JP2022015622A

JP2022015622A - 皮膚の老化防止用組成物

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Publication number: JP2022015622A
Application number: JP2020118576A
Authority: JP
Inventors: 憲己岡田; Noriki Okada
Original assignee: APA Corp
Current assignee: APA Corp
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2022-01-21

Abstract

【課題】従来よりも、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善することが可能な、皮膚の老化防止用組成物を提供することを目的とする。【解決手段】皮膚の老化防止用組成物は、珪素を含有している。皮膚の老化防止用組成物の総質量に基づく珪素の含有量は、０．００５質量％以上１００質量％未満である。また、皮膚の老化防止用組成物の総質量に基づく珪素の含有量は、０．０５質量％以上１００質量％未満であってもよい。皮膚の老化防止用組成物は医薬品又は飲食品に含有されてもよい。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り株式会社ＡＰＡコーポレーションは、京急第２ビルで令和１年９月２９日に開催されたＡＰＡコーポレーション販社会議において、本願発明に係る皮膚の老化防止用組成物を公開した。

本発明は、皮膚の老化防止用組成物に関する。

現代における美容意識の高まりに伴い、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善する老化防止化粧料が、種々提案されている。
このような老化防止化粧料として、例えば特許文献１に、ハイビスカス抽出物が開示されている。ハイビスカス抽出物は、線維芽細胞の増殖を活性化させ、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善する可能性があると考えられている。

特開平９－２９５９２８号公報

単に線維芽細胞の増殖を活性化させるのみでは、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を十分に改善することができない虞がある。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、従来よりも、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善することが可能な、皮膚の老化防止用組成物を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、
珪素を含有しており、
前記珪素の含有量が、０．００５質量％以上１００質量％未満である。

例えば、前記珪素の含有量が、０．０５質量％以上１００質量％未満であってもよい。

本発明によれば、従来よりも、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善することが可能な、皮膚の老化防止用組成物を提供することが可能になる。

珪素のエラスターゼ阻害活性を示すグラフである。（ａ）は、珪素がシワに及ぼす影響を示すグラフであり、（ｂ）は、レプリカのシワの画像である。皮膚の水分蒸散に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。ヒアルロン酸産生に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。コラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。 β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。トラングルタミナーゼ１遺伝子（ＴＧＭ１）の発現に珪素が及ぼす影響を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態に係る皮膚の老化防止用組成物について説明する。

本発明の皮膚の老化防止用組成物は、珪素を含有している。

珪素は、非晶質珪素であり、例えば、食物由来の珪素や、鉱物由来の珪素が挙げられる。
食物由来の珪素としては、穀類、野菜類、海藻類などに含まれる珪素が挙げられる。
穀類としては、例えば、麦、玄米、白米、トウモロコシである。
野菜類としては、例えば、ゴボウ、大根、人参である。
海藻類としては、例えば、昆布、ワカメである。
穀類、野菜類、海藻類などの食物は、粉砕された状態で、本発明の皮膚の老化防止用組成物に含有されていてもよい。

鉱物由来の珪素としては、水晶から抽出した珪素が挙げられる。

また、珪素は、市販の珪素であってもよく、例えば、株式会社ＡＰＡコーポレーションから販売されている水溶性珪素「ｕｍｏ（登録商標）」に含まれている珪素が挙げられる。

また、珪素は、単体の珪素であってもよいし、例えば二酸化珪素のように化合物中の珪素であってもよい。

そして、本発明の皮膚の老化防止用組成物の総重量に基づく珪素の含有量は、０．００５質量％以上１００質量％未満である。
そして、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、ヒトの皮膚に塗布又はヒトに飲用されると、皮膚や腸管から吸収されて、皮膚のシワやハリ等を改善すると考えられる。

具体的には、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、皮膚や腸管から吸収されると、以下の実施例で説明する通り、エラスターゼ活性率の低下作用、ヒアルロン酸の産出率の増加作用、及びコラーゲン分解の抑制作用などを生じさせると考えられる。
ここで、これらの作用は皮膚のシワやハリ等を改善する作用であるが、従来のハイビスカス抽出物が単に繊維芽細胞の増殖を活性化させる作用は、皮膚のシワやハリ等を改善する可能性を単に示唆するものであると考えられる。
その為、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、従来のハイビスカス抽出物よりも、皮膚のシワや、皮膚のハリ等を改善することが可能であると考えられる。
なお、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、ヒトの皮膚のシワやハリ等を改善するとともに、以下の実施例で説明する通り、大腸菌やレジオネラ菌を静菌させる。

