JP2022032875A - 体液から核酸を抽出する前処理キット - Google Patents

Abstract

【課題】被検者自身によって簡易に生体試料を採取することが可能であるとともに、検査者が感染するリスクを抑え、かつ、検体前処理液と試料との比率を定量的にすることができ、さらに、生体試料を採取直後に、病原体を不活性化させる。【解決手段】被検者自身で採取可能な唾液を採取するスワブまたは漏斗による唾液採取手段と、被検者の唾液からウイルスを溶解し核酸を抽出する検体前処理液と、前記唾液と、前記検体前処理液とを懸濁するための懸濁用チューブ２０と、前記懸濁用チューブを封止するキャップ２１０と、前記懸濁用チューブを封止した後に、前記懸濁用チューブを把持した手と前記懸濁用チューブの外側とを消毒する消毒手段とを備え、前記懸濁用チューブは、検体前処理液を検量する目盛りと唾液を検量する目盛りと、上端に連結部とを備える核酸抽出キットを提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、体液から核酸を抽出する前処理キットに関する。

従来、ウイルスまたは細菌による感染の有無を検査する遺伝子検査では、生体試料における感染源の標的核酸を検出するために、通常、生体から採取した試料から、前処理を施した上で標的核酸を抽出し、標的核酸配列を増幅する反応系に供する方法が行われている。

まず、生体試料から核酸を抽出し、次に、抽出した核酸を、ＲＴ－ＰＣＲ装置などの遺伝子解析装置を使用して、検査対象とするウイルスまたは細菌の標的核酸配列の増加に共役して蛍光強度が増大する蛍光物質を含む試薬と反応させて、標的核酸配列の増加に共役した蛍光物質の蛍光強度の増大を検出することによって、検査対象とするウイルスまたは細菌による感染の有無を検査する方法が知られている。

また、感染症の病原体を採取する生体試料としては、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、唾液、喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、便、血液などがあるが、プライバシーを害しないため、検査者の感染を防ぐため、あるいは、一度に多数の検査を行う必要がある場合などには、検体を自己採取できることが望ましく、これらのなかでも、被検者自身による採取が容易な体液として、唾液、喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、血液などが適しており、その中でも特に唾液が最も自己採取が容易なものとされている。

生体試料から核酸を抽出する方法について、下記の特許文献１では、菌体を含む液状の検体および試薬の通過を規制し、かつ菌体に含まれる核酸の通過を許容する核酸通過フィルターを少なくとも一部に有する壁により検体を収容する第１室を形成する容器を準備し、第１室内に検体を収容し、検体を加熱することにより菌体を破砕し、菌体から放出された核酸を、核酸通過フィルターを通過させる、核酸回収方法が提案されている。

特開２０１９－１７６８３１

しかしながら、特許文献１に記載の核酸抽出方法では、被検者自身によって被検者の生体試料の定量的な採取をすることが不可能であるため、検査者による生体試料の採取が必要となり、被検者が病原体を保有していた場合には、検査者が感染するリスクがある。また、特許文献１に記載の核酸抽出方法では、検体を採取する段階において、採取する生体試料と検体前処理液との比率を定量的にすることができないため、所定量の生体試料中における病原体の定量が不可能であり、かつ、核酸を的確に抽出することができない。

そこで、被検者自身によって簡易に生体試料を採取することが可能であるとともに、検査者が感染するリスクを抑え、かつ、検体前処理液と試料との比率を定量的にすることができる核酸抽出キットが望まれている。また、生体試料を採取直後に、病原体を不活性化させることができれば、その後の工程におけるバイオハザードのレベルを下げることが可能となる。

上記課題を解決するための本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
被検者自身で採取可能な体液を採取する体液採取手段と、
被検者の体液からウイルスを溶解し核酸を抽出する検体前処理液と、
前記体液と、前記検体前処理液とを懸濁するための懸濁用チューブと、
前記懸濁用チューブを封止するキャップと、
前記懸濁用チューブを封止した後に、前記懸濁用チューブを把持した手と前記懸濁用チューブの外側とを消毒する消毒手段と
を備え、
前記懸濁用チューブは、検体前処理液を検量する目盛りと体液を検量する目盛りと、上端に連結部とを
備えることを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記懸濁用チューブが、透過性があり、かつ、可塑性のあるプラスチック素材で形成される
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記消毒手段が、ウイルスを不活性化させる試薬が予め注入された消毒用容器を備え、
前記消毒用容器は、前記懸濁用チューブを把持した手と前記懸濁用チューブの外側とを挿入することができる開口部を備える
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
カラムをさらに備え、
前記カラムは、前記懸濁用チューブと着脱可能な連結部と、グラスフィルターと、前記連結部の反対側にノズルを備える
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記検体前処理液が、下記（１）から（６）の成分から選択される少なくとも４つ以上の成分を含むことを特徴としている。
（１）タンパク質変性剤
（２）イオン性界面活性剤
（３）非イオン性界面活性剤
（４）エタノール
（５）還元剤
（６）緩衝剤

