JP2021532837A - 膜結合型核酸ナノ細孔 - Google Patents
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Abstract
Description
1)チャネル管腔は、チャネル管腔内側の大きな生体分子の分子を収容するために少なくとも約5nm幅であるべきであり、チャネル内の大きな生体分子の結合は、分析物が細孔入口で結合する場合よりもより高い読み出し感度を生じる、
2)細孔は、電気的な読み出しにおいて一定のベースレベルを達成する(すなわち、バックグラウンドノイズを低減する)ように構造的に画定されるべきである、かつ
3)細孔寸法は、細孔を異なる生体分子サイズに適合するように容易に調整可能であるべきである。
a.足場成分を提供する1つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
b.複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープル成分の各々が、足場成分にハイブリダイズし、
足場成分内に含まれる少なくとも1つのポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ膜内に埋め込まれ、膜と実質的に同一平面上にあり、
ナノ細孔が、膜を穿孔するために好適なチャネルを画定し、
チャネルが、その中心に沿って延びる長手方向軸、および少なくとも3nmの長手方向軸に垂直な最小内部寸法を有する、膜貫通ナノ細孔を提供する。
a.足場成分を提供する1つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
b.複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープル成分の各々が、足場成分にハイブリダイズし、
足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ膜内に埋め込まれ、膜と実質的に同一平面上にあり、それによって、ナノ細孔が、膜を穿孔するチャネルを画定し、中央チャネルが、少なくとも3nmの最小内部幅を有する管腔を有する。
a.ナノ細孔の周囲に結合し、実質的に等距離に配置され、複数の疎水性アンカー分子が、ナノ細孔のチャネルの縦軸から半径方向外向きに配向される、および/または
b.複数の疎水性アンカー分子が、挿入されると膜と相互作用する、および/または膜内に延びるように配向されるように、ナノ細孔またはその一部の膜に面する側に結合している。
−ステロールは、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択され、
−アルキル化フェノールは、メチル化フェノールおよびトコフェロールからなる群から選択され、
−フラボンは、フラバノン含有化合物および6−ヒドロキシフラボンからなる群から選択され、
−飽和および不飽和脂肪酸は、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択され、かつ/または
−合成脂質分子は、ドデシル−ベータ−D−グルコシドである。
i.少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖と、
ii.複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成し、
少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖および複数のステープルポリヌクレオチド鎖のいずれかまたは両方が、複数の疎水性アンカー分子をさらに含み、
膜貫通ナノ細孔は、少なくとも1つの足場ポリヌクレオチド鎖の大部分の配向が膜の平面に実質的に平行であり、それによって少なくとも約4nmの最小内部幅を有する中央チャネルを画定するように配置される、膜貫通ナノ細孔を提供する。
I.本明細書に記載の膜を提供することと、
II.ナノ細孔を分析物と接触させ、少なくとも1つのナノ細孔を通るイオンの流れ、またはナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
III.ナノ細孔を横切る電気信号を測定することと、を含み、
分子感知は、分析物の検出または特徴付けを含み、電気的測定の変化は分析物を示す、方法を提供する。
a)本発明の第3の態様に従って膜を提供することと、
b)ナノ細孔内のチャネルの最小内部幅未満の直径を有する少なくとも1つの生体分子を提供することと、
c)少なくとも1つの生体分子がナノ細孔を通過するまでインキュベートすることと、を含む方法を提供する。
I.酵素−ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ギラーゼ、テロメラーゼ、およびそれらの核酸結合サブドメインまたは誘導体を含む、
II.合成または天然由来の親和性結合タンパク質およびペプチド−アフィマー、抗原結合マイクロプロテイン、操作された複数の反復タンパク質、アンキリン結合ドメイン、ラクトフェリン、カテリシジン、フィコリン、コラーゲンレクチン、T細胞受容体ドメインおよびディフェンシンを含む、
III.抗体−ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化およびラクダ抗体、またはFab、scFv、Bis−scFv、VH、VL、V−NAR、VhHまたはその他の抗原結合単一ドメイン抗体フラグメントを含む抗原結合フラグメントおよびその誘導体を含む、
IV.オリゴヌクレオチドプローブ、アプタマーおよびリボザイムを含む、合成または天然由来の親和性結合核酸および核酸類似体、
V.薬物、フルオロフォア、代謝物およびケモカインを含む天然に存在するかまたは合成の小分子、ならびに
VI.受容体の結合ドメインを含むシグナル伝達分子および/またはそのポリペプチド受容体、および受容体複合体。