また、本発明の皮膚の老化防止用組成物の総質量に基づく珪素の含有量は、０．０５質量％以上１００質量％未満であることが好ましい。
これにより、本発明の皮膚の老化防止用組成物をヒトの皮膚に塗布又はヒトが飲用した際に、皮膚のシワやハリを一層改善することが可能になると考えられる。
なお、本発明の皮膚の老化防止用組成物の総質量に基づく珪素の含有量について、好ましいのは０．０５質量％以上１００質量％未満であるから、例えば０．１質量％、０．５質量％、１．０質量％、５．０質量％、１０質量％、１５質量％、２０質量％、２５質量％、３０質量％、３５質量％、４０質量％、４５質量％、５０質量％、５５質量％、６０質量％、６５質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％、及び９５質量％が含まれる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。

例えば、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、必要に応じて、皮膚のシワやハリ等を改善する抗酸化作用を奏する成分を含んでいてもよい。
このような抗酸化作用を奏する成分としては、特に限定されないが、例えば、γ－オリザノール、アルファリポ酸、カテキン類、フラボノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＣ、ビタミンＥ、アルファカロテン、ベータカロテン、エンゾジノール、ローヤルゼリー、尿酸、クエン酸等を挙げることができる。
本発明の皮膚の老化防止用組成物は、必要に応じて、これらの抗酸化作用を奏する成分の少なくとも１つ以上を含有してもよい。

そして、本発明の皮膚の老化防止用組成物に、上記のγ－オリザノール、アルファリポ酸、カテキン類、フラボノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＣ、ビタミンＥ、アルファカロテン、ベータカロテン、エンゾジノール、ローヤルゼリー、尿酸、クエン酸等を含有させる場合、それらの含有量は、特に限定されない。

また、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、必要に応じて、賦形剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、コーティング剤、着色剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤等を含有してもよい。

また、本発明の皮膚の老化防止用組成物は、医薬品又は飲食品に含まれていてもよい。

医薬品に含まれる場合は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体とともに、錠剤、カプセル剤、液剤、粉末剤、ペースト状剤、ゲル状剤等の形態で人体に投与される。

飲食品は、飲料品又は食料品を意味し、特に限定されないが、例えば、果汁飲料、清涼飲料、コーヒー、野菜ジュース、茶、コーヒー、シロップ、食酢、味噌、果物、野菜、穀物、肉、乳製品、菓子、麺、ゼリー、栄養補助食品、機能性食品、健康食品等が挙げられる。

次に、本発明の皮膚の老化防止用組成物について、実施例により説明する。
なお、以下の実施例では、本発明の皮膚の老化防止用組成物に含有される珪素として、株式会社ＡＰＡコーポレーションから販売されている水溶性珪素「ｕｍｏ（登録商標）」に含まれている珪素を使用した。

［珪素のエラスターゼ阻害活性］
（実施例１）
まず、水溶性珪素「ｕｍｏ」に超純水（ＣＡＳＮｏ．７７３２－１８－５，Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を添加して混合し、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である被験物質を用時調製した。
次に、５０μＬの当該被験物質が入った９６ウェルプレートに、５０μＬの１．２５μｇ／ｍＬエラスターゼ酵素（ＣＡＳＮｏ．３９４４５－２１－１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）溶液及び１００μＬのＮ－Ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（ＣＡＳＮｏ．５２２９９－１４－６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）溶液を添加し、２７０ｒｐｍで３０秒間振とうして、その後３７℃で１５分間培養した。
その後、この９６ウェルプレートを２７０ｒｐｍで１０秒間振とうし、ウェル内の色素を均一に分散させて、マイクロプレートリーダーにより４１５ｎｍの吸光度（ＯＤ_４１５）を測定した。
なお、この吸光度（ＯＤ_４１５）を用いた、珪素のエラスターゼ阻害活性の算出方法は、後述する。

（実施例２）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３０質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例１と同様にして、吸光度（ＯＤ_４１５）を測定した。

