JP2021530457A - 免疫応答を制御するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は一般に、それを必要とする対象において、特にLMBR1L(リム領域1様)を阻害することによって免疫抑制療法を提供する方法に関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年6月26日に出願された米国仮特許出願第62/689,907号に基づく優先権および利益を主張し、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本出願は、2018年6月26日に出願された米国仮特許出願第62/689,907号に基づく優先権および利益を主張し、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本開示は一般に、それを必要とする対象において、特にリム領域1様(limb region 1 like)(LMBR1L)を阻害することによって免疫抑制療法を提供する方法に関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
炎症性および自己免疫疾患などの過剰または過活動免疫系に関連する疾患は、米国において最も一般的な疾患であり、2350万を超える人々に影響を与えている。一部の炎症性および自己免疫疾患は、生命を脅かし、大部分は衰弱性で生涯の処置を必要とする。多数の治療アプローチにもかかわらず、炎症性または自己免疫関連疾患を有する人の割合は、2030年より前に少なくとも37%まで増加すると予測されている。
宿主組織の外来物としての異常な認識によって生じる過剰な炎症、または炎症性プロセスの長期化により、喘息、糖尿病、動脈硬化、白内障、再灌流傷害およびがんなどの多様な自己免疫または炎症性疾患、感染性髄膜炎においてなどの感染後症候群ならびに、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどのリウマチ性疾患が引き起こされる場合がある。これらの様々な疾患における免疫応答の中心は、免疫系、疾患処置の重要な構成成分を制御することである。異常な炎症性応答は、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、COX−2阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤などの抗炎症剤によって調節され得るが、これらの薬剤の多くは、著しい副作用を有する。例えば、副腎皮質ステロイドは、クッシング様の特性、皮膚の菲薄化、感染症の易罹患性の増加、および視床下部・下垂体・副腎皮質系の抑制を誘導する場合がある。また、炎症性および自己免疫疾患がしばしば慢性であることから、それらは、一般に生涯の処置およびモニタリングを必要とする。したがって、炎症性および自己免疫疾患を処置するために有効な方法および組成物に対する必要性が存在する。
本明細書において、対象においてリム領域1様(LMBR1L)を阻害することを含む、それを必要とする対象において疾患(例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶)を処置するための免疫抑制療法を提供する方法が開示される。方法は、それを必要とする対象において免疫応答を抑制するまたは低減することを含み、方法は、それを必要とする対象においてT細胞、B細胞、NKおよび/またはNK T細胞のレベルを減少させることに関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
一態様では、それを必要とする対象においてリム領域1様(LMBR1L)を阻害し、それにより免疫応答を抑制することを含む、免疫抑制療法を提供する方法が提供される。
一部の実施形態では、前記阻害することは、対象におけるリンパ球系共通前駆細胞および/またはリンパ球の数を低減することを含む。リンパ球は、例えばT細胞、B細胞、NKおよびNK T細胞の1つまたは複数を含み得る。
対象は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する場合がある。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス(systematic lupus erythematosus)(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーブス病、I型糖尿病、多発性硬化症および/または関節リウマチである場合がある。
種々の実施形態では、方法は、LMBR1Lの細胞外ドメインなどのLMBR1Lに結合する、抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片などのLMBR1L阻害剤の有効量を対象に投与することをさらに含み得る。
別の態様は、リム領域1様(LMBR1L)、好ましくはLMBR1Lの細胞外ドメインに結合する、抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片などのLMBR1L阻害剤に関する。
さらなる態様は、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合性断片などのLMBR1L阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、免疫抑制のための医薬組成物に関する。
本明細書において、免疫応答を抑制するまたは低減するための医薬の製造のための、本明細書において開示される抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片などのLMBR1L阻害剤の使用も開示される。
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方が例示および説明のみであり、本開示の組成物および方法の限定ではないことを理解されたい。
本明細書において、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において、LMBR1L(リム領域1様)を阻害することに関連する組成物および方法、ならびにこのような方法において使用され得るキットが開示される。本開示の一態様は、LMBR1L中の変異またはLMBR1Lのノックアウトが、末梢血中のCD3+T細胞の頻度の減少、CD4+のCD8+に対する比の増加、表面糖タンパク質CD44およびCD62Lの増加、B細胞発達の障害、T細胞依存性およびT細胞非依存性液性免疫応答の減少、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)殺滅活性の減少およびナチュラルキラー(NK)およびNK T細胞の頻度の低減が挙げられる、免疫不全によって特徴付けられる表現型を生じるとの驚くべき発見に関する。したがって、LMBR1Lは、リンパ球新生に不可欠である。抗体などのLMBR1Lの阻害剤は、それを必要とする対象において免疫応答を低減または抑制するために使用され得る。
LMBR1Lは、以前は機能が未知であった、複数回貫通型形質膜タンパク質である。予想外に、本明細書に開示されるように、LMBR1Lの非存在下で、すべてのリンパ球依存性免疫は、強く抑制され、リンパ系細胞は、典型的には増殖を生じる刺激によってアポトーシスへと向かった。また、驚くべきことに、本開示の実験は、LMBR1Lがすべての系列のリンパ球においてWntシグナル伝達経路の不可欠な構成成分であることも実証している。β−カテニン活性が恒常的に高く、分解複合体が関与できなかった(すなわち、細胞膜でFRIZZLED−6が高く上方制御されるようになり、ZNRF3が下方制御された)ことから、Wnt経路を介するシグナル伝達は、LMBR1Lノックアウトマウスにおいて異常であった。本開示のデータは、LMBR1Lが、GSK3β、β−カテニン、ZNRF3、RNF43およびFRIZZLED−6を含むリンパ球におけるWntシグナル伝達経路のいくつかの構成成分と相互作用できることを示している。さらに、全身性エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患に対する特異的で敏感な指標である自己抗体(dsDNA特異的IgG)の産生などの自己免疫応答をLMBR1L欠損が阻害することが予想外に発見された。
したがって、抗体および小分子アンタゴニストなどのLMBR1L阻害剤は、免疫系が過剰または過活動である状態、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する対象における免疫応答を低減するまたは抑制するために使用され得る。
定義
簡便さのために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語は、ここにまとめられている。他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示において使用される多数の用語の一般的定義を含む技能を提供する、Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1sted.,1992);Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(revised ed.,2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley & Sons(3rded.,2002);Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1sted.,1999);Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler(Ed.),Springer−Verlag Telos (1994);Dictionary of Organic Chemistry,Kumar and Anandand (Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);およびA Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press(4thed.,2000)。本開示に具体的に適用されるこれらの用語の一部のさらなる明確化が本明細書において提供される。
簡便さのために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語は、ここにまとめられている。他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示において使用される多数の用語の一般的定義を含む技能を提供する、Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1sted.,1992);Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(revised ed.,2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley & Sons(3rded.,2002);Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1sted.,1999);Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler(Ed.),Springer−Verlag Telos (1994);Dictionary of Organic Chemistry,Kumar and Anandand (Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);およびA Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press(4thed.,2000)。本開示に具体的に適用されるこれらの用語の一部のさらなる明確化が本明細書において提供される。
本明細書において使用される場合、冠詞「a(1つの)」および「an(1つの)」は、冠詞の文法的目的語の1つまたは1つより多く、例えば、少なくとも1つを参照する。語「a(1つの)」または「an(1つの)」の使用は、本明細書において用語「含む」と併せて使用される場合、「1つ」を意味する場合があるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは1つより多く」の意味と矛盾しない。
本明細書において使用される場合、「約」および「およそ」は、測定の性質または正確度を考慮した、測定された量についての誤差の許容可能な程度を一般に意味する。誤差の例示的な程度は、値の所与の範囲の20パーセント(%)以内、典型的には10%以内、さらに典型的には、5%以内である。用語「実質的に」は、50%より多く、好ましくは80%より多く、最も好ましくは90%または95%より多くを意味する。
LIMRとしても知られている、「Lmbr1l」および「LMBR1L」は互換的に用いられ、リム領域1様を指し、他に記す場合を除いて、「Lmbr1l」が一般に遺伝子またはmRNAを指し、「LMBR1L」がタンパク質産物を指す。用語が、完全な遺伝子、cDNA配列、完全なアミノ酸配列またはこれらの任意の断片もしくはバリアントを含むことは理解されるべきである。一部の実施形態では、LMBR1LはヒトLMBR1Lである。
本明細書において使用される場合、用語「LMBR1L阻害剤」は、LMBR1L活性を阻害、下方調節、抑制または下方制御する治療剤を含むことが意図される。用語は、小分子阻害剤またはアンタゴニストなどの化合物および生物学的薬剤(例えば、抗体)、干渉RNA(shRNA、siRNA)、遺伝子編集/サイレンシングツール(CRISPR/Cas9、TALEN)などを含むことが意図される。
「抗LMBR1L抗体」は、LMBR1L(例えば、その細胞外ドメイン)に免疫特異的に結合する抗体である。抗体は、単離された抗体であってよい。LMBR1Lへのこのような結合は、例えば、1μM以下、100nM以下、または50nM以下の値のKdを示す。Kdは表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイなどの当業者に知られている任意の方法によって測定され得る。抗LMBR1L抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であってよい。
本明細書において使用される場合、「抗体」は、標的エピトープに結合する結合ドメインを含む1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質である。抗体という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖分子を含むモノクローナル抗体、単一重鎖可変ドメイン抗体ならびに、モノクローナルおよび単一重鎖可変ドメイン抗体のキメラバリアントを含むこれらのバリアントおよび誘導体を含む。結合ドメインは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされており、ここでタンパク質は、抗原に免疫特異的に結合する。認められる免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、次に免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをそれぞれ決める、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類される。ヒトおよびマウス種を含む大部分の脊椎動物生物について、典型的な免疫グロブリン構造単位は、各対が1つの「軽」(約25kD)および1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有するポリペプチド鎖の2つの同一の対からなる四量体を含む。「VL」および「VH」は、これらの軽鎖および重鎖それぞれの可変ドメインを指す。「CL」および「CH」は、軽鎖および重鎖の定常ドメインを指す。β鎖のループは、VLおよびVHにそれぞれ3個が、抗原への結合に関与しており、「相補性決定領域」または「CDR」と称される。「Fab」(断片、抗原結合)領域は抗体の各重鎖および軽鎖由来の、1つの定常および1つの可変ドメイン、すなわち、VL、CL、VH、およびCH1を含む。
抗体は、未処置免疫グロブリンおよびその抗原結合性断片を含む。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合するまたは抗原結合(すなわち、特異的結合)について未処置抗体と(すなわち、それらが由来する未処置抗体と)競合する抗体のポリペプチド断片を指す。抗原結合性断片は、当技術分野において周知である組換えまたは生化学方法によって産生され得る。例示的抗原結合性断片として、Fv、Fab、Fab’、(Fab’)2、CDR、パラトープおよび1本鎖Fv抗体(scFv)が挙げられ、ここでVHおよびVL鎖は、連続したポリペプチドを形成するように併せて一緒に接続されている(直接またはペプチドリンカーを通じて)。
抗体として、バリアント、キメラ抗体およびヒト化抗体も挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「抗体バリアント」は、重鎖および/または軽鎖中に単一のまたは複数の変異を有する抗体を指す。一部の実施形態では、変異は、可変領域に存在する。一部の実施形態では、変異は定常領域に存在する。「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同性である一方で、鎖の残りのセグメントが別の対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の1つの種由来の抗体の可変領域を模倣し、一方定常部分は、別のもの由来の抗体における配列に相同性である。このようなキメラ形態の1つの明らかな利点は、例えば、可変領域が、容易に利用可能な非ヒト宿主生物由来のハイブリドーマまたはB細胞を使用して現在知られている供給源から、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて簡便に導かれ得ることである。可変領域が調製の容易さの利点を有する一方で、特異性はその供給源に影響されず、ヒトである定常領域は、抗体が注射された場合に、非ヒト供給源由来の定常領域よりもヒト対象からの免疫応答をあまり誘発しない。しかし、定義は、この具体的な例に限定されない。「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインまたは、可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域(CDR)のみのいずれかを含む場合がある。抗原結合部位は野生型であってよく、または1つもしくは複数のアミノ酸置換によって改変されていてよい、例えば、ヒト免疫グロブリンにさらに密接に類似するように改変されてよい。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのCDR配列を保存している(例えば、マウス抗体由来の6個すべてのCDRを含有するヒト化マウス抗体)。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変更されており、1つまたは複数のCDRに「由来する」1つまたは複数のCDRとも称される1つまたは複数のCDR(1、2、3、4、5または6個)を有する。
本明細書に記載される通り、抗体のアミノ酸残基は、Kabatの一般的番号付けに従って番号付けられてよい(Kabat,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition.Public Health Service,NIH,Bethesda,MD)。
VHHなどの抗体と標的としてのLMBR1Lのエピトープとの間の結合の文脈において、本明細書において使用される場合、用語「結合」は、分子間の非共有結合相互作用のプロセスを指す。好ましくは、前記結合は特異的である。抗体の特異性は、親和性に基づいて決定され得る。特異的抗体は、結合親和性またはそのエピトープについて10−7M未満、好ましくは10−8M未満の解離定数Kdを有し得る。
用語「親和性」は抗体の結合ドメインとエピトープとの間の結合反応の強さを指す。それは、結合ドメインとエピトープとの間に作用する引力と反発力との合計である。本明細書において使用される場合、用語、親和性は、解離定数、Kdを指す。
用語「抗原」は、抗体などの選択的結合剤によって結合され得る分子または分子の一部を指し、抗原のエピトープに結合できる抗体を産生する動物においても追加的に使用され得る。抗原は、1つまたは複数のエピトープを有し得る。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および/または特異的な電荷特徴を有する場合がある。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および/または高分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると称される。エピトープマッピングのための方法は、X線共結晶解析、アレイベースオリゴペプチドスキャンニング、部位特異的変異導入、ハイスループット変異導入マッピングおよび水素重水素交換など、当技術分野において周知である。
エピトープに結合する抗体上の部位は、「パラトープ」と称され、結合するとエピトープに近接近するアミノ酸残基を典型的には含む。Sela−Culang et al.,Front Immunol.2013;4:302を参照されたい。
「免疫組織化学」または「IHC」は、生物学的組織において目的の抗原を免疫特異的に認識する抗体の結合および続く検出を可能にする、組織切片の細胞において抗原を検出するプロセスを指す。IHC技術の概説に関して、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ramos−Vara et al.,Veterinary Pathology January 2014 vol.51 no.1,42−87を参照されたい。IHC結果を評価するために、さまざまな定性的および半定量的スコア化システムが開発されている。例えば引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Fedchenko et al.,Diagnostic Pathology,2014;9:221を参照されたい。一例は、可能値300で、細胞の百分率と染色強度順序値(staining intensity ordinal value)(「シグナルなし」に対する0から「強いシグナル」に対する3までスコア化される)との乗算の結果を加算することによって決定されるH−スコアである。
