CN114515256A - 表皮内的抗氧化物质的表达增强剂 - Google Patents

表皮内的抗氧化物质的表达增强剂 Download PDF

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Abstract

本发明通过利用二酸甘油酯PEG加成物来增强表皮内的抗氧化相关物质的表达。本发明涉及一种包含二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的表皮内抗氧化相关物质的表达增强剂。上述抗氧化相关物质为氧化应激应答基因，抗氧化酶和抗氧化蛋白。上述二酸甘油酯PEG加成物选自二肉豆蔻酸甘油酯PEG‑12(GDM12)、二硬脂酸甘油酯PEG‑12(GDS12)、二硬脂酸甘油酯PEG‑23(GDS23)、二棕榈酸甘油酯PEG‑23(GDP23)和二油酸甘油酯PEG‑12(GDO12)。

Description

表皮内的抗氧化物质的表达增强剂
技术领域
本发明涉及表皮内的抗氧化物质的表达增强剂。
背景技术
已知由磷脂和表面活性剂形成的封闭小泡(囊泡)，也称脂质体。专利文献1中提出了一种制备方法，使用以二酰基甘油聚乙二醇加成物(以下有时也称作“二酸甘油酯(diacylglycerol)PEG加成物”)作为主体的脂质代替磷脂来与水或表面活性剂进行混合，由此自发形成囊泡。这样的囊泡在其内部、表面封入或结合蛋白质、抗体等目标物质，被用于传递至生物体内的细胞的药物传递系统。
以二酸甘油酯PEG加成物作为脂质的囊泡在其表面具有被亲水性的PEG链覆盖的形态，向生物体内的渗透性和在血液中的稳定性良好。专利文献2中记载了通过在由二酸甘油酯PEG加成物形成的囊泡的表面结合带电要素使其带正电来提高向表皮角质层的渗透性和保留性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4497765号公报；
专利文献2：日本专利第6297737号公报；
专利文献3：美国专利第6998421号说明书；
专利文献4：美国专利第6495596号说明书。
发明内容
发明要解决的问题
药物传递系统中的囊泡仅被认为是目标物质的载体。虽然囊泡最终在生物体内分解成各个分子，但构成囊泡的分子本身在生物体内的作用却几乎不为人所知。专利文献3和专利文献4公开了二酸甘油酯PEG加成物在生物体内的数个作用。根据这些文献，二酸甘油酯PEG加成物在体内与磷脂酶A和环加氧酶-2结合而抑制这些酶，由此发挥抑制疼痛、发热和炎症的作用。然而，在炎症通路的抑制机构中，除了抑制磷脂酶A和环加氧酶-2来减轻炎症等以外，还存在多种抑制机构。关于这些其他的炎症抑制机构，二酸甘油酯PEG加成物在生物体内的作用迄今为止尚不明确。
本发明的目的在于利用二酸甘油酯PEG加成物的新发现的特性，特别是增强表皮内的抗氧化物质的表达。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供以下构成。
本发明的方式为一种表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其包含二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分，上述二酸甘油酯PEG加成物具有以下结构式，长链脂肪酸中的R的碳原子数在11～23的范围内，聚乙二醇链中的n在11～46的范围内。
本发明的另一方式为一种二酸甘油酯PEG加成物作为表皮内的抗氧化物质的表达增强剂的应用，其中，上述二酸甘油酯PEG加成物具有以下结构式，长链脂肪酸中的R的碳原子数在11～23的范围内，聚乙二醇链中的n在11～46的范围内。
[化学式1]
Figure BDA0003202932030000021
优选上述二酸甘油酯PEG加成物选自二肉豆蔻酸甘油酯PEG-12(GDM12)、二硬脂酸甘油酯PEG-12(GDS12)、二硬脂酸甘油酯PEG-23(GDS23)、二棕榈酸甘油酯PEG-23(GDP23)和二油酸甘油酯PEG-12(GDO12)。
优选上述二酸甘油酯PEG加成物以溶液状态渗透到表皮内。
优选上述二酸甘油酯PEG加成物以囊泡状态渗透到表皮内。
优选上述二酸甘油酯PEG加成物的囊泡具有20～40nm的范围内的直径。
优选上述抗氧化物质为氧化应激应答基因，上述氧化应激应答基因为Nrf2。
优选上述抗氧化物质为氧化应激应答基因，上述氧化应激应答基因为PPARG。
优选上述抗氧化物质为抗氧化酶，上述抗氧化酶为选自NAD(P)H醌还原酶(NQO-1)、过氧化氢酶(CAT)和血红素氧合酶-1(HMOX1)中的一种或多种。
优选上述抗氧化物质为抗氧化蛋白，上述抗氧化蛋白为谷胱甘肽。
本发明还提供一种抑制紫外线引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了上述的抗氧化物质的表达增强剂。
本发明还提供一种抑制大气污染物质引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了上述的抗氧化物质的表达增强剂。
本发明还提供一种表皮内的氢醌的氧化抑制剂，其使用了上述的抗氧化物质的表达增强剂。
本发明还提供一种化妆品，其包含上述的抗氧化物质的表达增强剂。
