JP2022095266A - 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法 - Google Patents

核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022095266A
JP2022095266A JP2020208491A JP2020208491A JP2022095266A JP 2022095266 A JP2022095266 A JP 2022095266A JP 2020208491 A JP2020208491 A JP 2020208491A JP 2020208491 A JP2020208491 A JP 2020208491A JP 2022095266 A JP2022095266 A JP 2022095266A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
estrogen
cells
acid construct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020208491A
Other languages
English (en)
Inventor
滋久 川田
Shigehisa Kawada
美津子 石原
Mitsuko Ishihara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toshiba Corp
Original Assignee
Toshiba Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toshiba Corp filed Critical Toshiba Corp
Priority to JP2020208491A priority Critical patent/JP2022095266A/ja
Priority to US17/552,652 priority patent/US20220220568A1/en
Publication of JP2022095266A publication Critical patent/JP2022095266A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/145—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/15—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/22—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated the carbon skeleton being further substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/24—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one carboxyl group bound to the carbon skeleton, e.g. aspartic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

【課題】エストロゲン感受性細胞をより感度よく検出することができる核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法を提供する。【解決手段】ＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列２と、エンハンサー配列２の下流に連結されたプロモーター配列３と、プロモーター配列３の下流に連結されたレポーター遺伝子４とを含む、核酸構築物１ａ、１ｂ、１ｃとする。【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法に関する。
乳がんのサブタイプであるルミナル型は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性であることを特徴とする乳がんである。ルミナル型の中にはホルモン療法が有効であるケースと有効でないケースが含まれており、ホルモン療法が有効でないケースも多く含まれる。そのため、適切な治療のためにどちらのケースであるかを正確に判断することが求められている。
両者はがんの進行のメカニズムが異なる。ホルモン治療が有効なケースは、リガンドのホルモンと結合したＥＲがエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）配列に結合することにより周囲の遺伝子の転写が促進され、がん化が進行する。一方ホルモン治療が有効でないケースにおいては、ＥＲは発現又は過剰発現しているもののＥＲＥ配列の周囲の遺伝子の転写促進は引き起こされず、他の機構によってがん化が進行すると考えられている。
したがって、ＥＲのＥＲＥ配列への結合による遺伝子発現をより正確かつ高感度に検出する方法が求められている。
Hayashi, S., Niwa, T., & Yamaguchi, Y. "Estrogen signaling pathway and its imaging in human breast cancer" Cancer Sci. 2009 Oct; 100(10):1773-8
本発明が解決しようとする課題は、エストロゲン感受性細胞をより感度よく検出することができる核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法を提供することである。
実施形態に従う核酸構築物は、エストロゲン感受性の細胞を検出するために用いられる。核酸構築物は、ＥＲＥ配列およびＸＲＥ配列を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列と、エンハンサー配列の下流に連結されたプロモーター配列と、プロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含む。
図１は、実施形態の核酸構築物の一例を示す図である。 図２は、エストロゲン感受性細胞の図、及びエストロゲン感受性細胞での実施形態の核酸構築物の挙動の一例を示す図である。 図３は、エストロゲン非感受性細胞の図、及びエストロゲン非感受性細胞での実施形態の核酸構築物の挙動の一例を示す図である。 図４は、実施形態のエストロゲン感受性細胞の検出方法の一例を示すフローチャートである。 図５は、実施形態の治療効果予測方法の一例を示すフローチャートである。 図６は、実施形態のＣＭＯＳイメージセンサの一例を示す平面図及び断面図である。 図７は、実施形態の核酸構築物を内包する脂質粒子の一例を示す断面図である。 図８は、例１において作製したベクター（１）を示す図である。 図９は、例１において作製したベクター（２）を示す図である。 図１０は、例１において作製したベクター（３）を示す図である。 図１１は、例１において作製したベクター（４）を示す図である。 図１２は、例１において作製したベクター（５）を示す図である。 図１３は、例３における実験結果を示す図である。 図１４は、例４における実験結果を示す図である。 図１５は、例５における実験結果を示す図である。 図１６は、例６における実験結果を示す図である。
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
・核酸構築物
実施形態によれば、核酸構築物が提供される。核酸構築物は、例えば直鎖状又は環状の二本鎖ＤＮＡである。核酸構築物は、例えばベクターであってもよい。例えば、プラスミドベクター又はウイルスベクターを基礎としたベクターであってもよい。
図１の（ａ）～（ｃ）に例示する通り、核酸構築物１（１ａ、１ｂ、１ｃ）は、エンハンサー配列２と、エンハンサー配列２の下流に連結されたプロモーター配列３と、プロモーター配列３の下流に連結されたレポーター遺伝子４とを含む。
本明細書において連結とは、２つの配列の間に他の配列を含むことなく連結されている場合、及び２つの配列の間に任意の配列が含まれる場合を含む。任意の配列は例えばスペーサーである。スペーサーは、上記の各配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、且つこれらの配列の活性に与える悪影響が少ない核酸配列である。上記配列は、各々の機能が作動できるように連結されている。
エンハンサー配列２は、エストロゲン応答エレメント（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｎｔ：ＥＲＥ）配列５及び生体異物応答因子（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ：ＸＲＥ）配列６を少なくとも１つずつ含む。