（実施例３）
水溶性珪素「ｕｍｏ」に超純水を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして、吸光度（ＯＤ_４１５）を測定した。なお、この実施例での被験物質は、濃度が１００％である水溶性珪素「ｕｍｏ」である。

（比較例１）
水溶性珪素「ｕｍｏ」を使用せず、超純水をそのまま用いたこと以外は、実施例１と同様にして、吸光度（ＯＤ_４１５）を測定した。なお、この比較例は対照実験であり、対照として超純水が用いられた。

そして、実施例１～３及び比較例１で測定された吸光度（ＯＤ_４１５）を用いて、実施例１～３の各々の珪素のエラスターゼ活性率を、次式で算出した。
エラスターゼ活性率（％）＝（Ｓ－ＳＢ）×１００／（Ｃ－ＣＢ）
ここで、Ｓは実施例１～３で測定された被験物質の吸光度、ＳＢは実施例１～３における被験物質のブランクの吸光度、Ｃは比較例１で測定された対照の吸光度、ＣＢは比較例１における対照のブランクの吸光度である。なお、ブランクでは、エラスターゼ酵素の代わりに０．０５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｂｕｆｆｅｒを用いた。

［珪素がシワに及ぼす影響］
（実施例４）
皮膚のレプリカに水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布した後における、皮膚のレプリカのシワの面積を測定した。

（比較例２）
皮膚のレプリカに水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布する前における、皮膚のレプリカのシワの面積を測定した。

［皮膚の水分蒸散に珪素が及ぼす影響］
（実施例５）
まず、ヒトの皮膚の水分蒸散量を測定した。
次に、ヒトの皮膚に水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布し、３０分後、１時間後及び２時間後における皮膚の水分蒸散量を測定した。

（比較例３）
まず、ヒトの皮膚の水分蒸散量を測定した。
次に、ヒトの皮膚に水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布することなく、３０分後、１時間後及び２時間後における皮膚の水分蒸散量を測定した。

［ヒアルロン酸産生に珪素が及ぼす影響］
（実施例６）
水溶性珪素「ｕｍｏ」を蒸留水に添加して混合し、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％である水溶液を作製した。そして、この水溶液を、線維芽細胞を含む培地に添加し、ヒアルロン酸の産生率を測定した。この測定は、３回行った。

（実施例７）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％である水溶液を作製したこと以外は、実施例６と同様にして、ヒアルロン酸の産生率を測定した。

（実施例８）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％である水溶液を作製したこと以外は、実施例６と同様にして、ヒアルロン酸の産生率を測定した。

（比較例４）
蒸留水を、水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されることなく、線維芽細胞を含む培地に添加したこと以外は、実施例６と同様にして、ヒアルロン酸の産生率を測定した。なお、この測定値を対照とした。

［コラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例９）
まず、水溶性珪素「ｕｍｏ」を精製水に添加して混合し、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％である被験物質を用時調製した。
次に、３５ｍｍディッシュに５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬのＮＢ１ＲＧＢ細胞（ＲＩＫＥＮＢＲＣ，Ｊａｐａｎ）を播種し、ＣＯ_２インキュベータ（ＣＯ_２濃度５％、３７℃）内で２４時間培養した。その後、培地を除去し、上記用時調製した被験物質を含有する培地を加え、ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。