本发明提供一种药品，其包含上述的抗氧化物质的表达增强剂。
本发明还提供二酸甘油酯PEG加成物在制备增强人表皮内的抗氧化物质的表达的制剂中的应用，所述二酸甘油酯PEG加成物具有以下结构式，长链脂肪酸中的R的碳原子数在11～23的范围内，聚乙二醇链中的n在11～46的范围内，
Figure BDA0003202932030000031
发明效果
根据本发明，可以实现包含二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂。
附图说明
图1为示出试样1～4的Nrf-2的表达量的图。
图2为示出试样1～4的PPARG的表达量的图。
图3为示出试样1～4的NQO-1的表达量的图。
图4为示出试样1～4的CAT的表达量的图。
图5为示出试样1～4的HMOX1的表达量的图。
图6为示出试样5～9中的相对于蛋白质的总谷胱甘肽量的图。
图7为示出试样10～15(GDS12)的结果的图。
图8为示出试样16～19(GDM12)的结果的图。
图9为示出试样20～24(GDS23)的结果的图。
图10为示出试样25～39的前列腺素E2的产生率的图。
图11为示出试样25～39的白细胞介素1-α的产生率的图。
图12为示出试样40～46的蛋白量的测定结果的图。
图13为示出试样47～53的前列腺素E2的产生量的图。
图14为示出试样47～53的白细胞介素1-α的产生量的图。
图15为示出关于氢醌和苯醌的细胞杀伤性的试验结果的图。
图16为示出关于氢醌的细胞杀伤性的试验结果的图。
图17为示出试样54～58的细胞存活率的测定结果的图。
图18为示出试样59～62的细胞存活率的测定结果的图。
具体实施方式
以下，一边参照附图一边对本发明的实施方式进行说明。
本发明是利用在二酰基甘油聚乙二醇加成物(二酸甘油酯PEG加成物)中新发现的特性而创作的。在此，新发现的特性是增强人表皮内的抗氧化物质的表达的作用。
以下示意性地示出本发明的作为脂质分子的二酸甘油酯PEG加成物的结构式。
[化学式2]
Figure BDA0003202932030000051
二酸甘油酯PEG加成物由具有3个碳的甘油骨架部(CH2CHCH2)、键合在骨架部的3个碳中末端的1个碳的直链型聚乙二醇的PEG链以及分别键合在3个碳中其他两个碳的同种长链脂肪酸(COOR)构成。PEG链的部分为亲水性，长链脂肪酸的部分为疏水性。
以下说明中，在表示特定的二酸甘油酯PEG加成物时，根据长链脂肪酸的种类和PEG链的n的个数，称作“[二]+[长链脂肪酸名]+[甘油酯]+[PEG-n]”。例如，在长链脂肪酸为肉豆蔻酸、PEG链的n为12时，为“二肉豆蔻酸甘油酯PEG-12”。另外，有时也用简称表示特定的二酸甘油酯PEG加成物。
长链脂肪酸中的R的碳原子数能够在11～23的范围内。该范围所包含的长链脂肪酸为例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸等。PEG链的n的个数能够在11～46的范围内。作为与本发明相关的二酸甘油酯PEG加成物，能够示例以下物质。括号内表示熔点和简称。
·二肉豆蔻酸甘油酯PEG-12(25.0℃：GDM12)
·二硬脂酸甘油酯PEG-12(40.0℃：GDS12)
·二硬脂酸甘油酯PEG-23(39.8℃：GDS23)
·二棕榈酸甘油酯PEG-23(31.2℃：GDP23)
·二油酸甘油酯PEG-12(25.0℃：GDO12)
人体内的炎症通路与细胞内物质的氧化有关。近年大量报道由于紫外线、大气污染物质等引起的细胞的氧化应激而产生的皮肤问题。
在针对于生物体的氧化应激的防御机构中，已知作为氧化应激应答基因的Nrf-2起到重要的作用。作为转录激活因子的Nrf-2在非氧化应激的状态下与蛋白质的Keap-1结合而被失活。当生物体中产生氧化应激时，Keap-1受到抑制，由此Nrf-2活化。活化了的Nrf-2转移至细胞核，产生抗氧化酶。进而，作为蛋白质的PPARγ也是抗氧化物质，通过其与Nrf-2相互刺激来提高细胞的抗氧化活性。
发明人等发现，通过将二酸甘油酯PEG加成物应用于人的表皮，能够增强作为表皮内的抗氧化物质的Nrf-2和PPARγ的表达。进而还发现还能够增强由这些抗氧化物质产生的抗氧化酶和抗氧化蛋白。作为具体的抗氧化酶，确认到分别增强了NAD(P)H醌还原酶(NQO-1)、过氧化氢酶(CAT)和血红素氧合酶-1(HMOX1)的产生。此外，作为具体的抗氧化蛋白，确认到增强了谷胱甘肽的产生。增强表皮细胞内这些抗氧化物质的表达的作用是二酸甘油酯PEG加成物新发现的作用，可以说是二酸甘油酯PEG加成物的新特性。该二酸甘油酯PEG加成物的新作用不是表皮表面的单纯物理保护，而是在表皮细胞内发挥的作用。可以认为通过该新特性的表皮内的抗氧化效果，能够减轻来自外部的各种氧化应激引起的皮肤问题。
本发明利用该二酸甘油酯PEG加成物的新发现的特性，提供一种将二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的、人的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂。另外，本发明提供一种使用二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的、人的表皮内的抗氧化物质的表达增强方法。
