JP2022054972A - 培養装置及び培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】個別管理が必要な複数種類の細胞を平行して操作性よく簡便に培養することができる培養装置及びこの装置を用いた培養方法の提供。【解決手段】少なくとも培養器２４、培地収容器２６及び廃棄用培地収容器２８の容器群と、第一ポンプカートリッジ３４Ａを備える第一流路３０Ａ、及び、該培養器側の開口部に細胞巻き込み防止機構を備え、かつ流路上に第二ポンプカートリッジ３４Ｂを備える第二流路３０Ｂとを、それぞれ着脱可能に収容する筐体と、並びに、前記筐体に備えられた第一ポンプモータと、前記筐体に備えられた第二ポンプモータと、制御部と、を含み、培養器内の細胞懸濁液の容量に基づいて、前記培地収容器から前記培養器へ第一流路を介した培地の移送を制御し、及び、前記培養器から前記廃棄用培地収容器へ第二流路を介した廃棄用培地の移送を制御する、閉鎖系培養装置。【選択図】図２

Description

本開示は、培養装置及び培養方法に関する。

近年、再生医療、細胞治療の分野では大量の細胞が必要になることがあるため、細胞を連続的に効率よく増殖させるために、灌流培養が提案されている。例えば、特許文献１には、培養槽内に連続的に新鮮な培養液を供給しながら、細胞の代謝物が蓄積された培養液を培養槽外に移送して回収する培養装置が開示されている。
一方で、治療に用いられる細胞は、患者個人に対して使用するため、個別に管理する必要がある。例えば、特許文献２～４には、個々の細胞の培養を個別に管理しながら、培養槽内に連続的に新鮮な培養液を供給し、かつ使用済み培地を排出可能な装置が開示されている。

特開平６－２０９７６１号公報 米国特許出願公開第２０１９／０１６９５７２号明細書 米国特許出願公開第２０２０／００７１６７０号明細書 米国特許出願公開第２０２０／０２５５７９３号明細書

しかしながら、特許文献１の装置では、複数の細胞種類を同時に管理するには、同じ装置を複数用意した上で、それぞれを管理する必要があるため、操作性及び簡便性に欠ける。一方、特許文献２～４に記載の装置では、培地交換の際に使用済み培地と共に細胞が回収されないように、培養器内の液量及び細胞数を精密に管理する必要があるなど、操作性に劣ることが懸念される。
本開示は、個別管理が必要な複数種類の細胞を平行して操作性よく簡便に培養することができる培養装置及びこの装置を用いた培養方法を提供する。

本開示に係る実施形態は、以下のとおりである。
［１］ 少なくとも以下の容器群及び流路群を、それぞれ着脱可能に収容する筐体と、
細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養器としての容器、
培地を収容する培地収容器としての容器、
廃棄用培地を収容する廃棄用培地収容器としての容器、
前記培養器及び前記培地収容器に接続され、かつ流路上に第一ポンプカートリッジを備える第一流路、並びに、
前記培養器及び前記廃棄用培地収容器に接続され、該培養器側の開口部に細胞巻き込み防止機構を備え、かつ流路上に第二ポンプカートリッジを備える第二流路；
前記筐体に備えられ、前記第一ポンプカートリッジを連結する第一ポンプモータと、
前記筐体に備えられ、前記第二ポンプカートリッジを連結する第二ポンプモータと、
前記第一ポンプモータ及び前記第二ポンプモータの駆動を制御する制御部と、を含み、
前記制御部は、培養器内の細胞懸濁液の容量に基づいて、前記培地収容器から前記培養器へ第一流路を介した培地の移送を制御し、及び、前記培養器から前記廃棄用培地収容器へ第二流路を介した廃棄用培地の移送を制御する、培養装置を提供する、閉鎖系培養装置。
［２］ 前記筐体を複数備え、前記制御部は、複数の筐体内の培地の移送及び廃棄用培地の移送を、筐体毎に独立して制御する、［１］記載の閉鎖系培養装置。
［３］ 前記第一ポンプカートリッジと第一ポンプモータとが着脱自在であり、前記第二ポンプカートリッジと第二ポンプモータとが着脱自在である［１］又は［２］記載の閉鎖系培養装置。
［４］ 前記筐体に含まれる各容器内の液量を非接触で検知する複数の水位計を更に含む、［１］～［３］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［５］ 前記細胞巻き込み防止機構は、フィルタを含む、［１］～［４］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［６］ 前記フィルタは、前記培養器底面に対して平行に配置されている［５］記載の閉鎖系培養装置
［７］ 前記培養器及び前記培地収容器と第一流路との間に無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタからなる群から選択される少なくとも一方を備える［１］～［６］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［８］ 前記培養器及び前記廃棄用培地収容器と第二流路との間に、無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタからなる群から選択される少なくとも一方を備える、［１］～［７］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［９］ 前記筐体が、追加用容器を収容するための少なくともひとつの追加収容領域を更に含み、前記少なくともひとつの追加収容領域のための少なくともひとつの流路を更に含む、［１］～［８］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［１０］ 前記培養器と流路との間、並びに、前記追加用容器と流路との間のそれぞれに、無菌的接続コネクタまたは無菌的脱離コネクタのどちらか一方、または両方を備える、［９］記載の閉鎖系培養装置。
［１１］ 前記培養器内を観察するための観察装置を更に含む、［１］～［１０］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［１２］ 前記観察装置が、前記培養器の下部に配置されている［１１］記載の閉鎖系培養装置。
［１３］ 前記培養器に接続される追加流路を更に含み、前記制御部は、前記培養器から追加流路を介して、培養器の内部から外部へ細胞の移送を制御する、［１］～［１２］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［１４］ 前記培養器が、前記廃棄用培地収容器及び前記培地収容器よりも下に配置される［１］～［１３］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［１５］ 前記筐体内の複数の容器への気体を供給する気体供給部を更に備え、該気体供給部と前記筐体内の複数の容器との間にフィルタを更に有する［１］～［１４］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置。
［１６］ ［１］～［１５］のいずれか１に記載の閉鎖系培養装置を用いて細胞を培養する培養方法。