「免疫特異的」または「免疫特異的に」(「特異的に」と互換的に使用される場合もある)は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされるドメインを介して目的のタンパク質の1つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性分子の混合集合物を含有する試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない抗体を指す。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定される50nM以下の値のKdで同族抗原に免疫特異的に結合する。このようなアッセイの使用は、当技術分野において周知である。
用語「免疫応答」は、T細胞媒介性応答、B細胞媒介性免疫応答および/またはNK細胞媒介性応答ならびにT、Bおよび/またはNK細胞の数および/または発達における変化(例えば、リンパ球系共通前駆細胞を制御することによる)を含む。また、免疫応答という用語は、T細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生(液性応答)およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。
本明細書において使用される場合、用語「リンパ球新生」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、B、TおよびNK細胞などのリンパ球の生成を指す。したがって、用語「T細胞リンパ球新生」は、T細胞(すなわちTリンパ球)の生成を指す。
用語「自己免疫疾患」は、対象の免疫系が対象自身の細胞を攻撃する抗体を産生し、悪化ならびに一部の場合では細胞および/または組織の破壊を生じる、対象における過活動性免疫応答から生じる疾患を指す。自己免疫疾患の例として、非限定的に、1型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ(RA)、強直性脊椎炎、クローン病、皮膚筋炎、グットパスチャー症候群、ギランバレー症候群(GBS)、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「炎症性疾患」は、過剰な炎症性応答(または炎症性過剰反応)から生じる障害として定義される。炎症性疾患は、不適当な抗原に対する不適当で過剰な応答の結果である。炎症性疾患の例として、これに限定されないが、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ループス、再灌流傷害(preperfusion injury)、移植片拒絶、アジソン病、円形脱毛症、ジストロフィー型表皮水疱症、精巣上体炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血および潰瘍性大腸炎が特に挙げられる。炎症性腸疾患(IBD)は、2つの主な種類、すなわちクローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)を含む。
用語「薬剤」は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過活動である状態を有する対象における免疫応答を低減または抑制できる任意の分子、ペプチド、抗体または他の薬剤を含み得る。種々の薬剤は、本明細書に記載される組成物および方法において有用である。
用語「交差競合する」、「交差競合」、「交差遮断する」、「交差遮断される」および「交差遮断」は、直接または、本開示の抗LMBR1L抗体のアロステリック調節を通じて間接的に、標的LMBR1Lへの結合を干渉する抗体またはその断片の能力を意味して本明細書において互換的に用いられる。抗体またはその断片が別のものの標的への結合を干渉できる程度、およびそれにより、それが本開示による交差遮断するまたは交差競合すると称され得るかどうかは、競合結合アッセイを使用して判定され得る。1つの特に好適な定量的交差競合アッセイは、標的へのそれらの結合に関して標識化(例えば、Hisタグ化、ビオチン化または放射標識)抗体またはその断片と他の抗体またはその断片との間の競合を測定するためのFACSまたはAlphaScreenに基づくアプローチを使用する。一般に、交差競合する抗体またはその断片は、例えば、アッセイの際および二次抗体またはその断片の存在下で、本開示による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録された置き換えが、所与の量で存在する、試験される潜在的に交差遮断する抗体またはその断片による最大の理論的置き換え(例えば、交差遮断される必要があるコールド(例えば、未標識)抗体またはその断片による置き換え)の100%に至る(例えば、FACSベース競合アッセイにおいて)ように、交差競合アッセイにおいて標的に結合できるものである。好ましくは、交差競合する抗体またはその断片は、10%と100%の間、より好ましくは50%から100%の間である記録された置き換えを有する。
用語、「抑制する」、「抑制」、「阻害する」、「阻害」、「中和する」、「中和」は、本明細書において互換的に使用され、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性(例えば、LMBR1L活性)における任意の統計的に有意な減少を指す。例えば「阻害」は、生物学的活性における約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%の減少を指し得る。
用語「対象」または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物を含む。
本明細書において使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書に記載されるものなどの治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、患者、例えば、炎症性疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または自己免疫疾患(例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、I型インスリン依存性糖尿病、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS))などの免疫系が過活動である状態を有する患者への、免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する患者において1つもしくは複数の症状を予防、治癒、遅延、重症度の低減もしくは回復させるための、またはこのような処置を欠くときに予測されるものを超えた患者の生存の延長のための本明細書において提供されるLMBR1L阻害剤の投与を使用する。
本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、患者に投与された場合に、免疫系が過剰または過活動である状態、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病、もしくは同種移植片拒絶を有する患者において免疫応答を低減または抑制するために十分である、および/または炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶の処置、予後または診断に影響を与える、LMBR1L阻害剤、例えば、抗LMBR1L抗体などの薬剤の量を指す。治療有効量は、処置される患者および疾患状態、患者の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて変動し、当業者によって容易に決定され得る。投与のための投薬量は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合部分の例えば約1ngから約10,000mg、約5ngから約9,500mg、約10ngから約9,000mg、約20ngから約8,500mg、約30ngから約7,500mg、約40ngから約7,000mg、約50ngから約6,500mg、約100ngから約6,000mg、約200ngから約5,500mg、約300ngから約5,000mg、約400ngから約4,500mg、約500ngから約4,000mg、約1μgから約3,500mg、約5μgから約3,000mg、約10μgから約2,600mg、約20μgから約2,575mg、約30μgから約2,550mg、約40μgから約2,500mg、約50μgから約2,475mg、約100μgから約2,450mg、約200μgから約2,425mg、約300μgから約2,000、約400μgから約1,175mg、約500μgから約1,150mg、約0.5mgから約1,125mg、約1mgから約1,100mg、約1.25mgから約1,075mg、約1.5mgから約1,050mg、約2.0mgから約1,025mg、約2.5mgから約1,000mg、約3.0mgから約975mg、約3.5mgから約950mg、約4.0mgから約925mg、約4.5mgから約900mg、約5mgから約875mg、約10mgから約850mg、約20mgから約825mg、約30mgから約800mg、約40mgから約775mg、約50mgから約750mg、約100mgから約725mg、約200mgから約700mg、約300mgから約675mg、約400mgから約650mg、約500mgまたは約525mgから約625mgの範囲であり得る。投薬は、例えば、毎週、2週間ごと、3週間ごと、4週間ごと、5週間ごとまたは6週間ごとであってよい。投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすために調整され得る。有効量は、薬剤のいかなる毒性もしくは有害作用(副作用)も最小化され、および/または有益な効果が上回るものでもある。投与は、静脈内に、1週間に正確にもしくは約6mg/kgもしくは12mg/kgまたは2週間に正確にもしくは約12mg/kgもしくは24mg/kgであってよい。追加的投薬レジメンは、以下に記載される。
本明細書において使用される場合、組換え核酸技術、微生物学、免疫学、抗体工学ならびに分子および細胞生物学の分野において使用される他の用語は、適用される分野の当業者によって一般に理解される。例えば、従来の技術は、組換えDNAを調製するため、オリゴヌクレオチド合成を実施するためならびに組織培養および形質転換(例えば、電気穿孔法、トランスフェクションまたはリポフェクション)を実行するために使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に達成される通り、また本明細書に記載される通り実施され得る。前述の技術および手順は、当技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通じて引用および考察される種々の一般的およびさらに具体的な参考文献に記載される通り、一般に実施され得る。例えば、任意の目的に関して引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照されたい。具体的な定義が提供される場合を除いて、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および技術との関連で利用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されている。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤および送達ならびに患者の処置のために使用され得る。
本明細書において使用される場合、用語「含んでいる」または「含む」は、所与の実施形態において示される組成物、方法およびこれらそれぞれの構成成分を参照して使用され、未指定の要素の含有にさらに開かれている。
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の実施形態のために必要な要素を指す。用語は、本開示の実施形態の基礎的および新規のまたは機能的特徴に実質的に影響を与えない追加的要素の存在を許容する。
用語「からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法およびこれらそれぞれの構成成分を指し、実施形態の記載に列挙されていない要素を除外する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a(1つの)」、「an(1つの)」および「the(その)」は、内容がそうでないと明確に示す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば、「方法」を参照することは、本明細書に記載される種類のおよび/または本開示の読解において当業者に明らかになる、1つまたは複数の方法および/またはステップを含む。
種々の態様および実施形態は、続くサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
LMBR1L
リム領域1様(LMBR1L)は、9回膜貫通細胞表面タンパク質であり、本明細書において開示される通りT細胞、B細胞、NKおよびNK T細胞を含むすべてのリンパ球系列の正常な機能のために必要である。LMBR1Lは、低分子分泌タンパク質、ヒトリポカリン(Liopcalin)−1(PMID:23964685)に対する受容体として同定された。ヒトLMBR1Lの全長遺伝子配列は、長さ14,985bpである(GenBank ID番号NC_000012.12)。本開示に先立って、LMBR1Lタンパク質は、複数の先天性四肢奇形と遺伝的に関連付けられた。しかし、ヒトおよびマウス遺伝子座のさらなる研究は、LMBR1Lのイントロン内に位置する長い範囲のSHHエンハンサーの破壊が原因で、四肢欠損との元来の関連は偶発的であったことを示した(Dolezal,D.Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Nov 10;112(45):13928−13933)。本開示より前には、LMBR1Lの機能は明らかにされていなかった。
リム領域1様(LMBR1L)は、9回膜貫通細胞表面タンパク質であり、本明細書において開示される通りT細胞、B細胞、NKおよびNK T細胞を含むすべてのリンパ球系列の正常な機能のために必要である。LMBR1Lは、低分子分泌タンパク質、ヒトリポカリン(Liopcalin)−1(PMID:23964685)に対する受容体として同定された。ヒトLMBR1Lの全長遺伝子配列は、長さ14,985bpである(GenBank ID番号NC_000012.12)。本開示に先立って、LMBR1Lタンパク質は、複数の先天性四肢奇形と遺伝的に関連付けられた。しかし、ヒトおよびマウス遺伝子座のさらなる研究は、LMBR1Lのイントロン内に位置する長い範囲のSHHエンハンサーの破壊が原因で、四肢欠損との元来の関連は偶発的であったことを示した(Dolezal,D.Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Nov 10;112(45):13928−13933)。本開示より前には、LMBR1Lの機能は明らかにされていなかった。
本明細書に記載される通り、表現型は、マウスにおけるすべてのリンパ球系列の細胞自律不全(cell autonomous failure)と関連してフォワードジェネティクススクリーニングにおいて検出された。原因となる変異は、免疫においてそれ以前に記載された機能を有さない9回貫通膜タンパク質をコードするLmbr1lにおいて同定された。T細胞におけるLMBR1L欠損は、Wnt共受容体frizzled−6(FZD6)および低密度リポタンパク質受容体−関連タンパク質6(LRP6)の発現を増加させ、刺激でのWnt/β−カテニン経路およびアポトーシス性細胞死の異常な活性化を生じる。LMBR1Lとユビキチン関連ドメイン含有2(ubiquitin associated domain containing 2)(UBAC2)および糖タンパク質78(GP78)との相互作用は、小胞体内のユビキチン化を通じてFZD6およびLRP6の成熟を妨げることによってリンパ球におけるWntシグナル伝達の下方制御をもたらす。したがって、本開示は、Wnt/β−カテニン経路の負の制御因子として作用する、リンパ球新生およびリンパ系の活性化の際のLMBR1Lについて不可欠な機能を証明する。
また、本明細書においてLMBR1L相互作用タンパク質も開示される。4個のタンパク質は、ユビキチン関連ドメイン含有2(UBAC2)、移行型小胞体ATPase(TERA、VCPとして知られている)、UBXドメイン含有タンパク質8(UBXD8、FAF2として知られている)および糖タンパク質78(GP78;AMFRとして知られている)を含む、小胞体関連分解(ERAD)経路の不可欠な構成成分である。Wnt/β−カテニンシグナル伝達経路の構成成分も、ジンクおよびリングフィンガー3(ZNRF3)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6(LRP6)、β−カテニン、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−3α(GSK3α)およびGSK3βを含む推定LMBR1L相互作用物質として本明細書において同定されている。追加的分析は、LMBR1LがWntおよびERAD構成成分それぞれと相互作用することを確認し(図3Bおよび13)、LMBR1Lが、ERADおよびWnt/β−カテニンシグナル伝達経路の重要な構成成分である可能性があることを示唆している。実際に、LMBR1Lは、本明細書においてWnt/β−カテニンシグナル伝達の新規の負の制御因子として同定された。LMBR1Lは、GP78−UBAC2複合体中に存在し、ER内でWnt共受容体成熟を阻害することによってWnt/β−カテニンシグナル伝達を減弱する。
本明細書における知見は、リンパ球においてWnt/β−カテニンシグナル伝達を制御する、以前は認識されていなかった経路の存在を実証する。T細胞の過剰なアポトーシスは、LMBR1L欠損マウスにおいてWnt/β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化から生じるリンパ球減少症をもたらす。LMBR1Lの非存在下で、Wnt共受容体の成熟形態は、高度に上方制御され、分解複合体の構成成分は下方制御される。これらの変化は、核に侵入し、c−Myc、p53およびCD44などの標的遺伝子の転写を促進するβ−カテニンの蓄積に寄与する。このシグナル伝達カスケードは、内在性および外因性のカスパーゼカスケード依存性の様式でアポトーシスを支持する。
このように、LMBR1Lを阻害することによって、免疫抑制は達成され得る。これは、対象の免疫系が過活動である疾患または状態を処置するために特に有用である。LMBR1Lを阻害し、それにより免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制するための組成物も提供される。組成物は、本明細書に開示される1つまたは複数の抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片を含み得る。一部の実施形態では、小分子化合物などの他のLMBR1L阻害剤もLMBR1Lの1つまたは複数の活性を阻害するために使用され得る。
さらに、LMBR1L欠損は、以前は明らかにされていなかった汎リンパ系免疫不全障害における潜在的な原因として示された。したがって、免疫不全障害を処置するための組成物および方法は、LMBR1Lをコードする導入遺伝子などの核酸(DNAまたはmRNA)を、それを必要とする対象に導入することを含み得る。
LMBR1L阻害剤およびその使用
LMBR1Lの阻害は、炎症性疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または自己免疫疾患(例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、I型インスリン依存性糖尿病、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS))などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制できる。このように、LMBR1L阻害剤は、免疫抑制療法において有効な薬剤として使用され得る。理論に束縛されることなく、LMBR1L欠損または阻害が、T細胞などのリンパ球のアポトーシス、および自己抗体(例えば、dsDNA−特異的IgG)の産生などの自己免疫応答の阻害をもたらし得ると考えられる。LMBR1Lは、Wnt/β−カテニン経路の負の制御因子として作用し、リンパ球新生およびリンパ系活性化の際の不可欠な機能を有する。
LMBR1Lの阻害は、炎症性疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または自己免疫疾患(例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、I型インスリン依存性糖尿病、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS))などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制できる。このように、LMBR1L阻害剤は、免疫抑制療法において有効な薬剤として使用され得る。理論に束縛されることなく、LMBR1L欠損または阻害が、T細胞などのリンパ球のアポトーシス、および自己抗体(例えば、dsDNA−特異的IgG)の産生などの自己免疫応答の阻害をもたらし得ると考えられる。LMBR1Lは、Wnt/β−カテニン経路の負の制御因子として作用し、リンパ球新生およびリンパ系活性化の際の不可欠な機能を有する。
種々のLMBR1L阻害剤は、本開示に含まれる。例として、例えば、ウエスタンブロット分析またはZNRF3、FRIZZLED−6、β−カテニンおよび/もしくはc−Myc発現アッセイにおいて測定される、LMBR1Lに結合でき、その活性を阻害または減少させる小分子阻害剤および生物学的薬剤(例えば、抗体)などの化学物質が挙げられる。Lmbr1l遺伝子またはその制御配列を標的化するように特異的に設計されている、干渉RNA(shRNA、siRNA)および遺伝子編集/サイレンシングツール(CRISPR/Cas9、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ)などの、Lmbr1l遺伝子発現レベルを制御する薬剤も含まれる。
一部の実施形態では、細胞と試験剤とを接触させることを含み得る、LMBR1L阻害剤を同定するための方法が提供され、試験剤と接触していない対照細胞と比較したFRIZZLED−6、β−カテニン、および/もしくはc−Mycの発現の増加、ならびに/またはZNRF3の発現の減少が、試験剤がLMBR1L阻害剤であることを示す。
一部の実施形態では、LMBR1L阻害剤は、LMBR1Lを発現する細胞の増殖の少なくとも部分的な阻害(例えば、対照と比較して少なくとも10%まで)によって特徴付けられ得る。
