３９３８８ Ｂは、植物ラブドウイルスに属するノゲシ黄網ウイルス（ＳＹＮＶ）の遺伝操作方法が開示される。特許ＣＮ １０４９６２５８０ Ｂは、緑色蛍光タンパク質（約７００ ｂｐ）とβ－ガラクトシダーゼ（１．８ Ｋｂ）結合遺伝子を担持できるＳＹＮＶ発現ベクターおよびその作製方法が開示されるが、より大きな外来遺伝子フラグメント（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）の全身送達、および当該ウイルスベクターを用いて非トランスジェニックのゲノム部位特異的編集の方法を実現することができなかった。
論文（Ｇａｏら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ、２０１９、２２３：２１２０－２１３３）と特許ＣＮ １１０５１１９５５ Ａは、植物ラブドウイルスオオムギ縞萎縮ウイルス（ＢＹＳＭＶ）の感染性クローン、発現ベクターおよびその構築方法と使用が開示される。蛍光タンパク質遺伝子とβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入するとき、当該ベクターは、麦類植物寄主において外来遺伝子の全身送達と発現を実現することができる。しかし、より大きなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子（約５ Ｋｂ）を担持するとき、当該ベクターは、アグロバクテリウムＴ－ＤＮＡ形質転換法でベンサミアナタバコに導入することしかできず、単細胞でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを発現し、標的遺伝子編集を産生するが、組み換えウイルスはベンサミアナタバコ内で運動することができず、麦類植物の寄主および媒介としてのウンカ体内で全身感染することもできない（Ｇａｏら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ， ２０１９， ２２３： ２１２０－２１３３；原文第１２ページ「ＢＹＳＭＶ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｎｎｏｔ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｂｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｉｎ ｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ， ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｅｓ， ｂｕｔ ｔｈｉｓ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＹＳＭＶ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ａｄｄｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ＣＡＳ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ ｓｔｕｄｉｅｓ」）。
以上説明したように、従来技術では非トランスジェニックのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの全身送達を実現することができなかった。
以上説明したように、従来技術では非トランスジェニックのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの全身送達を実現することができなかった。
現在の植物ウイルスベクターを用いて植物に対して非トランスジェニックのゲノム部位特異的修飾を行う技術的難題を克服するために、本発明は、植物ラブドウイルスを用いて配列特異的ヌクレアーゼを植物に送達する。前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノムの特定核酸配列を標的とし、標的サイトを切断し、植物内因性ＤＮＡ修復機構を介して前記標的サイトの部位特異的修飾を完成させることができる。さらに、前記植物ラブドウイルスは、全身感染能力を有し、ウイルスの全身感染に伴って、配列特異的ヌクレアーゼに対する全身送達を実現し、外来核酸配列統合を含まない部位特異的編集植物部分を獲得することができ、さらに、外来配列統合を含まない部位特異的編集植物部分（例えば、植物細胞）再生後、非トランスジェニックの安定に遺伝可能な部位特異的編集植物を獲得することができる。
本発明の第１の態様は、修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない植物細胞遺伝物質を修飾する方法を提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）とを含む。
前記細胞遺伝物質修飾プロセスは、配列特異的ヌクレアーゼによって切断誘導され、植物内因性ＤＮＡ修復機器によって完成される。
好ましくは、前記方法は、ステップｂ）の後に、選択マーカーを利用する必要がなく、遺伝物質を含む修飾植物細胞対象を選択するステップｃ）をさらに含む。
前記細胞遺伝物質修飾プロセスは、配列特異的ヌクレアーゼによって切断誘導され、植物内因性ＤＮＡ修復機器によって完成される。
好ましくは、前記方法は、ステップｂ）の後に、選択マーカーを利用する必要がなく、遺伝物質を含む修飾植物細胞対象を選択するステップｃ）をさらに含む。
本発明の第２の態様は、修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない遺伝物質が修飾された植物を産生する方法を提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）と、前記遺伝物質が修飾された細胞から植物を取得するステップｃ）、選択マーカーを利用する必要がなく、前記遺伝物質を含む修飾植物対象を選択するステップｄ）とを含む。
好ましくは、前記修飾すべき細胞を感染する方法は、組み換えウイルス未接種細胞自然感染、汁の摩擦接種、接ぎ木、昆虫媒介伝播、または他の任意のウイルスによる感染方法を含む。
好ましくは、前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターは、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）またはナス斑点萎縮ウイルス（ｅｇｇｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ、ＥＭＤＶ）である。
好ましくは、前記ノゲシ黄網ウイルスゲノム核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、前記ナス斑点萎縮ウイルスゲノム核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。
好ましくは、前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターは、一つまたは複数の種類の突然変異および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターを含み、好ましくは、前記誘導ウイルスベクターが、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇ）アミノ基末端ドメインが突然変異された、および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターである。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインが欠失されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインが欠失されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインのヌクレオチド配列が異種核酸配列に置換されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記細胞遺伝物質修飾は、標的サイトで少なくとも１つの塩基欠失、または１つの塩基挿入、または１つの塩基置換、またはこれらの修飾パターンの組み合わせを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼであり、好ましくは、前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌に由来するＳｐＣａｓ９またはラクノスピラに由来するＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
好ましくは、前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列は、単一または複数のガイドＲＮＡの核酸配列と、Ｃａｓヌクレアーゼの核酸配列とを含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子と対をなす配列と、Ｃａｓヌクレアーゼと結合して複合体を形成する配列とを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を取り除くように加工される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる。
前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣｐｆ１ヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子と対をなす配列と、Ｃａｓヌクレアーゼと結合して複合体を形成する配列とを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を取り除くように加工される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる。
前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣｐｆ１ヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、
好ましくは、前記植物は、植物ラブドウイルスの自然または実験寄主である。好ましくは、前記植物は、ノゲシ黄網ウイルスまたはナス斑点萎縮ウイルスの寄主である。
好ましくは、前記植物はベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。
好ましくは、前記植物はジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。
好ましくは、前記植物はジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。
好ましくは、前記植物は、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニコチアナ・リーブランド（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・エドワードソニー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｄｗａｒｄｓｏｎｉｉ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ヒユアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、扶桑（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）、イヌホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ハルノノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ニコチアナ・グルチノサとニコチアナ・リーブランドとのハイブリッド品種、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、コセンダングサ（Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）などから選択される。
本発明の第３の態様は、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記配列特異的ヌクレアーゼは、ウイルスベクターが感染した細胞内で一過性発現するとともに、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、前記標的配列は、前記ヌクレアーゼによって修飾されることを特徴とする、感染性組み換え植物ラブドウイルスベクターを提供する。
前記組換え型ラブドウイルスは、全身感染能力を有し、好ましくは、前記ラブドウイルスは、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）またはナス斑点萎縮ウイルス（ｅｇｇｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ、ＥＭＤＶ）である。
好ましくは、前記組み換え植物ラブドウイルスベクターは、組み換え核酸コンストラクトであり、ウイルスベクターを含む配列は、プロモーターに作動可能に連結される。
好ましくは、前記ノゲシ黄網ウイルスゲノム核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、前記ナス斑点萎縮ウイルスゲノム核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。
好ましくは、前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターは、一つまたは複数の種類の突然変異および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターを含み、好ましくは、前記誘導ウイルスベクターが、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇ）アミノ基末端ドメインが突然変異された、および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターである。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインが欠失されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインが欠失されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記糖タンパク質は、糖タンパク質Ｎ末端ドメインのヌクレオチド配列が異種核酸配列に置換されるように変異および／または組み換え修飾される。
好ましくは、前記細胞遺伝物質修飾は、標的サイトで少なくとも１つの塩基欠失、または１つの塩基挿入、または１つの塩基置換、またはこれらの修飾パターンの組み合わせを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼであり、好ましくは、前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌に由来するＳｐＣａｓ９またはラクノスピラに由来するＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼであり、好ましくは、前記ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示され、ＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼの核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される。
好ましくは、前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列は、単一または複数のガイドＲＮＡの核酸配列と、Ｃａｓヌクレアーゼの核酸配列とを含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子と対をなす配列と、Ｃａｓヌクレアーゼと結合して複合体を形成する配列とを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を取り除くように加工される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる。
前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣａｓヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子と対をなす配列と、Ｃａｓヌクレアーゼと結合して複合体を形成する配列とを含む。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する。
好ましくは、前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される。
好ましくは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を含む。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を取り除くように加工される。
好ましくは、前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる。
前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣａｓヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、
好ましくは、前記植物は、植物ラブドウイルスの自然または実験寄主である。好ましくは、前記植物は、ノゲシ黄網ウイルスまたはナス斑点萎縮ウイルスの寄主である。
好ましくは、前記植物はベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。
好ましくは、前記植物はタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。
好ましくは、前記植物はタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である。
好ましくは、前記植物はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である。
好ましくは、前記植物は、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニコチアナ・リーブランド（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・エドワードソニー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｄｗａｒｄｓｏｎｉｉ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ヒユアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、扶桑（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）、イヌホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ハルノノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ニコチアナ・グルチノサとニコチアナ・リーブランドとのハイブリッド品種、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、コセンダングサ（Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）などから選択される。
本発明の第５の態様は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターによって産生される遺伝物質が修飾された植物および子の世代を提供する。
本発明の第６の態様は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける感染性組み換えウイルスベクターを提供する。
本発明の第７の態様は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける菌株または組み換えウイルスを提供する。
本発明の第６の態様は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける感染性組み換えウイルスベクターを提供する。
本発明の第７の態様は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける菌株または組み換えウイルスを提供する。
本発明の第８の態様は、植物ゲノム編集における本明細書に記載の方法または組換え型ラブドウイルスベクター、または組換え型ラブドウイルスベクター、または本明細書に記載の菌株または組み換えウイルスの使用を提供する。
発明詳述
発明詳述
本発明をよりよく定義し、本発明を実施するように当業者に示唆するために、以下の定義および方法を提供し、明確に指定又は限定しない限り、用語が関連する分野の当業者の従来使用法に従って理解されるべきである。
本発明において、用語「植物」は、植物全体および任意の子の世代、および植物を構成する植物部分などを含み、植物部分は、植物細胞、植物細胞培養物、植物組織、植物組織培養物、植物挿し木、植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎および関連外植体）、植物種子（例えば、成熟種子、未成熟種子、種皮のない未成熟胚）などを含むが、これらに限定されない。植物細胞は、単離された単一細胞または細胞凝集体の形態（例えば、カルスおよび培養細胞）であってもよいし、プロトプラスト、配偶子を産生する細胞、または完全な植物に再生可能な細胞または細胞の集合であってもよい。植物細胞培養物または組織培養物は、当該細胞または組織由来の植物の生理学的または形態学的特徴を有する植物を再生することができ、かつ当該植物と実質的に同じである遺伝子型を有する植物を再生することができる。植物細胞培養物または組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分生細胞、カルス、花粉、葉、雄蕊の葯、根、根尖、糸、花、果仁、穂、穂軸、殻、または茎であってもよい。
用語「ラブドウイルス」は、マイナスセンスＲＮＡウイルスラブドウイルス科の一員であり、「マイナスセンスＲＮＡウイルス」は「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」とも呼ばれ、ウイルス粒子中にパッケージングしたウイルスゲノムがマイナスセンス（ｍＲＮＡの極性とは逆）であるヒト、動物、植物と真菌などを感染するウイルスであり、ゲノムが非分節型であるモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅ）を含み、例えば、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニヤミウイルス科（Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、Ｍｙｍｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＮｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅとＳｕｎｖｉｒｉｄａｅなど、ゲノムが分節型であるブニヤウイルス目（Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ）のブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、フェラウイルス科（Ｆｅｒａｖｉｒｉｄａｅ）、フィモウイルス科（Ｆｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ハンタウイルス科（Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ）、ジョンウイルス科（Ｊｏｎｖｉｒｉｄａｅ）、ナイウイルス科（Ｎａｉｖｉｒｉｄａｅ）、ペリブニヤウイルス科（Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ファシマウイルス科（Ｐｈａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、フェヌイウイルス科（Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ）とトマト黄化えそウイルス科（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｉｄａｅ）など。ゲノムが分節であり、目的に分類されていないアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アスピウイルス科（Ａｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ）とオルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）。ここで、ラブドウイルスは、典型的な桿菌状や弾丸状のウイルス粒子を有し、動物に感染するラブドウイルス科および植物を感染するラブドウイルス科を含み、動物に感染するラブドウイルス科は、リッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、エファメロウイルス属（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）、粒外ラブドウイルス属（Ｎｏｖｉｒｈａｂｄｉｖｉｒｕｓ）などを含むが、これらに限定されない。植物に感染するラブドウイルスは、主に以下の４つの属があり、それぞれヌクレオラブドウイルス属（Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、サイトラブドウイルス属（Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、二分ラブドウイルス属（Ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、ヴァリコサウイルス属（Ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ）である。細胞核ラブドウイルス属のメンバーは、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）、トウモロコシ条斑ウイルス（ｍａｚｅ ｆｉｎｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ、ＭＦＳＶ）、トウモロコシイランモザイクウイルス（ｍａｉｚｉｒａｎｉａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＭＩＭＶ）、トウモロコシモザイクウイルス（ｍａｚｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＭＭＶ）、ナスのまだら萎縮ウイルス（ｅｇｇ ｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ、ＥＭＤＶ）、ジャガイモ黄萎ウイルス（ｐｏｔａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ， ＰＹＤＶ）、コムギ黄縞ウイルス（ｗｈｅａｔ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｖｉｒｕｓ， ＷＹＳＶ）、イネ黄葉ウイルス（ｒｉｃｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｕｎｔ ｖｉｕｒｓ、ＲＹＳＶ）、芋脈退緑ウイルス（ｔａｒｏ ｖｅｉｎ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＴＶＣＶ）、クロスグリ随伴ラブドウイルス（ｂｌａｃｋ ｃｕｒｒａｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｈａｂｄｏｖｉｉｒｕｓ、ＢＣＡＲＶ）、マンダラ黄脈ウイルス（ｄａｔｕｒａ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｖｉｒｕｓ、ＤＹＶＶ）などを含むが、これらに限定されない。細胞質ラブドウイルス属のメンバーは、イネ縞モザイクウイルス（ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＭＶ）、ムギ北地モザイクウイルス（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｅｒｅａｌ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＮＣＭＶ）、トウモロコシ黄条斑ウイルス（ｍａｉｚｅ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｖｉｒｕｓ、ＭＹＳＶ）、オオムギ黄条斑モザイクウイルス（ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉａｔｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＢＹＳＭＶ）などを含むが、これらに限定されない。ヴァリコサウイルス属のメンバーは、ノスズメノテッポウバリコサウイルス（ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ、ＡＭＶＶ）、レタスヴァリコサ随伴ウイルス（ｌｅｔｔｕｃｅ ｂｉｇ ｖｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＬＢＶａＶ）、ムラサキツメクサバリコサウイルス（ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ、ＲＣＶＶ）などを含むが、これらに限定されない。二分ラブドウイルス属は、ランえそ斑紋ウイルス（ｏｒｃｈｉｄ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ、ＯＦＶ）、カンキツモザイク病ウイルス（ｃｉｒｕｓ ｌｅｐｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＣｉＬＶ）、柑橘退緑斑ウイルス（ｃｉｔｒｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ、ＣＣＳＶ）、コーヒー輪斑ウイルス（ｃｏｆｆｅｅ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ， ＣＲＶ）、タイセイ退緑斑点ウイルス（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ， ＣＬＣＳＶ）などを含むが、これらに限定されない。
ラブドウイルス科ウイルスゲノムの構造は保存的であり、ゲノム３’端から５’端までの順に３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’、すなわち、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、リンタンパク質Ｐ（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）、基質タンパク質Ｍ（Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、糖タンパク質Ｇ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ大サブユニットＬ（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ）などの５つの保存構造タンパク質をコードする。ここで、ラブドウイルスの最小感染ユニットリボ核タンパク質複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＲＮＰ）は、ウイルスのコアタンパク質によりゲノムＲＮＡを包んで構成され、コアタンパク質が、通常ヌクレオカプシドタンパク質ＮとＬであり、あるウイルスメンバーのコアタンパク質はまた他の種類のタンパク質、例えば、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）のコアタンパク質はリンタンパク質Ｐを含む。ラブドウイルスは、上述の５つの保存構造タンパク質をコードする以外に、一部のメンバーが付加的な非構造タンパク質をコードし、例えば、ＳＹＮＶは１つの付加的な非構造タンパク質ｓｃ４をコードする。ラブドウイルスゲノムの両端には、３’－ｌｅａｄｅｒと５’－ｔｒａｉｌｅｒ配列をそれぞれ含む。Ｌｅａｄｅｒ配列とｔｒａｉｌｅｒ配列は、いずれも非タンパク質コード配列であるが、ゲノムの複製とｍＲＮＡ転写に対して重要な制御役割を果たしている。ラブドウイルスの各遺伝子間には、保存的の遺伝子スペーサー配列を含み、例えば、Ｎ遺伝子とＰ遺伝子の間のスペーサーがＮＰＪ（Ｎ／Ｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）配列であり、遺伝子スペーサー配列の作用は、上流遺伝子の転写終了と下流遺伝子の転写開始であり、上流ｍＲＮＡ転写終結シグナルおよびポリアデニルテンプレートとするエレメント、ｍＲＮＡ合成過程で転写されない配列からなるエレメント（通常連続的なウラシルヌクレオチドＵを含む）、下流ｍＲＮＡ転写開始エレメントという３つの部分からなる。
