JP2021527407A - 全般的アミロイド相互作用モチーフ（ｇａｉｍ） - Google Patents

全般的アミロイド相互作用モチーフ（ｇａｉｍ） Download PDF

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Abstract

本発明は、バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）の全般的アミロイド相互作用モチーフ（ＧＡＩＭ）のバリアントおよびその融合タンパク質に関する。本発明のＧＡＩＭバリアントおよび融合タンパク質は、部分的または完全に脱免疫されており、多種多様なアミロイドタンパク質に対して優れた結合および特異性を実証し、アミロイドリモデリングの増強およびアミロイド凝集の阻害を示す。本発明はさらに、核酸、ベクター、宿主細胞、ならびにＧＡＩＭバリアントおよびその融合タンパク質を作製する方法にも関する。本発明はまた、医薬組成物およびバクテリオファージの感染性を増加させる方法、アミロイド凝集体を検出する方法、ならびに誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患を診断および／または処置する方法にも関する。

Description

本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／６８５，７５７号、および２０１８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／７４９，４９９号の優先権を主張する。
本発明は、部分的または完全に脱免疫され、先行技術と比較して優れた効力、優れた構造安定性、およびアミロイドタンパク質に対して増加した結合特異性を実証するような、繊維状バクテリオファージ遺伝子３タンパク質（「ｇ３ｐ」、「ｐ３」または「ｐＩＩＩ」としても知られる）の全般的アミロイド相互作用モチーフ（ＧＡＩＭ）のバリアントを含むポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドをコードする核酸分子および構築物、そのような核酸分子によって形質転換された宿主細胞、ならびにそのようなポリペプチドを組換えによって作製する方法が包含される。加えて、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む診断用組成物および医薬組成物、アミロイド凝集体を検出するためおよび／または誤って折り畳まれたおよび／もしくは凝集したタンパク質に関連する疾患を診断するための診断用組成物の使用、ならびにアミロイド量を減少させるため、凝集を防止するため、アミロイドを脱凝集するため、またはその他の形で誤って折り畳まれたおよび／もしくは凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患、例えば全身性および末梢性のアミロイド疾患、神経変性性タウオパチーを含む神経変性疾患、および伝染性海綿状脳症（プリオン関連疾患）を処置もしくは防止するための医薬組成物の治療的および／または予防的使用に関する。本発明のポリペプチドは、融合タンパク質およびそのアミロイド結合部分を含む。
バクテリオファージｇ３ｐは、アミロイド線維に直接結合し、バクテリオファージ媒介性のアミロイド脱凝集（例えば、リモデリング）は、この最初の結合ステップに依存する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０８２１１４Ａ１を参照されたい。本発明者らは以前に、アミロイド結合、アミロイド脱凝集、および／またはアミロイド凝集体の形成の防止にとって必要なｇ３ｐの最小配列を同定した。同書。この最小配列は、ｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメインを含む全般的アミロイド相互作用モチーフ（ＧＡＩＭ）によって包含され、アミロイドタンパク質に結合することおよび／またはアミロイドタンパク質を脱凝集することが可能であるｇ３ｐポリペプチド（その変異体、断片、融合タンパク質、またはその医薬組成物を含む）の生成をもたらす。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、同書；ＷＯ２０１４／０５５５１５Ａ１号を参照されたい。ＷＯ２０１３／０８２１１４Ａ１およびＷＯ２０１４／０５５５１５Ａ１に開示されるｇ３ｐポリペプチドは、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患の防止または処置にとって有効である。同書。しかし、これらのｇ３ｐポリペプチドはまた、患者において望ましくない免疫応答を誘発し得るヒトＴ細胞エピトープも含む。したがって、天然のｇ３ｐに存在する５つのＴ細胞エピトープのうち最大４つを除去する変異を含む、部分的に脱免疫されたｇ３ｐポリペプチドを開発した。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１９３９３５Ａ１を参照されたい。
さらに、アミロイドに結合し、アミロイド関連疾患または状態の検出、診断、防止、または処置にとって有用であるｇ３ｐポリペプチドを動物細胞において組換えによって産生することは、潜在的Ｎグリコシル化部位が存在するために制限された。このように、潜在的Ｎグリコシル化部位が１つまたは複数の変異によって除去された、部分的に脱免疫されたｇ３ｐポリペプチドを含む改善されたｇ３ｐポリペプチドが生成された。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０９００２２Ａ８を参照されたい。