核酸構築物は、例えば図１の（ａ）に示す核酸構築物１ａのように、エンハンサー配列２はＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６を１つずつこの順番で含む。又は例えば図１の（ｂ）に示す核酸構築物１ｂのように、エンハンサー配列２はＸＲＥ配列６及びＥＲＥ配列５を１つずつこの順番で含む。又は例えば図１の（ｃ）に示す核酸構築物１ｃのように、エンハンサー配列２はＥＲＥ配列５と、その上流及び下流に連結された２つのＸＲＥ配列６とを含む。連結されたＥＲＥ配列５とＸＲＥ配列６との間にはスペーサーが設けられていることが好ましい。
エンハンサー配列２の構成はＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６を１つずつ含むものであれば上記に限定されるものではない。以下、実施形態の核酸構築物をまとめて核酸構築物１とも記載する。
次にＥＲＥ配列５とＸＲＥ配列６について説明する。
ＥＲＥ配列５は、例えば表１に示す配列番号１～６の塩基配列のうち少なくとも１つを含む。
Figure 2022095266000002
ＥＲＥ配列５は、表１の配列の何れかを複数組み合わせて連結されたものであってもよい。その場合、互いに異なる複数の配列を含んでもよいし、互いに同じ複数の配列を含んでもよい。例えばＥＲＥ配列５は表１に示す６つの配列がこの順番で連結された配列であることが好ましい。
複数の配列を組み合わせる場合、配列の間にはスペーサーが配置されることが好ましい。スペーサーの塩基配列は表１の配列の機能に与える悪影響が少ない配列であればよく、限定されるものではない。スペーサーの塩基長は、例えば１０塩基～６０塩基程であることが好ましい。例えば、ＥＲＥ配列５は、表２に示す配列番号７の配列であってもよい。
Figure 2022095266000003
下線部は配列番号１～６の塩基配列を示す。
ＸＲＥ配列６は、アリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）が認識して結合する配列である。ＸＲＥ配列６は、例えば表３に示す塩基配列を少なくとも１つ含むことが好ましい。ＸＲＥ配列６は、表３に示す塩基配列を複数連結した配列であってもよい。
Figure 2022095266000004
又はＸＲＥ配列６は、コア配列ＧＣＧＴＧを少なくとも１つ含む配列であってもよい。ある実施形態においては、ＸＲＥ配列６はＧＣＧＴＧである。
プロモーター配列３は、ウイルス由来プロモーター又は組織特異的プロモーターから選択されることが好ましい。ウイルス由来プロモーターは、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター又はシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）プロモーター又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター等である。組織特異的プロモーターは、被検細胞の由来の組織において特異的に使用されているプロモーターである。したがって組織特異的プロモーターは被検細胞の種類に従って選択される。例えば、被検細胞が乳がん細胞である場合、乳腺組織特異的プロモーター、例えば、エストロゲンプロモーター又はエストロゲンレセプタープロモーターを用いることが好ましい。しかしながらプロモーター配列３は、プロモーター配列の機能を有する限りにおいて上で列挙したものに限定されるものではなく、また上記プロモーター配列の塩基配列のうち任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。
Figure 2022095266000005
レポーター遺伝子４は、例えば蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子又は薬剤耐性遺伝子等である。例えば、青色蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子又は赤色蛍光タンパク質遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子；ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子等の発光酵素タンパク質の遺伝子；キサンチンオキシダーゼ遺伝子又は一酸化窒素合成酵素遺伝子等の活性酸素生成酵素の遺伝子；βアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子；或いは重金属結合タンパク質遺伝子等を用いることができる。
しかしながらレポーター遺伝子４は、上で列挙したレポーター遺伝子に限定されるものではなく、レポーターとしての機能を有する限りにおいては他のレポーター遺伝子、又は上記のレポーター遺伝子の塩基配列の任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。
レポーター遺伝子４は、例えばルシフェラーゼであるＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。その塩基配列の例を表２に示す。
Figure 2022095266000006
レポーター遺伝子４の下流には、転写終結配列が更に連結されていてもよい。転写終結配列は、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列又は人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列等である。ただし、転写終結配列はこれらに限定されるものではなく、転写終結配列としての機能を有する限りにおいては、他の配列、又は上記した転写終結配列の塩基配列を改変したもの等を用いてもよい。
核酸構築物１は、上記の配列の他にも任意の塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列は、例えば特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。機能を有する塩基配列は、例えば、更なるレポーター遺伝子発現ユニット、複製開始配列及び／又は複製開始タンパク質発現ユニット等である。
以上に説明した核酸構築物１によれば、被検細胞のうちエストロゲンに対して感受性である細胞を可視化して判別することができる。その原理について図２及び図３を用いて説明する。ここでは、図１の核酸構築物１ａを用いる例を説明する。
図２の（ａ）に示す被検細胞２０では、例えばエストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＲ）が過剰発現しており、ＥＲは細胞２０外から供給されるリガンドのエストロゲン９と結合し、複合体１０を形成する。複合体１０は核２１内に移動し、ゲノム上に存在するＥＲＥ配列２２に結合する。この結合はその周囲に存在する遺伝子２３の過剰発現を引き起こしている。このような被検細胞２０はＥＲのＥＲＥ配列へ結合による周囲遺伝子の転写促進能を有するエストロゲン感受性の細胞である。被検細胞２０は、例えばルミナル型の乳がんのうち、ホルモン治療が有効な乳がん細胞であり得る。
この被検細胞２０に実施形態の核酸構築物１ａを導入し、エストロゲン９を添加した場合、図２の（ｂ）に示すように、複合体１０が核酸構築物１ａのＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６に結合する。ＸＲＥ配列６にはＡｈＲ１１も結合し得る。その結果、ＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６によりレポーター遺伝子４の転写促進が起こり、レポータータンパク質１２が生成し得る。レポータータンパク質１２は、例えば信号１３を生じる等、種類に応じた検出可能な活性を示す。
一方、図３の（ａ）に示すＥＲのＥＲＥ配列へ結合による転写促進が起こりにくい、即ちエストロゲン非感受性の被検細胞３０では、ＥＲが発現若しくは過剰発現していたとしても、エストロゲン９と結合しないか、エストロゲン９と結合したＥＲ（複合体１０）が細胞内のＥＲＥ配列３２に結合しないか、又は結合しても周囲の遺伝子３３の発現若しくは過剰発現を引き起こしていない。被検細胞３０は、例えばルミナル型乳がんのうち、ホルモン治療が有効でない乳がん細胞であり得る。
この被検細胞３０に実施形態の核酸構築物１ａを導入し、エストロゲン９を添加した場合、図３の（ｂ）に示すように、複合体１０が形成されたとしても複合体１０はＥＲＥ配列５及びＸＲＥ配列６には結合しないか、或いは結合してもレポーター遺伝子４の転写を促進しない。したがって、レポータータンパク質１２は発現しないか、又は発現量は細胞２０と比較して少ない。
