JP2022038847A - 光学測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】従来技術では生体組織下の細胞や血管を観察する際には例えば生体内部からの摘出が必要とる場合が多く、時間がかかっていた。また摘出を必要としない場合でも蛍光プローブなどで標識付けが必要となり、共焦点顕微鏡や二光子顕微鏡のような計測装置では装置が大型化になると同時に計測時間が長く、扱いが難しい等の課題があった。【解決手段】本発明では、光導波路を用いたデジタルホログラフィック顕微鏡と結像光学系を利用することで複雑な光学系が簡略化されると同時に装置の小型化が可能である。さらに、生体組織表面上に形成された干渉縞を結像光学系によって記録することで生体組織下の細胞や血管に標識付けを必要とせずに生体の特徴を簡易的に計測できる。【選択図】 図１

Description

本発明は、光導波路を使った光学測定装置に係り、特に生体系の観察や解析を容易に且つ高精度に行う光学測定装置に関する。

近年、医療分野において生体皮膚下の血管や細胞のイメージング技術は分子機構の解明や治療薬の開発に大きく貢献している。例えば血管イメージングは既存の血管から新しい血管が伸びる血管新生（血管増生）を観察する際に必要とされる。この血管新生は炎症や低栄養状態、癌などの病的状態において活発に起こるため、これらの疾患の治療において非常に重要である（非特許文献１参照）。これらのイメージング技術として様々な手法が提案されてきた（例えば、特許文献１、２参照）。しかしながら一般的に知られている二光子励起顕微鏡は適切な蛍光プローブでの標識付けの準備、組織切片の摘出や高価な装置など簡易的な計測に不向きであった。

そこで測定対象物に対して非侵襲・非破壊・非染色で簡易な計測方法が求められていた。非侵襲・非破壊・非染色な評価指標の１つとして定量位相情報（厚みや屈折率）があり、細胞増殖や活性度、癌細胞か否かなどと相関性が高いことが知られており、様々な研究が行われている。中でもデジタルホログラフィック顕微鏡(Digital Holographic Microscopy : DHM)は，微小物体の定量位相計測が可能な技術の一種である（非特許文献３参照）。DHMは光源から発せられた光を物体に照射する物体光と、物体に照射しない基準の光となる参照に分け、撮像素子上に形成される干渉縞を電気信号として記録する。この干渉縞は参照光に対して物体を透過した分の強度と位相の変調が起きているため、物体の情報が記録される干渉縞の強度情報として記録される。その後、この干渉縞に対して計算機上で画像処理と光波伝搬計算を行うことで物体の複素振幅情報の再構成の計算を行えるため定量位相計測が可能である。

しかし一般的なDHMも拡大用の対物レンズや光軸調整用のミラーなどの光学素子によって装置の大型化や複雑な光学系調整が問題であった。また、生体細胞を摘出する必要がある。DHMで高分解能かつ広視野な顕微計測を行うための物体光と参照光を同軸上で入射させるインライン型は、再構成像に重なる-1次光や0次光の像を除去するために位相シフトによって複数枚の干渉縞画像を記録する必要があり高速イメージングは困難であった（非特許文献４参照）。またオフアクシス型では再生像の重なりを分離できるが物体光と参照光に適切な角度関係が必要であり、撮像素子で記録できる空間周波数を最大限使用できていない（非特許文献５参照）。さらに1次光らの分離に必要とされる角度では記録される干渉縞が細かい状態となってしまうため、散乱などの外的要因による影響を受けやすい。

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特開2009-31262

特開2017-49069

従来技術では生体組織下の細胞や血管を観察する際には多くの場合表面の皮膚を剥ぐ、さらには生体内部からの摘出が必要となり、観察の準備に時間を要していた。また摘出を必要としない場合でも蛍光プローブなどで標識付けが必要となり、共焦点顕微鏡や二光子顕微鏡のような計測装置では装置が大型化になると同時に計測時間が長く、扱いが難しい等の課題があった。

