JP2022082235A - 表皮内の抗酸化物質の発現増強剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を利用することによって、表皮内の抗酸化関連物質の発現を増強する。【解決手段】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む、表皮内の抗酸化関連物質の発現増強剤である。前記抗酸化関連物質が、酸化ストレス応答遺伝子,抗酸化酵素、及び抗酸化タンパクである。前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。【選択図】図１
Description
本発明は、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤及び発現増強方法に関する。
リン脂質と界面活性剤とからなる閉鎖小胞体（ベシクル）が知られており、リポソームとも称される。特許文献１には、リン脂質に替えて、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（以下「ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物」と称する場合がある）を主体とする脂質を用い、水又は界面活性剤と混合することによって、自発的にベシクルを形成させる調製方法が提示されている。このようなベシクルは、それらの内部や表面にタンパク質や抗体などの目的物質を封入又は結合させて生体内の細胞に送達するドラッグデリバリーシステムに利用されている。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を脂質とするベシクルは、その表面が親水性のＰＥＧ鎖で覆われた形態を有しており、生体内への浸透性と血中での安定性が良好である。特許文献２には、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物からなるベシクルの表面に荷電要素を結合させて正帯電させることにより、表皮の角層への浸透性と貯留性を向上させることが記載されている。
ドラッグデリバリーシステムにおけるベシクルは、単に目的物質のキャリアとして認識されている。ベシクルは、最終的に生体内で個々の分子に分解するが、ベシクルを構成する分子自体の生体内での作用は、ほとんど知られていない。特許文献３及び特許文献４は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の生体内での幾つかの作用を開示している。それによれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、体内でホスホリパーゼＡ及びシクロオキシゲナーゼ－２に結合してこれらの酵素を阻害することによって、痛み、発熱、炎症を抑制する作用を発揮するとされている。しかしながら、炎症経路の抑制機構には、ホスホリパーゼA及びシクロオキシゲナーゼ－２阻害による炎症等の軽減以外にも多数存在する。それらの別の炎症抑制機構に関して、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の生体内での作用は、これまで不明であった。
本発明の目的は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物に関して新たに見出された特性を利用することであり、特に、表皮内の抗酸化物質の発現を増強することである。
上記の目的を達成するために本発明は、以下の構成を提供する。
本発明の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤である。
また、本発明の別の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、表皮内の抗酸化物質の発現増強方法である。
本発明の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤である。
また、本発明の別の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、表皮内の抗酸化物質の発現増強方法である。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルが、２０～４０ｎｍの範囲内の直径を有する。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルが、２０～４０ｎｍの範囲内の直径を有する。
好ましくは、前記抗酸化物質が酸化ストレス応答遺伝子であり、前記酸化ストレス応答遺伝子がＮｒｆ２である。
好ましくは、前記抗酸化物質が酸化ストレス応答遺伝子であり、前記酸化ストレス応答遺伝子がＰＰＡＲＧである。
好ましくは、前記抗酸化物質が抗酸化酵素であり、前記抗酸化酵素が、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈキノン還元酵素（ＮＱＯ－１）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、及びヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＭＯＸ１）からなる群のうち１つ又はそれ以上である。
好ましくは、前記抗酸化物質が抗酸化タンパクであり、前記抗酸化タンパクがグルタチオンである。
好ましくは、前記抗酸化物質が酸化ストレス応答遺伝子であり、前記酸化ストレス応答遺伝子がＰＰＡＲＧである。
好ましくは、前記抗酸化物質が抗酸化酵素であり、前記抗酸化酵素が、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈキノン還元酵素（ＮＱＯ－１）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、及びヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＭＯＸ１）からなる群のうち１つ又はそれ以上である。
好ましくは、前記抗酸化物質が抗酸化タンパクであり、前記抗酸化タンパクがグルタチオンである。
本発明はさらに、上記の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、紫外線による表皮損傷の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、上記の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、大気汚染物質による表皮損傷の抑制剤を提供する。
本発明はさらに、上記の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、表皮内のハイドロキノンの酸化抑制剤を提供する。
本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤が実現される。また、本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた、表皮内の抗酸化物質の発現増強方法が実現される。
以下、図面を参照しつつ、本発明の実施の形態を説明する。
本発明は、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物）において新たに見出された特性を利用して創作されたものである。ここで新たに見出された特性は、ヒトの表皮内の抗酸化物質の発現を増強する作用である。
本発明は、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物）において新たに見出された特性を利用して創作されたものである。ここで新たに見出された特性は、ヒトの表皮内の抗酸化物質の発現を増強する作用である。
本発明に関する脂質分子であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の構造式を概略的に示す。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、３つの炭素を有するグリセロール骨格部（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）と、骨格部の３つの炭素のうち末端の１つの炭素に結合した直鎖型ポリエチレングリコールであるＰＥＧ鎖と、３つの炭素のうち他の２つの炭素にそれぞれ結合した同種の長鎖脂肪酸（ＣＯＯＲ）とから構成されている。ＰＥＧ鎖の部分が親水性であり、長鎖脂肪酸の部分が疎水性である。
