JP2021535748A - 飼料組成物のための安定した顆粒 - Google Patents

Abstract

本発明は、内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる顆粒を含んでなる、ペレット化飼料組成物に関する。本発明は、蒸気処理ペレット化飼料組成物のための塩及び疎水性被覆顆粒の使用にさらに関する。【選択図】なし

Description

配列リストへの言及
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含有する。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に援用される。

本発明は、内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる顆粒を含んでなる、ペレット化飼料組成物に関する。本発明は、蒸気処理ペレット化飼料組成物のための塩及び疎水性被覆顆粒の使用にさらに関する。

動物飼料は、典型的には、動物に望ましい成分を含有するペレットとして提供される。これは、動物が必要とする全成分が利用可能であり、特に飼料のデンプン画分の消化性が向上し、成分からの粉塵が減少するという利点を有する。

飼料ペレットの製造中に、ペレットは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの細菌を殺滅する目的で、高温で蒸気処理される。多くの場合、飼料ペレット中に存在する酵素などの活性化合物は、高温及び高湿度下では安定していないので、飼料ペレット中に大量の酵素が必要になる。代案としては、酵素を含まない飼料ペレット上への酵素コーティングの塗布が使用されてもよい；しかし、このコーティング工程は煩雑であり、既存の飼料プラントと適合性でないことが多い。

活性化合物の安定性を改善する方法は、蒸気処理及びペレット化の前に、コア内の活性化合物及びコア上に被覆された適切なコーティング剤を含む顆粒を提供することである。国際公開第９２／１２６４５号パンフレットは、脂肪又はワックスで被覆されたＴ顆粒、及び蒸気処理され引き続いてペレット化される飼料構成成分を記載する。国際公開第２００６／０３４７１０号パンフレットは、ペレット化の前に塩コーティングで被覆された酵素含有顆粒を開示する。

しかし、ペレット化飼料製品中の酵素などの活性化合物の安定性をさらに向上させる必要が依然としてある。

本発明は、コアとコーティングとを含んでなる顆粒を含んでなり、コアがムラミダーゼを含んでなり、コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる、ペレット化飼料組成物を提供する。

本発明は、コアとコーティングとを含んでなる顆粒をさらに提供し、コアはムラミダーゼを含んでなり、コーティングは内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる。

さらなる実施形態では、コアとコーティングとを含んでなる顆粒が提供され、コアはムラミダーゼを含んでなり、コーティングは内部塩層と外部疎水性層とを含んでなり、顆粒は、蒸気ペレット化前の活性と比較して、蒸気ペレット化後に活性を保持したムラミダーゼを少なくとも７５％を含んでなり、顆粒は、
ｉ．顆粒の粒度は１２００μｍ未満である、
ｉｉ．内部内部（ｉｎｎｅｒ ｉｎｎｅｒ）塩層の厚さは少なくとも１５μｍである、
ｉｉｉ．外部疎水性コーティングの厚さは少なくとも１μｍである、
ｉｖ．ムラミダーゼは熱不安定性である
の１つ又は複数をさらに含んでなる。

また、本発明によって、動物に給餌する方法、飼料組成物を製造する方法、ムラミダーゼの安定性を改善する方法、及び１２％を超える湿度を有するマッシュ組成物中のムラミダーゼの安定性を改善する方法も提供される。

なおもさらなる実施形態は、蒸気処理ペレット化飼料組成物を調製するための、ムラミダーゼを含んでなるコア、内部塩層、及び外部疎水性層を含んでなる顆粒の使用を提供する。

配列リストの概要
配列番号１は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２から単離された、Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５遺伝子のＤＮＡ配列である。

配列番号２は、配列番号１から推定されるアミノ酸配列である。

配列番号３は、合成的に最適化されたＧＨ２５遺伝子のＤＮＡ配列である。

配列番号４は、配列番号３から推定されるアミノ酸配列である。

定義
一定湿度：化合物又は物質の「一定湿度」（本発明の文脈では「ＣＨ」と略されることがある）という用語は、全体が所定の温度で閉じた空間内に閉じ込められた、前記化合物の固相と接触した前記化合物の飽和水溶液と平衡状態にある大気の％ＲＨとして理解されるべきである。この定義は、”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｓ”ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳＡ，５８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ Ｅ４６，１９７７−１９７８に準拠する。したがって、化合物についてＣＨ_２０℃＝５０％は、湿度５０％の空気が２０℃の化合物の飽和水溶液と平衡状態にあることを意味する。したがって、一定湿度という用語は、化合物の吸湿性の尺度である。

粉塵：顆粒又は粉末に関連して「粉塵」という用語は、取り扱い時に顆粒又は粉末が、微細な空中浮遊粒子を放出する傾向を指す。顆粒粉塵又は粉末粉塵は業界で日常的に測定されており、いくつかの異なる技術で測定されてもよい。酵素粉塵を測定するための良く知られた方法としては、例えば、風簸アッセイ及びＨｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイが挙げられる。気流式簸試験では、酵素顆粒が背の高いガラス管内のガラスフリット上に置かれ、一定時間にわたって一定の乾燥気流で流動化される。Ｈｅｕｂａｃｈアッセイでは、顆粒は回転するパドルと鋼球が取り付けられた小さな円筒形の鋼製チャンバーに入れられ；乾燥気流がチャンバーに浸透する間に、顆粒はパドルと鋼球によって押し周される。どちらの試験においても、空気流によって粒子から剥離された粉塵は、その後の重量測定及び活性測定のためにガラス繊維フィルターに捕捉される。これらの試験のさらなる詳細は、例えば、”Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｉｎ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ，”ｅｄ．Ｊａｎ Ｈ．ｖａｎ Ｅｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｐｔ．１５，ｐｇｓ．３１０−３１２（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９７））、及びその中で引用されている参考文献に見いだされ得る。

ＧＨ２５ムラミダーゼ：「ＧＨ２５ムラミダーゼ」という用語は、ＧＨ２５ファミリーに属するムラミダーゼに対して使用される。ＧＨ２５ファミリーは、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔグリコシルヒドロラーゼファミリー分類に準拠した酵素の分類である（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，Ａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６（１９９１）；Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．Ｎｅｗ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９３：７８１−７８８（１９９３）；Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５−６９６（１９９６）；Ｄａｖｉｅｓ Ｇ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：８５３−８５９（１９９５））。ＧＨ２５に加えて、リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）活性を有するその他の酵素ヒドロラーゼファミリーは、ＧＨ２２、ＧＨ２３、及びＧＨ２４である。

水素化：「水素化」という用語は、不飽和炭水化物鎖の飽和に対して用いられ、例えば、トリグリセリドでは、炭素＝炭素二重結合が炭素−炭素単結合に変換される。

マッシュ組成物：マッシュ組成物は、穀物、穀物製品、及び任意選択的な栄養補給剤の栄養的に完全な組成物であり、例えば、ペレット化も調質もされていない小麦、トウモロコシなどを含んでなる。

粒度：顆粒の粒度とは、顆粒の質量平均直径を意味する。

ペレット化飼料組成物：「ペレット化飼料組成物」という用語は、ペレット化及び調質後の飼料組成物、すなわち動物に食べさせる飼料ペレットを意味することを意図している。

％ＲＨ：用語「％ＲＨ」は、空気の相対湿度として理解されるべきである。１００％ＲＨは固定温度において水分で飽和した空気であり、したがって％ＲＨは空気の水分飽和度を反映する。

溶液：溶液は、２つ以上の物質の均質な混合物として定義される。

懸濁液：懸濁液は、流体に懸濁された微粒子として定義される。

序論
例えば、１３〜１５％の湿度を有するマッシュ組成物からペレット化された飼料製品に含まれる、例えば、ムラミダーゼなどの酵素は、より低い湿度を有するマッシュ組成物からの飼料製品よりも安定性が低い傾向がある。本発明により、驚くべきことに、ムラミダーゼが、内部塩層及び外部疎水性層をさらに含んでなる顆粒に含まれる場合、ムラミダーゼの安定性が一般に向上することが見いだされた。さらに驚くべきことに、本発明によれば、例えば、湿度１３％〜１５％などの湿度１１％以上のマッシュ組成物からペレット化されたムラミダーゼについても、ムラミダーゼの安定性が向上することが見いだされた。したがって、蒸気処理に曝された飼料中のムラミダーゼの安定性は、本発明の顆粒に含まれない蒸気処理ムラミダーゼの安定性と比較して改善される。本発明のさらなる利点は、顆粒が少量の粉塵しか放出せず、顆粒の貯蔵寿命が保持されることである。

顆粒
本発明の顆粒に言及する場合、それは、単一の顆粒又はいくつかの顆粒のどちらかであり得る。

本発明の顆粒は、特に蒸気ペレット化に適しており、蒸気処理ペレット化飼料組成物の一部として好適である。顆粒はコアとコーティングとを含んでなり、コアはムラミダーゼを含んでなり、コーティングは内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる。

本発明の顆粒の適切な粒度は、５０〜２０００μｍ、より具体的には１００〜１５００μｍであることが見いだされている。本発明の一実施形態では、顆粒の粒度は２５０μｍを超える。本発明のさらなる実施形態では、粒度は１２００μｍ未満である。なおもさらなる実施形態では、粒度は２５０〜１２００μｍである。本発明の別の実施形態では、完成顆粒の粒度は２５０〜９００μｍである。本発明のなおも別の実施形態では、完成顆粒の平均粒度は５００〜７００μｍである。本発明のなおも別の実施形態では、完成顆粒の粒度は６００〜１２００μｍである。本発明のなおも別の実施形態では、完成顆粒の粒度は６００〜９００μｍである。

コア
コアは、濃縮乾物の形態のＧＨ２５ムラミダーゼなどのムラミダーゼを含んでなる。

コアは、
１．１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素の均質な配合物、
又は
２．ムラミダーゼと、任意選択的にさらなる酵素とがその上に塗布された、不活性粒子、
又は
３．１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素と、１つ又は複数のムラミダーゼで被覆された結合剤として機能する材料との均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）配合物
のいずれかであり得る。

本発明のコア粒度は、特定の実施形態では２０〜１９００μｍである。本発明のより特定の実施形態では、コア粒度は５０〜１４００μｍである。本発明のなおもより特定の実施形態では、コア粒度は１５０〜１１００μｍである。本発明の最も特定の実施形態では、コア粒度は２５０〜１２００μｍである。