本発明では、光導波路を用いたデジタルホログラフィック顕微鏡と結像光学系を利用することで複雑な光学系が簡略化されると同時に装置の小型化が可能である。

さらに、生体組織上に形成された干渉縞を結像光学系によって記録することで生体組織下の細胞や血管に標識付けを必要とせずに生体の特徴を簡易的に計測できる。

本発明による光学測定装置は小型の光導波路を使って生体組織の透過光を干渉縞として記録することが出来るため、この干渉縞に対して計算機上で画像処理と光波伝搬計算を行うことで生体組織内の振幅、位相情報を高精度に取得することが可能である。このため、生体観察の用途として簡易な血管検査や生体内の癌細胞の検査（正常細胞と癌細胞の識別）、生体組織の３次元生体認証等の用途に関して有効である。

また、光導波路を含めた光学系の多くを１チップ化することができ、超小型の光学系を構築することが可能となる。従って小型で且つ低コスト化も可能であることから医療用や生体観察用だけではなく、例えば生体認証用途にも応用可能となり、ATMや防犯用途等にも応用可能である。

実施例に係る光学測定装置を含む全体システム構成の一例を示す図。 実施例に係る光学測定装置のソフトウェア構成図。 実施例に係る光学測定装置の主要技術である光導波路の一例を示す図。 実施例に係る光学測定装置の主要技術である光導波路の別の例を示す図。 実施例に係る光学測定装置の別の光導波路を使った構成を示す図。

以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。全図を通じて同一の構成には同一の符号を付けてその重複説明は省略する。以下の実施形態においては、本発明に係る光学測定装置を例に挙げて説明する。

図１は本発明の実施形態の光学測定装置１を含む全体構成の一例を示した図である。図１の光学測定装置１では観察対象である生体組織６は光を透過する形の例を示しているが、これに限ることはなく、反射型でも良い。

この光学測定装置１は記録光学機能２と分離処理機能１２とシステム制御機能１６の３つの機能要素から構成されている。以下各機能について詳細に記載する。

記録光学機能２では例えば特定の波長を有する光を放射する光源３から照射された光が光導波路４で第一の光７と第二の光８に分波される。この光導波路４は屈折率の異なるコアとクラッドから成り、入射した光は導波路内を全反射しながら伝搬する。一般的なミラーなどを用いた空間光学系と比較して光学系がコンパクトになり、複雑なアライメント作業を必要としない利点がある。位相シフト機能５は分波された第一の光７または第二の光８の波長の位相をシフトさせる機能を有するもので、例えばピエゾ素子を使って光路長を変えることで位相をシフトさせる、或いはヒーターと温度センサを使って波長の位相を変化させることを可能にする機能部材である。光源３は特定の波長を有しているが、一定の波長でなく、波長の可変機能を有していても良い。第一の７と第二の光８に分波された光は生体組織６に入射するが、光導波路から出射された光は球面波となり、前記２つの光は生体組織６を透過して表面上に干渉縞９を形成する。この干渉縞９を、レンズ１０を通して撮像素子１１で光強度分布として記録する。

ここで、例えば第一の光７が血管や細胞組織等の生体組織の観察対象物６aを通過し、第二の光８はそのまま生体組織６を通過するとそこで形成される生体表面上の干渉縞は生体組織の観察対象物６aの影響を受けた干渉縞となり撮像素子１１を通して画像として分離処理機能１２に記録される。実際に記録される画像は分離処理機能内の一時メモリ（図示せず）やRAM１９等で記録する。このとき第一の光７、あるいは第二の光８の一方に熱源を加えて光の位相差を加えると干渉縞に位相差が生じ、相対位相差が異なる複数の干渉縞を記録することで、画像処理上で再生像に重なるノイズを除去できる。と同時に複数の位相差の干渉縞からホログラムを形成し、画像処理１３を施して光波伝搬計算１４を行って生体組織６の内部の血管や細胞の情報を再構成して画像表示処理１５を使って画像化する。

上記第一の光７と第二の光８はそれぞれ参照光と物体光となるが、どちらかが参照光、どちらかが物体光とすれば良い、また、参照光となる導波路上位相シフト機能５が有る必要があるが、例えば第一の光７と第二の光８の導波路上のそれぞれに位相シフト機能５を付加し、選択させても良い。これら詳しい処理の方法については後述する。