以下の説明において特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を表すとき、長鎖脂肪酸の種類と、ＰＥＧ鎖のｎの数に基づいて、"［ジ］＋［長鎖脂肪酸名］＋［グリセロール］＋［ＰＥＧ－ｎ］"と称する。例えば、長鎖脂肪酸がミリスチン酸、ＰＥＧ鎖のｎが１２の場合は、"ジミリスチン酸ＰＥＧ－１２"である。また、特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をさらに略称で示す場合もある。
長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数は、１１～２３の範囲内とすることができる。この範囲に含まれる長鎖脂肪酸は、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、又はオレイン酸などである。ＰＥＧ鎖のｎの数は、１１～４６の範囲内とすることができる。本発明に関係するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物として、以下のものを例示することができる。括弧内に、融点と略称を示す。
・ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（２５．０℃：ＧＤＭ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（４０．０℃：ＧＤＳ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３９．８℃：ＧＤＳ２３）
・ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３１．２℃：ＧＤＰ２３）
・ジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２ （２５．０℃：ＧＤＯ１２）
・ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（２５．０℃：ＧＤＭ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（４０．０℃：ＧＤＳ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３９．８℃：ＧＤＳ２３）
・ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３１．２℃：ＧＤＰ２３）
・ジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２ （２５．０℃：ＧＤＯ１２）
ヒトの生体における炎症経路には、細胞内物質の酸化が関係している。近年、紫外線や大気汚染物質等による細胞への酸化ストレスによって皮膚トラブルが生じることが多く報告されている。
生体への酸化ストレスに対する防御機構においては、酸化ストレス応答遺伝子であるＮｒｆ－２が重要な役割を果たすことが知られている。転写活性因子であるＮｒｆ－２は、酸化ストレスのない状態ではタンパク質のＫｅａｐ－１と結合しており、不活性化されている。生体に酸化ストレスがかかると、Ｋｅａｐ－１が抑制されることによりＮｒｆ－２が活性化する。活性化したＮｒｆ－２は細胞の核内に移行して、抗酸化酵素を産生する。さらに、タンパク質であるＰＰＡＲγもまた抗酸化物質であり、Ｎｒｆ－２と相互に刺激し合うことによって、細胞の抗酸化活性を高めている。
発明者らは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮に適用することによって、表皮内の抗酸化物質であるＮｒｆ－２及びＰＰＡＲγの発現が増強されることを見出した。さらに、これらの抗酸化物質によって産生される抗酸化酵素及び抗酸化タンパクも増強されることを見出した。具体的な抗酸化酵素として、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈキノン還元酵素（ＮＱＯ－１）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、及びヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＭＯＸ１）の産生がそれぞれ増強されることが確認された。また、具体的な抗酸化タンパクとして、グルタチオンの産生が増強されることが確認された。表皮細胞内においてこれらの抗酸化物質の発現を増強する作用は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物について新たに見出された作用であり、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の新たな特性といえる。このジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の新規作用は、表皮表面の単なる物理的な保護ではなく、表皮細胞内で発揮される作用である。この新規特性による表皮内の抗酸化効果によって、外部からの様々な酸化ストレスによる皮膚トラブルを軽減することが可能となると考えられる。
本発明は、このジアシルグリセロールＰＥＧ付加物において新たに見出された特性を利用して、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤を提供する。また、本発明は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた、表皮内の抗酸化物質の発現増強方法を提供する。
本発明では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮に適用する場合、一種のみで用いてもよく、又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
本発明によれば、表皮内に到達したジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、それが無い場合に比べて、表皮内の抗酸化物質をより多く発現させることによって、外部からの酸化ストレス、例えば、紫外線や大気汚染物質による表皮内の細胞損傷を軽減又は防止することが可能となる。この効果は、後述する試験によって確認された。
さらに、表皮内に到達したジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、それが無い場合に比べて、表皮内の抗酸化物質をより多く発現させることによって、化粧品に美白成分として含まれるハイドロキノンの表皮内での酸化を抑制することが可能となる。その結果、表皮内でのハイドロキノンの酸化によって生成される、毒性をもつベンゾキノンによる細胞損傷を防止することができる。この効果も、後述する試験によって確認された。
したがって、本発明によれば、表皮内の抗酸化物質の発現増強を目的として、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする化粧品又は医薬品を提供することができる。さらに、本発明によれば、表皮内の抗酸化物質の発現増強を目的として、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた、表皮内の細胞損傷の軽減又は防止方法を提供することができる。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮内に到達させる１つの方法では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を水又は所定の溶媒に溶解させた溶液状態で表皮内に到達させることができる。例えば、リン酸緩衝食塩水PBS(-)を溶媒とする所定の濃度のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物溶液を調製し、皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。塗布された溶液は、最上層の角層内に浸透し、さらに角層の下の顆粒層へと浸透する。そして、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、浸透した表皮内の各層において当該層に元々存在する抗酸化物質の発現を増強する。
好適な方法では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をベシクル状態で表皮内に到達させることができる。そのようなベシクルは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の二重層、又は、二重層が複数重なった多重層からなる閉じた球殻として形成されており、親水性のＰＥＧ鎖が最外層の表面に配置されている。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルを調製し、それを皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。表皮内に到達した後にベシクルが分解し、個々の分子に分離することで、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体の作用を発揮することができる。