本開示によれば、個別管理が必要な複数種類の細胞を平行して操作性よく簡便に培養することができる培養装置及び培養方法が提供される。

一実施形態に係る培養装置の全体像を説明する概念図である。 一実施形態に係る培養装置の培養部におけるユニットを模式的に示す概略図である。 一実施形態に係る培養装置の培養部における筐体を模式的に示す概略図である。 一実施形態に係る培養装置の機能を示す概略ブロック図である。 一実施形態に係る培養装置の使用態様の全体を説明する概念図である。 一実施形態に係る培養装置の他の培養器を模式的に示す概略図である。 一実施形態に係る培養装置の他の培養器の使用態様を模式的に説明する概念図である。 一実施形態に係る培養装置の使用態様を模式的に説明する概念図である。 一実施形態に係る培養装置の使用態様を模式的に説明する概念図である。

本開示の種々の実施形態を、図面を参照して説明する。なお、図面において共通した構成要件には同一の参照番号を付して、説明を省略することがある。また、ある図面に表現された構成要素が、説明の便宜上、別の図面においては省略されていることがある点に留意されたい。更にまた、添付した図面が必ずしも正確な縮尺で記載されている訳ではない。

図１には、一実施形態に係る閉鎖系の培養装置１０が示されている。本明細書において「閉鎖系」とは、外部の微生物の侵入が阻止されていることを意味する。培養装置１０は、培養部１２と、操作部４８と、ガス供給部５６とから構成されている。培養装置１０には、図示しない温度調整機構及び湿度調整機構が備えられており、温度と湿度が一定に維持されている。培養部１２には、複数の筐体１４が着脱自在に配置されている。筐体１４は、キャビネット１６内に収容されていてもよい。キャビネット１６には、図示しない温度調整機構及び湿度調整機構が備えられ、例えば３７℃及び相対湿度約９９％に維持されている。なお、培養部１２又は筐体１４に温度調整機構及び湿度調整機能が備えられている場合には、培養部１２は、キャビネット１６を有していなくてもよい。その場合には、培養部１２に筐体１４を直接収容することができる。

筐体１４には、後述するように、水位計４０、観察装置４４、容積式ポンプ３２等の部材が取り付けられている。これらの部材は、各種配線で筐体１４に接続されており、補修等の際には、個別に容易に取り外しすることができる。筐体１４の前面には、ドア１２が取り付けられ、開閉可能となっている。

筐体１４内の下部には、観察部４２が設けられており、観察部４２の上方となる筐体１４の内部は、細胞を培養するためのユニット１８の載置領域となっている。なお、観察部４２は、筐体１４内に収容されていてもよく、筐体１４の外に配置されていてもよい。筐体１４とユニット１８とは着脱自在となっている。これにより、ユニット１８は、他のユニット１８と交換可能となっている。以下、ユニット１８の詳細について、図２及び図３を参照して、説明する。

ユニット１８には、本体の下から上に向かって順に配置部２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄが設けられている。配置部２２Ａには、細胞を含む細胞懸濁液を収容するための培養器２４が配置され、配置部２２Ｂには、新鮮な培地を収容するための培地収容器２６が配置される。一番上の配置部２２Ｄには、廃棄用培地を収容するための廃棄用培地収容器２８が配置される。配置部２２Ｃは、追加領域として使用することができる。培養器２４は本体の最下段の配置部２２Ａに配置されるため、観察部４２との距離が近く、観察しやすい。配置部２２Ａ及び配置部２２Ｂにそれぞれ、内部の液量が多くなる培養器２４及び培地収容器２６を配置することによってユニット１８における重心安定性が良好となるが、配置部２２Ｂ、配置部２２Ｃ及び配置部２２Ｄに収容する容器については、特に制限はない。

培養器２４内には、細胞を含む細胞懸濁液が収容され、細胞の培養が行われる。ここで培養される細胞としては、浮遊性細胞が挙げられるが、接着性細胞であってもよい。培地収容器２６に収容される培地は、培養器２４内で培養される細胞の種類に応じて、適宜選択される。

培養器２４と培地収容器２６とは、培地収容器２６から培養器２４へ新鮮な培地を移送するためのチューブ３０Ａで接続されている。チューブ３０Ａの両側の端部には、培養器２４及び培地収容器２６との間を接続するための図示しない無菌コネクタを備えている。無菌コネクタは、無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタの少なくとも一方であればよく、例えば、無菌的分離コネクタであり、これにより、培養器２４は無菌的コネクタとの接続を解除することによって、簡便に、培地収容器２６から無菌的に分離することができる。

チューブ３０Ａには、ポンプカートリッジ３４Ａが取り付けられており、ポンプカートリッジ３４Ａは、筐体１４側に取り付けられ、モータを内蔵する容積式ポンプ３２Ａに連結されている。ポンプカートリッジ３４Ａには、容積式ポンプ３２Ａの駆動をポンプカートリッジ３４Ａに伝達するための図示しない連結部が備えられている。

容積式ポンプ３２Ａの駆動機構については特に制限はない。例えば、ポンプカートリッジ３４Ａには、凹部が設けられ、容積式ポンプ３２Ａには凸部が設けられている。ポンプ３２Ａ内のモータの軸が回転する際、容積式ポンプ３２にＡ設けられた凸部も回転する。ポンプカートリッジ３４Ａの凹部と容積式ポンプ３２Ａの凸部とは連結可能であり、ポンプカートリッジ３４Ａの凹部の回転により、チューブ３０Ａが圧縮と開放が繰り返され、容積式ポンプカートリッジ３４Ａが機能する。これにより、チューブ３０Ａを介して、培地収容器２６から培養器２４に、容積式ポンプ３２Ａの駆動量に応じた所定量の新鮮な培地が移送される。ポンプカートリッジ３４と容積式ポンプ３２とは着脱自在となっており、必要に応じて、容積式ポンプ３２から、ポンプカートリッジ３４を切り離すことができる。後述するポンプカートリッジ３４Ｂ及び容積式ポンプ３２Ｂと、ポンプカートリッジ３４Ｃ及び容積式ポンプ３２Ｂも同様である。