ラブドウイルスの転写は順次転写と極性転写の特徴があり、順次転写とは、ウイルス転写の過程において、各ウイルス遺伝子がゲノム上での相対位置に従ってを順次転写し、極性転写とは、順次転写されたｍＲＮＡの生産量がゲノム上での相対位置に従って徐々に減少することである。ラブドウイルスの転写過程は、ウイルスポリメラーゼの作用下で行われ、ウイルスゲノムの３’端から最初にｌｅａｄｅｒ ｍＲＮＡを転写し、次に、ウイルスタンパク質をコードする夫々のｍＲＮＡを順次に転写し、転写過程が遺伝子スペーサー配列によって制御され、ウイルスポリメラーゼが各遺伝子間の遺伝子スペーサーに移動するとき、遺伝子スペーサーの上流に位置する遺伝子転写を終了し、ポリメラーゼ複合体によりｐｏｌｙ－Ａ配列を上流遺伝子のｍＲＮＡの末端に添加するとともに、５’キャップ構造と３’ｐｏｌｙ－Ａ構造を有するｍＲＮＡを放出し、このとき、ポリメラーゼ複合体は次の遺伝子の転写開始シグナルに出会うまで下流へ移動続けて、次の遺伝子の転写を開始し、最後にｔｒａｉｌｅｒ ｍＲＮＡに転写する。この結果、当該種類のウィルスを利用してベクター改造を行う場合、当該種類のウィルスの転写特徴に従う必要があり、外来核酸配列を添加すると同時に、外来核酸配列を独立転写ユニットにし、ウィルスポリメラーゼの作用下で転写と発現を行うことができるように、転写制御エレメント、すなわち、上述の遺伝子スペーサーを添加する必要がある。
用語「ベクター」は、遺伝子工学技術において外来核酸フラグメントを受容体細胞に転移させる自己複製可能なＤＮＡ分子を指し、一般的に、外来コード配列と特定の宿主においてコード配列を発現するために必要とされる適切な核酸配列を含み、プラスミドは例示的なベクターである。「組み換えウイルスベクター」、「組み換えウイルス発現ベクター」、「組み換えウイルスクローン」は、本明細書で交換可能に使用され、ウイルスベクターにより介在する特定の核酸配列を標的細胞、組織、器官または植物に送達することで形成されたコンストラクトである。「感染性ウイルスベクター」、「ウイルス感染性クローン」は、ウイルスベクターにより介在する特定の核酸配列を標的細胞、組織、器官または植物に送達し、かつ活性を有する組み換えウイルスを救い出すことができ、全身感染を実現することで形成されたコンストラクトを指す。
用語「外来」、「異種」は、外来種からの配列を指すか、または同じ種からの場合、意図的な人為的介入によって天然形態から組成および／または遺伝子座の顕著な変化が生じた配列を指す。用語「遺伝物質」は、親の代と子の世代との間で遺伝情報を伝送する物質である。「遺伝物質修飾すべき」は、単一または複数のデオキシリボヌクレオチド置換、欠失、添加、または上記の組み合わせを含むが、これらに限定されない。用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」は、交換可能に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、天然存在、変異、合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、およびヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含み、一本鎖または二重鎖であってもよい。そのような核酸またはポリヌクレオチドは、構造遺伝子のコード配列、アンチセンス配列、およびｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列を含むが、これらに限定されない。用語「遺伝子」、「遺伝子配列」は、生物学的機能に関するＤＮＡ核酸を指す。したがって、遺伝子は、ゲノム配列中のイントロンおよびエクソンを含むことができ、またはｃＤＮＡ中のコード配列のみを含むことができ、および／または調節配列と組み合わせたｃＤＮＡを含むことができる。
用語「配列特異的ヌクレアーゼ」（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＳＳｓｓ）とは、特定のＤＮＡ配列を切断し、ＤＮＡの二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を創出できるエンドヌクレアーゼである。現在よく使われる配列特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な短い配列の回文配列リピートおよびＣＲＩＳＰＲ関連システム（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を含むが、これらに限定されない。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」とは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと結合させることによって生成された人工制限酵素を指し、ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断エレメントと結合した工学的で改造されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの合成タンパク質を含み、特定のＤＮＡ配列で二重鎖切断を誘導することにより、ゲノム配列の遺伝子座特異的標的操作を達成するために使用することができる。「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」とは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）を誘導するＤＮＡ認識エレメントをヌクレアーゼの触媒エレメントに結合させることによって生成された人工制限酵素を指す。具体的には、ＴＡＬＥＮシステムは主にＴＡＬＥタンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインからなり、ＴＡＬＥタンパク質は３３～３５個のアミノ酸からなる重複ペプチドフラグメントを複数含み、夫々のペプチドフラグメントは１つの塩基を認識することができる。ＴＡＬＥＮを機能させるには、二量体の形式でそれぞれ５′から３′方向と３′から５′方向のＤＮＡ鎖を認識し、結合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを用いて標的配列を切断する必要がある。「クラスター化して規則的な短い配列の回文配列リピートおよびＣＲＩＳＰＲ関連システム」、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」、「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムに存在するヌクレアーゼ、およびその突然変異体（例えば、ニック酵素突然変異体、不活化突然変異体など）およびそれらの他の機能性タンパク質と結合する誘導体を指す。当該用語は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて細胞内でゲノム編集を達成可能な任意のヌクレアーゼを網羅する。
本発明において、用語「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」は、交換可能に使用され、一般に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合して複合体を形成し、かつ当該複合体を標的サイトに誘導することができるＲＮＡ分子を指す。Ｃａｓ９に基づくゲノム編集システムでは、ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ分子からなり、そのうちのｃｒＲＮＡは標的配列と相補する配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体と当該標的配列とを特異的に結合するように指導することができる。また、当技術分野で周知のように、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを結合させることにより単一ガイドＲＮＡとして設計することができる。一方、ＣｐＦ１に基づくゲノム編集システムでは、一般的にｇＲＮＡはｃｒＲＮＡのみを指す。
本発明において、用語「標的」、「標的サイト」、「標的配列」、「標的サイト配列」は、交換可能に使用され、一般に、作用される任意の所望の核酸配列を指し、コードまたは非コード配列、遺伝子、エクソン、イントロン、調節配列、遺伝子スペーサー配列、合成配列、および細胞内寄生生物配列などを含むが、これらに限定されない。
本発明において、用語「送達」は、核酸配列および／またはアミノ酸配列を標的細胞、組織、器官または植物に送達する手段を指し、送達方法は、遺伝子銃法、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム接種、機械的摩擦、真空浸透、高圧スプレーガン噴射、化学送達などを含むが、これらに限定されない。
本発明において、用語「ｔＲＮＡ」は、アミノ酸を担持して輸送する機能を有する小分子ＲＮＡを指し、クローバー状の二次構造に折り畳むことができ、真核生物体において、ｔＲＮＡ遺伝子転写によって産生されたｔＲＮＡ前駆体は、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＲＮａｓｅ Ｚによって認識され、成熟したｔＲＮＡに加工される。本発明のいくつかの実施形態では、使用されたｔＲＮＡ配列は、「多元誘導ゲノム編集および他のＲＮＡ技術のための方法および組成物」（特許公開番号ＷＯ ２０１６／０６１４８１）におけるｔＲＮＡＧｌｙコード配列から選択される。
本発明において、用語「組培」、「組織培養」は、交換可能に使用され、植物体から要求にかなう細胞、組織、器官またはプロトプラスト等を分離し、無菌操作により人工制御条件下で培養して再生の完全株を得たり、経済的価値のある他の製品を生産したりする技術である。
本発明において、用語「遺伝子編集」、「ゲノム編集」、「ゲノム部位特異的編集」、「ゲノム指向性編集」、「ゲノム修飾」、「ゲノム部位特異的修飾」、「ゲノム指向性修飾」は、交換可能に使用され、生命体ゲノム中の特定の標的遺伝子を修飾する技術である。一般的に、まず、ゲノム中の特定の位置で遺伝子座特異的二重鎖切断を産生し、生命体を誘導して非相同末端結合または相同組み換えを介して二重鎖切断を修復し、さらに標的修飾を産生する。
また、本明細書で用いられるように、単数形「１つ／１種類」および「前記」という語は、特定の文脈によって他に指示がない限り、複数の指示物を含む。
また、本明細書で用いられるように、単数形「１つ／１種類」および「前記」という語は、特定の文脈によって他に指示がない限り、複数の指示物を含む。
本発明は、修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない植物細胞遺伝物質を修飾する方法を提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）とを含む。
前記細胞遺伝物質修飾プロセスは、配列特異的ヌクレアーゼによって切断誘導され、植物内因性ＤＮＡ修復機器によって完成される。
好ましくは、前記方法は、ステップｂ）の後に、選択マーカーを利用する必要がなく、遺伝物質を含む修飾植物細胞対象を選択するステップｃ）をさらに含む。
前記細胞遺伝物質修飾プロセスは、配列特異的ヌクレアーゼによって切断誘導され、植物内因性ＤＮＡ修復機器によって完成される。
好ましくは、前記方法は、ステップｂ）の後に、選択マーカーを利用する必要がなく、遺伝物質を含む修飾植物細胞対象を選択するステップｃ）をさらに含む。
本発明は、修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない遺伝物質が修飾された植物を産生する方法をさらに提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）と、選択マーカーを利用する必要がなく、前記遺伝物質を含む修飾植物細胞対象を選択するステップｃ）とを含む。
本発明は、修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない遺伝物質が修飾された植物カルスを産生する方法をさらに提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）と、選択マーカーを利用する必要がなく、前記遺伝物質を含む修飾カルス対象を選択するステップｃ）とを含む。
前記修飾すべき細胞を感染する方法は、組み換えウイルス未接種細胞自然感染、汁の摩擦接種、接ぎ木、昆虫媒介伝播、またはウイルスＤＮＡコンストラクトを介さない他の任意の感染方法を含む。
前記細胞遺伝物質修飾は、標的サイトで少なくとも１つの塩基欠失、または１つの塩基挿入、または１つの塩基置換、またはこれらの修飾パターンの組み合わせを含む。
本発明は、ａ）ある種類の植物寄主を全身感染させることができる、ｂ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断することを特徴とする、感染性組み換え植物ラブドウイルスベクターをさらに提供する。
前記組換え型ラブドウイルスは、全身感染能力を有し、好ましくは、前記ラブドウイルスが、ノゲシ黄網ウイルスであり、本発明の実施形態で使用されたノゲシ黄網ウイルスゲノム核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、上記の配列は、当該ウイルスのノゲシ上の単離物の核酸配列であり、ノゲシに加えて、当該ウイルスは、レタス、チシヤ、キノア、タバコなどの複数種類の植物に感染することができ、他の寄主に由来するウイルス単離物の核酸配列も本発明に記載の方法に適用可能である。当該ウイルスゲノムの全長は１３．７ ｋｂであり、各遺伝子をコードする順序は３’－Ｎ－Ｐ－ｓｃ４－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’とし、ラブドウイルス転写方式によれば、異種核酸配列は、ウイルスゲノム中の任意の２つの隣接する遺伝子の間（例えば、Ｎ、Ｐの間、Ｐ、ｓｃ４の間、ｓｃ４、Ｍの間、Ｍ、Ｇの間またはＧ、Ｌの間）、またはｌｅａｄｅｒ領域の後（３’－ｌｅａｄｅｒとＮタンパク質との間）、ｔｒａｉｌｅｒ領域の前（Ｌタンパク質と５’－ｔｒａｉｌｅｒとの間）に挿入することができる。本発明のさらなる実施形態では、異種核酸配列の挿入位置は、３’－ｌｅａｄｅｒとＮタンパク質との間である。本発明のいくつかの実施形態では、異種核酸配列の挿入位置は、ＮとＰとの間であり、異種核酸配列の挿入は、ウイルス自身のコードポリシーに従う必要があり、異種核酸配列を添加すると同時に、独立転写ユニットになるために付加的なスペーサーを添加すべきである。ＳＹＮＶの各遺伝子スペーサーの長さは、１００から２００ ｎｔの間であり、かつ１６個前後の塩基保存配列（５’－ＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣ－３’）を含み、スペーサーを付加的に添加する場合、一般的に、これらの保存配列を含む必要があるが、残りの配列は突然変異、トランケーション、または長くすることができる。本発明の好ましい実施形態として、異種核酸配列を添加すると同時に、完全な遺伝子スペーサーを添加すべきである。
好ましくは、前記組換え型ラブドウイルスが、ナス斑点萎縮ウイルスであり、本発明の実施形態に使用されたナス斑点萎縮ウイルスゲノム核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。上記核酸配列は、当該ウイルスのナス上の単離物の核酸配列であり、ナスに加えて、当該ウイルスは、キュウリ、アジサイ、トマトなど多くの植物に感染することができ、他の寄主に由来するウイルス単離物核酸配列も本発明に記載の方法に適用可能である。当該ウイルスゲノムの全長は約１３．２ ｋｂであり、各遺伝子をコードする順序は３’－Ｎ－Ｘ－Ｐ－Ｙ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’とし、ノゲシ黄網ウイルスＳＹＮＶと同様に、異種核酸配列は、ウイルスゲノム中の任意の２つの隣接する遺伝子の間（例えばＮ、Ｘの間、Ｘ、Ｐの間、Ｐ、Ｙの間、Ｙ、Ｍの間、Ｍ、Ｇの間またはＧ、Ｌの間）、またはｌｅａｄｅｒ領域の後（３’－ｌｅａｄｅｒとＮタンパク質の間）、ｔｒａｉｌｅｒ領域の前（Ｌタンパク質と５’－ｔｒａｉｌｅｒとの間）に挿入することができる。異種核酸配列の挿入は、同様にウイルスのコードポリシーに従う必要があり、付加的なスペーサーを添加してから正常な転写および発現を行うことができる。ＥＭＤＶの各遺伝子スペーサーの長さは４７から２１７ ｎｔの間であり、かつ１７個前後の塩基保存配列（５’－ＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣ－３’）を含み、転写ユニットを付加的に添加する場合、一般的に、当該保存配列を保留する必要があるが、残りの配列は突然変異、トランケーション、または長くすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、異種核酸配列の挿入位置はＬｅａｄｅｒとＮとの間であり、本発明のさらなる実施形態では、異種核酸配列挿入位置はＮとＸとの間である。
前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターは、１つまたは複数の種々の変異および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターをさらに含む。好ましくは、前記修飾後のウイルスベクターが、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇ）が変異および／または組み換え修飾されたウイルスベクターである。マイナスセンスＲＮＡウイルスがコードするＧタンパク質構造は保存的であり、シグナルペプチド、Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメインとＣ末端ドメインから構成され、かつトリマーの形式でウイルス粒子の表面にモザイクされ、既存の研究結果が、Ｇタンパク質はウイルスと媒介の識別と伝播過程において重要な役割を果たし、例えば、トマト黄化えそウイルスにおけるＧタンパク質の１つの非同義突然変異（Ｃ１３７５Ａ）は、ウイルスの全身感染に影響しないことを明らかにした。しかし、媒介ヒラズハナアザミウマで伝播されることはできないため、組換え型ラブドウイルスベクターのＧタンパク質を部分的に欠失、突然変異または置換することにより、当該ウイルスの昆虫媒介の伝播に影響を与え、より高い生物安全性を有する。本発明のいくつかの実施形態では、ノゲシ黄網ウイルスのＧタンパク質Ｎ末端ドメインを欠失または置換することによって、全身感染能力を有する組み換えウイルスベクターを獲得することができ、かつ植物の部位特異的編集に影響を与えない。
前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼであり、好ましくは、前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。具体的には、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９）、Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１などのＣａｓ１２ａとも呼ばれる）、ＣａｓＸまたはＣａｓＹなどのすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼ、および前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づく一部のアミノ酸の突然変異、変異体または誘導体、例えば、ハイファイＣａｓヌクレアーゼｅｓｐＣａｓｔ９、Ｃａｓ９ニック酵素ｎＣａｓ９、Ｃａｓ９不活化酵素ｄＣａｓ９、塩基エディタＡＢＥ、ＣＢＥ、ＰＢＥなどである。
好ましくは、前記ヌクレアーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示される核酸配列を含むか、または２０％あるいはそれより高いの配列同一性を有する化膿レンサ球菌に由来するＳｐＣａｓ９またはラクノスピラに由来するＬｂＣｐＦ１である（例えば、３０％あるいはそれより高い、４０％あるいはそれより高い、５０％あるいはそれより高い、６０％あるいはそれより高い、７０％あるいはそれより高い、８０％あるいはそれより高い、８５％あるいはそれより高い、９０％あるいはそれより高い、９５％あるいはそれより高い、９７％あるいはそれより高い、９８％あるいはそれより高い、９９％あるいはそれより高い、または１００％の配列同一性）ヌクレオチド配列である。「同一性」は、配列（例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）の照合においてポリヌクレオチドまたはタンパク質セグメントの不変の程度を示す。配列の照合は、以下の工程により生成する：２つの配列、例えば、本明細書で提供されるような参照用の配列および別の配列を手動で対比して、個別のヌクレオチドまたはアミノ酸のような最大数目のマッチング要素を生成し、同時に、ニックを任意の配列に導入することを可能にし、参照配列と照合される配列の「同一性点数」は、マッチング要素の数を参照配列の全長で割ったものであり、照合プロセスによって参照配列に導入されるニックを含まない。本明細書で使用されるように、「百分率同一性」は、同一性点数に１００を乗算したものである。
当業者であれば、具体的な宿主種に対するコドン最適化の例が実現可能で、既知であり、より効率的なＣａｓヌクレアーゼの発現を獲得するためには、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列を具体的な種に応じてコドン最適化することができることが分かるはずである。コドン最適化とは、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、または最も頻繁に使用されるコドンを介して天然配列の少なくとも１つのコドン、例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上のコドンを置換するとともに、当該天然アミノ酸を維持し、核酸配列を修飾して関心のある宿主細胞における発現を強化する方法である。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトに対するコドン最適化を行うＣａｓ９ヌクレアーゼ配列の例を提供し、本発明のさらなる実施形態によれば、ベンサミアナタバコに対するコドン最適化を行うＣａｓ９ヌクレアーゼ配列の一例が提供される。
前記配列特異的ヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞レベル下局在化ドメインをさらに含むことができ、当該１つまたは複数の細胞レベル下局在化ドメインは、核局在シグナル、ミトコンドリア標的シグナル、または葉緑体標的シグナルを含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、前記細胞レベル下構造局在化ドメインは、核局在化配列（ＮＬＳ）である。一般に、ＮＬＳは、タンパク質の表面に曝露された正荷電を持つリジンまたはアルギニンの１つまたは複数の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳも公知である。前記ＮＬＳ配列は、ヌクレアーゼのＮ末端および／またはＣ末端に存在することができ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＮＬＳをＮ末端に結合してもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のＮＬＳをＣ末端に結合してもよく、上述した結合方式の組み合わせを採用してもよい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記ＮＬＳは、ヌクレアーゼのＮ末端およびＣ末端に同時に結合されたＳＶ４０核局在シグナルである。
前記ラブドウイルスベクターは、少なくとも１つの配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである場合、ラブドウイルスベクターが担持する核酸配列は、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方）およびＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列である。前記ｇＲＮＡは、標的配列の相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列Ｎｘと、Ｃａｓヌクレアーゼと結合して複合体を形成する配列とを含み、ここで、ＮｘはＸ個の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃを選択し、式中、Ｘが１８≦Ｘ≦３５の整数であり、好ましくはＸ＝２０である。
現在使用中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムでは、Ｃａｓ９とｇＲＮＡは、一般的に、独立した転写、発現ユニットに構築されており、Ｃａｓ９タンパク質発現ユニットはＰｏｌ ＩＩ型プロモーター、Ｃａｓ９ ＯＲＦ、ターミネーターからの順に構成されており、ｇＲＮＡ転写ユニットはＰｏｌ ＩＩＩ型プロモーター（Ｕ ６、Ｕ ３などの小ＲＮＡ転写プロモーターを用いることが多い）、ｇＲＮＡユニット、ＰｏｌｙＴターミネーターから順に構成されている。Ｃａｓ９タンパク質発現ユニットおよびｇＲＮＡ転写ユニットは、２つの独立ベクター上にそれぞれ構築して共形質転換することができ、２つの独立ユニットとして単一ベクター上に構築して形質転換することもでき、いくつかの結合配列を介してＣａｓ９タンパク質発現ユニットおよびｇＲＮＡ転写ユニットを同一のユニットに置いて単一ベクター上に構築して形質転換することもできる。ここで、Ｃａｓ９タンパク質の発現は、形質転換目標の特性と実験要求に応じて適切なＰｏｌ ＩＩ型プロモーターを選択することができ、例えば、動物細胞に常用のＣＭＶ、Ｈｓｐ７０、ＳＶ４０および植物に常用のＣａＭＶ３５Ｓ、ＺｍＵｂ１、ＡｔＵｂ１０などのプロモーターなど、一般的に、ｇＲＮＡ転写ユニットは、形質転換目標に応じて、標的ゲノム中の特異的なＵ６、Ｕ３などの小ＲＮＡ転写プロモーターを使用する。しかし、ラブドウイルスベクターの場合、ラブドウイルスの転写特徴により、付加的な発現ユニットに遺伝子スペーサーを添加すればよく、操作が極めて簡単で便利であり、且つガイドＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼ配列は同じ転写ユニットによって制御することができ、異なる転写ユニットによって制御することもできる。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列およびガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、同じ転写ユニットによって制御することができ、両者の間には、公知の結合配列によって結合される。具体的には、前記結合配列は５’－ＡＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＡＴＣ－３’（Ｍｉｋａｍｉらの２０１７年に報告されている配列を用いる）であり、当該結合配列に加えて、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列と、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列とを様々な方法で同じ転写ユニットに配置することができることが知られている。例えば、リボザイム（ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピンリボザイム、Ｄ型肝炎リボザイム、ＶＳリボザイム、Ｉクラスイントロン、ＲＮａｓｅ Ｐなど）、ｔＲＮＡ配列、Ｃｓｙｈ４配列などのＲＮＡ加工エレメントを含むが、これらに限定されない。本発明のさらなる実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列およびＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列は、それぞれ独立した転写ユニットとなるように付加的な遺伝子スペーサーをそれぞれ結合させる。
ガイドＲＮＡをコードする異種核酸配列が、独立した転写ユニットとして発現される場合、ラブドウイルス自身の転写特性に応じて、転写産物にはウイルスベクターに由来する余分な配列を含み、本発明のいくつかの実施形態では、上記ガイドＲＮＡの核酸配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼの核酸配列を担持する組換え型ラブドウイルスベクター（ＳＹＮＶ－ｇＧＦＰ２－Ｃａｓ９）の標的サイトに対する編集効率は２０％前後であった。本発明のさらなる実施形態では、比較的精確なガイドＲＮＡ転写産物を得るために、ガイドＲＮＡをコードする異種核酸配列の両側にｔＲＮＡＧｌｙ前駆体配列を添加し、当該前駆体配列は、植物内因性ｔＲＮＡ加工機器によって識別され、さらに、より精確なガイドＲＮＡ転写産物を切断して加工することができる。上記ガイドＲＮＡの核酸配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼの核酸配列を担持する組換え型ラブドウイルスベクター（ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９）の標的サイトに対する編集効率は９０％前後であった。したがって、ＲＮＡ加工エレメントを有する組み換えウイルスベクターは、本発明の好適なベクターであり、一般的なＲＮＡ加工エレメントは、リボザイム（ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピンリボザイム、Ｄ型肝炎リボザイム、ＶＳリボザイム、Ｉクラスイントロン、ＲＮａｓｅ Ｐなど）、ｔＲＮＡ配列、Ｃｓｙｈ４配列などを含むが、これらに限定されない。
前記ガイドＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個およびそれ以上などの単一遺伝子または複数の遺伝子を標的とすることができる。本発明のさらなる実施形態では、前記ガイドＲＮＡは単一遺伝子を標的とする。具体的には、標的された遺伝子はベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子であり、選択された標的はＰＤＳ標的１であり、使用された配列特異的ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、使用された組換え型ラブドウイルスはＳＹＮＶであり、得られた組み換えウイルス発現ベクターはＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９であり、当該ベクターの編集効率は７９％前後であった。本発明のさらなる実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、２つの遺伝子を同時に標的とする。具体的には、複数のｔＲＮＡ配列とｇＲＮＡ配列（ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ１－ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ２－ｔＲＮＡ）とを直列接続するポリシーを採用し、ｔＲＮＡ配列が植物内因性加工機構によって識別されて切断されると、２つのガイドＲＮＡ転写産物を同時に放出することができ、具体的には、前記遺伝子はベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６とＳＧＳ３であり、前記２つの標的サイトはそれぞれＲＤＲ６の標的１およびＳＳＧ３の標的１である。上記の標的は異種四倍体ベンサミアナタバコにおけるＲＤＲ６の２つのコピーおよびＳＧＳ３の２つのコピーをそれぞれ標的とすることができる。より具体的には、前記標的サイト配列は、それぞれ５’－ＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）と５’－ＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）であり、前記ｔＲＮＡ－ＲＤＲ６ ｔａｒｇｅｔ１－ｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔＲＮＡ－ＳＧＳ３ ｔａｒｇｅｔ１－ｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔＲＮＡを含む異種核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１０に示すとおりであり、得られた組換え型ラブドウイルスベクターはＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－１／ＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９であり、当該組換え型ラブドウイルスベクターのＲＤＲ６とＳＧＳ３に対する標的効率はそれぞれ９６％と９３％前後であった。本発明のさらなる具体的な実施形態では、ＳＹＮＶ多標的編集ベクターを用いてゲノム染色体フラグメントの部分的欠失を実現した。具体的には、ｔＲＮＡ配列を用いてベンサミアナタバコを標的とする内因性ＰＤＳ遺伝子の２つの標的サイトを直列接続し、２つのガイドＲＮＡ転写産物を放出し、ＰＤＳの標的１と標的３をそれぞれ標的とすることができる（この２つの標的は、いずれもベンサミアナタバコを標的とするＰＤＳの２つのコピーを同時に標的することができる）。具体的には、前記標的配列はそれぞれ５’－ＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）と５’－ＴＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）であり、前記ｔＲＮＡ－ＰＤＳ ｔａｒｇｅｔ１－ｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔＲＮＡ－ＰＤＳ ｔａｒｇｅｔ３－ｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ－ｔＲＮＡを含む異種核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すとおりであり、得られた組換え型ラブドウイルスベクターはＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１／３－Ｃａｓ９であり、当該ベクターの染色体フラグメントの部分的欠失の産生効率は４８％前後であった。