従来のドラッグデリバリーシステムでは、ベシクルの材料であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、目的物質の単なるキャリアと考えられてきたが、本発明では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体を有効成分として利用する。したがって、本発明では、通常のドラッグデリバリーシステムにおいてベシクルに組み込まれる目的物質は、基本的に不要である。本発明では、水とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のみを混合して形成したベシクルを表皮内に浸透させることによって、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体が、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤として機能することができる。
幾つかのジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、所定の温度で水と混合することにより、自発的にベシクルを形成する（特許文献１、２参照）。例えば、２質量％のＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２を９８質量％の脱イオン水に室温で混合し撹拌することにより、ＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２のベシクルの懸濁液が得られる。別の例として、２質量％のＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３を４５～５５℃で溶解させてから、４５～５５℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３のベシクルの懸濁液が得られる。さらに別の例として、２質量％のＧＤＰ２３を３７℃で溶解させてから、３７℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＰ２３のベシクルの懸濁液が得られる。室温よりも高い温度で得られた懸濁液を室温に冷却しても、ベシクルは安定している。
別の例として、水に替えて、種々の物質の水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を混合撹拌することによって形成したベシクルを用いる場合も、本発明の範囲に含まれるその場合、水溶液に含まれる物質に、別の機能をもたせることもできる。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物により形成された一般的なベシクルの大きさは、例えば、直径が約１００～３００ｎｍである。後述する試験によって、特に、２０～４０ｎｍの範囲内の直径を有する微細化ベシクルは、良好な抗酸化作用を示すことが判明した。これは、微細化ベシクルの良好な浸透性によると考えられる。このような微細化ベシクルは、例えば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を、別の脂質であるスクワラン及びコレステロールと混合することによって得ることができる（詳細は後述）。
さらに別の例として、水又は水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物とを混合撹拌することによって形成したベシクルの表面を、例えばカチオン性界面活性剤などの荷電要素で修飾して用いる場合も、本発明の範囲に含まれる。特許文献２には、正帯電したベシクルが、特に表皮への浸透性と貯留性に優れていることが記載されている。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む化粧品や医薬品は、例えば、水溶液、乳液、ゲル、クリーム等の多様な形態で提供することができる。
以下、表皮に対するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の適用と、表皮内の抗酸化物質及び酸化ストレスとの関係を試験データにより示す。
（１）酸化ストレス応答遺伝子及び抗酸化酵素の発現に関する試験
ヒト正常表皮メラノサイトを用いて試料を作製した後、ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、各目的物質（Ｎｒｆ－２、ＰＰＡＲＧ、ＮＱＯ－１、ＣＡＴ、ＨＭＯＸ１）の遺伝子の発現及び増幅を確認した。ＰＰＡＲＧは、タンパク質ＰＰＡＲγの遺伝子コードであり、酸化ストレス応答遺伝子の１つである。
ヒト正常表皮メラノサイトを用いて試料を作製した後、ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより、各目的物質（Ｎｒｆ－２、ＰＰＡＲＧ、ＮＱＯ－１、ＣＡＴ、ＨＭＯＸ１）の遺伝子の発現及び増幅を確認した。ＰＰＡＲＧは、タンパク質ＰＰＡＲγの遺伝子コードであり、酸化ストレス応答遺伝子の１つである。
（１－１）試験方法
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を３．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料１～４をそれぞれ添加した培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で６時間培養した。
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を３．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料１～４をそれぞれ添加した培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で６時間培養した。
試料１は、コントロール（ＧＤＳ２３無添加）である。試料２～４では、ＧＤＳ２３の量がそれぞれ異なる。
試料１：コントロール（N.C.）
試料２：ＧＤＳ２３（５００μＭ）
試料３：ＧＤＳ２３（１０００μＭ）
試料４：ＧＤＳ２３（２０００μＭ）
試料１：コントロール（N.C.）
試料２：ＧＤＳ２３（５００μＭ）
試料３：ＧＤＳ２３（１０００μＭ）
試料４：ＧＤＳ２３（２０００μＭ）
その後、各試料について、培養された細胞からＲＮＡをそれぞれ抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析により各目的物質のｍＲＮＡを定量した。内部標準としてはＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）を用いた。解析は、各目的物質のｍＲＮＡ発現量を、同一試料における内部標準であるＧＡＰＤＨの発現量の値でそれぞれ補正した後、コントロールの補正値を１００％としたときの各試料の補正値をそれぞれ算出した。
（１－２）試験結果
図１、図２、図３、図４、及び図５はそれぞれ、試料１～４についてのＮｒｆ－２、ＰＰＡＲＧ、ＮＱＯ－１、ＣＡＴ、及びＨＭＯＸ１の発現量を示すグラフである。
図１、図２、図３、図４、及び図５はそれぞれ、試料１～４についてのＮｒｆ－２、ＰＰＡＲＧ、ＮＱＯ－１、ＣＡＴ、及びＨＭＯＸ１の発現量を示すグラフである。
図１及び図２の結果は、表皮メラノサイトをＧＤＳ２３で処理することによって、酸化ストレス応答遺伝子であるＮｒｆ－２及びＰＰＡＲＧの発現が増強されることを示している。Ｎｒｆ－２及びＰＰＡＲＧの発現が増強されると、これらによって誘導される抗酸化酵素の産生も増強されると考えられる。図３は、酸化還元酵素であるＮＱＯ－１の増強を示している。図４は、過酸化水素を酸素と水に変える反応の触媒となる酵素であるＣＡＴの増強を示している。図５のＨＭＯＸ１の増強は、ヘム分解律速酵素及び細胞を酸化ストレスによる傷害から守る細胞保護タンパクの増強を示している。
（２）抗酸化タンパクの発現に関する試験
ヒト正常表皮メラノサイトを用いて試料を作製した後、細胞内の抗酸化タンパクであるグルタチオンの量を確認した。
ヒト正常表皮メラノサイトを用いて試料を作製した後、細胞内の抗酸化タンパクであるグルタチオンの量を確認した。
（２－１）試験方法
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料５～９をそれぞれ添加した同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料５～９をそれぞれ添加した同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