在本发明中，在将二酸甘油酯PEG加成物应用于人的表皮时，可以仅单独使用一种，或者也可以组合使用多种。
根据本发明，与没有二酸甘油酯PEG加成物的情况相比，到达表皮内的二酸甘油酯PEG加成物使表皮内的抗氧化物质更多地表达，由此能够减轻或防止来自外部的氧化应激，例如减轻或防止紫外线、大气污染物质引起的表皮内的细胞损伤。该效果通过后述试验得到确认。
进而，与没有二酸甘油酯PEG加成物的情况相比，到达表皮内的二酸甘油酯PEG加成物使表皮内的抗氧化物质更多地表达，由此能够抑制化妆品中作为美白成分所包含的氢醌在表皮内的氧化。结果，能够防止因在表皮内的氢醌的氧化而生成的具有毒性的苯醌引起的细胞损伤。该效果也通过后述试验得到确认。
因此，根据本发明，能够提供以增强表皮内的抗氧化物质的表达为目的、以二酸甘油酯PEG加成物为有效成分的化妆品或药品。进而，根据本发明，能够提供以增强表皮内的抗氧化物质的表达为目的、将二酸甘油酯PEG加成物用作有效成分的减轻或防止表皮内的细胞损伤的方法。
在使二酸甘油酯PEG加成物到达人的表皮内的一个方法中，能够以将二酸甘油酯PEG加成物溶解于水或规定的溶剂中的溶液状态，使其到达表皮内。例如，制备以磷酸缓冲食盐水PBS(-)作为溶剂的规定浓度的二酸甘油酯PEG加成物溶液，通过在皮肤表面进行涂敷来使其渗透到表皮内。涂敷的溶液渗透到最上层的角质层内，进一步向角质层下的颗粒层渗透。然后，二酸甘油酯PEG加成物对已渗透的表皮内的各层中原本存在于该层的抗氧化物质的表达进行增强。
在优选的方法中，能够使二酸甘油酯PEG加成物以囊泡状态到达表皮内。这样的囊泡可以作为由二酸甘油酯PEG加成物的双层或多个双层重叠得到的多层形成的密闭球壳而形成，亲水性的PEG链配置在最外层的表面。能够通过制备二酸甘油酯PEG加成物的囊泡，将其涂敷在皮肤表面来使其渗透到表皮内。到达表皮内后，囊泡分解，分离成各个分子，由此可以发挥二酸甘油酯PEG加成物自身的作用。
在以往的药物传递系统中，作为囊泡材料的二酸甘油酯PEG加成物仅被认为是目标物质的载体，但本发明利用二酸甘油酯PEG加成物自身作为有效成分。因此，在本发明中，基本不需要在通常的药物传递系统中填入在囊泡中的目标物质。在本发明中，通过使仅由水与二酸甘油酯PEG加成物混合形成的囊泡渗透到表皮内，二酸甘油酯PEG加成物自身能够作为表皮内的抗氧化物质的表达增强剂来发挥功能。
数个二酸甘油酯PEG加成物通过在规定的温度与水混合，自发形成囊泡(参照专利文献1、2)。例如，通过在室温将2质量％的GDM12或GDO12在98质量％的去离子水中混合搅拌，得到GDM12或GDO12的囊泡的悬浮液。作为其他例子，使2质量％的GDS12或GDS23在45～55℃溶解，然后在45～55℃的98质量％的去离子水中进行混合并搅拌，由此得到GDS12或GDS23的囊泡的悬浮液。进而作为又一个例子，使2质量％的GDP23在37℃溶解，然后在37℃的98质量％的去离子水中进行混合并搅拌，由此得到GDP23的囊泡的悬浮液。即使将在高于室温的温度得到的悬浮液冷却至室温，囊泡也稳定。
作为其他例子，代替混合搅拌水与二酸甘油酯PEG加成物、而使用混合搅拌各物质的水溶液与二酸甘油酯PEG加成物所形成的囊泡的情况也包含在本发明的范围中，在此情况下，水溶液中包含的物质也能够具有其他功能。
由二酸甘油酯PEG加成物形成的通常的囊泡的大小例如直径约为100～300nm。通过后述试验证明，特别是具有20～40nm范围内的直径的微细囊泡显示良好的抗氧化作用。这可以认为是因为微细囊泡具有良好的渗透性。这样的微细囊泡能够通过例如将二酸甘油酯PEG加成物与其他作为脂质的角鲨烷和胆固醇进行混合来得到(详细内容如下所述)。
进而作为又一个例子，在用例如阳离子表面活性剂等带电要素修饰通过混合搅拌水或水溶液与二酸甘油酯PEG加成物而形成的囊泡的表面并使用的情况也包含在本发明的范围内。专利文献2中记载了带正电的囊泡向表皮的渗透性和保留性特别优异。
包含二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的化妆品、药品例如能够以水溶液、乳液、凝胶、乳霜等多种形态进行提供。
以下利用试验数据示出二酸甘油酯PEG加成物对表皮的应用与表皮内的抗氧化物质和氧化应激的关系。
(1)有关氧化应激应答基因和抗氧化酶的表达的试验
使用人正常表皮黑素细胞制作试样，然后提取RNA，利用实时PCR确定各目标物质(Nrf-2、PPARG、NQO-1、CAT、HMOX1)的基因的表达和扩增。PPARG是蛋白质PPARγ的基因编码，是氧化应激应答基因之一。
(1-1)试验方法
将人正常表皮黑素细胞(NHEM：KURABO INDUSTRIES LTD.制)以3.0×104cells/well的细胞密度，使用培养基(DermaLife(注册商标)M Comp kit培养基：KURABOINDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换为分别添加了以下试样1～4的培养基后，在37℃、5％二氧化碳下培养6小时。
试样1为对照(未添加GDS23)。在试样2～4中，GDS23的量各不相同。
试样1：对照(N.C.)
