JP2021531819A - 低ａｄｃｃ／ｃｄｃ機能性モノクローナル抗体、及びその調製方法と使用 - Google Patents

Abstract

低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体、及びその調製方法と使用である。ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４７およびＣ５などの複数の標的に対する抗体の配列を操作し、ＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域の間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することで、多量体の形成を有意に増加させることなく、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させることができる。上記操作後の抗体と元の抗体は、同じ部位に対するものであるが、抗体のサブクラス又はグリコシル化が異なり、操作後の抗体は安定性が大幅に向上し、又は／及び、免疫原性が大幅に低下し、半減期が延長された。

Description

相互参照
本願は、２０１８年７月６日に出願された発明の名称が「低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１完全ヒト型モノクローナル抗体及びその使用」である中国特許出願第２０１８１０７３８５６５．８号、２０１８年８月１４日に出願された発明の名称が「ヒトプログラムデスレセプターＰＤ−１に対するＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗体」である中国特許出願第２０１８１０９２４２４９．Ｘ号、及び、２０１９年５月７日に出願された発明の名称が「ヒトＣＴＬＡ４に対するＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗体」である中国特許出願第２０１９１０３７６８５２．３号に基づく優先権を主張するものであり、それらの開示内容全体を援用により本願に取り込む。

本発明は、治療用抗体の調製及び使用に関するものであり、主に、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体の使用、及び抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ等の機能を低下させる方法に関するものである。

抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）とは、ＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するＮＫ細胞、マクロファージおよび好中球等が、標的細胞の表面に結合されたＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントと結合することで、これらの標的細胞を殺傷する作用である。ＩｇＧ抗体は、これらの細胞を媒介してＡＤＣＣ作用を発揮させることができるが、ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣ作用を発揮できる主な細胞である。抗体が媒介するＡＤＣＣ作用の発生過程では、抗体は、標的細胞上の対応するエピトープにのみ特異的に結合できるが、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞は、抗体に結合された任意の標的細胞を殺傷できるため、抗体と標的細胞上の抗原との結合は特異的であり、ＮＫ細胞などの標的細胞に対する殺傷効果は非特異的である。

ＣＤＣは、補体系が活性化された後、標的細胞の表面にＭＡＣが形成されることにより標的細胞が溶解されることを意味し、このような効果は、補体依存性細胞障害と呼ばれる。補体は、さまざまな細菌やその他の病原性生物細胞の溶解を引き起こすことができ、病原性生物による感染に抵抗するための生体の重要な防御メカニズムである。特に、グラム陰性菌の感染予防において重要な役割を果たしている。場合によっては、補体系は、生体の組織や細胞の損傷を引き起こし、過敏症や自己免疫疾患の発病過程に関与できる。

抗体医薬品の使用は、感染症や腫瘍に限らない。抗体の標的タンパク質への結合により誘導される不利なＡＤＣＣ機能とＣＤＣ機能を回避するため、現在採用されている主な方法として、抗体の重鎖に対して、グリコシル化部位におけるアミノ酸Ｎ（２９７）をＡに変異させる脱グリコシル化変異、又は、抗体の重鎖をＩｇＧ２／４サブクラスに変更するものがある。しかしながら、抗体の重鎖の脱グリコシル化により、生成物中の多量体の含有量が高くなり過ぎてしまい、薬物の免疫原性が著しく向上し、患者に複数回投与した後、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生の発生率が高くなる。ＩｇＧ２サブクラスの抗体は依然として、ＦｃγＲＩＩａへの結合により、単球が媒介するＡＤＣＣおよびマクロファージが媒介するＡＤＣＰを誘発できる。また、ＩｇＧ２のヒンジ領域の上流部に余分なＣｙｓ残基があるため、ＩｇＧ２分子の立体配座と機能に影響を与えるジスルフィド結合異性体が形成される。抗体の重鎖をＩｇＧ４サブクラスに変更すると、ＩｇＧ４サブクラスの抗体医薬品の重鎖は、血液において、自動的に他のヒトＩｇＧ４の重鎖と交換し、半分子で二重特異性の機能的に一価である抗体が形成される。同時に、ＩｇＧ２／４サブクラスの抗体の半減期はＩｇＧ１サブクラスよりも有意に短くなっている。

ＰＤ−１は、主に活性化されたＴ細胞とＢ細胞で発現し、その機能は免疫細胞の活性化を阻害することであり、これは免疫系の正常な自己安定化機構であり、過剰なＴ／Ｂ細胞の活性化が自己免疫疾患を引き起こすため、ＰＤ−１は、私たちの人体のお守りである。しかしながら、腫瘍微小環境により、浸潤Ｔ細胞によるＰＤ−１分子の高度発現が誘導され、腫瘍細胞は、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を高度に発現する。そのため、腫瘍微小環境におけるＰＤ−１経路が持続的に活性化され、Ｔ細胞の機能が阻害され、腫瘍細胞を殺傷できなくなる。
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１に対する抗体はいずれもこの経路を遮断し、Ｔ細胞の機能を部分的に回復させ、これらの細胞が腫瘍細胞を殺傷し続けられるようにすることができる。米国ＦＤＡは、２０１６年５月１８日に、プラチナ含有化学療法を受ける間／受けた後、または、プラチナ含有化学療法のネオアジュバント療法／アジュバント療法を受けた１２ヶ月以内に疾患が進行する局所進行性または転移性の尿路上皮がんの治療に用いられる、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（商品名：Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）注射液を承認した。しかしながら、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能の誘導を回避するために、当該抗体医薬品は、抗体の重鎖に対して脱グリコシル化変異を行ったため、生成物中の多量体の含有量が高くなり過ぎてしまい、薬物の免疫原性が著しく向上し、患者に複数回投与した後、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生の発生率が４１．５％にも達している。

米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１４年９月４日に、他のものと反応しなくなった進行性または切除不能な黒色腫の治療に用いられる、米国メルク（Ｍｅｒｃｋ）社のＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（商品名：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）の承認を加速した。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１７年５月２７日に、最初の複数種の癌の治療が可能な抗体医薬品である、マイクロサテライト不安定性を有する固形がんの治療に用いられるＫｅｙｔｒｕｄａを承認した。当該抗体医薬品は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能の誘導を回避するために、ＦｃγＲ受容体に対する親和性が弱く、補体を活性化する能力に欠けるＩｇＧ４サブクラスを使用した。ＩｇＧ４サブクラス抗体自身にＦａｂアーム交換が存在するため、半抗体または二重特異性抗体を形成する可能性があり、投薬の潜在的なリスクが高まり、また、ＩｇＧ４サブクラス抗体の製造プロセスはＩｇＧ１サブクラス抗体ほど成熟していない（主に構造安定性、物理的・化学的特性、耐重合性、発現量などに現れる）。

これは、臨床患者の使用にリスクと不便をもたらしており、同時に、薬の半減期も比較的に短く、使用過程でも、この不足を補うために薬の投与量を増やす必要がある。これに基づいて、抗体の親和性と特異性を影響することなく、抗体の定常領域を操作することで、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させるとともに、抗体医薬品が大量な多量体を形成することを回避して抗体医薬品の免疫原性を低下させることができれば、一方ではモノクローナル抗体の安全性を向上させることができ、他方では、薬物の半減期を延ばすことができ、その投与量を減らしつつ治療効果を向上させることもできる。

ＣＤ１５２とも呼ばれるＣＴＬＡ−４は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で発現する、ＣＴＬＡ−４遺伝子によってコードされる膜貫通型タンパク質であり、Ｔ細胞表面の補助刺激受容体（ＣＤ２８）と高い相同性を有する。ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８はいずれも免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、両者は、同じリガンドＣＤ８６（Ｂ７−２）とＣＤ８０（Ｂ７−１）に結合する。ＣＴＬＡ−４の免疫調節機能の鍵は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−、ＣＤ８＋Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の制御にある。ＣＴＬＡ−４は、活性化されたＴ細胞の応答（Ｔ細胞応答、Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を中止させることができ、そして、Ｔｒｅｇの抑制機能を媒介できる。従来の研究により、ＣＴＬＡ−４が主に２つの経路を介してＴ細胞応答を阻害することが明らかとなった。その１つは、ＣＤ２８と競合的にＢ７に結合して、又はＣＴＬＡ−４の細胞内ドメインにホスファターゼを動員してＴＣＲ（Ｔ細胞受容体、Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とＣＤ２８のシグナルを低減する経路である。もう１つは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）でのＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを下げて、又はトランスエンドサイトーシス（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によってＡＰＣからそれらを除去して、Ｔ細胞の活性化におけるＣＤ２８の関与を減らすことである。また、ＣＴＬＡ−４は、樹状細胞のＣＤ８０／ＣＤ８６への結合も媒介し、トリプトファン分解酵素ＩＤＯの発現を誘導して、ＴＣＲの阻害を引き起こす。ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合することにより、Ｔｒｅｇを減少させ、ＴＣＲを活性化させる。