これらの進歩にもかかわらず、より安定、強力、および特異的であり、ならびに完全またはほぼ完全に脱免疫されたｇ３ｐポリペプチドが当技術分野でなおも必要である。
国際公開第２０１３／０８２１１４号 国際公開第２０１４／０５５５１５号 国際公開第２０１４／１９３９３５号 国際公開第２０１６／０９００２２号
これら一連の治療的品質を有するポリペプチドを生成することは、少なくとも部分的にｇ３ｐポリペプチドにおけるある特定の逆相関のため、これまで重大な課題をもたらしてきた。第１に、ｇ３ｐポリペプチドの完全な脱免疫にとって必要であるＴ細胞エピトープ２を除去する本発明者らのこれまでの試みは、一貫してアミロイド結合能の低減をもたらした。第２に、ＧＡＩＭのＮ１−Ｎ２ドメインの安定性を増加させる本発明者らのこれまでの試みもまた、一貫してアミロイド結合活性の低減を引き起こした。例えば、超安定化ＧＡＩＭバリアントであるＰＢ１１３は、不良なアミロイド結合能を示す。第３に、Ｎ２ドメインの不安定性により、可溶性タンパク質様の非アミロイド基質、粘着性のモルテングロビュール構造および非アミロイド線維性ポリマー、例えばコラーゲンおよびエラスチンとの無差別な相互作用が駆動される。このように、アミロイド結合活性を増加させるためにＮ２を脱安定化すれば特異性が犠牲となり、オフターゲット結合を回避するためにＮ２を安定化すればアミロイドに対する結合が犠牲となる。意外にも、ＧＡＩＭバリアントおよびその融合体を含む融合タンパク質を「オープン安定化（open-stabilized）」コンフォメーションで生成することによって、３つ全ての逆相関が克服された。
先行技術とは異なり、本明細書に記載されるオープン安定化ポリペプチドは、タンパク質の安定性および結合特異性を維持しながら多様なアミロイドに対して強力なアミロイド結合活性およびリモデリング活性を実証している。このように、一部の態様では、本発明は、少なくとも部分的に脱免疫され、優れたアミロイド結合活性、アミロイド結合特異性、およびアミロイドリモデリング活性を有する、ＧＡＩＭのオープン安定化バリアント（ＧＡＩＭ）、ＧＡＩＭ−免疫グロブリン（ＧＡＩＭ−Ｉｇ）融合タンパク質、またはその医薬組成物に関する。一部の態様では、これらのオープン安定化ＧＡＩＭバリアント、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質、またはその医薬組成物は、強力かつ特異的なアミロイド結合を犠牲にすることなく、構造安定性を犠牲にすることなく完全に脱免疫される。本明細書に記載されるオープン安定化ＧＡＩＭバリアントおよびＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、脳および末梢臓器におけるアミロイドに会合して（engaging）除去することが可能であり、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患を検出、診断、防止、発症を遅らせる、および／または処置する優れた能力を有する新規ポリペプチドセットを構成する。
本発明の追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から明白であるか、または本発明の実践によって学習することができる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘した要素および組合せによって実現および達成される。前述の一般的説明および以下の詳細な説明はいずれも例示的で単なる説明に過ぎず、特許請求される本発明を制限しないと理解される。
図１Ａは、ＧＡＩＭ Ｎ１およびＮ２ドメインの三次構造（ＰＤＢ構造２Ｇ３Ｐを使用して示される）のグラフ表示である。部位特異的変異誘発に付されたβ鎖は、濃灰色で示されている。矢印は、Ｎ１中の極性残基およびＮ２中の疎水性残基の位置を示す。図１Ｂは、本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のグラフ表示である。図１Ｃは、ＧＡＩＭ二量体のグラフ表示である。
図２は、ｆＡβ４２中のＧＡＩＭ−相互作用配列を示す水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換試験の結果を表す図である。
図３Ａは、ｆｄファージに由来するｇ３ｐのＮ１部分のアミノ酸配列の対応する部分（配列番号１）およびＩＦ１ファージに由来するｇ３ｐの対応するＮ１部分を比較する図である（配列番号２）。白抜き四角は、上部に、ＰＢ１０６のアミノ酸２３〜２８（ＤＤＫＴＬＤ；配列番号３）およびＧＡＩＭ足場ＰＢ１２０（ＰＢ１０６に由来する）、下部に、本発明のオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体中に存在するＥＧＤＳ（配列番号４）置換（ＥＧＤＳ＝配列番号４）を表す。図３Ｂは、ＧＡＩＭ Ｎ１およびＮ２ドメインの三次構造のグラフ表示である（ＰＤＢ構造２Ｇ３Ｐを使用して示される）。図３Ｂ中の白抜き四角は、ｆｄ ｇ３ｐ中の配列番号３の位置を示す。図３Ｃは、Ｎ２ドメインの安定化に関係している３つの緩慢折り畳みループ（「ターン」とも呼ばれる）のグラフ表示である。Ｔ１＝ターン１（ＦＱＮＮ；配列番号５）；Ｔ２＝ターン２（ＲＱＧＡ；配列番号６）；Ｔ３＝ターン３（ＱＧＴＤＰＶＫ；配列番号７）。以下で実証されるように、変異誘発によってＴ１、Ｔ２またはＴ３のうち１つまたはそれより多くを除去することは、Ｎ２ドメインを安定化する。図３Ｄは、Ｔ５０の選択アミノ酸置換に基づく結合および安定性の変化を表す図である。 同上。 同上。 同上。