培養器２４と廃棄用培地収容器２８とは、培養器２４から廃棄用培地収容器２８へ使用済み培地を移送するためのチューブ３０Ｂで接続されている。チューブ３０Ｂの両側の端部には、培養器２４と廃棄用培地収容器２８との間を接続するための図示しない無菌コネクタを備えている。無菌コネクタは、無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタの少なくとも一方であればよく、例えば、無菌的分離コネクタであり、これにより、培養器２４は廃棄用培地収容器から無菌的に分離することができる。

チューブ３０Ｂは、筐体１４側に取り付けられた容積式ポンプ３２Ｂに連結されている。ポンプカートリッジ３４Ｂには、容積式ポンプ３２Ｂの駆動をポンプカートリッジ３４Ｂに伝達するための図示しない連結部が備えられている。容積式ポンプ３２Ｂの駆動機構は、容積式ポンプ３２Ａと同様であり、容積式ポンプ３２Ｂの駆動によって、駆動量の応じた所定量の使用済み培地が培養器２４から廃棄用培地収容器２８へ移送される。

チューブ３０Ｂの培養器２４側の端部には、培養器２４内の細胞が使用済み培地の吸い込みに巻き込まれて侵入することを阻止するためのフィルタ３６（図６参照）が取り付けられている。フィルタ３６は、細胞の通過を阻止可能であれば特に制限はなく、メッシュでも多孔質でもよい。メッシュの場合、メッシュ孔径は縦横０．１μｍ～１０μmが望ましい。多孔質の場合、孔径０．１μｍ～１０μｍが望ましい。フィルタ３６の材質は疎水性が望ましい。

図６には、フィルタ３６（濾過面）を含むフィルタ部３６Ａの一例が示されている。フィルタ３６は、培養器の底面に対して並行となるように設けられている。これにより、使用済み培地を移送する際には、均一に培地の吸い上げが可能になっている。フィルタ３６の内径又は面積は、チューブ３０Ｃの内径又は断面積と同等か、それよりも大きい。これにより、チューブ３０Ｃ内に比べて、断面積当たりの送液速度を下げることができ、この結果、細胞の巻き込みを阻止することができる。またフィルタ３６と培養器２４内部とは、フィルタ部３６Ａの開口部３６Ｂを通じて接続している。これにより、培養器２４の培地は、開口部３６Ｂを通じてフィルタ部３６内部へ移動し、フィルタ３６を通過する。開口部３６Ｂはフィルタ部３６Ａの培養器２４側端よりも上に設けられており、これにより、培養器２４底面上に延びる壁面３６Ｃが形成されている。壁面３６Ｃは、細胞又は細胞塊が培地と共にフィルタ部３６Ａへ移動しても障壁として作用し、開口部３６Ｂへの細胞の侵入が抑制される。壁面３６Ｃの高さは、細胞径と同等程度か、それ以上が望ましく、例えば、０．１μｍ～１００μｍとすることができ、又は、細胞塊と同程度か、それ以上が望ましく、例えば、１００～１０００μｍとすることができる。

図２に示されるように、ユニット１８の配置部２２Ｃには、追加の容器を配置される。追加の容器としては、例えば、新鮮な培地を収容する第二の培地収容器、所定の処理のための処理液用容器、細胞回収時に洗浄するための緩衝液を収容する緩衝液用容器、細胞回収用の容器などが挙げられる。配置部２２Ｃには、無菌コネクタ３８を備えたチューブ３０Ｃが接続されている。無菌コネクタ３８は、追加の容器側に設けられた対応する無菌コネクタとの間で、接続又は接続解除を無菌的に行うことができる。無菌コネクタ３８は無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタの少なくとも一方であればよく、例えば無菌的接続コネクタの場合には、追加の容器は、配置部２２Ｃに備えられた無菌的接続コネクタを使用することで、追加の容器を無菌的に接続可能である。無菌コネクタ３８が例えば、無菌的分離コネクタの場合には、培養器２４側には無菌的コネクタが使用され、これにより、追加の容器から培養器２４を無菌的に分離できる。無菌的接続コネクタと無菌的分離コネクタ両方を用いてもかまわない。この場合、追加の容器は無菌的に接続可能であり、使用後に、無菌的に分離も可能である。

チューブ３０Ｃは、筐体１４側に取り付けられた容積式ポンプ３２Ｂに連結されている。ポンプカートリッジ３４Ｃには、容積式ポンプ３２Ｃの駆動をポンプカートリッジ３４Ｃに伝達するための図示しない連結部が備えられている。容積式ポンプ３２Ｃの駆動機構は、容積式ポンプ３２Ａと同様であり、容積式ポンプ３２Ｃの駆動によって、追加の容器内に収容された液体を、駆動量の応じた所定量で、培養器２４に移送することができる。

それぞれの容器は、無菌的接続コネクタポートを備えていてもよい。例えば、培地に添加剤を加えたい場合、別の容器から無菌的接続コネクタポートを介して培地収容器へ添加剤の添加が後から可能である。またシリンジ等を用いて無菌的接続コネクタポートを介して培養器から細胞培地のサンプリングが可能である。またシリンジ等を用いて無菌的接続コネクタポートを介して廃棄用培地収容器から廃棄用培地のサンプリングが可能である。

筐体１４には、ユニット１８を筐体１４内に挿入したときに（図２における矢印３Ａ）、ユニット１８の配置部２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄに対応する位置に、それぞれの領域に容器（例えば、培養器２４）が配置されたときに各容器の上部、中部、下部における液体量を非接触で検知可能な水位計４０が備えられている。なお、ユニット１８の各配置部２２には、３つの水位計４０（上位水位計４０Ａ、中位水位計４０Ｂ、下位水位計４０Ｃ）が備えられているが、これに限定されず、少なくともひとつ設けられていればよく、又は筐体１４には、水位計４０がひとつも備えられていない配置部２２が存在していてもよい。