米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１１年４月に、進行性黒色腫の治療に用いられる米国ブリストルマイヤーズスクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，ＢＭＳ）社のｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（商品名：Ｙｅｒｖｏｙ）を承認し、それが市場に投入された最初の免疫チェックポイント阻害剤となった。しかし、その適応症が非常に少ないため、市場投入までの時間などでは１位を獲得したが、市場でより大きな割合を占めるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１関連の抗体医薬品に追い越され、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の３５０億ドルの市場シェアに比べ、抗体医薬品Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの２０１７年の年間売上高はわずか１２億ドルであった。今まで、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に対する抗体の承認された適応症には、進行性黒色腫、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、尿路上皮がん、ホジキンリンパ腫、メルケル細胞癌（Ｍｅｒｋｅｌ’ｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）固形がんが含まれるが、ＣＴＬＡ−４抗体ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの適応症は、進行性黒色腫および高リスク再発性黒色腫に限られる。なお、ＰＤ−１抗体に比べ、ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂは、進行性黒色腫の治療有効率が低いが、免疫関連副作用の発生率がより高い。これは、臨床患者の使用にリスクと不便をもたらしており、抗体医薬品の市場シェアと販売シェアを大幅に制限している。
現在、ＣＴＬＡ４抗体の主な推進方向は、複数の標的に対するより効果的な併用投与であり、例えば、ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂとＮｉｖｏｌｕｍａｂ（抗ＰＤ−１抗体）とを併用したところ、その抗腫瘍効果が大幅に増加する。そのため、併用投与の分野では、ＣＴＬＡ４抗体の多くの有名な抗体医薬品（ＰＤ−１抗体Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂなど）との併用療法によりその市場シェアが効果的に拡大されている。しかしながら、半数以上の患者においてグレード３〜４の重篤な副作用が現れ、抗ＣＴＬＡ−４抗体の研究開発と使用を制限する最も重要な要因になっている。

ＣＴＬＡ４抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂは強いＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を有するＩｇＧ１サブクラスを使用しており、このような強いＡＤＣＣ効果は、免疫療法により誘導される副作用を引き起こし、これは主にＦｃＲが媒介する腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の特異的な排除によって生じる。したがって、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性抗体は、ＡＤＣＣによる相応の副作用の発生率を効果的に減らすことができる。

ＢＭＳのイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）は、抗ＣＴＬＡ−４ヒトＩｇＧ１であり、３ｍｇ／ｋｇの投与量で、３週間ごとに合計４回静脈内投与される。イピリムマブの副作用は非常に強く、単独投与の場合、患者の１０〜２０％では、Ｔ細胞の過剰な活性化と繁殖により、重篤な副作用が発生し、死に至ることもある。ニボルマブとの併用により抗腫瘍効果は大幅に向上するが、半数以上の患者において、グレード３〜４の重篤な副作用が現れる。重篤な副作用の場合、投与を永久に中止する。イピリムマブが、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路による免疫系の抑制を一時的に阻害するだけでなく、それ自身のＡＤＣＣ機能によって制御性Ｔ細胞も殺されてしまい、患者の免疫抑制調節がきっぱりと解除され、免疫系が過剰に活性化されてしまうことを見出した。イピリムマブに対してＡＤＣＣ／ＣＤＣをなくす操作を行うことで、先発医薬品の中和効果を保持するだけでなく、ＡＤＣＣの毒性の副作用も除去できれば、免疫療法に関連する免疫毒性を大幅に軽減し、グレード３〜４の重篤な副作用の発生率を顕著に低減でき、より安全になる。
今までは、アミノ酸配列を挿入することにより、抗体医薬品における多量体の含有量とその免疫原性を低減させることが報告されていない。

本発明の第一の目的は、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減する方法及びその使用を提供することである。

本発明の第二の目的は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣが低く、多量体が少なく、免疫原性が低い、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４等の複数種のモノクローナル抗体を含む治療性抗体及びその使用を提供することである。

上記発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術案を採用する。
本発明は、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖の定常領域に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入する、ＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減又は除去する方法を提供する。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、当該方法は、オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入するものである。

さらに、前記挿入された一定の長さの柔軟なアミノ酸配列は、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減する。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＩｇＧ１抗体であるモノクローナル抗体は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、Ｃ５、Ａβ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＨＧＦ、ＣＭＥＴ、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＬ１１、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＤＫＫ１／２、ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＬＬ４、ＰＤＧＦＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１／２、ＲＡＮＫＬ、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＧＣＧＲ、ＣＧＲＰ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＴＦＰＩ、ＦＣＧＲＴ、ＣＤ４７抗体であり、例えば、モノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｅｒｅｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｆａｓｉｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ等の抗体医薬品のＩｇＧ１サブクラスの改良型である。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記柔軟なアミノ酸配列は、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記柔軟なアミノ酸配列の挿入部位は、ＧＧ（１３８／１３９）、ＳＳ（１７７／１７８）、ＳＧ（１７８／１７９）、ＳＳ（１８４／１８５）、ＳＳＳ（１９１／１９２／１９３）、ＬＬ（２３５／２３６）、ＧＧ（２３７／２３８）を含むが、これらに限定されるものではない。

また、本発明は、抗体の安定性の向上／抗体の免疫原性の低下／抗体の半減期の延長における、柔軟なアミノ酸配列の使用を提供する。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記柔軟なアミノ酸配列は、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖の定常領域に挿入される。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記柔軟なアミノ酸配列は、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３とＣＨ２との間に挿入される。

また、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を含む、ＡＤＣＣ／ＣＤＣが低く、多量体が少なく、免疫原性が低い治療用抗体を提供する。

また、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を含む、ＡＤＣＣ／ＣＤＣが低く、多量体が少なく、免疫原性が低い治療用抗体の調製方法を提供する。

本発明は、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ誘導の作用機序に基づき、抗体の重鎖の定常領域に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することにより、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体医薬品の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体医薬品と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球等のＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減する。

また、本発明は、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社の抗体医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの、２９８番目のアミノ酸であるＡを元のＮに変異させてグリコシル化を回復した上で、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達を遮断することにより、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させるとともに、多量体の形成を有意に増加させないことを達成する。

本発明の低免疫原性の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、元のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの配列における非抗原結合部位に対してアミノ酸の操作を行い、その免疫原性を低下させたものであって、前記元のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの配列における重鎖の全長のアミノ酸配列と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２が示すとおりである。

さらに、本発明で提供される低免疫原性の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号３又は４が示すとおりであり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２が示すとおりである。

本発明で提供される抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、軽鎖がＬ０（配列番号２）が示すとおりであり、重鎖の全長がＨ−１（配列番号３）、Ｈ−２（配列番号４）の２つの塩基配列に示されるいずれかの配列を備える。

本発明は、上記の軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を備える組み合わせから、スクリーニングにより２つのモノクローナル抗体の配列を得、当該抗体は、本来の、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性を維持しながら、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合を特異的に遮断でき、さらに、多量体の含有量も減少させている。これにより、免疫原性を効果的に低下させることができる。また、操作過程におけるＡＤＣＣ活性の検証結果により、本発明でスクリーニングにより得られた２つのモノクローナル抗体の配列のＡＤＣＣ活性が、元のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと一致していることが明らかとなっている。

本発明で得られる２つの低免疫原性の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、それぞれ、Ｈ−１Ｌ０、Ｈ−２Ｌ０である。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

前記生物学的材料は、発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である。

本発明は、疾患を治療する医薬品の調製における、上記２つの低免疫原性の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記疾患は、腫瘍、免疫機能低下等である。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における、上記抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記医薬品は、抗腫瘍薬、免疫機能低下疾患の医薬品である。

本発明は、上記抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を含有する医薬品又は検出試薬を提供する。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における、上記低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、第２の治療剤または治療形態と組み合わせることができる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＴＬＡ−４抗体またはＣＤ４７抗体の投与を含む癌治療と組み合わせることができる。組み合わせの非限定的な例には、メラノーマまたは非小細胞肺癌の治療における抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の併用が含まれる。

本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる治療は、化学療法と組み合わせることができる。細胞毒性薬を使用する化学療法は、癌細胞を死に至らしめることによって、腫瘍抗原の放出を増加させる。前記腫瘍抗原の増加の有効性は、抗ＰＤ−Ｌ１療法との相乗効果につながりうる。

治療対象から癌細胞を除去するために、本発明のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を用いる治療は、手術と組み合わせることができる。

本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１遮断と相乗効果を発揮できる療法と組み合わせることができ、前記療法は、ホルモン除去または血管新生の阻害のための標的薬、または腫瘍細胞において活性を有するタンパク質を標的とする標的薬を含み、それらはいずれも、腫瘍の細胞死の増加と、免疫刺激性腫瘍抗原の有効性の向上につながる。

本発明の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、癌または感染症を治療するための別の治療用抗体と組み合わせることができる。具体的な例としては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を標的とする抗体との組み合わせがある。