図４Ａおよび４Ｂは、ＧＡＩＭ二量体または単量体と比較したＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の熱融解実験から得た代表的なデータを示す図である。熱融解は、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ結合によってモニターした。第１の転移、Ｔｍ１は、正規化蛍光強度からの非線形フィッティングによって算出した。 同上。
図５Ａおよび５Ｂは、２９５ｎｍ（図５Ａ）および２８０ｎｍ（図５Ｂ）で励起された、０Ｍグアニジン塩酸（ＧｕＨＣｌ）（破線）、２Ｍ ＧｕＨＣｌ（実線）および５Ｍ ＧｕＨＣｌ（点線）でのＧＡＩＭの蛍光発光スペクトルを表す図である。図５Ｃは、ＧｕＨＣｌによるＧＡＩＭ二量体の平衡アンフォールディングを表す図である。図５Ｃは、２つの転移、１Ｍと２Ｍ ＧｕＨＣｌの間の第１の転移および２Ｍと４Ｍ ＧｕＨＣｌの間の第２の転移を表す図である。３４０ｎｍ（励起２８０ｎｍ）での相対蛍光強度を、種々の濃度のＧｕＨＣｌでプロットした。図５Ｄは、１．５Ｍ ＧｕＨＣｌでのＮ２ドメインアンフォールディングを表す図である。図５Ｅは、２．６Ｍ ＧｕＨＣｌでのＮ１ドメインアンフォールディングを表す図である。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａおよび６Ｂは、アミロイド結合をモジュレートするＧＡＩＭ残基のマッピングを表す図である。図６Ａは、Ｔｍ１と相関するＧＡＩＭバリアントのＡβ４２線維結合力を示す散布図である（スピアマン相関係数＝０．７０３、ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、Ｔｍ１と相関するＧＡＩＭバリアントのｆタウ線維結合力（ftau fiber-binding potency）を示す散布図である（スピアマン相関係数＝０．８７８、ｐ＜０．０００１）。ｆタウ結合が不十分なバリアントには、ＥＬＩＳＡにおいて飽和に到達しないバリアントについての曲線のあてはめにおける不正確性のため、ＥＣ５０＝１０００ｎＭが与えられている。図６Ａおよび図６Ｂの両方について、ＧＡＩＭ足場ＰＢ１２０は、灰色三角によって表され、バリアントは、丸によって表されている。Ｔｍ１の低下は、ＧＡＩＭのよりオープンなコンフォメーションを示し、結果として、結合が増加するのに対し、より高いＴｍ１を有する安定化されたバリアントは、結合活性を失う傾向がある。 同上。
図７Ａおよび７Ｂは、選択ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のアミロイド結合を示す図である。図７Ａは、ＧＡＩＭ足場（黒丸）およびその安定化バリアントのアミロイド結合を比較する。ＦＱＧＮ、ＶＮＧＶおよびＱＧＧＫは、それぞれ、配列番号８〜１０である。図７Ｂは、オープン安定化（超安定化ではない）ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質の優れた結合を示す。オープン安定化ポリペプチド（右端に示される、超安定化ポリペプチドＰＢ１１３以外）が、白抜き四角内に示されている。 同上。
図８Ａ〜８Ｄは、代表的なオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の、種々のＡβ線維への結合（丸）を、対照足場の、それらのＡβ線維への結合（四角）と比較して示す図である。図８Ａは、Ａβ３−４２−Ｐｙｒｏ線維への結合を示し；図８Ｂは、Ａβ１−４２ Ｅ２２Ｑ線維への結合を示し；図８Ｃは、Ａβ１１−４２線維への結合を示し；図８Ｄは、Ａβ１１−４２−Ｐｙｒｏ線維への結合を示す。これらの実験に使用される凝集体は、長い無分岐線維（Ａβ１−４２ Ｅ２２Ｑ線維）から高度にジグザグ状のコンフォーマー（Ａβ３−４２−Ｐｙｒｏ線維）まで極めて多様な形態を示す。Ｐｙｒｏ＝ピログルタミン酸。 同上。 同上。 同上。
図９は、コラーゲンへのオフターゲット結合に対するＮ２安定化変異の効果を示す図である。ＦＱＧＮ＝配列番号８、ＶＮＧＶ＝配列番号９、ＱＧＧＫ＝配列番号１０。
図１０Ａ〜１０Ｄは、Ａβ４２線維と共にインキュベートされた、種々のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のリモデリング効率を取り扱う図である。図１０Ａは、６Ｅ１０ ＭＡｂによって達成されたリモデリングとの比較をさらに示す。丸＝平均；バー＝標準偏差。図１０Ｂは、Ａβ４２結合と、種々のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質によるリモデリングの間の相関をさらに実証する。オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ−融合体は、濃灰色の逆三角形によって表される。ＧＡＩＭ足場は、薄灰色の上向き三角形によって表される。丸は、他の試験されたＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を表す。図１０Ｃは、ＧＡＩＭ足場のリモデリング効率（三角）または線維単独（四角）に対して、代表的なオープン安定化ポリペプチド（丸）のリモデリング効率を比較する。バー＝標準偏差。より大きなリモデリング効率は、尿素における線維のより大きな溶解（例えば、より低いＴｈＴ蛍光）によって実証される。図１０Ｄは、３７℃で６日間の０．８μＭ ＰＢ１０８とのインキュベーションの前（左）および後（右）のＡβ４２線維を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。 同上。 同上。 同上。