コアが不活性粒子を含んでなる場合、不活性粒子は水溶性又は水不溶性であってもよく、例えば、キャッサバ又は小麦の形態のデンプン；又は糖（スクロース又は乳糖など）、又は塩（塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムなど）であってもよい。本発明の適切な不活性粒子材料としては、無機塩、糖、糖アルコール、有機酸又は塩などの小型有機分子、粘土又はケイ酸塩などのミネラル、又はこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。不活性粒子は、結晶化、沈殿、パンコーティング、流動床コーティング、流動床凝集、回転噴霧、押し出し、プリリング、球形化、サイズ縮小法、ドラム造粒、及び／又は高剪断造粒をはじめとする、様々な造粒技術によって製造されてもよい。

コアが１つ又は複数の結合剤を含んでなる場合、結合剤は、例えば、ビニルポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスルホネート、ポリカルボキシレート、及びそれらの共重合体、脂肪をはじめとするワックス、発酵ブロス、炭水化物、塩又はポリペプチドなどの合成ポリマーであってもよい。特定の実施形態では、結合剤はポリペプチドである。ポリペプチドは、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、キトサン、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン（ｇｌｕｔａｍａｔｉｃ）酸から選択されてもよい。別の特定の実施形態では、結合剤は、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース又はＣＭＣなどのセルロース誘導体である。適切な結合剤は、デキストリンなどの炭水化物結合剤、例えば、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ ２１Ｄ又はＡｖｅｄｅｘ Ｗ８０である。

一実施形態では、コアは塩を含んでなってもよい。塩は、例えば、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸、硝酸、塩化物又は炭酸の塩などの無機塩であってもよく、又はクエン塩、マロン酸又は酢酸などの単純な有機酸（例えば、６個以下の炭素原子など１０個未満の炭素原子）の塩であってもよい。これらの塩の陽イオンの例は、アルカリイオン又はアルカリ土類金属イオンであるが、アンモニウムイオン又はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、又はアルミニウムなどの第一遷移系列の金属イオン。アニオンの例としては、塩化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、一塩基性リン酸塩、二塩基性リン酸塩、次亜リン酸塩、ピロリン酸二水素、炭酸塩、炭酸水素塩、メタケイ酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩又はグルコン酸塩などが挙げられる。特に、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸、硝酸、塩化物若しくは炭酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩、又は、クエン酸、マロン酸若しくは酢酸などの単純な有機酸の塩が使用されてもよい。特定の例としては、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、（ＮＨ_４）Ｈ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、Ｍｇ（ＮＯ_３）_２、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ホウ酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。粒子のコアの塩はまた、水和塩、すなわち、国際公開第９９／３２５９５号パンフレットに記載されているような、結晶水が結合した結晶性塩水和物であってもよい。水和塩の例としては、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物（Ｎａ_２ＨＰＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、硝酸マグネシウム六水和物（Ｍｇ（ＮＯ_３）_２（６Ｈ_２Ｏ））、ホウ酸ナトリウム十水和物、クエン酸ナトリウム二水和物、及び酢酸マグネシウム四水和物が挙げられる。

一実施形態では、コア及び／又は内部塩層は、吸湿性化合物を含んでなってもよい。吸湿性化合物は、顆粒内のムラミダーゼと接触する遊離水を減少させることによって水分活性を低減できる、緩衝剤として機能する。吸湿性化合物がコアに添加される場合、内部塩層の適用後に存在する水を除去するための過剰な緩衝能力があることが重要である。一実施形態では、吸湿性化合物は、例えば５％を超える、例えば１０％を超えるなど、３％を超える吸水量を有する。吸水量は、２５℃、相対湿度７０％で１週間後の平衡吸水量として見いだされる。顆粒に添加される吸湿性化合物の量は、顆粒の１％を超え、２％を超え、５％を超え、又は１０％ｗ／ｗを超える。

吸湿性化合物は、有機化合物又は無機化合物のどちらかであってもよく、小麦粉、デンプン、トウモロコシ穂軸製品、セルロース、及びシリカゲルからなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。

顆粒は、加工助剤、充填剤、繊維材料、安定剤、可溶化剤、懸濁剤、粘度調節剤、光球（ｌｉｇｈｔ ｓｐｈｅｒｅ）、可塑剤、塩、潤滑剤、及び芳香剤などの追加的な材料を含んでなってもよい。加工助剤は、粉末散布として提供されてもよく、例えば、ＣａＣＯ_３、滑石及び／又はカオリンなどであってよい。適切な充填剤は、微粉砕アルカリ硫酸塩、アルカリ炭酸塩及び／又はアルカリ塩化物などの水溶性及び／又は不溶性無機塩である、カオリン（例えば、ＳＰＥＳＷＨＩＴＥ（商標）、Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｌａｙ）、ベントナイト、滑石、ゼオライト、チョーク、炭酸カルシウム及び／又はケイ酸塩などの粘土である。典型的な充填剤は、硫酸二ナトリウム及びリグノスルホンカルシウム酸である。安定剤又は保護剤は、造粒の分野で従来使用されているものなどである。安定剤又は保護剤は、アルカリ性又は中性物質、還元剤、抗酸化剤及び／又は第一遷移系列金属イオンの塩など、いくつかのカテゴリーに分類されてもよい。これらのそれぞれは、同一又は異なるカテゴリーのその他の保護剤と組み合わせて使用されてもよい。アルカリ性保護剤の例は、アルカリ金属ケイ酸塩、炭酸塩又は炭酸水素塩である。還元性保護剤の例が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ硫酸塩又はＭｎＳＯ_４塩である一方、抗酸化剤の例は、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）又はブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）である。特に、安定剤は、例えば、チオ硫酸ナトリウムなどのチオ硫酸塩又はメチオニンであってもよい。有用な安定剤のなおもその他の例は、ゼラチン、尿素、ソルビトール、グリセロール、カゼイン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、脱脂乳粉末及び／又は大豆油又はキャノーラ油などの食用油の粉末である。飼料顆粒中の特定の安定剤は、乳酸源又はデンプンである。好ましい乳酸源は、コーンスティープリカーである。デンプン、脂質、タンパク質などの酵素基質が酵素の安定剤として機能し得ることもまた、当該技術分野で周知である。

ムラミダーゼ：
本発明で使用するためのムラミダーゼは、任意のムラミダーゼ、２つ以上のムラミダーゼの組み合わせ、又は任意のムラミダーゼと１つ又は複数のさらなる酵素との組み合わせであってもよい。したがって、「ムラミダーゼ」に言及する場合、これは、一般に、１つのムラミダーゼ、２つ以上のムラミダーゼの組み合わせ、又はムラミダーゼと１つ又は複数のさらなる酵素の組み合わせを含むものと理解される。

ムラミダーゼはＯ−グリコシルヒドロラーゼであり、これはリゾチーム活性を有し、したがって、２つ以上の炭水化物間、又は炭水化物部分と非炭水化物部分との間のグリコシド結合の加水分解を触媒する。ムラミダーゼは、例えば、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間の１，４−β−結合、及びキトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合など、細菌細胞壁のムコ多糖類とムコペプチドの特定の残基間のグリコシド結合を切断して溶菌をもたらす。ムラミダーゼは、酵素クラスＥＣ３．２．１．１７に属する。

ムラミダーゼ変異型（例えば、組換え技術によって製造される）は、「ムラミダーゼ」という用語の意味に含まれることが理解されるべきである。このようなムラミダーゼ変異型の例は、例えば、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレット、国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレット、及び国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットに開示されている。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、ＧＨ２５ムラミダーゼである。一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、細菌細胞壁を溶解する能力を有する。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、ｉ）国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットの実施例４に記載されている濁度アッセイに従って判定される、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）に対するリゾチーム活性を判定するための方法、及びｉｉ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの実施例５６に記載されている、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対するリゾチーム活性を判定する方法によって判定される、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対するリゾチーム活性を判定するための方法のいずれか１つによる判定で、ａ）鶏卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）のリゾチーム活性と比較して、リゾチーム活性を改善した。一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットの実施例４に記載されている濁度アッセイに従って判定されるように、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の細胞壁に見られるペプチドグリカンに対して、リゾチーム活性を有する。一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、国際公開第２０１８／１１３７４５の実施例５６に記載されている、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対するリゾチーム活性を判定する方法によって判定されるように、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対して、リゾチーム活性を有する。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、リゾチーム活性を有する単離ポリペプチドであり、
ａ．配列番号２の成熟ポリペプチドと、又は配列番号４の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
ｃ．中〜高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列又はその全長補体とハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
ｄ．１つ又は複数（例えば、いくつか）の位置での置換、欠失、及び／又は挿入を含んでなる、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの変異型；及び
ｅ．リゾチーム活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドの断片断片（ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ）からなる群から選択される。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドを含んでなるか、又はそれからなるポリペプチドの中から選択される。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットで言及される単離ポリペプチドであり、
（ａ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号３のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号６のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号９のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号１２のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号１５のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号１８のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号２１のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号２４のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号２７のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｊ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号３０のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｋ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号３３のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｌ）国際公開第２０１８／１１３７４３号パンフレットの配列番号３８のポリペプチドと少なくとも８３％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される。

一実施形態では、本発明で使用するためのムラミダーゼは、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットで言及される単離ポリペプチドであり、
（ａ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号３、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号９、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１２、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１５、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１８、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２１、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２４、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２７、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号３３、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号３６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号４２、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号４５、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号４８、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号５１、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号５４、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号５７、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号６０、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号６３、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号６６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号６９、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号７５、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号８０、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号８３、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号８６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号９８、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１０１、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１０４、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１０７、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１１６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１１９、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１２２、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１２５、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１２８、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１３１、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１３４、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１３７、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１４０、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１４３、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１４６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１４９、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１５２、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１５５、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１５８、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２２１、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２２４、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２２７、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２３０、及び国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号２３３からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号６、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号３０、及び国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号７２からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８４％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号８９のポリペプチドと少なくとも８６％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号９２、国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号９５、及び国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１１０からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８２％の配列同一性を有するポリペプチド、及び
（ｅ）国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレットの配列番号１１３のポリペプチドと少なくとも８１％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される。