本発明は、以下のステップを含む、上記抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の調製方法を提供する。
（１）本発明は、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの構造を分析し、抗体の可変領域と定常領域との間で比較的柔軟な領域を探し、対応する領域に柔軟なアミノ酸配列を挿入し、対応する配列に対して遺伝子合成、シーケンスを実行し、シーケンスが正しい配列を選択する。
（２）本発明は、既知の抗体の重鎖のグリコシル化情報により、対応する修飾後の配列に対して全遺伝子合成を実行し、合成された遺伝子に対してシーケンスを実行するとともに、シーケンスが正しい配列を選択して次のステップを実行し、軽鎖の可変領域の酵素切断部位をＫｐｎ Ｉ＋ＢａｍＨ Ｉとし、重鎖の可変領域の酵素切断部位をＫｐｎ Ｉ＋Ａｇｅ Ｉとし、それぞれ、発現ベクターであるｐＪＨ１６ベクターに接続し、それと同時に大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、重鎖、軽鎖キメラ抗体の発現ベクターを得る。構築された抗体のシーケンスと配列の比較を同時に行う。
（３）上記の発現ベクターに対して、プラスミドの大量精製を行い、ＱｉａｇｅｎのＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを選択する。
（４）選択されたプラスミドの組み合わせを最適化し、ＣＨＯ細胞で一過性トランスフェクション発現を実行し、発現された抗体に対して親和性とＥＣ５０の検出を実行し（詳細は図２を参照）、検出結果により、組み合わせを選択して安定トランスフェクションを実行する。
（５）本発明では、以上の検出結果に基づいて、対応する組み合わせを選択し、エレクトロトランスフェクションにより安定株を構築し、同時に、ＭＴＸを用いて抗体の発現の程度をスクリーニングし、加圧後の安定株に対してモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、最終的に抗体の収量の高い安定株を選択して、その後の実験に使用する。
（６）本発明によって作製されるモノクローナル抗体のマウス体内における免疫反応は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂより弱い。

本発明で提供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂは、ＰＤ−Ｌ１の同じ部位に対するものであるが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、免疫原性と抗体の立体配座がＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａと異なり、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍｍａｂに比べて、安定性が著しく向上し、免疫原性が大幅に低下し、動物体内における薬物の半減期が長くなり、非常に理想的な生物学的な標的治療用抗体になることが有望視されている。本発明では、モノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの定常領域の配列を操作することにより、当該抗体医薬品による患者体内の免疫原性の発生リスクを著しく低減させている。本発明の実施例により、本発明の改良型Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ抗体のＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性が元のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍｍａｂに近く、ＡＤＡ感染価が著しく低下し、抗体医薬品の半減期が延長され、効果が向上したことが明らかとなった。

また、本発明は、ヒトＰＤ−１に対するＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体及び当該モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明は、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ誘導の作用機序に基づき、オリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂのアミノ酸配列を操作することで、抗体をＩｇＧ４サブクラスからＩｇＧ１サブクラスに変更し、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、モノクローナル抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減する。前記オリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の全長のアミノ酸配列は、配列番号５が示すとおりであり、軽鎖の全長のアミノ酸配列は、配列番号６が示すとおりである。

さらに、本発明で提供されるＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体は、重鎖の全長に配列番号７が示すアミノ酸配列又は配列番号７が示すアミノ酸配列の変異体を含み、軽鎖の全長に配列番号６が示すアミノ酸配列又は配列番号６が示すアミノ酸配列の変異体を含む。

上記のいずれの実施形態において、抗体の重鎖定常領域又はその変異体は、ＩｇＧ１である。

本発明の抗体では、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達が遮断され、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させるとともに、抗体の後の作製プロセスの開発の難度を下げ、抗体の耐重合性、発現量及び安定性を向上させることを達成している。

具体的には、本発明で提供されるＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体は、軽鎖の全長のアミノ酸配列が、Ｌ０（配列番号６）が示すとおりであり、重鎖の全長のアミノ酸配列が、Ｈ１（配列番号７）が示す配列を有する。
本発明は、上記の軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を備える組み合わせから、スクリーニングによりＨ２Ｌ０モノクローナル抗体の配列を得る。当該抗体は、本来の、ヒトＰＤ−１に対する結合親和性を維持しながら、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合を特異的に遮断でき、ＡＤＣＣ機能とＣＤＣ機能の活性を低減させる。そして、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体であるため、ＩｇＧ４サブクラスであるオリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂに比べて、生産プロセスがより成熟で、難度が低く、抗体の耐重合性、発現量及び安定性が全て向上している。

本発明は、上記のいずれか一つのＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子を含む発現ベクターを提供する。前記発現ベクターを含む宿主菌、宿主細胞又は発現カセットも、本発明の保護範囲内に含まれる。
本発明は、治療量の本発明の抗体を治療が必要な対象に投与することを含む、免疫細胞の活性を高める方法を提供する。前記方法は、癌の治療に使用でき、また、免疫力低下疾患の治療にも使用できる。本発明は、また、第２の治療剤又は治療形態をさらに与えることを含む。

本発明は、また、免疫機能を高める医薬品の調製における、上記抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の使用を含む。

本発明の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、第２の治療剤または治療形態と組み合わせることができる。抗ＰＤ−１抗体は、組換サイトカインの投与や免疫因子の分泌を含むがん治療と組み合わせることができる。組み合わせの非限定的な例には、メラノーマ又は腎細胞癌の治療における抗ＰＤ−１抗体と組換ＩＬ−２又は組換ＩＦＮ２との併用が含まれる。組換ＩＬ−２は、がん患者体内のＴ細胞の発生を増加させる。組換ＩＦＮ２は、治療を受ける患者においてがん細胞の成長を抑制するだけでなく、がん細胞、抗原提出細胞、およびその他の体細胞におけるＰＤ−１の抑制性配位子の発現を向上させる。本発明の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、癌または感染症の治療に使用できると考えられるその他のサイトカインと組み合わせることができる。

本発明の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体又は抗体断片は、ワクチンと組み合わせて、がんまたは感染症を予防または治療できる。非限定的な例として、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、治療されるがんや感染に関する一種または複数種の抗原を含むタンパク質、ペプチドまたはＤＮＡワクチン、若しくは、前記抗原により刺激された樹突細胞からなるワクチンと組み合わせることができる。本発明は、抗ＰＤ−１抗体の、（弱体化された）がん細胞又は全ウイルスワクチン（ｗｈｏｌｅ−ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）の用途を提供する。本発明は、抗ＰＤ−１治療法と、遺伝子工学による操作を経た、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する全細胞がんワクチンとの組み合わせを提供する。

本発明の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、癌または感染症の看護基準とみなされる治療と組み合わせることができる。前記組み合わせの基本的な原理は、抗ＰＤ−１と同時に高められる免疫活性化作用が、介護治療基準の初期臨床症状を誘導又は促進し、長期的な臨床症状、及び疾患に対する長期的な免疫制御を誘導することである。

本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いる治療は、化学療法と組み合わせることができる。細胞毒性薬を使用する化学療法は、癌細胞を死に至らしめることによって、腫瘍抗原の放出を増加させる。前記腫瘍抗原の増加の有効性は、抗ＰＤ−１療法との相乗効果につながりうる。

治療対象から癌細胞を除去するために、本発明のＰＤ−１モノクローナル抗体を用いる治療は、手術と組み合わせることができる。

本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１遮断と相乗効果を発揮できる療法と組み合わせることができ、前記療法は、ホルモン除去または血管新生の阻害のための標的薬、または腫瘍細胞において活性を有するタンパク質を標的とする標的薬を含み、それらはいずれも、腫瘍の細胞死の増加と、免疫刺激性腫瘍抗原の有効性の向上につながる。抗ＰＤ−１抗体と併用する場合、Ｔ細胞活性化作用の向上は、がんに対する持続的な免疫制御を引き起こしうる。

本発明の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、癌または感染症を治療するための別の治療用抗体と組み合わせることができる。具体的な例としては、抗ＰＤ−１抗体とＨｅｒ２／ｎｅｕ又はＥＧＦ受容体を標的とする抗体との組み合わせ、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせ、抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片とＯＸ４０を標的とする抗体との組み合わせがある。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

前記生物学的材料は、発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である。

本発明は、疾患を治療する医薬品又は免疫機能を向上させる医薬品の調製における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記疾患は、腫瘍、免疫機能低下等である。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記医薬品は、抗腫瘍薬、免疫機能低下疾患の医薬品である。

本発明は、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体を含む医薬品又は検出試薬を提供する。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＰＤ−１モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明は、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して、米国メルク（Ｍｅｒｃｋ）社のＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの構造を分析し、抗体をＩｇＧ４サブクラスからＩｇＧ１サブクラスに変更するとともに、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させながら、抗体の後の作製プロセスの難度を下げ、抗体の耐重合性、発現量及び安定性を向上させ、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖置換特性による半抗体と二重特異性抗体の形成を回避することを達成している。本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性が元のＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ抗体に近く、ＰＤ−１と細胞表面のＰＤ−Ｌ１との結合を特異的に遮断し、抗体医薬品の半減期を延長させ、治療効果を高めることができ、臨床応用価値に優れる。

また、本発明は、ヒトＣＴＬＡ４に対する、ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体及び当該モノクローナル抗体の使用を提供する。

本発明は、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ誘導の作用機序に基づき、オリジナルのモノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂのアミノ酸配列を操作することで、ＩｇＧ１サブクラス抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、モノクローナル抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減する。前記オリジナルのモノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖の全長のアミノ酸配列は、配列番号８が示すとおりであり、軽鎖の全長のアミノ酸配列は、配列番号９が示すとおりである。