上述の一連の処理を制御するのがシステム制御機能１６でありコントローラ１７、ROM１８、RAM１９、外部メモリ２０で構成されている。コントローラ１７は記録光学機能２内の各部材の電源のON/OFFや細かな各種設定値の設定や制御、分離処理機能１２へのコマンドセットや制御も行う。ROM１８にはシステムのソフトウェアや初期値等を記録されている。RAM１９はコントローラ１７や分離処理機能１２で一時的に記録されたデータや設定値を記録するためのものである。外部メモリ２０はROM１８やRAM１９に保存仕切れないものや以前のデータ等を保持しておくためのメモリである。あるいはソフトウェアのアップデータ等の保存や新たな設定値の保存等にも利用できる。画像表示処理１５で生成された画像データは表示部２１で表示される。これらデータ等はシステムバス２２でデータは送受信される。図１では表示されていないが、前記データはネットワークを介して外部へ送受信しても良い。

図２は本実施例の光学測定装置１のソフトウェア構成図であり、コントローラ１７、ROM１８、RAM１９、及び外部メモリ２０、システムバス２２からなる。コントローラ１７は、所定のプログラムに従って光学測定装置１全体を制御するマイクロプロセッサユニットである。システムバス２２はコントローラ１７と光学測定装置１内の各部との間でデータ送受信を行うためのデータ通信路である。ROM（Read Only Memory）１８は、オペレーティングシステムなどの基本動作プログラムやその他のアプリケーションプログラムが格納されたメモリであり、例えばEEPROM（Electrically Erasable Programmable ROM）やフラッシュROMのような書き換え可能なROMが用いられ、ROM１８に格納されたプログラムを更新することにより、基本動作プログラムやその他のアプリケーションプログラムのバージョンアップや機能拡張が可能である。

RAM（Random Access Memory）１９は基本動作プログラムやその他のアプリケーションプログラム実行時のワークエリアとなる。具体的には、例えばROM１８に格納された基本動作プログラム１８ａはRAM１９に展開され、更にコントローラ１７が前記展開された基本動作プログラムを実行することにより、基本動作実行部１９ａを構成する。以下では、説明を簡単にするために、コントローラ１７がROM１８に格納された基本動作プログラム１８ａをRAM１９に展開して実行することにより各部の制御を行う処理を、基本動作実行部１９ａが各部の制御を行うものとして記述する。なお、その他のアプリケーションプログラムに関しても同様の記述を行うものとする。

撮像処理実行部１９ｂは撮像素子１１に対し撮影の指示、停止等を行うのと共に入力された撮像素子からの電気信号を元に撮像画像の再生処理を行う。画像処理実行部１９c前記再生処理を行った撮像画像に対して様々なソフトウェアの処理で輝度や色彩等の補正や画像をより鮮明にするためのエッジ処理や画質改善処理を行う。光伝搬計算実行部１９dについての詳細は後述するが、記録光学機能２で得られた干渉縞画像に対し様々な光伝搬計算を行いそれによって新たな詳細の対象物体の画像やプロファイル等を作成する計算を行う処理である。各種部材の設定値実行部１９eは記録光学機能２の位相シフト機能５、光源の波長設定３等の様々な設定値の変更を行う処理であり、これにより変更された設定値での画像や干渉縞等の取得を可能とする。例えば光源３である波長で設定されて得られた干渉縞に対し、λ/4だけシフトさせた時の干渉縞が必要な場合にはこの部分の処理により位相シフト機能５の設定を行う。画像表示実行部１９fは前記計算等により再構成された画像や初期の物体画像等を表示するためのソフトウェアである。上記ソフトウェアは全てがソフトウェアとして記載されているがこれに限ることはなく、例えば高速化するために一部をハードウェア化されていても良い。