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記タンパク質変性剤が、グアニジウム塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、尿素の何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミドの何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記還元剤が、ジチオトレイトール、２－メルカプトエタノールの何れか１つ、またはこれらの組合せを含むことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記緩衝剤が、トリス塩酸緩衝液であることを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記体液採取手段がスワブであり、
前記スワブは、把持部と、軸部と、体液を採取するための先端部とから構成され、
前記軸部の上端に、前記把持部を有し、
前記軸部の下端に、前記先端部を有する
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記スワブが、前期懸濁用チューブを封止するための前記キャップの内側上面に前記スワブの軸部の上端が結合することにより、前記キャップと一体に形成された
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記体液採取手段が、前記スワブと絞取容器とから構成され、
前記絞取容器は、透過性のある中空の筒状体であり、可塑性のあるプラスチック素材により成形され、
上端に第１の開口部と開口部を封止するキャップと、上端側の外周に前記キャップとの着脱可能な第１の連結部と、下端側に目盛りおよび前記懸濁用チューブとの着脱可能な連結部と、下端に開口部と、前記開口部を封止するシールとを備える
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記絞取容器の内側に絞り部をさらに備え、
前記スワブの前記先端部が、前記絞取容器の内部において、前記絞り部を複数回貫通するように上下方向に移動させることによって、前記絞り部により前記先端部が絞られ、体液が前記絞取容器の下端に集積される
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記体液採取手段が、漏斗であり、
前記漏斗は、透過性があり、上端に開口部と、下端側に前記懸濁用チューブとの着脱可能な連結部と、目盛りと、下端に開口部と、前記開口部を封止するシールとを備えて、
前記体液が前記漏斗の下端に集積される
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、
前記漏斗が、非検査対象物を濾し取るフィルターを備える
ことを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、検査対象の体液が、唾液、喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、血液のいずれか一つとすることを特徴としている。

また、本発明に係る体液から核酸を抽出するキットは、前記体液採取手段により採取される検体が唾液の場合に、唾液と前記検体前処理液との比率が１対５ないし１対１０の何れか一の容量割合となるよう混合されることを特徴としている。

以上のように、本発明によれば、被検者自身によって簡易に生体試料を採取することが可能であるとともに、検査者が感染するリスクを抑え、かつ、検体前処理液と生体試料との比率を定量的にすることができる核酸抽出キットを提供することができる。また、生体試料を採取直後に、病原体を不活性化させることができ、その後の工程におけるバイオセーフティレベルを下げることができる。

本発明の第一の実施形態に係る唾液の採取方法を示した図。 本発明の実施形態に係る懸濁用チューブを示した図。 本発明の第一の実施形態に係るスワブから体液を抽出する方法を示した図。 本発明の第一の実施形態に係るスワブとキャップとを一体にした実施例を示した図。 本発明の実施形態に係る検体前処理液を洗浄し、核酸増幅試薬に懸濁するまでの工程を示した図。 実験結果を示した一覧表。 滅菌用容器に懸濁用チューブとそれを把持した手を挿入している図。 本発明の第二の実施形態に係る漏斗と懸濁用チューブを示した図。 本発明の第二の実施形態に係る唾液の採取方法を示した図。 本発明の第三の実施形態に係るスワブ、絞取容器および懸濁用チューブを示した図。 本発明の第三の実施形態に係る体液をスワブから抽出する方法、検体前処理液に懸濁する方法を示した図。

以下、図面を参照して本発明の望ましい実施形態を詳細に説明する。但し、本発明は多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。

図１から図１１を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。まず、図１は、本発明の第一の実施形態に係る第１の体液採取手段であるスワブ１０を示した図１（ａ）と、スワブ１０によって口腔内から唾液を採取する様子を示した図１（ｂ）および（ｃ）である。

第１の体液採取手段は、スワブ１０を使用する。図１（ａ）に示すように、スワブ１０は、把持部１０１、軸部１０２および先端部１０３から構成され、軸部１０２の上端に、前記把持部１０１が、軸部１０２の下端に、試料を採取する先端部１０３を備える。スワブ１０は、市販の綿棒であってもよいが、先端部１０３は、液体を含浸する量ができるだけ多くすることができる材質が望ましい。

把持部１０１は、手でスワブ１０を把持するためのものであり、形状は、把持できる外径であり、その材質は、把持できる性質のものであれば、特に限定されず、例えば、紙、木、プラスチックなどでもよく、軸部１０２と同じ材質であってもよい。

軸部１０２の材質としては、紙、木、金属、プラスチック等を用いることができるが、加工等の観点からプラスチックを用いることが望ましい。プラスチックの材質として、例えば、塩化ビニール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリアミド、又はポリカーボネート等を挙げることができる。

先端部１０３の材質として、例えば、綿、レーヨン、オレフィンフォーム、ポリウレタンフォーム、ポリアミド、吸水性ポリマーあるいはこれを組み合わせたものが挙げられる。

図１（ｂ）および（ｃ）は、被検者自身がスワブ１０を口腔内に入れて、唾液を採取している様子を示した図である。被検者は、スワブ１０の先端部１０３を、飴をなめるようにして唾液を採取する。スワブ１０の先端部１０３を口腔内に挿入し、３０秒以上唾液を含浸させることが望ましい。

スワブ１０により採取する検体は、唾液に限定されるものではなく、スワブ１０で拭いとることができる体液検体であれば、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、尿、汗、精液、子宮経管粘液、膣分泌液、血液などであってもよい。図示しないが、被検者自身が自身の喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、血液などの体液を自身でスワブ１０の先端部１０３に含浸するようにしてもよい。