配置部２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｄにそれぞれ３つの水位計４０が備えられている場合は、例えば、各容器内の液体量の上限値と最適量と下限値を計測することができる。これらの計測結果は、配置部２２Ｂに配置された培地収容器２６における初期値の適切な培地量の管理、培地使用完了の管理等、配置部２２Ａに配置された培養器２４における適切な培地供給量の管理、過剰培地供給の管理、培地除去の管理等、配置部２２Ｄに配置された廃棄用培地収容器２８における培地廃棄開始の管理、培地廃棄完了の管理等に用いることができる。

筐体１４の奥側には、容積式ポンプ３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃが備えられている。各容積式ポンプ３２は、対応する各ポンプカートリッジ３４と着脱自在に連結されている。これにより、無菌状態を維持しつつポンプカートリッジ３４と容積式ポンプ３２との連結を解除することができる。

観察部４２には、ユニット１８の最下段の配置部２２Ａを観察するための観察装置４４と、観察装置４４の位置を移動するための移動装置４６が備えられている。これにより、観察装置４４は、ユニット１８の手前及び奥側方向（矢印３Ｂ）及びこれ直交する方向（矢印３Ｃ）に移動することができる。なお、観察装置４４の移動方向はこれに限定されない。観察装置４４としては、細胞の状態を観察可能な装置であれば、特に制限されず、カメラ等の撮像装置であってもよく、電気計測部であってもよく、これらの双方であってもよく、その他の装置であってもよい。なお、観察部４２の培養器２４配置側は、光透過性観察装置４４による観察が可能になっていればよく、例えば、観察装置４４による観察を遮らない材料で構成されていてもよく、観察のための開口部等が設けられていてもよい。
電気計測部は、例えば、培養器２４に設けられた２つ以上の導電部と接続可能であり、２つ以上の電極間で、直流又は交流電流を印可し、電気容量又は導電率を、電圧、電流、周波数等を変えることで、培養器内部の観察が可能にするものが挙げられる。

操作部４８には、各種動作を指示する信号を入力可能な入力パネル等の入力部５０と、各種情報を出力可能なモニター等の出力部５２とが接続されている。入力部５０からは、培養対象の細胞に関する細胞情報、処理情報、培養条件情報等が入力可能となっている。

また、培養装置１０には、制御部５４が設けられている。制御部５４には、培養部１２の各容積式ポンプ３２及び水位計４０と、観察部４２の観察装置４４及び移動装置４６と、操作部４８の入力部５０及び出力部５２が接続されている。制御部５４には、各水位計４０からの信号に基づいて各容器内の液量情報が入力される。また制御部５４からは、容積式ポンプ３２へ駆動指示が出力される。

制御部５４には、培養装置１０において細胞を培養するためのプログラムが格納されており、各要素からの情報が入力されると、プログラムに従って各要素へ所定の指示が出力される。例えば、制御部５４は、各水位計４０からの情報に基づいて容積式ポンプ３２の駆動を制御し、新鮮な培地の培養器２４への供給と、使用済み培地の培養器２４から廃棄用培地収容器２８への排出を行う。
培養装置１０には、ガス供給部５６が接続されている。ガス供給部５６と、各容器とは、外気と内規が交換可能であるフィルタ（図示せず）を介して接続されている。ガス供給部５６を備えることにより、筐体１４内の雰囲気が一定の条件、例えば、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２環境下に維持されている。

培養装置１０の各筐体１４における操作の一例について説明する。
筐体１４内のユニット１８の各配置部２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｄに、培養器２４、培地収容器２６と廃棄用培地収容器２８が配置される。このとき、各容器は、チューブ３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｄにそれぞれ接続される。これにより、培養器２４、培地収容器２６、及び廃棄用培地収容器２８の間で、容積式ポンプ３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃの駆動による液体の移送が可能となる。培養器２４から使用済み培地が移送する際には、チューブ３０Ａに取り付けられたフィルタ３６と壁面３６Ｂに遮られて、細胞がチューブ３０Ａ内に巻き込まれることが阻止される。

制御部５４では、操作部４８からの指示に従って、種々の培養モード、例えば、灌流培養及びフェドバッチ培養を実施するための各種指示を各部材に指示する。
灌流培養 操作部４８からの指示にしたがって培養を開始し、所定時間が経過すると、制御部５４からの信号にしたがって容積式ポンプ３２Ａが駆動して、培地収容器２６から新鮮な培地が培養器２４へ供給されると共に、容積式ポンプ３２Ｃが駆動して、培養器２４内の使用済み培地が廃棄用培地収容器２８へ排出される。水位計４０からの情報に従ってほぼ一定となるように容積式ポンプ３２Ａ、３２Ｃの駆動が制御されることによって、各容器内の液量が調整される。

フェドバッチ培養 観察部４２の観察装置４４による細胞増加の経時観察の結果に基づいて、容積式ポンプ３２Ａ、３２Ｃの駆動状態を変更することができる。例えば、培地の供給と排出が一定量による培地交換の場合（灌流培養）、細胞から排出される細胞培養の安定化を促す分泌物の低下が生じたときには、容積式ポンプ３２Ａの駆動を停止して容積式ポンプ３２Ｃのみを駆動させて、培地を排出するモードと、容積式ポンプ３２Ｃの駆動を停止して容積式ポンプ３２Ａのみを駆動させて、培地を供給するモードを交互に行うことができる（フェドバッチ培養）。このように、培地の連続的な交換から培地の逐次の交換へ変更することで、分泌物の低下を抑制し、培養を安定化することができる。

操作者は、必要に応じて、ユニット１８の追加的な配置部２２Ｃに、例えば処理液を収容する追加容器を載置する場合には、追加容器を、配置部２２Ｃの無菌コネクタ３８を追加容器に接続する。操作部４８から容積式ポンプ３２Ｃを駆動させて、処理液を培養器２４へ供給し、処理液による処理を行うことができる。