コントローラ１７は光学測定装置１全体の制御を行うアルゴリズムが組み込まれている。本実施例の光学測定装置１の動作は、図２に示したように、主として外部メモリ２０に記憶された撮像処理プログラム２０ｂと、画像処理プログラム２０ｃと、光伝搬計算プログラム２０ｄと、各種部材の設定プログラム２０e、画像表示プログラム２０fがRAM１９に展開され、コントローラ１７により実行される撮像処理実行部１９ｂと、画像処理実行部１９ｃと、光伝搬計算実行部１９ｄ、各種部材の設定値実行部１９e、画像表示実行部１９fによって制御されるものとする。前述の撮像処理実行部１９ｂと、画像処理実行部１９ｃと、光伝搬計算実行部１９ｄ、各種部材の設定値実行部１９e、画像表示実行部１９fはその一部または全部の動作をハードウェアで実現する各ハードウェアブロックで行っても良い。ROM１８及びRAM１９はコントローラ１７と一体構成であっても良い。また、ROM１８は、図２に示したような独立構成とはせず、外部メモリ２０内の一部記憶領域を使用しても良い。また、RAM１９は、各種アプリケーションプログラム実行時に、必要に応じてデータを一時的に保持する一時記憶領域を備えるものとする。

外部メモリ２０は撮像素子１１で撮影されている画像を一時的に蓄えても良い。また、光学測定装置１の各動作設定値や光学測定装置１の位置情報や各種情報、光学測定装置１が撮影した画像や情報等の一部または全部のデータ、その他プログラムを格納している。外部メモリ２０の一部領域を以ってROM１８の機能の全部または一部を代替しても良い。また、外部メモリ２０は、光学測定装置１に電源が供給されていない状態であっても記憶している情報を保持する必要がある。したがって、例えばフラッシュROMやSSD（Solid State Drive）、HDD（Hard Disc Drive）等のデバイスが用いられる。

次に本発明の光導波路４の一例について図３を使って説明する。図１では光源１から光導波路４へ入ると第一の光７と第二の光８に分波され、それぞれ光導波路４を通過した後に生体組織に入射されている図を示しているが、これに限ることはなく、例えば図3に示す様に分波素子４a、スイッチング素子４b、位相シフタ５aで構成された光導波路４により、入射端で入射される光を分波素子４a、スイッチング素子４b、位相シフタ５aを通して２つの光、すなわち第一の光７と第二の光８にして出射端より出射されれば良い。具体的には図３では分波素子４aで５つの光に分波された光がスイッチング素子４b、位相シフタ５aを通った後に(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の５つの導波路となっているが、コントローラ１７により選択された２つの光が出射端より出射される。

上記の位相シフタ５aは図１で説明した位相シフト機能５の一例である。具体的には、入射端から所定の波長の光が入射し、分波素子４aで入射光を分波している（図３の例では５つに分波されている）。次にスイッチング素子４bを用いて使用する導波路を選択し、干渉させる２光（第一の光７と第二の光８）だけを通す。次に選択した光路の一方に位相シフタで位相変調を行い、出射端より出てきた第一の光７と第二の光８を干渉させる。スイッチング素子４bと位相シフタ５aをコントローラ１７で制御することで、使用する２光の導波路を自由に変えられる。これによってたまたま透過性が悪い生体組織の観察対象物６aが光を遮っても、異なる選択された光同士（(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の５つの導波路の内、２つを選択）で干渉縞を生成することが可能となる。また、異なった位置に存在する生体組織の観察対象物６aや異なった角度からのイメージングも光学測定装置１を動かす必要なく見ることが可能となる。

図３では分波素子４aで５つの光に分波される例を示しているが、これに限ることはなく、分波される光の数は設計事項であり幾つに設定しても良い。また、図３では(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の５つの導波路の２つが選択されてその一方を第一の光７他方を第二の光８としていたが、これに限ることはなく、図４で示す様に、入射端で２つの光に分波され、その一方はそのまま入射光の波長のまま出射されいわゆる物体光として生体組織６に入射され、２つに分波された一方がスイッチング素子４b、位相シフタ５aを通って出射端から出射しても良い。この場合には第二の光８はいわゆる参照光となる。この場合には位相シフタ５aは予め複数の位相をシフトできる状態に設定しておき、スイッチング素子４aのスイッチングと同時に光の位相を変えて出射させることが可能になるようにする事で高速に測定可能になる。

次に本発明の光学測定装置１の位相シフト機能５を使ってノイズ除去を行う方法について式を使って説明する。特定の波長を有する光源３から出射された光は光導波路４に入射し、分波される。光導波路４で分波された光は上記の説明では第一の光７と第二の光８としていたがここでは説明を簡単にするために、一方の光が生体組織６を透過する物体光であり、もう一方の光を基準の光となる参照光とする。これら２つの光が異なる導波路を通って出射される。光導波路４から出射された光は球面波となり、生体組織を透過して表面上に干渉縞を形成する。この干渉縞をレンズと撮像素子によって光強度分布として記録する。