本発明は、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して、米国ブリストルマイヤーズスクイブ（ＢＭＳ）社のｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの構造を分析し、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させながら、抗体の治療における副作用を低減させ、抗体の耐重合性、発現量及び安定性を向上させることを達成している。本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に対する結合親和性が元のｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ抗体に近く、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０及びＣＤ８６との結合を特異的に遮断し、抗体医薬品の治療における副作用を低減させ、抗体医薬品の治療効果を高めることができ、臨床応用価値に優れる。

さらに、本発明で提供されるＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、重鎖の全長に配列番号１０が示すアミノ酸配列を含み、軽鎖の全長に配列番号９が示すアミノ酸配列を含む。

上記のいずれの実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブクラスである。

本発明の抗体では、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達が遮断され、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させるとともに、抗体の後の作製プロセスの開発の難度を下げ、抗体の耐重合性、発現量及び安定性を向上させることを達成している。

具体的には、本発明で提供されるＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、軽鎖の全長のアミノ酸が、Ｌ０（配列番号９）が示すとおりであり、重鎖の全長のアミノ酸配列が、Ｈ１（配列番号１０）の配列が示すとおりである。

本発明では、Ｈ１Ｌ０モノクローナル抗体の配列をスクリーニングする。当該抗体は、本来の、ヒトＣＴＬＡ４に対する結合親和性を維持しながら、ＣＴＬＡ４とその配位子との結合を特異的に遮断でき、さらに、ＡＤＣＣ機能とＣＤＣ機能の活性を低減させる。

本発明は、上記のいずれか一つのＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子を含む発現ベクターを提供する。前記発現ベクターを含む宿主菌、宿主細胞又は発現カセットも、本発明の保護範囲内に含まれる。

本発明は、治療量の本発明の抗体を治療が必要な対象に投与することを含む、免疫細胞の活性を高める方法を提供する。前記方法は、癌の治療に使用でき、また、免疫力低下疾患の治療にも使用できる。本発明は、また、第２の治療剤又は治療形態をさらに与えることを含む。

本発明は、また、免疫機能を高める医薬品の調製における、上記抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の使用を含む。

本発明の抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、第２の治療剤または治療形態と組み合わせることができる。抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含むがん治療と組み合わせることができる。組み合わせの非限定的な例には、メラノーマまたは非小細胞肺癌の治療における、抗ＣＴＬＡ４抗体と抗ＰＤ−１抗体との併用が含まれる。

本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体を用いる治療は、化学療法と組み合わせることができる。細胞毒性薬を使用する化学療法は、癌細胞を死に至らしめることによって、腫瘍抗原の放出を増加させる。前記腫瘍抗原の有効性の増加は、抗ＣＴＬＡ４療法との相乗効果につながりうる。

治療対象から癌細胞を除去するために、本発明のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体を用いる治療は、手術と組み合わせることができる。

本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４遮断と相乗効果を発揮できる療法と組み合わせることができ、前記療法は、ホルモン除去または血管新生の阻害のための標的薬、または腫瘍細胞において活性を有するタンパク質を標的とする標的薬を含み、それらはいずれも、腫瘍の細胞死の増加と免疫刺激性腫瘍抗原の有効性の向上につながる。抗ＣＴＬＡ４抗体と併用する場合、Ｔ細胞活性化作用の向上は、がんに対する持続的な免疫制御を引き起こしうる。

本発明の抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、癌または感染症を治療するための別の治療用抗体と組み合わせることができる。具体的な例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体と、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体との組み合わせがある。

本発明は、ＣＴＬＡ４を標的とする疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記モノクローナル抗体又は当該モノクローナル抗体を含む生物学的材料の使用を提供する。

前記生物学的材料は、発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である。

本発明は、疾患を治療する医薬品又は免疫機能を向上させる医薬品の調製における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記疾患は、腫瘍、免疫機能低下等である。

本発明は、ＣＴＬＡ４を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の使用を提供する。

前記医薬品は、抗腫瘍薬、免疫機能低下疾患の医薬品である。

本発明は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の併用を提供する。
本発明は、腫瘍細胞の殺傷又は免疫力変性疾患の治療における、上記ＩｇＧ１サブクラスの低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の使用を提供する。

以上、本発明の抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させる方法によれば、多量体の形成を有意に増加させることなく、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させることができる。操作後のモノクローナル抗体とオリジナルのモノクローナル抗体とは同一部位に対するものであって、いずれもＡＤＣＣ機能が除去されたが、抗体の立体配座が異なり、操作後のモノクローナル抗体は、安定性が著しく向上し、免疫原性が著しく低下し、半減期が長くなり、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能による副反応が効果的に回避され、治療効果が向上し、臨床応用価値に優れる。

本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（Ｈ−１Ｌ０）と元の抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の配列のアライメント結果を示す図である。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と元の抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの親和性の評価結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 本発明の操作後の２つのＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（Ｈ−１Ｌ０、Ｈ−２Ｌ０）と元の抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＡＤＣＣ活性実験の結果を示す図である。縦軸はＲａｊｉ−ＰＤＬ１細胞の溶解百分率であり、横軸はサンプルの濃度であり、ＩＭＭ２５は陽性対照としてのＡＤＣＣ陽性抗体であり、先発医薬品ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂをＡＤＣＣ実験の陰性対照とする。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１活性に対する抑制の細胞実験の結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸はルシフェラーゼの酵素活性の平均値である。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と元の抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＡＤＡ評価の比較を示す図である。横軸は血清の希釈率であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 元の抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＨＰＬＣ−ＳＥＣの結果を示す図である。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣの結果を示す図である。 先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの糖鎖構造解析の質量分析の結果を示す図である。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の糖鎖構造解析の質量分析の結果を示す図である。 本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と元の抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの熱安定性の実験結果を示す図である。図中の横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と元の抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖のアライメント結果を示す図である。 本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と元の抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの親和性の評価結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と元の抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂのＡＤＣＣ活性の実験結果を示す図である。縦軸はＲａｊｉ−ＰＤ−１細胞の溶解百分率であり、横軸はサンプルの濃度であり、先発医薬品ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂをＡＤＣＣ実験の対照とし、ＩｇＧ１サブクラスに変化されたモノクローナル抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂをＡＤＣＣ実験の陽性対照とし、Ｈ１Ｌ０は、本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体である。 本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と元の抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂのＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１活性に対する抑制の細胞実験の結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸はルシフェラーゼの酵素活性の平均値である。 本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖のアライメント結果を示す図である。 本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの親和性の評価結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂのＡＤＣＣ活性の実験結果を示す図である。縦軸はＲａｊｉ−ＣＴＬＡ４細胞の溶解百分率であり、横軸はサンプルの濃度であり、先発医薬品ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂをＡＤＣＣ実験の陽性対照とし、Ｈ１Ｌ０は、本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体である。 本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０及びＣＤ８６との結合を阻害する活性の実験結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。 本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂが、ＣＤ８０及びＣＤ８６と競合的にヒトＣＴＬＡ４にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に結合した結果を示す図である。横軸は抗体の濃度（Ｍ）であり、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度である。

用語と定義
「抗体」とは、所望の生物学的活性（例えば、リガンドとその受容体との結合の阻害、またはリガンドによって誘導される受容体のシグナル伝達の阻害）を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、前記抗体は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体を含むが、これらに限定されるものではないことは明確である。

「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖、１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域からなるものである。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントである。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合される。

「Ｆａｂ’フラグメント」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含む１つの重鎖とを含んでいるため、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成できる。

本願で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同じ抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量で存在し得る可能な天然変異体を除いて、前記集団を構成する各抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高度な特異性を持ち、単一の抗原部位を標的とすることができる。さらに、通常、複数の異なる決定基（エピトープ）を標的とする複数の異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。修飾用語「モノクローナル」は、実質的に同じ抗体集団から得られる抗体の特性を指し、前記抗体の調製のためにいずれの特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「柔軟なアミノ酸配列」という用語は、両端のドメインの空間的コンフォメーションによる相互干渉を防止または低減するための、側鎖の小さいアミノ酸からなる一定の長さのＣ−ペプチドを指し、その配列は、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、造血を起源とし、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、リンパ球、例えば、Ｂ細胞やＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球が含まれる。

本明細書で使用される「約」という用語は、数値が当業者によって測定される具体的な値の許容誤差範囲内にあることを指し、前記数値はどのように測量または測定したのか（すなわち、測量システムの限界）に部分的に依存する。たとえば、当分野のすべての実行において、「約」は、１以内または１以上の標準偏差を意味できる。あるいは、「約」または「実質的に含む」は、最大２０％の範囲を意味できる。また、特に生物学的システムまたはプロセスにおいて、この用語は、最大で１桁、または最大で数値の５倍を意味できる。特に断りがないかぎり、具体的な値が本願および特許請求の範囲に現れる場合、「約」または「実質的に含む」の意味は、当該具体的な値が許容可能な誤差範囲内にあると想定されるべきである。