ある特定の実施形態では、LMBR1L阻害剤は、抗LMBR1L抗体、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態では、抗LMBR1L抗体は、改変抗体、例えば、マウス抗LMBR1L抗体由来のキメラまたはヒト化抗体であり得る。改変抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。一部の実施形態では、抗LMBR1L抗体は、ヒトLMBR1Lタンパク質に存在するエピトープ、例えば、細胞外外部ドメイン、またはその一部に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。
さらに別の実施形態では、抗LMBR1L抗体などのLMBR1L阻害剤は、LMBR1Lの異なるエピトープにそれぞれ結合する2つ以上の抗LMBR1L抗体の混合物またはカクテルを含み得る。一実施形態では、混合物またはカクテルは、LMBR1L上の異なるエピトープにそれぞれ結合する3種の抗LMBR1L抗体を含む。
別の実施形態では、LMBR1L阻害剤は、LMBR1Lの発現または活性を阻害するRNA分子などの核酸分子を含み得る。LMBR1Lの発現および/または活性を特異的に阻害するshRNAまたはsiRNAなどの、LMBR1Lに特異的な干渉RNAは、当技術分野において知られる方法により設計され得る。
一態様では、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶、などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制する医薬の製造のためのLMBR1L阻害剤の使用が提供される。別の態様では、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する患者において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、LMBR1L阻害剤の有効量を患者に投与することを含む。
抗LMBR1L抗体の調製
抗LMBR1L抗体は、当技術分野において一般に知られている種々の方法を使用して作製され得る。例えば、ファージディスプレイ技術は、治療用の完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためにヒト抗体ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。高親和性結合剤は、中和研究のための候補と見なされ得る。代替的に、マウスまたはウサギがヒトタンパク質を用いて免疫処置され、候補結合剤が同定および試験され、ヒト抗体をコードする配列に重鎖および軽鎖を組み合わせる部位を移植することによって最終的にヒト化抗体が産生される、従来のモノクローナルアプローチが使用され得る。
抗LMBR1L抗体は、当技術分野において一般に知られている種々の方法を使用して作製され得る。例えば、ファージディスプレイ技術は、治療用の完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためにヒト抗体ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。高親和性結合剤は、中和研究のための候補と見なされ得る。代替的に、マウスまたはウサギがヒトタンパク質を用いて免疫処置され、候補結合剤が同定および試験され、ヒト抗体をコードする配列に重鎖および軽鎖を組み合わせる部位を移植することによって最終的にヒト化抗体が産生される、従来のモノクローナルアプローチが使用され得る。
典型的には抗体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対を含み、各対は、1つの全長「軽」鎖(典型的には、約25kDaの分子量を有する)および1つの全長「重」鎖(典型的には、約50〜70kDaの分子量を有する)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には抗原認識に関与する約100から110またはこれを超えるアミノ酸の可変領域を典型的には含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に関与する定常領域を典型的には画定する。重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、相補性決定領域またはCDRとも称される3個の高頻度可変領域によって接続された4個の比較的保存されたフレームワーク領域(FR)を含む同じ一般構造を典型的には示す。典型的には各対の2本の鎖由来のCDRはフレームワーク領域によってアラインされ、そのアラインメントが特定のエピトープへの結合を可能にする。N末端からC末端に、軽鎖および重鎖可変領域の両方が、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4ドメインを典型的には含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987 and 1991,National Institutes of Health,Bethesda,Md.),Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901−917またはChothia et al.,1989,Nature 342:878−883)の定義に典型的には従う。
抗体は、モノクローナル抗体の開発で医薬品として有用で、興味の対象になった。モノクローナル抗体は、培養物中で連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために好適な方法の例は、Kohler et al.(1975,Nature 256:495−497)のハイブリドーマ法ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001;およびBrodeur et al.,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.51−63)を含む。
モノクローナル抗体は、治療法としての使用のために改変され得る。一例は、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である一方で、鎖(複数可)の残部が、別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である、「キメラ」抗体である。他の例は、所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片である。米国特許第4,816,567号およびMorrison et al.(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855を参照されたい。関連する開発は、抗体が特定の種由来のまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む一方で、抗体鎖(複数可)の残部が別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同性である、「CDR移植」抗体である。
別の開発は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知である(米国特許第5,585,089号および第5,693,762号を参照されたい;ラマ抗体のヒト化についてCecile Vincke et al.J.Biol.Chem.2009;284:3273−3284も参照されたい)。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物によって産生され、次いである特定のアミノ酸残基、典型的には、抗体の非抗原認識部分が、対応するアイソタイプのヒト抗体中の前記残基に相同性であるように改変される。ヒト化は、例えば、当技術分野において記載される方法(Jones et al.,1986,Nature 321:522−525;Riechmann et al.,1988,Nature 332:323−327;Verhoeyen et al.,1988,Science 239:1534−1536)を使用して、げっ歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に関して置換することによって、実施され得る。
ヒトへの抗原の曝露を行わないヒト抗体(「完全ヒト抗体」)が近年開発された。内在性マウス免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を使用して、このような抗体は、抗原(典型的には、少なくとも6近接アミノ酸を有する)、任意選択で担体にコンジュゲートされている、を用いた免疫処置によって産生される。例えば、Jakobovits et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551−2555;Jakobovits et al.,1993,Nature 362:255−258;およびBruggermann et al.,1993,Year in Immunol.7:33を参照されたい。これらの方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウス重および軽免疫グロブリン鎖をコードしている内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。すべてではない改変を有する部分的に改変された動物は、次に、すべての所望の免疫系改変を有する動物を得るために交雑される。これらのトランスジェニック動物は、免疫原を投与されると、可変領域を含んでこれらの抗原に免疫特異的で、ヒト(マウスではなく)アミノ酸配列を有する抗体を産生する。引用することにより本明細書の一部をなすものとするPCT公開第WO96/33735号および第WO94/02602号を参照されたい。追加的な方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第5,545,807号、PCT公開第WO91/10741号、第WO90/04036号ならびにEP546073B1およびEP546073A1に記載されている。ヒト抗体は、本明細書に記載される通り、宿主細胞における組換えDNAの発現によって、またはハイブリドーマ細胞における発現によっても産生され得る。
一部の実施形態では、ファージディスプレイ技術は、治療用抗体をスクリーニングするために使用され得る。ファージディスプレイでは、抗体レパートリーは、糸状バクテリオファージの表面に提示され、構築されたライブラリーは、免疫原に結合するファージについてスクリーニングされ得る。抗体ファージは、バクテリオファージの遺伝子工学ならびに抗原ガイド選択(antigen−guided selection)およびファージ増殖の反復ラウンドに基づく。本技術は、LMBR1Lモノクローナル抗体のin vitro選択を可能にする。ファージディスプレイプロセスは、抗体ライブラリー調製で始まり、可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)PCR産物のファージディスプレイベクターへのライゲーションが続き、結果的にモノクローナル抗体のクローンの分析になる。抗体レパートリーを表すVHおよびVL PCR産物は、M13バクテリオファージに元は由来した大腸菌(Escherichia coli)の糸状バクテリオファージのpIIIマイナーカプシドタンパク質に融合されたscFvとしてVHおよびVLを発現するために操作される、ファージディスプレイベクター(例えば、ファージミドpComb3X)にライゲーションされる。しかし、ファージディスプレイベクターpComb3Xは、大腸菌において完全なバクテリオファージをコードするために必要な他の遺伝子をすべては有していない。これらの遺伝子のために、ファージディスプレイベクターライブラリーを用いて形質転換される大腸菌にヘルパーファージが加えられる。それぞれ、その表面にLMBR1Lモノクローナル抗体を発現し、それぞれのヌクレオチド配列をその中に有するベクターを保有しているファージのライブラリーが生じる。ファージディスプレイは、ある特定の株の大腸菌においてLMBR1Lモノクローナル抗体それ自体(ファージカプシドタンパク質に付着していない)を産生するためにも使用され得る。ファージディスプレイベクター中の追加的cDNAは、産生されるmAbの特徴付けおよび精製を可能にするためにVLおよびVH配列の後で操作される。具体的には、組換え抗体は、溶液からの容易な精製を可能にするためにヘマグルチニン(HA)エピトープタグおよびポリヒスチジンを有し得る。
多様な抗体ファージライブラリーは、ヘルパーファージを感染させた約108個の独立した大腸菌形質転換体から産生される。バイオパニングを使用して、ライブラリーは、モノクローナル抗体の表面発現を通じて、上に列挙される免疫原配列またはその断片に結合するファージについてスクリーニングされ得る。周期的なパニングは、潜在的に非常にまれな抗原結合クローンを引き出すことを可能にし、大腸菌中のファージ結合剤の、抗原(ELISAプレートに固定されている、または細胞表面で溶液中)へのファージ結合、洗浄、溶出および再増幅の複数ラウンドからなる。各ラウンドの際に、特異的結合剤は非結合剤を洗浄除去し、結合ファージクローンを選択的に溶出することによってプールから選択される。3または4回後、それらの表面LMBR1Lモノクローナル抗体を通じたファージクローンの高度に特異的な結合は、固定された免疫原での方向付けられた選択に特徴的である。
別の方法は、親和性クロマトグラフィーによる精製のために好適なC末端Hisタグを上に列挙された免疫原配列に加えることである。精製されたタンパク質は、好適なアジュバントと共にマウスに接種され得る。ハイブリドーマにおいて産生されたモノクローナル抗体は、免疫原への結合について試験されてよく、陽性結合剤は、本明細書のアッセイにおいて記載される通りスクリーニングされてよい。
完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも産生され得る(Hoogenboom et al.,1991,J.Mol.Biol.227:381;およびMarks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581に開示される通り)。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面での抗体レパートリーの提示、および選択した抗原へのそれらの結合によるファージの続く選択を通じて免疫選択を模倣する。1つのこのような技術は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするPCT公開第WO99/10494号に記載されており、このようなアプローチを使用したMPL−およびmsk−受容体についての高親和性および機能性アゴニスト性抗体の単離を記載している。
一部の実施形態では、ヒトLMBR1Lの細胞外ドメインは、免疫原として使用され得る。ヒトLMBR1Lは、5個の細胞外ドメインを有する(図1B)。これらの細胞外ドメインは、
(1)MEAPDYEVLSVREQLFHERIR(配列番号5);
(2)SNEVLLSLPRNYYIQWLNGSLIHGLWN(配列番号6);
(3)VDKNKANRESLYDFWEYYLPY(配列番号7);
(4)DEAAMPRGMQGTSLGQVSFSKLGS(配列番号8);および
(5)SRTLGLTRFDLLGDFGRFNWLG(配列番号9)
を含む。
(1)MEAPDYEVLSVREQLFHERIR(配列番号5);
(2)SNEVLLSLPRNYYIQWLNGSLIHGLWN(配列番号6);
(3)VDKNKANRESLYDFWEYYLPY(配列番号7);
(4)DEAAMPRGMQGTSLGQVSFSKLGS(配列番号8);および
(5)SRTLGLTRFDLLGDFGRFNWLG(配列番号9)
を含む。
ヒトLMBR1L細胞外ドメインの断片または部分は、免疫原としても使用され得る。モノクローナル抗体は、1つまたは複数の免疫原を使用して産生され得る。有望な治療用抗LMBR1L抗体が生成され得る。
一例では、マウスLmbr1l遺伝子にノックされたヒトLMBR1Lの1つまたは複数の細胞外ドメインを有するマウスモデルおよびヒトT細胞(Jurkatまたはヒトドナー由来初代T細胞)を使用して、ノックアウト変異を表現型コピーしたモノクローナル抗体は、有望な抗LMBR1L抗体候補として試験および同定され得る。ノックアウト変異を表現型コピーしたモノクローナル抗体は、T細胞(例えば、CD4+およびCD8+)、B細胞、NKおよび/またはNK T細胞の数の低減などの表現型を提示できる。このような試験として、例えば、ウエスタンブロットで検出されるFRIZZLED−6、ZNRF3、β−カテニンおよび/またはc−Mycタンパク質発現の増大などのエンドポイント(複数可)のスクリーニングが挙げられる。スクリーニング後、完全ヒトモノクローナル抗体は前臨床試験のために、生じさせることができ、次いでヒト臨床治験において安全性および有効性について試験され得る。このような抗体は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病もしくは同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減もしくは抑制できる、および/または免疫抑制療法を改善できる(例えば、リンパ球の数を減少させることによって)臨床的候補であり得る。
上記抗体をコードするヌクレオチド配列は、決定され得る。その後、キメラ、CDR移植、ヒト化および完全ヒト抗体は、組換え法によっても産生され得る。抗体をコードする核酸は、当技術分野において一般に知られている材料および手順を使用して宿主細胞に導入および発現され得る。
本開示は、LMBR1Lに対する1つまたは複数のモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、抗体は、ヒトLMBR1Lの1つもしくは複数の細胞外ドメインまたはその断片に結合する。好ましい実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にそれらの可変領域に対応する配列をコードするヌクレオチド配列およびそれを含むアミノ酸配列を提供する。好ましい実施形態では、CDR、具体的には、CDR1からCDR3に対応する配列が提供される。追加的な実施形態では、本開示は、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株およびそれから産生されるモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトLMBR1Lに対する精製されたヒトモノクローナル抗体を提供する。
本開示の抗LMBR1L抗体の軽鎖および重鎖可変領域のCDRは、同じまたは別の種由来のフレームワーク領域(FR)に移植され得る。ある特定の実施形態では、抗LMBR1L抗体の軽鎖および重鎖可変領域のCDRは、コンセンサスヒトFRに移植され得る。コンセンサスヒトFRを創出するために、数個のヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のFRは、コンセンサスアミノ酸配列を同定するためにアラインされる。抗LMBR1L抗体重鎖または軽鎖のFRは、異なる重鎖または軽鎖由来のFRを用いて置き換えられ得る。抗LMBR1L抗体の重鎖および軽鎖のFR中のまれなアミノ酸は、典型的には置き換えられない一方で、残りのFRアミノ酸は、置き換えられる場合がある。まれなアミノ酸は、FR中で通常見出されない位置にある特定のアミノ酸である。本開示の抗LMBR1L抗体から移植された可変領域は、抗LMBR1L抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。代替的に、移植された可変領域は1本鎖Fv抗体の一部である。CDR移植は、任意の目的のため引用することにより本明細書の一部をなすものとする、例えば、米国特許第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号および第5,530,101号に記載されている。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ株によって産生され得る。これらの実施形態では、本開示の抗体は、LMBR1Lにおよそ4pMから1μMの間の解離定数(Kd)で結合する。本開示のある特定の実施形態では、抗体は、LMBR1Lに約100nM未満、約50nM未満または約10nM未満のKdで結合する。
好ましい実施形態では、本開示の抗体は、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプのものであり、IgG1アイソタイプが最も好ましい。本開示の好ましい実施形態では、抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトIgG1、IgG2またはIgG4重鎖を含む。具体的な実施形態では、抗体の可変領域は、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプについての定常領域以外の定常領域にライゲーションされる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされた。
代替的実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。これらの実施形態では、具体的な抗体をコードする配列は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用され得る。これらの実施形態により、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに(または、ウイルスベクターに)パッケージングし、宿主細胞にウイルス(もしくはベクター)を形質導入すること、または当技術分野において知られているトランスフェクション手順によるものを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の知られている方法を使用して達成され得る。このような手順は、米国特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号および第4,959,455号(すべて、任意の目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする)によって例示される。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する場合がある。異種性ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、これだけに限らないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム中へのポリヌクレオチド(複数可)の封入および核へのDNAの直接微量注入が挙げられる。