次に、採取した体液のウイルスを溶解して核酸を抽出するために、体液を検体前処理液１００に懸濁させる。図２（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、本発明の一実施形態に係る懸濁用チューブ２０を示した図である。懸濁用チューブ２０は、透過性があり、かつ、可塑性のあるプラスチック素材であることが望ましい。透過性があり、かつ可塑性のあるプラスチック素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニールなどでも良いが、本発明はこれに限定されるものではない。

懸濁用チューブ２０が可塑性を有することに因って、図３に示すように、被検者自身でスワブ１０の先端部１０３に含浸させた体液を懸濁用チューブ２０に注入し、懸濁用チューブの略中央部の両側を指で押して、スワブ１０の先端部１０３から体液を前処理懸濁液１００に十分に含浸させることができる。

図２（ａ）および（ｂ）に示す懸濁用チューブ２０は、上端に開口部２０１を有し、かつ、上端の外周には、キャップ２１０の内周部の連結部（ネジ溝）、後述する図８（ａ）に示す漏斗４０の下端の内周部の連結部（ネジ溝）４０３、または、後述する図１０（ｂ）に示す絞取容器５０の下端の内周部の連結部（ネジ溝）５０６と螺合することができるように、連結部（ネジ溝）２０２を備える。また、懸濁用チューブ２０の上端の連結部（ネジ溝）２０２の下部には、図２では示されないが、図１０（ｃ）に示すようなフランジ６０３のようなフランジが形成されていることが望ましい。

懸濁用チューブ２０は、簡易に計量できるようにするため、図２（ａ）および（ｂ）に示すように円柱状であることが望ましいが、図２（ｃ）に示すように、下端が逆円錐形状であってもよい。図２（ａ）および（ｂ）に示すように懸濁用チューブ２０の形状が円柱である場合には、円柱の容積を算出し、円柱の所定の箇所に、目盛りを付す。図２（ｃ）に示すように、下端が逆円錐形状の場合は、円錐形状部分の容積と円柱部分の容積とを合算して所定の箇所に、目盛り２０３Ｅを付す。この目盛り２０３Ｅは、体液と検体前処理液１００とを懸濁させた懸濁液の計量を示す目盛りであることが望ましい。図２（ａ）および（ｂ）に示すように、検体前処理液１００の注入量を示す目盛り２０３Ａ、２０３Ｃと、体液と検体前処理液１００とを懸濁させた懸濁液の合計量を示す目盛り２０３Ｂ、２０３Ｄの双方を付してもよい。

懸濁用チューブは、図２（ｂ）に示すように、その内部に、絞り部２０４を設けることが望ましい。被検者は、スワブ１０を上下方向に移動させることによって、スワブ１０の先端部１０３が、この絞り部２０４により圧迫され、ワイプされて、先端部に含浸された体液が懸濁用チューブ２０に落下して集積される。また、被検者は、図３に示すように、懸濁用チューブ２０を両側から指で押圧して、スワブ１０の先端部１０３に含浸された体液を絞り出すようにしてもよい。

検体前処理液１００は、予め、一定量が懸濁用チューブ２０に注入される。そして、被検者は、予め検体前処理液１００が注入された懸濁用チューブ２０に自身の体液を一定量注入した後に、懸濁用チューブ２０にキャップ２１０をかぶせて封止する。図２（ａ）および（ｂ）に示す実施形態では、キャップ２１０を懸濁用チューブ２０の連結部２０２に螺合させることにより開口部２０１を封止し、図２（ｃ）に示す実施形態では、上端部と一体となったキャップ２１０を上から圧入して開口部２０１を封止する。

図４に示すように、キャップ２１０とスワブ１０とを一体として形成してもよい。一体として形成する方法としては、エポキシ樹脂系接着剤でキャップ２１０とスワブ１０とを接着するようにしてもよい。また、例えば、キャップ２１０の内側上面にスワブ１０の軸の上部を接着剤等で予め結合するように加工しても良い。キャップ２１０とスワブ１０とを一体として形成した場合は、スワブ１０の把持部１０１の代わりに、キャップの外周がスワブ１０の把持部分の役割を担う。

ウイルスが不活性化するように、検体前処理液１００は、ウイルスを不活性化するものでなければならない。また、検体前処理液１００は、核酸を抽出するとともに、核酸を溶解するＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを阻害する必要がある。さらに、検体前処理液１００は、抽出した核酸の保存安定性を備えることが望ましい。

さらに、迅速に遺伝子診断を行うために、体液から核酸を抽出する工程で時間をかけないようにするために、室温でウイルスを不活性化させて核酸を抽出することができることが望ましく、かつ、時間をかけないように、できるだけ遠心機を使用しないことが望ましい。

検体前処理液１００は、タンパク質変性剤、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、エタノールを混合してなることが望ましく、さらに、イオン性界面活性剤、還元剤、高吸水高分子を混合してなることが望ましい。

検体前処理液１００に混合させるタンパク質変性剤としては、グアニジウム塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、尿素の何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

検体前処理液１００に混合させる緩衝剤としては、トリス塩酸緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

体前処理液１００に混合させる非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｔｒｉｔｏｎは登録商標）のいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

さらに、体前処理液１００に混合させるイオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミドの何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

さらに、体前処理液１００に混合させる還元剤としては、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２－メルカプトエタノールの何れか１つ、またはこれらの組合せを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