図１１Ａ〜１１Ｃは、タウ線維と共にインキュベートされた種々のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のリモデリング効率を取り扱う図である。図１１Ａは、代表的なオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質ＰＢ１０８および超安定化融合タンパク質ＰＢ１１３のリモデリング効率を比較する。リモデリングは、処置された凝集体のタウＫＬ単量体および二量体の存在によって（中間のパネル）示される。図１１Ｂは、異なる濃度の融合タンパク質での、２つの代表的なオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質およびＧＡＩＭ足場のリモデリング効率を比較する。エラーバーは、３つの独立実験から得た標準偏差を表す。図１１Ｃは、３７℃で３日間の１００ｎＭ ＰＢ１０８とのインキュベーションの前（左）および後（右）のタウＫＬ線維を示すＴＥＭ画像を示す図である。 同上。 同上。
図１２Ａ〜１２Ｄは、本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質によるアミロイド集合の阻害を表す図である。エラーバーは、３つまたはそれより多い独立実験から得た標準偏差を表す。図１２Ａは、Ａβ４２線維集合の濃度依存性阻害を示す。ＰＢ１２０（対照足場）は、丸によって、ＰＢ１０８は、四角によって、ＰＢ１１６は、三角によって表される。図１２Ｂは、２５０ｎＭのＧＡＩＭ融合体でのＡβ４２線維集合の阻害を比較する。図１２Ｃは、タウＫＬ線維集合の濃度依存性阻害を示す。ＰＢ１２０（対照足場）は丸によって、ＰＢ１０８は四角によって、ＰＢ１１６は三角によって表される。図１２Ｄは、２５０ｎＭのＧＡＩＭ融合体でのタウＫＬ線維集合の阻害を比較する。 同上。 同上。 同上。
配列の簡単な説明
配列番号１＝ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮ
配列番号２＝ＡＴＴＤＡＥＣＬＳＫＰＡＦＤＧＴＬＳＮＶＷＫＥＧＤＳＲＹＡＮ
配列番号３＝ＤＤＫＴＬＤ；配列番号４＝ＥＧＤＳ
配列番号５＝ＦＱＮＮ；配列番号６＝ＲＱＧＡ；配列番号７＝ＱＧＴＤＰＶＫ；配列番号８＝ＦＱＧＮ；配列番号９＝ＶＮＧＶ；配列番号１０＝ＱＧＧＫ
配列番号１１＝
Figure 2021527407
配列番号１２＝
Figure 2021527407
配列番号１３＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号１４＝
Figure 2021527407
配列番号１５＝
Figure 2021527407
配列番号１６＝
Figure 2021527407
配列番号１７＝
Figure 2021527407
配列番号１８＝
Figure 2021527407
配列番号１９＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号２０＝
Figure 2021527407
配列番号２１＝
Figure 2021527407
配列番号２２＝
Figure 2021527407
配列番号２３＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号２４＝
Figure 2021527407
配列番号２５＝
Figure 2021527407
配列番号２６＝
Figure 2021527407
配列番号２７＝ＧＧＧＧＳ；配列番号２８＝ＧＧＧＳ
配列番号２９＝
Figure 2021527407
配列番号３０＝
Figure 2021527407
配列番号３１＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号３２＝
Figure 2021527407
配列番号３３＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号３４＝
Figure 2021527407
配列番号３５＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号３６＝
Figure 2021527407
配列番号３７＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号３８＝
Figure 2021527407
配列番号３９＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４０＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４１＝
Figure 2021527407
配列番号４２＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４３＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４４＝
Figure 2021527407
配列番号４５＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４６＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４７＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４８＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号４９＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号５０＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号５１＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号５２＝