本開示の方法のある特定の実施形態により、本開示のLMBR1L抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的ライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。好ましい実施形態では、LMBR1L重鎖または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のC末端に付加され、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、使用される具体的な宿主細胞において機能性である(すなわち、ベクターが、遺伝子の増幅および/または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構に適合性である)ように、典型的には選択される。発現ベクターの概説について、Goeddel(ed.),1990,Meth.Enzymol.Vol.185,Academic Press.N.Y.を参照されたい。
典型的には、任意の宿主細胞において使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のため、ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有し得る。このような配列は、プロモーター、1つもしくは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択可能マーカーエレメント、の1つまたは複数のヌクレオチド配列を典型的には含む。これらの配列は、当技術分野において周知である。
本開示の発現ベクターは、商業的に入手できるベクターなどの出発ベクターから構築されてもよい。このようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含有してもしなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の1つまたは複数がベクターにまだ存在しない場合、それらは、個々に得られ、ベクターにライゲートされてもよい。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
ベクターが構築され、抗LMBR1L抗体を含む軽鎖もしくは重鎖または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な位置に挿入された後、完成したベクターは、増幅および/またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入され得る。抗LMBR1L抗体についての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、微量注入、リポフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクションまたは他の知られている技術が挙げられる周知の方法によって達成され得る。選択された方法は、一部は、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.,上記に記載されている。
適切な条件下で培養される場合、宿主細胞は、抗LMBR1L抗体を合成し、続いてそれは、培養培地から(宿主細胞がそれを培地に分泌する場合)またはそれを産生する宿主細胞から直接(分泌されない場合)収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいまたは必要であるポリペプチド修飾(グリコシル化またはリン酸化など)および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の要因に依存する。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、これに限定されないがチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)および多数の他の細胞株が挙げられるAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多数の不死化細胞株をこれだけに限らないが含む。ある特定の実施形態では、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的なLMBR1L結合特性を有する抗体を産生するのかを決定することによって細胞株を選択できる。別の実施形態では、それ自体の抗体を作製しないが、異種性抗体を作製および分泌する能力を有するB細胞系列(例えば、マウス骨髄腫細胞株NS0およびSP2/0)から細胞株を選択できる。
医薬組成物およびその使用
別の態様では、本明細書において開示される方法において使用され得る医薬組成物、すなわち、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病もしくは同種移植片拒絶などの免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するもしくは抑制する、および/または免疫抑制療法を改善する(例えば、リンパ球の数を減少させることによって)ための医薬組成物が提供される。
別の態様では、本明細書において開示される方法において使用され得る医薬組成物、すなわち、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病もしくは同種移植片拒絶などの免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するもしくは抑制する、および/または免疫抑制療法を改善する(例えば、リンパ球の数を減少させることによって)ための医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、LMBR1L阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。LMBR1L阻害剤は、薬学的に許容される担体と共に医薬組成物に製剤化され得る。追加的に、医薬組成物は、例えば、免疫系が過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するもしくは抑制する、および/または免疫抑制療法を改善するための患者の処置のための組成物の使用のための説明書を含み得る。
一実施形態では、LMBR1L阻害剤は、抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片であってよい。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的適合性である任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤ならびに他の賦形剤を含む。好ましくは、担体は、非経口、経口または局所投与のために好適である。投与の経路に依存して、活性化合物、例えば小分子または生物学的製剤(biologic agent)は、酸および化合物を不活性化する可能性がある他の天然条件の作用から化合物を保護するために材料でコーティングされ得る。
薬学的に許容される担体として、滅菌水溶液または分散剤および滅菌注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉剤、ならびに錠剤、丸剤、カプセルなどの調製のための従来の賦形剤が挙げられる。薬学的活性物質の製剤化のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書において提供される医薬組成物におけるその使用は、適合性である。補助的活性化合物も組成物に組み入れられ得る。
薬学的に許容される担体として、薬学的に許容される抗酸化物質が挙げられる。薬学的に許容される抗酸化物質の例として、(1)水溶性抗酸化物質、例えば、アルコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;(2)油溶性抗酸化物質、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、プロピルガレート、アルファトコフェロールなど;および(3)金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本明細書において提供される医薬組成物において使用され得る好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびこれらの好適な混合物ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。必要に応じて、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことは有用である場合がある。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの機能的賦形剤も含有する場合がある。
治療用組成物は、典型的には、滅菌、非系統学的(non-phylogenic)ならびに製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロ乳剤、リポソームまたは高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。
滅菌注射可能な溶液は、活性化合物を必要に応じて上に列挙した成分の1つまたは組合せを含んで適切な溶媒中に必要な量で組み入れることに続いて、滅菌、例えば精密濾過によって調製され得る。一般に分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅菌粉剤の場合では、調製方法として、あらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉剤をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)が挙げられる。活性剤(複数可)は、滅菌状態下で追加的な薬学的に許容される担体(複数可)と、および任意の保存剤、緩衝剤または必要に応じて噴霧剤と混合され得る。
微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順によって、ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によっての両方で確実にされ得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。加えて、注射可能な薬学的形態の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされ得る。
LMBR1L阻害剤を含む医薬組成物は、単独または組合せ療法で投与され得る。例えば、組合せ療法は、LMBR1L阻害剤および当技術分野において知られており、下でさらに詳細に考察される1つまたは複数の化学療法剤などの少なくとも1つまたは複数の追加的治療剤を含む本明細書において提供される組成物を含み得る。医薬組成物は、放射線療法および/または手術と併せて投与されてもよい。
投薬レジメンは、最適な望ましい応答(例えば、治療応答)をもたらすように調整される。例えば、単一ボーラスは投与されてよく、数回に分けられた用量が経時的に投与されてよく、または用量は、治療の状況の緊急性によって示される通り比例的に低減もしくは増加されてもよい。
抗体の投与についての例示的な投薬量範囲は、10〜1000mg(抗体)/kg(患者の体重)、10〜800mg/kg、10〜600mg/kg、10〜400mg/kg、10〜200mg/kg、30〜1000mg/kg、30〜800mg/kg、30〜600mg/kg、30〜400mg/kg、30〜200mg/kg、50〜1000mg/kg、50〜800mg/kg、50〜600mg/kg、50〜400mg/kg、50〜200mg/kg、100〜1000mg/kg、100〜900mg/kg、100〜800mg/kg、100〜700mg/kg、100〜600mg/kg、100〜500mg/kg、100〜400mg/kg、100〜300mg/kgおよび100〜200mg/kgを含む。例示的な投薬スケジュールとして、3日に1回、5日に1回、7日に1回(すなわち、1週間に1回)、10日に1回、14日に1回(すなわち、2週間に1回)、21日に1回(すなわち、3週間に1回)、28日に1回(すなわち、4週間に1回)および1カ月に1回が挙げられる。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位投与形態に製剤化することは、有利である場合がある。本明細書において使用される場合、単位投与形態は、処置される患者のための単位投薬量として適している物理的に分けられた単位を指し、各単位は、任意の必要な医薬用担体と併せて所望の治療効果を生じるように算出されたあらかじめ決められた量の活性剤を含有する。単位投与形態についての仕様は、(a)活性化合物の固有の特徴および達成される具体的な治療効果、ならびに(b)個体での感受性の処置のための活性化合物の調剤技術に内在する制限、に応じて決定され、それに直接依存する。
本明細書において開示される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性であることなく、具体的な患者、組成物および投与の様式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変動する場合がある。投与の文脈で本明細書において使用される場合、「非経口」は、通常注射による、経腸的および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射(intrasternal injection)ならびに注入が挙げられる。
本明細書において使用される場合、句「非経口投与」および「非経口的に投与」は、通常注射または注入による、経腸的(すなわち、消化管を介する)および局所投与以外の投与様式を指し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられる。静脈内注射および注入は、しばしば(しかし、排他的ではなく)抗体投与のために使用される。
本明細書において提供される薬剤が医薬としてヒトまたは動物に投与される場合、それらは単独または、例えば、0.001から90%(例えば、0.005から70%、例えば、0.01から30%)の活性成分を薬学的に許容される担体との組合せで含有する医薬組成物として与えられてよい。
ある特定の実施形態では、免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するため、および/または免疫抑制療法を改善する(例えば、リンパ球の数を減少させることによって)ための本明細書において提供される方法および使用は、LMBR1L阻害剤およびLMBR1L阻害剤ではない少なくとも1つの追加的薬剤の投与を含み得る。
一態様では、本開示による組合せの有効性の改善は、治療的相乗効果を達成することによって実証され得る。
用語「治療的相乗効果」は、所与の用量での2つの産物の組合せが、同じ用量での2つの産物単独のそれぞれの最良よりもさらに効果的である場合に使用される。一例では、治療的相乗効果は、パラメーター、腫瘍体積について反復測定(例えば、時間的要因)を用いた二元配置分散分析から得られる概算を使用して、組合せを最良の単一の薬剤と比較することによって評価され得る。
用語「相加的」は、所与の用量での2つ以上の産物の組合せが、2つ以上の産物それぞれを用いて得られた効果の合計と同等に有効である場合を指し、一方、用語「優加法的(superadditive)」は、組合せが、2つ以上の産物それぞれを用いて得られる有効性の合計よりもさらに有効である場合を指す。
免疫系が過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するための組成物および方法が本明細書において開示される。方法は、それを必要とする対象においてLMBR1Lを阻害することを含む。ある特定の実施形態では、LMBR1Lを阻害することは、T細胞(例えば、CD4+およびCD8+)、B細胞、NKおよび/またはNK T細胞の数を低減でき、それにより免疫抑制療法を提供する。LMBR1L阻害(例えば、抗LMBR1L抗体)は、例えば、対象におけるリンパ球の数を低減することによってスタンドアロン免疫抑制療法として使用され得る。一部の実施形態では、LMBR1L阻害は、他の治療と併せて使用され得る。
種々の実施形態では、本明細書において開示される方法は、抗LMBR1L抗体またはその抗原結合性断片などのLMBR1L阻害剤の有効量を対象に投与することを含み得る。一般に有効量は、治療的および/または予防的に投与され得る。
処置は、このようながんを罹患している、有する、罹患しやすいまたは発症するリスクがある対象、特にヒトに適切に投与され得る。これらの「リスクがある」対象の判定は、診断試験または対象もしくは医療提供者の所見(例えば、遺伝的試験、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴など)による任意の客観的または主観的判定によって行われ得る。このような処置を必要とする対象を同定することは、対象または医療従事者の判断であってよく、主観的(例えば、所見)または客観的(例えば、試験もしくは診断法によって測定可能)であってよい。
製剤の投与
これだけに限らないが、再構成されたおよび液体の製剤を含む本開示の製剤は、本明細書において開示されるLMBR1L阻害剤を用いた処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、ボーラスなどの静脈内投与、または一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内(intrasynovial)、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によってなどの知られている方法により投与される。
これだけに限らないが、再構成されたおよび液体の製剤を含む本開示の製剤は、本明細書において開示されるLMBR1L阻害剤を用いた処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、ボーラスなどの静脈内投与、または一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内(intrasynovial)、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によってなどの知られている方法により投与される。
好ましい実施形態では、製剤は、哺乳動物に皮下投与によって(すなわち、皮膚の下に)投与される。このような目的のために、製剤は、シリンジを使用して注射され得る。しかし、製剤の投与のための他のデバイス、例えば、注射デバイス(例えば、INJECT−EASE(商標)およびGENJECT(商標)デバイス);注射ペン(GENPEN(商標)など);オートインジェクターデバイス、無針デバイス(例えば、MEDIJECTOR(商標)およびBIOJECTOR(商標));ならびに皮下パッチ送達システムは利用可能である。
具体的な実施形態では、本開示は、単一用量投与単位のためのキットを対象とする。このようなキットは単一または複数のチャンバーがあるあらかじめ充填されたシリンジを含む、治療用タンパク質または抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なあらかじめ充填されたシリンジは、Vetter GmbH、Ravensburg、Germanyから入手可能である。
タンパク質の適切な投薬量(「治療有効量」)は、例えば、処置される状態、状態の重症度および経過、タンパク質が予防的または治療的目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴およびLMBR1L阻害剤への応答、使用される製剤の形式ならびに主治医の判断に依存する。LMBR1L阻害剤は、1回または処置の経過にわたって患者に適切に投与され、診断以降の任意の時期に患者に投与され得る。LMBR1L阻害剤は、唯一の処置として、または課題の状態を処置することに有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与され得る。
LMBR1L阻害剤について、開始候補投薬量は、患者への投与のために約0.1〜20mg/kgの範囲であってよく、1つまたは複数に分かれた投与の形態をとる場合がある。しかし、他の投薬レジメンが有用である場合もある。このような治療の進行は、従来の技術によって容易にモニターされる。
本開示のある特定の実施形態により、複数用量のLMBR1L阻害剤(または、LMBR1L阻害剤および本明細書において述べられる任意の追加的な治療活性剤の組合せを含む医薬組成物)は、定められた時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示の本態様による方法は、本開示の抗LMBR1L抗体などのLMBR1L阻害剤の複数用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書において使用される場合、「連続的に投与する」は、異なる時点、例えば、あらかじめ定められた期間(例えば、数時間、数日または数カ月)離された異なる日に、各用量のLMBR1L阻害剤が対象に投与されることを意味する。本開示は、患者に単一の初回用量のLMBR1L阻害剤に続いて、1つまたは複数の二次用量のLMBR1L阻害剤に続いて、任意選択で1つまたは複数の三次用量のLMBR1L阻害剤を連続的に投与することを含む方法を含む。LMBR1L阻害剤は、0.1mg/kgから約100mg/kgの間の用量で投与され得る。
用語「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」は、本開示のLMBR1L阻害剤の投与の時間的な連続を指す。したがって、「初回用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量(「ベースライン用量」とも称される)であり;「二次用量」は初回用量後に投与される用量であり;「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。初回、二次および三次用量は、すべて同じ量のLMBR1L阻害剤を含有する場合があるが、一般に、投与の頻度に関して互いに異なっている場合がある。しかし、ある特定の実施形態では、初回、二次および/または三次用量に含有されるLMBR1L阻害剤の量は、処置の経過の際に互いに変動する(例えば、上方にまたは下方に適切に調整される)。ある特定の実施形態では、2以上(例えば、2、3、4または5)の用量は、処置レジメンの開始時に「初回負荷量」として投与され、少ない頻度を基に投与される次の用量(例えば、「維持用量」)が続く。
本開示のある特定の例示的実施形態では、二次および/または三次用量それぞれは、直前の用量の1から26(例えば、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2、またはこれを超える)週間後に投与される。本明細書において使用される場合、句「直前の用量」は、複数投与の連続において、介在する用量を伴わずに連続における次の用量の投与に先行して患者に投与される、LMBR1L阻害剤の用量を意味する。