本発明は、熱不安定性ムラミダーゼに特に好適である。特定のムラミダーゼの文脈で適用される用語「熱不安定性」は、ｐＨ５．５で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて判定される融解温度、Ｔ_ｍを指す。熱不安定性ムラミダーゼでは、Ｔ_ｍは１００℃未満である。特定の実施形態では、Ｔ_ｍは、８０℃未満、７０℃未満、さらには６０℃未満など、９０℃未満である。ＤＳＣによるＴ_ｍの判定は、ＭｉｃｒｏＣａｌ社からのＶＰ−ＤＳＣを用いて、様々なＰＨ値で実施される。スキャンは、２０〜９０℃から１．５℃／分の一定の走査速度で実施される。ＤＳＣを実行する前に、ムラミダーゼは、適切な緩衝液（例えば、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５又は３．０；０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５；０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化されたＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して脱塩される。データ処理は、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用して実施されてもよい。ＤＳＣ測定は、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００３／６６８４７号パンフレットに記載されているように実施される。

本発明の特定の実施形態では、本発明の顆粒のムラミダーゼは熱不安定性である。

本発明の特定の実施形態では、ペレット化飼料組成物の顆粒のムラミダーゼは、熱不安定性である。

本発明の特定の実施形態では、ペレット化飼料組成物のために使用される顆粒のムラミダーゼは、熱不安定性である。

コーティング
粒子のコアは、コア周囲の内部塩層、内部塩層周囲の外部疎水性層、及び任意選択的に１つ又は複数のさらなるコーティング層で被覆される。

内部塩層
本発明の特定の実施形態では、内部塩層は、顆粒の２０〜７０％ｗ／ｗ、３０〜６０％ｗ／ｗ、４０〜６０％ｗ／ｗ又は５０〜６０％ｗ／ｗなど、顆粒の２０〜９９％ｗ／ｗに寄与してもよい。一実施形態では、内部塩層。一実施形態では内部塩層は、例えば６５％ｗ／ｗ又は７０％ｗ／ｗの塩など、少なくとも６０％ｗ／ｗの塩を含んでなり、それは、例えば少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗなど、例えば少なくとも９０％ｗ／ｗ又は少なくとも９５％ｗ／ｗさらには少なくとも９９％ｗ／ｗの塩など、少なくとも７５％ｗ／ｗの塩であってもよい。

本発明の特定の実施形態では、顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも４０％ｗ／ｗを構成する。

本発明の特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物中の顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも４０％ｗ／ｗを構成する。

本発明の特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物で使用するための顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも４０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のさらなる特定の実施形態では、顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも５０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のさらなる特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物中の顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも５０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のさらなる特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物で使用するための顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも５０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のなおもさらなる特定の実施形態では、顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のなおもさらなる特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物中の顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

本発明のなおもさらなる特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物で使用するための顆粒の内部塩層中の塩の量は、内部塩層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

許容可能な保護を提供できるように、内部塩層は好ましくは特定の厚さを有する。本発明の特定の実施形態では、内部塩層は少なくとも１５μｍの厚さである。より特定の実施形態では、内部塩層の厚さは少なくとも２２μｍである。なおもより特定の実施形態では、内部塩層の全厚は少なくとも３０μｍである。最も特定の実施形態では、内部塩層の全厚は少なくとも３７μｍである。最も特定の実施形態では、内部塩層の全厚は少なくとも４５μｍである。最も特定の実施形態では、内部塩層の全厚は少なくとも５２μｍである。本発明の特定の実施形態では、内部塩層の厚さは１００μｍ未満である。より特定の実施形態では、内部塩層の厚さは６０μｍ未満である。なおもより特定の実施形態では、内部塩層の全厚は４０μｍ未満である。

本発明の特定の実施形態では、本発明の顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３０μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、本発明の顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３７μｍである。本発明のなおも別の特定の実施形態では、本発明の顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも４５μｍである。

本発明の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３０μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３７μｍである。本発明のなおも別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも４５μｍである。

本発明の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３０μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも３７μｍである。本発明のなおも別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の内部塩層の厚さは、少なくとも４５μｍである。

一実施形態では、被覆顆粒は、国際公開第０１／２５４１２号パンフレットに記載の顆粒であり、このタイプの顆粒の被覆顆粒の直径とコアユニットの直径との比率（略称ＤＧ／ＤＣ）は、少なくとも１．１、特に少なくとも１．５、より具体的には少なくとも２、より具体的には少なくとも２．５、より具体的には少なくとも３、最も具体的には少なくとも４である。しかし、ＤＧ／ＤＣは、特に約１００未満、特に約５０未満、より具体的には２５未満、そして最も特に１０未満である。特に、ＤＧ／ＤＣの範囲は約４〜約６である。したがって、このような顆粒では、内部塩層の厚さは、少なくとも２５μｍでなければならない。特定の厚さは、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２５０μｍ又は特に少なくとも３００μｍなど、少なくとも５０μｍである。この種の内部塩層の厚さは、通常８００μｍ未満である。特定の厚さは、３５０μｍ未満、３００μｍ未満、２５０μｍ未満、２００μｍ未満、１５０μｍ未満又は特に８０μｍ未満など、５００μｍ未満である。

内部塩層は、実質的に連続した層を形成することによって、すなわち、穴がほとんど又は全くない内部塩層としてコアユニットをカプセル化すべきであり、その結果、それがカプセル化するコアユニットには、未被覆領域がほとんど又は全くない。内部塩層は特に，厚さが均質（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）でなければならない。

添加される塩は、好ましくは塩溶液又は塩懸濁液の形態であり、その中で微粒子は１μｍ未満など、５μｍ未満である。

本発明の特定の実施形態では、内部塩層として塩溶液を使用することが好ましいが、使用する塩が低溶解度を有する場合には、塩溶液ではなく塩懸濁液を使用して、顆粒に添加される液体１リットル当たりより多くの塩を添加できるようにすることが好ましくあり得る。本発明の特定の実施形態では、内部塩層は、国際公開第０３／５５９６７号パンフレットに従って調製される。

内部塩層中の塩への言及は、１つの特定の塩又は塩の混合物のどちらかであり得る。

使用される塩は、例えば、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸、硝酸、塩化物又は炭酸の塩などの無機塩であってもよく、又はクエン塩、マロン酸又は酢酸などの単純な有機酸（例えば、６個以下の炭素原子など１０個未満の炭素原子）の塩であってもよい。これらの塩の陽イオンの例は、アルカリ又はアルカリ土類金属イオンであるが、アンモニウムイオン又はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、又はアルミニウムなどの第一遷移系列の金属イオン。アニオンの例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、一塩基性リン酸塩、二塩基性リン酸塩、次亜リン酸塩、ピロリン酸二水素、四ホウ酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、メタケイ酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩又はグルコン酸塩などが挙げられる。特に、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホスホン酸、硝酸、塩化物若しくは炭酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩、又は、クエン酸、マロン酸若しくは酢酸などの単純な有機酸の塩が使用されてもよい。特定の例としては、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、（ＮＨ_４）Ｈ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、Ｍｇ（ＮＯ_３）_２、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ホウ酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。

塩はまた、水和塩、すなわち国際公開第９９／３２５９５号パンフレットに記載されているような、結晶化の結合水を有する結晶性塩水和物であってもよい。水和塩の例としては、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物（Ｎａ_２ＨＰＯ_４（７Ｈ_２Ｏ））、硝酸マグネシウム六水和物（Ｍｇ（ＮＯ_３）_２（６Ｈ_２Ｏ））、ホウ酸ナトリウム十水和物、クエン酸ナトリウム二水和物、及び酢酸マグネシウム四水和物が挙げられる。

本発明の実施形態では、内部塩層は水和塩を含まない。本発明の特定の実施形態では、内部塩層は、５０℃で４個を超える水分子を含んでなる塩を含まない。

本発明の特定の実施形態では、本発明の適切な塩の特定の例は、ＮａＣｌ（ＣＨ_２０℃＝７６％）、Ｎａ_２ＣＯ_３（ＣＨ_２０℃＝９２％）、ＮａＮＯ_３（ＣＨ_２０℃＝７３％）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９５％）、Ｎａ_３ＰＯ_４（ＣＨ_２５℃＝９２％）、ＮＨ_４Ｃｌ（ＣＨ_２０℃＝７９．５％）、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９３，０％）、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９３．１％）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝８１．１％）、ＫＣｌ（ＣＨ_２０℃＝８５％）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９２％）、ＫＨ_２ＰＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９６．５％）、ＫＮＯ_３（ＣＨ_２０℃＝９３．５％）、Ｎａ_２ＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９３％）、Ｋ_２ＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９８％）、ＫＨＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝８６％）、ＭｇＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９０％）、ＺｎＳＯ_４（ＣＨ_２０℃＝９０％）、及びクエン酸ナトリウム（ＣＨ_２５℃＝８６％）である。

本発明の特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＮａＣｌ、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物からなる群から選択される。本発明のより特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＮａＣｌ、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物からなる群から選択される。

本発明の特定の実施形態では、本発明の顆粒の内部塩層に含まれる塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＮａＣｌ、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物からなる群から選択される。

本発明の特定の実施形態では、蒸気処理ペレット化飼料組成物の顆粒の内部塩層に含まれる塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＮａＣｌ、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物の群から選択される。

本発明の特定の実施形態では、蒸気処理ペレット化飼料組成物で使用するための顆粒の内部塩層に含まれる塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＮａＣｌ、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物の群から選択される。

外部疎水性層
外部疎水性層は、本発明の特定の実施形態において、例えば、顆粒の１〜５％ｗ／ｗ、又は２〜３％ｗ／ｗなど、顆粒の１〜１０％ｗ／ｗに寄与してもよい。一実施形態では、外部疎水性層は、顆粒の約２％ｗ／ｗに寄与する。別の実施形態では、外部疎水性層は、顆粒の約３％ｗ／ｗに寄与する。

本発明の特定の実施形態では、顆粒の外部疎水性層中の疎水性コーティング材料の量は、外部疎水性層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

本発明の特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物中の顆粒の外部疎水性層中の疎水性コーティング材料の量は、外部疎水性層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