試料５は、コントロール（ＧＤＳ２３無添加）である。試料６～９では、ＧＤＳ２３の量がそれぞれ異なる。
試料５：コントロール（N.C.）
試料６：ＧＤＳ２３（５００μＭ）
試料７：ＧＤＳ２３（１０００μＭ）
試料８：ＧＤＳ２３（２０００μＭ）
試料９：ＧＤＳ２３（４０００μＭ）
試料５：コントロール（N.C.）
試料６：ＧＤＳ２３（５００μＭ）
試料７：ＧＤＳ２３（１０００μＭ）
試料８：ＧＤＳ２３（２０００μＭ）
試料９：ＧＤＳ２３（４０００μＭ）
その後、各試料について、アッセイキット（TaKaRa BCA Protein Assay Kit：タカラバイオ（株）製）を用いて、表皮メラノサイトのタンパク量及び総グルタチオン(GSH＋GSSG)量をグルタチオンレダクターゼリサイクリング法によりそれぞれ定量した。各試料について定量したタンパク量と総グルタチオン量からタンパク量当たりの総グルタチオン量をそれぞれ求めた後、コントロールの増加比を１００％としたときの各試料の増加比をそれぞれ算出した。
（２－２）試験結果
図６は、試料５～９におけるタンパク質当たりの総グルタチオン量を示すグラフである。図６によれば、表皮メラノサイトをＧＤＳ２３で処理することによって、高い抗酸化力を有するタンパクであるグルタチオンの細胞内における産生が促進されることが確認された。グルタチオンは、グルタチオン産生酵素により生成され、そしてグルタチオン産生酵素は、Ｎｒｆ－２及び／又はＰＰＡＲγにより誘導される。したがって、ＧＤＳ２３によりＮｒｆ－２及び／又はＰＰＡＲγが発現増強されることによって、結果的にグルタチオンの産生が促進されることが確認された。
図６は、試料５～９におけるタンパク質当たりの総グルタチオン量を示すグラフである。図６によれば、表皮メラノサイトをＧＤＳ２３で処理することによって、高い抗酸化力を有するタンパクであるグルタチオンの細胞内における産生が促進されることが確認された。グルタチオンは、グルタチオン産生酵素により生成され、そしてグルタチオン産生酵素は、Ｎｒｆ－２及び／又はＰＰＡＲγにより誘導される。したがって、ＧＤＳ２３によりＮｒｆ－２及び／又はＰＰＡＲγが発現増強されることによって、結果的にグルタチオンの産生が促進されることが確認された。
（３）紫外線損傷の抑制効果試験－１
紫外線による紅斑反応は、短波長紫外線（ＵＶＢ）(２９０～３２０nm)によって引き起こされる紫外線損傷であり、サンバーンと呼ばれる。このサンバーンは、活性酸素及びプロスタグランジンＥ２によって引き起こされるとされている。そこで、表皮内の抗酸化物質の発現を増強するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による紫外線損傷の軽減効果を示すために、ＵＶＢ照射と細胞生存率との関係を確認する試験を行った。
紫外線による紅斑反応は、短波長紫外線（ＵＶＢ）(２９０～３２０nm)によって引き起こされる紫外線損傷であり、サンバーンと呼ばれる。このサンバーンは、活性酸素及びプロスタグランジンＥ２によって引き起こされるとされている。そこで、表皮内の抗酸化物質の発現を増強するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による紫外線損傷の軽減効果を示すために、ＵＶＢ照射と細胞生存率との関係を確認する試験を行った。
（３－１）試験方法
正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料１０～１５、１６～１９、及び２０～２４をそれぞれ添加した同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。試料１０、１６、及び２０は、コントロール（無添加）である。試料１１～１５、１７～１９、及び２１～２４では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（質量％、溶媒はHBSS(－)）がそれぞれ異なる。
試料１０：コントロール（N.C.）
試料１１：ＧＤＳ１２（０．０３１２５％）
試料１２：ＧＤＳ１２（０．０６２５％）
試料１３：ＧＤＳ１２（０．１２５％）
試料１４：ＧＤＳ１２（０．２５％）
試料１５：ＧＤＳ１２（０．５％）
試料１６：コントロール（N.C.）
試料１７：ＧＤＭ１２（０．０１２５％）
試料１８：ＧＤＭ１２（０．０２５％）
試料１９：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料２０：コントロール（N.C.）
試料２１：ＧＤＳ２３（０．０３１２５％）
試料２２：ＧＤＳ２３（０．０６２５％）
試料２３：ＧＤＳ２３（０．１２５％）
試料２４：ＧＤＳ２３（０．２５％）
正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料１０～１５、１６～１９、及び２０～２４をそれぞれ添加した同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。試料１０、１６、及び２０は、コントロール（無添加）である。試料１１～１５、１７～１９、及び２１～２４では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（質量％、溶媒はHBSS(－)）がそれぞれ異なる。
試料１０：コントロール（N.C.）
試料１１：ＧＤＳ１２（０．０３１２５％）
試料１２：ＧＤＳ１２（０．０６２５％）
試料１３：ＧＤＳ１２（０．１２５％）
試料１４：ＧＤＳ１２（０．２５％）
試料１５：ＧＤＳ１２（０．５％）
試料１６：コントロール（N.C.）
試料１７：ＧＤＭ１２（０．０１２５％）
試料１８：ＧＤＭ１２（０．０２５％）
試料１９：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料２０：コントロール（N.C.）
試料２１：ＧＤＳ２３（０．０３１２５％）
試料２２：ＧＤＳ２３（０．０６２５％）
試料２３：ＧＤＳ２３（０．１２５％）
試料２４：ＧＤＳ２３（０．２５％）
培養後、培地をHBSS(-)（富士フィルム和光純薬（株）製）に交換し、各試料を、ＵＶＢ照射（ＵＶＢ（＋））と非照射（ＵＶＢ（－））に分けた。ＵＶＢ（＋）群については、ＵＶＢを５０mJ／cm２で照射した。ＵＶＢ（－）群は、培地交換のみを行なった。その後、培地をＫＢ２培地 （クラボウ製）に交換し、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、ニュートラルレッドアッセイによって、細胞生存率を測定した。コントロール（無添加）のＵＶＢ（－）の場合の細胞生存率を１００％として、各試料について細胞生存率をそれぞれ算出した。
（３－２）試験結果
図７は、試料１０～１５（ＧＤＳ１２）の結果を、図８は、試料１６～１９（ＧＤＭ１２）の結果を、図９は、試料２０～２４（ＧＤＳ２３）の結果をそれぞれ示すグラフである。
図７は、試料１０～１５（ＧＤＳ１２）の結果を、図８は、試料１６～１９（ＧＤＭ１２）の結果を、図９は、試料２０～２４（ＧＤＳ２３）の結果をそれぞれ示すグラフである。
試料１０、１６、及び２０のコントロールにおいて、ＵＶＢ照射（ＵＶＢ（＋））は、細胞損傷のためにＵＶＢ非照射（ＵＶＢ（－））に比べて細胞生存率が低下した。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む各試料においても、ＵＶＢ（＋）は、当該試料のＵＶＢ（－）に比べて細胞生存率が低下しているが、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む各試料のＵＶＢ（＋）は、コントロールのＵＶＢ（＋）と比べるといずれも細胞生存率が高い。
また、コントロールと、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む各試料のＵＶＢ（－）群を比較すると、各試料はいずれもコントロールよりも細胞生存率が高い。これは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む各試料では、ＵＶＢ照射前の２４時間の培養中にＵＶＢ以外の酸化ストレスによって、抗酸化物質が増加したためと考えられる。
この試験結果により、表皮に予めジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を適用し、表皮内の抗酸化物質を増強しておくことにより、その後にＵＶＢを照射したときの紫外線による細胞損傷を軽減できることが確認された。
（４）紫外線損傷の抑制効果試験－２
次に、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による紫外線損傷の軽減効果を示すために、紫外線損傷を引き起こす炎症性サイトカインであるプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率を確認する試験を行った。