本開示の本態様による方法は、患者にLMBR1L阻害剤の任意の数の二次および/または三次用量を投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、2以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8またはこれを超える)二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、2以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8またはこれを超える)三次用量が患者に投与される。
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の1から2週間または1から2カ月後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の2から12週間後に患者に投与され得る。本開示のある特定の実施形態では、二次および/または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの経過にわたって変動する場合がある。投与の頻度は、臨床検査後に個々の患者の必要に応じて医師によって処置の経過の際に調整され得る。
本開示は、2から6回の初回負荷量が第1の頻度(例えば、1週間に1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、4週間ごとに1回、1カ月に1回、2カ月ごとに1回など)で患者に投与され、少ない頻度を基に患者への2回以上の維持用量の投与が続く投与レジメンを含む。例えば、本開示の態様により、初回負荷量が、例えば1カ月に1回の頻度で投与される場合(例えば、1カ月に1回投与される2、3、4またはこれを超える初回負荷量)、次いで維持用量は、患者に5週間ごとに1回、6週間ごとに1回、7週間ごとに1回、8週間ごとに1回、10週間ごとに1回、12週間ごとに1回など)投与され得る。
治療的使用および方法
本明細書において開示される組成物(例えば、LMBR1L阻害剤)は、例えば、免疫系が過剰または過活動応答を示す状態または疾患の処置が挙げられる多数の治療的有用性を有する。本開示は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するための方法を特に提供する。例示的な方法は、例えば、免疫抑制療法を提供するために本明細書に記載されるいずれかのLMBR1L阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む。
本明細書において開示される組成物(例えば、LMBR1L阻害剤)は、例えば、免疫系が過剰または過活動応答を示す状態または疾患の処置が挙げられる多数の治療的有用性を有する。本開示は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するための方法を特に提供する。例示的な方法は、例えば、免疫抑制療法を提供するために本明細書に記載されるいずれかのLMBR1L阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む。
免疫抑制療法の例示的な適用例として、同種免疫疾患、自己免疫疾患、アレルギーおよび他の炎症性疾患が挙げられる。同種免疫疾患として、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病(GVHD)(例えば、同種造血幹細胞移植後、HSCT)および同種幹細胞移植(SCT)後GVHDが挙げられる。
自己免疫疾患は、免疫系が自分自身のタンパク質、細胞および組織を攻撃する疾患である。自己免疫疾患の包括的な表および概説は、The Autoimmune Diseases(Rose and Mackay,2014,Academic Press)に見出すことができる。処置され得る例示的な自己免疫疾患として、1型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ(RA)、強直性脊椎炎、クローン病、皮膚筋炎、グットパスチャー症候群、ギランバレー症候群(GBS)、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
炎症性疾患は、炎症によって特徴付けられる多数の障害および状態を広く定義するために使用され得る。例として、とりわけ、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ループス、再灌流傷害、移植片拒絶、アジソン病、円形脱毛症、ジストロフィーの表皮水疱症、精巣上体炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血および潰瘍性大腸炎が挙げられる。炎症性腸疾患(IBD)は、2つの主な種類、すなわちクローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)を含む。
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
[実施例1]
LMBR1Lは、Wnt/β−カテニンシグナル伝達によるリンパ球新生を制御する
要約:免疫系の発達には、Wntシグナル伝達の正確な統御が必要である。本明細書では、リム領域1様(Lmbr1l)にN−エチル−N−ニトロソウレア誘導変異が引き起こされ、以前に説明された免疫における機能を備えていない膜貫通タンパク質をコードしているマウスにおいて、全リンパ系列の重度の発達障害を検出した。LMBR1Lと糖タンパク質78(GP78)およびユビキチン関連ドメイン含有2(UBAC2)との相互作用は、小胞体内でのユビキチン化によるFZD6およびLRP6の成熟を妨害し、分解複合体タンパク質を安定化させることによって、リンパ球でのWntシグナル伝達を減衰させた。LMBR1L欠損T細胞は、Wnt/β−カテニン活性化の特徴を示し、増殖性刺激に応答してアポトーシス細胞死を起こした。LMBR1Lは、リンパ球新生およびリンパ球活性化において不可欠な機能を有し、Wnt/β−カテニン経路の負の制御因子として作用する。
LMBR1Lは、Wnt/β−カテニンシグナル伝達によるリンパ球新生を制御する
要約:免疫系の発達には、Wntシグナル伝達の正確な統御が必要である。本明細書では、リム領域1様(Lmbr1l)にN−エチル−N−ニトロソウレア誘導変異が引き起こされ、以前に説明された免疫における機能を備えていない膜貫通タンパク質をコードしているマウスにおいて、全リンパ系列の重度の発達障害を検出した。LMBR1Lと糖タンパク質78(GP78)およびユビキチン関連ドメイン含有2(UBAC2)との相互作用は、小胞体内でのユビキチン化によるFZD6およびLRP6の成熟を妨害し、分解複合体タンパク質を安定化させることによって、リンパ球でのWntシグナル伝達を減衰させた。LMBR1L欠損T細胞は、Wnt/β−カテニン活性化の特徴を示し、増殖性刺激に応答してアポトーシス細胞死を起こした。LMBR1Lは、リンパ球新生およびリンパ球活性化において不可欠な機能を有し、Wnt/β−カテニン経路の負の制御因子として作用する。
序論:造血系は、特殊な機能を備えた多くの細胞種からなる。リンパ系または骨髄系のいずれかに由来する血液細胞は、造血幹細胞(HSC)から生成される。HSCは、一連の系列に限定されたステップを通じて血液細胞種全てを継続的に補充し、これらの機構のバランスを取って、生物の生涯を通じて定常状態の造血を維持する。過去20年間で、カノニカルWntシグナル伝達(Wnt/β−カテニンシグナル伝達としても知られている)および非カノニカルWntシグナル伝達(例えば、平面細胞極性経路およびWnt−Ca2+シグナル伝達)は、HSCの自己複製、TおよびB細胞の発達ならびにT細胞活性化を制御することによって、免疫系の重要な制御因子として浮上してきた(1〜4)。リンパ球では、Wntタンパク質は成長促進因子として機能するが、アポトーシスや静止を含む細胞運命の決定にも影響を及ぼす(5)。大腸腺腫症(Apc)の欠如によるT細胞系列のWnt/β−カテニン経路の異常な活性化は、末梢における成熟T細胞の自発的な活性化およびのアポトーシスの結果としてT細胞リンパ球減少症を引き起こす(6)。
その広範な重要性を考えると、いくつかのフィードバック制御機構が、適切なWntシグナル伝達を統御するのに役立っている。これらには、負のフィードバック制御因子であるジンクおよびリングフィンガー3(ZNRF3)ならびにその同族リングフィンガー43(RNF43)が含まれる(7)。これらの膜貫通E3リガーゼは、Frizzledタンパク質(FZD)の細胞質ループのリジン残基のユビキチン化を特異的に促進し、FZDをリソソーム分解させ、それによってWntシグナル伝達を減衰させる(8、9)。最近、ディシュベルト(DVL)がZNRF3/RNF43媒介FZDのユビキチン化および分解の重要な中間体として示唆されている。(10)。ZNRF3およびRNF43の発現の喪失は、Wnt刺激に過敏反応を引き起こすことが予測され、ZNRF3およびRNF43における変異は、ヒトにおける種々のがんにおいて認められている(7,9)。免疫におけるWntシグナル伝達の重要性にもかかわらず、リンパ球新生を特異的に統御する負のフィードバック制御因子は不明のままである。本明細書では、リンパ球のWntシグナル伝達の負の制御におけるLMBR1Lの機能および作用機序について説明する。
Lmbr1l変異によって引き起こされる免疫不全
リンパ球新生および免疫の非冗長性制御因子を発見するために、N−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)で変異を誘導したマウスにおいてフォワード遺伝子スクリーニングを実施した。末梢血においてCD3+T細胞のパーセンテージが低い、ENU処置を受けた共通の初代の子孫である何匹かのマウスを同定した(図1Aの挿入図)。strawberry(st)と称した表現型は、劣性形質として伝達された。系統の遺伝子型対表現型の関連を分析する方法である単一系統マッピングによって(11)、strawberry表現型はLmbr11およびCers5における変異と相関していた(図1A)。Lmbr1lは、免疫における機能が未知の膜貫通タンパク質であるリム領域1様(LMBR1L)をコードし、Cers5は、セラミド合成における酵素であるセラミドシンターゼ5(CERS5)をコードする。Lmbr1lとCers5の変異によって引き起こされる影響に関しては当初よくわからなかったが、Lmbr1lを優先して遺伝的に解決された(図8A〜図8C)。strawberryマウスにおけるLmbr1l変異は、LMBR1Lの第5の膜貫通ヘリックスに早期停止を伴うシステイン212の置換(C212*)を引き起こす(図1B)。この変異は、推定上のヌル対立遺伝子と考えられた。Cers5およびLmbr1lの両方のCRISPR/Cas9標的ノックアウト変異が生成され、Lmbr1lにおける変異が観察された表現型に単独で関与していることが確認された(図1C)。
リンパ球新生および免疫の非冗長性制御因子を発見するために、N−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)で変異を誘導したマウスにおいてフォワード遺伝子スクリーニングを実施した。末梢血においてCD3+T細胞のパーセンテージが低い、ENU処置を受けた共通の初代の子孫である何匹かのマウスを同定した(図1Aの挿入図)。strawberry(st)と称した表現型は、劣性形質として伝達された。系統の遺伝子型対表現型の関連を分析する方法である単一系統マッピングによって(11)、strawberry表現型はLmbr11およびCers5における変異と相関していた(図1A)。Lmbr1lは、免疫における機能が未知の膜貫通タンパク質であるリム領域1様(LMBR1L)をコードし、Cers5は、セラミド合成における酵素であるセラミドシンターゼ5(CERS5)をコードする。Lmbr1lとCers5の変異によって引き起こされる影響に関しては当初よくわからなかったが、Lmbr1lを優先して遺伝的に解決された(図8A〜図8C)。strawberryマウスにおけるLmbr1l変異は、LMBR1Lの第5の膜貫通ヘリックスに早期停止を伴うシステイン212の置換(C212*)を引き起こす(図1B)。この変異は、推定上のヌル対立遺伝子と考えられた。Cers5およびLmbr1lの両方のCRISPR/Cas9標的ノックアウト変異が生成され、Lmbr1lにおける変異が観察された表現型に単独で関与していることが確認された(図1C)。
Lmbr1l変異によって引き起こされた免疫学的欠陥をさらに特徴付けるために、全血球数(CBC)試験、血液細胞のフローサイトメトリー分析、免疫処置ならびに抗体応答および記憶形成の分析、in vivo NKおよびCTL媒介細胞傷害性試験およびマウスサイトメガロウイルス感染によってマウスの免疫表現型を決定した。(図1C〜1R、9A〜12C)。Lmbr1l−/−マウスは、白血球、リンパ球および単球の数が低減している血球減少症であった(図9A〜9H)。末梢血細胞数と一致して、Lmbr1l−/−およびstrawberryマウスは、野生型同腹仔と比較して末梢血におけるCD3+T細胞の頻度が減少していた(図1C、10A)。CD4+対CD8+T細胞比は、Lmbr11−/−およびstrawberryマウスで増加していた(図1D、10B)。増大するT細胞集団に豊富に存在する表面糖タンパク質CD44およびCD62Lの発現が増加していた(図1E、1F、10C、10D)。B細胞対T細胞の比も増加していた(図1G、10E)。野生型マウスと比較して、Lmbr1l−/−またはstrawberryホモ接合体の末梢血では、IgG発現の増加(図1J、10H)を伴って表面B220(図1H、10F)およびIgD(図1l、10G)発現が低下していた。これは、Lmbr1l変異がB細胞発達に影響を及ぼしたことを示唆している。Lmbr1l−/−マウスは、野生型マウスと比較してわずかに小さい胸腺を有していた(図11A)。ダブルネガティブ(DN)胸腺細胞の数は、Lmbr1l−/−および野生型マウスの間で同等であった(図11B)。しかし、Lmbr1l−/−マウスでは、ダブルポジティブ(DP)およびシングルポジティブ(SP)胸腺細胞の減少が認められた(図11C〜11E)。脾細胞の総数は同程度であったが、野生の脾臓と比較してLmbr1l−/−の脾臓では全リンパ球の数が著しく低減していた(図11F〜11K)。組換えセムリキ森林ウイルスにコードされたβ−ガラクトシダーゼ(rSFV−βgal)および4−ヒドロキシ−3−ニトロフェニルアセチル−Ficoll(NP−Ficoll)に対するT細胞依存性および非依存性液性免疫応答は、それぞれ少なくなっていた(図1K、1L、10I、10J)。免疫処置されたLmbr11−/−またはstrawberryマウスにおける抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)殺滅活性も、野生型同腹仔と比較して減少していた(図10、10M)。免疫処置されたLmbr1l−/−マウスの脾臓におけるKb/SIINFEKL−テトラマー陽性CD8+T細胞の総数(図1P)および頻度の低減(図12Aから図12C)によって示されたように、Lmbr1l−/−マウスでは野生型マウスと比較して、水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン(OVA)による免疫処置に対する抗原特異的CD8+T細胞応答は弱かった。ナチュラルキラー細胞(NK;図1M、10K、11I)およびNK1.1+T細胞(図1N、10L、11J)の頻度および数は、Lmbr1l−/−またはstrawberryマウスで低減し、同時にNK細胞標的殺滅も減少していた(図1Q、10N)。さらに、Lmbr1l−/−マウスは、致死量以下の用量のMCMVに曝露した後の肝臓でのウイルス力価の上昇によって判定されるように、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)に対する感受性を示した(図1R)。Lmbr1lmRNAは様々なマウス組織および免疫細胞で検出され、骨髄、胸腺、脾臓およびリンパ球でより高い発現を示した(図13Aおよび図13B)。しかし、LMBR1L欠損は、骨髄細胞の発達(図11Nおよび図11O)、または種々の刺激に応答したIFN−α、IL−1βおよびTNF−α分泌によって判定したように、それらの機能(図13C〜13J)には影響を及ぼさなかった。したがって、LMBR1Lはリンパ球新生に不可欠である。
細胞内因性のリンパ球新生不全
細胞由来のLmbr1lに関連する欠陥を決定するために、照射された野生型(CD45.1)またはRag2−/−(CD45.2)レシピエントを混合していない野生型(Lmbr1l+/+;CD45.2)骨髄、Lmbr1l変異体(CD45.2)骨髄または変異体(CD45.2)および野生型(CD45.1)骨髄細胞の等量混合物で再構成した。競合の有無にかかわらず、strawberryドナーの骨髄細胞は、野生型ドナーから得られた細胞ほど効率的に、照射されたレシピエントの脾臓においてB220+(図2A、2E)、CD3+T(図2A、2F)およびNK細胞(図2B、2G)などのリンパ系列の細胞を再増殖させることはできなかった。野生型マウスの骨髄を投与されたものと比較して、strawberry骨髄を投与されたマウスの胸腺では、DN細胞の頻度が増加し、DP細胞の頻度が減少しており(図2C、2H、2I)、Lmbr1l変異は胸腺におけるT細胞分化に軽度の影響を与えることを示唆している。
細胞由来のLmbr1lに関連する欠陥を決定するために、照射された野生型(CD45.1)またはRag2−/−(CD45.2)レシピエントを混合していない野生型(Lmbr1l+/+;CD45.2)骨髄、Lmbr1l変異体(CD45.2)骨髄または変異体(CD45.2)および野生型(CD45.1)骨髄細胞の等量混合物で再構成した。競合の有無にかかわらず、strawberryドナーの骨髄細胞は、野生型ドナーから得られた細胞ほど効率的に、照射されたレシピエントの脾臓においてB220+(図2A、2E)、CD3+T(図2A、2F)およびNK細胞(図2B、2G)などのリンパ系列の細胞を再増殖させることはできなかった。野生型マウスの骨髄を投与されたものと比較して、strawberry骨髄を投与されたマウスの胸腺では、DN細胞の頻度が増加し、DP細胞の頻度が減少しており(図2C、2H、2I)、Lmbr1l変異は胸腺におけるT細胞分化に軽度の影響を与えることを示唆している。
骨髄では、野生型ドナー(B220+IgM+IgD−;図2D、2J)と比較して、strawberryドナーから得られた再増殖したB細胞、および成熟再循環B細胞段階に進行したstrawberryドナーから得られたB細胞のごく一部(B220+IgM+IgD+;図2D、2K)で、未熟B細胞が増加していた。この発達停止は、競合に関係なく、照射された野生型およびRag2−/−レシピエントの両方で生じた。strawberryホモ接合体およびLmbr1l−/−マウスの末梢血B細胞において、B220およびIgDの発現減少ならびにIgMの発現増加も検出された(図1H〜図1J、10F〜10H)。したがって、Lmbr1l変異はB細胞発達も障害した。
B、TおよびNK細胞を含むリンパ球は、リンパ球系多能性前駆細胞(LMPP)およびLMPPから発達すると考えられているリンパ球系共通前駆細胞(CLP)に由来する。したがって、骨髄における造血幹細胞および前駆細胞の集団を調べた。LMBR1L欠損は、野生型同腹仔と比較してLSK+細胞の割合および数の増加を引き起こした(図2L、2M)。LSK区画の組成は、Lmbr1l−/−骨髄では少し変化していて、LMPPおよびCLPの割合の低減が生じていた(図2L)。対照的に、長期造血幹細胞(LT−HSC)、短期(ST)−HSCおよび多能性前駆細胞(MPP)の数は、野生型マウスと比較してLmbr1l−/−骨髄で増加していた(図2M)。LMBR1L欠損は、骨髄系共通前駆細胞(CMP)、巨核球−赤血球前駆細胞(MEP)または顆粒球−マクロファージ前駆細胞(GMP;図2L、2M)を含むLK+細胞の組成および数にそれほど影響を与えなかった。さらに、これらの前駆細胞集団の相対的な適応度を評価するために、Lmbr1l−/−(CD45.2)および野生型(CD45.1)骨髄の1:1混合物を使用して、競合性骨髄キメラを作製した。移植して8週間後に、Lmbr1l−/−由来造血細胞は、LSK、ST−HSC、MPP、CMPおよびMEPの再増殖には有利であったが、LMPP、CLPおよびGMPの再増殖には不利であることが示された(図14A〜14B)。Lmbr1l−/−マウスで観察されたHSC表現型は、発現低下したApc変異を有するマウスにおいてWntシグナル伝達が適度に増加している場合のHSC表現型に対応している(12)。これは、細胞自律的であるリンパ系列の関わり合いに対してLMBR1L欠損が特異的に影響を及ぼすことを示唆している。
Lmbr1l変異は、DP細胞の減少と共にDN細胞の割合の増加によって示されるように、胸腺において異常な細胞性を引き起こしたが(図2H、2I)、残存するDP細胞は胸腺選択を生き延び、成熟SP細胞に発達することができた(図2C)。末梢血T細胞と同様に、Lmbr1l−/−マウスの脾臓におけるCD4+およびCD8+T細胞は、表面糖タンパク質CD44の発現増加を示し、最近に活性化され増大している記憶表現型の細胞を包含している(図3A)。CD44発現の増加は、発達している胸腺細胞では明らかではなかった(図3A)。Lmbr1l−/−マウスのCD8+T細胞のイムノブロット分析によって、活性化エフェクターT細胞で以前に認められた表現型であるT細胞因子−1(TCF−1)およびリンパ系エンハンサー結合因子1(LEF−1)の下方制御が明らかになった(図3B)(13)。さらに、リン酸化によって活性化される、Akt、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(p44/42 MAPK)、p70S6K(mTORC1基質)およびリボソームタンパク質S6(p70S6K基質)は、Lmbr1l−/−マウスのCD8+T細胞において基本的条件下で構成的にリン酸化された(図3B)。strawberryホモ接合体のCD4+およびCD8+T細胞の高いパーセンテージは、野生型同腹仔と比較して、定常状態でアネキシンVに陽性であった(図3C)。野生型同腹仔と比較して、Lmbr1l−/−マウスの末梢T細胞では、IL−7Rαの発現が低いことが認められた(図3D)。したがって、Lmbr1l変異マウスの末梢T細胞は、アポトーシスの素因となる可能性のある活性化状態で存在すると考えられたので、増大シグナルに対する増殖性応答を調査することにした。
抗原特異的T細胞増殖を調べるために、OVA特異的野生型(CD45.2)およびLmbr1l−/−OT−I T細胞(CD45.2)の等量混合物を野生型レシピエント(CD45.1)に移植し、その後、可溶性OVAで免疫処置した。野生型OT−I T細胞は予測通りに増殖したが、免疫処置して2または3日後に脾臓で検出されたLmbr1l−/−OT−I T細胞は、有意に少なかった(図3E〜3G)。過剰なLmbr1l−/−OT−I T細胞は、アネキシンV染色によって示されるように、アポトーシス性であることが見いだされた(図15A)。Lmbr1l変異のT細胞増殖に対する影響をさらに試験するために、恒常性増殖シグナルに対する応答を調べた。野生型およびホモ接合体strawberry脾臓T細胞の等量混合物を、致死量以下で照射された野生型マウスに養子移植した。野生型T細胞は広範囲に増殖したが、ホモ接合体strawberryT細胞は照射されたレシピエントでは増殖できず(図3H〜3J)、野生型T細胞と比較してアネキシンV染色の高い頻度を示した(図15B)。