oペプチド/ポリペプチド/タンパク質−折り畳まれ、部分的/完全に折り畳まれていない、
o酵素、
oタンパク質/核酸コンストラクト、
oサイズによって定義される分子、
o指定されたサイズ範囲、例えば、1〜10kD、1〜50kD、1〜100kD、10〜50kD、10〜100kD、20〜50kD、および20〜100kDから選択された範囲内の高分子、
o多タンパク質複合体、
o抗原、
o糖タンパク質、
o炭水化物、
o生体高分子、
o毒素、
o代謝物およびその副産物、
oサイトカイン、
o核酸。
核酸平面環状ナノ細孔の構築
このナノ構造の設計は、半流動脂質膜に埋め込むことができ、特に分析物(図1b)およびイオンが膜バリアを選択的に通過することを可能にする、新しい大きなナノ細孔(図1a)を作成することを目的としていた。負に帯電したDNAナノ細孔を脂質二重層に挿入できるようにするために、疎水性コレステロールタグも構造内の選択された位置(この場合はナノ細孔の周囲に等間隔に配置された6つの位置)に組み込まれた(図1c)。
核酸平面環状ナノ細孔の組み立ておよび膜挿入
DNA環構造は、10本のDNA鎖、つまり1本の長い足場鎖Sおよび9本の短いステープル鎖から折り畳まれた。
POPC SUVを用いたDNA環媒介色素放出テスト(図5)
まず、POPC SUVは、従来の1xインキュベーションバッファーを使用せず、1x色素含有バッファー(500mM 6−カルボキシフルオレセイン(6−CF)を含む0.5 TAE)に変更して、前のセクションから変更した方法で調製し、脂質フィルムを再懸濁して、色素をロードしたSUVを形成した。次に、過剰な色素をG−25ゲル濾過によって除去した。精製されたSUV溶液は、さらに使用するために1xインキュベーションバッファーで10倍の容量に希釈した。
機能性ナノ細孔は、サイズに依存した様式でGUV小胞への色素の流入を媒介する
コレステロール標識ステープルおよびAtto647N−標識ステープルを保持するDNA環構造を、1×インキュベーションバッファー中のPOPC GUVに添加し、共焦点観察のためにGUVが落ち着くまで2分間待ってディッシュ中で穏やかに混合した。
核酸多角形環状ナノ細孔の構築
一般的な多角形の細孔の設計は、オリゴマータンパク質の細孔に触発され、複数のモジュラーブロックの多角形のフレームワークに依存している。図8を参照すると、多角形の細孔のブロックまたはモジュールは、挿入されると足場ポリヌクレオチド鎖の主要部分が膜に実質的に平行に走るように配置されたDNAヘリックス束から好適に構成される。本発明の多角形のナノ細孔は、三角形、および四角形または長方形、五角形、六角形、または台形などの四辺形を含む任意の好適な形状を有してよい。モジュールは、図8に示すように、10nmまたは20nmなどの調整可能な辺の長さを有することがある。モジュラーブロックは、平行に整列したDNA二重鎖の束で構成されている。図8A〜D(それぞれ三角形、四角形の細孔、五角形、六角形)では、ユニットは一辺の長さが約10nmの3×2の二重鎖の束で構成されている。比較すると、図8E〜8F(それぞれ、三角形および四角形)では、ユニットは一辺の長さが約20nmの3×4の二重鎖で構成されている。この例では、フレームは、約43〜約400nm2のチャネル領域を囲む。
核酸平面環状ナノ細孔の組み立てと膜挿入
モジュールは、足場とステープルのアプローチによって個別に調製された。設計アプローチは、最初に多角形フレームの表面部分を調製することによって検証された(垂直チャネル形成テールなし)。DNAナノ構造は、アニーリングと冷却によって組み立てられた。
DNAオリガミ細孔のTEMの特徴付け
本発明の一実施形態によるDNAナノ細孔は、四角形の10nm細孔について例示されるように、ゲル電気泳動における単一バンドによって示されるように均一に組み立てられた(図9D)。多角形のDNAフレームの設計された寸法および形状は、透過型電子顕微鏡とネガティブ染色で確認された(図8)。
コレステロールを欠く精製されたDNA細孔6μLをグロー放電処理されたTEMグリッド(Agar Scientific)に加え、2%ギ酸ウラニル溶液で染色した。TEM分析は200kVで動作するJEM−2100電子顕微鏡(JEOL)で実行され、画像はOriusSC200カメラで取得された。コレステロールタグを付けたナノ細孔を、500mM NaClを添加した0.5×TAE中のPOPCSUVと20分間インキュベートした後、EMグリッドに沈着させ、乾燥させ、ネガティブ染色し、TEM分析を行いた。SUVの調製には、2mLガラスバイアル中のPOPC溶液(20mg/mL 50μL、クロロホルム中)をアルゴン気流で乾燥し、乾燥したフィルムを1xインキュベーションバッファー(0.5×TAE、500mM NaClから1mL)で再懸濁した、30分間、超音波処理した。
GUVへのDNA細孔結合の顕微鏡分析
膜結合は、上記で調製されたコレステロールを運ぶ細孔を使用して検証された。アッセイでは、細孔を小さな単層小胞(SUV)とインキュベートした。SUVは大きすぎてゲルの網目構造に入ることができないため、結合はDNA細孔のゲル電気泳動バンドのアップシフトによって示された(図9D)。SUVがない場合のスメア細孔バンド(図9D)は、疎水性の脂質化面によるいくつかの細孔の非特異的相互作用を示している可能性がある。SUVへの細孔結合はTEMで直接視覚化された(図9H、20nm細孔)。膜結合の程度を調べるために、蛍光顕微鏡を使用した。Atto647Nフルオロフォアを運ぶ細孔は、Bodipyでタグ付けされた巨大な単層小胞(GUV)とインキュベートされた。GUVの蛍光顕微鏡画像は、細孔が膜によく結合していることを示唆する、両方の信号の均一な蛍光分布をもたらした(図9G−9H)。
ナノ細孔記録