さらに、体前処理液１００に混合させる高吸水性高分子としては、ポリアクリル酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されるものではない。

表１は、本発明の一実施形態に係る検体前処理液１００の組み合わせを示した表である。グアニジンチオシアン酸塩（タンパク質変性剤）と、ポリアクリル酸ナトリウム（高吸水性高分子）と、トリス塩酸緩衝液（緩衝剤）と、Ｔｒｉｔｏｎ（商標登録）Ｘ－１００（非イオン性界面活性剤）と、エタノールとを混合させたものである。この検体前処理液１００と、不活化されたＡ型インフルエンザウイルスと、唾液とを懸濁させた実験を行った。

図５に示すように、まず、標的遺伝子試料（図示せず）と、表１の組み合わせからなる検体前処理液１００（図５および図６では、便宜上「ＳＳＢ」と表記する）と、スワブ１０の先端部１３０に含浸させた唾液とを懸濁させる。その後、グラスフィルター付きカラム８０１でろ過し、グアニジン塩酸塩とエタノールを混合させた溶液をグラスフィルター付きカラム８０１に注入して洗浄する。このとき、グラスフィルター付きカラム８０１の下部のノズル部分からバキューム等により吸引して洗浄液を排出するようにしてもよい。最後に、グラスフィルター付きカラム８０１をチューブ８０２にかぶせて、ＤＮａｓｅフリー、ＲＮａｓｅフリーの溶出液を一定量注入し、グラスフィルターで濾しとられたＲＮＡをチューブ８０２内に抽出する。そして、チューブ８０２内には、ＲＮＡが含まれるＤＮａｓｅフリー、ＲＮａｓｅフリーの溶出液（図５では便宜上「ＲＮＡ液」と表記する）が入った状態になる。このＲＮＡ液から一定量をチューブ８０３に注入し、増幅検出用の試薬（図５では便宜上「ＰＣＲ液」と表記する）の一定量と混合して、ＲＴ－ＰＣＲ装置により増幅反応をさせる。

このように、本発明の実施形態においては、まず、体液を検体前処理液１００に懸濁させる。次に、その懸濁液を、グラスフィルター付きカラム８０１に移してろ過し、グアニジン塩酸塩とエタノール等により洗浄する。最後に、ヌクレアーゼフリー水等の溶出液で検出対象のＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡまたはＲＮＡの溶液を、増幅用の試薬と混合して、ＲＴ－ＰＣＲ装置等により増幅反応させることが望ましい。

図６は、表１に記載の組成からなる検体前処理液１００と、不活化されたＡ型インフルエンザウイルスと、唾液とを懸濁させた実験を行った結果を示した表である。図６においては、Ｘは、核酸を抽出する検体前処理液１００を意味し、Ｙは、唾液を意味する。実験では、不活化されたＡ型インフルエンザウイルス５８，０００コピーを標的遺伝子（図６では「ＦｌｕＡ－ＲＮＡ」と表記する）とする試料として使用し、表１に記載の組成からなる検体前処理液１０００μＬに、前記５８，０００コピーの試料と、唾液（図６では「ｓａｌｉｖａ」と表記する）とを懸濁した。

検体前処理液と唾液量との最適な比率を検討するために、検体前処理液１０００μＬに対して、唾液量をそれぞれ、０μＬ、５０μＬ（検体前処理液：唾液の比率が２０：１）、１００μＬ（検体前処理液：唾液の比率が１０：１）、２００μＬ（検体前処理液：唾液の比率が５：１）、５００μＬ（検体前処理液：唾液の比率が２：１）、１０００μＬ（検体前処理液：唾液の比率が１：１）で懸濁したもの各３つのサンプルを用意し、それぞれ懸濁させて試験に供した。

実験の結果、検体前処理液に対する唾液量が少なければ少ない方が、標的遺伝子を検出する確率が高くなることが分かった。特に、検体前処理液と唾液量との比率が２：１の場合、平均で２０．２％しか検出できなかったが、検体前処理液と唾液量の比率が５：１にした場合には、平均で７１．７％検出することができ、さらに、検体前処理液と唾液量の比率が１０：１とした場合には、平均で９１．２％検出することができた。

唾液量の比率が高くなるにしたがって、ＲＮＡの検出率が悪くなる要因としては、唾液に、核酸分解活性を有する酵素であるＤＮａｓｅやＲＮａｓｅ等の物質が含まれていることが考えられる。但し、この実験では、いずれにも、不活化されたＡ型インフルエンザウイルス５８，０００コピーを標的遺伝子とする試料として注入しているが、実際の感染症に罹患している同一の患者から採取する唾液には、唾液量に比例したウイルスが含まれていると考えられることから、唾液量の比率が少なければ少ないほど核酸抽出率が高くなるとはいっても、一定量の唾液は必要となる。

実験の結果、表１に記載の組成からなる検体前処理液と唾液量との比率が５：１ないし１０：１のいずれかの条件が実使用に適うことが分かった。実験の結果から、懸濁用チューブ２０内に注入された検体前処理液と採集する唾液との割合が５：１ないし１０：１相当する量になるように、懸濁用チューブ２０の目盛りは、予め注入する検体前処理液が、採集する唾液に対して５：１ないし１０：１に相当する量になるように付すか、または、注入する検体前処理液１００を５ないし１０、唾液を１とした比率を合計した量になるように付することが望ましい。但し、前者と後者の目盛り双方を付すようにしてもよい。