二次リンパ器官へのT細胞ホーミングが障害されているかどうかに取り組むために、野生型およびLmbr1l−/−色素標識汎T細胞の混合物を照射されたレシピエントに移植した。野生型およびLmbr1l−/−T細胞の有意な数が、養子移植後の照射されたレシピエントの脾臓で検出され、ホーミング欠陥の可能性は排除され、Lmbr1l−/−CD4+およびCD8+T細胞には増殖欠陥があることがさらに支持された(図16A、16B)。これらの結果は、抗原特異的または恒常性増大シグナルに応答して、Lmbr1l変異体またはLmbr1l−/−T細胞がアポトーシスされることを示している。Lmbr1l−/−T細胞の活性化状態(CD44hi)がそれらの細胞をアポトーシスさせる素因があるかどうかを調べるために、成熟SP胸腺細胞(CD44lo;図3A)を単離し、それらを刺激して恒常性増大シグナルに応答して増殖させた。脾臓T細胞と同様に、Lmbr1l−/−マウスの成熟SP胸腺細胞も増殖することができず、アポトーシス細胞のパーセンテージの増加を示した(図3K〜図3Mおよび15C)。したがって、LMBR1L欠損T細胞は、活性化状態に関係なく、増大シグナルに応答して死滅する。
末梢では、活性化(エフェクター)T細胞の増大とその後の免疫応答の終了中の消失とのバランスは、外因性細胞死受容体およびカスパーゼ依存性アポトーシス、内因性ミトコンドリアおよびカスパーゼ依存性アポトーシスまたはカスパーゼ非依存性細胞死によって統御されている。野生型またはLmbr1l変異CD8+T細胞のいずれかの腫瘍壊死因子(TNF)−αまたはFasリガンド(FasL)などの外因性細胞死受容体のリガンドによる処置は、外因性アポトーシス経路のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−8、−3、−7およびPARP)のタンパク質溶解プロセシングを増強した。切断カスパーゼのレベルは、野生型T細胞と比較してLmbr1l変異T細胞で増加した(図17A、17B)。さらに、内因性経路の主要な担い手であるカスパーゼ−9の過剰な切断が、外因性のアポトーシス誘導因子で処置した後のLmbr1l−/−細胞で検出された(図17A、17B)。したがって、外因性および内因性の両方のカスパーゼカスケードは、LMBR1L欠損T細胞アポトーシスにおいて役割を果たすものと考えられる。特に、TNF−α(図17C)、Fas(図17D)またはカスパーゼ−3(図17E)の欠損は、Lmbr1l−/−マウスのT細胞欠損をレスキューすることはできなかった。Fas−、TNFR−およびカスパーゼ−3媒介アポトーシス経路も、Lmbr1l−/−T細胞の死に全く関与していなかった。
Wnt/β−カテニンシグナル伝達の負の制御因子としてのLMBR1Lの同定
LMBR1Lは最初、リガンドの内部移行および分解を媒介する親油性化合物の細胞外スカベンジャー/担体であるヒトリポカリン−1(LCN1)の受容体として同定された(14〜18)。その後の発見によって、LMBR1Lはヒトにおける主要な食品由来アレルゲンであるウシリポカリンβ−ラクトグロブリン(BLG)の内部移行を媒介し(19)、LMBR1Lは走化性阻害特性を有するウテログロビン(UG)と相互作用することが示唆された(20)。ヒトLCN1のマウスオルソログであるLcn3の標的化ヌル対立遺伝子を有するマウスを生成し、LCN3欠損マウスは明らかに正常であり、リンパ球発達の欠陥を示さないことを観察した。したがって、リンパ球新生におけるLMBR1Lの機能は、LCN3との相互作用とは無関係である(図18A〜図18C)。
LMBR1Lは最初、リガンドの内部移行および分解を媒介する親油性化合物の細胞外スカベンジャー/担体であるヒトリポカリン−1(LCN1)の受容体として同定された(14〜18)。その後の発見によって、LMBR1Lはヒトにおける主要な食品由来アレルゲンであるウシリポカリンβ−ラクトグロブリン(BLG)の内部移行を媒介し(19)、LMBR1Lは走化性阻害特性を有するウテログロビン(UG)と相互作用することが示唆された(20)。ヒトLCN1のマウスオルソログであるLcn3の標的化ヌル対立遺伝子を有するマウスを生成し、LCN3欠損マウスは明らかに正常であり、リンパ球発達の欠陥を示さないことを観察した。したがって、リンパ球新生におけるLMBR1Lの機能は、LCN3との相互作用とは無関係である(図18A〜図18C)。
共免疫沈降(co−IP)を質量分析(MS)と組み合わせて使用してLMBR1L−相互作用タンパク質を同定することによって、LMBRL1の免疫機能を理解しようとした。推定LMBR1L相互作用物質(データセットS1)として同定された1623個の候補タンパク質のうち25個のタンパク質は、空のベクター対照と比較してLMBR1Lco−IP産物において50倍超豊富であった(表1)。
これらのタンパク質のうち4つは、ユビキチン関連ドメイン含有2(UBAC2;297倍上昇)、移行型小胞体ATPアーゼ(VCPとして知られているTERA;120倍上昇)、UBXドメイン含有タンパク質8(UBXD8、FAF2として知られている;71倍上昇)(21)および糖タンパク質78(GP78;AMFRとして知られている;51倍上昇)を含むERAD経路に不可欠な構成成分であった。ジンクおよびリングフィンガー3(ZNRF3)、低密度リポタンパク質受容体関連性タンパク質6(LRP6)、β−カテニン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3α(GSK3α)およびGSK3βを含む、LMBR1Lco−IPにおいてのみ見いだされた764個のタンパク質の中にあるWnt/β−カテニンシグナル伝達経路の多数の構成成分も同定した。LMBR1L相互作用タンパク質を同定するための第2の公平なアプローチとして、タンパク質マイクロアレイ分析も実行した。GSK−3βは、LMBR1Lへの結合親和性について9483個のヒトタンパク質のうち8番目にランク付けされた(図4A、データセットS2)。LMBR1Lは、CK1α、γ、δおよびεを含むカゼインキナーゼ1(CK1)アイソフォームならびにβ−カテニンに対して結合親和性を示した。LMBR1LとWnt/β−カテニンシグナル伝達またはERAD経路の構成成分との相互作用を確認するために、HEK293T細胞にHAタグ化LMBR1LおよびFLAGタグ化GSK−3β、β−カテニン、ZNRF3、リングフィンガー43(RNF43、Wnt受容体プロセシングにおいて冗長機能を備えたZNRF3のホモログ)、FZD6、LRP6またはDVL2を同時トランスフェクトした。LMBR1Lは、FLAGタグ化タンパク質のそれぞれと共免疫沈降させた(図4B)。さらに、co−IPおよびイムノブロット分析によって、LMBR1LがUBAC2、UBXD8、VCPおよびGP78を含むERAD構成成分のそれぞれと相互作用することが確認された(図19A〜19D)。したがって、LMBR1LはWnt/β−カテニンおよびERADシグナル伝達経路の重要な構成成分である可能性がある。
Wnt/β−カテニンシグナル伝達とLMBR1Lとの関係を判定するために、Lmbr1l−/−および野生型マウスのCD8+T細胞におけるWnt/β−カテニンシグナル伝達を調べた。Wnt/β−カテニンシグナル伝達経路における重要な制御ステップには、リン酸化、ユビキチン化およびその後のWnt下流エフェクタータンパク質であるβ−カテニンの分解が含まれる(22)。LMBR1L欠損によってβ−カテニンの蓄積が引き起こされるとともに野生型細胞に比べてリン酸化β−カテニンのレベルが減少した(図4C)。β−カテニンの蓄積は、胸腺細胞の発達(DN1−4、DP、SP4、SP8;図20A、20B)ならびに末梢におけるナイーブおよび成熟T細胞(図20B)において観察された。β−カテニンの局在化に変化があったかどうかを判定するために、核および細胞基質抽出物をLmbr1l−/−CD8+T細胞から単離した。イムノブロッティングによって、野生型細胞と比較して、Lmbr1l−/−CD8+T細胞の核画分におけるβ−カテニンレベルの増加が明らかになった(図20C)。持続的なβ−カテニンの不活性化には、足場タンパク質Axin1およびDVL2から構成される完全な分解複合体内のGSK−3α/βおよびCK1によるβ−カテニンのリン酸化、それに続くE3ユビキチンリガーゼβ−TrCPによって媒介されるユビキチン化が必要である(5、22)。Lmbr1l−/−CD8+T細胞は、総GSK−3α/βおよびCK1レベルの減少と共にGSK−3β不活性型(リン酸化GSK−3β;図4C)レベルの増加を示した。さらに、Axin1、DVL2およびβ−TrCPレベルは、野生型細胞と比較して、Lmbr1l−/−CD8T細胞において低減していた(図4C)。Wnt活性化によるβ−カテニンの核蓄積は、CD44およびc−Mycを含むその標的遺伝子の上方制御を促進する。Lmbr1l−/−CD8+T細胞の核画分におけるβ−カテニンレベルの増加と一致して、全細胞溶解物におけるc−Myc発現の増加が見いだされた(図4C)。c−Myc誘導性アポトーシスはp53依存性である。抗アポトーシス細胞周期停止タンパク質p21はp53の標的であり、c−Mycによって転写的に抑制される(23)。LMBR1L欠損はp53発現を増加させ、p21を抑制し、カスパーゼ−3および−9切断を増加させた(図4C)。LMBR1L欠損は、CD4+TおよびB細胞において同様の効果を生じた(図21A〜21B)。
腸上皮における異常なWnt活性化は、腺腫の形成および結腸がんを引き起こす(9)。しかし、Lmbr1l−/−腸上皮は、β−カテニンの蓄積(図22A、22C)、Ki−67染色によって判定された陰窩の顕著な増大(図22B、22D)またはデキストラン硫酸ナトリウムの経口投与後の腸の恒常的な異常を示さなかった(DSS;図22E)。LGR5+腸幹細胞におけるLmbr1lmRNA発現の欠如と一致して(24)、我々の発見は、β−カテニン活性を制御するためのその他の系が腸細胞環境においてLMBR1Lと重複していることを示唆している。これらの結果によって、LMBR1LはWnt/β−カテニンシグナル伝達のリンパ球特異的な負の制御因子として確立される。
LMBR1L−GP78−UBAC2複合体は、ER内のWnt受容体の成熟を制御し、GSK−3βを安定化する
Wntタンパク質は、2つの分子、FZDおよびLRP6の受容体複合体に結合する(5)。本発明者らの知見は、LMBR1LがWnt経路の負の制御因子として作用することを示唆している。したがって、LMBR1LがWnt共受容体の発現および/または分解複合体の安定化を制御できるかどうかを調べた。野生型細胞と比較して、Lmbr1l−/−CD8+T細胞の膜画分においてFZD6の成熟(グリコシル化)型のレベル増加が検出された(図5A)。FZD6およびLRP6の成熟型と未熟型の両方が、野生型CD8+T細胞と比較してLmbr1l−/−CD8+T細胞の全細胞溶解物(TCL)中で増加していた(図5A)。
Wntタンパク質は、2つの分子、FZDおよびLRP6の受容体複合体に結合する(5)。本発明者らの知見は、LMBR1LがWnt経路の負の制御因子として作用することを示唆している。したがって、LMBR1LがWnt共受容体の発現および/または分解複合体の安定化を制御できるかどうかを調べた。野生型細胞と比較して、Lmbr1l−/−CD8+T細胞の膜画分においてFZD6の成熟(グリコシル化)型のレベル増加が検出された(図5A)。FZD6およびLRP6の成熟型と未熟型の両方が、野生型CD8+T細胞と比較してLmbr1l−/−CD8+T細胞の全細胞溶解物(TCL)中で増加していた(図5A)。
ZNRF3およびRNF43は、Wnt経路の負の制御因子である。ZNRF3およびRNF43は、FZDの細胞質ループのリジンを選択的にユビキチン化し、形質膜で分解するためにFZDを標的とする(8)。さらに、DVLタンパク質は、FZDのZNRF3/RNF43媒介ユビキチン化および分解の中間体として作用する(10)。ZNRF3/RNF43レベルは、野生型細胞におけるレベルと比較して、Lmbr1−/−CD8+T細胞の膜画分で変化していることが見いだされた。TCLでは、ZNRF3レベルは変化していないが、RNF43レベルはわずかに増加していた(図5A)。
UBAC2は、ER膜で発現したGP78ユビキチンリガーゼ複合体のコア構成成分である。UBAC2は、ERAD中の基質抽出に関与するタンパク質であるUBXD8と物理的に相互作用し、ポリUB鎖を付加する(21、25)。LMBR1LとUBAC2、GP78およびUBXD8との相互作用が、FZDおよび/またはLRP6に対するGP78ユビキチンリガーゼ複合体の活性を制御する可能性があると仮定した。FLAGタグ化FZD6およびHAタグ化LMBR1LまたはUBAC2でHEK293T細胞を一過性同時トランスフェクションすることによって、成熟FZD6の総レベルの減少が引き起こされた(図5B)。FLAGタグ化FZD6およびHAタグ化GP78の同時発現は、FZD6の成熟型および未熟型の両方を大幅に減少させた。LMBR1Lとは対照的に、UBAC2およびGP78はFZD6のユビキチン化を大幅に促進した(図5B)。さらに、GFPタグ化FZD6はHEK293T細胞の形質膜およびERの両方に局在していたが、LMBR1LとFZD6−GFPとの同時発現は、FZD6−GFPの局在を変化させ、ERにおける蓄積を引き起こし、形質膜での発現を阻害した(図23)。野生型細胞と比較して、結合免疫グロブリンタンパク質(BiP)およびグルコース制御タンパク質94(GRP94)の発現増加によって示されるように、ERストレスがLmbr1l−/−CD8+T細胞で観察された(図5A)。LMBR1L発現は成熟LRP6を優先的に減少させたのに対し、UBAC2は成熟および未熟LRP6の両方を減少させたことが見いだされた(図5C)。機能ドメインが今までに報告されていないLMBR1Lは、形質膜に局在することが知られている(17、18)。しかし、我々のデータは、LMBR1LがGP78−UBAC2ユビキチンリガーゼ複合体のコア構成成分として機能して、LMBR1Lが媒介するWnt共受容体の成熟がER内で制御される可能性があることを示唆している。
この仮説を試験するために、HEK293T細胞の内因性LMBR1Lタンパク質のC末端に付加されたFLAGタグのCRISPRベースのノックインを作製した。ほとんどのLMBR1L−FLAGはこれらの細胞のERで発現しており、形質膜に局在するのはごく一部であった(図5D)。CRISPR/Cas9系を使用して、HEK293T細胞(図24A)およびマウスT細胞株EL4(図24B)においてUbac2またはGp78もノックアウトした。親HEK293TまたはEL4細胞と比較して、Ubac2−/−およびGp78−/−細胞の両方でFZD6およびLRP6の増加が検出された(図24A、24B)。初代CD8+T細胞におけるLMBR1L欠損と同様に、HEK293TまたはEL4細胞のGP78欠損もβ−カテニンの蓄積を引き起こした(図24A、24B)。さらに、CRISPR/Cas9標的Gp78ノックアウトマウスを作製し、初代CD8+T細胞におけるGP78欠損がFZD6およびLRP6発現の増加ならびにβ−カテニン蓄積を引き起こすことを確認するために使用した(図5E)。Ubac2−/−または親HEK293T細胞においてFLAGタグ化FZD6、HAタグ化LMBR1LおよびEGFPを一過性トランスフェクションした後、LMBR1Lによって媒介されるFZD6成熟に対するUBAC2の影響も調べた。LMBR1Lの量を増加させると、野生型HEK293T細胞におけるEGFP発現に影響を及ぼすことなく、成熟FZD6の量が大幅に低減し、未熟FZD6の量が増加した(図25)。しかし、Ubac2−/−細胞においてLMBR1Lの量を増加させると、野生型細胞ほど効率的にFZD6成熟を阻害することはできなかった(図25)。さらに、野生型細胞で観察されたLMBR1Lによる成熟LRP6の優先的阻害は、Gp78−/−細胞において部分的にレスキューされ、LRP6の総発現は著しく高くなった(図5F)。同様に、FLAGタグ化β−カテニンおよびHAタグ化LMBR1L、UBAC2またはGP78によるHEK293T細胞の一過性同時トランスフェクションによって、空のベクター対照と比較してβ−カテニンの総レベルの減少が引き起こされた(図5G)。co−IPを使用して、GP78とβ−カテニンとの間の物理的相互作用が確認された(図26A)。FLAGタグ化β−カテニンおよびHAタグ化GP78の同時発現は、β−カテニンのユビキチン化を大幅に促進した(図5G)。逆に、FLAGタグ化β−カテニンの一過性トランスフェクション後に、親HEK293T細胞と比較して、Gp78−/−細胞ではβ−カテニン発現の増加が観察された(図26B)。したがって、LMBR1L−GP78−UBAC2複合体は、リンパ球のER内でのFZD6およびWnt共受容体LRP6の成熟を妨害するようである。さらに、LMBR1L−GP78−UBAC2複合体は、β−カテニンのユビキチン化および分解を制御することができる。
Lmbr1l−/−T細胞で観察されたもう1つの顕著な違いは、足場タンパク質Axin1、DVL2、キナーゼGSK−3α/βおよびCK1、ならびにE3リガーゼβ−TrCPを含む分解複合体のいくつかの構成成分が、野生型細胞よりも低いレベルで発現したことであった(図4C)。さらに、Lmbr1l−/−T細胞は、リン酸化β−カテニンおよびリン酸化LRP6の発現の減少(それぞれ図4Cおよび図5A)、リン酸化GSK−3βの増加(図4C)ならびにリン酸化によってGSK−3βを不活性化するAktおよびp70S6Kなどのキナーゼの活性化(図3B)を示した。したがって、LMBR1L−GP78−UBAC2複合体は、β−カテニンおよびLRP6をそれぞれリン酸化することによってWnt/β−カテニンシグナル伝達において阻害および刺激の両方の役割を有しているGSK−3βなどの分解複合体構成成分の安定性を制御することができると仮定した(26)。HEK293T細胞のFLAGタグ化Axin1、DVL2またはGSK−3βとHAタグ化LMBR1Lまたは空のベクター対照による一過性同時トランスフェクションによって、空のベクター対照と比較してHA−LMBR1Lの存在下でFLAGタグ化Axin1タンパク質の総レベルの減少が引き起こされた。しかし、LMBR1Lは、DVL2またはGSK−3βの発現(図27)にも、リン酸化GSK−3βのレベル(図6A)にも影響を及ぼさなかった。GSK−3βの半減期に対するLMBR1Lの影響を測定するために、HEK293T細胞にFLAGタグ化GSK−3βおよびHAタグ化LMBR1Lまたは空のベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの14時間後、細胞を翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド(CHX)で処置し、処置後様々な時間で採取した。LMBR1Lの存在下では、CHX処置4時間後までGSK−3βの検出可能な減少は観察されず、LMBR1LがGSK−3βを安定化させることが示唆された(図6B)。
次々と得られた証拠によると、LMBR1LがWnt/β−カテニンシグナル伝達の負の制御因子として働くことが示唆される。観察された表現型が経路に依存するかどうかを試験するために、CRISPR/Cas9系を使用してEL4細胞においてLmbr1l、β−カテニン(Ctnnb1)またはLmbr1lおよびCtnnb1をノックアウトした。初代Lmbr1l−/−CD8+T細胞で観察された表現型と同様に、Lmbr1l−/−EL4細胞は、通常の培養条件下であっても増殖に深刻な欠陥を示した(図7A)。アネキシンVおよびPI染色は、Lmbr1l−/−EL4細胞の大部分がアポトーシス性であることを示した(図7B:右上、7C)。親の野生型EL4細胞と比較して、Ctnnb1−/−EL4細胞で壊死細胞の頻度の増加が検出されたが(図7B:左下、7C)、それらの増殖は正常であった(図7A)。Lmbr1l−/−EL4細胞におけるCtnnb1の欠如は、Lmbr1l−/−EL4細胞と比較して、増殖能を実質的に回復させ、アポトーシスを減少させたが(図7A、B:右下、7C)、増殖およびアポトーシスは、親の野生型Ctnnb1−/−EL4細胞で観察されたレベルには達しなかった(図7A、7B)。これらの結果は、β−カテニンがマウスTリンパ球形質転換細胞株においてLMBR1Lの下流にあるという遺伝的証拠であり、LMBR1L欠損T細胞で観察された表現型がWnt/β−カテニンシグナル伝達に大きく依存していることを示唆している。
LMBR1L欠損は、マウスにおける自己抗体産生およびB細胞生存を阻害する
自己抗体(dsDNA特異的IgG)の産生は、その他の自己免疫疾患と比較して、全身性エリテマトーデスについての最も特異的で感度の高い指標である。自己免疫疾患におけるLMBR1Lの制御についての洞察を深めるために、Lmbr1l−/−マウスを、T細胞で発現せずB細胞系列に限定されているヒトB細胞リンパ腫2(BCL2)cDNAを含有する導入遺伝子を発現しているTg(BCL2)22Wehi/Jマウス株(以下、Bcl2−Tg)と交配した。B細胞におけるヒトBCL2導入遺伝子の発現は、細胞の生存を増強し、自己抗体産生を促進することが知られていた。
自己抗体(dsDNA特異的IgG)の産生は、その他の自己免疫疾患と比較して、全身性エリテマトーデスについての最も特異的で感度の高い指標である。自己免疫疾患におけるLMBR1Lの制御についての洞察を深めるために、Lmbr1l−/−マウスを、T細胞で発現せずB細胞系列に限定されているヒトB細胞リンパ腫2(BCL2)cDNAを含有する導入遺伝子を発現しているTg(BCL2)22Wehi/Jマウス株(以下、Bcl2−Tg)と交配した。B細胞におけるヒトBCL2導入遺伝子の発現は、細胞の生存を増強し、自己抗体産生を促進することが知られていた。
本明細書では、Lmbr1l−/−;Bcl2−Tgマウスは、Lmbr1l+/+;Bcl2−Tgマウスと比較して、血清中のdsDNA特異的IgGレベルが有意に低いことが見いだされた(図30A)。6ヵ月齢NZB/NZWF1雑種雌の血清を、dsDNA特異的抗体測定の陽性対照として用いた。この結果は、LMBR1L欠損が自己免疫応答を阻害することを示唆している。さらに、Lmbr1l+/+;Bcl2−TgおよびLmbr1l−/−;Bcl2−Tgマウスにおける末梢血B細胞の定量によって、LMBR1L欠損がマウスにおけるB細胞の生存を有意に阻害することが明らかになった(図30B)。
結論
本発明者らの知見は、リンパ球におけるWnt/β−カテニンシグナル伝達を制御する経路の存在を示している。LMBR1L欠損マウスにおいてリンパ球減少症を引き起こすT細胞の過剰なアポトーシスは、Wnt/β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化によって生じる。LMBR1Lがない場合、Wnt共受容体の成熟型およびリン酸化GSK−3βの発現は高度に上方制御されたが、複数の分解複合体タンパク質の発現は低減した。これらの変化は、核に進入し、Myc、Trp53およびCd44などの標的遺伝子の転写を促進するβ−カテニンの蓄積に寄与した。このシグナル伝達カスケードは、内因性および外因性のカスパーゼカスケードに依存したアポトーシスに有利である。