当業者であれば、上述した実施形態は、多標的編集方式の１つの好ましい形態に過ぎなく、ラブドウイルスの転写方式によれば、複数のガイドＲＮＡ転写ユニットが、例えば、複数のガイドＲＮＡ転写ユニットの異種核酸配列が遺伝子スペーサーをそれぞれ結合し、それぞれ独立した転写ユニットとなる方式、または、複数のガイドＲＮＡをコードする転写ユニットは、上述した結合配列に従って結合および発現される方式などの他の異なる方式により発現することが可能であり、また、上記の方式は実現可能で、既知であることが分かるはずである。例えば、本発明のさらなる実施形態では、複数のｃｒＲＮＡ異種核酸配列を直列接続することで、植物ゲノムの多標的編集を図ることができる。具体的には、前記ｃｒＲＮＡの直列手法は、直接繰り返し配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ、ＤＲ）－ガイド配列１（Ｇｕｉｄｅ １）－直接繰り返し配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ、ＤＲ）－ガイド配列２（Ｇｕｉｄｅ ２）－直接繰り返し配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ、ＤＲ）、すなわち、ＤＲ－ｇｕｉｄｅ１－ＤＲ－ｇｕｉｄｅ２－ＤＲである。ＤＲ配列がＣｐｆ１のｃｒＲＮＡ加工機構によって識別されて切断されると、２つのｃｒＲＮＡ転写産物を放出することができ、具体的には、前記２つの目的遺伝子は、１６ｃ内因性遺伝子ＧＦＰとＰＤＳであり、前記２つの標的サイトは、それぞれＧＦＰの標的１とＰＤＳの標的１であり、上述した標的は、異種四倍体１６ｃ株中のＧＦＰの１コピーとＰＤＳの２つのコピーをそれぞれ標的とすることができ、より具体的には、前記標的サイト配列は、それぞれ５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）と５’－ ＴＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）であり、前記ＤＲ－ＧＦＰ１－ＤＲ－ＰＤＳ１－ＤＲを含む異種核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すとおりであり、得られた組換え型ラブドウイルスベクターはｐＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ－１／ＰＤＳ－１－Ｃｐｆ１であり、当該ベクターのＧＦＰとＰＤＳに対する標的効率はそれぞれ８１％と８２％であった。
前記植物は、任意のラブドウイルスの寄主となる可能な植物であり、大部分の単子葉や双子葉植物、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、カエデ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）などの植物、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、水稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、コセンダングサ（Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニコチアナ・リーブランド（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・エドワードソニー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｄｗａｒｄｓｏｎｉｉ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ヒユアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、扶桑（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）、またはイヌホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）などの植物を含むが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態では、前記植物は、ベンサミアナタバコ、タバコ、ジャガイモ、トマト、ナスなどである。
本発明のいくつかの実施形態では、前記植物は、ベンサミアナタバコ、タバコ、ジャガイモ、トマト、ナスなどである。
前記ラブドウイルスを介して植物に感染する方法とは、遺伝子銃法、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム接種、機械的摩擦、株接ぎ木、真空浸透、高圧スプレーガン噴射などを含むが、これらに限定されない当分野で知られている任意の方法によって感染することである。本発明の好ましい実施形態では、アグロバクテリウム浸潤接種の手法を利用して組換え型ラブドウイルスの全身感染を実現する。本発明のさらなる実施形態では、組換え型ラブドウイルスの感染を開始するために、摩擦接種の手法を利用する。本発明の別の実施形態では、接ぎ木手法を利用してラブドウイルスの全身感染を実現する。
前記非トランスジェニックの安定に遺伝可能な指向性修飾植株を獲得する方法は、編集すべき植物の一部を組織培養し、標的サイトを部位特異的編集かつ安定に遺伝可能な株を得ることを含む。例えば、本発明の一実施形態では、ラブドウイルスベクターを用いてＣａｓ９ヌクレアーゼをコードして非トランスジェニックの編集植株を獲得する方法が提供される。前記組換え型ラブドウイルスがノゲシ黄網ウイルスであり、前記配列特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記遺伝子スペーサーがＮとＰとの間のスペーサーであり、前記ｔＲＮＡフランキング配列を含むガイドＲＮＡ異種核酸配列と、Ｃａｓ９を発現するための異種核酸配列とが、ＮＰＪ配列をそれぞれ結合して独立した転写ユニットになり、ＮとＰとの間に挿入し、前記目的遺伝子がベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子であり、前記標的サイトが５’－ＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）であり、得られた組換え型ラブドウイルスベクターがｐＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９である。当該ベクターは、ベンサミアナタバコに浸潤接種した後の全身感染葉の組織培養を経て、Ｍ０世代にウイルスを含まない非トランスジェニックの編集植株を獲得することができ、かつ安定に突然変異を子の世代に遺伝することができ、Ｍ１世代とＭ２世代の両方でウイルスを含まない非トランスジェニックの編集植株を獲得することができる。本発明のさらなる実施形態では、ラブドウイルスベクターを用いてＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードして非トランスジェニックの編集植株を獲得する方法が提供される。前記遺伝子スペーサーがＮ ５’ＵＴＲとＮＰＪであり、前記ｃｒＲＮＡを転写するための異種核酸配列と、ＬｂＣｐｆ１を発現するための異種核酸配列とが、遺伝子スペーサーをそれぞれ結合して２つの独立した転写ユニットになり、両者をＮ遺伝子転写ユニットの前に挿入し、前記目的遺伝子がベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子であり、前記標的サイトが５’－ＴＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）であり、前記ｃｒＲＮＡを発現するための異種核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すとおりである。得られた組換え型ラブドウイルスベクターがＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ１－Ｃｐｆ１であり、当該ベクターは、ベンサミアナタバコに浸潤接種した後の全身感染葉の組織培養を経て、Ｍ０世代でウイルスを含まない非トランスジェニックの編集植株を獲得することができ、かつ安定に突然変異を子の世代に遺伝することができる。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターによって産生される遺伝物質が修飾された植物および子の世代をさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける感染性組み換えウイルスベクターをさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける菌株または組み換えウイルスをさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターによって産生される遺伝物質が修飾された植物および子の世代をさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける感染性組み換えウイルスベクターをさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の方法または感染性組み換えウイルスベクターにおける菌株または組み換えウイルスをさらに提供する。
本発明は、植物ゲノム編集における本明細書に記載の組換え型ラブドウイルスベクター、組換え型ラブドウイルスベクター、菌株または組み換えウイルスの使用をさらに提供する。
本発現は、従来技術に比べて、以下のような有益な効果を有する。
(1)
(1)
(2) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、ガイドＲＮＡを転写するための異種核酸配列と、Ｃａｓヌクレアーゼを発現するための異種核酸配列とを同時に収容することができるより強い外来性フラグメント収容能力を有する。
(3)
(3)
(4) 前記組換え型ラブドウイルスベクターを植物に接種した後、ウイルスの複製に伴って大量の配列特異的ヌクレアーゼを産生し、標的遺伝子を編集し、より高い編集効率を得ることができる。
(5)
(5)
(6) ガイドＲＮＡ転写産物の産生は、ウイルス自身の転写ポリシーに依存するので、標的配列の最初の塩基は、従来のＵ６プロモーターまたはＵ３プロモーターに必要とされるＧまたはＡに限定されない。
(7) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、複数のヌクレアーゼを発現することができるので、複数のＰＡＭ配列を識別することができ、標的の範囲を拡大させる。
(8) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、複数の転写ユニットを同時に添加するか、またはｔＲＮＡ加工の方式を用いて多標的編集を行うことができる。
(9) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、良好な安定性を有し、得られた組換え型ラブドウイルスは、摩擦接種の方式により編集植株を獲得することができる。
(10) 本出願によれば、Ｍ０世代で非トランスジェニックの編集植物を直接獲得することができ、編集を子の世代に安定的に遺伝させることができる。
(7) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、複数のヌクレアーゼを発現することができるので、複数のＰＡＭ配列を識別することができ、標的の範囲を拡大させる。
(8) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、複数の転写ユニットを同時に添加するか、またはｔＲＮＡ加工の方式を用いて多標的編集を行うことができる。
(9) 前記組換え型ラブドウイルスベクターは、良好な安定性を有し、得られた組換え型ラブドウイルスは、摩擦接種の方式により編集植株を獲得することができる。
(10) 本出願によれば、Ｍ０世代で非トランスジェニックの編集植物を直接獲得することができ、編集を子の世代に安定的に遺伝させることができる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、そのような実施例が、単に説明的なものであり、限定とみなされるべきではないことに注意されたい。記載の本発明の実施例に基づいて、取得するその他の修正例または改善例は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
明確に指定又は限定しない限り、以下の実施例で用いる実験方法は、いずれも常に使用する処理法であり、実験に用いる試薬、材料もすべて常規の生物化学試薬会社から購入してもよい。
用いたベンサミアナタバコ材料、ウイルス材料は、すべて本実験室で保存したもので、用いた各種類の発現ベクターは、すべて本実験室で構築し、保存したものであった。
組換え型ラブドウイルスベクターＳＹＮＶ、ＳＹＮＶ－ＧＦＰ、コアタンパク質発現ベクターｐＧＤ－ＮＰＬ、ＲＮＡサイレンシング抑制サブタンパク質発現ベクター（ｐＧＤ－Ｈｃ－Ｐｒｏ、ｐＧＤ－ｐ１９、ｐＧＤ－γｂ）が、文献「Ｗａｎｇ Ｑ， Ｍａ Ｘ， Ｑｉａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ： Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ２０１５， １１： ｅ１００５２２３」に開示されている。
組換え型ラブドウイルスベクターＳＹＮＶ－ＲＦＰ、ＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｄＧＮ、ＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮが、文献「Ｓｕｎ Ｋ， Ｚｈｏｕ Ｘ， Ｌｉｎ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｔｒｉｘ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｂｕｄｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｖａｇｉｎａｔｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２０１８， １９：２２８８－２３０１」に開示されている。
植物双元発現ベクターｐＢＧＫ０１－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９が、文献「Ｆｕ Ｓ， Ｘｕ Ｙ， Ｌｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ Ｓ－ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｍｏｒｉｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｔｓ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ， ２０１８，１１：２６９－２８７」に開示されている。
プラスミドｐＹＱ２３０が、文献「Ｔａｎｇ， Ｘ．， Ｌｏｗｄｅｒ， Ｌ．Ｇ．， Ｚｈａｎｇ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ，２０１７， ３：１７０１８」に開示されている。
実施例１：ＳＹＮＶウイルスベクターを用いて二重レポーター遺伝子発現システムの構築
工程一：ＳＹＮＶ二重レポーター遺伝子発現ベクターの構築
実施例１：ＳＹＮＶウイルスベクターを用いて二重レポーター遺伝子発現システムの構築
工程一：ＳＹＮＶ二重レポーター遺伝子発現ベクターの構築
ＧＦＰとＲＦＰレポーター遺伝子を独立した発現フレームの形式でＳＹＮＶゲノムに同時に挿入する工程であって、挿入位置はＮとＰの間を含むが、これらに限定されない。以下、ＧＦＰとＲＦＰ発現フレームをＮとＰ遺伝子の間に同時に挿入することを例にして（図１Ａ）、ＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰの構築過程を詳述する。上記構築過程は、主に以下のステップを含む。
ステップ（１）において、表６中のＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／ＦおよびＮＰＪ－ＧＦＰ／Ｒ、ＧＦＰ／ＦおよびＮＰＪ－ＲＦＰ／Ｒ、ＲＦＰ／ＦおよびＰ－ＮｈｅＩ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ、ＳＹＮＶ－ＧＦＰ、ＳＹＮＶ－ＲＦＰをテンプレートとして、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、ＧＦＰフラグメント、ＲＦＰ－ＮｈｅＩフラグメントを増幅した。ここで、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメントは、Ｎ遺伝子上のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位から下流までのＮＰＪ領域を含み、ＲＦＰ－ＮｈｅＩフラグメントは、完全なＲＦＰ ＯＲＦと、下流のＮＰＪ配列からＰ遺伝子までのＮｈｅＩ酵素切断部位とを含む。これらのフラグメントは、いずれも隣接するフラグメントと相同する１５～２０ｂｐ配列を含み、相同組換えによって上述の３つのフラグメントを順次に直列接続することができ、フラグメント一Ｎ－ＧＦＰとフラグメント三ＲＦＰ－Ｐは、それぞれ直線化されたＳＹＮＶベクター（Ｂｓｕ３６Ｉ、ＮｈｅＩダブル酵素切断を経た後直線化）と相同する配列を含み、ＳＹＮＶベクターとの組換えに用いられる。
ステップ（２）において、制限エンドヌクレアーゼＢｓｕ３６ＩとＮｈｅＩを用いてＳＹＮＶベクターを消化し、電気泳動検出後にベクターフラグメントを回収し、直線化ベクターを取得し、精製後に待用とした。
ステップ（３）において、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ組換え方式を用いて、精製されたＢｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、ＧＦＰフラグメント、ＲＦＰ－ＮｈｅＩフラグメントを直線化ＳＹＮＶベクターに同時にクローンし、コロニーＰＣＲから陽性クローンＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰをスクリーニングして酵素切断同定を行い、酵素切断同定の誤りなくクローンに対してシークエンシングを行い、３つのフラグメントがＳＹＮＶベクターに順次に正確に組み立てられていることを検証した。
工程二：アグロバクテリウム形質転換、培養およびベンサミアナタバコに対する浸潤接種
電撃法を用いてＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰをアグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０５に導入した。
工程二：アグロバクテリウム形質転換、培養およびベンサミアナタバコに対する浸潤接種
電撃法を用いてＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰをアグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０５に導入した。
同時に、ＳＹＮＶ全身感染に必要とされるコアタンパク質発現ベクターｐＧＤ－ＮＰＬおよびウイルスＲＮＡサイレンシング抑制サブタンパク質発現ベクター（ｐＧＤ－Ｈｃ－Ｐｒｏ、ｐＧＤ－ｐ１９、ｐＧＤ－γｂ）をアグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０５に電撃形質転換した。
上記の組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰ、コアタンパク質発現ベクターｐＧＤ－ＮＰＬおよびＲＮＡサイレンシング抑制サブタンパク質発現ベクター（ｐＧＤ－Ｈｃ－Ｐｒｏ、ｐＧＤ－ｐ１９、ｐＧＤ－γｂ）を含むアグロバクテリウムを４ｍＬのＹＥＰ液体培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン＋２５μｇ／ｍＬリファンピシンを含む）にそれぞれ接種し、ＯＤ６００が０．８～１．２になるまで２８℃、２２０ｒｐｍ振盪、一晩培養し、５５００ｒｐｍ １０分間遠心分離し、上澄み液を捨て、菌体を浸潤緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＥＳ、２００ｍＭアセトシリンゴンを含む）で再懸濁し、ＯＤ６００を１．０前後に調整し、２～３時間静置した。
静置後のウイルス発現ベクター、コアタンパク質発現ベクター、ＲＮＡサイレンシング抑制サブタンパク質発現ベクターのアグロバクテリウムを１：１：１の割合で等体積混合してからベンサミアナタバコに浸潤接種し、４～６葉期の株を選択することが望ましく、浸潤接種は針を持たない１ｍｌの使い捨て注射器で葉の背へ浸潤し、１株当たり３～４枚の葉を浸潤させ、接種後、植株を２５℃隔離温室に置いて培養し、対照とした。同様の手法を利用して、ＧＦＰタンパク質のみを発現する組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ＧＦＰを浸潤接種した。
工程三：組み換えＳＹＮＶウイルスベクターが２つのレポーター遺伝子を同時に発現できるか否かを検出する
工程三：組み換えＳＹＮＶウイルスベクターが２つのレポーター遺伝子を同時に発現できるか否かを検出する
組み換えＳＹＮＶウイルスベクターＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰがベンサミアナタバコに接種した６日の前後、接種葉には顕著なＧＦＰとＲＦＰ蛍光が認められ、接種１２日の前後、蛍光レポーター遺伝子が細胞間に拡散移動し、接種３０日の前後、上部全身葉の葉脈と葉肉細胞に強いＧＦＰとＲＦＰ蛍光が認められたが（図１Ｂ）、対照としたＳＹＮＶ－ＧＦＰ接種植株にはＧＦＰ蛍光のみが認められ、ウイルス全身感染後、全ての接種株は矮化、葉カール、葉脈黄化、萼カールなどの典型的なウイルス感染症状を示し（図１Ｃ）、また、赤色蛍光タンパク質ＲＦＰの蓄積に伴いＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰを接種した株の花びらは、徐々にピンクの症状を呈した。上述の症状の産生は、ＳＹＮＶウイルスの感染によるものであることを確認するため、組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ＧＦＰ－ＲＦＰを接種した植株の全身葉を採集し、葉の総タンパクを抽出し、それぞれＳＹＮＶポリクローナル抗体、ＧＦＰモノクローナル抗体、ＲＦＰモノクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、葉の総タンパクからＳＹＮＶに対応するウイルスタンパク質バンド、ＧＦＰタンパク質バンドおよびＲＦＰタンパク質バンドが検出され、対照としたＳＹＮＶ－ＧＦＰを接種した葉からＳＹＮＶのウイルスタンパク質バンドとＧＦＰバンドのみが検出され、ＲＦＰバンドがないことが分かった（図１Ｄ）。上記の結果が、組み換えＳＹＮＶウイルスベクターがＧＦＰおよびＲＦＰという２つの外因性レポーター遺伝子を同時に発現できることを明らかにした。
実施例２：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ベクターの構築
実施例２：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ベクターの構築
ｇＲＮＡとＣａｓ９を独立した発現フレームの形式でＳＹＮＶゲノムに同時に挿入する工程であって、挿入位置はＮとＰの間を含むが、これらに限定されない。以下、ｇＲＮＡ転写ユニットとＣａｓ９発現フレームをＮとＰ遺伝子の間に同時に挿入することを例にして（図２Ａ）、ＳＹＮＶに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ベクターの構築過程を詳述し、構築されたクローンは以下のとおりである：
1) ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９：Ｃａｓ９タンパク質のみを発現するＳＹＮＶベクターであり、対照とした。
2) ＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを転写するとともにＣａｓ９タンパク質を発現するＳＹＮＶベクター。
3) ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを正確に転写するとともにＣａｓ９タンパク質を正確に発現するＳＹＮＶベクター。
具体なクローンの構築方法は以下のとおりである：
１）ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９
1) ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９：Ｃａｓ９タンパク質のみを発現するＳＹＮＶベクターであり、対照とした。
2) ＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを転写するとともにＣａｓ９タンパク質を発現するＳＹＮＶベクター。
3) ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを正確に転写するとともにＣａｓ９タンパク質を正確に発現するＳＹＮＶベクター。
具体なクローンの構築方法は以下のとおりである：
１）ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９
表６中のプライマーＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ－ＦおよびＦｌａｇ－ＮＰＪ／Ｒ、Ｃａｓ９／ＦおよびＣａｓ９／Ｒ、Ｃａｓ９－ＮＰＪ／ＦおよびＰ－ＮｈｅＩ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ、ｐＢＧＫ０１－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶをテンプレートとして、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、Ｃａｓ９ ＯＲＦフラグメント、ＮＰＪ－ＮｈｅＩフラグメント（図２Ａ）を増幅した。ここで、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメントは、Ｎ遺伝子上のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位から下流までのＮＰＪ領域を含み、ＮＰＪ－ＮｈｅＩフラグメントは、ＮＰＪ配列からＰ遺伝子までのＮｈｅＩ酵素切断部位を含む。これらのフラグメントは、いずれも隣接するフラグメントと相同する１５～２０ｂｐ配列を含み、フラグメント一Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪとフラグメント三ＮＰＪ－ＮｈｅＩは、それぞれＢｓｕ３６ＩとＮｈｅＩを介してダブル酵素切断後の直線化されたＳＹＮＶベクターと相同する配列を含むため、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合により上述の３つのフラグメントを順次に結合することで、ベクターＳＹＮＶ－Ｃａｓ９を獲得することができる。
２）ＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９
２）ＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９
表６中のプライマーＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／ＦおよびＧＦＰ２－ＮＰＪ／Ｒ、ＧＦＰ２－ｇＲＮＡ／ＦおよびｇＲＮＡ／Ｒ、ｇＲＮＡ－ＮＰＪ／ＦおよびＣａｓ９－ＡｈｄＩ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ、ｐＢＧＫ０１－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９をテンプレートとして、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、ｇＲＮＡフラグメント、ＮＰＪ－ＡｈｄＩフラグメント（図２Ａ）を増幅した。Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメントは、Ｎ遺伝子上のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位から下流までのＮＰＪ領域を含み、ｇＲＮＡフラグメントは、ＧＦＰ ｔａｒｇｅｔ２配列およびｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含み、ＮＰＪ－ＡｈｄＩフラグメントは、ＮＰＪ配列からＣａｓ９遺伝子までの酵素切断部位を含み、上述のフラグメントがｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ組み換えを経た後、ベクターＳＹＮＶ－ｇＧＦＰ２－Ｃａｓ９を獲得することができる。
３）ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９
３）ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９
ｇＲＮＡの精確な転写を実現するために、ｇＲＮＡの両端にｔＲＮＡ前駆体配列、すなわち、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ｔＲＮＡを結合し、ここで、ｔＲＮＡ配列は植物内因性加工機器によって識別切断された後、相対的に精確なｇＲＮＡ転写産物を放出することができる（図２Ｂ）。ＳＥＱ ＩＤ １～９によって提供される配列に従って異なる標的サイトを含む当該配列を合成するとともに、配列の５’および３’末端にそれぞれ１５ｎｔのＮＰＪ３’末端に由来する１５ｎｔ配列（５’－ＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＣＣ－３’）および５’末端の１５ ｎｔ配列（５’－ＴＡＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡ－３’）を添加し、次のステップの増幅およびクローンの構築を容易にする。選択された標的サイトはＧＦＰ、ＮｂＰＤＳ、ＮｂＲＤＲ６、ＮｂＳＧＳ３の２個、３個、２個、２個標的の順であった。これらの標的サイトはいずれも制限エンドヌクレアーゼを含み、ＰＣＲ／ＲＥ法ににより編集効率の検出を容易にし、また、これらの標的サイトはＮｂＰＤＳ、ＮｂＲＤＲ６、ＮｂＳＧＳ３の２つの相同コピー（ａとｂ）において完全に一致し、選択された標的サイトは上述の遺伝子にて同時に標的されることができる。上記合成された配列をテンプレートとして、表６中のプライマーＮＰＪ－ｔＲＮＡ／ＦとＮＰＪ－ｔＲＮＡ／Ｒを用いて増幅し、異なる標的サイトを含むｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ｔＲＮＡ配列を獲得し、同時にＳＹＮＶ－Ｃａｓ９をテンプレートとして、プライマーを用いてＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／ＦとＮＰＪ／Ｒ、ＮＰＪ／ＦとＣａｓ９－ＡｈｄＩ／Ｒに対して、それぞれＢｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、ＮＰＪ－ＡｈｄＩフラグメントを増幅し、ここで、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメントはＮ遺伝子上のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位から下流までのＮＰＪ領域を含み、ＮＰＪ－ＡｈｄＩフラグメントはＮＰＪ配列からＣａｓ９遺伝子までのＡｈｄＩ酵素切断部位を含み、上記３つのフラグメントをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローンすることで、それぞれＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ３－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－４－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９である異なる標的サイトを含むＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９ベクターを獲得した。