DNA細孔が水で満たされた穴で脂質二重層を穿刺することを示すために、単一チャネルの電流記録を使用した。10nmの三角形のDNAナノ細孔、10nm×10nmの四角形のDNAナノ細孔、20nm×20nmの四角形のDNAナノ細孔のトレースおよびIV曲線を図10に示す。80pA、232pAおよび395pAのコンダクタンスは43nm2、100nm2、および400nm2の計算された断面細孔面積値と一致する。
1)大きな管腔。
これにより、タンパク質などのより大きな分析対象物の通過が可能になり、同時に既存のオリガミ細孔の幅は狭くなる。
2)材料の効率的な使用。
従来のオリガミ細孔の場合、通常は数百のステープル(約8000bp)を消費するが、この設計では、構造を形成するために必要な鎖は10本(300bp)のみであった。
3)シンプルで迅速な調製条件。
従来のオリガミ細孔の場合、オリガミ構造を折り畳むのに数日かかるが、このデザインでは折り畳みが2時間に短縮された。
4)簡単で正確な機能化。
細孔構造の明確な形成はそれに原子レベルの精度を与え、このことは、さらなるエンジニアリングが幅広い機能を獲得することを可能にする。
Claims (38)
- 膜貫通(membrane−spanning)ナノ細孔であって、前記ナノ細孔が、
a.足場成分を提供する1つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
b.複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
前記複数のステープル成分の各々が、前記足場成分にハイブリダイズし、
前記足場成分内に含まれる少なくとも1つのポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ前記膜内に埋め込まれ、前記膜と実質的に同一平面上にあり、
前記ナノ細孔が、前記膜を穿孔するために好適なチャネルを画定し、
前記チャネルが、その中心に沿って延びる長手方向軸、および少なくとも3nmの前記長手方向軸に垂直な最小内部寸法を有する、膜貫通ナノ細孔。 - 足場成分を提供する前記1つ以上のポリヌクレオチド鎖、および前記複数のステープル成分の少なくとも1つのいずれかまたは両方が、前記ナノ細孔の前記膜への挿入を促進する少なくとも1つの疎水性アンカーをさらに含む、請求項1に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記チャネルが、環状、楕円形および多角形からなる群から選択される前記長手方向軸に垂直な形状を有する、請求項1または2に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔が1つ以上のモジュールを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔が、前記1つ以上のモジュール間に接続された少なくとも1つのサブモジュールをさらに含む、請求項4に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記または各モジュールが、前記ナノ細孔が前記チャネルの前記長手方向軸の周りで回転対称性を有するように同一である、請求項5に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記または各モジュールが、少なくとも1つの他のモジュールに接続されている、請求項4〜6のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- モジュール間の前記接続が、前記モジュールのうち1つのステープル鎖またはその一部、前記モジュールのうち1つの足場鎖またはその一部、請求項5に記載のサブモジュール、スペーサー成分を提供する1つ以上のポリヌクレオチド鎖からなる群から選択される構造によって提供される、請求項7に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記足場成分、前記複数のステープル成分、および/または存在する場合は前記スペーサー成分内に含まれる少なくとも1つのポリヌクレオチド鎖がDNAを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔および/またはその成分の組み立てが、DNAオリガミ技術を介する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記少なくとも1つの疎水性アンカーが、前記足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖の疎水性部分から構成される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記少なくとも1つの疎水性アンカーが、前記複数のステープル成分またはその疎水性部分のうちの少なくとも1つから構成される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記少なくとも1つの疎水性アンカーが、複数の疎水性アンカー分子を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記複数の疎水性アンカー分子が、
a.前記ナノ細孔の周囲に結合し、実質的に等距離に配置され、前記複数の疎水性アンカー分子が、前記ナノ細孔の前記チャネルの前記長手方向軸から半径方向外向きに配向され、かつ/あるいは
b.前記複数の疎水性アンカー分子が、挿入されると前記膜と相互作用するか、および/または前記膜内に延びるように配向されるように、前記ナノ細孔またはその一部の膜に面する側に結合している、請求項13に記載の膜貫通ナノ細孔。 - 前記ナノ細孔が、少なくとも4つの疎水性アンカー分子を含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記少なくとも1つの疎水性アンカー分子が、脂質およびポルフィリンからなる群から選択される、請求項1〜10および請求項13〜15のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記脂質が、ステロール、アルキル化フェノール、フラボン、飽和および不飽和脂肪酸、ならびに合成脂質分子(ドデシル−ベータ−D−グルコシドを含む)からなる群から選択される、請求項16に記載の膜貫通ナノ細孔。