処理液としては、特に制限されない。例えば、遺伝子導入用試薬を挙げることができる。遺伝子導入用試薬としては、例えば、低伝導率緩衝液を挙げることができ、この低伝導率緩衝液の導電率は、１μＳ／ｃｍ～１０ｍＳ／ｃｍとすることができる。処理液として低伝導率緩衝液を収容した追加容器を用いることにより、各細胞の培養を管理しながら、遺伝子導入処理を行うことできる。

操作者は、必要に応じて、培地収容器２６の無菌コネクタ（図示せず）を介して各種添加剤を予め培地に添加することができる。特に、事前に培地へ加えることが困難な、温度不安定性又は光不安定性の添加剤の場合、冷凍庫や遮光庫から、必要に応じて取り出し、任意に培養途中から培地収容器２６内の新鮮な培地に加えることが可能である。

図１に示されるように、培養装置１０には、上述した筐体１４が複数備えられており、それぞれ同様の操作が可能である。これにより操作者は、筐体１４毎に同一又は異なる操作を平行して実施することができる。
例えば、図５に示されるように、複数の患者に由来する細胞等を原料として得た後、培養装置１０において個別に培養及び処理することができる。培養装置１０にて実施可能な処理としては、培養器２４内の細胞を回収するための回収処理、細胞に対して指定された反応を実施するための反応処理等が挙げられる。処理後の細胞は、最終生成物として、個別に回収可能である。

このように培養装置１０を用いることによって、個別管理が必要な複数種類の細胞を、平行して操作性よく簡便に培養することができる。ポンプカートリッジ３４と容積式ポンプ３２とは着脱自在となっているため、ポンプカートリッジ３４を容積式ポンプ３２から取り外すことによって、ポンプカートリッジ３４に接続する培養器２４、培地収容器２６、廃棄用培地収容器２８は、簡便に交換可能となる。培養装置１０を用いることによって、個別管理が必要な複数種類の細胞を、灌流培養又はフェドバッチ培養しながら、平行して操作性よく簡便に培養することができる。培養装置１０には、フィルタ部３６Ａが設けられているので、培養期間中で使用済み培地を排出しても培養器２４内の細胞が巻き込まれることがなく、閉鎖系での培養を連続的に効率よく行うことができる。このため、培養装置１０の操作性は、従来の培養装置と比較して格段に向上する。

筐体１４に適用可能な培養器は、他の形状、形態のものであってもよい。
図６には、本開示の他の実施形態に係る培養器６０が示されている。培養器６０には、チューブ３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃが、培養器６０の紙面上面側に接続され、それぞれ他の容器との間で液体の移送が可能になっている。培養器６０の側面に、無菌コネクタ３８を介して、細胞回収用チューブ６４が内部奥深くまで挿入されている。培養器６０の無菌コネクタ３８配置側とは反対側の端部（紙面左側）はテーパ部６２となっている。培養器６０には、チューブ３０Ｂを介して、例えば、細胞の洗浄又は回収用の緩衝液が供給される。細胞回収用チューブ６４は、無菌コネクタ３８を介して、チューブ３０Ｄに連結され、容積式ポンプ３２Ｄが連結されたポンプカートリッジ３２Ｄに接続されている（図７参照）。

培養器６０を用いた培養装置１０の操作を、図８を参照して、細胞の回収を行う細胞回収処理を例に説明する。
細胞回収又は洗浄用の緩衝液を収容した追加容器を、配置部２２Ｃに配置し、チューブ３０Ｃに接続する。処理の開始と共に、容積式ポンプ３２Ｂが駆動して、追加容器内の緩衝液が、チューブ３０Ｃを介して、培養器６０へ供給される（図８（１）参照）。なお、処理の開始前に、必要に応じて容積式ポンプ３２Ｃを駆動させて、培養器６０内の培地を予め容器外へ排出する。排出の完了は、配置部２２Ａに対応する水位計４０（図３参照）で管理可能である。

緩衝液を培養器６０へ供給後、すぐに又は所定時間経過後に、容積式ポンプ３２Ｃを駆動して、培養器６０内の緩衝液を培養器６０の外部へ排出する。緩衝液の培養器６０への供給及び排出は数回繰り返してもよい。洗浄処理後に操作者は、チューブ３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃの一部を無菌コネクタ３８で分離又は無菌的に封止して切断し（図８（２）参照）、筐体１４から培養器６０を取り出す。取り出された培養器６０の向きを、テーバ部６２が下となるように変更することで、培養器６０内の細胞をテーバ部６２へ集めることもできる（図８（３）参照）。このとき、培養器６０本体を、遠心分離器を用いて軽く遠心することで、より確実にテーパ部６２に細胞を集めることもできる（図８（４）参照）。テーパ部６２に細胞を集めた後は、無菌コネクタ３８を介して、容積式ポンプ３２Ｄに連結されたチューブ３０Ｄと、細胞回収用チューブ６４とが接続される。テーパ部６２に集められた細胞は、容積式ポンプ３２Ｄ（図７参照）を駆動させることによって細胞回収用チューブ６４を介して培養器６０の外部へ移送される。移送された細胞は、図７に示されるように、細胞回収用チューブ６４及びチューブ３０Ｄを介して、細胞バック等の他の容器又は他の処理装置に移送される。

培養器６０には、図９に示されるように、三方弁６６を用いて二方向に振り分けしてもよい。例えば、細胞回収チューブ６４及びチューブ３０Ｄ内で選択的に特定の細胞を回収したい場合、チューブ内へ、特定の細胞の抗原と反応する抗体を備えた磁気ビーズを導入する。制御可能な磁気体７０を、三方弁６６と細胞回収用チューブ６４の外側に配置し、磁気ビーズと細胞の反応後、細胞を細胞回収チューブから三方弁側へ移動させる。事前に磁気を励起させることで、磁気ビーズと反応した細胞は、磁気体によってチューブ内で捕捉され、磁気ビーズと反応しない細胞は、磁気体中を通過し、三方弁の一方のバッグへ回収される。続いて、磁気の励起を終了させることで、磁気ビーズと反応した細胞は、捕捉状態から解消され、チューブ内を移動可能になり、三方弁のもう一方からバックへ移動可能になる。これにより、細胞種に依存して二方向への振り分けが可能になる。