Figure 2021527407
Figure 2021527407
配列番号５３＝ＨＨＨＨＨＨ；配列番号５４＝ＥＤＧＳ
定義
本明細書で使用される用語は、一般的に当技術分野で、本発明の文脈内で、および各用語が使用される特定の文脈においてその通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらを作製および使用する方法の記載にあたって追加の指針を実践者に提供するために、ある特定の用語を以下にまたは本明細書の他所で考察する。冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。用語「または」は、本文が明白に示していない限り、用語「および／または」を意味し、それらと互換的に使用される。本出願では、単数形の使用は、具体的にそうでないと述べていない限り、複数形を含む。さらに、用語「含む（comprising）」ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprised）」などの他の形態の使用も限定的ではない。本明細書に記載されるいかなる範囲も、エンドポイントおよびエンドポイント間の全ての値を含むと理解される。
用語「ｇ３ｐ」を、単独でまたは「ｇ３ｐ由来」または「ｇ３ｐ融合体」などの用語で使用する場合、アミロイドに対する結合能を保持しているｇ３ｐの断片、バリアント、および変異体を含む任意の野生型または組換え繊維状ファージｇ３ｐタンパク質を指す。これらの用語は、任意の特定の繊維状バクテリオファージｇ３ｐに限定されないと解釈すべきである。
用語「繊維状バクテリオファージ」、「バクテリオファージ」、および「ファージ」は、本明細書において互換的に使用され、野生型および組換え繊維状バクテリオファージの両方を含む。
本明細書で使用される場合、用語「野生型繊維状バクテリオファージ」は、自然界で見出される繊維状バクテリオファージ、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸配列データベースにおいて「野生型」として示されている繊維状バクテリオファージ、市販されており「野生型」として特徴付けられる繊維状バクテリオファージ、および継代の間に前述のいずれかと比較して非組換え変異を獲得した繊維状バクテリオファージを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」は、例えばポリペプチド鎖の部分で構成される独立してフォールディングされた構造を含む、いくつかの特有の物理的特色または特有の役割を有するポリペプチドまたはタンパク質の領域を意味する。ドメインは、ポリペプチドの特有の物理的特色の配列を含有してもよく、またはその結合特徴を保持する物理的特色の断片を含有し得る（例えば、第２のドメインに結合する能力を保持する）。ドメインは、別のドメインと会合してもよい。例えば、ｇ３ｐ Ｎ２ドメインは、Ｆ−ｐｉｌｉに結合し、ｇ３ｐ Ｎ１ドメインはＴｏｌＡに結合する。
本明細書で使用される場合、「全般的アミロイド相互作用モチーフ」または「ＧＡＩＭ」は、分子の内部表面を裏打ちする疎水性および極性残基の両方の組合せを使用してアミロイド結合を媒介する２ドメインポリペプチド（ｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメイン）を指す。ＧＡＩＭ単量体のＮ１およびＮ２ドメインは、芳香族アミノ酸の非対称分布を有する。ＧＡＩＭ Ｎ２ドメインは、１１個のチロシン（Ｔｙｒ）残基、および１つの露出したトリプトファン（Ｔｒｐ）残基を含有し；Ｎ１ドメインは、３個のＴｒｐおよび３個のＴｙｒ残基を含有する。Ｎ１およびＮ２ドメインは、逆馬蹄形コンフォメーション（inverted horseshoe conformation）をとり、水素結合の複雑なネットワークによってクローズドコンフォメーション（ロックされたコンフォメーション（locked conformation））で一緒に保持される（Weininger et al., 2009）。ドメイン間リンカーにおけるプロリンのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性体化は、水素結合の進行性切断および２つのドメインの部分的開口をもたらす。ＧＡＩＭのＮ１およびＮ２ドメインの「開口性の」再配列により、Ｎ１のβ鎖４および５（極性残基を含む）、ならびにＮ２のβ鎖９および１０（芳香族／疎水性残基を含む）が露出し、アミロイドに結合することが可能となる。図１Ａを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「対照足場」または「ＧＡＩＭ足場」は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質ＰＢ１２０に対応する。ＧＡＩＭ足場のＧＡＩＭ部分は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＰＢ１２０は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＰＢ１０６に由来する。ＰＢ１０６のＧＡＩＭ部分は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される場合、「ＰＢ１０６＋ＥＤＧＳ」（「ＥＤＧＳ」は配列番号５４として開示される）は、配列番号１５によって提供されるアミノ酸配列を有するオープンコンフォメーションのポリペプチドを表す。「ＰＢ１０６＋ＥＤＧＳ」（「ＥＤＧＳ」は配列番号５４として開示される）のＧＡＩＭ部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される場合、「超安定化」ＧＡＩＭまたはＧＡＩＭ融合体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体ＰＢ１１３を指す。ＰＢ１１３のＧＡＩＭ部分は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