２つの標的サイトを同時に含むＳＹＮＶ編集ベクターを構築するために、ＳＥＱ ＩＤ １０－１２に提供された配列に従ってｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ｔＲＮＡフラグメントを合成し、同上の手法を利用してＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－１／ＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－４／ＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１／３－Ｃａｓ９を構築した。これらのベクターは、ＮｂＲＤＲ６の標的１とＮｂＳＧＳ３の標的１、ＮｂＲＤＲ６の標的４とＮｂＳＧＳ３の標的２、ＮｂＰＤＳの標的１と標的３をそれぞれ同時に標的とすることができる。
実施例３：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：アグロバクテリウム浸潤１６ｃ遺伝子組み換えタバコのＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９ベクターの接種
実施例３：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：アグロバクテリウム浸潤１６ｃ遺伝子組み換えタバコのＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９ベクターの接種
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＣＲＩＳＰＲ）オンライン設計ソフトウェアにより、１６ｃ植株中のＧＦＰを標的とすることができる２０ｎｔ標的配列（５’－ＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧ－３’と５’－ＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位ＮｄｅＩとＮｃｏＩである）を選択し、実施例２に記載の方法に従ってクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９とＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９を構築した。
実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、１６ｃ遺伝子組み換えタバコに浸潤接種し、接種後３０日の前後、浸潤植株は野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化のウイルス症状を示し、携帯紫外線ラップ下およびレーザー共焦点顕微鏡下でＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９を接種した植株では、ＧＦＰ緑色蛍光の発現量が明らかに低下し、葉肉細胞にはＧＦＰ蛍光の発現がほとんど認められず、緑色の孔辺細胞しか認められなかった。対照としたＳＹＮＶ－Ｃａｓ９接種の全身葉では、ＧＦＰ蛍光輝度は野生型１６ｃと一致した（図３Ａ）。
上述の症状の発生は、ＳＹＮＶ全身感染によるものであることを検証するために、発症植株の全身葉を採集し、葉の総タンパク質を抽出し、それぞれＳＹＮＶポリクローナル抗体、Ｆｌａｇタグ抗体、ＧＦＰモノクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、ＳＹＮＶ編集ベクターを接種した夫々の植株から、ＳＹＮＶに対応するウイルスタンパク質バンドとＣａｓ９タンパク質バンドを検出することができ、かつＧＦＰタンパク質の発現量が明らかに減少したことが分かった。対照としたベクターＳＹＮＶ－Ｃａｓ９が接種したタバコの葉におけるＧＦＰタンパク質の発現量は野生型１６ｃ植株と基本的に一致し（図３Ｂ）、上述の結果が、ＳＹＮＶウイルスベクターがｇＲＮＡ発現フレームとＣａｓ９発現フレームを同時に収容することができ、上述の外因性発現フレームを挿入した組換えウイルスベクターは、依然として全身感染性を有することを明らかにした。
外因性発現フレームがウイルスゲノムに統合できるか否かを探索するために、接種植株中のウイルス粒子を抽出し、電子顕微鏡下でウイルス粒体の形態特徴を観察した結果、組み換えウイルス粒体は典型的な弾状或いは棒状の形態を呈し、野生型ＳＹＮＶウイルス粒子（２４７ｎｍ前後）に比べ、編集ベクターのウイルス粒体の長さは明らかに長くなり、３３３ｎｍ前後に達することが分かった（図３Ｃ）。ウイルス粒体の長さは、組み換えウイルスゲノムの大きさと正割合し、この結果は、長さ４．８ ｋｂの外因性フラグメントがＳＹＮＶゲノムに統合され、成熟したウイルス粒体にパッケージされることを示した。
工程二：ＧＦＰ標的突然変異効率分析
工程二：ＧＦＰ標的突然変異効率分析
ＧＦＰ標的の編集効率を検証するために、ＰＣＲ／ＲＥ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ／Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いて接種植株の全身葉を測定し、プライマー表７中のプライマーＧＦＰ／ＦとＧＦＰ／Ｒを用いてＰＣＲを行った後、標的配列における対応する制限エンドヌクレアーゼを選択して酵素切断分析を行い、ＰＣＲ増幅産物が切断できない場合、当該標的サイトに突然変異が発生し、どのくらいバンドが切断できず、編集効率の高さを反映できることを示した。上述のＰＣＲ産物に対して酵素切断を行った後、ＧＦＰ標的１と標的２で、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、かつ突然変異の効率が９１％前後に達した（図４Ａ）。ＧＦＰの編集タイプを測定するために、上述のＰＣＲ増幅産物に対してＳａｎｇｅｒシークエンシング分析を行い、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、ＧＦＰの２つの標的サイトでそれぞれ１０個のモノクローナルを測定した結果、ＧＦＰ標的１と標的２で突然変異が生み出したモノクローナル数はそれぞれ７と８であり（図４Ｂ）、ＰＣＲ／ＲＥの検出結果と基本的に一致し、生成された編集タイプの多くは単一塩基や複数の塩基の欠失であった（図４Ｃ）。
実施例４：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物の精密加工による編集効率の向上
実施例４：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物の精密加工による編集効率の向上
ＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物の精確性を測定するために、ｃＲＴ－ＰＣＲの手法を利用してｇＲＮＡ転写産物のサイズを測定し、同時に組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物を対照とした。ウイルス自身の転写パターンによると、組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物の両端にはウイルス遺伝子スペーサーＮＰＪの５’ＵＴＲ配列と３’ＵＴＲ配列をそれぞれ含み、その転写産物のサイズは２０８～３００ ｎｔ前後（２０８ｎｔの転写産物および長さ不明のｐｏｌｙＡ配列）であった。組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物の両端にｔＲＮＡ認識配列を結合し、植物内因性ＲＮａｓｅ酵素認識加工を経た後、１００ｎｔ前後のｇＲＮＡ転写産物を産生すべきであり、認識加工を受けなかった場合、産生されたｇＲＮＡ転写産物のサイズは３６２～４００ ｎｔ前後（３６２ｎｔの転写産物および長さ不明のｐｏｌｙＡ配列）であった（図５Ａ）。
実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｇＧＦＰ２－Ｃａｓ９を構築し、ＳＹＮＶ－ｇＧＦＰ２－Ｃａｓ９およびＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９をそれぞれ１６ｃ株に接種し、上記ベクター接種株の全身葉の総ＲＮＡを抽出してｃＲＴ－ＰＣＲを行った。試験結果から、組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９が生み出したｇＲＮＡ転写産物のサイズはすべて１００ｎｔ前後（図５Ｂ）であり、ｔＲＮＡ配列が植物内因性ＲＮａｓｅ酵素によって完全に認識され加工されていることが分かった。さらに精確なｇＲＮＡ転写産物を放出し、ｇＲＮＡ転写産物の両端の残留配列をさらに検証するために、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合した後にＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。試験結果から、生成されたｇＲＮＡ－ｓｃａｆｆｏｌｄ転写産物の５’末端には残留塩基がなく、３’末端には１～３ｎｔが残留し、かつ残留塩基は３’末端に結合したｔＲＮＡ配列に由来することが分かった（図５Ｄ）。組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｇＧＦＰ２－Ｃａｓ９は、希望サイズ２０８ｎｔから３００ｎｔまでの転写産物を産生するほか、約１００ｎｔのサイズの転写産物（図５Ｂ）があり、当該小さいフラグメントをシークエンシング分析した結果から、当該小フラグメントは、ウイルスに由来する配列を除去した後のｇＲＮＡ転写産物であり、その３’末端にウイルス５’ＵＴＲ領域の１つの塩基またはｓｃａｆｆｏｌｄ配列の４～５塩基を欠失したことが分かった（図５Ｄ）。
上述の２種類の組み換えウイルスベクターの編集効率を比較するために、接種後の３０日前後、ランダムに２株の発症株を選択し、全身感染葉を採集し、ＰＣＲ／ＲＥ法とＳａｎｇｅｒシークエンシング法を用いてＧＦＰ標的の編集効率を測定した結果、ＧＦＰ標的の編集効率が１１～２０％前後であることが分かった（図５Ｃ）。
上述の結果が、ＳＹＮＶ編集ベクターがｔＲＮＡ加工メカニズムを採用していない場合、一つの加工メカニズムを利用して少量の精確なｇＲＮＡ転写産物を産生し、標的遺伝子に対してある程度の編集（１１～２０％前後）を産生することができ、植物内因性ｔＲＮＡ加工メカニズムを採用した場合、ｇＲＮＡ初期転写産物は植物内因性ＲＮａｓｅ酵素によって完全に識別され、精確なｇＲＮＡ転写産物に切断することができ、それにより当該ベクターの編集効率（９０％前後）を著しく高めることができることを明らかにした。したがって、ｇＲＮＡ転写産物の両端にｔＲＮＡ認識配列を結合するＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＮＡ－Ｃａｓ９が本発明の好適なベクターである。
実施例５：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
実施例５：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＣＲＩＳＰＲ）オンライン設計ソフトウェアにより、ＰＤＳを標的とすることができる２０ｎｔ標的配列（５’－ＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ－３’、５’－ＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧ－３’、５’－ＴＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＴＣ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位ＨｉｎｆＩ、ＮｃｏＩ、ＢｆａＩである）を選択し、上述の標的は、いずれも異種四倍体ベンサミアナタバコ中のＰＤＳのコピーａとｂを同時に標的することができる（図６Ａ）。実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ３－Ｃａｓ９をそれぞれ構築した。
実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ３－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図６Ｂ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いてＰＤＳの標的編集効率を測定し、使用されたプライマーはすべて同時にＰＤＳのコピーａとｂを増幅することができ、結果から分かるように、ＰＤＳの３つの標的サイトで、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、かつ編集効率が最大７９％前後（図６Ｃ）に達し、標的１を例にして、ランダムに選択された３株の植株において、編集効率はそれぞれ７９％、７０％、５６％であった。異なる株間の編集効率の違いは、ｇＲＮＡ転写産物やＣａｓ９タンパク質の発現量に関係している可能性がある。
Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを用いてＰＤＳ標的サイト１の編集状況を検証し、プライマー表７中のＰＤＳ特異的プライマーを用いてそれぞれＰＤＳコピーａとｂを増幅し、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、コピーごとに１０個のクローンを測定した結果、ＰＤＳコピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ８と７であり、ＰＣＲ／ＲＥ法で測定した編集効率の結果と基本的に一致し、また、編集タイプが、主に単一塩基や複数塩基の欠失および単一塩基の挿入などであった（図６Ｄ）。
実施例６：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
実施例６：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＣＲＩＳＰＲ）オンライン設計ソフトウェアにより、ＲＤＲ６を標的とすることができる２０ｎｔ標的配列（５’－ＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧ－３’、５’－ ＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＰｖｕＩＩである）を選択し、上述の標的は、いずれも異種四倍体ベンサミアナタバコ中のＲＤＲ６の２つのコピーａとｂを同時に標的することができる（図７Ａ）。
実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－４－Ｃａｓ９をそれぞれ構築し、実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＲＤＲ６－４－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図７Ｂ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いてＲＤＲ６の標的編集効率を測定し、使用されたプライマーはすべて同時にＲＤＲ６のコピーａとｂを増幅することができ、結果から分かるように、ＲＤＲ６の２つの標的サイトで、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、編集効率は最大９１％前後（図７Ｃ）に達した。
Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを用いてＲＤＲ６標的サイト１の編集状況を検証し、プライマー表７中のＲＤＲ６特異的プライマーを用いてそれぞれＲＤＲ６コピーａとｂを増幅し、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、コピーごとに１０個のクローンを測定した結果、ＲＤＲ６コピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ６と７であり、ＰＣＲ／ＲＥ法で測定した編集効率の結果と基本的に一致し、また、編集タイプが、主に単一塩基や複数塩基の欠失、単一塩基の置換または挿入などであった（図７Ｄ）。
実施例７：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＳＧＳ３を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＳＧＳ３を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
実施例７：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＳＧＳ３を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＳＧＳ３を選択使用して、本発明のウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＣＲＩＳＰＲ）オンライン設計ソフトウェアにより、ＳＧＳ３を標的とすることができる２０ｎｔ標的配列（５’－ＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴ－３’、５’－ ＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位ＴｓｃＡＩ、Ｅｃｏ１３０Ｉである）を選択し、上述の標的は、いずれも異種四倍体ベンサミアナタバコ中のＳＧＳ３の２つのコピーａとｂを同時に標的することができる（図８Ａ）。
実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９をそれぞれ構築し、実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、いずれも野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図８Ｂ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いてＳＧＳ３の標的編集効率を測定し、使用されたプライマーはすべて同時にＳＧＳ３のコピーａとｂを増幅することができ、結果から分かるように、ＳＧＳ３の２つの標的サイトで、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、編集効率は最大９１％前後（図８Ｃ）に達した。
Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを用いてＳＧＳ３標的サイト２の編集状況を検証し、プライマー表７中のＳＧＳ３特異的プライマーを用いてそれぞれＳＧＳ３コピーａとｂを増幅し、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、コピーごとに１０個のクローンを測定した結果、ＳＧＳ３コピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ８と６であり、ＰＣＲ／ＲＥ法で測定した編集効率の結果と基本的に一致し、また、編集タイプが、主に単一塩基や複数塩基の欠失、単一塩基の挿入などであった（図８Ｄ）。
実施例８：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多標的ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６とＳＧＳ３を同時に標的とする
実施例８：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多標的ベクターがベンサミアナタバコ内因性遺伝子ＲＤＲ６とＳＧＳ３を同時に標的とする
ＳＹＮＶベクターに基づくゲノム編集システムが植物ゲノムの多標的編集を行うことができるか否かを検証するために、ｔＲＮＡがｇＲＮＡ転写産物を直列接続する手法（ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ１－ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ２－ｔＲＮＡ）を使用して、ＳＹＮＶ二重標的編集ベクターを構築し、産生された一次転写産物は植物内因性ＲＮａｓｅ酵素によって識別され切断された後、２つの精確なｇＲＮＡ転写産物を同時に放出することができる（図９）。
実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－１／ＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－４／ＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９をそれぞれ構築し、ここで、組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－１／ＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９は、ＲＤＲ６の標的１（実施例６）とＳＳＧ３の標的１（実施例７）を同時に標的とすることができ、組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－４／ＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９は、ＲＤＲ６の標的４（実施例６）とＳＳＧ３の標的２（実施例７）を同時に標的とすることができる。実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－１／ＳＧＳ３－１－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＲＤＲ６－４／ＳＧＳ３－２－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、いずれも野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図１０Ａ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて、ＲＤＲ６とＳＧＳ３の標的編集効率を測定し、試験結果から、ＳＹＮＶ二重標的編集ベクターがＲＤＲ６とＳＧＳ３を同時に標的とする場合に、ＲＤＲ６またはＳＧＳ３の編集効率はＳＹＮＶ単標的編集ベクター（実施例６または実施例７）と基本的に一致することが分かった。この結果が、ＳＹＮＶベクターは植物ゲノム多標的の同時編集に利用することができ、かつ単標的の編集効率に影響を与えないことを明らかにした（図１０Ｂ）。
Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを用いてＲＤＲ６とＳＧＳ３の標的編集効率をさらに検証し、プライマー表７中の特異的プライマーを用いてそれぞれＲＤＲ６とＳＧＳ３の単一コピーを増幅し、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、コピーごとに１０個のクローンを測定した結果、ＲＤＲ６コピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ５と５であり、ＳＧＳ３コピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ７と８であり、ＰＣＲ／ＲＥ法で測定した編集効率の結果と基本的に一致し、また、編集タイプが、主に単一塩基や複数塩基の欠失、単一塩基や複数塩基の置換、単一塩基の挿入などであった（図１０Ｃ）。
実施例９：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多標的ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とすることにより引き起こされる染色体欠失
実施例９：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多標的ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とすることにより引き起こされる染色体欠失
ＳＹＮＶ多標的編集ベクターが植物ゲノムの染色体のフラグメントの欠失を引き起こすことができるか否かを検証するために、実施例２に記載の方法に従って組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＰＤＳ１／３－Ｃａｓ９を構築し、当該ベクターがＰＤＳの標的１と標的３（実施例５）を同時に標的とすることができ、実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＰＤＳ１／３－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図１１Ａ）。
上述の接種植株には染色体フラグメント欠失を産生できるか否かを測定するために、接種植株の総ＤＮＡを抽出し、同時に野生型植株の総ＤＮＡを対照として抽出し、プライマー表７中のプライマーＰＤＳ－１／３／ＦとＰＤＳ－１／３／Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行い、上述のプライマーがＰＤＳコピーａとｂを同時に増幅することができ、ここで、ＰＤＳコピーａの増幅産物のサイズは４９２ ｂｐであり、ＰＤＳコピーｂの増幅産物のサイズは４８６ ｂｐであった。ランダムに３株のＳＹＮＶ－ｔｇｔｇｔＰＤＳ１／３－Ｃａｓ９全身感染植株を選択して、試験結果から、上述の植株のＰＣＲ増幅産物は野生型バンドのサイズ以外に、２００ ｂｐ前後の小さいバンドが認められ、このサイズはＰＤＳ標的サイト１と標的サイト３の同時編集による染色体フラグメント欠失後のサイズと一致することが分かった（図１１Ｂ）。
上述のバンドはＰＤＳ二重標的の同時編集による生成されたものであることをさらに検証するために、当該フラグメントを回収してＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。試験結果から、当該バンドは確かにＰＤＳ標的サイト１と３の間の染色体フラグメント欠失によることが分かった。この結果をさらに分析すると、ＰＤＳコピーａとｂで、いずれもフラグメント欠失を産生し（図１１Ｃ）、そのシークエンシングピーク図は、図１１に示すとおりである（図１１Ｄ）。
実施例１０：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９感染の葉組織の再生およびＭ０世代遺伝子型分析
実施例１０：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９感染の葉組織の再生およびＭ０世代遺伝子型分析
再生編集植株を得るために、組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９接種後の全身葉を採集し、無菌水で洗浄した後、表面を７０％エタノールで３０秒消毒し、表面を０．１％リットルの水銀で１～２分間消毒し、無菌水で３回以上洗浄し、消毒後の葉を取り出し、明らかな主脈と葉のエッジをカットした後、葉を１ ｘ １ ｃｍ２の大きさにカットし、抗生物質なしのＭＳ分化培地（１ ｍｇ／Ｌ６－ＢＡを含む）上で培養し、２～３週間程で、分化した組織培養株が白子苗と緑色苗の２種類の表現型を示し（図１２Ａ）、分化芽を生根含有培地に移して培養し、３週間程で、培養瓶に無菌ｄｄＨ２Ｏを加えてラップをかけ、４～５日後、組織培養苗を土壌に移植した。
組織培養植株中のＰＤＳ標的サイトの編集状況を検出するために、Ｍ０世代の白子苗と緑色苗のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ／ＲＥ分析（図１２Ｂ）とＳａｎｇｅｒシークエンシング分析を行った。試験結果から、白子苗植株のＰＣＲ産物は完全に切断できなかったが、組織培養緑色苗のＰＣＲ産物は酵素切断を受けた後、完全切断、部分切断、完全切断不可という３種類の状況が出現したことが分かった。上記の各タイプの植株の統計結果について、表１に示すように、１）白子株（Ｍ０－１、－２、－４、－５、－９、－１１）ではＰＤＳコピーａとｂが完全に編集された；２）ＰＣＲ産物が完全にＨｉｎｆＩで切断された組織培養緑色植株（Ｍ０－３、－６）ではＰＤＳコピーａとｂは編集されなかった；３）ＰＣＲ生成物がＨｉｎｆＩで部分的に切断可能な組織培養緑色植物（Ｍ０－７、－１０、－１２、－１３、－１５、－２３、－２８、－３４、－３５、３９、４１）ではＰＤＳコピーａとｂは部分的に編集された；４）ＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩで完全に切断できない組織培養緑色植株（Ｍ０－８、－１８、－２１、－２２、－２７、－２９、－３１、－３２、－３３、－３６、－４２）ではＰＤＳコピーａとｂはいずれも編集された。このような植株の表現型は緑色であり、ＰＤＳ機能が完全に失われていないのは主に突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプが生み出したため、例えば、ｄ３、ｄ６、ｄ９など、ここで、ｄはｄｅｌｅｔｅを表す。
組織培養植株のウイルス含有状況を検出するために、Ｍ０世代植株の総ＲＮＡを抽出し、ＳＹＮＶのプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。試験結果から、少数の再生苗がすでにウイルスを除去し、Ｍ０世代でウイルス除去された非トランスジェニック編集植株、例えば、Ｍ０－７とＭ０－４２を獲得することができることが分かった（図１２Ｃ）。
実施例１１：Ｃａｓ９が生み出した突然変異は子の世代の植株に安定に伝達できることの検証
実施例１１：Ｃａｓ９が生み出した突然変異は子の世代の植株に安定に伝達できることの検証
突然変異がＭ０世代からＭ１世代に伝達できるか否かを検出するために、Ｍ０世代の緑色苗の種子（Ｍ１世代）を採取し、白子植株は開花結種できないため、実施例１０における第四タイプの植株、即ちＰＤＳコピーａとｂはすべて完全に編集され、突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含むＭ０世代の植株を選択使用して子の世代の分析を行った。Ｍ０－８を含む１１個のＭ０株系の子の世代をＭＳ培地に播種し、結果から分かるように、Ｍ１世代植株には、１）Ｍ０世代遺伝子型におけるＰＤＳａまたはｂが１つの突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含む場合、子の世代の分離比は３：１であった；２）Ｍ０世代遺伝子型におけるＰＤＳａとｂがそれぞれ１つの突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含む場合、子の世代の分離比は１５：１であるという２種類の分離が認められた（図１３）。
Ｍ０－８を例にして編集タイプの遺伝状況について説明する。当該植株の遺伝子型はｄ１ｉ１ｄ５ｄ３（図１４Ａ）であり、ここで、ｄはｄｅｌｅｔｅを表し、ｉはｉｎｓｅｒｔを表し、ｄ３は突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを表し、Ｍ０－８の１１４株のＭ１世代植株を検出した結果、８４株の緑色苗、３０株の白子苗が出現し、基本的に３：１のメンデルの法則に適合し、ランダムに４株の白子苗と６株の緑色苗を選択して、ＰＣＲ／ＲＥ分析およびシークエンシング分析を行った（図１４Ｂ）。結果から分かるように、Ｍ１世代植株におけるＰＤＳの編集タイプは完全にＭ０世代から由来し、新規の編集タイプは出現せず、ここで、白子苗中のＰＤＳ標的サイトは完全に編集され、かつフレームシフトし、例えば、Ｍ ８－１、遺伝子型はｄ１ｄ１ｄ５ｄ５であり、緑色苗に突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプｄ３を含むため、ＰＤＳ機能が完全に失われておらず、例えば、Ｍ８－９、遺伝子型はｄ１ｉ１ｄ５ｄ３であった。また、Ｍ０－１８、Ｍ０－２２、Ｍ０－２９、Ｍ０－４２などの株系を選択し、Ｍ１世代遺伝子型および表現型（表２）をさらに検証した結果が、Ｍ０世代植株の編集タイプはすべてＭ１世代に安定に遺伝でき、かつ編集タイプの伝達はメンデルの法則に適合することを明らかにした。