最後に、図７に示すように、封止された懸濁用チューブ２０と懸濁用チューブ２０を握持している手を、例えば、７０％以上のエタノールが予め注入された滅菌用容器７０に挿入し、封止された懸濁用チューブ２０の外側と手を消毒する。面菌用容器７０内に注入される消毒液は、エタノールに限定されず、エンベロープを有するウイルスを不活性化させるためには、例えば、強酸性電解水、界面活性剤を含有した水（但し、手荒れを起こさないもの）等でもよく、病原体を不活性化するものであれば特に限定されない。また、図示しないが、封止された懸濁用チューブと懸濁用チューブを握持している手を、ウイルスが不活性化する短波長の光、または人に無害とされる波長（例えば２２２ｎｍ）の紫外線に照射して消毒してもよい。

以上が本発明の第一の実施形態である。本発明の第一の実施形態によれば、被検者自身によりスワブ１０で容易に自身の体液を採取することが可能であるとともに、検査者が感染するリスクを抑え、かつ、検体前処理液と体液との比率を定量的にすることができる核酸抽出キットを提供することができる。また、体液を採取直後に、病原体を不活性化させることができ、その後の工程におけるバイオセイフティーのレベルを下げることができる。

次に、本発明の第二の実施形態に係る第２の体液採取手段について説明する。図８（ａ）および（ｂ）に示すように、漏斗４０は、透過性があり、その上端に第１開口部４０１を有し、第１開口部４０１は、被検者が自身の口腔内から唾液を採集するため、下端よりも広い円孔となっている。また、漏斗４０は、上端の開口部４０１から略中央にかけて、緩やかなテーパ形状を形成しており、略中央から下端にかけてより鋭角なテーパ形状を形成している。この第２の体液採取手段は、唾液を対象とすることに適している。

漏斗４０のテーパ形状の終端から下側は筒状体となっている。このテーパ形状の終端の内部には、食物残渣が唾液とともに口腔内から排出された場合に、食物残渣を濾し取ることができるフィルター４１０が配置されている。フィルター４１０は、下端が筒状体の内径と同じ外径であり、上部はテーパ形状に形成されて、筒状体から落下しないようになっている。筒状体には、目盛り４０２および懸濁用チューブ２０との着脱が可能なように連結部４０３を有し、さらに、下端に第２開口部４０４を有し、その下端の開口部４０４を封止するシール４０５を有する。また、漏斗４０は、図示しないが第１開口部４０１を封止するためのキャップ４０６を有してもよい。キャップの例としては、図２（ｃ）のように上端に連結されたもので、第１開口部４０１の上から圧入するものが考えられるが、これに限定されない。シール４０５は、例えば、アルミニウム箔をホットメルト剤により第２開口部４０４により封止したものが挙げられるが、密封性と易開封性とを兼ね備えた材質であることが望ましい。

図８（ａ）に示すように、漏斗４０の下端は、略円柱の形状となっており、下端の第２開口部４０４がシール４０５で封止されている。漏斗４０の下端の略円柱形状の外周には、唾液の採取量に応じた目盛り４０２が付されている。この目盛り４０２は、前述した検体前処理液１００との比率を一定にするために、例えば、１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬごとに目盛りを付するようにしてもよい。

図９は、被検者が自身で唾液を漏斗に移している状況を示した図である。被検者は、口腔内から漏斗４０の上端の第１開口部４０１から唾液が落ちるように、唾液を排出し、唾液が漏斗の下部に集積される。被検者は、自身で、漏斗４０の下端の外周に付された目盛り４０２の位置を確認しながら、目盛り４０２の位置に唾液が集積されるよう唾液を排出するようにしてもよい。

次に、漏斗４０に採集された唾液と検体前処理液１００とを懸濁させる方法について説明する。図８（ｂ）は、漏斗４０と懸濁用チューブ２０とを漏斗の連結部４０３、懸濁用チューブの連結部２０２とを螺合させて、連結した状態を示した図である。被検者は、自身の唾液が採集された漏斗４０を検査者に渡してもよく、または、被検者自身により、漏斗４０に採集された自身の唾液を検体前処理液１００と懸濁させるために懸濁用チューブ２０に移す作業をするようにしてもよい。ただし、被検者自身が、漏斗４０に採集された自身の唾液を、検体前処理液１００と懸濁させるために懸濁用チューブ２０に移す作業ができるようにするためには、予め、懸濁用チューブ２０内に、採集された唾液と一定比率となる検体前処理液１００が注入されていることが望ましい。

前記のとおり懸濁用チューブ２０の内分には、簡易に計量できるようにするため円柱状部分の外周に目盛り（図８（ａ）および（ｂ）では２０３Ａ、２０３Ｂ、２０３Ｃ、２０３Ｄ）が付されている。この目盛りは、検体前処理液の注入量を示す目盛り（図８（ａ）および（ｂ）では２０３Ａ、２０３Ｃ）であってもよく、唾液と検体前処理液とを懸濁させた懸濁液の合計量を示す目盛り（図８（ａ）および（ｂ）では２０３Ｂ、２０３Ｄ）であってもよく、検体前処理液の注入量を示す目盛りと、唾液と検体前処理液とを懸濁させた懸濁液の合計量を示す目盛りの双方を付してもよい。