本発明の特定の実施形態では、例えば、茎処理飼料組成物などの飼料組成物で使用するための顆粒の外部疎水性層中の疎水性コーティング材料の量は、外部疎水性層の少なくとも６０％ｗ／ｗを構成する。

許容可能な保護を提供できるように、外部疎水性層は、好ましくは特定の厚さを有する。本発明の特定の実施形態では、外部疎水性層は少なくとも１μｍの厚さである。より特定の実施形態では、外部疎水性層の厚さは少なくとも１．５μｍである。なおもより特定の実施形態では、外部疎水性層の全厚は少なくとも２μｍである。最も特定の実施形態では、外部疎水性層の全厚は少なくとも４μｍである。最も特定の実施形態では、外部疎水性層の全厚は少なくとも７μｍである。本発明の特定の実施形態では、外部疎水性層の厚さは１０μｍ未満である。より特定の実施形態では、外部疎水性層の厚さは７μｍ未満である。なおもより特定の実施形態では、外部疎水性層の全厚は４μｍ未満である。

本発明の特定の実施形態では、本発明の顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも１．５μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、本発明の顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも２μｍである。

本発明の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも１．５μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも２μｍである。

本発明の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも１．５μｍである。本発明の別の特定の実施形態では、例えば、蒸気処理ペレット化飼料組成物などの飼料組成物のために使用される顆粒の外部疎水性層の厚さは、少なくとも２μｍである。

外部疎水性層は、実質的に連続した層、すなわち、穴がほとんど又は全くない外部疎水性層を形成することによって、内部塩層をカプセル化すべきであり、その結果、それがカプセル化する内部塩層には、未被覆領域がほとんど又は全くない。外部疎水性層は、好ましい実施形態では、厚さが均質（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）でなければならない。

外部疎水性層中の疎水性コーティング材料への言及は、１つの特定の疎水性コーティング材料又は疎水性コーティング材料の混合物のどちらかであり得る。

疎水性コーティング材料としては、限定されないが、水素化ヒマシ油、水素化パーム核油、水素化パーム油、水素化綿実、水素化大豆油及び／又は水素化ナタネ油などの水素化植物油；水素化及び非水素化植物油の配合物；１２−ヒドロキシステアリン酸；Ｃｅｒｉｔ ＨＯＴなどの微晶蝋；及びＭｅｋｏｎ Ｗｈｉｔｅなどの高融点パラフィンワックスをはじめとする油及び／又はワックスが挙げられてもよい。

本発明に含まれるさらなる疎水性コーティング材料は、水不混和性液体又は低融点疎水性固体との組み合わせであり、それは融点が低下した混合物を生成する。これらとしては、Ｃ２６以上のワックス；パラフィンワックス；コレステロール；セチルアルコールなどの脂肪アルコール；水素化牛脂、水素化脂肪、水素化ヒマシ油などの動植物由来のモノ−、ジ−及び／又はトリグリセリド；脂肪酸などの脂肪誘導体；石鹸；エステル；エチルセルロースなどの疎水性デンプン；レシチンが挙げられる。ワックスは天然由来のものであってもよく、すなわち、動物、植物、又はミネラルであってもよい。動物ワックスとしては、限定されることなく、蜜蝋、ラノリン、シェラック蝋、及びシナ蝋が挙げられる。植物ワックスとしては、限定されることなく、カルナウバ、カンデリラ、ベイベリー、及びサトウキビ蝋が挙げられる。ミネラルワックスとしては、限定されることなく、オゾケライト、セレシン、及びモンタンをはじめとする鉱蝋又は土蝋；又はパラフィン及び微結晶ワックスをはじめとする石油ワックスが挙げられる。代案としては、ワックスは、合成であっても又は天然及び合成ワックスの混合物であってもよい。例えば、合成ワックス又は天然及び合成ワックス混合物は、低分子量の部分酸化ポリエチレンを含んでもよく、これはパラフィンと優先的に共溶融されてもよい。脂肪誘導体は、脂肪酸、脂肪酸アミド、脂肪アルコール、脂肪エステル、又はこれらの混合物のいずれかであってもよい。酸アミドは、ステアラミドであってもよい。ステロール又は長鎖ステロールエステルはまた、コレステロール又はエルゴステロールなどであってもよい。

好ましい疎水性コーティング材料は、パーム油又は水素化パーム油である。

飼料組成物
本発明の顆粒は、動物飼料組成物で使用するのに適している。顆粒は、飼料物質と混合される。顆粒の特性により、蒸気処理され、その後ペレット化される動物飼料として非常に適した組成物の構成成分としての使用が可能となる。

動物という用語には、全ての動物が含まれる。動物の例は、ウシ、ヒツジ、及びウマなどの非反芻動物及び反芻動物である。特定の実施形態では、動物は非反芻動物である。非反芻動物としては、例えば、ブタ（ｐｉｇ）又はブタ（ｓｗｉｎｅ）（仔ブタ、育成ブタ、及び雌ブタをはじめとするが、これらに限定されるものではない）などの単胃動物；七面鳥及び鶏（ブロイラー鶏、産卵鶏をはじめとするが、これらに限定されるものではない）などの家禽；若い仔ウシ；及び魚類（サケをはじめとするが、これらに限定されるものではない）が挙げられる。

飼料又は飼料組成物という用語は、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を意味する。本発明の飼料は、植物性タンパク質を含んでなってもよい。植物性タンパク質という用語は、本明細書の用法では修飾タンパク質及びタンパク質誘導体をはじめとする、植物由来又は植物起源の少なくとも１つのタンパク質を含む、任意の化合物、組成物、調製物又は混合物を指す。特定の実施形態では、植物性タンパク質のタンパク質含有量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０％（ｗ／ｗ）である。

植物性タンパク質は、マメ類及び穀類などの植物性タンパク質源に由来してもよく、例えば、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物から得られる材料、例えば、大豆ミール、ハウチワ豆（ｌｕｐｉｎ）ミール、ナタネミールなどが挙げられる。

特定の実施形態では、植物性タンパク質源は、例えば、大豆、ハウチワ豆、エンドウ豆、又はインゲン豆などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の１つ又は複数の植物からの材料である。

別の特定の実施形態では、植物性タンパク質源は、例えば、ビーツ、甜菜、ホウレンソウ又はキノアなどのアカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の１つ又は複数の植物からの材料である。

植物性タンパク質源のその他の例は、ナタネ、及びキャベツである。

大豆が好ましい植物性タンパク質源である。

植物性タンパク質源のその他の例は、大麦、小麦、ライ麦、オート麦、トウモロコシ（コーン）、米、及びソルガムなどの穀類である。

適切な動物飼料添加剤は、酵素阻害剤、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、微量ミネラル及びマクロミネラルである。

さらに、任意選択の飼料添加剤成分は、着色剤、香料化合物、安定剤、抗菌ペプチド、及び／又はフィターゼＥＣ３．１．３．３．８又は３．１．３．２６；キシラナーゼＥＣ３．２．１．８；ガラクタナーゼＥＣ３．２．１．８９；及び／又はβ−グルカナーゼＥＣ３．２．１．４から選択される少なくとも１つのその他の酵素である。

抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の例は、ＣＡＰ１８、ロイコシンＡ、トリトルプチシン、プロテグリン−１、タナチン、デフェンシン、ノビスピリン（Ｒｏｂｅｒｔ Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）などのオビスピリン、及び抗菌活性を保持するそれらの変異型又は断片である。

抗真菌ポリペプチド（ＡＦＰ）の例は、国際公開第９４／０１４５９号パンフレット及びＰＣＴ／ＤＫ０２／００２８９号明細書で開示されているような、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ペプチド、並びに抗真菌活性を保持するそれらの変異型及び断片である。

通常（Ｕｓａｌｌｙ）、脂溶性及び水溶性のビタミン、並びに微量ミネラルは、飼料への添加が意図されるいわゆるプレミックスの一部をなす一方で、マクロミネラルは通常、飼料に別々に添加される。

以下は、これらの構成成分の例の非排他的なリストである：
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、及び例えばビタミンＫ３などのビタミンＫである。

水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸及び例えばＣａ−Ｄ−パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）などのパントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）である。

微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、及びコバルトである。

マクロミネラルの例は、カルシウム、リン、及びナトリウムである。

なおもさらなる特定の実施形態では、本発明の動物飼料組成物は、０〜８０％トウモロコシ；及び／又は０〜８０％ソルガム；及び／又は０〜７０％小麦；及び／又は０〜７０％大麦；及び／又は０〜３０％オート麦；及び／又は０〜４０％大豆ミール；及び／又は０〜１０％魚粉；及び／又は０〜２０％ホエーを含有する。