上記撮像素子１１で記録した干渉縞画像I(x,y;θ)は所望する物体像の他に非回折光や共役像(0, -1次光）の情報を含んでいる。すなわち求めたい物体像の他に重畳した不要像の情報が含んでいる。いわゆるノイズである。そこで、下記の(1)式を計算することによって物体像に重畳する不要像を除去した複素振幅分布U(x)を取得する。このとき参照光側に熱源を加えて干渉縞に位相差を与える事で、相対位相差が異なる干渉縞を記録することになり、画像処理上で再生像に重なるノイズを除去できる。

本発明では４段階位相シフトの例を示す。4段階位相シフトは参照光の位相をπ/2ずつ位相シフトさせ、ずらした干渉縞画像を4枚取得する。撮像素子で記録した干渉縞画像をI(x,y;θ)とすると4段階位相シフトを用いた物体光の複素振幅分布U(x)は(1)式で表される。

位相変調を与える方式としてピエゾ素子や空間変調器を用いた方法もあるが、本発明では熱源を用いて熱を与えることによる屈折率勾配を用いた熱光学効果を利用した方法について記載する。ピエゾ素子や空間変調器を使う方法もあるが、熱源と温度センサを用いる方法であれば例えば薄膜プロセスで作成することも可能であり、光導波路を用いた利点であるコンパクトな光学系を維持したままノイズ除去ができる。

(1)式において簡単化のために定数項は省略し1次元で記述するが、位相シフト後の複素振幅分布U(x)を用いることで(2)式の様なフレネル・キルヒホッフの回折式から物体の複素振幅分布が計算で求めることが出来る。ここで、λは光波の波長、Zは伝搬距離、Fはフーリエ変換演算を表す。(2)式を光伝搬計算１４で行うことにより、目的の物体光のみを再生することが可能となる。

さらに、ここで得られる物体の空間分解能はNA = nsinθ ≒ nD / 2z_oの関係より、物体から干渉縞面までの距離z_oと記録する干渉縞のサイズDによって決定される。空間分解能δxはレイリーの空間分解能式より(3)式のように表せる。

NAの値を決めるのは設計事項であるが、NAは0.2程度で実現できるので波長632.8 nmでの分解能としては1.8 ~ 1.9 μm程度と計算できる。従って、生体組織内での毛細血管の太さは5～20 μm（平均 7 μm）であり、十分にイメージングできる分解能を有している。

上記で説明した本発明の光学測定装置１では、例えば廉価なレーザーダイオードで作られた光源３、薄膜プロセスを使って非常に小型化且つ低コスト化が可能な光導波路４とレンズ１０、撮像素子１１の記録光学機能２と、コントローラ１７を含めたシステム制御機能１６、主にソフトウェアで構成された分離処理機能１２とで構成されているため非常に小型且つ低コストで構成することが出来るため、例えば銀行のATMや入室管理に利用される生体認証装置にも応用可能である。

次に本発明の光学測定装置１の別の応用例として針型プローブを使った光学測定装置１について図５を使って説明する。生体組織６には非常に厚いものや、光が透過しにくいものもある。このような生体組織の場合でも内部の状態を観察したい場合には光導波路の形状を針状に形成して直接、又は光導波路を注射針のような金属製の針で覆うことで生体組織６に刺し、内部の血管や細胞の情報を再構成する方法がある。ここで光導波路は針状光導波路２３とする。針状光導波路２３を通過した第一の光７と第二の光８は生体組織６の中を進み、生体組織６の表面に干渉縞を形成し、これをレンズ１０及び撮像素子１１で捉えて分離処理機能１２で画像処理１３、光波伝搬計算１４を行い生体組織６の内部の情報を再構築して画像表示１５させて実際に画面表示させる。

この針状光導波路２３のサイズは薄膜プロセスで製造できるため、100 μm程度と非常に小さいサイズで設計可能である。医療分野で人体への皮下注射としてよく使用される注射針の太さが0.6 mm程度であるので、金属製の針で覆う場合でも十分なサイズである。