突然変異のＭ１世代からＭ２世代への伝達規則を検出するために、Ｍ１世代の種子（Ｍ２世代）を採取し、Ｍ２世代植株の編集状況を検出し、Ｍ８－９を例にして、遺伝子型はｄ１ｉ１ｄ５ｄ３であり、１５１株のＭ２世代を検出した結果、１１６株の緑色苗、３５株の白子苗が出現し、基本的に３：１のメンデルの法則に適合し、ランダムに５株の白子苗と５株の緑色苗を選択して、ＰＣＲ／ＲＥ分析およびシークエンシング分析を行った。試験結果から、Ｍ２世代植株におけるＰＤＳ遺伝子の編集タイプは完全にＭ１世代から由来し、かつ白子苗の遺伝子型はすべて突然変異かつフレームシフトの編集タイプであり、例えば、Ｍ８－９－１、遺伝子型はｄ１ｄ１ｄ５ｄ５であり、緑色苗の遺伝子型には、突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプｄ３を含み、例えば、Ｍ８－９－６、遺伝子型はｉ１ｉ１ｄ５ｄ３であることが分かった（図１４Ｃ）。
編集タイプのＭ１世代からＭ２世代への伝達規則をさらに検証するために、Ｍ１世代におけるホモ接合型植株を選択し、例えば、Ｍ８－３、遺伝子型はｉ１ｉ１ｄ３ｄ３であり、ランダムに当該株系の１０株のＭ２世代の植株を選択してシークエンシング検証を行った。試験結果から、そのＭ２世代の植株の遺伝子型はすべてｉ１ｉ１ｄ３ｄ３であることが分かった。また、Ｍ１世代ホモ接合型Ｍ１８－３、Ｍ２２－４、Ｍ２９－５、Ｍ４２－４を選択して子の世代の遺伝子型分析を行った。試験結果から、上述の株系のＭ２世代の植株はすべてホモ接合型であり、編集タイプはＭ１世代からＭ２世代に安定に遺伝でき、新規の編集タイプは産生しないことが分かった（表３）。
上記の結果が、ＳＹＮＶ編集システムを用いて得られた組織培養再生植株の編集タイプは子の世代に安定に遺伝でき（編集タイプは表４および表５を参照）、遺伝法則はメンデルの法則に従うことを明らかにした。
実施例１２：Ｃａｓ９編集植株Ｍ１世代のウイルスベクターの取り除きを検証する
実施例１２：Ｃａｓ９編集植株Ｍ１世代のウイルスベクターの取り除きを検証する
現在、植物ラブドウイルが種子を介して伝播できることに関しては未だ報告がなく、本実施例は、Ｍ１世代編集植株にＳＹＮＶウイルス感染が存在するか否かをさらに検出した。８つの株系、即ち、Ｍ０－８、－１８、－２２、－１９、－４２、－６、－７、および－４２を選択し、各株はランダムに４～５本のＭ１世代植株を選択し、総ＲＮＡを抽出し、ＳＹＮＶに対する特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ測定を行った。試験結果から、Ｍ１世代植株にはすべてＳＹＮＶウイルスを含まなく、得られたＴ１世代植株はすべてウイルス除去した非トランスジェニック編集植株であることが分かった（図１５）。
実施例１３：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ベクターのオフターゲット分析
実施例１３：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ベクターのオフターゲット分析
ＳＹＮＶ編集システムにオフターゲット効果が存在するか否かを検出するために、ＰＤＳ標的サイト１を選択してオフターゲット分析を行い、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒオンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）を用いてＰＤＳ標的サイト１に対して潜在的オフターゲット遺伝子座予測を行った。試験結果から、１つの標的配列と一致しない塩基数が２である潜在的オフターゲット遺伝子座、２つの標的配列と一致しない塩基数が３である潜在的オフターゲット遺伝子座、９３個の標的配列と一致しない塩基数が４である潜在的オフターゲット遺伝子座を発見した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｐオンライン設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＣＲＩＳＰＲ２／ＣＲＩＳＰＲ）を結合し、各潜在的オフターゲット遺伝子座のオフターゲット確率を分析し、計１３個の潜在的オフターゲット遺伝子座を選択して分析を行った（図１６Ａ）。
Ｔ７Ｅ１法を用いてＰＤＳ標的サイト１のオフターゲット状況を検出し、組織培養世代植株の生長過程で常にウイルスが存在し、より高いオフターゲット確率が存在するおそれがあるため、組織培養白子植株Ｍ０－１１を選択してオフターゲット測定を行い、表８のプライマーを用いて上述の潜在的オフターゲット遺伝子座に対してＰＣＲ増幅をそれぞれ行った。その結果、Ｍ０－１１のすべての潜在部位のＰＣＲ産物はＴ７Ｅ１の酵素切断を受けた後、いずれも対照とした野生型植株のバンドの輝度と一致し、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼが識別し、切断したバンドは認められなかった。この結果が、上述の潜在的オフターゲット遺伝子座はすべてオフターゲットしないことを明らかにした。この結果をさらに検証するために、ＨｉｎｆＩエンドヌクレアーゼを用いて上述の潜在的オフターゲット遺伝子座に対してＰＣＲ／ＲＥ分析を行い、１３個の潜在的オフターゲット遺伝子座のうちの２と３を除いて、残りのサイトはいずれもＨｉｎｆＩ酵素切断部位を含むため、上述の１１個の潜在的オフターゲット遺伝子座に対してＨｉｎＦＩ酵素切断を行った後、すべての部位は完全に酵素切断でき、酵素切断バンドも野生型対照と基本的に一致し、オフターゲットバンドの産生が認められなかった（図１６Ｂ）。
上記の結果が、ＳＹＮＶベクターに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムは、植物において比較的高い特異的を有することを明らかにした。
実施例１４：組み換えＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター摩擦接種継代および子の世代のウイルスの安定性分析
上記の結果が、ＳＹＮＶベクターに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムは、植物において比較的高い特異的を有することを明らかにした。
実施例１４：組み換えＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター摩擦接種継代および子の世代のウイルスの安定性分析
上記の実施例において、いずれもアグロバクテリウム浸潤接種を用いてＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターウイルス感染を開始し、他の接種方式の実現可能性を検証するために、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９感染した株の全身葉をウイルス源として採取し、機械的摩擦の方式を用いて健康の１６ｃ遺伝子組み換えタバコに接種し、同時に野生型ＳＹＮＶおよび組み換えベクターＳＹＮＶ－Ｃａｓ９を対照として接種し、接種後の３０日の前後、これらの株には、いずれも典型的なＳＹＮＶ全身感染の症状が認められ、携帯紫外線ランプ下で観察すると、対照植株に比べて、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９編集ベクターを接種した植株では、緑色蛍光タンパク質の発現量は明らかに低下し、植株も葉緑体自発赤色蛍光を呈していた（図１７Ａ）。
上述の接種植株の全身葉の総タンパク質を抽出してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行い、上述の感染した夫々の植株には大量のウイルス構造タンパク質Ｎ、Ｐ、ＭとＧが存在し、ＳＹＮＶ－Ｃａｓ９とＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９が感染した植株は、Ｃａｓ９タンパク質を発現した。対照植株に比べて、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９感染植株では、ＧＦＰタンパク質の発現量は明らかに低下した（図１７Ｂ）。これらの接種植株の全身葉の総ＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９が感染した植株では、ｇＲＮＡ転写ユニットとＣａｓ９ヌクレアーゼ配列は子の世代ウイルスゲノムに安定に存在し（図１７Ｃ）、ウイルスが摩擦継代後でも依然として安定であることを示した。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いてＧＦＰ標的の編集効率を測定した結果、ランダムに選択した３株のＳＹＮＶ－ｔｇｔＧＦＰ１－Ｃａｓ９を接種した植株では、ＧＦＰ標的サイトで、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、編集効率は最大８３％前後に達することが分かった（図１７Ｄ）。
実施例１５：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ベクターの構築
実施例１５：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ベクターの構築
ｃｒＲＮＡとＣｐｆ１を独立した発現フレームの形式でＳＹＮＶゲノムに同時に挿入する工程であって、挿入位置はｌｅａｄｅｒとＮの間を含むが、これらに限定されない。以下、ｃｒＲＮＡ転写ユニットとＣｐｆ１発現フレームをｌｅａｄｅｒとＮ遺伝子の間に同時に挿入することを例にして（図１８Ａ）、ＳＹＮＶに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集ベクターの構築過程を詳述し、構築されたクローンは以下のとおりである：
１）ＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１：Ｃｐｆ１タンパク質のみを発現するＳＹＮＶベクターであり、対照とした。
２）ＳＹＮＶ－ｃｒＲＮＡ－Ｃｐｆ１：ｃｒＲＮＡを正確に転写するとともにＣｐｆ１タンパク質を正確に発現するＳＹＮＶベクター。
具体なクローンの構築方法は以下のとおりである：
１）ＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１
１）ＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１：Ｃｐｆ１タンパク質のみを発現するＳＹＮＶベクターであり、対照とした。
２）ＳＹＮＶ－ｃｒＲＮＡ－Ｃｐｆ１：ｃｒＲＮＡを正確に転写するとともにＣｐｆ１タンパク質を正確に発現するＳＹＮＶベクター。
具体なクローンの構築方法は以下のとおりである：
１）ＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１
表６中のプライマーＰｖｕＩ／ＦおよびＮ５’ＵＴＲ／Ｒ、Ｃｐｆ１／ＦおよびＣｐｆ１／Ｒ、ＮＰＪ／ＦおよびＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ－ＧＦＰｌｅ／Ｎ、ＹＱ２３０、ＳＹＮＶ－ＧＦＰｌｅ／Ｎをテンプレートとして、ＰｖｕＩ－Ｎ５’ＵＴＲフラグメント、Ｃｐｆ１ ＯＲＦフラグメント、ＮＰＪ－Ｂｓｕ３６Ｉフラグメント（図１８Ａ）を増幅した。ここで、ＰｖｕＩ－Ｎ５’ＵＴＲフラグメントは、ＰｖｕＩ酵素切断部位からＮ遺伝子５’非コード領域までの配列を含み、ＮＰＪ－Ｂｓｕ３６Ｉフラグメントは、ＮＰＪ配列からＮ遺伝子のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位を含む。これらのフラグメントは、いずれも隣接するフラグメントと相同する１５～２０ｂｐ配列を含み、フラグメント一ＰｖｕＩ－Ｎ５’ＵＴＲとフラグメント三ＮＰＪ－Ｂｓｕ３６Ｉは、それぞれＰｖｕＩとＢｓｕ３６Ｉを介してダブル酵素切断後の直線化されたＳＹＮＶベクターと相同する配列を含むため、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合により上述の３つのフラグメントを順次に結合することで、ベクターＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１を獲得することができる。
２）ＳＹＮＶ－ｃｒＲＮＡ－Ｃｐｆ１
２）ＳＹＮＶ－ｃｒＲＮＡ－Ｃｐｆ１
表６中のプライマーＮ－ＰｖｕＩ／ＦおよびＮ５’ＵＴＲ／Ｒ、Ｎ５’ＵＴＲ－ＧＦＰ１／ＦおよびＮＰＪ－ＧＦＰ１／Ｒ、ＮＰＪ／ＦおよびＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ－ＧＦＰｌｅ／Ｎ、プライマー自身、ＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１をテンプレートとして、ＰｖｕＩ－Ｎ５’ＵＴＲフラグメント、ｃｒＲＮＡフラグメント、ＮＰＪ－Ｃｐｆ１－Ｂｓｕ３６Ｉフラグメント（図１８Ａ）を増幅した。ＰｖｕＩ－Ｎ５’ＵＴＲフラグメントは、ＰｖｕＩ酵素切断部位からＮ遺伝子５’非コード領域までの配列を含み、Ｃｐｆ１フラグメントは、ＧＦＰ ｔａｒｇｅｔ１配列を含み、ＮＰＪ－Ｃｐｆ１－Ｂｓｕ３６Ｉは、ＮＰＪ領域からＮ遺伝子のＢｓｕ３６Ｉサイトの間の配列であり、ここで、Ｃｐｆ１配列を含み、上述のフラグメントがｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ組み換えを経た後、ベクターＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ１－Ｃｐｆ１を獲得することができる。ウイルス自身の転写特徴により、両端にウイルス由来配列を含むｃｒＲＮＡ転写産物を放出し、Ｃｐｆ１切断を経て、精確なｃｒＲＮＡを産生することができる（図１８Ｂ）。
２つの標的サイトを同時に含むＳＹＮＶ編集ベクターを構築するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に提供された配列に従ってＤＲ－ｇｕｉｄｅ１－ＤＲ－ｇｕｉｄｅ２－ＤＲフラグメントを合成し、同上の手法を利用してＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ－１／ＰＤＳ－１－Ｃｐｆ１を構築した。これらのベクターは、ＧＦＰの標的１とＰＤＳの標的１をそれぞれ同時に標的とすることができる。
実施例１６：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：アグロバクテリウム浸潤１６ｃ遺伝子組み換えタバコのＳＹＮＶ ＣＲＩＰＳＲ／Ｃｐｆ１ベクターの接種
実施例１６：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：アグロバクテリウム浸潤１６ｃ遺伝子組み換えタバコのＳＹＮＶ ＣＲＩＰＳＲ／Ｃｐｆ１ベクターの接種
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｔ）オンライン設計ソフトウェアにより、１６ｃ植株中のＧＦＰを標的とすることができる２３ｎｔ標的配列（５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣ－３’と５’－ＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＧ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位ＮｄｅＩとＨｉｎｃＩＩである）を選択し、実施例１５の方法を使用してクローンＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ１－Ｃｐｆ１とＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ２－Ｃｐｆ１を構築した。
実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１、ＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ１－Ｃｐｆ１、ＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ２－Ｃｐｆ１をアグロバクテリウムに電撃して、１６ｃ遺伝子組み換えタバコに浸潤接種し、接種後３０日の前後、夫々の浸潤植株は野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化のウイルス症状を示し、また、携帯紫外線ラップ下にＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ１－Ｃｐｆ１、ＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ２－Ｃｐｆ１９を接種した植株では、ＧＦＰ緑色蛍光の発現量が明らかに低下し、葉肉細胞にはＧＦＰ蛍光の発現がほとんど認められず、緑色の孔辺細胞しか認められなかった。対照としたＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１接種の全身葉では、ＧＦＰ蛍光輝度は野生型１６ｃと一致した（図１９Ａ）。
上述の症状の発生は、ＳＹＮＶ全身感染によるものであることを検証するために、発症植株の全身葉を採集し、葉の総タンパク質を抽出し、それぞれＳＹＮＶポリクローナル抗体、Ｆｌａｇタグ抗体、ＧＦＰモノクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、ＳＹＮＶ編集ベクターを接種した植株から、いずれもＳＹＮＶに対応するウイルスタンパク質バンドとＣｐｆ１タンパク質バンドを検出することができ、かつＧＦＰタンパク質の発現量が明らかに減少したことが分かった。対照としたベクターＳＹＮＶ－Ｃｐｆ１が接種したタバコの葉におけるＧＦＰタンパク質の発現量は野生型１６ｃ植株と基本的に一致し（図１９Ｂ）、上述の結果が、ＳＹＮＶウイルスベクターがｃｒＲＮＡ発現フレームとＣｐｆ１発現フレームを同時に収容することができ、上述の外因性発現フレームを挿入した組換えウイルスベクターは、依然として全身感染性を有することを明らかにした。
工程二：ＧＦＰ標的サイト突然変異効率分析
工程二：ＧＦＰ標的サイト突然変異効率分析
ＧＦＰ標的の編集効率を検証するために、ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて、接種植株の全身葉におけるＧＦＰ遺伝子編集効率を測定し、プライマー表７中のプライマーＧＦＰ／ＦとＧＦＰ／Ｒを用いて標的サイトＤＮＡに対してＰＣＲを行い、標的配列における対応する制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩとＨｉｎｃＩＩを選択して酵素切断分析を行い、ＧＦＰ標的１と標的２で、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、かつ突然変異の効率が９０％前後に達した（図２０Ａ）。ＧＦＰ標的の編集タイプを測定するために、上述のＰＣＲ増幅産物をクローンした後、Ｔベクターに結合し、各標的サイトからそれぞれ１０個の陽性モノクローナルを選択してＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。ＧＦＰ標的１と標的２で突然変異が生み出したモノクローナル数はそれぞれ７と８であり（図２０Ｂ）、ＰＣＲ／ＲＥの検出結果と基本的に一致し、生成された編集タイプの多くは単一塩基や複数の塩基の欠失であった（図２０Ｃ）。
実施例１７：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を選択使用して、本発明のＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
実施例１７：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする
ベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を選択使用して、本発明のＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ウイルスベクター編集システムをさらに検証した。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｔ）オンライン設計ソフトウェアにより、ＰＤＳ遺伝子を標的とすることができる２３ｎｔ標的配列（ＰＤＳ１：５’－ＴＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧ－３’、ＰＤＳ－２：５’－ ＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＴ－３’、下線部分が対応する酵素切断部位ＨｉｎｆＩ、ＮｃｏＩである）を選択し、上述の標的は、いずれも異種四倍体ベンサミアナタバコ中のＰＤＳのコピーａとｂを同時に標的することができる（図２１Ａ）。実施例２に記載の方法に従って、上記の標的を標的とすることができる構築組み換えウイルスクローンＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ１－Ｃｐｆ１、ＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ２－Ｃｐｆ１をそれぞれ構築した。
実施例１の方法を使用して組み換えウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ１－Ｃｐｆ１、ＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ２－Ｃｐｆ１をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組み換えウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図２１Ｂ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて、ＰＤＳの標的編集効率を測定し、使用されたプライマーはすべて同時にＰＤＳのコピーａとｂを増幅することができ、試験結果から、ＰＤＳの２つの標的サイトで、いずれも異なる程度の突然変異が発生し、編集効率が最大７９％前後（図２１Ｃ）に達し、標的１を例にして、ランダムに選択された３株の植株において、編集効率はそれぞれ７９％、７０％、７３％であることが分かった。
Ｓａｎｇｅｒシークエンシングを用いてＰＤＳ標的サイト１の編集状況を検証し、プライマー表７中のＰＤＳ特異的プライマーを用いてそれぞれＰＤＳコピーａとｂを増幅し、ＰＣＲ産物をＴベクターに結合し、コピーごとに１０個のクローンを測定した結果、ＰＤＳコピーａとｂでの突然変異クローン数はそれぞれ８と７であり、ＰＣＲ／ＲＥ法で測定した編集効率の結果と基本的に一致し、また、編集タイプが、主に単一塩基や複数塩基の欠失などであった（図２１Ｄ）。
実施例１８：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１多標的ベクターがＧＦＰとＰＤＳ遺伝子を同時に標的とする
実施例１８：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１多標的ベクターがＧＦＰとＰＤＳ遺伝子を同時に標的とする
ＳＹＮＶベクターに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが植物ゲノムの多標的編集を行うことができるか否かを検証するために、ＤＲがｇｕｉｄｅ転写産物を直列接続する手法（ＤＲ－ｇｕｉｄｅ１－ＤＲ－ｇｕｉｄｅ２－ＤＲ）を使用して、ＳＹＮＶ二重標的編集ベクターを構築し、産生された一次転写産物はＣｐｆ１加工を経た後、余分な非コード領域配列を除去し、精確なｃｒＲＮＡを放出することができる（図２２）。
実施例１５に記載の方法に従って組換え型ラブドウイルスクローンＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ－１／ＰＤＳ－１－Ｃｐｆ１を構築し、当該ベクターは、ＧＦＰの標的１（実施例１６）とＰＤＳの標的１（実施例１７）を同時に標的とすることができる。実施例１の方法を使用して組換え型ラブドウイルス発現ベクターＳＹＮＶ－ｃｒＧＦＰ－１／ＰＤＳ－１－Ｃｐｆ１をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、上述組換え型ラブドウイルス発現ベクターがベンサミアナタバコに接種した３０日の前後、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図２３Ａ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて、ＧＦＰとＰＤＳの標的編集効率をそれぞれ測定し、試験結果から、ＳＹＮＶ二重標的編集ベクターがＧＦＰとＰＤＳを同時に標的とする場合に、ＧＦＰまたはＰＤＳの編集効率はＳＹＮＶ単標的編集ベクター（実施例１６または実施例１７）と基本的に一致することが分かった。この結果が、ＳＹＮＶベクターは植物ゲノム多標的の同時編集に利用することができ、かつ単標的の編集効率に影響を与えないことを明らかにした（図２３Ｂ）。
実施例１９：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１感染の葉組織の再生およびＭ０世代遺伝子型分析
実施例１９：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１感染の葉組織の再生およびＭ０世代遺伝子型分析
再生編集植株を得るために、組み換えウイルスベクターＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ１－Ｃｐｆ１感染後の全身葉を採集し、実施例１０に記載の方法に従って組織培養再生を行った。
組織培養植株中のＰＤＳ標的サイトの編集状況を検出するために、Ｍ０世代の白子苗と緑色苗のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ／ＲＥ分析（図２４Ｂ）とＳａｎｇｅｒシークエンシング分析を行った。試験結果から、白子苗植株のＰＣＲ産物は完全に切断できなかったが、組織培養緑色苗のＰＣＲ産物は酵素切断を受けた後、完全切断、部分切断、完全切断不可という３種類の状況が出現することが分かった。上記の各タイプの植株に対してＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った結果について、表９および表１０に示すように、１）白子株（Ｍ０－１、－２、－３、－４）ではＰＤＳコピーａとｂが完全に編集された；２）ＰＣＲ産物が完全にＨｉｎｆＩで切断された組織培養緑色植株（Ｍ０－５、－７、－１０、－１２、－２０、－２５、－２７、－２８、－３０、－３１）ではＰＤＳコピーａとｂは編集されなかった；３）ＰＣＲ生成物がＨｉｎｆＩで部分的に切断可能な組織培養緑色植物（Ｍ０－６、－８、－１３、－１８、－１９）ではＰＤＳコピーａとｂは部分的に編集された；４）ＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩで完全に切断できない組織培養緑色植株（Ｍ０－９、－１１、－１４、－１５、－１６、－１７、－２１、－２２、－２３、－２４、２６、－２９）ではＰＤＳコピーａとｂはいずれも編集された。このような植株の表現型は緑色であり、ＰＤＳ機能が完全に失われていないのは主に突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプが生み出したため、例えば、ｄ３、ｄ６、ｄ９など、ここで、ｄはｄｅｌｅｔｅを表す。
組織培養植株のウイルス含有状況を検出するために、Ｍ０世代植株の総ＲＮＡを抽出し、ＳＹＮＶのプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。試験結果から、一部の再生苗がすでにウイルスを除去し、Ｍ０世代でウイルス除去された非トランスジェニック編集植株、例えば、Ｍ０－６、Ｍ０－１７、Ｍ０－１８、Ｍ０－２２、Ｍ０－２３、Ｍ０－２４、Ｍ０－２７とＭ０－２８を獲得することができることが分かった（図２４Ｃ）。
実施例２０：Ｃｐｆ１が生み出した突然変異は子の世代の植株に安定に伝達できることの検証
実施例２０：Ｃｐｆ１が生み出した突然変異は子の世代の植株に安定に伝達できることの検証
ＳＹＮＶ－ｃｒＰＤＳ１－Ｃｐｆ１により編集されたＭ０世代の緑色苗の種子（Ｍ１世代）を採取し、実施例１９における第四タイプの植株、即ちＰＤＳコピーａとｂはすべて完全に編集され、突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含むＭ０世代の植株を選択して子の世代の分析を行った。当該タイプＭ０株系の子の世代をＭＳ培地に播種し、Ｍ１世代芽生えた後、１）Ｍ０世代ＰＤＳａまたはｂ遺伝子型がホモ接合型のフレームシフトではない編集タイプを含む場合、Ｍ０－１５子の世代のように白子苗がなかった；２）Ｍ０世代遺伝子型におけるＰＤＳａまたはｂが１つの突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含む場合、子の世代の分離比は３：１であった；３）Ｍ０世代遺伝子型におけるＰＤＳａまたはｂがそれぞれ１つの突然変異であるが、フレームシフトではない編集タイプを含む場合、子の世代の分離比は１５：１であるという３種類の分離状況が出現した（図２５）。
上記の結果が、ＳＹＮＶ編集システムを用いて得られた組織培養再生植株の編集タイプは子の世代に安定に遺伝でき、遺伝法則はメンデルの法則に従うことを明らかにした。
実施例２１：Ｇタンパク質Ｎ末端欠失または置換のＳＹＮＶ編集ベクターは、ベンサミアナタバコのゲノムに対する部位特異的編集の実現
実施例２１：Ｇタンパク質Ｎ末端欠失または置換のＳＹＮＶ編集ベクターは、ベンサミアナタバコのゲノムに対する部位特異的編集の実現
ラブドウイルスがコードするＧタンパク質は、シグナルペプチド、Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメインとＣ末端ドメインから構成され、かつトリマーの形式でウイルス粒子の表面にモザイクされ、既存の研究結果が、Ｇタンパク質はウイルスと媒介の識別と伝播過程において重要な役割を果たし、ＳＹＮＶのＧタンパク質に対して欠失または突然変異を行うと、当該ウイルスの昆虫媒介の認識または伝播に影響を与える可能性があり、より高い生物安全性を有することを明らかした。
ＳＹＮＶのＧタンパク質Ｎ末端に（ＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｄＧＮ）欠失またはＮ末端ドメインをレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙ（ＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮ）に置換したうえで、Ｎ上の単酵素切断部位Ｂｓｕ３６ＩとＰ上の単酵素切断部位ＮｈｅＩ酵素切断ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９を用いてＢｓｕ３６Ｉ－ＮｈｅＩフラグメントを回収し、Ｂｓｕ３６ＩとＮｈｅＩを介して直線化されたベクターＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｄＧＮとＳＹＮＶ－ＲＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮに結合し、得られたクローンはＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９－ｄＧＮとＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮである（図２６Ａ）。
実施例１に記載の方法に従って組み換えウイルス編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９－ｄＧＮとＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮをアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤するとともに、対照としてＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９を接種し、接種後３０日の前後、夫々の接種株は、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化のようなウイルス症状を示し、かつＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ１－Ｃａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙ：ＧＮ接種株の全身葉は蛍光顕微鏡下で明らかなｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光が認められた（図２６Ｂ）。発症株の全身葉から抽出した総タンパク質に対してＧタンパク質モノクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、ＳＹＮＶ編集ベクターを接種した株では、野生型ＳＹＮＶと同じサイズのＧタンパク質バンドが検出されたが、Ｇタンパク質Ｎ末端ドメインをレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙに置き換えると、サイズ３６．７ ｋＤのｍＣｈｅｒｙ：ＧＮ結合タンパク質が検出され、予期のサイズと一致することが分かった（図２６Ｃ）。上記の結果が、ＳＹＮＶのＧタンパク質Ｎ末端ドメインに対して欠失や置換を行った後、組み換えウイルスの全身感染性に影響を与えないことを明らかにした。