調製
顆粒コアの調製
本発明の顆粒のコアは、濃縮乾物の形態のムラミダーゼを含んでなってもよい。一実施形態では、濃縮乾物は噴霧乾燥によって調製される。

コアを調製する方法は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｃ．Ｅ．Ｃａｐｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ １；１９８０；Ｅｌｓｅｖｉｅｒに見いだされ得る。調製方法としては、既知の飼料及び顆粒調合物技術、すなわち以下が挙げられる：
ａ）噴霧乾燥製品。液体のムラミダーゼ含有溶液が噴霧乾燥塔内で噴霧化されて小液滴を形成し、それは乾燥塔内を落ちる間に乾燥して、ムラミダーゼ含有粒子状物質を形成する。このようにして、非常に小さな粒子が製造され得る（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｓｈｏｗｅｌｌ（ｅｄｉｔｏｒ）；Ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ；１９９８；ｖｏｌ．７１；ｐａｇｅ １４０−１４２；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）。
ｂ）層状製品。ムラミダーゼは予め形成された不活性コア粒子の周囲に層として被覆され、ムラミダーゼ含有溶液は典型的には流動床装置内で噴霧化され、予め形成されたコア粒子は流動化され、ムラミダーゼ含有溶液はコア粒子に付着し、乾燥してコア粒子の表面に乾燥ムラミダーゼの層を残す。所望のサイズの有用なコア粒子が見いだされ得れば、この方法で所望のサイズの粒子が得られ得る。このタイプの製品は、例えば、国際公開第９７／２３６０６号パンフレットに記載されている。
ｃ）吸収されたコア粒子。ムラミダーゼはコア周囲の層として塗布されるのではなく、ムラミダーゼはコアの表面上及び／又は表面内に吸収される。このようなプロセスは、国際公開第９７／３９１１６号パンフレットに記載されている。
ｄ）押し出し又はペレット化製品。ムラミダーゼ含有ペーストはペレットに圧搾されるか、又は加圧下で小さな開口部から押し出され、粒子に切断され、引き続いて乾燥される。このような粒子は、その中に押し出し開口部が作られている材料（通常、穴あきプレート）が押し出し開口部上の許容圧力損失に限界を設定しているため、通常、かなりのサイズを有する。また、小開口部を使用した場合の非常に高い押し出し圧力は、ムラミダーゼペーストの発熱を増加させ、これはムラミダーゼにとって有害である。（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｓｈｏｗｅｌｌ（ｅｄｉｔｏｒ）；Ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ；１９９８；ｖｏｌ．７１；ｐａｇｅ １４０−１４２；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）。
ｅ）プリルド製品。活性粉末は溶融ワックスに懸濁され、懸濁液は、例えば回転ディスク噴霧器を通じて冷却チャンバー内に噴霧され、液滴がその中で迅速に固化する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ．Ｓｈｏｗｅｌｌ（ｅｄｉｔｏｒ）；Ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ；１９９８；ｖｏｌ．７１；ｐａｇｅ １４０−１４２；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）。得られた製品は、ムラミダーゼがその表面に濃縮されるのではなく、不活性材料全体を通じて一様に分布しているものである。米国特許第４，０１６，０４０号明細書及び米国特許第４，７１３，２４５号明細書もまた、この技術に関連する文書である。
ｆ）ミキサー造粒製品。活性含有液体は、従来の造粒構成成分の乾燥粉末組成物に添加される。液体と粉末は適切な比率で混合され、液体の水分が乾燥粉末に吸収されると、乾燥粉末の構成成分が付着して凝集し始め、粒子が沈積して、ムラミダーゼを含んでなる顆粒が形成する。このようなプロセスは、米国特許第４，１０６，９９１号明細書（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）及び関連文献である欧州特許第１７０３６０Ｂ１号明細書（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）、欧州特許第３０４３３２Ｂ１号明細書（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）、欧州特許第３０４３３１号明細書（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）、国際公開第９０／０９４４０号パンフレット（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）、及び国際公開第９０／０９４２８（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ）号パンフレットに記載されている。様々な高剪断ミキサーが造粒機として使用され得るこのプロセスの特定の製品中では、ムラミダーゼなどの酵素、充填剤、及び結合剤などからなる顆粒がセルロース繊維と混合され、粒子が強化されて、いわゆるＴ造粒をもたらす。強化粒子はより堅牢であり、酵素粉塵の放出がより少ない。
ｇ）サイズ縮小。コアは、活性物質を含有するより大きな粒子、ペレット、錠剤、ブリケットなどをミル処理又は破砕することによって製造される。所望のコア粒子画分は、ミル処理又は破砕された製品を篩掛けすることによって得られる。過大粒子及び過小粒子は、リサイクルされ得る。サイズ縮小は、（Ｍａｒｔｉｎ Ｒｈｏｄｅｓ（ｅｄｉｔｏｒ）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１９９０；Ｃｈａｐｔｅｒ １０；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されている。
ｈ）流動床造粒。流動床造粒は、粒子を気流中に懸濁し、ノズルを介して流動化粒子に液体を噴霧することを伴う。噴霧液滴が当たった粒子は、濡れて粘着性になる。粘着性粒子は、その他の粒子と衝突して付着し、顆粒を形成する。
ｉ）コアは、流動床乾燥機内などで乾燥されてもよい。飼料又は酵素産業において顆粒を乾燥させるためのその他の既知の方法が、当業者によって使用され得る。乾燥は、好ましくは２５〜９０℃の製品温度で行われる。一部のムラミダーゼでは、ムラミダーゼを含んでなるコアが塩で被覆される前に、少量の水を含有することが重要である。過剰な水分が除去される前に感水性ムラミダーゼが塩で被覆されると、水がコア内に閉じ込められて、ムラミダーゼの活性に悪影響を与えることもある。乾燥後、コアは、好ましくは０．１〜１０％ｗ／ｗの水を含有する。

内部塩層の調製
内部塩層は、流動床内のコア顆粒への噴霧によって、ムラミダーゼを含んでなる顆粒コア上に塗布されてもよく、内部塩層は、真空ミキサー、糖衣錠式コーター（パンドラムコーター）、種子のコーティングのための機器、回転底を含んでなる機器（例えば（ｅｋｓ．）、Ｒｏｔｏ Ｇｌａｔｔ、ＣＦ造粒機（Ｆｒｅｕｎｄ）、ｔｏｒｂｅｄ加工機（Ｇａｕｄａ）内で、又はオムニテックス（奈良機械製作所）などの回転流動床加工機内で、さらに塗布されてもよい。

塩層が塗布された後、顆粒は任意選択的に乾燥されてもよい。塩被覆顆粒の乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、流動床乾燥、パンドラムコーティング、及び電子レンジ乾燥など、当業者が利用できる任意の乾燥方法によって達成され得る。塩被覆顆粒の乾燥はまた、例えば、流動床、流動床噴霧乾燥機（ＦＳＤ）又は多段式乾燥機（ＭＳＤ）の使用を含んでなる造粒方法と、組み合わされ得る。

疎水性外層の調製
デンマーク国特許第ＰＡ２００２００４７３号明細書、国際公開第８９／０８６９４号パンフレット、国際公開第８９／０８６９５号パンフレット、２７０６０８Ｂ１及び／又は国際公開第００／０１７９３号パンフレットに記載されているコーティングのような、技術分野で既知の従来のコーティング及び方法が、適切に使用されてもよい。従来のコーティング材料のその他の例は、米国特許第４，１０６，９９１号明細書、欧州特許第１７０３６０号明細書、欧州特許第３０４３３２号明細書、欧州特許第３０４３３１号明細書、欧州特許第４５８８４９号明細書、欧州特許第４５８８４５号明細書、国際公開第９７／３９１１６号パンフレット、国際公開第９２／１２６４５Ａ号パンフレット、国際公開第８９／０８６９５号パンフレット、国際公開第８９／０８６９４号パンフレット、国際公開第８７／０７２９２号パンフレット、国際公開第９１／０６６３８号パンフレット、国際公開第９２／１３０３０号パンフレット、国際公開第９３／０７２６０号パンフレット、国際公開第９３／０７２６３号パンフレット、国際公開第９６／３８５２７号パンフレット、国際公開第９６／１６１５１号パンフレット、国際公開第９７／２３６０６号パンフレット、国際公開第０１／２５４１２号パンフレット、国際公開第０２／２０７４６号パンフレット、国際公開第０２／２８３６９号パンフレット、米国特許第５８７９９２０号明細書、米国特許第５，３２４，６４９号明細書、米国特許第４，６８９，２９７号明細書、米国特許第６，３４８，４４２号明細書、欧州特許第２０６４１７号明細書、欧州特許第１９３８２９号明細書、独国特許第４３４４２１５号明細書、独国特許第４３２２２２９Ａ号明細書、独国特許第２６３７９０号明細書、特開昭６１−１６２１８５号公報及び／又は特開昭５８−１７９４９２号公報に見られ得る。

コーティングは、上に「コアの調製」及び「塩コーティングの調製」のセクションで述べたのと同じ方法によって調製されてもよい。

得られた顆粒は、マルメライザー（商標）内などで丸められ（例えば、球形化）、又は圧縮され得る。

顆粒は、流動床乾燥機内などで乾燥され得る。飼料又は酵素産業において顆粒を乾燥させるためのその他の既知の方法が、当業者によって使用され得る。乾燥は、好ましくは２５〜９０℃の製品温度で行われる。

飼料ペレットの製造
飼料ペレットの製造では、ペレット化の前に、調質と称される蒸気処理を行うことが好ましい。引き続くペレット化工程では、飼料がダイを通って押し出され、得られたストランドが様々な長さの適切なペレットに切断される。この調質工程中に、プロセス温度は６０〜１００℃に上昇することもある。

飼料混合物は、ムラミダーゼを含んでなる顆粒を所望の飼料構成成分と混合することによって調製される。混合物は、例えば、蒸気注入を備えたカスケードミキサーなどのコンディショナーに導かれる。飼料は、コンディショナー内で蒸気を注入することにより、コンディショナー出口での測定で、例えば、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃又は１００℃など、６０〜１００℃の所定の温度に加熱される。滞留時間は、数秒間から数分間、さらには数時間まで、様々であり得る。５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、及び１時間など。本発明の特定の実施形態では、温度は１００℃であり、滞留時間は６０秒間である。

本発明の特定の実施形態では、蒸気処理中のプロセス温度は、少なくとも６０℃である。本発明のより特定の実施形態では、蒸気処理中のプロセス温度は、少なくとも７０℃である。本発明のなおもより特定の実施形態では、蒸気処理中のプロセス温度は、少なくとも８０℃である。本発明の最も特定の実施形態では、蒸気処理中のプロセス温度は、少なくとも９０℃である。

飼料は、コンディショナーからＳｉｍｏｎ Ｈｅｅｓｅｎプレスなどのプレスに導かれ、例えば１５ｍｍなどの様々な長さのペレットに圧搾される。圧搾後、ペレットは空気冷却器に入れられ、例えば１５分間など所定の時間にわたり冷却される。

本発明の特定の実施形態は、
ｉ．ムラミダーゼを含んでなるコア、内部塩層、及び外部疎水性層を含んでなる顆粒と、飼料構成成分を混合するステップと、
ｉｉ．前記組成物（ｉ）を蒸気処理するテップと、
ｉｉｉ．前記組成物（ｉｉ）をペレット化するテップと
を含んでなる、飼料組成物を製造する方法である。

一実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、８５℃で飼料を蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも７５％を保持する。さらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９０℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも７５％を保持する。さらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９５℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも７５％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、８５℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８０％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９０℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８０％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９５℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８０％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、８５℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８５％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９０℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８５％を保持する。なおもさらなる実施形態では、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼは、９５℃で蒸気ペレット化した後に、蒸気ペレット化前の活性と比較して、顆粒のコア内に存在するムラミダーゼの活性の少なくとも８５％を保持する。