そして、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＣａｔＮｏ．１２１８３０１８Ａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、以下で述べるＲＮＡ抽出・精製を行った。
具体的には、２４時間培養後の培地を除去し、３５ｍｍディッシュを、３７℃に加温した２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。そして、さらに６００μＬの２ＭＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＣＡＳＮｏ．２７５６５－４１－９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）含有ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを添加して細胞を溶解させて、ライセートを回収した。
そして、そのライセート中に存在する細胞を、Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＣａｔＮｏ．１２１８３－０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）により破砕した。
そして、その細胞破砕液に、６００μＬの７０％エタノール（ＣＡＳＮｏ．６４－１７－５，Ｊａｐａｎａｌｃｏｈｏｌ，Ｊａｐａｎ）溶液を加え、シリカメンブレン付きカラムに移した。そして、１２０００×ｇ及び室温で、１秒間遠心した。そして、ろ液を廃棄した。
そして、シリカメンブレンに、７００μＬのグアニジンイソチオシアネート含有ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒＩ及び５００μＬのエタノール含有ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒＩＩを添加し、洗浄した。
そして、１２０００×ｇ及び室温で、１５秒間遠心した後、乾燥させた。
そして、ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＷａｔｅｒを３０μＬ添加し、室温で１分間静置し、１２０００×ｇ及び室温において１５秒間遠心した。この操作を２回行い、シリカメンブレンからＲＮＡを溶出させた。
そして、そのＲＮＡの一部を、ＵＶ透過性９６ウェルプレート (ＣａｔＮｏ．８４０４，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に分取し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡＢｕｆｆｅｒ (ＴＥ (ｐＨ８．０)，ＣａｔＮｏ．３１０－９００２３，ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ，Ｊａｐａｎ) により２５倍希釈し、マイクロプレートリーダー (ＳＰＡＲＫ（登録商標）１０ＭＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ) を用いて２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ_２３０，ＯＤ_２６０及びＯＤ_２８０）を測定した。
そして、被験物質のＲＮＡ濃度を次式により計算し、ＴＥＢｕｆｆｅｒにより希釈し、ＲＮＡの濃度を１０μｇ／ｍＬに調製した。
ＲＮＡ濃度(μｇ／ｍＬ) ＝Ａ×Ｋ×０．３×１０（希釈倍率）
ここで、Ａは被験物質のＯＤ_２６０であり、Ｋ＝４０（ＲＮＡの吸光係数）であり、ｌ＝０．３（光路長（ｃｍ））である。

次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＶＶＩＬＯＴＭＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈｅｚＤＮａｓｅ (ＣａｔＮＯ．１１７６６０５０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ) により、ＲＮＡの逆転写を行った。
具体的には、８連チューブ (ＡＢ１１８２, Ｔｈｅｒｍｏ Sｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ) に、１ウェルあたり１μＬの１０×ｅｚＤＮａｓｅＢｕｆｆｅｒ、１μＬのｅｚＤＮａｓｅｅｎｚｙｍｅ、６μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅＷａｔｅｒ及び２μＬの１０μｇ／ｍＬＲＮＡを加え、それを３７℃で２分間培養した。
そして、２分後、８連チューブに、１ウェルあたり４μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＶＶＩＬＯＴＭＭａｓｔｅｒＭｉｘ及び６μＬＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅＷａｔｅｒを添加し、リアルタイムＰＣＲ (ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３, ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ) を用いて、２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、及び８５℃で５分間加熱し、ｃＤＮＡを合成した。
そして、ＰＣＲプレート (ＣａｔＮｏ．８０１０５６０，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に、１ウェルあたり１０μＬＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＣａｔＮｏ．４４４４５５７，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、１μＬのＴａｑｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｒ、７μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅＴＭＤｉｓｔｉｌｌｅｄＷａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣａｔＮｏ．１０９７７－１５，ＵＳＡ）及び２μＬのｃＤＮＡを加え、プレートシール(ＣａｔＮｏ．４３６０９５４，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で密封した。
そして、プレート遠心機で溶液をスピンダウンし、起泡を除去した。
そして、リアルタイムＰＣＲシステムによりＲｅａｌ－ＴｉｍｅｑＰＣＲを行い、被験物質における各遺伝子の蛍光シグナルが任意の閾値に達する時のサイクル数であるＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出した。そして、内部標準遺伝子によりＣｔ値を補正し、ΔＣｔ値とした。そして、後述する対照のΔＣｔ値の平均によりΔＣｔ値を補正し、これをΔΔＣｔ値とした。ΔΔＣｔによって１サイクルあたりの検出の差で２倍量の差となると仮定し、２^{－ΔΔＣｔ}に代入して対照の遺伝子発現量を１とした場合の被験物質の遺伝子（ＭＭＰ１）発現量を求めた。被験物質の遺伝子（ＭＭＰ１）発現量を、対応のあるｔ検定で有意差検定を行った。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。

（実施例１０）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例９と同様にして、ＭＭＰ１の発現量を測定した。

（比較例５）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例９と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照には精製水が用いられた。

［ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例１１）
実施例９と同一の操作を行い、ＨＡＳ２の発現量を測定した。

（実施例１２）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である水溶液を用時調製したこと以外は、実施例１１と同様にして、ＨＡＳ２の発現量を測定した。