本発明者らの知見は、リンパ球におけるWnt/β−カテニンシグナル伝達を制御する経路の存在を示している。LMBR1L欠損マウスにおいてリンパ球減少症を引き起こすT細胞の過剰なアポトーシスは、Wnt/β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化によって生じる。LMBR1Lがない場合、Wnt共受容体の成熟型およびリン酸化GSK−3βの発現は高度に上方制御されたが、複数の分解複合体タンパク質の発現は低減した。これらの変化は、核に進入し、Myc、Trp53およびCd44などの標的遺伝子の転写を促進するβ−カテニンの蓄積に寄与した。このシグナル伝達カスケードは、内因性および外因性のカスパーゼカスケードに依存したアポトーシスに有利である。
本明細書では、リガンド結合とは無関係にWnt受容体利用性を制御することによってリンパ球のWntシグナル伝達活性を統御する、LMBR1L、GP78およびUBAC2を含むERにおける第2の「分解複合体」を報告する(図28)。さらに、LMBR1Lは、β−カテニンの分解およびLRP6の活性化に必要なGSK−3βを含むカノニカル分解複合体の発現および/または安定化を支持する。ヒトおよびマウスのLMBR1Lオルソログは96%同一性を共有しているので(図29)、同じ機構がヒトリンパ球細胞およびその前駆細胞で作動すると考えられる。LMBR1L欠損は、原因不明の汎リンパ系免疫不全障害の病因となる可能性があると考えられる。
材料および方法
マウス
The Jackson Laboratoryから購入した8から10週齢の純粋なC57BL/6Jバックグラウンドの雄を、以前に記載されたようにN−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)で変異誘発した(27)。変異誘発したG0雄をC57BL/6J雌と繁殖させ、得られたG1雄をC57BL/6J雌と交配してG2マウスを作出した。G2雌はG1雄親と戻し交配してG3マウスを生成し、表現型をスクリーニングした。全エキソーム配列決定およびマッピングは記載されたように実行した(11)。C57BL/6.SJL(CD45.1)、Rag2−/−、Tnf−α−/−、Casp3−/−、Faslpr、B2mtm1Unc(B2m−/−)およびTg(TcraTcrb)1100Mjb(OT−I)トランスジェニックマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。CD45.1;Lmbr1lst/st、Lmbr1l−/−;Tnf−α−/−、Lmbr1l−/−;Casp3−/−、Lmbr1l−/−;Faslpr/lpr、Lmbr1l−/−;OT−Iマウスは、マウス種を交雑することによって作出した。マウスは、University of Texas Southwestern Medical Centerで特定の病原体を含まない条件下に収容し、実験手法は全て、制度によって承認された手順に従って実行した。
マウス
The Jackson Laboratoryから購入した8から10週齢の純粋なC57BL/6Jバックグラウンドの雄を、以前に記載されたようにN−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)で変異誘発した(27)。変異誘発したG0雄をC57BL/6J雌と繁殖させ、得られたG1雄をC57BL/6J雌と交配してG2マウスを作出した。G2雌はG1雄親と戻し交配してG3マウスを生成し、表現型をスクリーニングした。全エキソーム配列決定およびマッピングは記載されたように実行した(11)。C57BL/6.SJL(CD45.1)、Rag2−/−、Tnf−α−/−、Casp3−/−、Faslpr、B2mtm1Unc(B2m−/−)およびTg(TcraTcrb)1100Mjb(OT−I)トランスジェニックマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。CD45.1;Lmbr1lst/st、Lmbr1l−/−;Tnf−α−/−、Lmbr1l−/−;Casp3−/−、Lmbr1l−/−;Faslpr/lpr、Lmbr1l−/−;OT−Iマウスは、マウス種を交雑することによって作出した。マウスは、University of Texas Southwestern Medical Centerで特定の病原体を含まない条件下に収容し、実験手法は全て、制度によって承認された手順に従って実行した。
骨髄キメラ
レシピエントマウスは、ガンマ線照射によって(X−RAD320、Precision X−ray Inc.)13Gyで致死的に照射された。マウスは、それぞれのドナーの脛骨および大腿骨から得られた骨髄細胞5×106個の静脈内注射を受けた。移植後4週間、マウスを抗生物質で維持した。骨髄移植の12週間後、キメラを安楽死させて、骨髄、胸腺および脾臓における免疫細胞の発達をフローサイトメトリーによって評価した。キメラ化は、コンジェニックCD45マーカーを使用して評価した。
レシピエントマウスは、ガンマ線照射によって(X−RAD320、Precision X−ray Inc.)13Gyで致死的に照射された。マウスは、それぞれのドナーの脛骨および大腿骨から得られた骨髄細胞5×106個の静脈内注射を受けた。移植後4週間、マウスを抗生物質で維持した。骨髄移植の12週間後、キメラを安楽死させて、骨髄、胸腺および脾臓における免疫細胞の発達をフローサイトメトリーによって評価した。キメラ化は、コンジェニックCD45マーカーを使用して評価した。
フローサイトメトリー
骨髄細胞、胸腺細胞、脾細胞または末梢血細胞を単離し、赤血球細胞(RBC)溶解緩衝液を添加してRBCを除去した。細胞は、抗マウスCD16/32抗体の存在化で、主要な免疫細胞系列:B220、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD11b、CD11c、CD19、CD43、CD44、CD62L、F4/80、IgD、IgMおよびNK1.1を包含するマウス細胞表面マーカーに特異的な15個のマウス蛍光色素がコンジュゲートしたモノクローナル抗体の1:200希釈物で、4℃で1時間染色した。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
骨髄細胞、胸腺細胞、脾細胞または末梢血細胞を単離し、赤血球細胞(RBC)溶解緩衝液を添加してRBCを除去した。細胞は、抗マウスCD16/32抗体の存在化で、主要な免疫細胞系列:B220、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD11b、CD11c、CD19、CD43、CD44、CD62L、F4/80、IgD、IgMおよびNK1.1を包含するマウス細胞表面マーカーに特異的な15個のマウス蛍光色素がコンジュゲートしたモノクローナル抗体の1:200希釈物で、4℃で1時間染色した。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
造血前駆細胞区画を染色するために、骨髄を単離し、Alexa Fluor 700がコンジュゲートした系列マーカー(B220、CD3、CD11b、Ly−6G/6CおよびTer−119)、CD16/32、CD34、CD135、c−Kit、IL−7RαおよびSca−1で、4℃で1時間染色した。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
H−2Kb(Baylor College of MedicineのMHC Tetramer Core)によって提示された卵白アルブミンエピトープペプチドSIINFEKLに特異的な試薬であるPEがコンジュゲートしたKb/SIINFEKLテトラマーを使用して、水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミンで免疫したマウスにおける抗原特異的CD8+T細胞応答および記憶CD8+T細胞形成を検出した。
細胞内β−カテニンを検出するために、胸腺をホモジナイズして単一細胞懸濁液を作製し、表面のCD3、CD25およびCD44を染色した。次に、BD Cytofix/Cytopermキットを使用して細胞を透過処理し、その後細胞内β−カテニンを染色した。データは、LSRFortessa細胞分析器(BD Bioscience)で取得し、FlowJoソフトウェア(Treestar)で分析した。
免疫処置
12から16週齢のG3マウスまたはLmbr1l−/−、Cers5−/−および野生型同腹仔をT細胞依存性抗原(TD)水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン(OVA/alum;200μg;Invivogen)で0日目に免疫処置した(i.m.)。OVA/alum免疫処置の14日後に、血液をMiniCollectチューブ(Mercedes Medical)に収集し、1,500×gで遠心分離して、ELISA分析のために血清を分離した。採血して3日後、以前に記載されたように(29)、マウスを0日目に別のTD抗原、rSFV−βGal(2×106IU;(28))で、8日目にT細胞非依存性抗原(TI)NP50−AECM−Ficoll(50μg;Biosearch Technologies)で免疫処置した(i.p.)。NP50−AECM−Ficollで免疫処置して6日後に、血液をELISA分析のために収集した。
12から16週齢のG3マウスまたはLmbr1l−/−、Cers5−/−および野生型同腹仔をT細胞依存性抗原(TD)水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン(OVA/alum;200μg;Invivogen)で0日目に免疫処置した(i.m.)。OVA/alum免疫処置の14日後に、血液をMiniCollectチューブ(Mercedes Medical)に収集し、1,500×gで遠心分離して、ELISA分析のために血清を分離した。採血して3日後、以前に記載されたように(29)、マウスを0日目に別のTD抗原、rSFV−βGal(2×106IU;(28))で、8日目にT細胞非依存性抗原(TI)NP50−AECM−Ficoll(50μg;Biosearch Technologies)で免疫処置した(i.p.)。NP50−AECM−Ficollで免疫処置して6日後に、血液をELISA分析のために収集した。
in vivoCTLおよびNK細胞傷害性
細胞傷害性CD8+T細胞エフェクター機能は、標準的なin vivo細胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイによって判定した。簡単に説明すると、脾細胞をナイーブマウスから単離し、半分に分けた。確立された方法(30)に従って、半分はCFSE5μM(CFSEhi)で染色し、半分はCFSE0.5μM(CFSElo)で標識した。CFSEhi細胞は、H−2bハプロタイプ(New England Peptide;(31))を有するマウスのためにE.coliβ−ガラクトシダーゼMHCIエピトープを有するICPMYARVペプチド5μMでパルスした。CFSElo細胞は刺激しなかった。CFSEhiおよびCFSElo細胞を(1:1)で混合し、2×106個の細胞を後眼窩注射によってナイーブマウスおよびrSFV−βgalで免疫処置したマウスに投与した。養子移植の24時間後に血液を収集し、フローサイトメトリーによって各集団のCFSE強度を評価した。標的(CFSEhi)細胞の溶解は溶解%=[1−(比対照マウス/比ワクチン接種したマウス)]×100;比=パーセントCFSElo/パーセントCFSEhiとして計算した。
細胞傷害性CD8+T細胞エフェクター機能は、標準的なin vivo細胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイによって判定した。簡単に説明すると、脾細胞をナイーブマウスから単離し、半分に分けた。確立された方法(30)に従って、半分はCFSE5μM(CFSEhi)で染色し、半分はCFSE0.5μM(CFSElo)で標識した。CFSEhi細胞は、H−2bハプロタイプ(New England Peptide;(31))を有するマウスのためにE.coliβ−ガラクトシダーゼMHCIエピトープを有するICPMYARVペプチド5μMでパルスした。CFSElo細胞は刺激しなかった。CFSEhiおよびCFSElo細胞を(1:1)で混合し、2×106個の細胞を後眼窩注射によってナイーブマウスおよびrSFV−βgalで免疫処置したマウスに投与した。養子移植の24時間後に血液を収集し、フローサイトメトリーによって各集団のCFSE強度を評価した。標的(CFSEhi)細胞の溶解は溶解%=[1−(比対照マウス/比ワクチン接種したマウス)]×100;比=パーセントCFSElo/パーセントCFSEhiとして計算した。
NK細胞媒介殺滅を測定するために、対照C57BL/6J(Violet0.5μM;Violetlo)およびB2m−/−マウス(Violet5μM;Violethi)の脾細胞をCellTrace Violetで染色した。ViolethiおよびVioletlo細胞の同数を後眼窩注射によって移植した。移植の24時間後に血液を収集し、フローサイトメトリーによって各集団のViolet強度を評価した。溶解%=[1−(標的細胞/対照細胞)/(B2m−/−における標的細胞/対照細胞)]×100。
MCMV曝露
前述したように(32)、腹腔内注射によってマウスにMCMV(Smith株;1.5×105pfu/体重20g)を感染させた。ウイルス負荷を判定するために、MCMV曝露の5日後にマウスを安楽死させた。個々のマウスの脾臓から抽出された全DNAを使用して、MCMV前初期1(IE1)遺伝子および対照DNA配列(β−アクチン)のコピー数を測定した。ウイルス力価は、β−アクチンに対するMCMV IE1のコピー数比として表している。
前述したように(32)、腹腔内注射によってマウスにMCMV(Smith株;1.5×105pfu/体重20g)を感染させた。ウイルス負荷を判定するために、MCMV曝露の5日後にマウスを安楽死させた。個々のマウスの脾臓から抽出された全DNAを使用して、MCMV前初期1(IE1)遺伝子および対照DNA配列(β−アクチン)のコピー数を測定した。ウイルス力価は、β−アクチンに対するMCMV IE1のコピー数比として表している。
in vivoにおけるT細胞活性化
脾臓CD45.2+OT−IおよびLmbr1−/−;OT−I T細胞は、EasySep(商標)マウスCD8+T細胞単離キット(StemCell Technologies)を使用して精製した。フローサイトメトリーによって試験したところ、純度は全実験において95%を上回っていた。細胞はCellTrace Far Red(CD45.2+OT−I)5μMまたはCellTrace Violet(Lmbr1−/−;OT−I)5μMで標識し、染色した細胞の同数(2×106)を後眼窩経路によって野生型CD45.1マウスに注射した。翌日、レシピエントにPBS200μlに溶かした可溶性OVA100μgまたは対照として滅菌PBS200μlのいずれかを注射した。抗原(OVA)特異的T細胞活性化は、48時間および72時間後の分裂中のOT−I細胞のFar RedまたはViolet強度に基づいて分析した。
脾臓CD45.2+OT−IおよびLmbr1−/−;OT−I T細胞は、EasySep(商標)マウスCD8+T細胞単離キット(StemCell Technologies)を使用して精製した。フローサイトメトリーによって試験したところ、純度は全実験において95%を上回っていた。細胞はCellTrace Far Red(CD45.2+OT−I)5μMまたはCellTrace Violet(Lmbr1−/−;OT−I)5μMで標識し、染色した細胞の同数(2×106)を後眼窩経路によって野生型CD45.1マウスに注射した。翌日、レシピエントにPBS200μlに溶かした可溶性OVA100μgまたは対照として滅菌PBS200μlのいずれかを注射した。抗原(OVA)特異的T細胞活性化は、48時間および72時間後の分裂中のOT−I細胞のFar RedまたはViolet強度に基づいて分析した。
恒常性増殖シグナルに応答したT細胞の増殖能を評価するために、それぞれビオチン化抗CD24mAb M1/69(eBioscience)を使用したEasySep(商標)マウス汎T細胞単離キット(StemCell Technologies)またはDynalネガティブ選択を使用することによって、脾臓汎T細胞または成熟SP胸腺細胞(CD24−)を単離した。Lmbr1l−/−、Lmbr1lst/stまたは野生型同腹仔から単離した汎Tまたは成熟CD24−胸腺細胞は、それぞれ5μMのCellTraceVioletまたはCellTraceFarRedで染色した。標識されたLmbr1l−/−または野生型細胞の1:1または10:1混合物を、6時間前に致死量以下で照射された(8Gy)C45.1+マウスまたは照射されていない対照に移植した。養子移植の4または7日後に、脾細胞を調製し、表面をCD45.1、CD45.2について、CD3、CD4およびCD8と一緒に染色し、その後フローサイトメトリーによってFar RedまたはViolet色素の希釈を分析した。
アポトーシスの検出
アネキシンV/PI標識および検出は、FITC−アネキシンVアポトーシス検出キットI(BD Bioscience)を使用して、製造業者の指示に従って実行した。
アネキシンV/PI標識および検出は、FITC−アネキシンVアポトーシス検出キットI(BD Bioscience)を使用して、製造業者の指示に従って実行した。
質量分析
以下に記載したように、Lmbr1l相互作用タンパク質を同定するために共免疫沈降法および質量分析を実行した。トランスフェクションは、HEK293T細胞(ATCC)において、リポフェクタミン2000試薬(Life Technologies)を使用して、Flagタグ化ヒトLmbr1lまたは空のベクター対照をコードするプラスミドを用いて実行した。トランスフェクションの48時間後、細胞をNP−40溶解緩衝液中に4℃で45分間採取した。免疫沈降は、抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)を使用して4℃で2時間実行し、ビーズはNP−40溶解緩衝液で6回洗浄した。タンパク質は、SDS試料緩衝液で溶出し、95℃で10分間加熱した。溶解物を12%(wt/vol)SDS−PAGEゲルに添加し、分離ゲルに約1cm泳動させた。ゲルをクーマシーブルー(Thermo Fisher)で染色し、染色した列全てについて前述したように(33)質量分析(LC−MS/MS)を行った。
以下に記載したように、Lmbr1l相互作用タンパク質を同定するために共免疫沈降法および質量分析を実行した。トランスフェクションは、HEK293T細胞(ATCC)において、リポフェクタミン2000試薬(Life Technologies)を使用して、Flagタグ化ヒトLmbr1lまたは空のベクター対照をコードするプラスミドを用いて実行した。トランスフェクションの48時間後、細胞をNP−40溶解緩衝液中に4℃で45分間採取した。免疫沈降は、抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)を使用して4℃で2時間実行し、ビーズはNP−40溶解緩衝液で6回洗浄した。タンパク質は、SDS試料緩衝液で溶出し、95℃で10分間加熱した。溶解物を12%(wt/vol)SDS−PAGEゲルに添加し、分離ゲルに約1cm泳動させた。ゲルをクーマシーブルー(Thermo Fisher)で染色し、染色した列全てについて前述したように(33)質量分析(LC−MS/MS)を行った。
タンパク質アレイ
ProtoArrayヒトタンパク質マイクロアレイV5.1(Invitrogen)を使用して、製造業者の指示に従って、ヒトLmbr1l相互作用タンパク質を同定した。簡潔には、Flag(N末端)およびV5(C末端)タグ化組換えヒトLmbr1lタンパク質をトランスフェクションによってHEK293T細胞で発現させ、抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)で精製した。タンパク質におけるFlagおよびV5タグの存在は、標準的なイムノブロットによって確認した。
ProtoArrayヒトタンパク質マイクロアレイV5.1(Invitrogen)を使用して、製造業者の指示に従って、ヒトLmbr1l相互作用タンパク質を同定した。簡潔には、Flag(N末端)およびV5(C末端)タグ化組換えヒトLmbr1lタンパク質をトランスフェクションによってHEK293T細胞で発現させ、抗FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)で精製した。タンパク質におけるFlagおよびV5タグの存在は、標準的なイムノブロットによって確認した。
精製した組換えFlag−ヒトLMBR1L−V5を最終濃度50μg/mlで使用して、ヒトV5.1ProtoArray(Invitrogen)をプロービングした。アレイの組換えタンパク質の結合は、Protoarrayブロッキング緩衝液(Invitrogen)で1:1,000に希釈したストレプトアビジンAlexaFluor647を用いて検出した。アレイは、GeneArray4000Bスキャナー(Molecular Devices)を使用して635nmでスキャンした。結果は複数のTIFFファイルとして保存し、Genepix Prospectorソフトウェア、バージョン7を使用して分析した。
形質膜または小胞体の単離
形質膜または小胞体のタンパク質は、Pierce細胞表面タンパク質単離キット(Thermo Fisher)または小胞体濃縮抽出キット(Novus Biologicals)をそれぞれ使用して、製造業者の指示に従って単離した。
形質膜または小胞体のタンパク質は、Pierce細胞表面タンパク質単離キット(Thermo Fisher)または小胞体濃縮抽出キット(Novus Biologicals)をそれぞれ使用して、製造業者の指示に従って単離した。
統計学的解析
群間の差の統計学的有意差は、GraphPad Prismを使用して示した統計学的検定を実行することによって解析した。群間の生値における差は、P<0.05のとき統計学的に有意と見なした。P値は、*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001によって示され;NSはP>0.05で有意差無しである。
群間の差の統計学的有意差は、GraphPad Prismを使用して示した統計学的検定を実行することによって解析した。群間の生値における差は、P<0.05のとき統計学的に有意と見なした。P値は、*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001によって示され;NSはP>0.05で有意差無しである。
参考文献:
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18. P. Wojnar, M. Lechner, B. Redl, Antisense down-regulation of lipocalin-interacting membrane receptor expression inhibits cellular internalization of lipocalin-1 in human NT2 cells. J Biol Chem 278, 16209-16215 (2003).