漏斗４０と懸濁用チューブ２０とを螺合させるときに、漏斗４０の下端の第２開口部４０４の内周は、懸濁用チューブ２０の上端の開口部２０１の外周よりもやや大きいため、シール４０５は破れるようになっている。このため、漏斗４０と懸濁用チューブ２０とを螺合させることにより、漏斗４０内に採集された唾液３０は、懸濁用チューブ２０内に注入され、検体前処理液１００と懸濁され、懸濁液１１０となる。

懸濁用チューブ内の目盛りは、前記のとおり、注入する検体前処理液が、採集した唾液に対して５：１ないし１０：１のいずれか一つに相当する量になるように付すか（図８（ａ）および（ｂ）では２０３Ａ、２０３Ｃ）、または、注入する検体前処理液１００の量を５ないし１０とした場合、１となる量の唾液とを合計した分量になるように付すことが最適である（図８（ａ）および（ｂ）では２０３Ｂ、２０３Ｄ）。但し、前者と後者の目盛り双方を付すようにしてもよい。例えば、１０００μＬとなる位置と１１００μＬとなる位置の双方に目盛りを付してもよい。

最後に、懸濁用チューブの上端部に螺合された漏斗４０を緩めて、漏斗４０を外して、懸濁用チューブ用のキャップ２１０を螺合し、懸濁用チューブ２０の上端を封止する。そして、懸濁用チューブの外周に病原体が付着している可能性があるため、図７に示すように、懸濁用チューブ２０（図７では、下端が逆円錐形状のものである）を、７０％以上のエタノールが予め注入された滅菌用容器７０に含浸させてもよい。以上により本発明の第二の実施形態に係る第２の唾液採取手段を使用しても、被検者自身によって簡易に唾液を採取することが可能であり、かつ、検体前処理液と唾液との比率を定量的にすることができる。

次に、本発明の第三の実施形態について説明する。本発明の第三の実施形態は、本発明の第一の実施形態と同じく、体液採取手段としてスワブ１０を使用するが、このスワブ１０の先端部から体液を採取しやすくするとともに、採取した体液の計量をより正確にするための実施形態である。

図１０（ａ）は、スワブ１０を示した図であり、図１（ａ）と同じ図である。図１０（ｂ）は、本発明の第三の実施形態に係る絞取容器の断面を示した図である。図１０（ｃ）は、第三の実施形態に係る懸濁用チューブ６０の断面を示した図である。

絞取容器５０及び懸濁用チューブ６０は、透過性のある中空の筒状体であり、可塑性のあるプラスチック素材により成形される。透過性があり、かつ可塑性のあるプラスチック素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニールなどでも良いが、本発明はこれに限定されるものではない。

絞取容器５０は、その上端に第１開口部５０３を有し、上端の側面にキャップ５１０と連結可能にするための第１連結部５０５その下側の内部に、絞り部５０１を有し、下端側には、目盛り５０２Ａ、５０２Ｂ、５０３Ｃおよび懸濁用チューブ６０との着脱が可能なように第２連結部５０６を有し、さらに、下端に第２開口部５０４を有し、その下端の第２開口部５０４を封止するシール５０７を有する。

第１連結部５０５は、キャップ５１０と連結し、内部を封止するためのものであり、図１０（ｂ）では、ネジ溝が設けられている。そして、キャップ５１０の内側にネジ溝が設けられてあり、第１連結部５０５とキャップ５１０が互いに螺合することで接合し、第１開口部を封止する。封止する方法または連結させる方法は、螺合して接合するものでなくともよく、例えば、図２（Ｃ）に示した懸濁用チューブ２０の上端から圧入するキャップ２１０を使用してもよい。

図１（ｂ）および（ｃ）に示したように、被検者自身がスワブ１０の先端部１０３を自分の口腔内に挿入し、飴をなめるようにして唾液を採取する。スワブ１０の先端部１０３を口腔内に挿入し、３０秒以上唾液を含浸させることが望ましい。

図１１（ａ）は、スワブ１０の先端部１３０を、絞取容器５０の内部において、絞り部５０１にワイプさせている状態を示した図である。絞取容器５０に対して上方向に移動させることによって、スワブ１０の先端部１３０を、絞取容器５０の前記絞り部５０１にワイプさせることが可能であり、スワブ１０の先端部１３０に含浸された唾液３０が絞取容器５０の下部に集積される。被検者自身または、検査者は、図１１（ａ）に示す絞り部５０１の側面から矢印の方向に指で押して、スワブ１０の先端部１３０に含浸された唾液を絞り取るようにしてもよい。

図１０（ｂ）および図１１（ａ）に示すように、絞取容器５０の下端は、略円柱の形状となっており、下端の第２開口部５０４がシール５０７で封止されている。そして絞取容器５０の下端の略円柱形状の外周には、唾液の採取量に応じた目盛り５０２Ａ、５０２Ｂ、５０３Ｃが付されている。この目盛り５０２Ａ、５０２Ｂ、５０３Ｃは、検体前処理液１００との比率を一定にするために、例えば、１００μＬ２００μＬ、３００μＬごとに目盛りを付するようにしてもよい。