（実施例１３）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１０質量％である水溶液を用時調製したこと以外は、実施例１１と同様にして、ＨＡＳ２の発現量を測定した。

（比較例６）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例１１と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照に精製水が用いられた。

［ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例１４）
まず、水溶性珪素「ｕｍｏ」を精製水に添加して混合し、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％である被験物質を用時調製した。
次に、３５ｍｍディッシュに１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬのＨａＣａＴ細胞を播種し、ＣＯ_２インキュベータ（ＣＯ_２濃度５％、３７℃）内で２４時間培養した。その後、培地を除去し、上記用時調製した被験物質を含有する培地を加え、ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。

そして、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＣａｔＮｏ．１２１８３０１８Ａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＮＡ抽出・精製を行った。
具体的には、２４時間培養後の培地を除去し、３５ｍｍディッシュを、３７℃に加温した２ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。そして、さらに６００μＬの２ＭＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＣＡＳＮｏ．２７５６５－４１－９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）含有ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒを添加して細胞を溶解させて、ライセートを回収した。
そして、そのライセート中に存在する細胞を、Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＣａｔＮｏ．１２１８３－０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）により破砕した。
そして、その細胞破砕液に、６００μＬの７０％エタノール（ＣＡＳＮｏ．６４－１７－５，Ｊａｐａｎａｌｃｏｈｏｌ，Ｊａｐａｎ）溶液を加え、シリカメンブレン付きカラムに移した。そして、１２０００×ｇ及び室温で、１５秒間遠心した。そして、ろ液を廃棄した。
そして、シリカメンブレンに７００μＬのグアニジンイソチオシアネート含有ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒＩ及び５００μＬのエタノール含有ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒＩＩを添加し、洗浄した。
そして、１２０００×ｇ及び室温で、１５秒間遠心した後、乾燥させた。
そして、ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＷａｔｅｒを３０μＬ添加し、室温で１分間静置した後、１２０００×ｇ及び室温で、１５秒間遠心した。この操作を２回行い、シリカメンブレンからＲＮＡを溶出させた。
そして、そのＲＮＡの一部を、ＵＶ透過性９６ウェルプレート (ＣａｔＮｏ．８４０４，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に分取し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡＢｕｆｆｅｒ (ＴＥ (ｐＨ８．０)，ＣａｔＮｏ．３１０－９００２３，ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ，Ｊａｐａｎ) で１０倍希釈し、マイクロプレートリーダー (ＳＰＡＲＫ（登録商標）１０ＭＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ) で２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ_２３０，ＯＤ_２６０及びＯＤ_２８０）を測定した。
ＯＤ_２６０を用いて被験物質のＲＮＡ濃度を次式により計算し、ＴＥＢｕｆｆｅｒにより希釈し、ＲＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬに調製した。
ＲＮＡ濃度(μｇ／ｍＬ) ＝Ａ×Ｋ×０．３×１０（希釈倍率）
ここで、Ａは被験物質のＯＤ_２６０であり、Ｋ＝４０（ＲＮＡの吸光係数）であり、ｌ＝０．３（光路長（ｃｍ））である。