したがって、核酸構築物１のレポーター遺伝子４の活性が高い細胞はエストロゲン感受性細胞であると判定することができる。反対にレポーター遺伝子４の活性の低い細胞をエストロゲン非感受性細胞と判定することができる。
詳しくは後述するが、例えば、上記のように検出されたエストロゲン感受性の細胞の存在率を算出し、被検細胞全体としてのエストロゲン感受性の強度を判定することも可能である。またその情報を用いて被検細胞を採取した対象のがんについてホルモン治療が有効であるか否かについて予測をすることができる。
・エストロゲンへの感受性細胞の検出方法
以下、核酸構築物１を用いた被検細胞のエストロゲンへの感受性を有する細胞の判別方法について説明する。本方法は、図４に示すように、例えば以下を含む。
（Ｓ１）核酸構築物を被験細胞に導入する導入工程、
（Ｓ２）被検細胞にエストロゲンを添加する添加工程、
（Ｓ３）被検細胞を培養する培養工程、
（Ｓ４）レポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を検出する検出工程、及び
（Ｓ５）前記検出の結果からエストロゲン感受性細胞を判別する判別工程。
以下、本方法の手順について詳細に説明する。
まず、被検細胞を用意する。被検細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。被検細胞は、例えば生体外に取り出された細胞であり、例えば、血液等の体液、組織又はバイオプシー等から分離された細胞であってもよい。被検細胞は、例えば、単離細胞、培養細胞又は株化された細胞であってもよい。或いは、細胞は、生体内の細胞であってもよい。
被検細胞は、例えばエストロゲン感受性に関係する疾患の対象から採取された細胞である。疾患は、例えばがんである。被検細胞は、例えば疾患の病巣から得られた細胞である。がんである場合は、被検細胞は例えば乳がん細胞又は子宮内膜がん細胞等である。被検細胞は、がんの原発巣又は転移した病巣のがん細胞であることが好ましい。ある実施形態においては、被検細胞はＥＲ陽性であることが判明しているがん細胞である。
次に、被検細胞に核酸構築物１を細胞に導入する（導入工程Ｓ１）。導入工程Ｓ１は、例えば被検細胞が生体外に取り出された細胞である場合、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、カチオン性ポリマー法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法又はソノポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
特にリポソーム法を用いることが好ましい。リポソーム法は、核酸構築物１をリポソーム（脂質粒子）に内包し、それを含む組成物等を細胞と接触させる。それにより、脂質粒子は例えばエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、内包物を細胞内に放出する。脂質粒子の詳細については、後のキットの実施形態において説明する。
被検細胞が生体内の細胞である場合、導入は、核酸構築物１を含む組成物を生体へ注射又は点滴すること等によって行うことができる。組成物は、例えば核酸構築物１を内包する上記脂質粒子を含んでもよい。
次に、被検細胞にエストロゲン９を添加する（添加工程Ｓ２）。エストロゲン９は、ＥＲのリガントであるホルモンであり、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）又はエストリオール（Ｅ３）である。本明細書において、エストロゲン９はエストロゲンの誘導体も含む。誘導体は、ＥＲのリガンドとしての機能を有する限りにおいて、エストロゲン９の分子内の一部が変化した化合物である。例えば、誘導体は、Ｅ１、Ｅ２又はＥ３の前駆体、或いはＥ１、Ｅ２又はＥ３が化学反応することにより得られた化合物等も含む。
エストロゲン９は市販のもの、例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のもの等を用いることができる。例えば粉末状のエストロゲン９を適切な溶媒に溶解して被検細胞に添加する。
次に、被検細胞を培養する（培養工程Ｓ３）。培養は、被検細胞の種類によって選択される、被検細胞の生存に適した公知の方法で行えばよい。例えば培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約５％であることが好ましい。また、培養は１日～３日間行われることが好ましい。培地は固体培地又は液体培地であり、被検細胞の生存に適した公知の培地を用いることができる。
次にレポーター遺伝子４から発現するレポータータンパク質１２の活性を検出する（検出工程Ｓ４）。検出工程Ｓ４は、被検細胞からレポータータンパク質１２を抽出して得られた抽出液又は被検細胞の培養液の上清において行ってもよい。又は生きたままの被検細胞において行うことも可能である。
レポータータンパク質１２が信号１３を生ずる場合、それを検出することによりレポーター遺伝子４の活性を検出することができる。信号１３は、例えば蛍光、化学発光、生物発光、生物化学発光及び呈色等、或いはタンパク質等の分子の呈示である。信号１３はレポータータンパク質１２自体から発せられるか、又はレポータータンパク質１２と特定の物質（以下、「第１物質」と記載する）との反応、例えば、酵素反応又は結合等により生じるもので有り得る。
第１物質は、例えば、レポータータンパク質１２が酵素である場合、その基質である。例えば、レポータータンパク質１２がルシフェラーゼである場合、第１物質は、ルシフェリンである。或いは、信号１３は、レポータータンパク質１２と第１物質との反応により生じる物質の存在を検出するための更なる検出試薬（以下、「第２物質」と記載する）に由来する信号であってもよい。
例えば、上記第１物質及び／又は第２物質を用いる場合、これらの物質は検出工程Ｓ４のはじめに被検細胞に添加され得る。これらの物質は、被検細胞の培養培地に添加してもよいし、細胞に導入してもよい。或いは、被検細胞から得られた抽出液又は上清に添加してもよい。
信号１３の検出は、その種類に応じて選択された何れかの公知の方法を用いて行えばよい。
レポータータンパク質１２が蛍光タンパク質である場合、細胞に励起光を照射することにより蛍光タンパク質から発生する蛍光として信号１３が得られる。蛍光（信号１３）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はフルオロメーター等により検出することができる。
レポータータンパク質１２がルシフェラーゼである場合、ルシフェリンを添加することにより化学発光として信号１３が得られる。化学発光（信号１３）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はルミノメーター等により検出することができる。
レポータータンパク質１２がβ－ガラクトシダーゼである場合、５－ブルモー４－クロロー３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）又はｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）等の基質を添加することにより、細胞溶液又は抽出液の吸光度として信号１３が得られる。吸光度（信号１３）は、吸光度計、分光光度計又は濁度計等で検出することができる。
レポータータンパク質１２が一酸化窒素合成酵素又はキサンチンオキシダーゼである場合、基質を添加し、発生する活性酸素が信号１３として得られる。活性酸素（信号１３）は電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）等で検出することができる。
レポータータンパク質１２が重金属結合タンパク質である場合、測定可能な重金属を添加し、レポータータンパク質に結合した重金属が信号１３として得られる。重金属は、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、ＭＲＩ撮像装置、又はＸ線コンピュータ断層撮影装置により検出することができる。
次に、検出結果（レポータータンパク質１２の発現量の情報）からエストロゲン感受性細胞を判別する（判別工程Ｓ５）。例えば信号１３の強度はレポータータンパク質１２の発現量と相関するため、信号１３が得られた細胞、信号１３の強度が閾値よりも高い細胞は、レポーター遺伝子４の活性が高く、エストロゲン感受性が高いエストロゲン感受性細胞と判断することができる。反対に信号１３が得られない細胞、信号１３の強度が閾値よりも低い細胞は、エストロゲン感受性が低いエストロゲン非感受性細胞と判断することができる。
閾値は、例えば、エストロゲン感受性が高いことが既知である細胞を用いて実施形態の検出方法を実施した際に得られたレポータータンパク質１２の発現量（信号１３の強度）の値とすることができる。