试样2：GDS23(500μM)
试样3：GDS23(1000μM)
试样4：GDS23(2000μM)
然后，对于各试样，分别从培养的细胞中提取RNA。将提取的RNA进行反转录制成cDNA，利用定量实时PCR表达分析对各目标物质的mRNA进行定量。使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内标。分析是将各目标物质的mRNA表达量用同一试样中作为内标的GAPDH的表达量的值分别进行校正后、分别算出将对照的校正值作为100％时的各试样的校正值。
(1-2)试验结果
图1、图2、图3、图4和图5分别为示出试样1～4的Nrf-2、PPARG、NQO-1、CAT和HMOX1的表达量的图。
图1和图2的结果显示，通过对表皮黑素细胞用GDS23进行处理，能够增强作为氧化应激应答基因的Nrf-2和PPARG的表达。当Nrf-2和PPARG的表达被增强时，可以认为由它们诱导的抗氧化酶的产生也得到增强。图3表示作为氧化还原酶的NQO-1的增强。图4表示作为将过氧化氢变为氧和水的反应的催化剂的酶CAT的增强。图5的HMOX1的增强表示保护血红素降解限速酶和细胞免受氧化应激损伤的细胞保护蛋白的增强。
(2)有关抗氧化蛋白的表达的试验
使用人正常表皮黑素细胞制作试样后，确认细胞内的作为抗氧化蛋白的谷胱甘肽的量。
(2-1)试验方法
将人正常表皮黑素细胞(NHEM：KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度，使用培养基(DermaLife(注册商标)M Comp kit培养基：KURABOINDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换为分别添加了以下试样5～9的同种培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。
试样5为对照(未添加GDS23)。在试样6～9中，GDS23的量各不相同。
试样5：对照(N.C.)
试样6：GDS23(500μM)
试样7：GDS23(1000μM)
试样8：GDS23(2000μM)
试样9：GDS23(4000μM)
然后，对各试样使用分析试剂盒(TaKaRa BCA Protein Assay Kit：Takara BioInc.制)利用谷胱甘肽还原酶循环法分别对表皮黑素细胞的蛋白量和总谷胱甘肽(GSH+GSSG)量进行定量。对于各试样，根据已定量的蛋白量和总谷胱甘肽量分别求出相对于蛋白量的总谷胱甘肽量，然后分别算出将对照的增加比作为100％时的各试样的增加比。
(2-2)试验结果
图6为示出试样5～9中的相对于蛋白质的总谷胱甘肽量的图。根据图6，确认了通过用GDS23对表皮黑素细胞进行处理，促进了作为具有高抗氧化力的蛋白的谷胱甘肽在细胞内的产生。谷胱甘肽由谷胱甘肽产生酶生成，并且谷胱甘肽生成酶由Nrf-2和/或PPARγ诱导。因此，确认了通过GDS23增强了Nrf-2和/或PPARγ表达，结果促进了谷胱甘肽的产生。
(3)紫外线损伤的抑制效果试验-1
紫外线引起的红斑反应是由短波长紫外线(UVB)(290～320nm)引起的紫外线损伤，称作晒斑。该晒斑是由活性氧和前列腺素E2引起的。因此，为了示出由增强表皮内的抗氧化物质的表达的二酸甘油酯PEG加成物所带来的紫外线损伤的减轻效果，进行了确认UVB照射和细胞存活率的关系的试验。
(3-1)试验方法
将正常人表皮角化细胞(NHEK：KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度、使用KG2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换为分别添加了以下试样10～15、16～19和20～24的同种培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。试样10、16和20为对照(无添加)。在试样11～15、17～19和21～24中，二酸甘油酯PEG加成物的种类和/或浓度(质量％、溶剂为HBSS(-))各不相同。
试样10：对照(N.C.)