このように培養器６０を用いることによって、特定の処理を閉鎖系環境下で簡便に行うことができ、また、処理後の細胞を閉鎖系環境下で効率よく回収することができる。

本開示は、更に、以下の実施形態も含む。
＜実施形態Ａ＞
第一の容器と、
前記第一の容器へ接続した第一の気体交換部と、
前記第一の容器へ接続した細胞導入口と、
前記細胞導入口へ接続した第一の無菌接続部と、
前記第一の容器と接続する第一の配管と、
前記第一の配管が、前記第一の容器の内部へ挿入され、配管の内径より大きい筒と、
前記筒が支える多孔質のフィルタと
前記筒は前記第一の容器の底面と、壁を成し、前記壁の上部に設けられた開口部と、
前記第一の容器の内部は、前記開口部を介して前記多孔質のフィルタと接触可能であり、
前記第一の配管と接続する第一の容積の可変部と、
前記第一の配管と接続する第二の容器と、
前記第二の容器と接続した第二の気体交換部と、
前記第一の容器と接続する第二の配管と、
前記第二の配管と接続する第二の容積の可変部と、
前記第二の配管と接続する第三の容器部と、
前記第二の容器と接続した第三の気体交換部と、
前記第一の気体交換部と、第二の気体交換部と、第三の気体交換部と、が外気と内気が交換可能である多孔質のフィルタと
前記第一の容積の可変部と、前記第二の容積の可変部を固定し、
前記第一の配管と、前記第二の配管と、前記細胞培養部と、前記新鮮培地部と、前記溶液廃棄部と、第一の無菌接続部が
収納可能な第一の筐体と、
で構成される外部の微生物から閉ざされた閉鎖系細胞培養システム。
実施形態Ａによれば、個別管理が必要な複数種類の細胞を、平行して操作性よく簡便に閉鎖系環境下で培養することができる。

＜実施形態Ｂ＞
実施形態Ａにおいて、
前記第一の容器は、水平方向にテーパを有し、
前記第一の筐体と脱着可能で、
前記配管から細胞を除去し、
前記配管から低伝導率緩衝液を導入し、
前記配管と無菌的に切離し、
前記第一の容器を水平方向から垂直方向へ変え、
前記第一の容器を遠心し、
前記テーパ底部から細胞回収配管を通じて細胞を回収する方法を含む、
閉鎖系細胞培養システム。
上記に加えて、実施形態Ｂによれば、遺伝子導入処理を行うことと処理後の細胞の回収とを閉鎖系環境下で操作性よく行うことができる。

＜実施形態Ｃ＞
実施形態Ａにおいて、
前記細胞培養部と前記新鮮培地保存部と前記溶液廃棄部を観察可能な非接触水位計と
前記非接触水位計が前記細胞培養部と前記新鮮培地保存部と前記溶液廃棄部の水位の上限と下限と、最適値の水位にそれぞれ設けられた第一の水位計と、第二の水位計と、第三の水位計と、第四の水位計と、第五の水位計と、第六の水位計と、第七の水位計と、第八の水位計と、第九の水位計と、
前記細胞培養部底面の細胞観察部と、
前記細胞培養部底面の細胞数を計測する細胞数計測部と、
前記第一の容積の可変部と、前記第二の容積の可変部と、接続可能な第一のモータと第二のモータと、
前記水位計と前記モータを固定可能であり、
前記細胞観察部と接続可能であり、
前記第一の筐体を収納可能な
第二の筐体と、
で構成される
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｃによれば、複数の細胞の管理をより詳細に精度よく行うことができる。

＜実施形態Ｄ＞
実施形態Ｃにおいて、
前記細胞観察部と
前記第一の容器と
前記第二の容器と
前記第三の容器と、の順で、下から上へ縦に位置し、
前記水位計が、前記第一の容器と、前記第二の容器と、前記第三の容器と、の側面に位置し、
第一の水位計(第一の容器の下限)と、
第二の水位計(第一の容器の最適値)と、
第三の水位計(第一の容器の上限)と、
第四の水位計(第二の容器の下限)と、
第五の水位計(第二の容器の中間値)と、
第六の水位計(第二の容器の上限)と、
第七の水位計(第三の容器の下限)と、
第八の水位計(第三の容器の中間値)と、
第九の水位計(第三の容器の上限)と、
の順で、下から上へ縦に位置し、
前記細胞観察部が、第一の容器の下に位置し、
前記第二の筐体を収納可能な
恒温機と、
ガス供給部
で構成される閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｄによれば、複数の細胞の管理をより詳細に精度よく行うことができる。

＜実施形態Ｅ＞
実施形態Ａにおいて、
前記第一の容器は細胞を収め、
前記第二の容器は細胞培地を収め、
前記第三の容器は使用された細胞培地を収め、
前記第一の容器にｐＨと溶存酸素に依存して変化する指標体を設ける、
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｄによれば、ｐＨ及び溶存酸素を指標として、複数の細胞の管理をより詳細に精度よく行うことができる。