用語「ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体」、「ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質」、および「ＧＡＩＭ融合体」は、本明細書において互換的に使用され、免疫グロブリン定常領域に直接または低分子リンカーによって接続されたｇ３ｐ ＧＡＩＭドメインを含むポリペプチドを指す。図１Ｂに示すように、本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のＦｃ領域が二量体化し、免疫グロブリン定常領域に直接または低分子リンカーによって結合した２コピーのＧＡＩＭを含む複合体をもたらす。本発明のＧＡＩＭ融合体は、シグナル配列をさらに含み得る。本発明は、任意の免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの免疫グロブリン定常領域とのＧＡＩＭ融合体を企図する。一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体である。一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、部分的または完全に脱免疫されている。
本明細書で使用される「ＧＡＩＭ二量体」は、本明細書に記載されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の２つのＧＡＩＭドメインを指す。ＧＡＩＭ二量体は、図１Ｃによってグラフ表示される。
用語「オープン安定化融合体」、「オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体」、「オープン安定化バリアント」、および「オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇバリアント」は、本明細書において互換的に使用され、融合体のＧＡＩＭ部分に少なくとも１つのオープンコンフォメーション変異および少なくとも１つの安定化変異を含むＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を指す。本明細書に記載されるオープン安定化バリアントのオープンコンフォメーション変異は、配列番号３（ＤＤＫＴＬＤ；配列番号１３および配列番号１５に関してアミノ酸２４〜２９）の、配列番号４（ＥＧＤＳ）での置換である。安定化変異は、例えば配列番号５（ＦＱＮＮ；配列番号１３に関してアミノ酸１３７〜１４０；配列番号１５に関してアミノ酸１３５〜１３８）の、配列番号８（ＦＱＧＮ）での置換、配列番号６（ＲＱＧＡ；配列番号１３に関してアミノ酸１４５〜１４８；配列番号１５に関してアミノ酸１４３〜１４６）の、配列番号９（ＶＮＧＶ）での置換、配列番号７（ＱＧＴＤＰＶＫ；配列番号１３に関してアミノ酸１５８〜１６４；配列番号１５に関してアミノ酸１５６〜１６２）の、配列番号１０（ＱＧＧＫ）への置換、またはその組合せから選択されるＮ２安定化変異であり得る。他のＮ２安定化変異を以下に記載する。本明細書に記載されるオープン安定化融合体は、１つまたは複数の置換、挿入、または欠失をさらに含み得る。例えば、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、免疫原性を低減もしくは消失させるように、潜在的グリコシル化部位を除去するように、またはアミロイドタンパク質に対する結合活性もしくは特異性をさらにモジュレートするようにさらに改変され得る。
本明細書で使用される場合、所定のアミノ酸配列「から本質的になる」本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、融合体のＧＡＩＭドメインとＦｃドメインとを接続する低分子リンカー、Ｎ末端シグナル配列もしくはその断片、Ｎ末端メチオニンの欠失（△Ｍ１）、またはＮ末端メチオニンとアラニンとの両方の欠失（△Ｍ１および△Ａ２）、および／または融合体のＦｃドメインのＣ末端リシン（Ｋ）の欠失をさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「低分子リンカー（small linker）」は、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のＧＡＩＭドメインとＦｃドメインとを接続する、最大２５アミノ酸長のペプチドリンカーを指す。以下にさらに説明するように、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のＧＡＩＭとＦｃドメインとを接続する例示的な「低分子リンカー」は、ＧＳに富む配列を含み得るか、またはアミノ酸配列ＡＲＳを含み得る。