レポータータンパク質１２が薬剤耐性遺伝子である場合、対応する薬剤を培地に添加して培養工程Ｓ４を行えばよい。この場合、エストロゲン感受性が高い被検細胞は生存し、エストロゲン感受性が低い被検細胞は死滅し得る。それによりエストロゲン感受性細胞を判別できる。
或いは検出工程Ｓ４は信号１３の検出又は薬剤によるスクリーニング等を行うのではなく、レポータータンパク質１２を直接検出又は定量してもよい。この場合、レポータータンパク質１２が検出された細胞、定量値が閾値よりも高い細胞は、レポーター遺伝子４の活性が高く、エストロゲン感受性が高い細胞と判断することができる。
このようにして、エストロゲン感受性細胞を判別することができる。例えば実施形態の方法によれば被検細胞としてＥＲ陽性型の乳がん細胞を用いた場合、ＥＲ陽性型の乳がん細胞を更にエストロゲン感受性によって分類することが可能である。また、本方法によればＥＲＥ配列５に加えてＸＲＥ配列６を用いることによって、より感度よくエストロゲン感受性細胞を判別することが可能である。ある実施形態によれば、例えばＥＲＥ配列５単独の場合と比較して約１．４倍～数倍感度よく判別可能である。
ＸＲＥ配列６は、一般的にはダイオキシン類等のリガンドと結合したＡｈＲが結合することにより周囲の遺伝子の転写を促進するものである。しかしながら、本方法によればＸＲＥ配列６はＡｈＲのリガンドがＡｈＲに結合する必要はなく、エストロゲン感受性細胞を判別することができる。
更なる実施形態において、本方法は、エストロゲン感受性細胞の存在率を算出する工程を更に含んでもよい。エストロゲン感受性細胞の存在率は、被検細胞の細胞数（Ａ）とエストロゲン感受性細胞数（Ｂ）とを計測し、次の式（Ｉ）に代入することにより得られる。
エストロゲン感受性細胞の存在率＝（Ｂ）／（Ａ）…式（Ｉ）
細胞数の計測は、公知の方法により行われればよい。例えば顕微鏡観察を行い目視により計測してもよいし、顕微鏡画像から自動的に計測してもよい。又はフローサイトメトリーを用いてもよい。
細胞数（Ｂ）は、検出工程Ｓ１２においてレポーター遺伝子４の活性が高い細胞の数である。例えば、細胞数（Ｂ）は信号１３が得られた細胞の数である。レポーター遺伝子４として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、細胞数（Ｂ）は生存した細胞の数である。
被検細胞の細胞数（Ａ）は、例えば被検細胞に散乱光を照射することで検出される細胞数である。薬剤耐性遺伝子を用いる場合、被検細胞の細胞数（Ａ）は導入工程Ｓ１１の前に計測しておけばよい。
エストロゲン感受性細胞の存在率の算出は、被検細胞の全てについて行う必要はなく、サンプリングした一部又は顕微鏡の視野内の一部の被検細胞において行い、その結果から被検細胞全体のエストロゲン感受性細胞の存在率を推定してもよい。
また、存在率を用いて被検細胞全体としてのエストロゲン感受性の強度を判定してもよい。エストロゲン感受性細胞の存在率が高いほどエストロゲン感受性の強度は高いと判定することができる。エストロゲン感受性の強度は、エストロゲン感受性の強度が既知である細胞群を用いて存在率と強度との関係を表す検量線又は閾値を予め用意しておき、それを基準として決定してもよい。
また、検出結果の補正を更に行ってもよい。例えばエストロゲン９を添加しない場合にもレポーター遺伝子４の活性が検出される場合がある。したがって、エストロゲン９添加あり（Ｅ（＋））の場合のレポータータンパク質１２の検出値とエストロゲン９添加無し（Ｅ（－））の場合のレポータータンパク質１２の検出値とを比較することで検出結果を補正することができる。Ｅ（＋）の検出値は、本検出方法を行うことによって得られたものである。Ｅ（－）の検出値は本検出方法の添加工程Ｓ２を除く工程行って得られたものである。検出値は例えば次の式（ＩＩ－１）によって補正することができる。
検出値の補正値＝Ｅ（＋）／Ｅ（－）…式（ＩＩ－１）
補正した検出結果に基づいて判別工程Ｓ５を行ってもよい。
又は、検出値に代えて存在率を上記式を用いて補正してもよい。即ち、存在率の補正値は、次の式（ＩＩ－２）によって得られる。
存在率の補正値＝Ｅ（＋）の場合の存在率／Ｅ（－）の場合の存在率
補正した存在率をエストロゲン感受性の強度の判定に用いてもよい。
以上に説明したエストロゲン感受性の検出方法によれば、実施形態の核酸構築物１を用いることによって、より感度よくエストロゲン感受性細胞を判別することができ、またエストロゲン感受性の強度を判定することができる。
・治療効果予測方法
更なる実施形態によれば、検出工程Ｓ３で得られた検出結果（レポータータンパク質１２の発現量の情報）は、核酸構築物１を用いた対象のがんにおけるホルモン治療の有効性を予測するために用いることができる。ここで、ホルモン治療は、エストロゲンの働きを抑制する薬剤の投与による治療である。以下、実施形態に従う治療効果予測方法について説明する。本方法は、図５に示すように、例えば以下を含む。
（Ｓ１１）核酸構築物を対象から得られた被験細胞に導入する導入工程、
（Ｓ１２）被検細胞にエストロゲンを添加する添加工程、
（Ｓ１３）被検細胞を培養する培養工程、
（Ｓ１４）レポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を検出する検出工程、及び
（Ｓ１５）前記検出の結果から対象のホルモン治療の有効性を予測する予測工程。
まず、被検細胞を対象から採取する。本方法において被検細胞はがん細胞、例えば乳がん細胞又は子宮内膜がん細胞等であり、好ましくはＥＲ陽性型の乳がん細胞である。
導入工程Ｓ１１～検出工程Ｓ１３は、前記導入工程Ｓ１～検出工程Ｓ３と同様に行うことができる。
予測工程Ｓ１５においては、核酸構築物１を導入しレポータータンパク質１２が発現しているか又は閾値よりも高発現している（レポーター遺伝子４の活性が高い）場合、被検細胞を採取した対象のがんについてホルモン治療が有効であると予測することができる。反対にレポータータンパク質１２が発現していないか又は低発現（レポーター遺伝子４の活性が低い）であれば、対象のがんについてホルモン治療が有効でないと予測することができる。
予測工程Ｓ１５は、上記存在率に基づいて行ってもよい。存在率が高いほどホルモン治療が有効であると予測することができる。治療効果の予測は存在率の閾値を基準に行ってもよい。例えば存在率の閾値は１０％以上であり、これより存在率が高い場合ホルモン治療が有効であると判定することも可能である。
レポータータンパク質１２の発現量の情報又はエストロゲン感受性細胞の存在率の情報をホルモン治療のスケジュール、例えば投与量、投与回数又は併用治療の種類等を決定するために使用することも可能である。例えば存在率に応じて薬剤のこれらの条件を変更してもよい。
・ＣＭＯＳイメージセンサ
実施形態のエストロゲン感受性細胞の検出方法及び治療効果予測方法において、培養工程と検出工程とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行ってもよい。図６は、ＣＭＯＳイメージセンサ１００の使用時の様子を示す。図６の（ａ）はＣＭＯＳイメージセンサ１００の平面図であり、図６の（ｂ）は（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である。ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、二次元領域にマトリックス状に並んだ複数のセンシング部１０１と、これらの複数のセンシング部１０１上に設けられた試料収容部１０２とを備える。試料収容部１０２内で被検細胞１０３を培養できる。各センシング部１０１は光学センサであり、センシング部１０１上の被検細胞１０３の有無、及び被検細胞１０３又は培地から生じる信号１３を二次元的に検出することが可能である。
・キット
実施形態によれば、エストロゲン感受性細胞を検出するため又は対象のがんについてホルモン治療の効果を予測するために用いられるキットが提供される。
キットは、核酸構築物１を含む。核酸構築物１は、例えば、溶媒に含まれた組成物として提供される。溶媒は、例えば、エンドトキシンフリー水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー又はＨＥＰＥＳバッファー等を用いることができる。組成物は、更に賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤等を含んでもよい。
核酸構築物１は、脂質粒子に内包された状態でキットに含まれていることが好ましい。脂質粒子について図７を用いて説明する。図７に示すように、脂質粒子２００は中空の球状の脂質膜である。
脂質粒子２００を構成する脂質膜は、単層、脂質二重層若しくは脂質三重層等の脂質膜である。また、脂質粒子２００は脂質膜が更に複数の重なった多層構造であってもよい。
脂質粒子２００は、１種類の脂質材料からなってもよいが、好ましくは複数種類の脂質材料からなる。脂質材料は、例えば、下記に例示するベース脂質と、第１の脂質化合物と、第２の脂質化合物とを少なくとも含むことが好ましい。
ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等であることが好ましい。ベース脂質は、例えば生体膜の主成分の脂質であってもよく、人工的に合成した脂質であってもよい。
ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子２００の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質として１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を用いることが好ましく、中性脂質として１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いることが好ましい。
ベース脂質は、脂質材料の全体に対して３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。或いは、１００％近くがベース脂質から構成されていてもよい。
第１の脂質化合物及び第２の脂質化合物は、生分解性脂質である。第１の脂質化合物はＱ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
脂質粒子２００が第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子２００の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、内包物の導入効率が高まり得る。
第１の脂質化合物として、例えば下記式で表される構造を有する脂質を用いれば導入効率がより優れているため好ましい。特に、下記式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を用いることが好ましい。
Figure 2022095266000007
第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子２００への核酸構築物１の内包量が多くなり得る。
例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、核酸構築物１の内包量がより優れているため好ましい。特に、下記式（２－０１）の化合物を用いることが好ましい。
Figure 2022095266000008
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子２００を用いた場合、核酸構築物１の内包量を増加させ、且つ核酸構築物１の被検細胞への導入効率を高めることが可能である。かつ導入した被検細胞の細胞死も低減することができる。
第１及び第２の脂質化合物は、脂質材料の全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質材料は、脂質粒子２００同士の凝集を防止する脂質、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含むこともまた好ましい。このような脂質は、脂質粒子２００の脂質材料全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質材料は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子２００に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を更に含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
用いられる脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子２００の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子２００のサイズ、内包物の種類、或いは導入する被検細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。
例えば、脂質粒子２００は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含むことが好ましい。
脂質粒子２００は、小分子を脂質粒子２００に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子２００の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、ベクター等の内包するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することによりベクター等を内包した脂質粒子２００が形成される。
また、キットは、レポータータンパク質１２を検出するための試薬を更に含んでもよい。試薬は、例えば、検出工程Ｓ４において説明した第１物質及び／又は第２物質である。
キットは、添加工程で使用するエストロゲン９を更に含んでもよい。
［例］
以下、実施形態のベクターを製造し、使用した例について説明する。
例１． 活性化エストロゲンレセプター（ＥＲ）を検出するレポーターベクターの作製
まず、アンピシリン耐性遺伝子配列、ＣｏｌＥ１ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする遺伝子（以下、「ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子」と表記する）、ＢＧＨポリＡ配列を連結したベクターＡを用意した。ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子の上流にあるＳａｃＩサイト及びＸｈｏＩサイトにおいて制限酵素処理を行った後、０．８％アガロース電気泳動を行い、ゲルを切り出して断片を精製した。
表 に示す人工的に合成した配列（配列番号１１）をテンプレートとして、表７に示す（１）～（５）のプライマーセットをそれぞれ用いて表 の条件でＰＣＲ法により増幅した。
Figure 2022095266000009
下線はＥＲＥ配列を示し、二重下線はプロモーター配列を示す。
Figure 2022095266000010
下線はXRE配列（配列番号８）を示す。
Figure 2022095266000011
上記増幅により、プロモーター（１）～（５）に対応して、プロモーター配列の前に次の配列が配置された５種の人工ＤＮＡ（１）～（５）がそれぞれ得られた：
（１）ＥＲＥ配列
（２）ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列
（３）ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列
（４）ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列
（５）ＸＲＥ配列
（ＸＲＥ配列は配列番号８の塩基配列を有するものを使用した。）
増幅産物を０．８％アガロース電気泳動によって精製し、ベクターＡのＳｃａＩ／ＸｈｏＩサイトにクローニングキット（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＴａＫａＲａ）を用いて連結した。その結果、図８に示す、人工ＤＮＡ（１）を含むベクター（１）、図９に示す、人工ＤＮＡ（２）を含むベクター（２）、図１０に示す、人工ＤＮＡ（１）を含むベクター（３）、図１１に示す、人工ＤＮＡ（４）を含むベクター（４）、及び図１２に示す、人工ＤＮＡ（５）を含むベクター（５）が得られた。配列番号８のＸＲＥ配列は、図中「ＡｈＲＥ」又は「ＡｈＲＥ－ＩＩＩ」と記載する。ベクター（１）～（５）についてＤＮＡ配列解析を行い、意図した配列であることをそれぞれ確認した。
例２． 活性化エストロゲンレセプター（ＥＲ）検出レポーターベクターを内包する脂質粒子の調製
例１で作製したベクター（１）～（５）をそれぞれ含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール中に脂質（ＦＦＴ１０（前記式（１－０１）の脂質化合物）／ＳＳＴ０４（前記式（２－０１）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１５／１０．５／１０．５／３０／２ｍｏｌ）を溶解した溶液に添加した。得られた混合液に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ベクター（１）～（５）を内包する脂質粒子を得た。脂質粒子のＤＮＡ内包量をＤＮＡ定量キット（Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴＭＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定した。