＜実施形態Ｆ＞
実施形態Ａにおいて、
前記第一のモータと、
前記第二のモータと、
第一の水位計(第一の容器の下限)と、
第二の水位計(第一の容器の最適値)と、
第三の水位計(第一の容器の上限)と、
第四の水位計(第二の容器の下限)と、
第五の水位計(第二の容器の中間値)と、
第六の水位計(第二の容器の上限)と、
第七の水位計(第三の容器の下限)と、
第八の水位計(第三の容器の中間値)と、
第九の水位計(第三の容器の上限)と、
前記細胞観察部と、
前記恒温機と、
前記ガス供給部に設けられたガス供給量計測部と、を
信号を介して接続する制御部と、
前記制御部と信号を介して接続する入力部と出力部で構成され、
前記第一のモータを駆動して、前記第二の容器から前記第一の容器へ培地を供給し、
前記第六の水位計の変化と、前記第一の水位計の変化で、正常な供給を判定し、
前記第二の水位計の変化で、前記第一の容器の適切な培地供給量を判定し、前記第一のモータの駆動を停止し、
経過時間を計測し、
経過時間の閾値を超えた後、
前記第二のモータを駆動して、前記第一の容器から前記第三の容器へ培地を移動し、
前記第七の水位計の変化で、正常な移動を判定し、
前記第一の水位計の変化で、前記第二のモータの駆動を停止し、
再び、前記第一のモータを駆動して、前記第二の容器から前記第一の容器へ培地を供給し、前記第一の水位計の変化で、正常な供給を判定し、
前記第二の水位計の変化で、前記第一の容器の適切な培地供給量を判定し、
前記第一のモータの駆動を停止し、
経過時間を計測し、
経過時間の閾値を超えた後、
前記第二のモータを駆動して、前記第一の容器から前記第三の容器へ培地を移動し、
前記第一の水位計の変化で、前記第二のモータの駆動を停止し、
再び、前記第一のモータを駆動して、第四の水位計が変化した時、
モータの駆動を停止し、
経過時間を計測し、
経過時間の閾値を超えた後、
前記第二のモータを駆動して、前記第一の容器から前記第三の容器へ培地を移動し、
前記第一の水位計の変化で、前記第二のモータの駆動を停止し、
培地交換を終了する
順次培地交換手順を実施する閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｆによれば、逐次的な培地交換（フェドバッチ培養）を閉鎖系で簡便に行うことができる。

＜実施形態Ｇ＞
実施形態Ａにおいて、
更に前記第一の容器は
前記第一の容器と接続する第二の無菌接続部と、
前記第二の無菌接続部と接続可能な第三の配管と、
前記第三の配管と接続する第三の容積の可変部と、
前記第三の配管と接続する第四の容器部と、
前記第四の容器と接続した第四の気体交換部と、
を設け、
前記第四の容器を更に格納可能な前記第一の筐体を設け、
で構成される
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｇによれば、前記第一の容器を取り外すことなく前記第四の容器へ細胞を回収でき、複数の細胞の管理をより詳細に精度よく行うことができる。

＜実施形態Ｈ＞
実施形態Ｇにおいて、
更に前記第四の容器は低伝導率緩衝液を収める
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｈによれば、遺伝子導入処理を閉鎖系で簡便に行うことができる。

＜実施形態Ｉ＞
実施形態Ｃにおいて、
前記第四の容器は、
更に前記第一の容器より上の任意の位置の第一の筐体に格納され、
更に
第十の水位計と、
第十一の水位計と、
第十二の水位計と、の順で、下から上へ縦に位置し
が設けられ、
前記水位計が、前記第四の容器の側面に位置し、
更に第三のモータが設けられ、
更に前記水位計と前記第三のモータは前記第二の筐体に固定される、
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｈによれば、前記第一の容器を取り外すことなく前記第四の容器へ細胞を回収でき、回収した細胞量を管理できるため、複数の細胞の管理をより詳細に精度よく行うことができる。

＜実施形態Ｊ＞
実施形態Ｅにおいて、
前記培地交換終了後、
前記第三のモータを駆動し、前記第四の容器から前記第一の容器へ、前記低伝導率緩衝液を移動させる
培地交換方法を実施可能な閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｊによれば、複数の細胞の管理に加えて、遺伝子導入処理を行うことができる。

＜実施形態Ｋ＞
実施形態Ｇにおいて、
前記低伝導率緩衝液の伝導率は、１μＳ／ｃｍ～１０ｍＳ／ｃｍとする
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｋによれば、複数の細胞の管理に加えて、遺伝子導入処理をより効率よく行うことができる。

＜実施形態Ｌ＞
実施形態Ｊにおいて、
前記培地交換終了後、
前記第三のモータを駆動し、前記第四の容器から前記第一の容器へ、前記低伝導率緩衝液を移動させ、
前記第一の容器内の、細胞を含む低伝導率緩衝液の伝導率は、１μＳ／ｃｍ～１０ｍＳ／ｃｍとする
培地交換方法を実施可能な閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｌによれば、複数の細胞の管理に加えて、遺伝子導入処理をより効率よく行うことができる。

＜実施形態Ｍ＞
実施形態Ｌにおいて、
前記第一の容器内の、
前記細胞を含む低伝導率緩衝液を、
前記第一の無菌接続部を介して、
第四の配管と接続する
第五の容器へ
前記第四の配管と接続する第四の容積の変化部を用いて移動させ、
前記第五の容器から、電気的に細胞へ外来物質を導入する
培地交換方法を実施可能な閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｍによれば、複数の細胞の管理に加えて、遺伝子導入処理をより効率よく行うことができる。

＜実施形態Ｎ＞
前掲の実施形態において、
入力部と出力部とが培養装置の動作全体を制御する、
閉鎖系細胞培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｎによれば、複数の細胞の管理を更に操作性よく行うことができる。

＜実施形態Ｏ＞
前掲の実施形態において、
細胞巻き込み防止機構を備え、かつ流路上に第二ポンプカートリッジを備える第二流路；
前記第一ポンプカートリッジを連結する第一ポンプモータと、
前記第二ポンプカートリッジを連結する第二ポンプモータと、
前記第一ポンプモータ及び前記第二ポンプモータの駆動を制御する制御部と、を含み、
前記制御部は、培養器内の細胞懸濁液の容量に基づいて、前記培地収容器から前記培養器へ第一流路を介した培地の移送を制御し、及び、前記培養器から前記廃棄用培地収容器へ第二流路を介した廃棄用培地の移送を制御する、閉鎖系培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｏによれば、培養器内の細胞懸濁液の廃棄時に、細胞を廃棄することなく培地を廃棄できるため、複数の細胞の管理を更に操作性よく行うことができる。