上記のベクターがＰＤＳに対する標的編集効率を検証するために、ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて接種植株の全身葉を検出し、使用されたプライマーは、いずれもＰＤＳのコピーａとコピーｂを同時に増幅することができ、試験結果から、上述の組み換えベクターは、いずれもＰＤＳ標的サイト１に対して有効な編集を産生でき、かつ編集効率は既存のＳＹＮＶ編集ベクターに相当し（図２６Ｄ）、ＳＹＮＶのＧタンパク質Ｎ末端ドメインに対して欠失または置換後、組み換えウイルスの編集効率に影響を与えないことが分かった。
上記の結果が、Ｇタンパク質Ｎ末端欠失または置換のＳＹＮＶ編集ベクターを用いて、ベンサミアナタバコのゲノムに対する部位特異的編集を実現した。
実施例２２：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／ｏＣａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする。
上記の結果が、Ｇタンパク質Ｎ末端欠失または置換のＳＹＮＶ編集ベクターを用いて、ベンサミアナタバコのゲノムに対する部位特異的編集を実現した。
実施例２２：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／ｏＣａｓ９ベクターがベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳ遺伝子を標的とする。
具体的な種に対するＣａｓヌクレアーゼコドン最適化の実施方式が実行可能であることを検証するために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに対してベンサミアナタバコに対するコドン最適化を行い、ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／ｏＣａｓ９編集ベクターのベンサミアナタバコ内因性ＰＤＳに対する標的編集効率を検証した。
既存の編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９に基づき、Ｃａｓ９核酸配列をｏＣａｓ９配列に置き換え、それをＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－ｏＣａｓ９（図２７Ａ）に改造した。具体的な構築プロセスは以下のとおりである：
まず、ｏＣａｓ９のみを発現するＳＹＮＶベクターを構築する。その構築過程は、ＳＥＱ ＩＤ： ３６が提供した配列に従ってベンサミアナタバココドン最適化ｏＣａｓ９配列を合成し、表６中のプライマーＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／ＦおよびＮＰＪ－ｏＣａｓ９／Ｒ、ｏＣａｓ９／ＦおよびＣａｓ９／Ｒ、Ｃａｓ９－ＮＰＪ／ＦおよびＰ－ＮｈｅＩ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ、ｏＣａｓ９、ＳＹＮＶをテンプレートとして、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメント、ｏＣａｓ９ ＯＲＦフラグメント、ＮＰＪ－ＮｈｅＩフラグメントを増幅した。ここで、Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪフラグメントは、Ｎ遺伝子上のＢｓｕ３６Ｉ酵素切断部位から下流までのＮＰＪ領域を含み、ＮＰＪ－ＮｈｅＩフラグメントは、ＮＰＪ配列からＰ遺伝子までのＮｈｅＩ酵素切断部位を含む。これらのフラグメントは、いずれも隣接するフラグメントと相同する１５～２０ｂｐ配列を含み、フラグメント一Ｂｓｕ３６Ｉ－ＮＰＪとフラグメント三ＮＰＪ－ＮｈｅＩは、それぞれＢｓｕ３６ＩとＮｈｅＩダブル酵素切断を経た後直線化されたＳＹＮＶベクターと相同する配列を含み、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合により上述の３つのフラグメントを順次に結合することで、ベクターＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９を獲得することができる。次に、表６中のプライマーＮ－Ｂｓｕ３６Ｉ／ＦおよびＰ２ ２０ｎｔ／Ｒ、Ｐ２ ２０ｎｔ／ＦおよびｏＣａｓ９／Ｂｓｕ３６Ｉ／Ｒで、それぞれＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９をテンプレートとして、Ｎ／Ｂｓｕ３６Ｉ－ＰＤＳ２フラグメント、ＰＤＳ２－ｏＣａｓ９／Ｂｓｕ３６Ｉフラグメントを増幅し、Ｂｓｕ３６Ｉで直線化されたＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９ベクターとｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合を行い、得られたベクターはＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－ｏＣａｓ９であった。
実施例１に記載の方法に従って組み換えウイルス編集ベクターＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－ｏＣａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、同時に対照としてＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９を接種し、接種後の３０日の前後、夫々の接種植株は、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化のウイルス症状を示した（図２７Ｂ）。上述のベクターのＰＤＳに対する標的編集効率を検証するために、それぞれランダムに１０株の全身感染した植株を選択し、ＰＣＲ／ＲＥ法を用いて全身葉を検出し、使用されたプライマーはいずれもＰＤＳのコピーａとコピーｂを同時に増幅することができる。試験結果から、上述の組み換えベクターはすべてＰＤＳ標的サイト１に対して有効な編集を産生でき、かつ編集効率は既存のＳＹＮＶ編集ベクターに相当することが分かった（図２７Ｃ）。上述の結果が、Ｃａｓヌクレアーゼに対して具体的な種のコドン最適化は実行可能性を有することを明らかにした。
実施例２３：ＳＹＮＶ単転写ユニット編集ベクターに基づくＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９編集システム
実施例２３：ＳＹＮＶ単転写ユニット編集ベクターに基づくＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９編集システム
ＳＹＮＶ編集ベクターの中で、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９が同一の転写ユニットによって制御できることを検証するために、１５ｂｐのｓｐａｃｅｒ配列（５’－ＡＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＴＡＴＣ－３’）を用いてベンサミアナタバココドン最適化のＣａｓヌクレアーゼ配列とｓｇＲＮＡ配列を結合し、単一転写ユニットのＳＹＮＶ編集ベクターＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９ｇＰＤＳ２（図２８Ａ）を構築した。当該クローン構築過程は以下のとおりである：表６中のプライマーｏＣａｓ９／ＢｓｔＥＩＩ／ＦおよびＣａｓ９／Ｒ、ｏＣａｓ９／ｌｉｎｋｅｒ Ｐ２／ＦおよびｇＲＮＡ／Ｒ、ｇＲＮＡ／ＮＰＪ／ＦおよびＰ／ＮｈｅＩ／Ｒで、ＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９、ＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－Ｃａｓ９、ＳＹＮＶをテンプレートとして、ｏＣａｓ９／ＢｓｔＥＩＩ－ｌｉｎｋｅｒ、ｌｉｎｋｅｒ－Ｓｃａｆｆｏｌｄ、ＮＰＪ－ＮｈｅＩフラグメントを増幅し、ＢｓｔＥＩＩとＮｈｅＩで直線化されたＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９ベクターとｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合を行い、得られたベクターはＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９ｇＰＤＳ２であった。
実施例１に記載の方法に従って単転写ユニット編集ベクターＳＹＮＶ－ｏＣａｓ９ｇＰＤＳ２をアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、同時に対照として既存のＳＹＮＶ－ｔｇｔＰＤＳ２－ｏＣａｓ９クローンを接種し、接種後の３０日の前後、上述の夫々の接種植株は、野生型ウイルスと類似する葉カール、葉脈黄化などの症状を示した（図２８Ｂ）。
ＰＣＲ／ＲＥ法を用いてＰＤＳ標的の突然変異効率を検出し、使用されたプライマーはいずれもＰＤＳのコピーａとコピーｂを同時に増幅することができる。試験結果から、単転写ユニットＳＹＮＶ編集ベクターはＰＤＳ標的サイト２に対して有効な編集を産生でき、かつ編集効率は既存のダブル転写ユニットＳＹＮＶ編集ベクターに相当することが分かった（図２８Ｃ）。上述の結果が、ＳＹＮＶ編集ベクターにおいて、同一の転写ユニットを用いてｓｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを発現する方法は実行可能性を有することを明らかにした。
実施例２４：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターベンサミアナタバコ感染能力の測定
工程一：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターの構築
実施例２４：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターベンサミアナタバコ感染能力の測定
工程一：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターの構築
ＧＦＰまたはＲＦＰ蛍光レポーター遺伝子を独立した発現フレームの形式でＥＭＤＶゲノムに挿入する工程であって、挿入位置はＮとＸの間を含むが、これらに限定されない。以下、ＧＦＰ遺伝子をＬｅａｄｅｒとＮの間に挿入することと、ＲＦＰ遺伝子をＮとＸ遺伝子の間に挿入することとを例にして（図２９Ａ）、ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターの構築過程を詳述し、構築したベクターは、以下のとおりである：
ＥＭＤＶ－ＧＦＰ：ＥＭＤＶ ｌｅａｄｅｒとＮ遺伝子の間に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＧＦＰを担持するＥＭＤＶ蛍光発現ベクター
ＥＭＤＶ－ＲＦＰ：ＥＭＤＶ Ｎ遺伝子とＸ遺伝子の間に赤色蛍光タンパク質遺伝子ＲＦＰを担持するＥＭＤＶ蛍光発現ベクター
具体的には、クローンの構築方法は、以下のとおりである：
ＥＭＤＶ－ＧＦＰ：ＥＭＤＶ ｌｅａｄｅｒとＮ遺伝子の間に緑色蛍光タンパク質遺伝子ＧＦＰを担持するＥＭＤＶ蛍光発現ベクター
ＥＭＤＶ－ＲＦＰ：ＥＭＤＶ Ｎ遺伝子とＸ遺伝子の間に赤色蛍光タンパク質遺伝子ＲＦＰを担持するＥＭＤＶ蛍光発現ベクター
具体的には、クローンの構築方法は、以下のとおりである：
ＥＭＤＶ－ＧＦＰに関しては、表６中のプライマーＥＭＤＶ－ＡａｔＩＩ／ＦおよびＥＭＤＶ－Ｎ３’／Ｒ、ＥＭＤＶ－Ｎ５’／ＦおよびＥＭＤＶ－ＡａｔＩＩ／Ｒで、それぞれＥＭＤＶ ＭＲおよびＥＭＤＶ－ＷＴをテンプレートとして、両端にＥＭＤＶ Ｎ遺伝子ＵＴＲを有するＧＦＰ遺伝子を含むＡフラグメント、およびＮ遺伝子５’ＵＴＲから２番目のＡａｔＩＩ酵素切断部位領域を含むＢフラグメントを増幅し、ＡａｔＩＩ単酵素切断により消化回収したＥＭＤＶ－ＷＴベクター骨格とともに、多フラグメントｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合によりＥＭＤＶ－ＧＦＰ蛍光発現ベクターを獲得した（図２９Ａ）。
ＥＭＤＶ－ＲＦＰに関しては、表６中のプライマーＥＭＤＶ－ＳｐｅＩ／ＦおよびＥＭＤＶ－Ａ／Ｒ、ＥＭＤＶ－ＲＦＰ／ＦおよびＥＭＤＶ－ＲＦＰ／Ｒ、ＥＭＤＶ－Ｃ／ＦおよびＥＭＤＶ－ＳｐｅＩ／Ｒで、それぞれ増幅することで、Ｎ遺伝子上のＳｐｅＩ酵素切断部位付近からＮ－Ｘｊｕｎｃｔｉｏｎまでの領域を含む結束Ａフラグメント、ＲＦＰ遺伝子配列を含むＢフラグメント、Ｎ－Ｘ ｊｕｎｃｔｉｏｎ領域開始からＭ遺伝子上のＳｐｅＩまでの酵素切断部位付近を含むＣフラグメントを獲得し、ＳｐｅＩ単酵素切断により消化回収したＥＭＤＶ－ＷＴベクター骨格とともに、多フラグメントｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合によりＥＭＤＶ－ＲＦＰ蛍光タグベクターを獲得した（図２９Ａ）。
工程二：アグロバクテリウムでベンサミアナタバコを浸潤してＥＭＤＶ蛍光発現ベクターを接種する
工程二：アグロバクテリウムでベンサミアナタバコを浸潤してＥＭＤＶ蛍光発現ベクターを接種する
実施例１に記載の方法に従って組換え型ラブドウイルス発現ベクターＥＭＤＶ－ＧＦＰまたはＥＭＤＶ－ ＲＦＰをアグロバクテリウムに電撃して、ベンサミアナタバコに浸潤接種し、ＥＭＤＶ－ＧＦＰを接種したベンサミアナタバコに関しては、接種後の２３日で、発症植株は、全身葉カール、葉脈黄化、植株顕著矮小化などの表現型を示し、蛍光顕微鏡下でウイルスが感染した全身葉全体から比較的強い緑色蛍光を発することができる（図２９Ｂ）。ＥＭＤＶ－ＲＦＰを接種したベンサミアナタバコに関しては、接種後３０日前後、浸潤発症株は野生型ウイルスと類似する全身葉カール、植株矮化のようなウイルス症状を示し、また、赤色蛍光タンパク質の大量発現により、植株の茎、上部全身葉および花びらも可視光下で薄い赤色を呈し、蛍光顕微鏡で、これらの植物組織は強い赤色蛍光を発することができる（図２９Ｃ）。
上述の症状の発生は、ＥＭＤＶ全身感染によるものであることを検証するために、発症植株の全身葉を採集し、葉の総タンパク質を抽出し、それぞれＥＭＤＶウイルス粒子抗体、ＧＦＰまたはＲＦＰモノクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、ＥＭＤＶ－ＧＦＰを接種した植株はＥＭＤＶに対応するウイルス構造タンパク質バンドとＧＦＰタンパク質バンドを検出でき（図２９Ｂ）、ＥＭＤＶ－ＲＦＰを接種した植株はＥＭＤＶウイルス構造タンパク質バンドとＲＦＰタンパク質バンドを検出できることが分かった（図２９Ｃ）。上記の結果が、ＥＭＤＶはＧＦＰやＲＦＰ蛍光タンパク質を担持することで、ベンサミアナタバコに対する全身感染の完成に成功することができ、かつベンサミアナタバコの各組織で蛍光タンパク質を大量に発現し、また、ＥＭＤＶ自身の感染特性に影響せず、後続の多種の作物上にＥＭＤＶの接種測定に大きな便利を与える。
実施例２５：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターのタバコ、ジャガイモ、ナスおよびトマトに対する感染能力の測定
実施例２５：ＥＭＤＶ蛍光発現ベクターのタバコ、ジャガイモ、ナスおよびトマトに対する感染能力の測定
既存の研究により、自然条件下で、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナス、キュウリなどの複数種類の農作物や経済作物において、分離を通じてＥＭＤＶウイルスを得た学者がいることが明らかになった。これにより、ベンサミアナタバコから救い出して得られたＥＭＤＶ－ＲＦＰまたはＥＭＤＶ－ＧＦＰ組み換えウイルスを用いて、ジャガイモ、タバコ、トマトおよびナスに対して機械的摩擦、茎注射、スプレーガン噴射、接ぎ木などの方式を介して感染測定を行い、具体的な結果は以下のとおりである。
タバコの場合、機械的摩擦によりＥＭＤＶ－ＲＦＰ組み換えウイルスを全身感染させることができ、接種後３０日前後で全身発症し、発症植株の全身葉に葉脈黄化が発生し、４５日前後で葉脈黄化が深刻化し、かつ全身葉にねじ曲がり奇形が出現し、蛍光顕微鏡下で症状が比較的厳重な全身葉とタバコ茎から、いずれも強い赤色蛍光を発することができる。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、発症のタバコ全身葉からＥＭＤＶウイルス構造タンパク質とＲＦＰ赤色蛍光タンパク質バンドを検出することができる（図３０Ａ）。
ジャガイモの場合、異種接ぎ木によりウイルス含有のベンサミアナタバコ台木を用いてジャガイモ接ぎ穂に対するウイルス伝送や全身感染を完成することができる。まず、適合苗齢の健康なベンサミアナタバコとジャガイモを選択使用し、ベンサミアナタバコの上部組織を切除し、３～４枚の葉を保留したベンサミアナタバコを台木とし、成長状態が良好かつ若ジャガイモの茎先部分を接ぎ穂とし、台木の円形茎の断面を径方向に沿ってカットし、接ぎ穂を茎の両側に沿って余分な組織を切除し、楔形の形状に最終的に加工した。その後、楔形の接ぎ穂茎を台木の茎に沿って予めカットした切開口にゆっくりと挿入し、固定し、予め濡れた薄いビニール袋で接ぎ木を完成した植株を注意深く完全にカバーし、植株の脱水速度を低下させ、恒温培養箱に２７℃／２４時間、高光照射で７日間培養した後、保湿用のビニール袋を剥がし、比較的によく成長した植株のベンサミアナタバコ台木部分に対してＥＭＤＶ組み換えウイルスのアグロバクテリウム浸潤／機械的摩擦接種を行い、２４℃／２４時間、弱光条件下で約１ケ月培養した後、培養箱から移し、ウイルス感染測定を行った。上記の方法により、ＥＭＤＶ－ＲＦＰのジャガイモ接ぎ穂に対する全身感染の実現に成功し、また、台木および接ぎ穂葉から強い赤色蛍光を観察した（図３０Ｃ）。
また、機械的摩擦によりナス、トマト、ジャガイモに対するＥＭＤＶの感染の実現に成功することも可能である（図３０Ｂ）。
実施例２６ ＥＭＤＶ蛍光発現ベクタートウガラシ感染能力測定。
また、機械的摩擦によりナス、トマト、ジャガイモに対するＥＭＤＶの感染の実現に成功することも可能である（図３０Ｂ）。
実施例２６ ＥＭＤＶ蛍光発現ベクタートウガラシ感染能力測定。
トウガラシに対しては、機械摩擦接種方式を用いて、ＥＭＤＶ－ＲＦＰ全身感染したベンサミアナタバコの葉を毒源とし、ホモジナイズしてウイルス汁を得て苗齢２週間程度のトウガラシに接種し、２３℃、１６ ｈ光照／８ ｈ暗の条件下で培養し、接種後７日で接種葉にＥＭＤＶ－ＲＦＰが接種葉にて発生した感染点を観察することができ、接種後２５日に全身感染症状が出現した。上部全身葉には、ウイルス感染による葉脈黄化が認められ、蛍光顕微鏡で強い赤色蛍光が認められた（図３１ Ｂ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔもトウガラシの全身葉からＥＭＤＶウイルス構造蛋白およびＲＦＰ赤色蛍光蛋白を検出することができる（図３１ Ａ）。
実施例２７：ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９編集ベクターの構築
実施例２７：ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが１６ｃ遺伝子組み換えタバコにおけるＧＦＰ遺伝子を標的とする
工程一：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９編集ベクターの構築
ｓｇＲＮＡとＣａｓ９を独立した発現フレームの形式でＥＭＤＶゲノムに同時に挿入する工程であって、挿入位置はＮとＸの間を含むが、これらに限定されない。以下、ｓｇＲＮＡ転写ユニットとＣａｓ９発現フレームをＮとＸ遺伝子の間に同時に挿入することを例にして（図３２Ａ）、ＥＭＤＶに基づくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ベクターの構築過程を詳述し、構築されたベクターは以下のとおりである：
ＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９：ベンサミアナタバコ１６ｃ遺伝子組み換え株におけるＧＦＰ２標的を標的とするｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を発現するＥＭＤＶベクターを含む
具体的なクローンの構築方法は以下のとおりである：
具体的なクローンの構築方法は以下のとおりである：
ＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９ベクターは、実施例３と同様の１６ｃ植株におけるＧＦＰを標的とする２０ ｎｔ標的配列（５’－ＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣ－３’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、下線部は対応する酵素切断部位ＮｃｏＩ）を用いて。まず、ＡａｒＩで酵素切断可能およびプライマーアニールで柔軟に標的を交換できる中間ベクターを構築し、ここで、中間ベクターは２つのＥＭＤＶ Ｎ－Ｘ ｊｕｎｃｔｉｏｎと、２つのＡａｒＩ酵素切断部位とを含むｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９全長配列を含み、ＡａｒＩにより単一酵素切断可能であり、そして表６中のプライマーＰＤＳ４／ＦとＰＤＳ４／Ｒでアニール後Ｔ４により中間ベクターに結合し、このベクターをテンプレートとしてＰＤＳ４標的を含むＩＩ－ＰＤＳ４フラグメントを得ることができる。その後、表６中のプライマーＥＭＤＶ－ＳｐｅＩ／ＦおよびＥＭＤＶ－Ｉ／Ｒ、ＥＭＤＶ－ＩＩ／ＦおよびＥＭＤＶ－ＩＩ／Ｒ、ＥＭＤＶ－ＩＩＩ／ＦおよびＥＭＤＶ－ＳｐｅＩ／Ｒを用いてそれぞれ増幅することで、Ｎ遺伝子上のＳｐｅＩ酵素切断部位の付近からＮ遺伝子までの３’ＵＴＲを含むＩフラグメント、２つのＥＭＤＶ Ｎ－Ｘ ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ｔｇｔ－ＧＦＰ２配列およびＣａｓ９ ＯＲＦを含むＩＩフラグメント、１つのＥＭＤＶ Ｎ－Ｘ ｊｕｎｃｔｉｏｎおよびＸ ５’ＵＴＲからＭ遺伝子上のＳｐｅＩまでの酵素切断部位付近を含むＩＩＩフラグメントを獲得し、ＳｐｅＩ単酵素切断により消化回収したＥＭＤＶ－ＷＴベクター骨格とともに、多フラグメントｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ結合によりＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９編集ベクターを獲得した
工程二：アグロバクテリウムでベンサミアナタバコを浸潤してＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９編集ベクターを接種する
工程二：アグロバクテリウムでベンサミアナタバコを浸潤してＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９編集ベクターを接種する
実施例１に記載の方法に従って組換え型ラブドウイルス発現ベクターＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、１６ｃ遺伝子組み換えバコに浸潤接種し、接種後の２７日で、浸潤発症植株は、野生型ウイルスと類似する全身葉カール、植株矮小化のウイルス症状を示し、また、携帯紫外線ランプ下で植株の全身葉の葉脈中の緑色蛍光が明らかに弱くなり、接種後の３５日で、植株上部の全身葉全体の葉の緑色蛍光はすべて明らかな減弱現象が認められたが、健康な１６ｃ植株頂部の葉の葉脈或いは葉肉中の緑色蛍光はすべて不変であった（図３２Ｂ）。
上述の症状の発生は、ＥＭＤＶ全身感染によるものであることを検証するために、発症植株の全身葉を採集し、葉の総タンパク質を抽出し、それぞれＥＭＤＶウイルス粒子抗体、Ｆｌａｇタグ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った。試験結果から、ＥＭＤＶ編集ベクターを接種した植株から、ＥＭＤＶに対応するウイルスタンパク質バンドとＣａｓ９タンパク質バンド（図３２Ｂ）を検出することができ、上述の結果が、ＥＭＤＶウイルスベクターはＳＹＮＶ編集ベクターと同様であり、両者もｓｇＲＮＡ発現フレームと長さが４．２ｋｂであるＣａｓ９発現フレームを同時に収容することができ、上述の外因性発現フレームを挿入した組換えラブドウイルスベクターは、依然として全身感染性を有することを明らかにした。
工程三：ＧＦＰ標的突然変異効率分析
工程三：ＧＦＰ標的突然変異効率分析
ＧＦＰ標的の編集効率を検証するために、ＰＣＲ／ＲＥ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ／Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いて、接種植株の全身葉を測定し、プライマー表７中のプライマーＧＦＰ２／ＦとＧＦＰ２／Ｒを用いてＰＣＲを行った後、標的配列における対応する制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩを選択して酵素切断分析を行った結果、選択したＧＦＰ２標的は比較的高効率な遺伝子の突然変異を発生させることができ、また、ＮｃｏＩ酵素切断結果から算出された編集効率が９０％前後であった。ＧＦＰの編集タイプを検出するために、上記のＰＣＲ増幅産物をＴベクターに結合した後、モノクローナルを採取してＳａｎｇｅｒシークエンシング分析を行った。試験結果から、発送検出された９個のモノクローナルコロニーのうち８個のモノクローナルには、異なるタイプの塩基変異が出現し、ＰＣＲ／ＲＥ検出結果と基本的に一致し、生成された編集タイプは単一塩基や複数の塩基の欠失が多く、塩基挿入も伴った（図３２Ｃ）。
実施例２８：ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコにおけるＰＤＳ遺伝子を標的とする
工程一：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターの構築
実施例２８：ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターがベンサミアナタバコにおけるＰＤＳ遺伝子を標的とする
工程一：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターの構築
ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９編集ベクターがＥＭＤＶ蛍光発現ベクターのようにジャガイモ、トマトなどの複数種類の作物に対する感染に成功でき、かつ作物上で対応するタイプの編集を産生することができるるか否かをテストするために、上述の作物のＰＤＳ遺伝子におけるすべて保存的の２０ ｎｔ標的配列（５’－ＣＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧ－３’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）を選択し、同様に単独転写ユニットの方式でＥＭＤＶ Ｎ遺伝子とＸ遺伝子の間に挿入し、構築されたベクターは以下の通りである。
ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９：複数種類植物ＰＤＳ遺伝子ＰＤＳ４標的を標的とするｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を発現するＥＭＤＶベクターを含む
ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターの構築プロセスは、ＥＭＤＶ－ｔｇｔＧＦＰ２－Ｃａｓ９と基本的に同様であり、ＩＩフラグメントをＩＩ－ＰＤＳ４フラグメントに置き換えたにすぎない（図３３Ａ）
工程二：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターがベンサミアナタバコＰＤＳ遺伝子を編集する
工程二：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターがベンサミアナタバコＰＤＳ遺伝子を編集する
ベクターＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９をアグロバクテリウムに電撃して、野生型ベンサミアナタバコに浸潤接種し、接種後の４０日で、浸潤発症植株も同様に全身葉葉脈黄化、葉カールおよび植株矮小化のウイルス症状を示し、発症植株の全身葉を採取した後Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行うと、対応するウイルス構造タンパク質バンドを同様に検出することができる（図３３Ｂ）。プライマー表７中のプライマーＰＤＳ－４ａ／ＦおよびＰＤＳ－４ａ／Ｒ、ＰＤＳ－４ｂ／ＦおよびＰＤＳ－４ｂ／Ｒという２対のプライマーを用いて、ベンサミアナタバコにおけるＰＤＳ－ａおよびＰＤＳ－ｂという２つのＰＤ対立遺伝子をそれぞれ増幅し、標的領域フラグメントを含み、Ｔ７ＥＩ酵素切断後、２本の対立遺伝子はいずれもある程度の遺伝子編集が出現することができる（図３３Ｃ）。
実施例２９ ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９が感染した葉組織再生およびＭ ０世代遺伝子型解析。
実施例２９ ＥＭＤＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９が感染した葉組織再生およびＭ ０世代遺伝子型解析。
再生編集株を得るために、ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ ４－Ｃａｓ ９が全身感染したベンサミアナタバコ上部幼若葉を外植体とし、実施例１０に記載の組織培養方法で再生株を得て、再生幼苗には白化と正常緑色の２種類の表現型が認められた（図３４ Ａ）。
再生植株中のＰＤＳ標的サイトの編集状況を測定するため、Ｍ ０世代幼苗の総ＤＮＡを抽出してＰＣＲ／ＲＥ分析を行い（図３４ Ｂ）、１００ ｎｇ野生型ＰＤＳフラグメント増幅産物と１００ ｎｇ Ｍ ０世代幼苗ＰＤＳフラグメント増幅プライマーを均一に混合した後、アニールし、Ｔ ７ ＥＩ酵素切断分析を行った。白化苗全数は標的サイトの編集を検出することができ、緑苗中のＭ ０－１９、２０、２１及び２７号植株は標的サイトの編集を検出することができる。
再生株中にＥＭＤＶ編集ベクターの持続感染が存在するか否かを検出するために、Ｍ ０世代株の総ＲＮＡを抽出し、ＥＭＤＶのプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ検出を行った。白化苗全数はＥＭＤＶベクターを携帯し、一部の再生緑苗、例えばＭ ０－１９と－２７は編集を含むが、すでにウイルスを除去し（図３４ Ｃ）、即ちＭ ０世代でウイルス除去された非遺伝子組換え編集植株を得ることができる。
実施例３０：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターがタバコ、ジャガイモおよびトマトＰＤＳ遺伝子を編集する
実施例３０：ＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９編集ベクターがタバコ、ジャガイモおよびトマトＰＤＳ遺伝子を編集する
ベンサミアナタバコから救い出して得られたＥＭＤＶ－ｔｇｔＰＤＳ４－Ｃａｓ９組み換えウイルスを実施例２４に記載の方法に従って、タバコ、ジャガイモおよびトマトにそれぞれ接種し、全身発症後にそれぞれプライマーシート中のプライマーＰＤＳ－Ｎｔ／ＦおよびＰＤＳ－Ｎｔ／Ｒ、ＰＤＳ－ＳＴ／ＦおよびＰＤＳ－ＳＴ／Ｒ、ＰＤＳ－ＳＬ／ＦおよびＰＤＳ－ＳＬ／Ｒを用いてタバコ、ジャガイモおよびトマトのＰＤＳ遺伝子に対応するフラグメントを増幅し、Ｔベクターに結合した後、それぞれ６～７個のモノクローナルを採取して検査に送るを行った。測定の結果から、これらの植物のＰＤＳ４標的サイトに変異が発生し、変異タイプは主に単一、複数の塩基の欠失や塩基の置換などであった（図３５）。
上記の結果が、ＥＭＤＶ編集ベクターはタバコ、ジャガイモ、トマトに対するゲノム部位特異的編集の実現に成功したことを明らかにした。
表１：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが植株Ｍ０世代を編集する遺伝子型および表現型分析
表２：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが植株Ｍ１世代を編集する遺伝子型および表現型分析
表３：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が植株Ｍ２世代を編集する植株遺伝子型分析
表４：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が植株Ｍ０世代ＰＤＳ－１標的を編集する編集タイプの一覧表
表５ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が植株Ｍ１世代植株ＰＤＳを編集する編集タイプの一覧表
表６クローン構築プライマーおよびＲＴ－ＰＣＲ、ｃＲＴ－ＰＣＲ検出プライマー
注：小文字で表記した配列は、相同組み換えのための１５～２０ ｎｔフラグメント
表７標的遺伝子編集効率検出プライマー
注：／はコピーａ／コピーｂの異なるＰＣＲ産物サイズを表す。
表８ＰＤＳ１潜在的オフターゲット遺伝子座検出プライマー