好ましい態様
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
１．コアとコーティングとを含んでなる顆粒を含んでなり、コアがムラミダーゼを含んでなり、コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる、ペレット化飼料組成物。
２．蒸気処理に曝された、態様１に記載の飼料組成物。
３．内部塩層が、顆粒の２０〜７０％ｗ／ｗに寄与する、態様１又は２に記載の飼料組成物。
４．内部塩層が、顆粒の４０〜６０％ｗ／ｗなど、３０〜６０％ｗ／ｗに寄与する、態様３に記載の飼料組成物。
５．内部塩層が顆粒の５０〜６０％ｗ／ｗに寄与する、態様４に記載の飼料組成物。
６．内部塩層が顆粒の約４０％ｗ／ｗに寄与する、態様１又は２に記載の飼料組成物。
７．内部塩層が顆粒の約５０％ｗ／ｗに寄与する、態様１又は２に記載の飼料組成物。
８．内部塩層が顆粒の約６０％ｗ／ｗに寄与する、態様１又は２に記載の飼料組成物。
９．内部塩層の厚さが少なくとも１５μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１０．内部塩層の厚さが少なくとも２２μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１１．内部塩層の厚さが少なくとも３０μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１２．内部塩層の厚さが少なくとも３７μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１３．内部塩層の厚さが少なくとも４５μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１４．内部塩層の厚さが少なくとも５２μｍである、態様１〜８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１５．内部塩層が、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでなる、態様１〜１４のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１６．内部塩層がＮａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４又はその混合物を含んでなる、態様１〜１５のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１７．内部塩層がＮａ_２ＳＯ_４を含んでなる、態様１〜１６のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１８．外部疎水性層が顆粒の１〜１０％ｗ／ｗに寄与する、態様１〜１７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
１９．外部疎水性層が顆粒の１〜５％ｗ／ｗに寄与する、態様１〜１８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２０．外部疎水性層が顆粒の２〜３％ｗ／ｗに寄与する、態様１９に記載の飼料組成物。
２１．外部疎水性層が顆粒の約２％ｗ／ｗに寄与する、態様２０に記載の飼料組成物。
２２．外部疎水性層が顆粒の約３％ｗ／ｗに寄与する、態様２０に記載の飼料組成物。
２３．外部疎水性層の厚さが少なくとも１μｍである、態様１〜２２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２４．外部疎水性層の厚さが少なくとも１．５μｍである、態様１〜２２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２５．外部疎水性層の厚さが少なくとも２μｍである、態様１〜２２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２６．外部疎水性層の厚さが少なくとも４μｍである、態様１〜２２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２７．外部疎水性層の厚さが少なくとも７μｍである、態様１〜２２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２８．外部疎水性層が、水素化ヒマシ油、水素化パーム核油、水素化パーム油、水素化綿実、水素化大豆油、水素化ナタネ油、水素化及び非水素化植物油の配合物、１２−ヒドロキシステアリン酸、微晶蝋、高融点パラフィンワックス、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数の疎水性コーティング材料を含んでなる、態様１〜２７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
２９．外部疎水性層が、水素化パーム油を含んでなる、態様１〜２８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３０．顆粒が加工助剤をさらに含んでなる、態様１〜２９のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３１．加工助剤が粉末散布として提供される、態様１〜３０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３２．加工助剤が、ＣａＣＯ_３、滑石、及び／又はカオリンである、態様３０又は３１に記載の飼料組成物。
３３．顆粒が５０μｍ〜２０００μｍの粒度を有する、態様１〜３２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３４．顆粒が１００μｍ〜１５００μｍの粒度を有する、態様１〜３３のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３５．顆粒が１２００μｍ未満の粒度を有する、態様１〜３４のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３６．顆粒が２５０μｍを超える粒度を有する、態様１〜３５のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３７．顆粒が２５０μｍ〜１２００μｍの粒度を有する、態様１〜３６のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３８．顆粒が２５０μｍ〜９００μｍの粒度を有する、態様１〜３７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
３９．顆粒が６００μｍ〜１２００μｍの粒度を有する、態様１〜３７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４０．顆粒が６００μｍ〜９００μｍの粒度を有する、態様１〜３７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４１．顆粒が５００μｍ〜７００μｍの平均粒度を有する、態様１〜３７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４２．ムラミダーゼがＧＨ２５ムラミダーゼである、態様１〜４１のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４３．ムラミダーゼが、細菌細胞壁を溶解する能力を有する、態様１〜４２のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４４．ムラミダーゼが、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の細胞壁に見られるペプチドグリカンに対してリゾチーム活性を有する、態様１〜４３のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４５．ムラミダーゼが、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対してリゾチーム活性を有する、態様１〜４４のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４６．ムラミダーゼが、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドと、又は配列番号４の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）中〜高ストリンジェンシー条件下で配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列又はその全長補体とハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）１つ又は複数（例えば、いくつか）の位置での置換、欠失、及び／又は挿入を含んでなる、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの変異型；及び
（ｅ）リゾチーム活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドの断片断片（ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
からなる群から選択される単離ポリペプチドである、態様１〜４５のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４７．ムラミダーゼが熱不安定性である、態様１〜４６のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４８．ムラミダーゼが、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドを含んでなるか又はそれからなる、ポリペプチドの中から選択される、態様１〜４７のいずれか１つに記載の飼料組成物。
４９．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に少なくとも１１％である、態様１〜４８のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５０．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に１１〜１５％である、態様１〜４９のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５１．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に１２〜１４％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５２．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１１％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５３．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１２％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５４．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１３％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５５．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１４％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５６．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１５％である、態様１〜５０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５７．コアが塩をさらに含んでなる、態様１〜５６のいずれか１つに記載の飼料組成物。
５８．塩が安定剤である、態様５７に記載の飼料組成物。
５９．塩が、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、及びＺｎＳＯ_４からなる（ｃｏｎｓｉｓｉｔｉｎｇ）群から選択される、態様５７又は５８に記載の試料組成物。
６０．塩がＮａ_２ＳＯ_４である、態様５７又は５８に記載の試料組成物。
６１．８５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６２．９０℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６３．９５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６４．８５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６５．９０℃（Ｃｅｌｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６６．９５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６７．８５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６８．９０℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
６９．９５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様１〜６０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
７０．コアが、１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素、ムラミダーゼと任意選択的にさらなる酵素とがその上に塗布された不活性粒子、又は１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素の均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）配合物、及び１つ又は複数のムラミダーゼで被覆された結合剤として機能する材料の均質な配合物である、態様１〜６９のいずれか１つに記載の飼料組成物。
７１．顆粒が少量の粉塵のみを放出する、態様１〜７０のいずれか１つに記載の飼料組成物。
７２．粉塵の定義に記載されているように、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイ又は風簸アッセイによって測定したときに、顆粒が全粉塵をほとんど又は全く生じない、態様１〜７１のいずれか１つに記載の飼料組成物。
７３．粉塵がＨｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイにおいて１０００μｇ／ｇ未満であり、及び／又は風簸アッセイにおいて１０００μｇ／ｇ未満である、態様１〜７２のいずれか１つに記載の飼料組成物。さらなる態様では、粉塵は、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで５００μｇ／ｇ未満、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで２５０μｇ／ｇ未満、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで１００μｇ／ｇ未満、又はＨｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで５０μｇ／ｇ未満である。なおもさらなる態様では、粉塵は、風簸アッセイで５００μｇ／ｇ未満、風簸アッセイで２５０μｇ／ｇ未満、風簸アッセイで１００μｇ／ｇ未満、又は風簸アッセイで５０μｇ／ｇ未満である。
７４．顆粒の貯蔵寿命が保持される、態様１〜７３のいずれか１つに記載の飼料組成物。
７５．コアとコーティングとを含んでなる顆粒であって、コアがムラミダーゼを含んでなり、コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる、顆粒。
７６．コアとコーティングとを含んでなる顆粒であって、コアがムラミダーゼを含んでなり、コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなり、顆粒は、蒸気ペレット化前の活性と比較して、蒸気ペレット化後に活性を保持したムラミダーゼを少なくとも７５％含んでなり、顆粒は、
ｖ．顆粒の粒度は１２００μｍ未満である、
ｖｉ．内部内部（ｉｎｎｅｒ ｉｎｎｅｒ）塩層の厚さは少なくとも１５μｍである、
ｖｉｉ．外部疎水性コーティングの厚さは少なくとも１μｍである、
ｖｉｉｉ．ムラミダーゼは熱不安定性である
の１つ又は複数をさらに含んでなる。
７７．蒸気処理に曝された、態様７５又は７６に記載の顆粒。
７８．内部塩層が顆粒の２０〜７０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜７７のいずれか１つに記載の顆粒。
７９．内部塩層が、顆粒の４０〜６０％ｗ／ｗなど、３０〜６０％ｗ／ｗに寄与する、態様７８に記載の顆粒。
８０．内部塩層が顆粒の５０〜６０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜７８のいずれか１つに記載の顆粒。
８１．内部塩層が顆粒の約４０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜７８のいずれか１つに記載の顆粒。
８２．内部塩層が顆粒の約５０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜７８のいずれか１つに記載の顆粒。
８３．内部塩層が顆粒の約６０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜７８のいずれか１つに記載の顆粒。
８４．内部塩層の厚さが少なくとも１５μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
８５．内部塩層の厚さが少なくとも２２μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
８６．内部塩層の厚さが少なくとも３０μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
８７．内部塩層の厚さが少なくとも３７μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
８８．内部塩層の厚さが少なくとも４５μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
８９．内部塩層の厚さが少なくとも５２μｍである、態様７５〜８３のいずれか１つに記載の顆粒。
９０．内部塩層が、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＮＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＨＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、クエン酸ナトリウム、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでなる、態様７５〜８９のいずれか１つに記載の顆粒。
９１．内部塩層が、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４又はその混合物を含んでなる、態様７５〜９０のいずれか１つに記載の顆粒。
９２．内部塩層がＮａ_２ＳＯ_４を含んでなる、態様７５〜９１のいずれか１つに記載の顆粒。
９３．外部疎水性層が顆粒の１〜１０％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜９２のいずれか１つに記載の顆粒。
９４．外部疎水性層が顆粒の１〜５％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜９３のいずれか１つに記載の顆粒。
９５．外部疎水性層が顆粒の２〜３％ｗ／ｗに寄与する、態様７５〜９４のいずれか１つに記載の顆粒。
９６．外部疎水性層が顆粒の約２％ｗ／ｗに寄与する、態様９５に記載の顆粒。
９７．外部疎水性層が顆粒の約３％ｗ／ｗに寄与する、態様９５に記載の顆粒。
９８．外部疎水性層の厚さが少なくとも１μｍである、態様７５〜９７のいずれか１つに記載の顆粒。
９９．外部疎水性層の厚さが少なくとも１．５μｍである、態様７５〜９７のいずれか１つに記載の顆粒。
１００．外部疎水性層の厚さが少なくとも２μｍである、態様７５〜９７のいずれか１つに記載の顆粒。
１０１．外部疎水性層の厚さが少なくとも４μｍである、態様７５〜９７のいずれか１つに記載の顆粒。
１０２．外部疎水性層の厚さが少なくとも７μｍである、態様７５〜９７のいずれか１つに記載の顆粒。
１０３．外部疎水性層が、水素化ヒマシ油、水素化パーム核油、水素化パーム油、水素化綿実、水素化大豆油、水素化ナタネ油、水素化及び非水素化植物油の配合物、１２−ヒドロキシステアリン酸、微晶蝋、高融点パラフィンワックス、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数の疎水性コーティング材料を含んでなる、態様７５〜１０２のいずれか１つに記載の顆粒。
１０４．外部疎水性層が、水素化パーム油を含んでなる、態様７５〜１０３のいずれか１つに記載の顆粒。
１０５．顆粒が加工助剤をさらに含んでなる、態様７５〜１０４のいずれか１つに記載の顆粒。
１０６．加工助剤が粉末散布として提供される、態様１０５に記載の顆粒。
１０７．加工助剤が、ＣａＣＯ_３、滑石、及び／又はカオリンである、態様１０５又は１０６に記載の顆粒。
１０８．顆粒が５０μｍ〜２０００μｍの粒度を有する、態様７５〜１０７のいずれか１つに記載の顆粒。
１０９．顆粒が１００μｍ〜１５００μｍの粒度を有する、態様７５〜１０８のいずれか１つに記載の顆粒。
１１０．顆粒が１２００μｍ未満の粒度を有する、態様７５〜１０９のいずれか１つに記載の顆粒。
１１１．顆粒が２５０μｍを超える粒度を有する、態様７５〜１１０のいずれか１つに記載の顆粒。
１１２．顆粒が２５０μｍ〜１２００μｍの粒度を有する、態様７５〜１１１のいずれか１つに記載の顆粒。
１１３．顆粒が２５０μｍ〜９００μｍの粒度を有する、態様７５〜１１１のいずれか１つに記載の顆粒。
１１４．顆粒が６００μｍ〜１２００μｍの粒度を有する、態様７５〜１１１のいずれか１つに記載の顆粒。
１１５．顆粒が６００μｍ〜９００μｍの粒度を有する、態様７５〜１１１のいずれか１つに記載の顆粒。
１１６．顆粒が５００μｍ〜７００μｍの平均粒度を有する、態様７５〜１１１のいずれか１つに記載の顆粒。
１１７．ムラミダーゼがＧＨ２５ムラミダーゼである、態様７５〜１１６のいずれか１つに記載の顆粒。
１１８．ムラミダーゼが、細菌細胞壁を溶解する能力を有する、態様７５〜１１７のいずれか１つに記載の顆粒。
１１９．ムラミダーゼが、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の細胞壁に見られるペプチドグリカンに対してリゾチーム活性を有する、態様７５〜１１８のいずれか１つに記載の顆粒。
１２０．ムラミダーゼが、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に対してリゾチーム活性を有する、態様７５〜１１９のいずれか１つに記載の顆粒。
１２１．ムラミダーゼが、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドと、又は配列番号４の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）中〜高ストリンジェンシー条件下で配列番号１又は配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列又はその全長補体とハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）１つ又は複数（例えば、いくつか）の位置での置換、欠失、及び／又は挿入を含んでなる、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドの変異型；及び
（ｅ）リゾチーム活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドの断片断片（ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
からなる群から選択される単離ポリペプチドである、態様７５〜１２０のいずれか１つに記載の顆粒。
１２２．ムラミダーゼが熱不安定性である、態様７５〜１２１のいずれか１つに記載の顆粒。
１２３．ムラミダーゼが、配列番号２又は配列番号４の成熟ポリペプチドを含んでなるか又はそれからなる、ポリペプチドの中から選択される、態様７５〜１２２のいずれか１つに記載の顆粒。
１２４．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に少なくとも１１％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１２５．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に１１〜１５％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１２６．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に１２〜１４％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１２７．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１１％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１２８．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１２％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１２９．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１３％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１３０．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１４％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１３１．マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に約１５％である、態様７５〜１２３のいずれか１つに記載の顆粒。
１３２．コアが塩をさらに含んでなる、態様７５〜１３１のいずれか１つに記載の顆粒。
１３３．塩が安定剤である、態様１３２に記載の顆粒。
１３４．塩が、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、及びＺｎＳＯ_４からなる（ｃｏｎｓｉｓｉｔｉｎｇ）群から選択される、態様１３２又は１３３に記載の顆粒。
１３５．塩がＮａ_２ＳＯ_４である、態様１３２又は１３３に記載の顆粒。
１３６．８５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１３７．９０℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１３８．９５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１３９．８５℃での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４０．９０℃（Ｃｅｌｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４１．９５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８０％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４２．８５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４３．９０℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４４．９５℃（Ｃｅｌｓｃｉｕｓ）での蒸気ペレット化後に顆粒コア内に存在するムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の顆粒コア中のムラミダーゼ活性の少なくとも８５％である、態様７５〜１３５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４５．コアが、１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素、ムラミダーゼと任意選択的にさらなる酵素とがその上に塗布された不活性粒子、又は１つ又は複数のムラミダーゼをはじめとする酵素の均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）配合物、及び１つ又は複数のムラミダーゼで被覆された結合剤として機能する材料の均質な配合物である、態様７５〜１４４のいずれか１つに記載の顆粒。
１４６．顆粒が少量の粉塵のみを放出する、態様７５〜１４５のいずれか１つに記載の顆粒。
１４７．粉塵の定義に記載されているように、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイ又は風簸アッセイによって測定したときに、顆粒が全粉塵をほとんど又は全く生じない、態様７５〜１４６のいずれか１つに記載の顆粒。
１４８．粉塵がＨｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイにおいて１０００μｇ／ｇ未満であり、及び／又は風簸アッセイにおいて１０００μｇ／ｇ未満である、態様７５〜１４７のいずれか１つに記載の顆粒。
さらなる態様では、粉塵は、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで５００μｇ／ｇ未満、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで２５０μｇ／ｇ未満、Ｈｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで１００μｇ／ｇ未満、又はＨｅｕｂａｃｈタイプ１アッセイで５０μｇ／ｇ未満である。なおもさらなる態様では、粉塵は、風簸アッセイで５００μｇ／ｇ未満、風簸アッセイで２５０μｇ／ｇ未満、風簸アッセイで１００μｇ／ｇ未満、風簸アッセイで５０μｇ／ｇ未満である。
１４９．顆粒の貯蔵寿命が保持される、態様７５〜１４８のいずれか１つに記載の顆粒。
１５０．態様１〜７４のいずれか１つに記載の飼料組成物を動物に投与するステップを含んでなる、動物に給餌する方法。
１５１．（ｉ）コア、内部コーティング、及び外部コーティングを含んでなる顆粒と、飼料構成成分を混合するステップであって、コアがムラミダーゼを含んでなり、内部コーティングが塩を含んでなり、外部コーティングが疎水性コーティング材料を含んでなる、ステップと、
（ｉｉ）前記組成物を蒸気処理するステップと、
（ｉｉｉ）前記組成物をペレット化するステップとを含んでなる、飼料組成物を製造する方法。
１５２．態様１〜７４のいずれか１つに記載の飼料組成物に、又は７５〜１４９のいずれか１つに記載の顆粒に、ムラミダーゼを組み込むステップを含んでなる、ムラミダーゼの安定性を改善する方法。
１５３．態様１〜７４のいずれか１つに記載の飼料組成物に、又は態様７５〜１４９のいずれか１つに記載の顆粒に、ムラミダーゼを組み込むステップを含んでなる、１２％を超える湿度を有するマッシュ組成物中のムラミダーゼの安定性を改善する方法。
１５４．蒸気処理ペレット化飼料組成物を調製するための、態様７５〜１４９のいずれか１つに記載のムラミダーゼを含んでなるコア、内部塩層、及び外部疎水性層を含んでなる、顆粒の使用。