＜実施形態Ｐ＞
前掲の実施形態において、
少なくとも以下の容器群及び流路群を、それぞれ着脱可能に収容する容器ユニットと、
細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養器としての容器、
培地を収容する培地収容器としての容器、
廃棄用培地を収容する廃棄用培地収容器としての容器、
前記培養器及び前記培地収容器に接続され、かつ流路上に第一ポンプカートリッジを備える第一流路、並びに、
前記培養器及び前記廃棄用培地収容器に接続され、該培養器側の開口部に細胞巻き込み機構を備え、かつ流路上に第二ポンプカートリッジを備える第二流路；
前記第一ポンプカートリッジを連結する第一ポンプモータと、
前記第二ポンプカートリッジを連結する第二ポンプモータと、
前記第一ポンプモータ及び前記第二ポンプモータの駆動を制御する制御部と、を含み、
前記制御部は、培養器内の細胞懸濁液の容量に基づいて、前記培地収容器から前記培養器へ第一流路を介した培地の移送を制御し、及び、前記培養器から前記廃棄用培地収容器へ第二流路を介した廃棄用培地の移送を制御する、培養装置。
上記に加えて、実施形態Ｐによれば、容器ユニットへポンプカートリッジが設けられているため、チューブをポンプモータへ締め付けや取り出し調整が不要なため、複数の細胞の管理を更に操作性よく行うことができる。

本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。

以上、前述の通り、様々な実施形態を例示したが、上記実施形態はあくまで一例であって、発明の範囲を限定することは意図していない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。また、各構成や、形状、大きさ、長さ、幅、厚さ、高さ、数等は適宜変更して実施することができる。

１０ 培養装置
１２ 培養部
１４ 筐体
１８ ユニット
２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ 配置部
２４ 培養器
２６ 培地収容器
２８ 廃棄用培地収容器
３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ チューブ
３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ 容積式ポンプ
３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ ポンプカートリッジ
３６ フィルタ
３８ 無菌コネクタ
４０ 水位計
４２ 観察部
４４ 観察装置
４８ 操作部
５４ 制御部
６０ 培養器
６２ テーパ部
６４ 細胞回収用チューブ

Claims (16)

1. 少なくとも以下の容器群及び流路群を、それぞれ着脱可能に収容する筐体と、
   細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養器としての容器、
   培地を収容する培地収容器としての容器、
   廃棄用培地を収容する廃棄用培地収容器としての容器、
   前記培養器及び前記培地収容器に接続され、かつ流路上に第一ポンプカートリッジを備える第一流路、並びに、
   前記培養器及び前記廃棄用培地収容器に接続され、該培養器側の開口部に細胞巻き込み防止機構を備え、かつ流路上に第二ポンプカートリッジを備える第二流路；
   前記筐体に備えられ、前記第一ポンプカートリッジを連結する第一ポンプモータと、
   前記筐体に備えられ、前記第二ポンプカートリッジを連結する第二ポンプモータと、
   前記第一ポンプモータ及び前記第二ポンプモータの駆動を制御する制御部と、を含み、
   前記制御部は、培養器内の細胞懸濁液の容量に基づいて、前記培地収容器から前記培養器へ第一流路を介した培地の移送を制御し、及び、前記培養器から前記廃棄用培地収容器へ第二流路を介した廃棄用培地の移送を制御する、閉鎖系培養装置。
2. 前記筐体を複数備え、前記制御部は、複数の筐体内の培地の移送及び廃棄用培地の移送を、筐体毎に独立して制御する、請求項１記載の閉鎖系培養装置。
3. 前記第一ポンプカートリッジと第一ポンプモータとが着脱自在であり、前記第二ポンプカートリッジと第二ポンプモータとが着脱自在である請求項１又は２記載の閉鎖系培養装置。
4. 前記筐体に含まれる各容器内の液量を非接触で検知する複数の水位計を更に含む、請求項１～請求項３のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
5. 前記細胞巻き込み防止機構は、フィルタを含む、請求項１～請求項４のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
6. 前記フィルタは、前記培養器底面に対して平行に配置されている請求項５記載の閉鎖系培養装置。
7. 前記培養器及び前記培地収容器と第一流路との間に無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタからなる群から選択される少なくとも一方を備える、請求項１～請求項６のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
8. 前記培養器及び前記廃棄用培地収容器と第二流路との間に、無菌的接続コネクタ及び無菌的脱離コネクタからなる群から選択される少なくとも一方を備える、請求項１～請求項７のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
9. 前記筐体が、追加用容器を収容するための少なくともひとつの追加収容領域を更に含み、前記少なくともひとつの追加収容領域のための少なくともひとつの流路を更に含む、請求項１～請求項８のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
10. 前記培養器と流路との間、並びに、前記追加用容器と流路との間のそれぞれに、無菌的接続コネクタまたは無菌的脱離コネクタのどちらか一方、または両方を備える、請求項９記載の閉鎖系培養装置。
11. 前記培養器内を観察するための観察装置を更に含む、請求項１～請求項１０いずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
12. 前記観察装置が、前記培養器の下部に配置されている請求項１１記載の閉鎖系培養装置。
13. 前記培養器に接続される追加流路を更に含み、前記制御部は、前記培養器から追加流路を介して、培養器の内部から外部へ細胞の移送を制御する、請求項１～請求項１２のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
14. 前記培養器が、前記廃棄用培地収容器及び前記培地収容器よりも下に配置される請求項１～請求項１３のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
15. 前記筐体内の複数の容器への気体を供給する気体供給部を更に備え、該気体供給部と前記筐体内の複数の容器との間にフィルタを更に有する請求項１～請求項１４のいずれか１項記載の閉鎖系培養装置。
16. 請求項１～請求項１５いずれか１項記載の閉鎖系培養装置を用いて細胞を培養する培養方法。

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