次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＶＶＩＬＯＴＭＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈｅｚＤＮａｓｅ (ＣａｔＮＯ．１１７６６０５０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ) により、ＲＮＡの逆転写を行った。
具体的には、８連チューブ (ＡＢ１１８２, Ｔｈｅｒｍｏ Sｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ) に、１ウェルあたり１μＬの１０×ｅｚＤＮａｓｅＢｕｆｆｅｒ、１μＬのｅｚＤＮａｓｅｅｎｚｙｍｅ、６μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅＷａｔｅｒ及び２μＬの１０μｇ／ｍＬＲＮＡを加えた。そして、３７℃で２分間培養した。
そして、２分後、８連チューブに、１ウェルあたり４μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＶＶＩＬＯＴＭＭａｓｔｅｒＭｉｘ及び６μＬＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅＷａｔｅｒを添加し、リアルタイムＰＣＲ (ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３, ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ) で、２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、及び８５℃で５分間加熱し、ｃＤＮＡを合成した。
そして、ＰＣＲプレート (ＣａｔＮｏ．８０１０５６０，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に、１ウェルあたり１０μＬＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＣａｔＮｏ．４４４４５５７，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、１μＬのＴａｑｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｒ、７μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅＴＭＤｉｓｔｉｌｌｅｄＷａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣａｔＮｏ．１０９７７－１５，ＵＳＡ）及び２μＬのｃＤＮＡを加え、プレートシール(ＣａｔＮｏ．４３６０９５４，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で密封した。
そして、プレート遠心機で溶液をスピンダウンし、起泡を除去した。
そして、リアルタイムＰＣＲシステムでＲｅａｌ－ＴｉｍｅｑＰＣＲを行って、被験物質における各遺伝子の蛍光シグナルが任意の閾値に達する時のサイクル数であるＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出した。そして、内部標準遺伝子によりＣｔ値を補正して、これをΔＣｔ値とした。後述する対照のΔＣｔ値の平均によりΔＣｔ値を補正し、これをΔΔＣｔ値とした。そして、ΔΔＣｔによって１サイクルあたりの検出の差で２倍量の差となると仮定して、２^{－ΔΔＣｔ}に代入し、対照の遺伝子発現量を１とした場合の被験物質の遺伝子（ＨＡＳ３）発現量を求めた。被験物質の遺伝子（ＨＡＳ３）発現量を、対応のあるｔ検定で有意差検定を行った。検定はいずれも両側で有意水準を５％未満とした（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。

（実施例１５）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例１４と同様にして、ＨＡＳ３の発現量を測定した。

（実施例１６）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１０質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例１４と同様にして、ＨＡＳ３の発現量を測定した。

（比較例７）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例１４と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照として精製水が用いられた。

［β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例１７）
実施例１４と同様の操作を行い、ＧＢＡの発現量を測定した。

（実施例１８）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例１７と同様にして、ＧＢＡの発現量を測定した。

（実施例１９）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１０質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例１７と同様にして、ＧＢＡの発現量を測定した。

（比較例８）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例１７と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照に精製水が用いられた。

［プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例２０）
実施例１４と同様の操作を行い、ＦＬＧの発現量を測定した。

（実施例２１）
水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３質量％である被験物質を用時調製したこと以外は、実施例２０と同様にして、ＦＬＧの発現量を測定した。

（比較例９）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例２０と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照に精製水が用いられた。

［トラングルタミナーゼ１遺伝子（ＴＧＭ１）の発現に珪素が及ぼす影響］
（実施例２２）
実施例１４と同様の操作を行い、ＴＧＭ１の発現量を測定した。

（比較例１０）
水溶性珪素「ｕｍｏ」が添加されなかったこと以外は、実施例２２と同様にして、ΔＣｔ値を測定した。なお、この測定値を対照とした。つまり、この比較例は対照実験であり、対照に精製水が用いられた。

［珪素の静菌作用］
（実施例２３）
水溶性珪素「ｕｍｏ」を蒸留水に添加して混合し、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％の水溶液を作製した。そして、この水溶液に、６．０×１０^５個の大腸菌を接種し、６０分後に大腸菌の数を確認した。

（比較例１１）
蒸留水に、６．０×１０^５個の大腸菌を接種し、６０分後に大腸菌の数を確認した。

（実施例２４）
水溶性珪素「ｕｍｏ」にｐＨ調整剤を添加し、水溶性珪素「ｕｍｏ」のｐＨを３．５とした。そして、この水溶性珪素「ｕｍｏ」に５．６×１０^５個の大腸菌を接種し、６０分後に大腸菌の数を確認した。

（比較例１２）
蒸留水に、５．６×１０^５個の大腸菌を接種し、６０分後に大腸菌の数を確認した。

（実施例２５）
水溶性珪素「ｕｍｏ」にｐＨ調整剤を添加し、水溶性珪素「ｕｍｏ」のｐＨを３．５とした。そして、この水溶性珪素「ｕｍｏ」に３．０×１０^６個のレジオネラ菌を接種し、６０分後にレジオネラ菌の数を確認した。

（比較例１３）
蒸留水に、３．０×１０^６個のレジオネラ菌を接種し、６０分後にレジオネラ菌の数を確認した。

得られた結果について、以下で説明する。

表１及び図１は、実施例１～３及び比較例１の実験結果を示し、珪素のエラスターゼ活性率の測定結果を示す。
具体的には、表１及び図１は、対照のエラスターゼ活性率を１００％とした場合の被験物質のエラスターゼ活性率の平均及び標準偏差を示す。