次に、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による紫外線損傷の軽減効果を示すために、紫外線損傷を引き起こす炎症性サイトカインであるプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率を確認する試験を行った。
（４－１）試験方法
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を４．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて４８穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料２５～２９、３０～３４、及び３５～３９を添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を４．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて４８穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料２５～２９、３０～３４、及び３５～３９を添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
試料２５、３０、及び３５は、コントロール（無添加かつＵＶＢ（－））である。試料２６、３１、及び３６は、別のコントロール（無添加かつＵＶＢ（＋））である。試料２７～２９、３２～３４、及び３７～３９では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（質量％、溶媒はＫＢ２培地）がそれぞれ異なり、いずれもＵＶＢ照射された。
試料２５：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料２６：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料２７：ＧＤＭ１２（０．００５％）
試料２８：ＧＤＭ１２（０．０１％）
試料２９：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料３０：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料３１：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料３２：ＧＤＭ１２（０．０２５％）
試料３３：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料３４：ＧＤＭ１２（０．１％）
試料３５：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料３６：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料３７：ＧＤＳ２３（０．０１２５％）
試料３８：ＧＤＳ２３（０．０２５％）
試料３９：ＧＤＳ２３（０．０５％）
試料２５：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料２６：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料２７：ＧＤＭ１２（０．００５％）
試料２８：ＧＤＭ１２（０．０１％）
試料２９：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料３０：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料３１：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料３２：ＧＤＭ１２（０．０２５％）
試料３３：ＧＤＭ１２（０．０５％）
試料３４：ＧＤＭ１２（０．１％）
試料３５：コントロール（ＵＶＢ（－））
試料３６：コントロール（ＵＶＢ（＋））
試料３７：ＧＤＳ２３（０．０１２５％）
試料３８：ＧＤＳ２３（０．０２５％）
試料３９：ＧＤＳ２３（０．０５％）
培養後、培地をHBSS(-)（富士フィルム和光純薬（株）製）に交換し、ＵＶＢ（＋）群については、ＵＶＢを２０mJ／cm２で照射した。ＵＶＢ（－）群は、培地交換のみを行なった。その後、再び培地をＫＢ２培地 （クラボウ製）に交換し、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、アッセイキット（TaKaRa BCA Protein Assay Kit：タカラバイオ（株）製）を用いて、プロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生量を測定した。
コントロール（無添加かつＵＶＢ（－））の産生率を１００％として、各試料についてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びインターロイキン１－α（ＩＬ１－α）の各々の産生率を以下の式１、式２から算出した。
式１： ＰＧＥ２産生率（％） ＝ＵＶＢ（＋）／ＵＶＢ（－）×１００
式２： ＩＬ１－α産生率（％） ＝ＵＶＢ（＋）／ＵＶＢ（－）×１００
式１： ＰＧＥ２産生率（％） ＝ＵＶＢ（＋）／ＵＶＢ（－）×１００
式２： ＩＬ１－α産生率（％） ＝ＵＶＢ（＋）／ＵＶＢ（－）×１００
（４－２）試験結果
図１０及び図１１は、試料２５～３９についてのプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率をそれぞれ示すグラフである。
図１０及び図１１は、試料２５～３９についてのプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率をそれぞれ示すグラフである。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物無添加の試料２６、３１、３６は、ＵＶＢ照射により炎症性サイトカインの産生率が大きく増加している。それに比べて、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を添加した試料２７～２９、３２～３４、３７～３９では、ＵＶＢ照射による炎症性サイトカインの産生率の増加が抑制されている。
この試験結果により、表皮に予めジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を適用し、表皮内の抗酸化物質を増強しておくことにより、その後にＵＶＢを照射したときの炎症性サイトカインの産生を抑制できることが確認された。
図７～図１１に示した紫外線損傷の抑制効果試験１、２の結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする抗酸化物質の発現増強剤を用いた、紫外線による表皮損傷の抑制剤を提供できることを示している。同様に、これらの試験結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いる抗酸化物質の発現増強方法を適用した、紫外線による表皮の損傷の抑制方法を提供できることを示している。これらの剤又は方法は、化粧品又は医薬品の形態で提供可能である。
（５）大気汚染物質損傷の抑制効果試験－１
近年大気汚染物質であるＰＭ２．５による健康被害の懸念が報告されている。大気汚染物質の人体への悪影響は、活性酸素が発生して各細胞及び臓器に損傷を与えることである。この大気汚染物質損傷に対抗するために、本来ヒトが兼ね備えている体内の抗酸化機能を強化すれば、大気汚染物質への暴露による健康被害を軽減できると考えられる。そこで、表皮内の抗酸化物質の発現を増強するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による大気汚染物質損傷の軽減効果を示すために、大気汚染疑似物質であるＤＰＥ（Diesel Particle Extracts）への接触と、細胞のタンパク量との関係を確認する試験を行った。
近年大気汚染物質であるＰＭ２．５による健康被害の懸念が報告されている。大気汚染物質の人体への悪影響は、活性酸素が発生して各細胞及び臓器に損傷を与えることである。この大気汚染物質損傷に対抗するために、本来ヒトが兼ね備えている体内の抗酸化機能を強化すれば、大気汚染物質への暴露による健康被害を軽減できると考えられる。そこで、表皮内の抗酸化物質の発現を増強するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による大気汚染物質損傷の軽減効果を示すために、大気汚染疑似物質であるＤＰＥ（Diesel Particle Extracts）への接触と、細胞のタンパク量との関係を確認する試験を行った。
（５－１）試験方法