- −前記ステロールが、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択され、
−前記アルキル化フェノールが、メチル化フェノール、ドリコールおよびトコフェロールからなる群から選択され、
−前記フラボンが、フラバノン含有化合物、および6−ヒドロキシフラボンからなる群から選択され、
−前記飽和および不飽和脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択され、かつ/または
−前記合成脂質分子が、ドデシル−ベータ−D−グルコシドである、請求項17に記載の膜貫通ナノ細孔。 - 前記ナノ細孔が、三角形、四角形、四辺形、五角形、六角形、七角形、および八角形からなる群から選択される多角形の形態である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記ナノ細孔の前記チャネルの最小内部幅が、約20nm未満である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記足場成分が、配列番号1、配列番号2、配列番号13、および配列番号14からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記複数のステープル成分が、配列番号3〜12、配列番号15〜56、配列番号65〜94、配列番号105〜140、および配列番号153〜268からなる群のうちの1つ以上から選択される配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 少なくとも1つのリンカーをさらに含み、前記リンカーの少なくとも一部が前記チャネルの表面上または前記チャネルの表面に近接して位置する、請求項1〜22のいずれか1項に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記リンカーが分析物結合分子に結合し、それによって前記分析物結合分子が前記チャネル内またはチャネルに近接して位置する、請求項23に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記リンカーがポリヌクレオチド鎖であり、共有結合または水素結合を介して前記分析物結合分子に結合している、請求項24に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記分析物結合分子が、抗体、またはFabフラグメントを含むその抗原結合フラグメント、ペプチドアプタマー、マイクロプロテイン、アフィマー、受容体またはその結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、および核酸アプタマーからなる群から選択される分子を含む、請求項24または25に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記リンカーが、触媒活性を有する生体分子に結合している、請求項26に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 触媒活性を有する前記生体分子が酵素である、請求項27に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 前記生体分子が、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ギラーゼ、およびテロメラーゼからなる群から選択される、請求項28に記載の膜貫通ナノ細孔。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の少なくとも1つの膜貫通ナノ細孔が挿入されている、膜。
- 前記膜が、ポリマーで形成された半流体膜を含む膜および固体膜からなる群から選択される、請求項30に記載の膜。
- 前記半流体膜を形成する前記ポリマーが、両親媒性合成ブロックコポリマーで構成され、好適には親水性コポリマーブロックおよび疎水性コポリマーブロックから選択される、請求項31に記載の膜。
- 前記膜が、小胞、ミセル、平面膜、または液滴の形態である、請求項31または32に記載の膜。
- 前記固体膜が、II−IVおよびIII−V族の酸化物および窒化物、固体の有機および無機ポリマー、プラスチック、エラストマー、ならびにガラスからなる群から選択される材料から形成される、請求項31に記載の膜。
- 生物学的センサーであって、請求項30〜34のいずれか1項に記載の膜および電気測定装置を含む、生物学的センサー。
- 生物学的センサーであって、請求項30〜34のいずれか1項に記載の膜および蛍光測定装置を含む、生物学的センサー。
- 分子感知のための方法であって、
I.請求項30〜34のいずれか1項に記載の膜を提供することと、
II.ナノ細孔を分析物と接触させ、前記少なくとも1つのナノ細孔を通るイオンの流れ、または前記ナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
III.前記ナノ細孔を横切る電気信号を測定することと、を含み、
前記分子感知は、分析物の検出または特徴付けを含み、電気的測定の変化は前記分析物を示す、方法。 - 前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定、および電界効果トランジスタ(FET)測定から選択される、請求項37に記載の方法。
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