リガンド／受容体、抗体／抗原または他の結合ペアに言及する場合、「特異的」結合とは、タンパク質および／または他の生物学的試薬の異種群において、ＰＤ−１などのタンパク質の結合反応があるかどうかを確定することを指す。したがって、特定の条件下において、特定のリガンド／抗原は、特定の受容体／抗体に結合し、有意な量でサンプルに存在する他のタンパク質と結合しない。

「投与」および「治療」を使用して、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に言及する場合、「投与」および「治療」は、外因性薬物、治療剤、診断薬または組成物を動物、ヒト、治療を受ける者、細胞、組織、器官または生体液と接触させることを意味する。「投与」および「治療」は、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法、および実験方法を指すことができる。細胞の治療には、試薬の細胞との接触、および試薬の流体との接触が含まれ、前記流体は細胞と接触する。「投与」および「治療」はまた、例えば、試薬、診断薬、結合組成物、または他の細胞による、インビトロおよびエクスビボでの細胞の治療をも意味する。

「有効量」は、医学的疾患の症状または病状を改善または予防するのに十分な量を含む。また、有効量は、診断を可能にするまたは促進するのに十分な量を意味する。治療を受ける者に対する具体的な有効量は、治療する疾患、患者の全体的な健康状態、投与方法と投与量、及び副作用の重篤度などの複数種の要素によって変わる。有効量は、顕著な副作用または毒作用を回避する最大量または投与レジメンであっても良い。モノクローナル抗体の調製では、本発明に係る抗体のＤＮＡを発現ベクターに導入し、次いでベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成できる。前記宿主細胞として、例えば、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンを別途産生しない骨髄腫細胞がある。抗体の組換え調製については、以下でより詳細に説明する。

適宜な投与経路には、非経口投与（例えば、筋肉内注射、静脈内または皮下投与）および経口投与が含まれる。医薬組成物に使用される抗体、または本発明の方法を実施するために使用される抗体は、複数種の常法に従って投与できるが、これらの方法として、例えば、経口摂取、吸入、局所適用または経皮、皮下、腹腔内、非経口、動脈内または静脈注射がある。全身投与ではなく局所投与（通常は持効性製剤または徐放性製剤）により抗体を投与することができ、例えば作用部位に抗体を直接に注射することができる。また、標的薬送達システムで抗体を投与することができる。

本明細書で使用される「阻害」または「治療（ｔｒｅａｔ又はｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患に関連する症状の進展を遅らせること、および／または前記疾患の進展するまたは進展すると予想されるこれらの症状の重篤度を軽減することを含む。前記用語には、既存の症状の緩和、他の症状の予防、およびこれらの症状の潜在的な原因の緩和または予防も含まれる。したがって、前記用語は、病気を患っている脊椎動物対象に有益な結果を与えたことを意味する。

本明細書で使用される「治療量」または「有効量」という用語は、抗体またはそのフラグメントを単独で、または別の治療剤と組み合わせて、細胞、組織または治療を受ける者に投与する場合、治療する疾患または病状を効果的に予防または緩和する量を意味する。治療量は、さらに、症状の緩和を引き起こすのに十分な前記化合物の量を指し、前記症状の緩和は、例えば、関連する病気の治療、治癒、予防または緩和、もしくは前記病気の治療率、治癒率、予防率、または緩和率の向上である。個体に単独投与する活性成分を投与する場合、治療量は当該単独投与された成分の量を指す。組み合わせて投与する場合、治療量は、併用投与、連続投与、同時投与のいずれの場合でも、治療効果が生じる有効成分の合計量を意味する。治療量は、症状を通常少なくとも１０％、通常少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％軽減する。

本発明の医薬組成物には、さらに、他の薬剤が含まれてもよく、細胞毒性薬、細胞増殖阻害剤、抗血管新生薬または代謝拮抗薬、標的抗腫瘍薬、免疫賦活剤または免疫調節剤、もしくは細胞毒性薬、細胞増殖阻害剤または他の毒性薬物と結合する抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬組成物を、他の治療形態（例えば、手術、化学療法、および放射線療法）とともに投与することもできる。

典型的な獣医、実験または研究対象には、サル、犬、猫、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、馬および人が含まれる。

本発明の抗体の治療における使用は以下の通りである。

ヒトＰＤ−１／Ｌ１およびＣＴＬＡ４に特異的に結合する本発明の抗体は、免疫応答の増加、改善、刺激または上方制御に使用できる。本発明の抗体は、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を改善することによって治療できる疾患を患っている治療を受ける者の治療に特に適している。好ましい治療を受ける者には、免疫応答の改善を必要とするヒト患者が含まれる。

本発明の抗体は、癌の治療に使用できる（すなわち、腫瘍細胞の成長または生存を阻害する）。本発明の抗体によって成長を阻害できる好ましい癌には、一般的に免疫療法に応答する癌が含まれるが、今まで免疫療法と関連がない癌も含まれる。治療する好ましい癌の非限定的な例には、メラノーマ（例えば、悪性転移性メラノーマ）、腎細胞がん（例えば、淡明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモンによる制御が困難な前立腺がん）、膵臓がん、乳がん、大腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫およびその他の悪性腫瘍が含まれる。なお、本発明は、本発明の抗体によって成長が阻害され得る難治性または再発性の癌を含む。

本発明の抗体は、単独で使用してもよく、或いは、抗がん剤または免疫原剤（例えば、弱体化された癌細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物類分子を含む）、腫瘍由来の抗原または核酸で刺激された樹状細胞、免疫賦活性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、および免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ただし、これに限定されないものではない）をコードする遺伝子でトランスフェクションされた細胞といった抗原提示細胞；標準的な癌治療（たとえば、化学療法、放射線療法または手術）；または他の抗体（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢおよびＩＣＯＳを標的とする抗体を含むがこれらに限定されるものではない）といった他の物質と組み合わせて使用してもよい。

本発明の抗体は、免疫低下疾患の予防または治療にも使用できる。抗体は、単独で、または、病原体および多量体に対する免疫応答を刺激するために、医薬品と併用してもよい。抗体は、ヒトに感染するウイルスに対する免疫応答を刺激するために使用でき、これらのウイルスとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルスなどがあるが、これらに限定されるものではない。抗体は、細菌または真菌、寄生虫やその他の病原体によって引き起こされる感染に対する免疫応答を刺激するために使用できる。抗体は、体内の多量体に対する免疫応答とその除去を刺激し、認知症などの疾患を治療するために使用できる。

本発明に係る抗体は、標的が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、Ｃ５、Ａβ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＨＧＦ、ＣＭＥＴ、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＬ１１、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＤＫＫ１／２、ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＬＬ４、ＰＤＧＦＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１／２、ＲＡＮＫＬ、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＧＣＧＲ、ＣＧＲＰ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＴＦＰＩ、ＦＣＧＲＴ、ＣＤ４７等を含むが、これらに限定されず、癌、喘息、自己免疫疾患、片頭痛、認知症、高脂血症、骨関節炎、群発頭痛、骨粗鬆症等の疾患の治療に使用できる。

以下の実施例より、本発明の内容をさらに説明するが、本発明がこれらの例に限定されると解釈すべきではない。本発明の趣旨および本質から逸脱しない限り、本発明の方法、ステップまたは条件に対して行われる修正または置換は、いずれも本発明の範囲内に属する。

特に断りがない限り、実施例で使用される技術手段は、当業者が熟知する通常の手段である。特に説明がない限り、以下の実施例で使用される材料、試薬は、いずれも商業ルートから入手できる。

実施例１ 免疫原性が低減された低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の分析と設計
本発明では、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの構造を分析し、抗体の可変領域と定常領域との間で比較的柔軟な領域を探し、対応する領域に柔軟なアミノ酸配列を挿入して、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体医薬品の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体医薬品と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球等のＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減した。

具体的には、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社の抗体医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの、２９７番目のアミノ酸であるＡを元のＮに変異させてグリコシル化を回復した上で、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達を遮断することにより、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させるとともに、多量体の形成を有意に増加させないことを達成した。元のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの配列における重鎖の全長のアミノ酸配列と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２が示すとおりである。

本発明で提供される低免疫原性の抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号３、４が示すとおりであり、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２が示すとおりであり、それぞれＨ−１Ｌ０、Ｈ−２Ｌ０と命名した。

本発明は、既知の抗体の重鎖のグリコシル化情報により、対応する修飾後の配列に対して全遺伝子合成を実行し、合成された遺伝子に対してシーケンスを実行するとともに、シーケンスが正しい配列を選択して次のステップを実行し、軽鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、重鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、

それぞれ、発現ベクターｐＥＥ６．４及びベクターｐＥＥ１２．４に接続し、それと同時に大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、抗体の重鎖、軽鎖の発現ベクターを得た。構築された抗体のシーケンスと配列の比較を同時に行い、操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と元の抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖のアライメント結果を図１に示す。