実施例１
顆粒１。ムラミダーゼを含んでなるコアと、コア上の塩層とを含んでなる、顆粒：
９６０ｇのセルロース、Ａｒｂｏｃｅｌ ＢＣ２００
６００ｇのデキストリン、カオリン
２５３４ｇの噴霧乾燥ＧＨ２５ムラミダーゼ粉末
７５５２ｇの粉砕Ｎａ_２ＳＯ_４
の組成の粉末混合物
を、
４８０ｇのスクロース
２２２０ｇの水
からなる造粒液と共にＬｏｅｄｉｇｅミキサーＦＭ ５０内で造粒した。
造粒は、米国特許第４，１０６，９９１号明細書の実施例１に記載されているように実施した。

顆粒を流動床乾燥機内で含水量が１％未満になるまで乾燥し、篩にかけて、２５０〜１２００マイクロメートルの粒度の製品を得た。

上述の顆粒コア４．０ｋｇをＭＰ１流動床内に入れた。
コアに塩層を塗布するために、
１６００ｇのＮａ２ＳＯ４
４０００ｇの水
の混合物を調製した。
コーティング中に、
空気流：２１５ｍ^３／時間
入口温度：９０℃
製品温度：４４℃
ノズルサイズ：１．２ｍｍ
ノズル圧（ｐｒｅｓｓｕｅｒ）：３．０バールの流動床設定を用いた。
コーティング後、顆粒を１０分間乾燥させて７５℃の温度に到達させ、最後に冷却した。