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料４０～４６をそれぞれ添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料４０～４６をそれぞれ添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
試料４０は、コントロール（無添加）である。試料４１～４６では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（質量％、溶媒はＫＢ２培地）がそれぞれ異なる。
試料４０：コントロール（N.C.）
試料４１：ＧＤＳ２３（０．０００５％）
試料４２：ＧＤＳ２３（０．００１％）
試料４３：ＧＤＳ２３（０．００２％）
試料４４：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料４５：ＧＤＭ１２（０．００２％）
試料４６：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料４０：コントロール（N.C.）
試料４１：ＧＤＳ２３（０．０００５％）
試料４２：ＧＤＳ２３（０．００１％）
試料４３：ＧＤＳ２３（０．００２％）
試料４４：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料４５：ＧＤＭ１２（０．００２％）
試料４６：ＧＤＭ１２（０．００４％）
培養後、各試料の培地を、ＤＰＥ無添加のＫＢ２培地と、５％ＤＰＥを含むＫＢ２培地の２つの培地に交換し、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間それぞれ培養した。その後、アッセイキット（TaKaRa BCA Protein Assay Kit：タカラバイオ（株）製）を用いて、細胞のタンパク量を測定した。
（５－２）試験結果
図１２は、試料４０～４６についてのタンパク量の測定結果を示すグラフである。ＤＰＥ無添加群では、試料４０のコントロールと、試料４１～４６のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物添加群との間に大きな差がない。すなわち、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の添加は、細胞のタンパク量に影響を与えていないこと、すなわちジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による細胞傷害性がないことを示している。
図１２は、試料４０～４６についてのタンパク量の測定結果を示すグラフである。ＤＰＥ無添加群では、試料４０のコントロールと、試料４１～４６のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物添加群との間に大きな差がない。すなわち、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の添加は、細胞のタンパク量に影響を与えていないこと、すなわちジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による細胞傷害性がないことを示している。
５％ＤＰＥ添加群では、試料４０のコントロールでは、細胞のタンパク量が大きく減少している（細胞が傷害を受けている）のに対し、試料４１～４６のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物添加群では、タンパク量の減少が抑制されている。したがって、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を予め添加して生体内の抗酸化物質を増強したことにより、その後にＤＰＥに接触した際のＤＰＥによる細胞傷害が緩和されたことが確認された。
（６）大気汚染物質損傷の抑制効果試験－２
次に、大気汚染疑似物質であるＤＰＥ（Diesel Particle Extracts）への接触と、細胞傷害を引き起こす炎症性サイトカインであるプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率を確認する試験を行った。
次に、大気汚染疑似物質であるＤＰＥ（Diesel Particle Extracts）への接触と、細胞傷害を引き起こす炎症性サイトカインであるプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生率を確認する試験を行った。
（６－１）試験方法
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料４７～５３をそれぞれ添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
正常ヒト表皮細胞（クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、ＫＧ２培地（クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料４７～５３をそれぞれ添加したＫＢ２培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。
試料４７は、コントロール（無添加）である。試料４８～５３では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（質量％、溶媒はＫＢ２培地）がそれぞれ異なる。
試料４７：コントロール（N.C.）
試料４８：ＧＤＳ２３（０．０００５％）
試料４９：ＧＤＳ２３（０．００１％）
試料５０：ＧＤＳ２３（０．００２％）
試料５１：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料５２：ＧＤＭ１２（０．００２％）
試料５３：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料４７：コントロール（N.C.）
試料４８：ＧＤＳ２３（０．０００５％）
試料４９：ＧＤＳ２３（０．００１％）
試料５０：ＧＤＳ２３（０．００２％）
試料５１：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料５２：ＧＤＭ１２（０．００２％）
試料５３：ＧＤＭ１２（０．００４％）
培養後、各試料の培地を、ＤＰＥ無添加のＫＢ２培地と、５％ＤＰＥを含むＫＢ２培地の２つの培地に交換し、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、アッセイキット（TaKaRa BCA Protein Assay Kit：タカラバイオ（株）製）を用いて、タンパク量を測定すると共に、ＥＬＩＳＡ法を用いてプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生量を測定した。プロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生量は、タンパク量当たりに換算した。
（６－２）試験結果
図１３及び図１４は、試料４７～５３についてのプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生量をそれぞれ示すグラフである。
図１３及び図１４は、試料４７～５３についてのプロスタグランジンＥ２及びインターロイキン１－αの産生量をそれぞれ示すグラフである。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物無添加の試料４７は、ＤＰＥにより炎症性サイトカインの産生量が大きく増加している。それに比べて、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を添加した試料４８～５３では、ＤＰＥによる炎症性サイトカインの産生量の増加が抑制されている。
この試験結果により、表皮に予めジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を適用し、表皮内の抗酸化物質を増強しておくことにより、その後にＤＰＥと接触したときの炎症性サイトカインの産生を抑制できることが確認された。
図１２～図１４に示した大気汚染物質損傷の抑制効果試験１、２の結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする抗酸化物質の発現増強剤を用いた、大気汚染物質による表皮損傷の抑制剤を提供できることを示している。同様に、これらの試験結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いる抗酸化物質の発現増強方法を適用した、大気汚染物質による表皮損傷の抑制方法を提供できることを示している。これらの剤又は方法は、化粧品又は医薬品の形態で提供可能である。