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、本発明のポリペプチドのＮ末端に存在するおよそ１６〜３０アミノ酸の短いペプチドを指す。例えば、シグナル配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＰ＿５１０８９１．１の１８アミノ酸のＮ末端配列を含み得る。シグナル配列は、本発明のポリペプチドを分泌するために真核細胞によって使用される。これは、典型的に分泌前にポリペプチドから切断され、したがって典型的に分泌されたポリペプチドには存在しない。
用語「アミロイド」または「アミロイド線維」は、本明細書においていくつかの異なるタンパク質のいずれかのミスフォールディングまたは凝集によって形成され、線維軸に対して垂直にスタッキングされたβシートの規則正しい配置を含む三次構造に関する一般的用語として使用される。Sunde et al., J. Mol Biol. (1997) 273:729-39。
本明細書で使用される場合、アミロイドは、以下のタンパク質：アンドロゲン受容体；アポリポタンパク質ＡＩ；アポリポタンパク質ＡＩＩ；アポリポタンパク質ＡＩＶ；アポ血清アミロイドＡ；Ａβ；ＡＢｒｉ；ＡＤａｎ；アトロフィン−１；心房性ナトリウム利尿因子；アタキシン；カルシトニン；γ−クリスタリン；シスタチンＣ；フィブリノゲン；ゲルソリン；ハンチンチン；インスリン；膵島アミロイドポリペプチド；免疫グロブリンカッパ軽鎖；免疫グロブリンラムダ軽鎖；ケラトエピセリン；ケラチン；ラクタヘドリン；ラクトフェリン；リゾチーム；肺サーファクタントタンパク質Ｃ；メディン；歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質；プリオンタンパク質；プロカルシトニン；プロラクチン；セメノゲリンＩ；血清アミロイドＡ；スーパーオキシドジスムターゼＩ；β２−ミクログロブリン；ＴＡＴＡボックス結合タンパク質；タウ；トランスサイレチン；およびα−シヌクレイン、または上記の組合せのいずれかから形成することができる。本明細書で使用される場合、アミロイドはまた、上記のタンパク質のいずれかのトランケート型または翻訳後改変型から形成することもできる。「アミロイド」または「アミロイド線維」は、アミロイドの異なるまたは複数のコンフォメーションまたは形態を含む。
本明細書で使用される場合、「毒性オリゴマー」は、典型的にはアミロイドの形成経路上にある単量体の小さい集合または凝集体を指す。
例示的なアミロイドは、アルツハイマー病において形成されるアミロイドβ凝集体を含み、これはベータ−アミロイドペプチド「Ａβ」、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）から切断された３９〜４３アミノ酸の内部断片を含む。Ａβは、トランケート型および翻訳後修飾型を含む。例えば、Ａβ４０は、Ａβの短い形態であり、より原線維形成性のアイソフォームＡβ４２は、長い形態である。Ａβのさらなる例には、Ｎトランケート型Ａβ１１−４２、Ａβ１１−４２−Ｐｙｒｏ、Ａβ３−４２−Ｐｙｒｏ、およびＡβ１−４２−Ｅ２２Ｑ−Ｄｕｔｃｈ変異が挙げられるがこれらに限定されない。Levy et al, 1990; Van Broeckhoven et al, 1990を参照されたい。他の例示的なアミロイドタンパク質には、α−シヌクレイン（パーキンソン病に関連する）、ハンチンチン（ハンチントン病に関連する）、タウ（アルツハイマー病に関連する）、プリオンタンパク質の異常なコンフォメーション、ＰｒＰＳｃ、ならびに免疫グロブリン軽鎖（カッパまたはラムダ）、トランスサイレチン、ゲルソリン、および膵島アミロイドポリペプチドを含むがこれらに限定されない様々なアミロイドーシス疾患に関連するアミロイドが挙げられる。追加の例は、本説明を通して提供され、当業者に公知である（例えば、Aguzzi (2010)、およびEichner and Radford, Mol. Cell (2011) 43:8-18を参照されたい）。タンパク質またはペプチドが明記されていなければ、用語「アミロイド」または「アミロイド線維」の使用は、任意の特定のタンパク質、形態、疾患、または状態に限定されないと解釈すべきである。
用語「ベータアミロイドペプチド」は、「βアミロイドペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」、および「Ａβ」と同義である。これらの用語は全て、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）に由来するアミロイド形成ペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」、および「プリオン」は、適切な条件下でタンパク質ミスフォールディング疾患の原因である凝集体の形成を誘導することが可能なポリペプチドを指す。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）は、適切な条件下で疾患、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）（狂牛病）、ネコのネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）を含むがこれらに限定されない疾患の原因である対応するスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に変換される。