19. M. Fluckinger, P. Merschak, M. Hermann, T. Haertle, B. Redl, Lipocalin-interacting-membrane-receptor (LIMR) mediates cellular internalization of beta-lactoglobulin. Biochim Biophys Acta 1778, 342-347 (2008).
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25. S. J. Lloyd, S. Raychaudhuri, P. J. Espenshade, Subunit architecture of the Golgi Dsc E3 ligase required for sterol regulatory element-binding protein (SREBP) cleavage in fission yeast. J Biol Chem 288, 21043-21054 (2013).
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27. P. Georgel, X. Du, K. Hoebe, B. Beutler, ENU mutagenesis in mice. Methods Mol Biol 415, 1-16 (2008).
28. A. S. Hidmark et al., Humoral responses against coimmunized protein antigen but not against alphavirus-encoded antigens require alpha/beta interferon signaling. J Virol 80, 7100-7110 (2006).
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32. K. Crozat et al., Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm Genome 17, 398-406 (2006).
33. Z. Zhang et al., Insulin resistance and diabetes caused by genetic or diet-induced KBTBD2 deficiency in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 113, E6418-E6426 (2016).
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18. P. Wojnar, M. Lechner, B. Redl, Antisense down-regulation of lipocalin-interacting membrane receptor expression inhibits cellular internalization of lipocalin-1 in human NT2 cells. J Biol Chem 278, 16209-16215 (2003).
19. M. Fluckinger, P. Merschak, M. Hermann, T. Haertle, B. Redl, Lipocalin-interacting-membrane-receptor (LIMR) mediates cellular internalization of beta-lactoglobulin. Biochim Biophys Acta 1778, 342-347 (2008).
20. Z. Zhang et al., Interaction of uteroglobin with lipocalin-1 receptor suppresses cancer cell motility and invasion. Gene 369, 66-71 (2006).
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22. V. S. Li et al., Wnt signaling through inhibition of beta-catenin degradation in an intact Axin1 complex. Cell 149, 1245-1256 (2012).
23. J. Seoane, H. V. Le, J. Massague, Myc suppression of the p21(Cip1) Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage. Nature 419, 729-734 (2002).
24. A. L. Haber et al., A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature 551, 333-339 (2017).
25. S. J. Lloyd, S. Raychaudhuri, P. J. Espenshade, Subunit architecture of the Golgi Dsc E3 ligase required for sterol regulatory element-binding protein (SREBP) cleavage in fission yeast. J Biol Chem 288, 21043-21054 (2013).
26. X. Zeng et al., A dual-kinase mechanism for Wnt co-receptor phosphorylation and activation. Nature 438, 873-877 (2005).
27. P. Georgel, X. Du, K. Hoebe, B. Beutler, ENU mutagenesis in mice. Methods Mol Biol 415, 1-16 (2008).
28. A. S. Hidmark et al., Humoral responses against coimmunized protein antigen but not against alphavirus-encoded antigens require alpha/beta interferon signaling. J Virol 80, 7100-7110 (2006).
29. C. N. Arnold et al., A forward genetic screen reveals roles for Nfkbid, Zeb1, and Ruvbl2 in humoral immunity. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 12286-12293 (2012).
30. J. H. Choi et al., A single sublingual dose of an adenovirus-based vaccine protects against lethal Ebola challenge in mice and guinea pigs. Mol Pharm 9, 156-167 (2012).
31. M. Oukka, M. Cohen-Tannoudji, Y. Tanaka, C. Babinet, K. Kosmatopoulos, Medullary thymic epithelial cells induce tolerance to intracellular proteins. J Immunol 156, 968-975 (1996).
32. K. Crozat et al., Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm Genome 17, 398-406 (2006).
33. Z. Zhang et al., Insulin resistance and diabetes caused by genetic or diet-induced KBTBD2 deficiency in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 113, E6418-E6426 (2016).
[実施例2]
LMBR1Lモノクローナル抗体の生成
NCBIマウス(Mus musculus)(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/74775)Lmbr1lおよびヒト(Homo sapiens)(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55716)(図2)LMBR1Lに基づいて、ESTライブラリーは、3個(NP_083374.1、XP_011244060.1およびXP_017172262.1)および15個(NP_060583.2、NP_001287679.1、NP_001287680.1、NP_001339090.1、NP_001339091.1、NP_001339092.1、NP_001339093.1、NP_001339094.1、NP_001339096.1、XP_016875117、XP_016875118、XP_016875116、XP_016875115、XP_016875120およびXP_011536866)の断片はそれぞれ代替スプライシング翻訳物として予測されると判定した。ヒトNP_060583.2およびマウスNP_083374.1はカノニカルLMBR1Lタンパク質として、9個の膜貫通ドメインを有する489残基の長さである。ヒトLMBR1Lタンパク質は、マウスLMBR1Lタンパク質と97%同一性を有する(図20)。図1Bでは、カノニカルヒトLMBR1Lの5個の細胞外ドメインに印をつけた。この分析に基づくと、LMBR1L抗体などの抗ヒトLMBR1L阻害剤の候補である5個の標的化可能な細胞外ペプチド配列が存在する。
LMBR1Lモノクローナル抗体の生成
NCBIマウス(Mus musculus)(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/74775)Lmbr1lおよびヒト(Homo sapiens)(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55716)(図2)LMBR1Lに基づいて、ESTライブラリーは、3個(NP_083374.1、XP_011244060.1およびXP_017172262.1)および15個(NP_060583.2、NP_001287679.1、NP_001287680.1、NP_001339090.1、NP_001339091.1、NP_001339092.1、NP_001339093.1、NP_001339094.1、NP_001339096.1、XP_016875117、XP_016875118、XP_016875116、XP_016875115、XP_016875120およびXP_011536866)の断片はそれぞれ代替スプライシング翻訳物として予測されると判定した。ヒトNP_060583.2およびマウスNP_083374.1はカノニカルLMBR1Lタンパク質として、9個の膜貫通ドメインを有する489残基の長さである。ヒトLMBR1Lタンパク質は、マウスLMBR1Lタンパク質と97%同一性を有する(図20)。図1Bでは、カノニカルヒトLMBR1Lの5個の細胞外ドメインに印をつけた。この分析に基づくと、LMBR1L抗体などの抗ヒトLMBR1L阻害剤の候補である5個の標的化可能な細胞外ペプチド配列が存在する。
5個の細胞外ドメイン(それぞれアミノ酸1〜21、88〜114、176〜196、327〜350および410〜431、図1Bを参照のこと)のいずれか1つまたは複数の一部は、完全長とは対照的に、免疫源として使用することもできる。当技術分野で知られている様々な方法および本明細書で開示した方法を使用して、モノクローナル、完全ヒトまたはヒト化抗LMBR1L抗体を生成することができる。例えば、前述のように、完全ヒトLMBR1L抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから産生することができる。ヒト化抗LMBR1L抗体は、ハイブリドーマから得られたヒト化モノクローナル抗体によって調製することができる。
アプローチ例には、以下を含めることができる。
1.LMBR1Lタンパク質の細胞外ループと反応する結合抗体を同定するためにファージディスプレイを使用して、リポソームでタンパク質を発現させることによってディスプレイすること。
2.このような結合抗体を発見したら、ヒトリンパ球細胞を使用してLMBR1L活性の阻害を再スクリーニングすること。抗体を添加した後で核β−カテニンおよび細胞内のc−Mycの上昇を測定することによって、活性の阻害を検出する。
3.抗体FabまたはIgG分子を産生するために親和性および操作を最適化すること。
1.LMBR1Lタンパク質の細胞外ループと反応する結合抗体を同定するためにファージディスプレイを使用して、リポソームでタンパク質を発現させることによってディスプレイすること。
2.このような結合抗体を発見したら、ヒトリンパ球細胞を使用してLMBR1L活性の阻害を再スクリーニングすること。抗体を添加した後で核β−カテニンおよび細胞内のc−Mycの上昇を測定することによって、活性の阻害を検出する。
3.抗体FabまたはIgG分子を産生するために親和性および操作を最適化すること。
LMBR1Lタンパク質は、ヒトおよびマウスの間で強く保存されている(図20)。ファージディスプレイを使用すると、両種と反応する試薬を生成しやすく、前臨床および臨床試験に有用である。
別の実施例では、アフィニティクロマトグラフィによる精製に好適なC末端Hisタグを免疫原に付加することができる。精製したタンパク質は、好適なアジュバントと一緒にマウスに接種することができる。ハイブリドーマで産生されたモノクローナル抗体は、免疫原への結合を試験することでき、陽性結合剤は、前述のアッセイでヒトリンパ球細胞におけるβ−カテニン、FRIZZLED−6、ZNRF3および/またはc−Myc発現に影響を与える能力について(例えば、T細胞依存性およびT細胞非依存性抗体応答の減少、T細胞、B細胞、NK細胞およびNK T細胞の減少)スクリーニングすることができる。したがって、抗体は前臨床および臨床試験のためにヒト化することができる。
細胞表面分子として、LMBR1Lは抗体による阻害を利用しやすい。これによって変異の効果を模倣できることがかなり期待されるだろう。LMBR1Lの抗体阻害剤は、例えば、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、グレーブス病、糖尿病I型、多発性硬化症および関節リウマチを含む(ただしこれらに限定されない)自己免疫疾患を阻止するために使用することができよう。
核への活性β−カテニンの放出によってWnt受容体が解離すると、プログラム細胞死を介してT細胞、B細胞、NK細胞およびNK T細胞(それほど活性化されていない細胞)を含む活性化リンパ球細胞全ての急速な死をもたらすので、このような抗体の投与が疾患発症後に効果的であると期待することも合理的である。離乳年齢で観察されるホモ接合体の数が予想より少ないため、LMBR1Lには発達上の要件がいくつか存在する可能性があるが、免疫異常以外の成熟したホモ接合型ノックアウトマウスの異常は不明であり、Wntシグナル伝達経路のこの構成成分は、少なくとも発達後はおそらくその作用は免疫特異的であることが示唆される。LMBR1Lに対する抗体は、シクロホスファミドなどの化学的細胞減少試薬または抗リンパ球グロブリンなどの抗体よりも選択性が高いだろう。
その他の実施形態
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせで、または前述の実施形態で具体的に論じられていない様々な配置で使用することができ、したがって、その適用において、前記の説明で記載されている、または図面に示されている構成成分の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態で記載された態様は、その他の実施形態で記載された態様とどのような方法によっても組み合わせることができる。
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせで、または前述の実施形態で具体的に論じられていない様々な配置で使用することができ、したがって、その適用において、前記の説明で記載されている、または図面に示されている構成成分の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態で記載された態様は、その他の実施形態で記載された態様とどのような方法によっても組み合わせることができる。
本開示の具体的な実施形態が論じられているが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書を検討することによって当業者には本開示には多くの変更が明らかになるであろう。開示の全範囲は、同等物の全範囲とともにクレームを、そのような変更とともに明細書を参照することにより決定するべきである。
引用による組み込み
本明細書で参照されている刊行物、特許および特許出願全ては、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりそのように組み込まれることが具体的に示された場合と同じ程度に、全目的のためにその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本明細書で参照されている刊行物、特許および特許出願全ては、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりそのように組み込まれることが具体的に示された場合と同じ程度に、全目的のためにその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
Claims (12)
- 過剰または過活動免疫系に関連する状態の処置における使用のためのリム領域1様(LMBR1L)のアンタゴニストであって、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、リム領域1様(LMBR1L)のアンタゴニスト。
- 過剰または過活動免疫系に関連する状態の処置において有用なアンタゴニストを同定する方法であって、試験化合物のLMBR1Lへの結合を判定すること、およびLMBR1Lの活性が対照と比較して前記試験化合物によって低減されることを判定することを含み、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、方法。
- LMBR1Lアンタゴニストを用いた処置に好適である、過剰または過活動免疫系に関連する状態を有する個体を同定する方法であって、個体から得た試料中のLMBR1Lの活性または量を決定することを含み、対照と比較した活性または量の増加が、前記個体がLMBR1Lアンタゴニストを用いた処置に好適であることを示し、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、方法。
- それを必要とする対象においてリム領域1様(LMBR1L)を阻害し、それにより免疫応答を抑制することを含む、免疫抑制療法を提供する方法。
- 前記阻害することが、前記対象におけるリンパ球系共通前駆細胞および/またはリンパ球の数を低減することを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記リンパ球が、T細胞、B細胞、NKおよびNK T細胞の1つまたは複数を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記対象が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス(SLE)、橋本甲状腺炎、グレーブス病、I型糖尿病、多発性硬化症および/または関節リウマチである、請求項7に記載の方法。
- LMBR1L阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含み、前記LMBR1L阻害剤がLMBR1L、好ましくはLMBR1Lの細胞外ドメインに結合する、請求項4に記載の方法。
- それを必要とする対象へのLMBR1Lをコードする核酸を含む、免疫不全障害を処置するための組成物。
- それを必要とする対象にLMBR1Lをコードする核酸を導入することを含む、免疫不全障害を処置するための方法。
- LMBR1Lアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む、過剰または過活動免疫系に関連する状態を有する前記対象においてリンパ球新生を低減する方法。
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