试样11：GDS12(0.03125％)
试样12：GDS12(0.0625％)
试样13：GDS12(0.125％)
试样14：GDS12(0.25％)
试样15：GDS12(0.5％)
试样16：对照(N.C.)
试样17：GDM12(0.0125％)
试样18：GDM12(0.025％)
试样19：GDM12(0.05％)
试样20：对照(N.C.)
试样21：GDS23(0.03125％)
试样22：GDS23(0.0625％)
试样23：GDS23(0.125％)
试样24：GDS23(0.25％)
培养后，将培养基更换为HBSS(-)(富士胶片和光纯药株式会社制)，将各试样分为UVB照射(UVB(+))和非照射(UVB(-))。对于UVB(+)组，以50mJ/cm2照射UVB。UVB(-)组仅进行培养基更换。然后，将培养基更换为KB2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制)，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，通过中性红分析来测定细胞存活率。将对照(无添加)的UVB(-)的情况的细胞存活率作为100％，对各试样分别算出细胞存活率。
(3-2)试验结果
图7为示出试样10～15(GDS12)的结果的图，图8为示出试样16～19(GDM12)的结果的图，图9为示出试样20～24(GDS23)的结果的图。
在试样10、16和20的对照中，UVB照射(UVB(+))由于细胞损伤而比UVB非照射(UVB(-))的细胞存活率低。即使在包含二酸甘油酯PEG加成物的各试样中，UVB(+)也比该试样的UVB(-)的细胞存活率低，但包含二酸甘油酯PEG加成物的各试样的UVB(+)的细胞存活率均比对照的UVB(+)高。
此外，当将对照与包含二酸甘油酯PEG加成物的各试样的UVB(-)组相比较时，各试样的细胞存活率均比对照高。这可以认为是因为在包含二酸甘油酯PEG加成物的各试样中，UVB照射前的24小时的培养中由于UVB以外的氧化应激，抗氧化物质增加了。
根据该试验结果确认，通过预先对表皮应用二酸甘油酯PEG加成物、增强表皮内的抗氧化物质，能够减轻在之后照射UVB时的紫外线引起的细胞损伤。
(4)紫外线损伤的抑制效果试验-2
接着，为了示出由二酸甘油酯PEG加成物所带来的紫外线损伤的减轻效果，进行了确认作为引起紫外线损伤的炎性细胞因子的前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生率的试验。
(4-1)试验方法
将正常人表皮细胞(KURABO INDUSTRIES LTD.制)以4.0×104cells/well的细胞密度、使用KG2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制)接种到48孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换成添加了以下试样25～29、30～34和35～39的KB2培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。
试样25、30和35为对照(无添加且UVB(-))。试样26、31和36为另一对照(无添加且UVB(+))。在试样27～29、32～34和37～39中，二酸甘油酯PEG加成物的种类和/或浓度(质量％、溶剂为KB2培养基)各不相同，均进行了UVB照射。
试样25：对照(UVB(-))
试样26：对照(UVB(+))
试样27：GDM12(0.005％)
试样28：GDM12(0.01％)
试样29：GDM12(0.05％)
试样30：对照(UVB(-))
试样31：对照(UVB(+))
试样32：GDM12(0.025％)
试样33：GDM12(0.05％)
试样34：GDM12(0.1％)
试样35：对照(UVB(-))
试样36：对照(UVB(+))
试样37：GDS23(0.0125％)
试样38：GDS23(0.025％)
试样39：GDS23(0.05％)
培养后，将培养基更换为HBSS(-)(富士胶片和光纯药株式会社制)，对于UVB(+)组，以20mJ/cm2照射UVB。UVB(-)组仅进行培养基更换。然后，再次将培养基更换为KB2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制造)，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，使用分析试剂盒(TaKaRa BCA Protein Assay Kit：Takara Bio Inc.制)测定前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生量。
将对照(无添加且UVB(-))的产生率作为100％，对于各试样，根据以下的式1、式2算出前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素1-α(IL1-α)的各自的产生率。
式1：PGE2产生率(％)＝UVB(+)/UVB(-)×100
式2：IL1-α产生率(％)＝UVB(+)/UVB(-)×100
(4-2)试验结果
图10和图11是分别示出试样25～39的前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生率的图。
没有添加二酸甘油酯PEG加成物的试样26、31、36由于UVB照射，炎性细胞因子的产生率大幅增加。与之相比，在添加了二酸甘油酯PEG加成物的试样27～29、32～34、37～39中，抑制了UVB照射引起的炎性细胞因子的产生率的增加。
根据该试验结果确认，通过预先对表皮应用二酸甘油酯PEG加成物、增强表皮内的抗氧化物质，能够抑制之后照射UVB时的炎性细胞因子的产生。
图7～图11所示的紫外线损伤的抑制效果试验1、2的结果显示，根据本发明，能够提供一种抑制紫外线引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了以二酸甘油酯PEG加成物为有效成分的抗氧化物质的表达增强剂。同样，这些试验结果表示，根据本发明，能够提供一种抑制紫外线引起的表皮损伤的抑制方法，其应用了将二酸甘油酯PEG加成物用作有效成分的抗氧化物质的表达增强方法。这些试剂或方法能够以化妆品或药品的形式提供。
(5)大气污染物质损伤的抑制效果试验-1
近年来有报告关注作为大气污染物质的PM2.5所引起的健康危害。大气污染物质对人体的不良影响是活性氧产生而对各细胞和脏器产生损伤。为了对抗该大气污染物质损伤，认为如果增强原本人兼备的体内的抗氧化功能，则能够减轻暴露在大气污染物质中引起的健康危害。因此，为了示出由增强表皮内的抗氧化物质的表达的二酸甘油酯PEG加成物所带来的大气污染物质损伤的减轻效果，进行了确认作为大气污染疑似物质的DPE(DieselParticle Extracts)的接触与细胞的蛋白量的关系的试验。
(5-1)试验方法
将正常人表皮细胞(KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度、使用KG2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换成分别添加了以下试样40～46的KB2培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。
试样40为对照(无添加)。在试样41～46中，二酸甘油酯PEG加成物的种类和/或浓度(质量％、溶剂为KB2培养基)各不相同。
试样40：对照(N.C.)