実施例２ 低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能ＰＤ−１モノクローナル抗体の分析と設計
本発明では、米国メルク（Ｍｅｒｃｋ）社のＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを操作した。まず、その重鎖のサブクラスをＩｇＧ４からＩｇＧ１に変更し、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して構造を分析し、抗体の可変領域と定常領域との間で比較的柔軟な領域を探し、対応する領域に柔軟なアミノ酸配列を挿入して、対応する配列に対して遺伝子合成、シーケンスを実行し、シーケンスが正しい配列を選択し、スクリーニングしてモノクローナル抗体Ｈ１Ｌ０を得た。本発明は、オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することを試み、挿入された柔軟なアミノ酸配列は、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減した。柔軟なアミノ酸配列は、その両端のドメインの空間的コンフォメーションによる相互干渉を防止または低減するための、側鎖の小さいアミノ酸からなる一定の長さのＣ−ペプチドであり、その配列は、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法に従って操作された重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７が示すとおりである。

本発明は、対応する修飾後の配列に対して全遺伝子合成を実行し、合成された遺伝子に対してシーケンスを実行するとともに、シーケンスが正しい配列を選択して次のステップを実行し、軽鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、重鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、それぞれ、発現ベクターｐＥＥ６．４及びベクターｐＥＥ１２．４に接続し、それと同時に大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、抗体の重鎖、軽鎖の発現ベクターを得た。構築された抗体のシーケンスと配列の比較を同時に行い、操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と元の抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖のアライメント結果を図９に示す。

実施例３ 低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の分析と設計
本発明では、米国ブリストルマイヤーズスクイブ（ＢＭＳ）社のｉｐｉｌｉｍｕｍａｂを操作し、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して構造を分析し、抗体の可変領域と定常領域との間で比較的柔軟な領域を探し、対応する領域に柔軟なアミノ酸配列を挿入して、対応する配列に対して遺伝子合成、シーケンスを実行し、シーケンスが正しい配列を選択し、スクリーニングしてモノクローナル抗体Ｈ１Ｌ０を得た。本実施例は、モノクローナル抗体ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することを試み、挿入された柔軟なアミノ酸配列は、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減した。柔軟なアミノ酸配列は、その両端のドメインの空間的コンフォメーションによる相互干渉を防止または低減するための、側鎖の小さいアミノ酸からなる一定の長さのＣ−ペプチドであり、その配列は、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではない。操作後の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０が示すとおりである。
本発明は、対応する修飾後の配列に対して全遺伝子合成を実行し、合成された遺伝子に対してシーケンスを実行するとともに、シーケンスが正しい配列を選択して次のステップを実行し、軽鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、重鎖の酵素切断部位をＥｃｏＲ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩとし、それぞれ、発現ベクターｐＥＥ６．４及びベクターｐＥＥ１２．４に接続し、それと同時に大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、抗体の重鎖、軽鎖の発現ベクターを得た。構築された抗体のシーケンスと配列の比較を同時に行い、操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と元の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖のアライメント結果を図１３に示す。

実施例４ 改良型抗体のＡＤＣＣ機能の検証
本発明における抗体のＡＤＣＣ機能を評価するために、本発明では、標的タンパク質（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４）過剰発現細胞に対するＦｃＲ−ＴＡＮＫ細胞の殺傷能力を検出することにより、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

ＰＤ−Ｌ１抗体のＡＤＣＣ活性の検出を例として、ＣＦＳＥで標的タンパク質過剰発現細胞を染色した後、細胞密度を６×１０^５／ｍＬに調整し、改良型抗体（Ｈ−１Ｌ０、Ｈ−２Ｌ０）とＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、及び陽性対照である抗体ＩＭＭ２５（ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｏから購入）を一定の割合で段階希釈（最高濃度４μｇ／ｍＬ、培地により３倍希釈を１２回段階希釈）しながら、ＦｃＲ−ＴＡＮＫ細胞をカウントし、細胞密度を６×１０^５／ｍＬに調整した。抗体、標的細胞およびエフェクター細胞を一緒にインキュベートした。詳しくは、上記の希釈段階が異なる抗体をそれぞれ５０μＬ、標的細胞を５０μＬ、ＦｃＲ−ＴＡＮＫ細胞を１００μＬ取り、９６ウェルプレートに入れて、各段階でデュプリケートしながら、ブランクコントロール（１５０μＬの培地＋５０μＬの標的細胞および５０μＬの培地＋５０μＬの標的細胞＋１００μＬのＦｃＲ−ＴＡＮＫ細胞）を設置した。３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。インキュベート完了後、細胞培養プレートを室温で１０分間置き、ＰＩ染色液（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を加えて均一に混ぜた。フローサイトメトリーによって異なる濃度における細胞のＰＩ染色の陽性率を分析し、下記の計算式により、抗体が媒介するＡＤＣＣ強度を計算し、ＡＤＣＣ％と濃度の関係をプロットした。

ＡＤＣＣ％＝［（Ｓａｍｐｌｅ％ＰＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ−Ｎｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ％ＰＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ）／（１００−Ｎｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ％ＰＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ）］×１００

図３に示すように、本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と先発医薬品である抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＡＤＣＣ活性の実験は、本発明の２つのＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体Ｈ−１Ｌ０、Ｈ−２Ｌ０のＡＤＣＣ活性が、先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと一致することを示している。Ｈ−１Ｌ０とＨ−２Ｌ０のいずれもＡＤＣＣ効果が除去されたことが証明されたため、後続研究では、主にＨ−１Ｌ０と先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを使用して比較検証を実行した。

図１１に示すように、本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体と先発医薬品である抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂのＡＤＣＣ活性の実験は、本発明の操作後のＰＤ−１モノクローナル抗体Ｈ１Ｌ０のＡＤＣＣ活性が消失したが、先発医薬品である抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの場合、弱いＡＤＣＣ活性が存在することを示している。

図１５に示すように、本発明の操作後のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と先発医薬品である抗体ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂのＡＤＣＣ活性の実験は、本発明のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体Ｈ１Ｌ０のＡＤＣＣ活性が消失したが、先発医薬品である抗体ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂのＡＤＣＣ活性が正常であることを示している。

実施例５ 改良型抗体の親和性の評価
実施例１〜３で構築されたベクターに対して、プラスミドの大量精製を行い、ＱｉａｇｅｎのＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを選択し、選択したプラスミドの組み合わせを最適化しながら、ＣＨＯ細胞を使用して一過性トランスフェクション発現を実行し、見かけ結合親和性の測定に、タンパク質によるＥＬＩＳＡ実験を使用した（ＥＣ_５０値として報告される）。改良型抗体と先発医薬品である抗体の結合能力を比較した。

タンパク質ＥＬＩＳＡを、抗体とヒトＰＤ−Ｌ１の相対的結合の測定に使用した。４℃で一晩置いてＰＤ−Ｌ１を酵素標識プレートに固相化し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳと室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックした。コーティング後、前記プレートをＰＢＳで洗浄し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の希釈液を調製し、固相化タンパク質とともに２５℃で１時間インキュベートした。結合後、前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２５℃で１／２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを含む結合緩衝液により２５℃で１時間インキュベートし、再度洗浄した後、ＴＭＢで発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図２に示す。５０％最大結合濃度で、相対的結合の親和性の値を表す。発現した抗体の親和性とＥＣ５０を検出し（表１を参照）、親和性ＥＬＩＳＡの結果は、図２に示すように、Ｈ−１Ｌ０のＰＤ−Ｌ１との親和性が先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂに近いことを示している。

タンパク質ＥＬＩＳＡを、抗体とヒトＰＤ−１の相対的結合の測定に使用した。４℃で一晩置いてＰＤ−１を酵素標識プレートに固相化し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックした。コーティング後、前記プレートをＰＢＳで洗浄し、抗ＰＤ−１抗体の希釈液を調製し、固相化タンパク質とともに２５℃で１時間インキュベートした。結合後、前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２５℃で１／２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを含む結合緩衝液により２５℃で１時間インキュベートし、再度洗浄した後、ＴＭＢで発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図１０に示す。５０％最大結合濃度で、相対的結合の親和性の値を表す。発現した抗体の親和性とＥＣ５０を検出し（表２を参照）、親和性ＥＬＩＳＡの結果は、図１０に示すように、Ｈ１Ｌ０のＰＤ−１との親和性が先発医薬品である抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂに近いことを示している。

タンパク質ＥＬＩＳＡを、抗体とヒトＣＴＬＡ４の相対的結合の測定に使用した。４℃で一晩置いてＰＤ−１を酵素標識プレートに固相化し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックした。コーティング後、前記プレートをＰＢＳで洗浄し、抗ＣＴＬＡ４抗体の希釈液を調製し、固相化タンパク質とともに２５℃で１時間インキュベートした。結合後、前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２５℃で１／２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを含む結合緩衝液により２５℃で１時間インキュベートし、再度洗浄した後、ＴＭＢで発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図１４に示す。５０％最大結合濃度で、相対的結合の親和性の値を表す。発現した抗体の親和性とＥＣ５０を検出し（表３を参照）、親和性ＥＬＩＳＡの結果は、図１４に示すように、Ｈ１Ｌ０のＣＴＬＡ４との親和性が先発医薬品である抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂに近いことを示している。