（７）ハイドロキノンの酸化抑制効果試験
ハイドロキノン（ＨＱ）は、世界中の美容医療機関で処方されるクリームや軟膏剤などの皮膚外用剤において一般的に用いられている物質である。ハイドロキノンによる皮膚の美白効果は１９５０年代から報告されているが、副作用の問題から日本では敬遠する医師が多い。日本では２００１年まで、医師の管理下でのみ処方が許されていたが、同年の規制緩和以降、化粧品へのハイドロキノンの配合が許されるようになった。しかし、未だハイドロキノンの美白に対する明確な作用機序及び安全性の情報は少なく、その副作用である皮膚の乾燥、紅斑、接触性皮膚炎などが課題である。副作用の要因となる細胞傷害性は、以下の化学反応式に示すように、ハイドロキノンが酸化されることで生じるベンゾキノン（ＢＱ）によってその傷害性及び毒性が強くなると考えられる。ハイドロキノンとベンゾキノンの酸化還元反応は、平衡反応である。
ハイドロキノン（ＨＱ）は、世界中の美容医療機関で処方されるクリームや軟膏剤などの皮膚外用剤において一般的に用いられている物質である。ハイドロキノンによる皮膚の美白効果は１９５０年代から報告されているが、副作用の問題から日本では敬遠する医師が多い。日本では２００１年まで、医師の管理下でのみ処方が許されていたが、同年の規制緩和以降、化粧品へのハイドロキノンの配合が許されるようになった。しかし、未だハイドロキノンの美白に対する明確な作用機序及び安全性の情報は少なく、その副作用である皮膚の乾燥、紅斑、接触性皮膚炎などが課題である。副作用の要因となる細胞傷害性は、以下の化学反応式に示すように、ハイドロキノンが酸化されることで生じるベンゾキノン（ＢＱ）によってその傷害性及び毒性が強くなると考えられる。ハイドロキノンとベンゾキノンの酸化還元反応は、平衡反応である。
そこで細胞自体の抗酸化力を高めることによってハイドロキノンの酸化が抑制されれば、細胞傷害性を軽減でき、副作用の抑制につながると考えられる。
（７－１）ハイドロキノンとベンゾキノンの細胞傷害性の確認試験
先ず、ハイドロキノンとベンゾキノンの細胞傷害性の違いを確認するための試験を行った。
＜試験方法＞
正常ヒト表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、ハイドロキノン（ＨＱ）又はベンゾキノン(ＢＱ)を所定の量（０μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ）で含む同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。培養後、ニュートラルレッドアッセイによって、細胞生存率を測定した。無添加のコントロール（N.C.）の細胞生存率を１００％として、ＨＱ又はＢＱを添加した各試料の細胞生存率を算出した。
先ず、ハイドロキノンとベンゾキノンの細胞傷害性の違いを確認するための試験を行った。
＜試験方法＞
正常ヒト表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、ハイドロキノン（ＨＱ）又はベンゾキノン(ＢＱ)を所定の量（０μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ）で含む同種の培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。培養後、ニュートラルレッドアッセイによって、細胞生存率を測定した。無添加のコントロール（N.C.）の細胞生存率を１００％として、ＨＱ又はＢＱを添加した各試料の細胞生存率を算出した。
＜試験結果＞
図１５は、ハイドロキノンとベンゾキノンの細胞傷害性に関する試験結果を示すグラフである。ハイドロキノンは２５０μＭでも細胞傷害性がないが、ベンゾキノンは２５０μＭで細胞傷害性（細胞毒性）を示すことが判明した。したがって、ベンゾキノンはハイドロキノンより毒性及び傷害性が大きいといえる。
図１５は、ハイドロキノンとベンゾキノンの細胞傷害性に関する試験結果を示すグラフである。ハイドロキノンは２５０μＭでも細胞傷害性がないが、ベンゾキノンは２５０μＭで細胞傷害性（細胞毒性）を示すことが判明した。したがって、ベンゾキノンはハイドロキノンより毒性及び傷害性が大きいといえる。
（７－２）ハイドロキノンの細胞傷害性の確認試験
次に、ハイドロキノンをベンゾキノンに酸化させずに維持した場合の細胞傷害性を確認するための試験を行った。
＜試験方法＞
ハイドロキノンとベンゾキノンの酸化還元反応は平衡反応であり、ハイドロキノンは容易にベンゾキノンへ酸化されやすい。そこで、以下の化学反応式で示すように、ピロ亜硫酸ナトリウム（食品等でも一般的に用いられる酸化防止剤）をハイドロキノンと併用して培地へ溶解させることでハイドロキノンの酸化を抑止し、前項と同様の試験方法で細胞傷害性の評価を行なった。コントロール（N.C.）は無添加試料であり、それ以外は、全てピロ亜硫酸ナトリウムを０．５μＭ含み、ハイドロキノンの量が異なる試料である。
次に、ハイドロキノンをベンゾキノンに酸化させずに維持した場合の細胞傷害性を確認するための試験を行った。
＜試験方法＞
ハイドロキノンとベンゾキノンの酸化還元反応は平衡反応であり、ハイドロキノンは容易にベンゾキノンへ酸化されやすい。そこで、以下の化学反応式で示すように、ピロ亜硫酸ナトリウム（食品等でも一般的に用いられる酸化防止剤）をハイドロキノンと併用して培地へ溶解させることでハイドロキノンの酸化を抑止し、前項と同様の試験方法で細胞傷害性の評価を行なった。コントロール（N.C.）は無添加試料であり、それ以外は、全てピロ亜硫酸ナトリウムを０．５μＭ含み、ハイドロキノンの量が異なる試料である。
＜試験結果＞
図１６は、ハイドロキノンの細胞傷害性に関する試験結果を示すグラフである。ピロ亜硫酸ナトリウムのみの試料は、コントロールと差はなかった。ピロ亜硫酸ナトリウムとハイドロキノンを含む試料では、ハイドロキノンが２０００μＭまで細胞傷害性を示さなかった。それに対し、上述した図１５では、ハイドロキノンが５００μＭで細胞傷害性を示しており、ハイドロキノンの酸化が起こっていたと考えられる。この結果から、細胞内でハイドロキノンを酸化させなければ、細胞傷害性を軽減でき、ベンゾキノンに起因する副作用も抑制できると考えられる。
図１６は、ハイドロキノンの細胞傷害性に関する試験結果を示すグラフである。ピロ亜硫酸ナトリウムのみの試料は、コントロールと差はなかった。ピロ亜硫酸ナトリウムとハイドロキノンを含む試料では、ハイドロキノンが２０００μＭまで細胞傷害性を示さなかった。それに対し、上述した図１５では、ハイドロキノンが５００μＭで細胞傷害性を示しており、ハイドロキノンの酸化が起こっていたと考えられる。この結果から、細胞内でハイドロキノンを酸化させなければ、細胞傷害性を軽減でき、ベンゾキノンに起因する副作用も抑制できると考えられる。
（８）ハイドロキノンの細胞傷害性抑制試験－１
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による表皮内の抗酸化物質の発現増強作用によって、ハイドロキノンの酸化抑制すなわち細胞傷害性抑制の効果が得られるかを確認するための試験を行った。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による表皮内の抗酸化物質の発現増強作用によって、ハイドロキノンの酸化抑制すなわち細胞傷害性抑制の効果が得られるかを確認するための試験を行った。
（８－１）試験方法
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料５４～５８を添加した培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で６時間培養した。
ヒト正常表皮メラノサイト（NHEM：クラボウ製）を２．０×１０４cells／wellの細胞密度にて、培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を用いて９６穴培養プレートに播種した。続いて、３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養した。その後、以下の試料５４～５８を添加した培地に交換した後、３７℃、５％二酸化炭素下で６時間培養した。
試料５４は、コントロール（ハイドロキノン及びＧＤＳ２３の両方無添加）である。試料５６は、別のコントロール（ハイドロキノン３００μＭのみ添加）である。試料５６、５７、５８は、３００μＭのハイドロキノンと、異なる量のＧＤＳ２３とを含む。
試料５４：コントロール（N.C.）
試料５５：コントロール（ＨＱのみ）
試料５６：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ）
試料５７：ＧＤＳ２３（１０００μＭ、ＨＱ）
試料５８：ＧＤＳ２３（２０００μＭ、ＨＱ）
試料５４：コントロール（N.C.）
試料５５：コントロール（ＨＱのみ）