试样41：GDS23(0.0005％)
试样42：GDS23(0.001％)
试样43：GDS23(0.002％)
试样44：GDM12(0.001％)
试样45：GDM12(0.002％)
试样46：GDM12(0.004％)
培养后，将各试样的培养基更换成没有添加DPE的KB2培养基和包含5％DPE的KB2培养基这两种培养基，在37℃、5％二氧化碳下分别培养24小时。然后，使用分析试剂盒(TaKaRa BCA Protein Assay Kit：Takara Bio Inc.制)测定细胞的蛋白量。
(5-2)试验结果
图12为示出试样40～46的蛋白量的测定结果的图。在没有添加DPE的组中，试样40的对照与试样41～46的添加二酸甘油酯PEG加成物的组之间没有大的差异。即，显示了二酸甘油酯PEG加成物的添加对细胞的蛋白量没有影响，也就是说二酸甘油酯PEG加成物没有细胞杀伤性。
在添加5％DPE的组中，相对于试样40的对照中细胞的蛋白量大幅减少(细胞受到损伤)，试样41～46的添加二酸甘油酯PEG加成物的组中蛋白量的减少得到抑制。因此确认，通过预先添加二酸甘油酯PEG加成物来增强生物体内的抗氧化物质，之后接触DPE时的DPE引起的细胞杀伤得到缓解。
(6)大气污染物质损伤的抑制效果试验-2
接着，进行了接触作为大气污染疑似物质的DPE(Diesel Particle Extracts)、与确认作为引起细胞杀伤的炎性细胞因子的前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生率的试验。
(6-1)试验方法
将正常人表皮细胞(KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度、使用KG2培养基(KURABO INDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换成分别添加了以下试样47～53的KB2培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。
试样47为对照(无添加)。在试样48～53中，二酸甘油酯PEG加成物的种类和/或浓度(质量％、溶剂为KB2培养基)各不相同。
试样47：对照(N.C.)
试样48：GDS23(0.0005％)
试样49：GDS23(0.001％)
试样50：GDS23(0.002％)
试样51：GDM12(0.001％)
试样52：GDM12(0.002％)
试样53：GDM12(0.004％)
培养后，将各试样的培养基更换成没有添加DPE的KB2培养基和包含5％DPE的KB2培养基这两种培养基，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，使用分析试剂盒(TaKaRaBCA Protein Assay Kit：Takara Bio Inc.制)，测定蛋白量并且使用ELISA法测定前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生量。将前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生量换算成相对于蛋白量的量。
(6-2)试验结果
图13和图14是分别示出试样47～53的前列腺素E2和白细胞介素1-α的产生量的图。
在没有添加二酸甘油酯PEG加成物的试样47中，由DPE引起的炎性细胞因子的产生量大幅增加。与之相比，在添加了二酸甘油酯PEG加成物的试样48～53中，DPE引起的炎性细胞因子的产生量的增加得到抑制。
根据该试验结果确认，通过预先对表皮应用二酸甘油酯PEG加成物、增强表皮内的抗氧化物质，能够抑制之后接触DPE时的炎性细胞因子的产生。
图12～图14所示的大气污染物质损伤的抑制效果试验1、2的结果显示，根据本发明，能够提供一种抑制大气污染物质引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了将二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分的抗氧化物质的表达增强剂。同样，这些试验结果表示，根据本发明，能够提供一种抑制大气污染物质引起的表皮损伤的抑制方法，其应用了将二酸甘油酯PEG加成物用作有效成分的抗氧化物质的表达增强方法。这些试剂或方法能够以化妆品或药品的形式提供。
(7)氢醌的氧化抑制效果试验
氢醌(HQ)是全世界美容医疗机构中开具处方的乳霜、软膏剂等皮肤外用剂中通常使用的物质。从1950年代开始报告有氢醌的皮肤美白效果，但由于副作用的问题，在日本很多医师对其敬而远之。在日本，直至2001年，仅仅在医师管理下允许开具处方，同年限制缓和以后，允许对化妆品配混氢醌。但是，对于氢醌的美白的明确的作用机理和安全性的信息尚少，作为其副作用存在皮肤的干燥、红斑、接触性皮炎等问题。成为副作用的重要原因的细胞杀伤性，如以下化学反应式所示，认为由于氢醌被氧化产生苯醌(BQ)导致其杀伤性和毒性变强。氢醌和苯醌的氧化还原反应是平衡反应。