表１及び図１に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ（ウモ）」の濃度が３質量％となる被験物質を用いた場合（実施例１に対応）、エラスターゼ活性率の平均値は５７．８％であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が３０質量％となる被験物質を用いた場合（実施例２に対応）、エラスターゼ活性率の平均値は４６．０％であった。さらに、水溶性珪素「ｕｍｏ」に超純水を添加せず、濃度が１００％である水溶性珪素「ｕｍｏ」を用いた場合（実施例３に対応）、エラスターゼ活性率の平均値は４１．３％であった。
この結果から、珪素がエラスターゼの活性を阻害することが確認された。

表２及び図２は、実施例４及び比較例２の実験結果を示し、水溶性珪素「ｕｍｏ」を皮膚のレプリカに塗布した場合の、皮膚のシワの面積の変化を示す。

※原液にて試験

表２及び図２に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布した後の方が、水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布する前と比較して、皮膚におけるシワの面積が減少した。

表３及び図３は、実施例５及び比較例３の実験結果を示し、ヒトの皮膚に水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布した場合の、皮膚の水分蒸散量の変化を示す。

※原液にて試験

表３及び図３に示す通り、皮膚に水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布した場合の方が、皮膚に水溶性珪素「ｕｍｏ」を塗布しなかった場合と比較して、全ての時間において皮膚からの水分蒸散量が減少した。

表４及び図４は、実施例６～８及び比較例４の実験結果を示し、水溶性珪素「ｕｍｏ」が線維芽細胞を含む培地に添加された場合の、ヒアルロン酸の産生率の変化を示す。
具体的には、表４及び図４は、比較例４で測定された対照のヒアルロン酸の産生率を１００％とした場合の、珪素のエラスターゼ活性率の平均及び標準偏差を示す。

表４及び図４に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％である水溶液を培地に添加した場合（実施例６に対応）、ヒアルロン酸の産生率の平均値は、１２４．３％であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％の水溶液を培地に添加した場合（実施例７に対応）、ヒアルロン酸の産生率の平均値は、１１３．６％であった。さらに、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％の水溶液を培地に添加した場合（実施例８に対応）、ヒアルロン酸の産生率の平均値は、１０７．０％であった。
この結果から、珪素がヒアルロン酸の産生率を増加させることが確認された。

表５及び図５は、実施例９及び１０並びに比較例５の実験結果を示し、コラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現量の変化を示す。
具体的には、表５及び図５は、比較例５で測定された対照のコラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現量を１．００±０．０４とした場合の、実施例９及び１０で測定されたＭＭＰ１の発現量の平均及び標準偏差を示す。

表５及び図５に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％となる場合（実施例９に対応）、コラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現量の平均値は、０．９２±０．０４であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０３質量％となる場合（実施例１０に対応）、コラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現量の平均値は、０．８９±０．０４であった。この結果から、珪素がコラーゲン分解酵素１遺伝子（ＭＭＰ１）の発現量を減少させることが確認された。

表６及び図６は、実施例１１～１３及び比較例６の実験結果を示し、ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量の変化を示す。
具体的には、表６及び図６は、比較例６で測定された対照のヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量を１．００±０．０３とした場合の、実施例１１～１３で測定されたＨＡＳ２の平均及び標準偏差を示す。

表６及び図６に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％となる場合（実施例１１に対応）、ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量の平均値は、１．１２±０．０６であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０３質量％となる場合（実施例１２に対応）、ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量の平均値は、１．１１±０．０２であった。さらに、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％となる場合（実施例１３に対応）、ヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量の平均値は、１．３３±０．０６であった。
この結果から、珪素がヒアルロン酸産生酵素２遺伝子（ＨＡＳ２）の発現量を増加させることが確認された。

表７及び図７は、実施例１４～１６及び比較例７の実験結果を示し、ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量の変化を示す。
具体的には、表７及び図７は、比較例７で測定された対照のヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量を１．００±０．１０とした場合の、実施例１４～１６で測定されたＨＡＳ３の平均及び標準偏差を示す。