試料５６：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ）
試料５７：ＧＤＳ２３（１０００μＭ、ＨＱ）
試料５８：ＧＤＳ２３（２０００μＭ、ＨＱ）
培養後、ニュートラルレッドアッセイによって、細胞生存率を測定した。無添加のコントロール（N.C.）の細胞生存率を１００％として、各試料の細胞生存率を算出した。
（８－２）試験結果
図１７は、試料５４～５８についての細胞生存率の測定結果を示すグラフである。ハイドロキノン３００μＭとジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む試料５６～５８は、試料５４のコントロールとほぼ同じ細胞生存率が得られた。したがって、試料５６～５８では、ハイドロキノンが酸化せずに維持されていると考えられる。
図１７は、試料５４～５８についての細胞生存率の測定結果を示すグラフである。ハイドロキノン３００μＭとジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を含む試料５６～５８は、試料５４のコントロールとほぼ同じ細胞生存率が得られた。したがって、試料５６～５８では、ハイドロキノンが酸化せずに維持されていると考えられる。
試験結果から、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、生体内で抗酸化物質を予め増強したことによって、ハイドロキノンの投与後に細胞内でのハイドロキノンの酸化を抑制でき、細胞傷害を起こさなかったことが確認された。
（９）ハイドロキノンの細胞傷害性抑制試験－２
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による表皮内でのハイドロキノンの酸化抑制効果を確認するために、上記（８）よりもハイドロキノンを増量した試験を行った。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物による表皮内でのハイドロキノンの酸化抑制効果を確認するために、上記（８）よりもハイドロキノンを増量した試験を行った。
（９－１）試験方法
上記（８－１）と同じ試験方法により、細胞生存率を測定した。ただし、培地に添加する試料として、以下の試料５９～６２を用いた。試料５９は、コントロール（ハイドロキノン及びＧＤＳ２３の両方無添加）である。試料６０は、別のコントロール（ハイドロキノン４００μＭのみ添加）である。試料６１は、４００μＭのハイドロキノン及び５００μＭのＧＤＳ２３を含む。試料６２は、４００μＭのハイドロキノン、５００μＭのＧＤＳ２３、スクワラン、及びコレステロールを含む。
試料５９：コントロール（N.C.）
試料６０：コントロール（ＨＱのみ）
試料６１：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ）
試料６２：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ、スクワラン、コレステロール）
上記（８－１）と同じ試験方法により、細胞生存率を測定した。ただし、培地に添加する試料として、以下の試料５９～６２を用いた。試料５９は、コントロール（ハイドロキノン及びＧＤＳ２３の両方無添加）である。試料６０は、別のコントロール（ハイドロキノン４００μＭのみ添加）である。試料６１は、４００μＭのハイドロキノン及び５００μＭのＧＤＳ２３を含む。試料６２は、４００μＭのハイドロキノン、５００μＭのＧＤＳ２３、スクワラン、及びコレステロールを含む。
試料５９：コントロール（N.C.）
試料６０：コントロール（ＨＱのみ）
試料６１：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ）
試料６２：ＧＤＳ２３（５００μＭ、ＨＱ、スクワラン、コレステロール）
試料６２は、微細化ベシクルの形態で培地に添加した。微細化ベシクルは、次のように調製した。１６３．８ｍｇのＧＤＳ２３、１２２．８５ｍｇのスクワラン、及び１６．３８ｍｇのコレステロールを８０℃で溶解した混合物に、１０ｍＬの培地（DermaLife（登録商標）M Comp kit培地：クラボウ製）を８０℃で添加し、混合撹拌した後、室温まで冷却し、所定の濃度に希釈した。この調製方法により得られるベシクルは、その９７．３％が２０～４０ｎｍの範囲内の直径を有していた。一般的には、例えば、ＧＤＭ１２の２％水溶液及びＧＤＳ２３の２％水溶液においてそれぞれ自己形成されるベシクルの平均直径は、いずれも約１４０ｎｍである。
（９－２）試験結果
図１８は、試料５９～６２についての細胞生存率の測定結果を示すグラフである。試料６１を、図１７の試料５６と比較すると、ハイドロキノンが増量されたために細胞生存率が低下している。しかしながら、試料６１も、ハイドロキノンのみを含む試料６０よりも高い細胞生存率を示している。
図１８は、試料５９～６２についての細胞生存率の測定結果を示すグラフである。試料６１を、図１７の試料５６と比較すると、ハイドロキノンが増量されたために細胞生存率が低下している。しかしながら、試料６１も、ハイドロキノンのみを含む試料６０よりも高い細胞生存率を示している。
特に、微細化ベシクルを含む試料６２では、試料５９のコントロールとほぼ同じ細胞生存率が得られた。したがって、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のみを用いるよりも、他の脂質と混合してジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を微細化ベシクルの形態とすることによって、細胞への取り込みがさらに向上すると考えられる。
図１７及び図１８に示したハイドロキノンの細胞傷害性抑制試験１、２の結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする抗酸化物質の発現増強剤を用いた、表皮内のハイドロキノンの酸化抑制剤を提供できることを示している。同様に、これらの試験結果は、本発明により、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いる抗酸化物質の発現増強方法を適用した、表皮内のハイドロキノンの酸化抑制方法を提供できることを示している。これらの剤又は方法は、化粧品又は医薬品の形態で提供可能である。
以上、実施例を参照して本発明を説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、これらから自明の変形例も本発明に含まれる。
Claims (12)
- ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される、請求項１に記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルが、２０～４０ｎｍの範囲内の直径を有する、請求項４に記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記抗酸化物質が酸化ストレス応答遺伝子であり、前記酸化ストレス応答遺伝子がＮｒｆ２である、請求項１～５のいずれかに記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記抗酸化物質が酸化ストレス応答遺伝子であり、前記酸化ストレス応答遺伝子がＰＰＡＲＧである、請求項１～５のいずれかに記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記抗酸化物質が抗酸化酵素であり、前記抗酸化酵素が、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈキノン還元酵素（ＮＱＯ－１）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、及びヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＭＯＸ１）からなる群のうち１つ又はそれ以上である、請求項１～５のいずれかに記載の表皮内の抗酸化物質の発現増強剤。
- 前記抗酸化物質が抗酸化タンパクであり、前記抗酸化タンパクがグルタチオンである、請求項１又は２に記載の抗酸化物質の発現増強剤。
- 請求項１～９のいずれかに記載の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、紫外線による表皮損傷の抑制剤。
- 請求項１～９のいずれかに記載の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、大気汚染物質による表皮損傷の抑制剤。
- 請求項１～９のいずれかに記載の抗酸化物質の発現増強剤を用いた、表皮内のハイドロキノンの酸化抑制剤。
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