[化学式3]
Figure BDA0003202932030000181
因此认为，如果通过提高细胞自身的抗氧化能力来抑制氢醌的氧化，则能够减轻细胞杀伤性，有利于抑制副作用。
(7-1)氢醌和苯醌的细胞杀伤性的确认试验
首先进行用于确认氢醌和苯醌的细胞杀伤性的差异的试验。
＜试验方法＞
将正常人表皮黑素细胞(NHEM：KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度，使用培养基(DermaLife(注册商标)M Comp kit培养基：KURABOINDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换成包含规定量(0μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM)的氢醌(HQ)或苯醌(BQ)的同种培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。培养后，通过中性红分析来测定细胞存活率。将没有添加的对照(N.C.)的细胞存活率作为100％，算出添加了HQ或BQ的各试样的细胞存活率。
＜试验结果＞
图15为示出关于氢醌和苯醌的细胞杀伤性的试验结果的图。证明氢醌即使在250μM也没有细胞杀伤性，但苯醌在250μM显示细胞杀伤性(细胞毒性)。因此，可以说苯醌比氢醌的毒性和杀伤性大。
(7-2)氢醌的细胞杀伤性的确认试验
接着，进行用于确认在维持氢醌不被氧化成苯醌的情况下的细胞杀伤性的试验。
＜试验方法＞
氢醌和苯醌的氧化还原反应是平衡反应，氢醌容易被氧化成苯醌。因此，如以下化学反应式所示，将焦亚硫酸钠(在食品等中也通常使用的抗氧化剂)与氢醌并用并溶解于培养基来抑制氢醌的氧化，用与前项相同的试验方法进行细胞杀伤性的评价。对照(N.C.)为没有添加试样，除此以外，均为包含0.5μM焦亚硫酸钠、氢醌量不同的试样。
[化学式4]
Figure BDA0003202932030000191
＜试验结果＞
图16为示出关于氢醌的细胞杀伤性的试验结果的图。仅有焦亚硫酸钠的试样与对照没有差异。在包含焦亚硫酸钠和氢醌的试样中，氢醌直至2000μM才显示出细胞杀伤性。与其相对，在上述图15中，在氢醌为500μM时显示出细胞杀伤性，认为是氢醌的氧化引起的。根据该结果可认为只要不使氢醌在细胞内氧化，则能够减轻细胞杀伤性，也可以抑制苯醌引起的副作用。
(8)氢醌的细胞杀伤性抑制试验-1
进行用于确认如下效果的试验：通过二酸甘油酯PEG加成物带来的表皮内的抗氧化物质的表达增强作用，能否得到抑制氢醌的氧化即细胞杀伤性抑制的效果。
(8-1)试验方法
将人正常表皮黑素细胞(NHEM：KURABO INDUSTRIES LTD.制)以2.0×104cells/well的细胞密度，使用培养基(DermaLife(注册商标)M Comp kit培养基：KURABOINDUSTRIES LTD.制)接种到96孔培养板中。接着，在37℃、5％二氧化碳下培养24小时。然后，更换成添加了以下试样54～58的培养基，然后在37℃、5％二氧化碳下培养6小时。
试样54为对照(氢醌和GDS23这两者都没有添加)。试样56为另一对照(仅添加氢醌300μM)。试样56、57、58包含300μM氢醌和不同量的GDS23。
试样54：对照(N.C.)
试样55：对照(仅HQ)
试样56：GDS23(500μM、HQ)
试样57：GDS23(1000μM、HQ)
试样58：GDS23(2000μM、HQ)
培养后，通过中性红分析来测定细胞存活率。以没有添加的对照(N.C.)的细胞存活率为100％，算出各试样的细胞存活率。
(8-2)试验结果
图17为示出试样54～58的细胞存活率的测定结果的图。包含氢醌300μM和二酸甘油酯PEG加成物的试样56～58得到了与试样54的对照几乎相同的细胞存活率。因此认为在试样56～58中维持氢醌未被氧化。
根据试验结果确认，通过二酸甘油酯PEG加成物预先在生物体内增强抗氧化物质，能够抑制在给予氢醌后细胞内的氢醌的氧化，不引起细胞杀伤。
(9)氢醌的细胞杀伤性抑制试验-2
为了确认二酸甘油酯PEG加成物带来的表皮内的氢醌的氧化抑制效果，进行了相比于上述(8)将氢醌增量的试验。
(9-1)试验方法
通过与上述(8-1)相同试验方法测定细胞存活率。其中，作为培养基中添加的试样，使用以下试样59～62。试样59为对照(氢醌和GDS23这两者都没有添加)。试样60为另一对照(仅添加氢醌400μM)。试样61包含400μM的氢醌和500μM的GDS23。试样62包含400μM的氢醌、500μM的GDS23、角鲨烷和胆固醇。
试样59：对照(N.C.)