上記では針状の光導波路についての記載であったがこれに限ることはなく、フレキシブルな光導波路でも良い。この場合生体組織内には非常に細くフレキシブルなプローブ状の光導波路を生体組織６内に挿入することとなる。

１：光学測定装置、２：記録光学機能、３：光源、４：光導波路、４a：分波素子、４b：スイッチング素子、５：位相シフト機能、５a：位相シフタ、６：生体組織、６a：生体組織の観察対象物、７：第一の光、８：第二の光、９：干渉縞、１０：レンズ、１１：撮像素子、１２：分離処理機能、１３：画像処理、１４：光伝搬計算、１５：画像表示処理、１６：システム制御機能、１７：コントローラ、１８：R O M、１９：R A M、２０：外部メモリ、２１：表示部、２２：システムバス、２３：針状光導波路

Claims (11)

1. 光源から発せられ、被写体を透過した光によって生じる画像を記録する記録光学機能と、記録した画像を処理する画像処理機能を有する光学測定装置において、特定の波長を有する光源で発光された光が導波路内で複数光に分けられ被写体を透過し第一の光と第二の光によって被写体表面に形成された干渉縞画像を記録する記録光学機能と、上記画像処理機能では、記録した干渉縞画像に対して演算処理を行い被写体内の情報を数値化する分離処理機能を有することを特徴とする光学測定装置。
   
2. 上記請求項１記載の光学測定装置において、被写体が生体組織であり、第一の光はそのまま生体組織を透過し、第二の光は生体組織内の観察対象物を透過し、上記２つの光によって生体組織表面に生じる干渉縞画像を記録する記録光学機能を有することを特徴とする光学測定装置。
   
3. 請求項１、２記載の光学測定装置において、光導波路は、積層プロセスまたは除去プロセスで形成されることを特徴とする光学測定装置。
   
4. 請求項１、２記載の記録光学機能は、光導波路で出射された複数の光の中で被写体中の被写体観察対象物を透過する物体光と被写体内をそのまま透過する参照光とにより被写体表面上に形成された干渉縞を記録する撮像部を有することを特徴とする光学測定装置。
   
5. 請求項１記載の分離処理機能は、前記記録光学機能で記録した１枚の干渉縞画像から画像処理と光波伝搬計算により被写体内の振幅情報と位相情報を数値化することを特徴とする光学測定装置。
   
6. 請求項１記載の数値化処理機能は、前記記録光学機能で記録した複数の干渉縞画像によりノイズを除去する画像処理と光波伝搬計算により振幅情報と位相情報を数値化することを特徴とする光学測定装置。
   
7. 請求項１、３、４記載の光導波路は、複数の光に分波されており、前記複数光に分波された導波路上の少なくとも一つ以上に熱源を加えることで位相を変調させる機能を有することを特徴とする光学測定装置。
   
8. 請求項１から７記載の光学測定装置において、光源で発光された特定の波長の光を複数光に分ける光導波路を針状に形成した針状光導波路を被写体内部に差し込み、被写体を透過して出来る被写体表面に形成された干渉縞画像を記録する記録光学機能と、上記画像処理機能では、記録した干渉縞画像に対して演算処理を行い振幅情報と位相情報に分離する分離処理機能を備えることを特徴とする光学測定装置。
   
9. 請求項１から７記載の光学測定装置において、光源で発光された特定の波長の光を複数光に分ける光導波路を細く且つフレキシブルな形状の光導波路を被写体内部に差し込み、被写体を透過して出来る被写体表面に形成された干渉縞画像を記録する記録光学機能と、上記画像処理機能では、記録した干渉縞画像に対して演算処理を行い振幅情報と位相情報に分離する分離処理機能を備えることを特徴とする光学測定装置。
   
10. 請求項８、９記載の光導波路は、積層プロセスまたは除去プロセスで形成されることを特徴とする光学測定装置。
    
11. 記録光学機能は、前記光導波路で出射された複数の光の中で物体中の物体を透過する物体波と参照波とにより物体表面上に形成された干渉縞を記録する撮像部を有することを特徴とする、請求項７に記載の光学測定装置。

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