例３． 活性化エストロゲンレセプター（ＥＲ）検出レポーターベクターの細胞株への導入
・ヒト乳腺腫瘍由来細胞株への導入
ヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＣＦ－７）をカルチャーフラスコ内で１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地（ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で付着培養した。培養後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がした。次いで、１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁し、Ｔｒｙｐｓｉｎを不活性化した。遠心で細胞を回収した後、２．０×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁した。９６ウェル培養ディッシュ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に４．０×１０４細胞／ウェルとなるように細胞懸濁液を２００μＬ加えた。その後、例２で作製したＤＮＡ内包脂質粒子をＤＮＡが６５ｎｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１５分培養後、最終濃度が４ｎＭとなるようにＥＲの基質であるエストラジオール（Ｅ２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
ＤＮＡ内包脂質粒子を添加した２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、培地を取り除いた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＧｌｏＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（プロメガ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、得られた混合液を－８０℃で３０分凍結した。それを室温で融解させた後、細胞溶解液を１．５ｍｌ遠心チューブに回収した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞残渣を沈殿させ、上清２５μＬを９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ）に分注した。分注した上清に、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ、プロメガ）に含まれるルシフェラーゼ基質溶液を２５μＬ添加し、混合した。得られた混合液についてルミノメーター（ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて、０．１秒当たりの１ウェルの当たりの発光強度（ＲＬＵ）を測定した。
発光強度は、Ｅ２を添加しない場合についても測定した。Ｅ２添加あり（Ｅ２（＋））の場合の値をＥ２添加無し（Ｅ２（－））の場合の値で除した補正値（Ｅ２（＋）／（－））を算出した。
・プロモーター活性の比較結果
図１３に発光強度（ＲＬＵ）の測定結果を示す。ＲＬＵ値の補正値は、
ベクター（１）（ＥＲＥ配列のみ）で２．０２、
ベクター（２）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列）で２．８５、
ベクター（３）（ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で３．７３、
ベクター（４）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で３．９８、
ベクター（５）（ＸＲＥ配列のみ）で０．９４であった。
ＸＲＥ配列との両方を含むベクターでは、ＥＲＥ配列のみのベクターに比べて、発光強度が高かった。またその強度は、ＥＲＥ配列のみ＜ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列＜ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列＜ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列の順であった。また、ＸＲＥ配列のみのベクターでは、Ｅ２（＋）とＥ２（－）とで差がほとんど無く、活性化エストロゲンレセプター（ＥＲ）の検出ができなかった。
これらの結果からＥＲＥ配列とＸＲＥ配列との両方を含むベクターを用いた場合、活性化エストロゲンレセプター（ＥＲ）の検出感度が向上することが明らかとなった。
例４． リポソーム法の評価
・ヒト乳腺腫瘍由来細胞株への導入
ヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＣＦ－７）をカルチャーフラスコ内で１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地（ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で付着培養した。培養後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がした。次いで、１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁し、Ｔｒｙｐｓｉｎを不活性化した。遠心で細胞を回収した後、２．０×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁した。９６ウェル培養ディッシュ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に４．０×１０４細胞／ウェルとなるように細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
・リポフェクタミン３０００によるＤＮＡの細胞への導入
リポフェクタミン３０００試薬（インビトロジェン製）を用いて、例１で作製したベクター（２）～（４）をヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＣＦ－７）に導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。ベクター（２）～（４）は、６５ｎｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１５分培養した。その後、最終濃度が４ｎＭとなるようにＥＲの基質であるエストラジオール（Ｅ２：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
リポフェクタミン３０００でベクター（２）～（４）を添加した４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、培地を取り除いた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＧｌｏＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（プロメガ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、得られた混合液を－８０℃で３０分凍結した。それを室温で融解させた後、細胞溶解液を１．５ｍｌ遠心チューブに回収した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞残渣を沈殿させ、上清２５μＬを９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ）に分注した。分注した上清に、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ、プロメガ）に含まれるルシフェラーゼ基質溶液を２５μＬ添加し、混合した。得られた混合液についてルミノメーター（ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて、０．１秒当たりの１ウェルの当たりの発光強度（ＲＬＵ）を測定した。また、例３と同様に補正値Ｅ２（＋）／（－）を算出した。
・プロモーター活性の比較結果
図１４にリポフェクタミン３０００試薬を用いた場合の発光強度（ＲＬＵ）の測定結果を示す。ＲＬＵ値の補正値は、
ベクター（２）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列）で２．１２、