顆粒２。ムラミダーゼを含んでなるコア、コア上の内部塩層、及び内部塩層上の外部疎水性層を含んでなる、顆粒。
２．０ｋｇの顆粒１をＬｏｄｉｇｅミキサーＬ ５に入れた。
塩層に疎水性層を塗布するために、
４０ｇの溶融水素化パーム油
１２０ｇのカオリン
の混合物を調製した。
コーティング後、最終製品をＭＰ２流動床内で冷却した。

ペレット化の安定性の測定：
異なるペレット化条件及び飼料調合物中の異なる水分含量を使用して、顆粒１及び２をペレット化した。

実験設定：
およそ８５ｇの酵素顆粒を小型平ミキサー内で、１０ｋｇのマッシュと１０分間にわたり予備混合した。このプレミックスをより大型の水平ミキサー内で、１９０ｋｇのマッシュと１０分間にわたり混合した。ミキサーからマッシュをおよそ３００ｋｇ／時間の速度で、コンディショナー（蒸気注入を備えたカスケードミキサー）に導いた。コンディショナーは、蒸気を注入することによって、マッシュをそれぞれ８５℃、９０℃、及び９５℃（出口での測定）に加熱した。コンディショナー内の滞留時間もまた、６０秒間〜１２０秒間で変化させた。コンディショナーから、マッシュを３．０×３５ｍｍの水平ダイを備えたＳｉｍｏｎ Ｈｅｅｓｅｎプレスに導いて、約１５ｍｍの長さのペレットに圧搾した。圧搾後、ペレットを空気冷却器に入れて、１５分間冷却した。

マッシュ調合物：
７３．０％のトウモロコシを挽く（Ｇｒｉｎｄ）
２１．５％のトーストした挽き割り大豆
４．０％の大豆油
０．５％のビタミン／プレミックスＦａｒｍｉｘ ＶＬＳＶＲＫ
マッシュの含水量：それぞれ１２％及び１４％。

投入された酵素顆粒の活性と最終ペレットの活性とを分析し、これらの数値から残効性を算出した。

マッシュ中の１２％の水分でのペレット化試験の結果：

マッシュ中の１４％の水分でのペレット化試験の結果：

マッシュ中の１４％の水分及び異なる温度でのペレット化試験の結果：

結果から、マッシュ中の水分含量が増加した場合、塩コーティングのみと比較して、内部塩層と外部疎水性層との組み合わせが、ペレット化の安定性を有意に改善することが明らかである。

実施例２
顆粒３。ムラミダーゼを含んでなるコアと、コア上の塩層とを含んでなる、顆粒：
９６０ｇのセルロース、Ａｒｂｏｃｅｌ ＢＣ２００
６００ｇのデキストリン、カオリン
２５３４ｇの噴霧乾燥ＧＨ２５ムラミダーゼ粉末
７５５２ｇの粉砕Ｎａ_２ＳＯ_４
の組成の粉末混合物
を
４８０ｇのスクロース
２２２０ｇの水
からなる造粒液と共にＬｏｄｉｇｅミキサーＦＭ ５０内で造粒した。
造粒は、米国特許第４，１０６，９９１号明細書の実施例１に記載されているように実施した。

顆粒を流動床乾燥機内で含水量が１％未満になるまで乾燥し、篩にかけて、２５０〜１２００マイクロメートルの粒度の製品を得た。

上述の顆粒コア４．０ｋｇをＭＰ１流動床内に入れた。
コアに塩層を塗布するために、
２０００ｇのＮａ２ＳＯ４
５０００ｇの水
の混合物を調製した。
コーティング中に、
空気流：２１５ｍ^３／時間
入口温度：９０℃
製品温度：４４℃
ノズルサイズ：１．２ｍｍ
ノズル圧（ｐｒｅｓｓｕｅｒ）：３．０バール
の流動床設定を用いた。
コーティング後、顆粒を１０分間乾燥させて７５℃の温度に到達させ、最後に冷却した。

顆粒４。ムラミダーゼを含んでなるコア、コア上の内部塩層、及び内部塩層上の外部疎水性層を含んでなる、顆粒：
２．０ｋｇの顆粒３をＬｏｄｉｇｅミキサーＬ ５に入れた。
塩層に疎水性層を塗布するために、
４０ｇの溶融水素化パーム油
１２０ｇのカオリン
の混合物を調製した。
コーティング後、最終製品をＭＰ２流動床内で冷却した。

顆粒５。ムラミダーゼを含んでなるコア、コア上の内部塩層、及び内部塩層上の外部疎水性層を含んでなる、顆粒：
９６０ｇのセルロース、Ａｒｂｏｃｅｌ ＢＣ２００
６００ｇのデキストリン、カオリン
２５３４ｇの噴霧乾燥ＧＨ２５ムラミダーゼ粉末
７５５２ｇの粉砕Ｎａ_２ＳＯ_４
の組成の粉末混合物
を
４８０ｇのスクロース
２２２０ｇの水
からなる造粒液と共にＬｏｄｉｇｅミキサーＦＭ ５０内で造粒した。
造粒は、米国特許第４，１０６，９９１号明細書の実施例１に記載されているように実施した。

顆粒を流動床乾燥機内で含水量が１％未満になるまで乾燥し、篩にかけて、２５０〜１２００マイクロメートルの粒度の製品を得た。

上述の顆粒コア４．０ｋｇをＭＰ１流動床内に入れた。
コアに塩層を塗布するために、
２４００ｇのＮａ２ＳＯ４
６０００ｇの水
の混合物を調製した。
コーティング中に、
空気流：２１５ｍ^３／時間
入口温度：９０℃
製品温度：４４℃
ノズルサイズ：１．２ｍｍ
ノズル圧（ｐｒｅｓｓｕｅｒ）：３．０バール
の流動床設定を用いた。
コーティング後、顆粒を１０分間乾燥させて７５℃の温度に到達させ、最後に冷却した。

顆粒６。ムラミダーゼを含んでなるコア、コア上の内部塩層、及び内部塩層上の外部疎水性層を含んでなる、顆粒：
２．０ｋｇの顆粒５をＬｏｄｉｇｅミキサーＬ ５に入れた。
塩層に疎水性層を塗布するために、
４０ｇの溶融水素化パーム油
１２０ｇのカオリン
の混合物を調製した。
コーティング後、最終製品をＭＰ２流動床内で冷却した。

ペレット化の安定性
マッシュ中の含水量を１４％に増加させて、顆粒１、２、３、４、及び６それぞれを含んでなる製品１、２、３、４、及び６を実施例１に示す条件を使用してペレット化した。

マッシュ中の１４％の水分及び異なる温度でのペレット化試験の結果：

実験から、塩コーティングの増加がペレット化の安定性を有意に改善し、外部疎水性パーム油層の添加が安定性をさらに向上させることが明らかである。

Claims (16)

1. コアとコーティングとを含んでなる顆粒を含んでなり、前記コアがムラミダーゼを含んでなり、前記コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる、ペレット化飼料組成物。
2. 蒸気処理に曝された、請求項１に記載の飼料組成物。
3. 前記内部塩層が、前記顆粒の４０〜６０％ｗ／ｗなど、３０〜６０％ｗ／ｗに寄与する、請求項１又は２に記載の飼料組成物。
4. 前記内部塩層が、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４又はその混合物を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料組成物。
5. 前記外部疎水性層が、顆粒の２〜３％ｗ／ｗに寄与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料組成物。
6. 前記外部疎水性層が、水素化パーム油を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の飼料組成物。
7. 前記ムラミダーゼが、細菌細胞壁を溶解する能力を有するＧＨ２５ムラミダーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の飼料組成物。
8. マッシュ組成物の湿度が、ペレット化及び調質前に少なくとも１１％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の飼料組成物。
9. ８５℃での蒸気ペレット化後に前記顆粒コア内に存在する前記ムラミダーゼの保持活性が、蒸気ペレット化前の前記顆粒コア中の前記ムラミダーゼ活性の少なくとも７５％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の飼料組成物。
10. コアとコーティングとを含んでなる顆粒であって、前記コアがムラミダーゼを含んでなり、前記コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなる、顆粒。
11. コアとコーティングとを含んでなる顆粒であって、前記コアがムラミダーゼを含んでなり、前記コーティングが内部塩層と外部疎水性層とを含んでなり、前記顆粒が、蒸気ペレット化前の活性と比較して、蒸気ペレット化後に活性を保持したムラミダーゼを少なくとも７５％を含んでなり、前記顆粒が、
    ｉ．前記顆粒の粒度は１２００μｍ未満である、
    ｉｉ．前記内部内部（ｉｎｎｅｒ ｉｎｎｅｒ）塩層の厚さは少なくとも１５μｍである、
    ｉｉｉ．前記外部疎水性コーティングの厚さは少なくとも１μｍである、
    ｉｖ．前記ムラミダーゼは熱不安定性である
    の１つ又は複数をさらに含んでなる、顆粒。
12. 請求項１〜９のいずれか１つに記載の飼料組成物を動物に投与するステップを含んでなる、動物に給餌する方法。
13. （ｉ）コア、内部コーティング、及び外部コーティングを含んでなる顆粒と、飼料構成成分を混合するステップであって、前記コアがムラミダーゼを含んでなり、前記内部コーティングが塩を含んでなり、前記外部コーティングが疎水性コーティング材料を含んでなる、混合するステップと、
    （ｉｉ）前記組成物を蒸気処理するステップと、
    （ｉｉｉ）前記組成物をペレット化するステップと
    を含んでなる、飼料組成物を製造する方法。
14. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の飼料組成物に、又は請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の顆粒に、ムラミダーゼを組み込むステップを含んでなる、前記ムラミダーゼの安定性を改善する方法。
15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の飼料組成物に、又は請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の顆粒に、ムラミダーゼを組み込むステップを含んでなる、１２％を超える湿度を有するマッシュ組成物中の前記ムラミダーゼの安定性を改善する方法。
16. 蒸気処理ペレット化飼料組成物を調製するための、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の、ムラミダーゼを含んでなるコア、内部塩層、及び外部疎水性層を含んでなる、顆粒の使用。