表７及び図７に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％となる場合（実施例１４に対応）、ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量の平均値は、１．０９±０．０８であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０３質量％となる場合（実施例１５に対応）、ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量の平均値は、１．０６±０．０８であった。さらに、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％となる場合（実施例１６に対応）、ヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量の平均値は、１．３６±０．２２であった。
この結果から、珪素がヒアルロン酸産生酵素３遺伝子（ＨＡＳ３）の発現量を増加させることが確認された。

表８及び図８は、実施例１７～１９及び比較例８の実験結果を示し、β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現量の変化を示す。
具体的には、表８及び図８は、比較例８で測定された対照のＧＢＡの発現量を１．００±０．０６とした場合の、実施例１７～１９で測定されたＧＢＡの平均及び標準偏差を示す。

表８及び図８に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％となる場合（実施例１７に対応）、β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現量の平均値は、１．０９±０．１３であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０３質量％の水溶液となる場合（実施例１８に対応）、β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現量の平均値は、１．１７±０．０４であった。さらに、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％となる場合（実施例１９に対応）、β－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現量の平均値は、１．２７±０．１１であった。
この結果から、珪素がβ－グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ＧＢＡ）の発現量を増加させることが確認された。

表９及び図９は、実施例２０及び２１並びに比較例９の実験結果を示し、プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）の発現量の変化を示す。
具体的には、表９及び図９は、比較例９で測定された対照のＦＬＧの発現量を１．００±０．０４とした場合の、実施例２０及び実施例２１で測定されたＦＬＧの平均及び標準偏差を示す。

表９及び図９に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０１質量％となる場合（実施例２０に対応）、プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）発現量の平均値は、１．２０±０．０５であった。また、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．０３質量％となる場合（実施例２１に対応）、プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）発現量の平均値は、１．０２±０．１２であった。
この結果から、珪素がプロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）発現量を増加させることが確認された。

表１０及び図１０は、実施例２２及び比較例１０の実験結果を示し、トランスグルタミナーゼ１遺伝子（ＴＧＭ１）の発現量の変化を示す。
具体的には、表１０及び図１０は、比較例１０で測定された対照のＴＧＭ１の発現量を１．００±０．１０とした場合の、実施例２２で測定されたＴＧＭ１の平均及び標準偏差を示す。

表１０及び図１０に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が０．１質量％となる場合（実施例２２に対応）、トランスグルタミナーゼ１遺伝子（ＴＧＭ１）発現量の平均値は、１．１６±０．０６であった。
この結果から、珪素がトランスグルタミナーゼ１遺伝子（ＴＧＭ１）発現量を増加させることが確認された。

表１１は、珪素の静菌作用に関する測定結果を示す。

表１１に示す通り、水溶性珪素「ｕｍｏ」の濃度が１質量％の水溶液に、６．０×１０^５個の大腸菌を接種した場合（実施例２３に対応）、６０分後における大腸菌数は６．７×１０^５であった。
一方で、蒸留水に、６．０×１０^５個の大腸菌を接種した場合（比較例１１に対応）、６０分後における大腸菌数は７．３×１０^５であった。

また、ｐＨが３．５である酸性の水溶性珪素「ｕｍｏ」に、５．６×１０^５個の大腸菌を接種した場合（実施例２４に対応）、６０分後における大腸菌数は２．５×１０^３であった。
一方で、蒸留水に、５．６×１０^５個の大腸菌を接種した場合（比較例１２に対応）、６０分後における大腸菌数は５．４×１０^５であった。

さらに、ｐＨが３．５である酸性の水溶性珪素「ｕｍｏ」に、３．０×１０^６個のレジオネラ菌を接種した場合（実施例２５に対応）、６０分後におけるレジオネラ菌数は１００未満であった。
一方で、蒸留水に、３．０×１０^６個のレジオネラ菌を接種した場合（比較例１３に対応）、６０分後におけるレジオネラ菌数は３．２×１０^６であった。

この結果から、大腸菌及びレジオネラ菌に対する珪素による静菌作用が確認された。

Claims

珪素を含有しており、
前記珪素の含有量が、０．００５質量％以上１００質量％未満である、
皮膚の老化防止用組成物。
前記珪素の含有量が、０．０５質量％以上１００質量％未満である、
請求項１に記載の皮膚の老化防止用組成物。