実施例６ 改良型ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１抗体の生物活性の検出
この方法は、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ３Ｌ細胞株及びＪｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴ細胞株の２つの細胞株に基づくものである。ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ３Ｌ細胞株は、ＰＤ−Ｌ１とａｎｔｉ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを安定的に発現し、標的細胞とする；Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴ細胞株は、ＰＤ−１とルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定的に発現し、ルシフェラーゼ遺伝子は、ＮＦＡＴ要素（転写因子）によって制御され（ＩＬ−２プロモーター）、エフェクト細胞とする。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合により、ＣＤ３の下流のシグナル伝達を遮断し、ルシフェラーゼの発現を阻害できる。ＰＤ−１抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体を添加すると、このような遮断（Ｂｌｏｃｋ）効果が逆転し、ルシフェラーゼの表現が可能になるため、蛍光シグナルが検出される。具体的な実験手順は次のとおりである。

１、細胞培養：Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して培養し、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ３Ｌ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡおよび抗生物質を含むＤＭＥＭまたはＦ１２培地を使用して培養した。
２、細胞播種：ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ３Ｌ細胞を９６ウェルプレートに５００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１２〜１４時間培養した。その後、培地を除去してから、１００,０００個のＪｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴ細胞を含む５０μＬのアッセイ培地（２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を各ウェルに加えた。
３、抗体状態スクリーニング：本発明の操作後の抗体または先発医薬品を１０μｇ／ｍＬの濃度から１：３の比率で段階希釈した（アッセイ培地を使用した）。その後、希釈した抗体を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。
４、１００μＬの蛍光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ）を添加し、フルオロメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５）で相対ルシフェラーゼ活性単位を計算した。

本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ−１Ｌ０の生物学的活性を先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと比較したところ、Ｈ−１Ｌ０のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の阻害効果が先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと近い結果となった（図４に示す）。表を作成し、抗体のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１を阻害するＩＣ５０値を計算し、表４に示す。

本発明の操作後のＰＤ−１抗体Ｈ１Ｌ０の生物学的活性を先発医薬品Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂのと比較したところ、Ｈ１Ｌ０のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の阻害効果が先発医薬品Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂと近い結果となった（図１２に示す）。表を作成し、抗体のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１を阻害するＩＣ５０値を計算して、表５に示す。

実施例７ 改良型ＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４のＣＤ８０又はＣＤ８６との結合活性の阻害の検証及び競争的実験
ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体のＣＴＬＡ４のＣＤ８０またはＣＤ８６との結合の阻害効率を検出した。４℃で一晩置いて、ｈＣＤ８０又はｈＣＤ８６を酵素標識プレートに固相化し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックした。コーティング後、前記プレートをＰＢＳで洗浄し、抗ＣＴＬＡ４抗体とＢｉｏｔｉｎ−ＣＴＬＡ４の混合希釈液（Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＴＬＡ４は１μｇ／ｍＬの固定濃度であり、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体を段階希釈し、最高濃度は１μｇ／ｍＬであり、最低濃度は０である。）を調製し、固相化タンパク質とともに２５℃で１時間インキュベートした。結合後、前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２５℃で１／８０００に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンを含む結合緩衝液により２５℃で１時間インキュベートし、再度洗浄した後、ＴＭＢで発色させた。ＥＬＩＳＡの結果を図１６に示し、本発明のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体がＣＴＬＡ４のＣＤ８０またはＣＤ８６との結合を阻害できることを示した。

本発明は、ＣＥＬＩＳＡ法により、抗体のＣＤ８０およびＣＤ８６と競合的にヒトＣＴＬＡ４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に結合する効果を評価した。まず、ｈＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞を構築し、ＣＨＯ−ｈＣＴＬＡ４細胞を５０μＬの培地で８０％〜１００％の被覆率まで培養した。次に、５０μＬの固定濃度（１μｇ／ｍＬ）のＢｉｏｔｉｎ−ＣＤ８０またはＢｉｏｔｉｎ−ＣＤ８６、及び希釈濃度（最高濃度１μｇ／ｍＬ、最低濃度０、段階希釈）が異なる抗ＣＴＬＡ４抗体を含有する混合培地に添加して、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、１００μＬの１／８０００の希釈率で希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、ＴＭＢで発色させた。ＥＬＩＳＡ結果を図１７に示す。

実施例８ マウス体内における改良型ＰＤ−Ｌ１抗体及び先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの免疫原性の評価
マウスをそれぞれ改良型抗体Ｈ−１Ｌ０及び先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂで免疫して、マウスにおいて産生したＡＤＡの感染価を評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて群分けし、実験を行い、群あたり５匹とした。具体的な免疫方法は次のとおりである。１）基本免疫：抗原とフロイント完全アジュバントを同体積で混合して完全に乳化し、注射箇所を分け、皮下注射した。２）追加免疫：追加免疫では、抗原とフロイント不完全アジュバントのエマルジョンを使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹あたりの総注入量を７０μｇとした。

免疫後のマウスについて、免疫前、免疫後７日、免疫後１４日、免疫後２１日のマウスの血清を採取し、マウスのＡＤＡ感染価を評価し、その結果を図５に示す。マウス体内における本発明で産生したモノクローナル抗体Ｈ−１Ｌ０のＡＤＡ感染価が、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂより８０％も低下した結果となった。

実施例９ 改良型ＰＤ−Ｌ１抗体の安定した細胞株の構築と小規模発現
本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１抗体および先発医薬品である抗体ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＣＨＯ安定細胞バンクを同時に構築し、当分野で公知の抗体医薬品製造基準に従って、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体および先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの、５ｇの小規模発現および精製を行った。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、得られた抗体に対してＨＰＬＣ−ＳＥＣにより比較を行った。先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ及び改良型ＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ−１Ｌ０のロード量（５０μＬ）と濃度（６０ｍｇ／ｍＬ）は、いずれも同じであった。図から、ロード量が同じである場合、先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのメインピークの面積が、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ−１Ｌ０に比べて約１０％も減少したことが分かった。したがって、先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂにおける多量体の含有量がより多いため、ＨＰＬＣ−ＳＥＣのロード中に、多量体がフィルターメンブレンによって除去され、ピーク面積が減少したと判断できる。２つの抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣのピーク面積の計算結果を表６に示す。同時に、ＨＰＬＣ−ＳＥＣの結果は、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ−１Ｌ０のピーク位置が先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂより前にあることを示しており、抗体のグリコシル化の回復により抗体の分子量が増加し、ピーク位置がより前になったと判断できる。

実施例１０ 改良型ＰＤ−Ｌ１抗体の糖鎖構造解析
実施例９で得られた結果に基づいて、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体の糖鎖構造をさらに検証した。主に、当該分野における公知の方法で実行した。詳しくは、抗体のオリゴ糖を消化して収集した後、質量分析によって糖鎖構造を分析・特定した。図７に示すように、特定により、先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂでは、Ｎ型糖鎖修飾が検出されなかったが、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体は正常にグリコシル化修飾されていた。改良型ＰＤ−Ｌ１抗体の糖鎖構造分析の結果を表７に示す。

実施例１１ 改良型ＰＤ−Ｌ１抗体及び先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの安定性の検証
本発明の操作後のＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体及び先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの安定性を比較検証した。改良型ＰＤ−Ｌ１抗体及び先発医薬品である抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを同時に急速熱処理し、その安定性を検証するための主な操作手順は以下のとおりである。

同体積の２つの異なる抗体を採取し、４℃で１０時間放置した後、少量のサンプルを採取した。最初のサンプリング後、２つの抗体を６０℃の恒温水浴に１０分間置いて、外観の変化を観察し、２回目の少量のサンプルを採取した。サンプリング後、２つの抗体を４℃、１００００ｒｐｍで５分間遠心し、遠心チューブの底に目視できる沈殿があるかどうかを観察し、上澄みを再度サンプリングした。３回目のサンプリング後、０．２μｍのフィルターにより上澄みをろ過した後、サンプルを再度採取した。サンプリング終了後、ろ過した上澄みを４℃に置いて継続的に観察した。得られたすべてのサンプルに対して、抗体の濃度及び抗体のＰＤ−Ｌ１との結合能力を検出した。

改良型ＰＤ−Ｌ１抗体及び先発医薬品ＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのＰＤ−Ｌ１との結合能力のＥＬＩＳＡ検出結果を図８に示し、２つの抗体の各サンプルの濃度データを表８に示す。先発医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂに比べて、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体の安定性がより良好であることが分かった。

これで分かるように、本発明では、スクリーニングにより複数の異なる標的に対する改良型ＡＤＣＣ機能除去モノクローナル抗体が得られた。これらの抗体は、本来の、標的タンパク質に対する結合親和性を維持できるとともに、ＡＤＣＣ機能が除去され、標的タンパク質とそれに対応するリガンドとの結合を特異的に遮断できる。同時に、改良型ＰＤ−Ｌ１抗体について、本発明のＡＤＣＣ機能の除去方法によれば、ＡＤＣＣ効果を除去する目的が達成されるだけでなく、元の先発医薬品である抗体医薬品の操作による高い多量体含有量、強免疫原性という問題も解決される。

上記の実施例の説明は、本発明の方法およびその核心的な思想を理解するのを助けるためのものに過ぎない。当業者にとって、本発明の原理から逸脱しない限り、本発明に対していくつかの改善および修飾を行うことができ、これらの改善および修飾もまた、本発明の特許請求の範囲の保護範囲内にあることにご注意ください。