ベクター（３）（ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で２．６０、
ベクター（４）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で２．５３であった。
上記の結果を例３で得られた脂質粒子を用いた場合の発光強度（ＲＬＵ）の実施形態のベクター（２）～（４）の補正値と比較した。
脂質粒子を用いた場合のＲＬＵ値の補正値は、
ベクター（２）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列）で２．８５、
ベクター（３）（ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で３．７３、
ベクター（４）（ＸＲＥ配列－ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列）で３．９８であった。
リポフェクタミン３０００試薬を用いた場合、脂質粒子を用いた場合と比較して補正値はより低くなった。したがって、脂質粒子を用いれば検出感度がより向上することが明らかとなった。
例５．ＸＲＥ配列の比較
ＸＲＥ配列としてＡｈＲＥ－ＩＩＩ（配列番号８）を用いたベクターと、ＸＲＥ配列としてＧＣＧＴＧを用いたベクターとを作製した。両ベクターのエンハンサー配列の構成は、ＥＲＥ配列－ＸＲＥ配列とした。例３と同様の方法で両ベクターをヒト乳腺腫瘍由来細胞株に導入してＥ２（＋）又はＥ２（－）の条件でＮａｎｏＬｕｃ発行強度を測定し、補正値Ｅ２（＋）／（－）を算出した。
結果を図１５に示す。Ｅ２（＋）／（－）は、ＡｈＲＥ－ＩＩＩ（配列番号８）を用いたベクターではより高く７．１４であり、ＧＣＧＴＧを用いた場合は４．３８と低い値であった。またＥ２（－）はＡｈＲＥ－ＩＩＩ（配列番号８）の方が有意に小さい値となった。図中、「＊」はＡｈＲＥ＿ＥＲＥ＿ＡｈＲＥのＥ（－）を「１」とした時のＧＣＧＴＧの値である。したがって、ＡｈＲＥ－ＩＩＩを用いた場合、検出感度がより向上することが明らかとなった。
例６．複数のＡｈＲＥ－ＩＩＩを含むエンハンサー配列の評価
エンハンサー配列としてＥＲＥ配列を含むベクター（ＥＲＥ）、１つのＡｈＲＥとＥＲＥ配列とを含むベクター（ＡｈＲＥ＿ＥＲＥ）、２つのＡｈＲＥとＥＲＥ配列とを含むベクター（ＡｈＲＥ×２＿ＥＲＥ）、及び３つのＸＲＥ配列（ＡｈＲＥ）とＥＲＥ配列とを含むベクター（ＡｈＲＥ×３＿ＥＲＥ）を作製した。例３と同様の方法で両ベクターをヒト乳腺腫瘍由来細胞株に導入してＥ２（＋）又はＥ２（－）の条件でＮａｎｏＬｕｃ発行強度を測定し、補正値Ｅ２（＋）／（－）を算出した。
Ｅ２（＋）／（－）は、ＥＲＥのベクターでは２．３７であり、ＡｈＲＥ＿ＥＲＥのベクターでは３．０４であり、ＡｈＲＥ×２＿ＥＲＥのベクターで２．８０であり、ＡｈＲＥ×３＿ＥＲＥでは２．９０であった。したがって、ＡｈＲＥを複数連結した場合にもＥＲＥ単独と比較して検出感度がより向上することが明らかとなった。ＡｈＲＥを複数連結した場合、ＡｈＲＥ単数よりＥ２（－）の値が上昇するものの、Ｅ２（＋）の値は向上し、反応性に優れていた。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
１、１ａ、１ｂ、１ｃ…核酸構築物、
２…エンハンサー配列、３…プロモーター配列、４…レポーター遺伝子、
５…ＥＲＥ配列、６…ＸＲＥ配列、９…エストロゲン、１０…複合体、
１２…レポータータンパク質、１３…信号、
２０、３０…被検細胞、
１００…ＣＭＯＳイメージセンサ、１０３…被検細胞、
２００…脂質粒子。

Claims (23)

  1. ＥＲＥ配列およびＸＲＥ配列を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列と、
    前記エンハンサー配列の下流に連結されたプロモーター配列と、
    前記プロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と
    を含む、エストロゲン感受性の細胞を検出するための核酸構築物。
  2. 前記エンハンサー配列は、前記ＥＲＥ配列と、前記ＸＲＥ配列の上流及び下流に配置された前記ＸＲＥ配列とを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記ＥＲＥ配列が、配列番号１～６の塩基配列うち少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
  4. 前記ＥＲＥ配列が、配列番号１～６の塩基配列をこの順番で含む、請求項３に記載の核酸構築物。
  5. 前記ＸＲＥ配列が、配列番号８の塩基配列を少なくとも１つを含む、請求項１～４の何れか１項に記載の核酸構築物。
  6. 発現プロモーター配列が、ウイルス由来プロモーター又は乳線組織特異的プロモーターである、請求項１～５の何れか１項に記載の核酸構築物。
  7. 前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項１～６の何れか１項に記載の核酸構築物。
  8. 前記被検細胞は、がん細胞である、請求項１～７の何れか１項に記載の核酸構築物。
  9. 前記癌細胞は、乳がん細胞又は子宮内膜がん細胞である、請求項８に記載の核酸構築物。
  10. エストロゲン感受性の細胞を検出するためのキットであって、
    脂質粒子に内包された核酸構築物を含み、
    前記核酸構築物は、
    ＥＲＥ配列およびＸＲＥ配列を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列と、
    前記エンハンサー配列の下流に連結されたプロモーター配列と、
    前記プロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と
    を含む、キット。
  11. 前記脂質粒子は、その材料として下記式（１－０１）の化合物、式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物：
    Figure 2022095266000012
    を含む、請求項１０に記載のキット。
  12. 前記レポーター遺伝子の発現を検出するための試薬を更に含む、請求項１０又は１１に記載のキット。
  13. エストロゲンを更に含む、請求項１０～１２の何れか１項に記載のキット。
  14. 核酸構築物を用いて被検細胞中のエストロゲン感受性の細胞を検出する方法であって、
    前記核酸構築物は、
    ＥＲＥ配列およびＸＲＥ配列を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列と、
    前記エンハンサー配列の下流に連結されたプロモーター配列と、
    前記プロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と
    を含み、
    当該方法は、
    前記核酸構築物を前記被験細胞に導入することと、
    前記被検細胞にエストロゲンを添加することと、
    前記被検細胞を培養することと、
    前記レポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を検出することと
    前記検出の結果からエストロゲン感受性細胞を判別することと
    を含む検出方法。
  15. 前記導入は、前記核酸構築物を内包した脂質粒子を前記被検細胞に接触させることにより行われる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記レポーター遺伝子の前記活性が高い細胞をエストロゲン感受性細胞と判定する請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 前記培養と前記検出とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行う、請求項１４～１６の何れか１項に記載の方法。
  18. 前記検出の結果から、次の式（Ｉ）により前記エストロゲン感受性細胞の存在率を算出することを更に含み、
    存在率＝エストロゲン感受性細胞数／被検細胞数…式（Ｉ）
    前記存在率から前記被検細胞のエストロゲン感受性の強度を判定することを更に含む、
    請求項１４～１７の何れか１項に記載の方法。
  19. 前記被験細胞のエストロゲン感受性の強度の判定は、予め用意された前記エストロゲン感受性細胞の存在率の閾値を基準として行われる、請求項１８に記載の方法。
  20. 次の式（ＩＩ）により得られた前記存在率の補正値を算出することを更に含み、
    存在率の補正値＝前記エストロゲンを添加した場合の前記存在率／前記エストロゲンを添加せずに前記検出方法を行った場合の前記存在率…式（ＩＩ）