试样60：对照(仅HQ)
试样61：GDS23(500μM、HQ)
试样62：GDS23(500μM、HQ、角鲨烷、胆固醇)
试样62以微细囊泡的形态添加到培养基中。微细囊泡如下制备。将163.8mg的GDS23、122.85mg的角鲨烷和16.38mg的胆固醇在80℃进行溶解得到混合物，在80℃向该混合物中添加10mL的培养基(DermaLife(注册商标)M Comp kit培养基：KURABO INDUSTRIESLTD.制)，混合搅拌，然后冷却至室温，稀释至规定浓度。通过该制备方法得到的囊泡的97.3％具有在20～40nm范围内的直径。通常，例如在GDM12的2％水溶液和GDS23的2％水溶液中分别自发形成的囊泡的平均直径均为约140nm。
(9-2)试验结果
图18为示出试样59～62的细胞存活率的测定结果的图。当将试样61与图17的试样56相比较时，由于氢醌增量而细胞存活率降低。然而，试样61也显示出比仅包含氢醌的试样60高的细胞存活率。
特别是在包含微细囊泡的试样62中，得到了与试样59的对照几乎相同的细胞存活率。因此认为，与仅使用二酸甘油酯PEG加成物相比，通过与其他脂质混合将二酸甘油酯PEG加成物制成微细囊泡的形态，能够进一步提高向细胞的摄入。
图17和图18所示的氢醌的细胞杀伤性抑制试验1、2的结果显示，根据本发明，能够提供一种表皮内的氢醌的氧化抑制剂，其使用了以二酸甘油酯PEG加成物为有效成分的抗氧化物质的表达增强剂。同样，这些试验结果表示，根据本发明，能够提供一种表皮内的氢醌的氧化抑制方法，其应用了将二酸甘油酯PEG加成物用作有效成分的抗氧化物质的表达增强方法。这些试剂或方法能够以化妆品或药品的形式提供。
以上，参照实施例对本发明进行了说明，但本发明不限定于这些实施例，从这些实施例显而易见的变形例也包含在本发明中。

Claims (15)

1.一种表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其包含二酸甘油酯PEG加成物作为有效成分，所述二酸甘油酯PEG加成物具有以下结构式，长链脂肪酸中的R的碳原子数在11～23的范围内，聚乙二醇链中的n在11～46的范围内，
Figure FDA0003202932020000011
2.根据权利要求1所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述二酸甘油酯PEG加成物选自二肉豆蔻酸甘油PEG-12(GDM12)、二硬脂酸甘油PEG-12(GDS12)、二硬脂酸甘油PEG-23(GDS23)、二棕榈酸甘油PEG-23(GDP23)和二油酸甘油PEG-12(GDO12)。
3.根据权利要求1或2所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述二酸甘油酯PEG加成物以溶液状态渗透到表皮内。
4.根据权利要求1或2所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述二酸甘油酯PEG加成物以囊泡状态渗透到表皮内。
5.根据权利要求4所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述二酸甘油酯PEG加成物的囊泡具有20～40nm的范围内的直径。
6.根据权利要求1或2所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述抗氧化物质为氧化应激应答基因，所述氧化应激应答基因为Nrf2。
7.根据权利要求1或2所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述抗氧化物质为氧化应激应答基因，所述氧化应激应答基因为PPARG。
8.根据权利要求1或2所述的表皮内的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述抗氧化物质为抗氧化酶，所述抗氧化酶为选自NAD(P)H醌还原酶(NQO-1)、过氧化氢酶(CAT)和血红素氧合酶-1(HMOX1)中的一种或多种。
9.根据权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂，其中，所述抗氧化物质为抗氧化蛋白，所述抗氧化蛋白为谷胱甘肽。
10.一种抑制紫外线引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂。
11.一种抑制大气污染物质引起的表皮损伤的抑制剂，其使用了权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂。
12.一种表皮内的氢醌的氧化抑制剂，其使用了权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂。
13.一种化妆品，其包含权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂。
14.一种药品，其包含权利要求1或2所述的抗氧化物质的表达增强剂。
15.二酸甘油酯PEG加成物在制备增强人表皮内的抗氧化物质的表达的制剂中的应用，所述二酸甘油酯PEG加成物具有以下结构式，长链脂肪酸中的R的碳原子数在11～23的范围内，聚乙二醇链中的n在11～46的范围内，
Figure FDA0003202932020000021
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