被検者は、自身で、絞取容器５０の下端の外周に付された目盛り５０２Ａ、５０２Ｂ、５０３Ｃで確認しながら、絞取容器５０２の絞り部５０１にスワブ１０の先端部１３０を、数回、ワイプさせるように上下に動かすとともに、ワイプさせる際に、絞取容器５０の絞り部５０１の外側から、指で挟み、所定の目盛り５０２の位置に唾液が集積されるように、先端部１３０の唾液を絞り採るようにしてもよい。

唾液の量が不足した場合には、被検者は、再度、自分の口腔内に別の新たなスワブ１０の先端部１３０を入れて、唾液を先端部１３０に十分に含浸させ、絞取容器５０の下端の外周に付された目盛り５０２を確認しながら、絞取容器５０の絞り部５０１にスワブ１０の先端部１３０を数回、ワイプさせて、所定の目盛り５０２の位置に唾液が集積されるようしてもよい。

次に、被検者は、絞取容器５０の上端の第１連結部５０５にキャップ５１０を螺合させて、第１開口部５０３を封止する。被検者は、この段階で、一度、絞取容器５０の外周に病原体が付着している可能性があるため、図７に示すようにエタノールが７０％以上含有された滅菌用容器７０に、絞取容器５０ごと含浸させてもよい（なお、図７は、懸濁用チューブ２０をエタノールに含浸させた図であるが、懸濁用チューブ２０を絞取容器５０と置き換えてもよい）。

次に、絞取容器５０に採集された唾液と検体前処理液１００とを懸濁させる方法について説明する。被検者は、自身の唾液が採集された絞取容器５０を検査者に渡してもよく、または、被検者自身により、絞取容器５０に採集された自身の唾液を検体前処理液と懸濁させるために懸濁用チューブ６０に移す作業をするようにしてもよい。ただし、被検者自身が、絞取容器に採集された自身の唾液を、検体前処理液と懸濁させるために懸濁用チューブ６０に移す作業ができるようにするためには、予め、懸濁用チューブ６０内に、採集された唾液と一定比率となる検体前処理液１００が注入されていることが望ましい。

図１０（ｃ）に示すように、懸濁用チューブ６０は、上端に、開口部６０１を有し、上端の外周には、絞取容器５０の第２連結部（ネジ溝）５０６と螺合させる連結部（ネジ溝）６０２を有し、その下部には、フランジ６０３が形成され、絞取容器５０の下端の側面がこのフランジ６０３と当接する。このフランジ６０３は、図示しないが、懸濁用チューブ６０を一時的に載置するチューブラックのような収納棚の穴の上部に掛けるために使用してもよい。

懸濁用チューブ６０のフランジ６０３より下の部分には、簡易に計量できるようにするため円柱状であることが望ましいが、図２（ｃ）に示すように、下端が逆円錐形状であってもよいことは前記したとおりである。図１０（ｃ）に示すように、懸濁用チューブ６０には、目盛り６０４Ａ、６０４Ｂ、６０４Ｃ、６０４Ｄが付されている。検体前処理液１００の注入量を示す目盛り６０４Ａ、６０４Ｃと、唾液と検体前処理液とを懸濁させた懸濁液の合計量を示す目盛り６０４Ｂ、６０４Ｄの双方を付してもよい。

図１１（ｂ）は、絞取容器５０と懸濁用チューブ６０とを連結させた状態を示す図である。絞取容器５０の下端の第２連結部５０６と懸濁用チューブ６０の上端の連結部６０２とを螺合させるときに、絞取容器５０の下端の内周は、懸濁用チューブ６０の上端の外周よりも大きいため、絞取容器５０の第２開口部５０４を封止しているシール５０７が破れるようになっている。このため、絞取容器５０と懸濁用チューブ６０とを螺合させることにより、絞取容器５０内に採集された唾液３０は、懸濁用チューブ６０内に注入されて、懸濁用チューブ６０に予め注入された検体前処理液１００と懸濁され、懸濁液１１０になる。なお、検体は、唾液以外の喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、血液などでもよいことは前述したとおりである。

最後に、図１１（ｂ）のように絞取容器５０と懸濁用チューブ６０とを連結させた状態で、図７に示す７０％以上のエタノールが予め注入された滅菌容器に挿入し、仮に、外周に病原体が付着していた場合、その病原体を不活性化させる。

図示しないが、懸濁液１１０が混合された後に、絞取容器５０を外し、代わりに、懸濁用チューブ６０のネジ溝６０２に螺合することができる接続部を備えたグラスフィルター付きのカラムを取り付けて、逆さまにし、懸濁液１１０をグラスフィルター付きのカラムに移した後に、懸濁用チューブ６０を取り外して、図５に示したような懸濁液１１０の洗浄処理、ＲＮＡ溶出処理をすることができるようにしてもよい。

以上の本発明の第三の実施形態によれば、被検者自身によって簡易に体液を採取することが可能であり、かつ、検体前処理液と体液との比率をより正確に定量的にすることができる。また、前処理懸濁液によって病原体が不活性化しており、かつ容器の外周の病原体も不活性化しているので、次の工程においては、バイオセイフティーのレベルを下げることが可能となる。

以上、本発明の第一の実施形態ないし第三の実施形態の例を詳細に説明した。ただし、上記説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定する趣旨で記載されたものではない。本発明には、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るものを含み得る。また、本発明にはその等価物が含まれる。