    前記補正値から前記被験細胞のエストロゲン感受性の強度を判定する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 核酸構築物を用いて対象のがんにおけるホルモン治療の有効性を予測する方法であって、
    前記核酸構築物は、
    ＥＲＥ配列およびＸＲＥ配列を少なくとも１つずつ含むエンハンサー配列と、
    前記エンハンサー配列の下流に連結されたプロモーター配列と、
    前記プロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と
    を含み、
    当該方法は、
    前記核酸構築物を前記対象から得られた被験細胞に導入することと、
    前記被検細胞にエストロゲンを添加することと、
    前記被検細胞を培養することと、
    前記レポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を検出することと
    前記検出の結果から前記対象のがんについてホルモン治療の有効性を予測することと
    を含む予測方法。
  22. 前記予測において、前記レポーター遺伝子の前記活性が高い場合、前記対象のがんについてホルモン治療が有効であると判定する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記被検細胞は、乳がん細胞又は子宮内膜がん細胞である、請求項２２に記載の方法。
JP2020208491A 2020-12-16 2020-12-16 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法 Pending JP2022095266A (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020208491A JP2022095266A (ja) 2020-12-16 2020-12-16 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法
US17/552,652 US20220220568A1 (en) 2020-12-16 2021-12-16 Nucleic acid construct, kit, detection method, and therapeutic effect prediction method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020208491A JP2022095266A (ja) 2020-12-16 2020-12-16 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022095266A true JP2022095266A (ja) 2022-06-28

Family

ID=82162898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020208491A Pending JP2022095266A (ja) 2020-12-16 2020-12-16 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20220220568A1 (ja)
JP (1) JP2022095266A (ja)

Also Published As

Publication number Publication date
US20220220568A1 (en) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11382952B2 (en) Molecular marker for cancer stem cell
El-Naggar et al. Translational activation of HIF1α by YB-1 promotes sarcoma metastasis
KR101429696B1 (ko) 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
US7157571B2 (en) Hepatoma specific chimeric regulatory sequence
US20220017894A1 (en) Compositions and methods for in vivo screening of therapeutics
KR101029765B1 (ko) 페리틴 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터 및 그의 용도
JP5080252B2 (ja) 細胞周期を知らせる細胞系
US7569221B2 (en) Compositions and methods for identifying agents that alter expression of survivin
US20200140951A9 (en) Transcriptional system and uses thereof for single cell detection
JP2022095266A (ja) 核酸構築物、キット、検出方法及び治療効果予測方法
WO2022118918A1 (en) Nucleic acid construct set, kit, detection method and method for predicting drug effect
WO2022153596A1 (en) Vector set for measuring transposase activity, kit, transposase activity measuring method, and cell separation method
US20220047517A1 (en) Composition, lipid particle manufacturing kit, substance delivery method, and detection method
Liu et al. Synthesizing oncogenic signal-processing systems that function as both “signal counters” and “signal blockers” in cancer cells
CN112444509B (zh) 一种活细胞内检测clk3激酶活性的生物探针及其应用
Zickler et al. Novel endogenous engineering platform for robust loading and delivery of functional mRNA by extracellular vesicles
Suresh et al. A new fluorescent based screening system for high throughput screening of drugs targeting HBV-core and HBsAg interaction
JP2020146014A (ja) トランスポゼース活性測定用ベクター、トランスポゼース活性測定用キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法
JP7273987B2 (ja) 腫瘍細胞群の特性を決定する方法、キット及びプログラム
US20240150751A1 (en) Compositions and methods for in vivo screening of therapeutics using single nucleus sequencing
RU2420584C1 (ru) Лентивирусная репортерная векторная система для измерения активности ключевых транскрипционных факторов, отражающих функциональное состояние сигнальных путей клетки
CN116286821A (zh) 基于CRISPR/Cas13a系统特异性靶向IDH1 R132H基因的crRNA及应用
CN115786515A (zh) Pdpn在拉帕替尼耐药的her2阳性胃癌诊断、治疗中的应用
CN116716301A (zh) 一种靶向胃癌细胞递送PLOD2 siRNA的外泌体

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230209

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240109

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240308