本発明は、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体、及びその調製方法と使用を提供する。本発明は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４７およびＣ５などの複数の標的に対する抗体の配列を操作し、ＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域の間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することで、多量体の形成を有意に増加させることなく、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減させることができる。本発明の操作後の抗体と元の抗体は、同じ部位に対するものであるが、抗体のサブクラス又はグリコシル化が異なり、本発明の操作後の抗体は安定性が大幅に向上し、又は／及び、免疫原性が大幅に低下し、半減期が延長された。操作後の抗体は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能が除去されたため、本発明の技術により操作された抗体は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能による副反応を効果的に回避し、治療効果を高めることができ、臨床応用価値に優れ、普及に適し、高い経済的価値と幅広い市場見通しを持っている。

また、本発明は、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社の抗体医薬品Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの、２９７番目のアミノ酸であるＡを元のＮに変異させてグリコシル化を回復した上で、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入し、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達を遮断することにより、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させるとともに、多量体の形成を有意に増加させないことを達成する。

本願で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同じ抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量で存在し得る天然変異体を除いて、前記集団を構成する各抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高度な特異性を持ち、単一の抗原部位を標的とすることができる。さらに、通常、複数の異なる決定基（エピトープ）を標的とする複数の異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。修飾用語「モノクローナル」は、実質的に同じ抗体集団から得られる抗体の特性を指し、前記抗体の調製のためにいずれの特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。

Claims (40)

1. オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖の定常領域に一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することを特徴とする、ＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低減又は除去する方法。
2. オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記挿入された一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減することを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、Ｃ５、Ａβ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＨＧＦ、ＣＭＥＴ、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＬ１１、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＤＫＫ１／２、ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＬＬ４、ＰＤＧＦＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１／２、ＲＡＮＫＬ、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＧＣＧＲ、ＣＧＲＰ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＴＦＰＩ、ＦＣＧＲＴ、ＣＤ４７抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｅｒｅｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｆａｓｉｎｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ、モノクローナル抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ又は前記抗体のＩｇＧ１サブクラスの改良型モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記柔軟なアミノ酸配列が、両端のドメインの空間的コンフォメーションが相互に干渉することを防止または低減するための、側鎖の小さいアミノ酸からなる一定の長さのＣ−ペプチドであり、その配列が、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではないことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により調製されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体。
7. 前記モノクローナル抗体が、キメラ型モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、完全ヒト型モノクローナル抗体、二重特異性抗体又は融合タンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体。
8. 前記モノクローナル抗体が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ−α、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、Ｃ５、Ａβ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ２３Ａ、ＨＧＦ、ＣＭＥＴ、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＬ１１、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＤＫＫ１／２、ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＬＬ４、ＰＤＧＦＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１／２、ＲＡＮＫＬ、ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、ＧＣＧＲ、ＣＧＲＰ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＴＦＰＩ、ＦＣＧＲＴ、ＣＤ４７のモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体。
9. ＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の低減又は除去における、請求項８に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性モノクローナル抗体の使用であって、前記モノクローナル抗体が、オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列を挿入して得られるものであり、前記柔軟なアミノ酸配列が、両端のドメインの空間的コンフォメーションによる相互干渉を防止または低減するための、側鎖の小さいアミノ酸からなる一定の長さのＣ−ペプチドであり、その配列が、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではないことを特徴とする、使用。
10. ＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の低減又は除去における、柔軟なアミノ酸配列の使用。
11. 前記柔軟なアミノ酸配列が、オリジナルのＩｇＧ１サブクラス抗体の重鎖の定常領域に挿入されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. 前記柔軟なアミノ酸配列が、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３とＣＨ２との間に挿入されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
13. 前記柔軟なアミノ酸配列の挿入部位が、ＧＧ（１３８／１３９）、ＳＳ（１７７／１７８）、ＳＧ（１７８／１７９）、ＳＳ（１８４／１８５）、ＳＳＳ（１９１／１９２／１９３）、ＬＬ（２３５／２３６）、ＧＧ（２３７／２３８）を含むが、これらに限定されるものではないことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 前記柔軟なアミノ酸配列が、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではないことを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
15. 抗体の安定性の向上／抗体の免疫原性の低下／抗体の半減期の延長における、柔軟なアミノ酸配列の使用。
16. 前記柔軟なアミノ酸配列が、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖の定常領域に挿入され、好ましくは、前記柔軟なアミノ酸配列が、オリジナルのＩｇＧ１抗体の重鎖のＣＤＲ３とＣＨ２との間に挿入され、より好ましくは、前記柔軟なアミノ酸配列が、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＳおよびＧＧＧＳを含むが、これらに限定されるものではないことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
17. オリジナルのモノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の定常領域に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達が遮断され、モノクローナル抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位が十分に露出せず、モノクローナル抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合が弱められ、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できなくなり、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルが低減されたことを特徴とする、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体。
18. オリジナルのモノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達が遮断され、前記オリジナルのモノクローナル抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号１が示すとおりであり、その軽鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号２が示すとおりであることを特徴とする、請求項１７に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体。
19. 軽鎖の全長に、配列番号２が示すアミノ酸配列又はその変異体が含まれ、重鎖の全長に、配列番号３〜４のいずれかが示すアミノ酸配列が含まれることを特徴とする、請求項１７に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体。
20. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子。
21. 発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である、請求項２０に記載の遺伝子を含む生物学的材料。
22. 請求項２０に記載の遺伝子または請求項２１に記載の生物学的材料の下記のいずれかの使用。
    （１）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における使用、
    （３）腫瘍又は免疫力変性疾患の治療における使用。
23. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の下記のいずれかの使用。
    （１）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）腫瘍を治療する医薬品の調製における使用、
    （３）免疫力変性疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （４）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における使用、
    （５）腫瘍又は免疫力変性疾患の治療における使用。
24. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を含む医薬品又は検出試薬。
25. オリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の定常領域に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達が遮断され、モノクローナル抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位が十分に露出せず、モノクローナル抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合が弱められ、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できなくなり、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルが低減されたことを特徴とする、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−１モノクローナル抗体。
26. オリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達が遮断され、前記オリジナルのモノクローナル抗体Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂの重鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号５が示すとおりであり、軽鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号６が示すとおりであることを特徴とする、請求項２５に記載のモノクローナル抗体。
27. 軽鎖の全長に、配列番号６が示すアミノ酸配列が含まれ、重鎖の全長に、配列番号７が示すアミノ酸配列が含まれることを特徴とする、請求項２５に記載のモノクローナル抗体。
28. 請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をコードする遺伝子。
29. 発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である、請求項２８に記載の遺伝子を含む生物学的材料。
30. 請求項２８に記載の遺伝子または請求項２９に記載の生物学的材料の下記のいずれかの使用。
    （１）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における使用、
    （３）腫瘍又は免疫力変性疾患の治療における使用。
31. 請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の下記のいずれかの使用。
    （１）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）腫瘍を治療する医薬品の調製における使用、
    （３）免疫力変性疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （４）ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を標的とする疾患の治療における使用、
    （５）腫瘍又は免疫力変性疾患の治療における使用。
32. 請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を含む医薬品又は検出試薬。
33. オリジナルのモノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖の定常領域に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の可変領域の抗原への結合によって生じるメカニカルストレスの伝達が遮断され、モノクローナル抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位が十分に露出せず、モノクローナル抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ及び好中球といったＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合または補体との結合が弱められ、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できなくなり、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルが低減されたことを特徴とする、低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体。
34. オリジナルのモノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に、一定の長さの柔軟なアミノ酸配列が挿入され、抗体の抗原への結合によって生じる抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達が遮断され、前記オリジナルのモノクローナル抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂの重鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号８が示すとおりであり、軽鎖の全長のアミノ酸配列が、配列番号９が示すとおりであることを特徴とする、請求項３３に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体。
35. 軽鎖の全長に、配列番号９が示すアミノ酸配列が含まれ、重鎖の全長に、配列番号１０が示すアミノ酸配列が含まれることを特徴とする、請求項３４に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体。
36. 請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体をコードする遺伝子。
37. 発現カセット、発現ベクター、人工細菌又は細胞である、請求項３６に記載の遺伝子を含む生物学的材料。
38. 請求項３６に記載の遺伝子又は請求項３７に記載の生物学的材料の下記のいずれかの使用。
    （１）ＣＴＬＡ−４を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）ＣＴＬＡ−４を標的とする疾患の治療における使用、
    （３）腫瘍の治療又は免疫力の向上における使用。
39. 請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の下記のいずれかの使用。
    （１）ＣＴＬＡ−４を標的とする疾患を治療する医薬品の調製における使用、
    （２）腫瘍を治療する医薬品の調製における使用、
    （３）免疫力を強化させる医薬品の調製における使用、
    （４）ＣＴＬＡ−４を標的とする疾患の治療における使用、
    （５）腫瘍細胞又は免疫力変性疾患の治療における使用。
40. 請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を含む、医薬品又は検出試薬。

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