表９ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベクターが植株Ｍ０世代を編集する遺伝子型および表現型分析
表１０ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１が植株Ｍ０世代ＰＤＳ－１標的を編集する編集タイプの一覧表
上記の結果が、ＥＭＤＶ編集ベクターはタバコ、ジャガイモ、トマトに対するゲノム部位特異的編集の実現に成功したことを明らかにした。
表１：ＳＹＮＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが植株Ｍ０世代を編集する遺伝子型および表現型分析
表７標的遺伝子編集効率検出プライマー
表８ＰＤＳ１潜在的オフターゲット遺伝子座検出プライマー
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。また、本発明の明細書および図面の内容を用いて、当業者が本発明を各種の簡単な変形をすることができるが、それらの変形は本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
なお、以上の具体的な実施形態で説明した各具体的な技術的特徴は、矛盾しない場合には、任意の適切な方式により組み合わせることができ、不必要な重複を回避するために、様々な可能な組み合わせ方式についてはここでは説明しない。
本発明に係るヌクレオチド配列の紹介
SEQ ID NO 1: partial sequence of SYNV－tgtGFP1－Cas9(tRNA－GFP target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 1: partial sequence of SYNV－tgtGFP1－Cas9(tRNA－GFP target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 2: partial sequence of SYNV－tgtGFP2－Cas9(tRNA－GFP target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 3: partial sequence of SYNV－tgtPDS1－Cas9(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 4: partial sequence of SYNV－tgtPDS2－Cas9(tRNA－PDS target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 5: partial sequence of SYNV－tgtPDS3－Cas9(tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 6: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－1－Cas9(tRNA－RDR6 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 7: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－4－Cas9(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 8: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－1－Cas9(tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 9: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－2－Cas9(tRNA－SGS3 target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 10: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－1/SGS3－1－Cas9
(tRNA－RDR6 target1－scaffold－tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 11: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－4/SGS3－2－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA－SGS3 target2－ffffold－tRNA)
SEQ ID NO 12: partial sequence of SYNV－tgtgtPDS1/3－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 13: partial sequence of SYNV－crGFP1－Cpf1(DR－GFP target1－DR)
SEQ ID NO 14: partial sequence of SYNV－crGFP2－Cpf1(DR－GFP target2－DR)
SEQ ID NO 15: partial sequence of SYNV－crPDS1－Cpf1(DR－PDS target1－DR)
SEQ ID NO 16: partial sequence of SYNV－crPDS2－Cpf1(DR－PDS target2－DR)
SEQ ID NO 17: partial sequence of SYNV－crGFP－1/PDS－1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR－PDS target1－DR)
SEQ ID NO 18: Cas9核酸配列
SEQ ID NO 19: Cpf1核酸配列
SEQ ID NO 20－33: 標的サイト配列
SEQ ID NO 34－35: NPJに由来する配列
SEQ ID NO 36: ヘ゛ンサミアナタハ゛コに対してコト゛ン最適化を行ったoCas9配列
SEQ ID NO 10: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－1/SGS3－1－Cas9
(tRNA－RDR6 target1－scaffold－tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 11: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－4/SGS3－2－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA－SGS3 target2－ffffold－tRNA)
SEQ ID NO 12: partial sequence of SYNV－tgtgtPDS1/3－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 13: partial sequence of SYNV－crGFP1－Cpf1(DR－GFP target1－DR)
SEQ ID NO 14: partial sequence of SYNV－crGFP2－Cpf1(DR－GFP target2－DR)
SEQ ID NO 15: partial sequence of SYNV－crPDS1－Cpf1(DR－PDS target1－DR)
SEQ ID NO 16: partial sequence of SYNV－crPDS2－Cpf1(DR－PDS target2－DR)
SEQ ID NO 17: partial sequence of SYNV－crGFP－1/PDS－1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR－PDS target1－DR)
SEQ ID NO 18: Cas9核酸配列
SEQ ID NO 19: Cpf1核酸配列
SEQ ID NO 20－33: 標的サイト配列
SEQ ID NO 34－35: NPJに由来する配列
SEQ ID NO 36: ヘ゛ンサミアナタハ゛コに対してコト゛ン最適化を行ったoCas9配列
SEQ ID NO 37: partial sequence of EMDV－tgtPDS4－Cas9(tRNA－PDS target4－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 38: SYNVケ゛ノムcDNA配列
SEQ ID NO 39: EMDVケ゛ノムcDNA配列
SEQ ID NO 38: SYNVケ゛ノムcDNA配列
SEQ ID NO 39: EMDVケ゛ノムcDNA配列
配列情報：
SEQ ID NO 1: partial sequence of SYNV－tgtGFP1－Cas9
(tRNA－GFP target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGATACCCAGATCATATGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 2: partial sequence of SYNV－tgtGFP2－Cas9
(tRNA－GFP target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 1: partial sequence of SYNV－tgtGFP1－Cas9
(tRNA－GFP target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGATACCCAGATCATATGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 2: partial sequence of SYNV－tgtGFP2－Cas9
(tRNA－GFP target2－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAACAAGTGTTGGCCATGGAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 3: partial sequence of SYNV－tgtPDS1－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 3: partial sequence of SYNV－tgtPDS1－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGCCGTTAATTTGAGAGTCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 4: partial sequence of SYNV－tgtPDS2－Cas9
(tRNA－PDS target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 4: partial sequence of SYNV－tgtPDS2－Cas9
(tRNA－PDS target2－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATTGGTAGTAGCGACTCCATGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 5: partial sequence of SYNV－tgtPDS3－Cas9
(tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 5: partial sequence of SYNV－tgtPDS3－Cas9
(tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATTAACTGTATTGTCTAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 6: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－1－Cas9
(tRNA－RDR6 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 6: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－1－Cas9
(tRNA－RDR6 target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAAGTTGGGTAAGAGTCAGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 7: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－4－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 7: partial sequence of SYNV－tgtRDR6－4－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAATTCTCAGCTAACCAGCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 8: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－1－Cas9
(tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 8: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－1－Cas9
(tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAACAAGAGTGGAAGCAGTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 9: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－2－Cas9
(tRNA－SGS3 target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 9: partial sequence of SYNV－tgtSGS3－2－Cas9
(tRNA－SGS3 target2－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATGCCTCAACTGATCCCAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 10: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－1/SGS3－1－Cas9
(tRNA－ RDR6 target1－scaffold－tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 10: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－1/SGS3－1－Cas9
(tRNA－ RDR6 target1－scaffold－tRNA－SGS3 target1－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAAGTTGGGTAAGAGTCAGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAACAAGAGTGGAAGCAGTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 11: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－4/SGS3－2－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA－SGS3 target2－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 11: partial sequence of SYNV－tgtgtRDR6－4/SGS3－2－Cas9
(tRNA－RDR6 target4－scaffold－tRNA－SGS3 target2－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAATTCTCAGCTAACCAGCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATGCCTCAACTGATCCCAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 12: partial sequence of SYNV－tgtgtPDS1/3－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
SEQ ID NO 12: partial sequence of SYNV－tgtgtPDS1/3－Cas9
(tRNA－PDS target1－scaffold－tRNA－PDS target3－scaffold－tRNA)
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGCCGTTAATTTGAGAGTCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATTAACTGTATTGTCTAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 13: partial sequence of SYNV－crGFP1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATAAGATACCCAGATCATATGAAGCAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 14: partial sequence of SYNV－crGFP2－Cpf1
(DR－GFP target2－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATAGGGAGACACCCTCGTCAACAGGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 15: partial sequence of SYNV－crPDS1－Cpf1
(DR－PDS target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 16: partial sequence of SYNV－crPDS2－Cpf1
(DR－PDS target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATGTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 17: partial sequence of SYNV－crGFP1&PDS1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR－PDS target1－DR)
SEQ ID NO 13: partial sequence of SYNV－crGFP1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATAAGATACCCAGATCATATGAAGCAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 14: partial sequence of SYNV－crGFP2－Cpf1
(DR－GFP target2－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATAGGGAGACACCCTCGTCAACAGGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 15: partial sequence of SYNV－crPDS1－Cpf1
(DR－PDS target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 16: partial sequence of SYNV－crPDS2－Cpf1
(DR－PDS target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATGTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 17: partial sequence of SYNV－crGFP1&PDS1－Cpf1
(DR－GFP target1－DR－PDS target1－DR)
AATTTCTACTAAGTGTAGATAAGATACCCAGATCATATGAAGCAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAGAATTTCTACTAAGTGTAGAT
SEQ ID NO 18: Cpf1 sequence
SEQ ID NO 18: Cpf1 sequence
ATGGCTCCTAAGAAGAAGCGGAAGGTTGGTATTCACGGGGTGCCTGCGGCtTCAAAGCTCGAGAAATTCACCAACTGTTATTCGTTGAGCAAAACACTGCGGTTTAAAGCGATTCCAGTCGGCAAGACTCAAGAGAATATAGACAATAAGCGGCTGTTGGTGGAAGATGAAAAGCGCGCGGAAGACTACAAAGGGGTGAAGAAGTTGTTGGACAGATACTACCTCTCTTTTATCAATGATGTCTTGCACTCAATCAAATTGAAGAATCTGAACAACTACATCTCCCTCTTCAGAAAGAAAACAAGGACAGAAAAGGAGAATAAGGAACTTGAAAATTTGGAGATCAATCTGAGGAAAGAGATCGCGAAAGCCTTTAAAGGCAACGAAGGATACAAAAGTCTGTTCAAGAAGGATATAATTGAGACAATTTTGCCAGAGTTCCTCGATGACAAGGACGAGATTGCGCTGGTCAATTCGTTCAACGGATTCACAACAGCATTCACAGGCTTCTTTGATAATCGGGAAAATATGTTCTCTGAGGAGGCAAAGTCCACTTCTATTGCGTTCAGGTGTATCAATGAGAATCTCACTAGGTACATTTCCAACATGGATATCTTTGAGAAGGTTGACGCAATTTTTGACAAGCACGAAGTTCAGGAGATTAAGGAGAAGATCCTCAATTCCGATTATGACGTTGAGGACTTCTTCGAAGGTGAGTTTTTTAATTTCGTGCTCACTCAAGAGGGTATCGACGTGTATAATGCGATCATCGGTGGGTTCGTGACTGAGTCCGGTGAAAAGATTAAGGGATTGAACGAGTATATCAACCTTTACAACCAAAAGACGAAACAGAAGCTGCCAAAGTTCAAGCCTCTTTACAAACAGGTTCTTTCAGACCGCGAGTCACTCTCGTTCTATGGGGAGGGCTACACTTCGGATGAGGAAGTCCTGGAGGTGTTCAGGAATACTCTCAATAAGAATTCGGAGATTTTCTCTTCTATAAAAAAACTGGAAAAGTTGTTTAAGAATTTTGACGAATACTCTAGCGCCGGCATATTTGTGAAAAACGGCCCGGCCATATCAACGATAAGTAAAGATATCTTCGGCGAATGGAACGTGATCAGAGACAAATGGAACGCGGAGTATGACGATATTCACCTGAAGAAGAAGGCTGTCGTAACGGAGAAGTACGAGGATGATCGCAGGAAAAGCTTCAAAAAGATCGGAAGTTTCAGCCTGGAACAGTTGCAGGAGTATGCTGACGCCGATCTTAGCGTCGTCGAGAAGTTGAAGGAGATAATCATCCAAAAGGTCGACGAGATATATAAAGTCTATGGATCAAGTGAAAAACTGTTCGACGCCGACTTCGTTTTGGAGAAGTCCCTGAAGAAGAACGACGCTGTTGTTGCCATTATGAAGGATCTGCTCGACAGCGTGAAGAGTTTCGAGAACTATATTAAGGCTTTTTTCGGGGAGGGGAAGGAGACTAACAGAGATGAGTCCTTCTACGGAGACTTCGTCCTCGCGTACGATATACTCCTTAAGGTAGACCACATCTACGACGCAATCAGAAATTACGTGACACAAAAGCCGTACAGCAAGGACAAGTTCAAACTCTACTTCCAGAACCCCCAGTTCATGGGCGGCTGGGACAAGGACAAGGAAACGGATTACAGGGCTACGATCCTGAGGTATGGTTCAAAATACTACTTGGCGATTATGGACAAGAAGTACGCCAAGTGTCTCCAGAAGATTGACAAAGACGATGTCAATGGCAATTATGAGAAGATCAACTACAAGCTGCTTCCGGGTCCGAACAAGATGCTCCCAAAGGTTTTCTTCAGCAAGAAATGGATGGCCTACTATAACCCAAGCGAGGACATCCAGAAGATTTATAAGAACGGTACGTTCAAGAAGGGCGACATGTTCAATCTTAACGACTGTCACAAGCTGATCGACTTCTTCAAAGACTCAATTAGCCGGTACCCAAAGTGGTCTAACGCCTATGACTTCAACTTTTCGGAAACCGAGAAGTACAAGGATATAGCCGGATTTTATAGAGAGGTGGAAGAGCAGGGCTACAAGGTGTCATTCGAGTCCGCCAGCAAGAAGGAAGTGGACAAGCTCGTGGAAGAGGGTAAGCTCTACATGTTCCAGATTTATAATAAAGACTTTAGCGATAAGAGCCACGGGACACCTAATCTCCACACAATGTATTTCAAGCTGCTCTTCGACGAGAATAACCACGGCCAAATCAGGTTGTCAGGAGGGGCTGAACTCTTCATGCGGCGCGCTAGCCTTAAGAAGGAGGAGCTTGTAGTCCACCCTGCGAATAGTCCAATTGCGAATAAGAACCCGGACAATCCTAAAAAGACTACAACATTGAGCTACGACGTGTACAAGGATAAGAGGTTTTCCGAGGATCAGTACGAGCTCCACATCCCGATTGCGATCAACAAGTGCCCAAAGAATATTTTCAAGATAAACACAGAGGTGCGTGTACTCCTGAAGCATGACGACAATCCTTACGTCATTGGGATTGATCGGGGCGAGAGGAACCTCCTCTATATTGTGGTGGTGGACGGGAAGGGGAACATAGTCGAACAGTACTCCCTTAACGAAATAATTAACAATTTCAACGGCATCCGTATCAAGACCGACTACCATTCGTTGCTGGACAAGAAGGAGAAGGAGAGATTTGAGGCGCGGCAAAATTGGACAAGTATCGAGAACATCAAGGAACTCAAAGCAGGTTATATCTCTCAAGTTGTGCATAAGATATGCGAGCTGGTTGAGAAGTATGACGCAGTGATCGCTCTTGAGGACCTCAACTCGGGCTTTAAGAATTCTAGAGTTAAAGTGGAGAAGCAGGTCTATCAAAAGTTCGAGAAGATGCTTATAGATAAGCTCAACTACATGGTCGATAAGAAATCGAACCCATGTGCCACCGGCGGCGCACTCAAAGGTTACCAAATAACAAACAAATTCGAGTCCTTCAAATCGATGAGTACTCAGAATGGGTTCATATTTTATATACCGGCGTGGCTTACGTCTAAGATCGACCCGTCAACTGGTTTTGTCAACCTGTTGAAGACGAAATACACGTCCATTGCCGATTCGAAAAAGTTCATATCTAGTTTTGATCGTATTATGTACGTCCCAGAGGAAGATCTTTTCGAGTTTGCTCTCGACTACAAAAACTTTTCGCGGACCGATGCGGATTACATTAAAAAATGGAAACTCTATTCGTACGGCAACAGAATCAGGATTTTTCGCAACCCTAAGAAGAATAACGTCTTTGATTGGGAGGAAGTTTGCTTGACTAGCGCGTACAAGGAGCTCTTTAATAAGTATGGCATTAACTACCAACAGGGTGATATCAGAGCACTGCTTTGCGAACAATCTGACAAGGCTTTCTACTCATCCTTCATGGCTTTGATGAGCCTGATGCTCCAGATGAGAAATTCAATTACAGGCAGAACCGACGTGGATTTCTTGATCTCCCCGGTTAAAAATTCTGATGGCATCTTTTACGATAGCAGGAACTATGAAGCGCAAGAGAATGCGATTCTGCCAAAAAATGCAGACGCCAACGGTGCCTATAACATCGCCAGGAAAGTCCTGTGGGCGATCGGCCAGTTCAAAAAGGCCGAAGACGAAAAATTGGACAAGGTCAAAATCGCTATCAGCAACAAAGAGTGGCTGGAGTATGCTCAGACATCCGTAAAGCATAAGCGTCCTGCTGCCACCAAAAAGGCCGGACAGGCTAAGAAAAAGAAGTGA
SEQ ID NO 19: Cas9 sequence
SEQ ID NO 19: Cas9 sequence
ATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACAATTCTGGGAAGATAATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAA
SEQ ID NO 20: 5’－ACAAGTGTTGGCCATGGAAC－3’
SEQ ID NO 21: 5’－GCCGTTAATTTGAGAGTCCA－3’
SEQ ID NO 22: 5’－AGTTGGGTAAGAGTCAGGAG－3’
SEQ ID NO 23: 5’－ACAAGAGTGGAAGCAGTGCT－3’
SEQ ID NO 24: 5’－TTAACTGTATTGTCTAGCTCTGG－3’
SEQ ID NO 25: 5’－AAGATACCCAGATCATATGAAGC－3’
SEQ ID NO 26: 5’－AGGGAGACACCCTCGTCAACAGG－3’
SEQ ID NO 27: 5’－TGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAG－3’
SEQ ID NO 28: 5’－GTAGTAGCGACTCCATGGGGCAT－3’
SEQ ID NO 29: 5’－GATACCCAGATCATATGAAG－3’
SEQ ID NO 30: 5’－TTGGTAGTAGCGACTCCATGG－3’
SEQ ID NO 31: 5’－TTAACTGTATTGTCTAGCTC－3’
SEQ ID NO 32: 5’－ ATTCTCAGCTAACCAGCTGA－3’
SEQ ID NO 33: 5’－ TGCCTCAACTGATCCCAAGG－3’
SEQ ID NO 34: 5’－TTATTTGTCTAGGCC－3’
SEQ ID NO 35: 5’－TAAACTACAGCCACA－3’
SEQ ID NO 36: oCas9 sequence
SEQ ID NO 20: 5’－ACAAGTGTTGGCCATGGAAC－3’
SEQ ID NO 21: 5’－GCCGTTAATTTGAGAGTCCA－3’
SEQ ID NO 22: 5’－AGTTGGGTAAGAGTCAGGAG－3’
SEQ ID NO 23: 5’－ACAAGAGTGGAAGCAGTGCT－3’
SEQ ID NO 24: 5’－TTAACTGTATTGTCTAGCTCTGG－3’
SEQ ID NO 25: 5’－AAGATACCCAGATCATATGAAGC－3’
SEQ ID NO 26: 5’－AGGGAGACACCCTCGTCAACAGG－3’
SEQ ID NO 27: 5’－TGCCGTTAATTTGAGAGTCCAAG－3’
SEQ ID NO 28: 5’－GTAGTAGCGACTCCATGGGGCAT－3’
SEQ ID NO 29: 5’－GATACCCAGATCATATGAAG－3’
SEQ ID NO 30: 5’－TTGGTAGTAGCGACTCCATGG－3’
SEQ ID NO 31: 5’－TTAACTGTATTGTCTAGCTC－3’
SEQ ID NO 32: 5’－ ATTCTCAGCTAACCAGCTGA－3’
SEQ ID NO 33: 5’－ TGCCTCAACTGATCCCAAGG－3’
SEQ ID NO 34: 5’－TTATTTGTCTAGGCC－3’
SEQ ID NO 35: 5’－TAAACTACAGCCACA－3’
SEQ ID NO 36: oCas9 sequence