１０ スワブ
１０１ 把持部
１０２ 軸部
１０３ 先端部
２０ 懸濁用チューブ
２０１ 開口部
２０２ 連結部
２０３Ａ、２０３Ｂ、２０３Ｃ、２０３Ｄ、２０３Ｅ 目盛り
２０４、２０５ キャップ
３０ 唾液
４０ 漏斗
４０１ 第１開口部
４０２Ａ、４０２Ｂ、４０３Ｃ、４０３Ｄ 目盛り
４０３ 連結部
４０４ 第２開口部
４０５ シール
４０６ キャップ
５０ 絞取容器
５０１ 絞り部
５０２Ａ、５０２Ｂ、５０２Ｃ 目盛り
５０３ 第１開口部
５０４ 第２開口部
５０５ 第１連結部
５０６ 第２連結部
５０７ シール
５１０ キャップ
６０ 懸濁用チューブ
６０１ 開口部
６０２ 連結部
６０３ フランジ
６０４Ａ、６０４Ｂ、６０４Ｃ、６０４Ｄ 目盛り
７０ 滅菌用容器
７０１ エタノール
８０１ グラスフィルター付きカラム
８０２、８０３ チューブ
１００ 検体前処理液
１１０ 懸濁液

Claims (18)

1. 被検者自身で採取可能な体液を採取する体液採取手段と、
   被検者の体液からウイルスを溶解し核酸を抽出する検体前処理液と、
   前記体液と、前記検体前処理液とを懸濁するための懸濁用チューブと、
   前記懸濁用チューブを封止するキャップと、
   前記懸濁用チューブを封止した後に、前記懸濁用チューブを把持した手と前記懸濁用チューブの外側とを消毒する消毒手段と
   を備え、
   前記懸濁用チューブは、検体前処理液を検量する目盛りと体液を検量する目盛りと、上端に連結部とを備えることを特徴とする核酸抽出キット
2. 前記懸濁用チューブが、透過性があり、かつ、可塑性のあるプラスチック素材で形成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出キット。
3. 前記消毒手段が、ウイルスを不活性化させる試薬が予め注入された消毒用容器を備え、
   前記消毒用容器は、前記懸濁用チューブを把持した手と前記懸濁用チューブの外側とを挿入することができる開口部を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出キット。
4. カラムをさらに備え、
   前記カラムは、前記懸濁用チューブと着脱可能な連結部と、グラスフィルターと、前記連結部の反対側にノズルを備えることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
5. 前記検体前処理液が、下記（１）から（６）の成分から選択される少なくとも４つ以上の成分を含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
   （１）タンパク質変性剤
   （２）イオン性界面活性剤
   （３）非イオン性界面活性剤
   （４）エタノール
   （５）還元剤
   （６）緩衝剤
6. 前記タンパク質変性剤が、グアニジウム塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、尿素の何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出キット。
7. 前記イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミドの何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項５または６に記載の核酸抽出キット。
8. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの何れか１つ、またはこれらの任意の組合せを含むことを特徴とする請求項５ないし７のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
9. 前記還元剤が、ジチオトレイトール、２－メルカプトエタノールの何れか１つ、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項５ないし８のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
10. 前記緩衝剤が、トリス塩酸緩衝液であることを特徴とする請求項５ないし９のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
11. 前記体液採取手段がスワブであり、
    前記スワブは、把持部と、軸部と、体液を採取するための先端部とから構成され、
    前記軸部の上端に、前記把持部を有し、
    前記軸部の下端に、前記先端部を有することを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
12. 前記スワブが、前期懸濁用チューブを封止するための前記キャップの内側上面に前記スワブの軸部の上端が結合することにより、前記キャップと一体に形成されたことを特徴とする請求項１１に記載の核酸抽出キット。
13. 前記体液採取手段が、前記スワブと絞取容器とから構成され、
    前記絞取容器は、透過性のある中空の筒状体であり、可塑性のあるプラスチック素材により成形され、
    上端に第１の開口部と開口部を封止するキャップと、上端側の外周に前記キャップとの着脱可能な第１の連結部と、下端側に目盛りおよび前記懸濁用チューブとの着脱可能な連結部と、下端に開口部と、前記開口部を封止するシールとを備えることを特徴とする請求項１１または１２に記載の核酸抽出キット。
14. 前記絞取容器の内側に絞り部をさらに備え、
    前記スワブの前記先端部が、前記絞取容器の内部において、前記絞り部を複数回貫通するように上下方向に移動させることによって、前記絞り部により前記先端部が絞られ、体液が前記絞取容器の下端に集積されることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
15. 前記体液採取手段が、漏斗であり、
    前記漏斗は、透過性があり、上端に開口部と、下端側に前記懸濁用チューブとの着脱可能な連結部と、目盛りと、下端に開口部と、前記開口部を封止するシールとを備えて、
    前記体液が前記漏斗の下端に集積されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
16. 前記漏斗が、非検査対象物を濾し取るフィルターを備えることを特徴とする請求項１５に記載の核酸抽出キット。
17. 検査対象の体液が、唾液、喀痰、尿、汗、精液、子宮頚管粘液、膣分泌液、血液のいずれか一つとすることを特徴とする核酸抽出キット。
18. 前記体液採取手段により採取される検体が唾液であって、唾液と前記検体前処理液との比率が１対５ないし１対１０の何れか一の容量割合となるよう混合されることを特徴とする請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の核酸抽出キット。
    
    
    
    

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