ATGGATTACAAGGATCACGATGGAGATTACAAAGATCACGATATAGATTACAAAGATGATGATGATAAAATGGCACCTAAGAAGAAAAGAAAGGTTGGAATTCATGGTGTGCCTGCTGCAGATAAGAAGTACAGTATAGGACTTGATATCGGTACCAACTCTGTTGGATGGGCTGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCTAGTAAGAAATTCAAGGTGCTCGGTAACACAGATAGACACTCTATTAAGAAGAATCTTATAGGAGCTCTTTTGTTTGATTCAGGTGAAACAGCTGAGGCAACCAGACTTAAAAGGACAGCAAGAAGGAGATACACCAGGAGAAAGAACAGAATTTGTTATTTGCAAGAAATCTTCTCTAATGAGATGGCTAAGGTTGATGATTCATTTTTCCATAGATTAGAAGAGAGTTTTCTTGTGGAAGAGGATAAGAAACATGAAAGACACCCTATATTCGGAAATATTGTTGATGAAGTGGCTTACCATGAGAAATATCCAACAATCTACCACTTGAGAAAGAAACTCGTTGATTCTACCGATAAAGCAGATCTCAGGTTAATCTACCTTGCTTTGGCACATATGATAAAGTTTAGAGGACACTTCTTGATTGAGGGAGATCTTAATCCTGATAACTCAGATGTTGATAAGCTTTTTATTCAACTTGTGCAGACATATAACCAACTTTTCGAAGAGAATCCAATCAACGCTTCAGGAGTTGATGCTAAAGCAATATTGAGTGCAAGACTCTCTAAGTCTAGGAGACTCGAAAATCTTATAGCTCAGTTGCCTGGAGAAAAGAAGAACGGATTATTCGGTAACCTTATCGCACTCTCTCTCGGTCTTACTCCAAACTTCAAGTCAAACTTCGATCTTGCTGAAGATGCAAAATTGCAACTCTCTAAGGATACATACGATGATGATTTGGATAATCTCTTAGCTCAGATTGGAGATCAATATGCAGATCTTTTTCTTGCTGCAAAAAACCTCTCAGATGCTATCCTTTTGAGTGATATACTTAGAGTTAACACTGAAATTACAAAGGCTCCTCTTTCAGCAAGTATGATCAAGAGATACGATGAGCATCACCAGGATTTGACTCTCTTAAAGGCTTTAGTTAGACAACAGCTTCCAGAAAAGTATAAGGAGATTTTCTTTGATCAGTCTAAGAACGGATATGCTGGTTACATCGATGGAGGTGCATCTCAAGAAGAGTTCTACAAGTTCATTAAACCTATCTTGGAAAAGATGGATGGAACCGAAGAGCTTTTGGTTAAACTCAACAGAGAGGATCTCTTAAGAAAGCAGAGGACTTTCGATAACGGATCTATCCCTCATCAAATACACCTTGGTGAATTGCATGCTATTTTGAGGAGACAAGAGGATTTCTACCCATTCCTCAAGGATAACAGAGAAAAGATTGAGAAGATTCTTACCTTTAGGATCCCTTATTACGTTGGACCATTGGCTAGGGGTAACAGTAGGTTCGCATGGATGACTAGAAAATCTGAAGAGACAATTACCCCTTGGAATTTTGAAGAGGTTGTGGATAAGGGTGCTTCTGCACAGTCTTTTATTGAAAGAATGACAAACTTCGATAAGAATTTGCCTAACGAGAAAGTTCTCCCAAAGCATTCTCTTTTGTACGAATACTTCACTGTGTACAATGAGCTTACAAAGGTTAAATATGTGACCGAAGGAATGAGAAAGCCAGCTTTTCTTTCAGGAGAGCAGAAGAAAGCAATCGTTGATCTCTTATTCAAAACTAACAGAAAGGTTACAGTGAAGCAACTTAAGGAAGATTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGATTCTGTTGAAATATCAGGAGTGGAGGATAGATTCAATGCTTCTTTGGGTACTTATCATGATCTTTTGAAGATTATCAAGGATAAGGATTTTCTTGATAATGAGGAGAACGAAGATATTCTTGAGGATATCGTTTTGACTCTCACATTATTCGAAGATAGAGAGATGATTGAAGAGAGGTTAAAAACATACGCTCACCTTTTCGATGATAAGGTTATGAAACAACTTAAGAGGAGAAGGTATACCGGATGGGGTAGATTGTCTAGGAAGCTCATCAACGGAATAAGAGATAAACAGTCAGGAAAGACTATCCTCGATTTCTTAAAGAGTGATGGATTCGCTAACAGAAACTTCATGCAATTGATCCATGATGATTCTCTCACTTTTAAAGAAGATATTCAAAAGGCTCAGGTTTCAGGACAGGGAGATAGTTTGCATGAGCACATTGCTAATCTCGCAGGATCACCTGCTATTAAGAAGGGTATATTGCAAACTGTTAAGGTTGTGGATGAACTCGTTAAAGTGATGGGAAGACATAAGCCAGAGAATATAGTGATTGAAATGGCTAGGGAGAACCAAACTACACAGAAAGGTCAAAAGAATTCTAGAGAAAGGATGAAAAGAATCGAAGAGGGAATTAAGGAGTTGGGTTCACAAATTCTCAAAGAACATCCTGTTGAGAATACACAACTTCAGAACGAAAAGCTTTACTTGTATTACTTGCAGAACGGAAGAGATATGTATGTGGATCAAGAGCTCGATATTAATAGGCTTAGTGATTACGATGTTGATCACATCGTGCCTCAGTCTTTTCTCAAGGATGATTCAATAGATAACAAGGTTCTTACTAGATCAGATAAGAATAGGGGAAAGTCTGATAACGTGCCATCAGAAGAGGTTGTTAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTCCTCAACGCTAAGCTCATAACTCAAAGAAAGTTCGATAATCTCACAAAAGCTGAAAGGGGAGGTCTTTCTGAGTTGGATAAAGCAGGATTCATTAAGAGACAGTTGGTTGAAACTAGGCAAATTACAAAACATGTGGCTCAAATCCTTGATTCAAGGATGAATACTAAGTACGATGAAAACGATAAGTTGATAAGAGAGGTTAAGGTTATTACACTCAAGAGTAAACTTGTTTCTGATTTCAGAAAGGATTTCCAGTTCTACAAGGTGAGGGAGATTAATAACTACCATCACGCTCACGATGCATATCTTAACGCTGTTGTGGGAACAGCATTAATCAAGAAATACCCTAAGCTTGAATCTGAGTTCGTTTACGGAGATTACAAGGTTTACGATGTGAGAAAAATGATTGCTAAGTCAGAACAAGAGATTGGTAAAGCTACTGCAAAGTACTTTTTCTATAGTAACATTATGAACTTTTTCAAAACCGAAATCACTTTGGCTAACGGAGAGATCAGAAAGAGGCCACTCATAGAAACCAACGGAGAAACTGGAGAGATTGTTTGGGATAAAGGTAGAGATTTCGCTACAGTTAGGAAGGTGCTTTCTATGCCTCAGGTTAACATCGTGAAGAAAACAGAAGTTCAAACCGGAGGTTTTAGTAAGGAGTCTATATTGCCAAAGAGAAACTCAGATAAGCTCATTGCTAGGAAGAAAGATTGGGATCCTAAGAAATACGGAGGTTTCGATAGTCCAACAGTTGCTTATTCTGTGTTGGTTGTGGCAAAGGTTGAAAAGGGAAAAAGTAAGAAACTTAAGTCTGTGAAGGAGCTTTTGGGTATCACTATTATGGAAAGATCTTCATTCGAGAAAAACCCTATAGATTTCCTTGAAGCTAAAGGATACAAGGAGGTTAAGAAAGATTTGATAATTAAACTCCCAAAGTATTCACTCTTCGAATTAGAGAATGGTAGAAAAAGGATGTTAGCTAGTGCAGGAGAACTTCAAAAGGGTAACGAGCTCGCTCTCCCTTCTAAGTATGTTAATTTTCTTTACTTGGCATCTCATTATGAGAAGCTTAAAGGTTCACCAGAAGATAATGAGCAAAAACAGCTTTTCGTGGAACAGCATAAGCACTACTTGGATGAAATCATAGAGCAAATTTCAGAATTTTCTAAGAGAGTTATTTTGGCTGATGCAAACTTAGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCATAGAGATAAGCCTATAAGGGAACAAGCAGAGAACATTATCCACCTTTTTACCTTGACTAATCTCGGAGCTCCAGCTGCTTTTAAGTACTTCGATACCACTATCGATAGAAAAAGGTATACATCTACCAAGGAAGTTTTGGATGCAACTCTCATTCATCAGTCTATCACCGGTCTTTATGAGACTAGAATTGATCTTTCACAACTTGGAGGAGATAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAA
SEQ ID NO 37: partial sequence of EMDV－tgtPDS4－Cas9
SEQ ID NO 37: partial sequence of EMDV－tgtPDS4－Cas9
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCACAATACAGTTAACTATTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID NO 38: SYNV genome cDNA sequence
SEQ ID NO 38: SYNV genome cDNA sequence
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SEQ ID NO39: EDMV genome cDNA sequence
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SEQ ID NO39: EDMV genome cDNA sequence
ACACACCCACCGAAGCATTATAACCATAATGGATGTATTAGGTGCAGGCACCTTTTTAAGACCCAGAACACAGACTCAGTACCAGGAGAGATGTCTTCATCATAGCAGCCTTGCTGAGGAATATACATTAAACTAAACCCTTTAAATTTAGGGTTTTTATTAAGTACTATAGCTGCCTTGATTGATCAGAGGGGGTATTAGGTTCCAACAATATTGAACCCTCTCCTCTTTTGGGTCTTGAAGTTGATAGATATAAAGACATCTTCCCATGTGGCCCCTATGTTCTGTAATAGGGGGTCTCTGTGCACTTTGAGATACATCAACTTGTAGAATCTCACCATGGCATTGTCCACACTGCAAGTTCTCAGTCTCGGGGTGATTCTCCCTCTGATGGAGTCCAGGTCGGCAGATTTAATCCTCCCTATAGTGTCAGCATCAAAAGGCTCTGCATGGGCAAGTACACTGATGATCAGTCTCATTAAGATGTCCTGTATTCTTTTGGTCTTTCTTCTCAGTCTGCAGAATGAGTCAATGCGGTCAATCTCCTTGAGCCTTCTGGAGAAGACATTAATCATCTCTAGTCTATTCTTGAAAGTGTACAGGCGAATCTGCTGTCTGGTGCTAGAGATGTGCGAGAAGTTATCCCCGGGTCTCGTTGGTCTGGGTGCCTCCGGTCCGATGTGAGCTACCTCTTCATACAGATGATGAAGCGGGGATAGGTTAGTGATGTAATTCTGATTGGTGAATTCCAGAATCATCAGCAGCGCCGGAACTATCACCCTGGGGAACGTGAATACACAGTCAATTCTTCGTCTCATATCGTCACCCATCGTTGACAGGCGAGAGCCTCCCATAGCACAGTACACTCTCCCTCGGTCCTCAAGGATCTCAGATGCTATCTCTTGCCTCCTGGATATAACCAGGCAGTCCCCTTCTGTAATGTCTTCTTCTGAGTAGGACATGATAACTGCACACTGTCCCAATTTATTATCTCTAAATTTCTCAAATATATTGCCTGTCTCCTCATCTGACAATGAGTCAATCATTATATGAATGGGTTTATTGAAGCCTGTCCTCATTCTCACAGCAGCGTAGATAATCTCTGCTGACTCAATCTCTAGGTCCATGACAATGCAGTCAATCTCCACTTCATGTACAAATCTCTGAATGAGATCTGCCCACTCTTGAACTGACGTTTCCTCACCCACTGAGAATATCGGGAGAAGGGTAGGAAGGTCCAGAAGTTCTGATTCATGGGATGTCCTTATCCTACTGATGGCGGGCACATCTTCATAATGATACATGTCGGGGATGTTGGGATCTGGTATCTGAACCAGCTCTTTTAATAGATTATCAGGATGGGCACAAATAATAGGCACTCTCACACTGACAAATTGGTGGGCTGAGCACATACTCATGGACAGAGCATCTTTAGTTCTCATGTTCATAATCTTCTTGAGTATACCCAGACAATCAGGACACCCAACCAACATGGGGTTCTTGCCCAGCTTATGTAGGATTATTTGCAGAGGCAACCAACCCAGTACACTATTAGGGTAGCATAGAATACCTATCGGCTTGTCCTCCTCCCAAGTGTCGGTTATCACAGAGGTGGATACCCCCTCAAGCCTACCTTCTGTTGCCCATCCCAGGGCGGACATTTTTGCGGACATGCCTTGTAGTGTATCGCAGAGAACGTCTAATGATCTGCAACTCTGAATACTCATCGTGGGATCAATGTACCGAAGCAATGTGATCTTCTTCCTAAATGATAACAAGCATGCATCTACATCCACTTTCTCTCGAGCCAGTAGCATAAAGCTTTTGGACATGCCATGTTTTCTTCCTAGAGCCTCAATGACCAATATGGTACTTATACAGTCAATGATTCTGTCCCGAGATGACCCCAAGACAGTGATGTCTTCAAGGATCATCGGGGCAATGCTCTGGCTGTCCTCTATTGCAAGTCTTCGAGTGTAGTCCATCTTTATACTCTCACTTTCTACATAAACCAGAAGATTGTTCGGGAGTGTAGGAAAAGATACCGGCAGTGTGGGAGCGGTGGAGTCTGGTGGAATGGGCTCGATCTCTGTTATGCATGTCGGACAACATTCATGAGCATGATACTCAGTGATAGCGTCAGATATCCTCGATCCCCTCATGTACCTCAGCATGTATCTTACACAAGTTATCATACAAGATTGAAAGTGAATGTATTCATTTTTCCCCGATCTCGAATGCTCCACCCACGTGGAAGTGCACATACTCAAGTGTGTGCTGGCAGTATTCAAGAAATTGGGTATCCCTCCATGCGTGTTGGCATCTGTGTTCCTCCTGTGATCGTAACTACCTCTTATGGTCTCCTCTCTCACCCAGACAGTCTCAGGATCAACATTGGAGACAGCCAACAGAGTAGCCGCGATTATCCTGCCAAATGTGGAGTCTGAAGGGTATCTCCAACCTATCAGCTTCTGAATACTCACAGCCCTCTTCAGTACATCTTCATCCCCATAAGCTGATGCTATGTCAGTTGCCTTGAATCGTTCTTTAGTATATGATCCGAAATAGGGTTTGCACGGTCCCTTGGTTGATAGGATGTCTTGTCCGCCCTGTCTCCCGTCTTGTATGGTGATGTAACCTGACATGCACAGGTGACCATTTCTCGGCACAACATTCAGGTATTCAGCCGGATGAGGCACAGTCACTCCTAGCACTTGCTTTTTATAAGAGAGAGACCTCATTGAATCTGCTGTAAGTCTTGAGCAATCAGAGAACTTTAGATCATGAGGAACCTTATCTCTTACATGCAGGTACCCTATATACTTTTTCTCAGACTCTGCCAGCTCTGACACAACCGACATGGTCTCATTCATTCTGCGTATGGTCCGCGTCTTGTCAATTCGTGAGATGAGGCTGTTGGTCACGCCATATAGAGAAGCTTTAGCAATCTCATGTAACACCTTTGGATCTAGCTTTTCTCCAGAGCATAGTGCAGAATAAAACACTCTTTCATTTTCCTTGCTTGCAACAGAAACAAGATTGACAAAGTCAGGATTGTTATGTTTCGCTACTGAAAGGACGGCCTCCCGTGCATTTTCTCTGAGGGTTGATGTGCTGTGGGATGGGCTGTCATGAGAGATAGCAGCGGGATCTTCAACCAGCTTCTCATAATTGGGGTGCTGACTGAAAGAGATTCCCTTCATTGCACCCACAGCAATACCTAAACCTATGTCTATTTTCATCAATCTCTCATGCAACTTGTTAAGAAACATCACACCTTCTGTCACAGGATCGGGGAACCCCCTCTCAGTCAGGTTAAAGCAATTGGATAAGCCCGGCCCTCCAAAGATCGAAGGGAGGTAAAGTATTTTGGCCCAGAAGTGAACCAGATCCATCTCCTCTAGTGATAGACTCCTCTTTGACCCCTGTCTCATCACATCAAAGGTCCCTGAAACAAGACTTCCTTCCGTAGCGTAGAACAAAGGATTCATTGATCTTGACAGCTCAGCAATATACAGACCCCACAAACACTTCATTGTGATCACACCGACAATAAAATGCTCCTTCTGCATTGCTGCCTTTAGAATAGTACTGACACTGTTGCACATAAGGGCAGTGGACATCACTGAAGAATTGGAGAATGGGAAACACCTGCTGATTTGCTTCATTACAGTCCGTAGCGGTCTGCCTTTATAGTACATGTGCTTGTTATACATGAATAGAGAAGTGCTAGTCCAAGTTTCACTAGCCTTTAGTGGAAGACCACGTCTATCAAAATGCTGCTGCAATTCGGACAAGAAAGCTTTCATCTTATCCCTGATTTTTCTCTTCCCTTCTTGACTTATCTCCCCCCCTTCTAAGATGTCAGATGTTCTGATAGTGACGGTCAACACCTGATTATCTCCTCCCCCAACCAGAGATGCATCCATTCCCAATCGATCCGCAACATACTTTATATCACACACTGTCATGATTGTCCAGCCTTTCTGTCTCAATCCCTCCTTGCCAGACCCATCCCCTGTCCAGGAATTAATACCGTCCACTACCACCCCAGTAATGGGATCCGCGGTTAGAGGTCTCTCGCCAGAACTCAGATAGATTACACACTTCCTTAACATCAAATGGGTCTGATCATACAATCCTTCAGACCCAAATGTTCTCCCTAACTTGGAGAAGACAGGATGACAAATTTCATATCTCATTTGCTGGTTCCATTTCATGAAATCCATATTCACAACATATGTAACCGACCTGCTCTGATCAGACTGATGGCCTGAAAGCTTGCTCATGATCTTTGTCATCTCAAGCAAATTGATCGACATAGTTATCTCTGGGAAATATTTGAGTACCTTATCATTCAACAACCCTTCAGTGGAAGTGACATACAGCCTGAATTCATGTGTCATCAGTGAGAAGAATCTTGGCTTTATTTTTAACTCCCTCTCTTTCGGGTATATGCCGATCATGAGAAATTTATCTTCAAGGCCGTTAGCACCAACTTTCTCAAGGAAATCACGCATGGGGCCAAGTGGAGTCATAATTGTCTTCAATATAACCCGTCTCATATCTTGATTGAACACGTGTCCCCTTGTGATTAAGTTGTGATAGAGCTCTTCTCTGTTAGGAGAAATGGCCTTGTCCTTTACCGTGTGTATGATGTTCCAGGAGGTAGGTATCTCAAAGTTCTGACCAACCACCACCCATTCCCAATCCTGCATGGAATAGCCAATATTGGATGTGGAGAAAATGGTGTTGCCCTTTAGACAATTAAGGAGATATATACTGCTCTCCGCTTTGGCTATATCTATGTGGTCCGGCCTCTCTATATGGTGCAGAGGATAAACCCCATGTTTCTTCCTGAAATTTGAAAAGAACAACTCTAAAAATTTCCTGCCTACTTCATCTCCTAAAGCAAGATCTGTTTCCTTCTCCTGTAAGGACACTGATCTCATCTTTTCCATCCCCCCATCTATGTCTATGATAGGATGACCCCATATCCT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Claims (35)
- 修飾すべき細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない植物細胞遺伝物質を修飾する方法であって、
少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）とを含み、
前記細胞遺伝物質修飾プロセスは、配列特異的ヌクレアーゼによって切断誘導され、植物内因性ＤＮＡ修復機器によって完成される、植物細胞遺伝物質を修飾する方法。 - 修飾すべき植物細胞ゲノム内に外来遺伝子配列を導入する必要がない遺伝物質が修飾された植物を産生する方法であって、
少なくとも１つの遺伝物質修飾すべき植物細胞を提供するステップａ）と、全身感染能力を有する組み換え植物ラブドウイルスベクターを用いて前記植物細胞を感染するステップであって、前記全身感染能力を有する組換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列を担持し、前記配列特異的ヌクレアーゼは、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、標的サイトを切断するステップｂ）と、前記遺伝物質が修飾された細胞から植物を取得するステップｃ）、選択マーカーを利用する必要がなく、前記遺伝物質を含む修飾植物対象を選択するステップｄ）とを含む、遺伝物質が修飾された植物を産生する方法。 - 前記修飾すべき細胞を感染する方法は、組み換えウイルス未接種細胞自然感染、汁の摩擦接種、接ぎ木、昆虫媒介伝播、または他の任意のウイルスによる感染方法を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターが、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）またはナス斑点萎縮ウイルス（ｅｇｇｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ、ＥＭＤＶ）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記全身感染能力を有するラブドウイルスベクターは、一つまたは複数の種類の突然変異および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記誘導ウイルスベクターが、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇ）アミノ基末端ドメインが突然変異された、および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 前記細胞遺伝物質修飾は、標的サイトで少なくとも１つの塩基欠失、または１つの塩基挿入、または１つの塩基置換、またはこれらの修飾パターンの組み合わせから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするリボ核酸配列は、単一または複数のガイドＲＮＡの核酸配列と、Ｃａｓヌクレアーゼの核酸配列とを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記配列特異的ヌクレアーゼ配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣａｓヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記植物は、植物ラブドウイルスの自然または実験寄主である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記植物は、ノゲシ黄網ウイルスまたはナス斑点萎縮ウイルスの寄主であり、
前記植物は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニコチアナ・リーブランド（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・エドワードソニー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｄｗａｒｄｓｏｎｉｉ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ヒユアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、扶桑（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）、イヌホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ハルノノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ニコチアナ・グルチノサとニコチアナ・リーブランドとのハイブリッド品種、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、コセンダングサ（Ｂｉｄｅｎｓ ｐｉｌｏｓａ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）の一つまたは複数から選択される、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 感染性組み換え植物ラブドウイルスベクターであって、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記配列特異的ヌクレアーゼは、ウイルスベクターが感染した細胞内で一過性発現するとともに、植物ゲノム核酸配列を特異的に標的とし、前記標的配列は、前記ヌクレアーゼによって修飾される、ことを特徴とする感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記ラブドウイルスベクターは、ノゲシ黄網ウイルス（ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ、ＳＹＮＶ）またはナス斑点萎縮ウイルス（ｅｇｇｐｌａｎｔ ｍｏｔｔｌｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ、ＥＭＤＶ）に由来する、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記感染性組み換え植物ラブドウイルスベクターは、一つまたは複数の種類の突然変異および／または組み換え修飾後の誘導ウイルスベクターを含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記修飾後のウイルスベクターが、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇ）アミノ基末端ドメインが突然変異された、および／または組み換え修飾後のウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項２０に記載の誘導ウイルスベクター。
- 前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはすべてのゲノム編集を実現可能なヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記ラブドウイルスベクターが担持する配列が、単一または複数のガイドＲＮＡの核酸配列と、Ｃａｓヌクレアーゼの核酸配列とを転写産生する、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記配列特異的ヌクレアーゼ配列は、ラブドウイルスのゲノム中に独立した転写ユニットの形態で存在する、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、異なる転写ユニットによって制御される、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- ガイドＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ配列は、同一の転写ユニットによって制御される、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記配列特異的ヌクレアーゼ配列の転写は、ラブドウイルスメッセンジャーＲＮＡ転写に関する調節エレメントによって制御される、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列を細胞内因性ｔＲＮＡ加工機器によって取り除かれる、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記ガイドＲＮＡ転写産物は、ウイルスに由来する末端配列をＣａｓヌクレアーゼ加工によって取り除かれる、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターは、組み換え核酸コンストラクトであり、ウイルスベクターを含む配列は、プロモーターに作動可能に連結される、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 感染された自然または実験的寄主細胞内で、前記配列特異的ヌクレアーゼを一過性発現する、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。
- 前記植物が、ノゲシ黄網ウイルスまたはナス斑点萎縮ウイルスの寄主であり、
前記植物寄主は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニコチアナ・リーブランド（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・エドワードソニー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｄｗａｒｄｓｏｎｉｉ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ヒユアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｍｅｔｅｌ）、扶桑（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）、イヌホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ハルノノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ニコチアナ・グルチノサとニコチアナ・リーブランドとのハイブリッド品種の一つまたは複数から選択される、ことを特徴とする請求項１８に記載の感染性組み換え植物ラブドウイルスベクター。 - 請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法または請求項１８～３２のいずれか一項に記載の感染性組み換えウイルスベクターによって産生される遺伝物質が修飾された植物およびその子の世代。
- 請求項１８～３２のいずれか一項に記載の感染性組み換えウイルスベクターにおける菌株または組み換えウイルス粒子。
- 植物ゲノム編集における、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法または請求項１８～３２のいずれか一項に記載の組み換えウイルスベクターの使用。
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