本明細書で使用される場合、「誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患」には、アルツハイマー病；早期発症型アルツハイマー病；後期発症型アルツハイマー病；発症前アルツハイマー病；ＡＬアミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合；嗜銀顆粒性認知症；大動脈中膜アミロイドーシス；ＡｐｏＡＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス；心房アミロイドーシス；イギリス型／デンマーク型認知症；白内障；大脳皮質基底核変性症；逆まつげに関連する角膜アミロイドーシス；シスタチンＣプラーク関連疾患；シスタチンＣプラーク関連冠動脈疾患；シスタチンＣプラーク関連腎疾患；皮膚苔癬アミロイドーシス；ボクサー認知症；歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮症；石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病；レヴィー小体認知症；ダウン症候群；家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）；家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）；家族性イギリス型認知症；家族性デンマーク型認知症；家族性脳症；家族性地中海熱；フィブリノゲンアミロイドーシス；フィンランド型遺伝性アミロイドーシス；パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；前頭側頭葉認知症；ハレルフォルデン‐スパッツ病；血液透析関連性アミロイドーシス；遺伝性脳アミロイド血管症；アミロイドーシスを伴う遺伝性脳内出血；遺伝性格子状角膜ジストロフィー；ハンチントン病；アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症；封入体筋炎；注射部位限局性アミロイドーシス（Injection-localized amyloidosis）；膵島アミロイドポリペプチドアミロイドーシス；リゾチームアミロイドーシス；多発性骨髄腫；筋強直性ジストロフィー；ニーマン・ピック病Ｃ型；神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患；パーキンソン病；末梢性アミロイドーシス；ピック病；下垂体プロラクチノーマ；脳炎後パーキンソニズム；プリオンタンパク質脳アミロイド血管症；プリオン媒介性疾患；クールー；クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）；致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）；スクレイピー；海綿状脳症；肺胞タンパク症；進行性皮質下グリオ−シス；進行性核上麻痺；老年性全身性アミロイドーシス；血清ＡＡアミロイドーシス；球脊髄性筋萎縮症；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）；亜急性硬化性全脳炎；全身性アミロイドーシス；家族性アミロイドーシス；野生型アミロイドーシス；神経原線維変化優位型認知症；およびタウオパチーが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Chiti & Dobson, Annu Rev Biochem (2006) 75:333-66;およびJosephs et al., Acta Neuropathol (2011) 122:137-153を参照されたい。これらの疾患の症状または重症度を処置するかまたは低減させるために、アミロイド凝集体形成（すなわち、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したタンパク質）を防止および／または低減させることが大いに必要である。
本明細書で使用される場合、「アミロイドを低減させる」ポリペプチド、組成物、製剤、または核酸は、以下の１つまたは複数を行う：アミロイド形成を阻害する、アミロイド脱凝集を引き起こす、アミロイドリモデリングを引き起こす、アミロイドクリアランスを促進する、アミロイド凝集を阻害する、毒性オリゴマーの形成を遮断および／または防止する、および／または毒性オリゴマーのクリアランスを促進する。
本発明のまたは「脱凝集する」もしくは「脱凝集を媒介する」と記載されるポリペプチド、核酸、または組成物は、既に形成された凝集体を低減させる。脱凝集は、フィルタートラップアッセイ（Wanker et al., Methods Enzymol (1999) 309:375-86）または当技術分野で公知の他の方法によって測定することができる。フィルタートラップアッセイを使用して、凝集体を検出し、本発明の組成物によって媒介される脱凝集をモニターすることができる。脱凝集は、脱凝集剤の漸増濃度の存在下で、染色の減少によって示されるフィルター上のアミロイドの保持の減少として検出される。
「アミロイドによる損傷からニューロンを保護する」と記載される本発明のポリペプチド、核酸、または組成物は、新規アミロイドの蓄積を防止する、および／または毒性オリゴマーの形成を防止する。「アミロイドによる損傷からニューロンを保護する」と記載される本発明の産物または組成物を、予防的に摂取してもよい。産物または組成物がアミロイドによる損傷からニューロンを保護するか否かは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０５５５１５に記載されるニューロン細胞培養細胞傷害アッセイによって測定され得る。
アミロイドを「リモデリングする」と記載される本発明のポリペプチド、核酸、または組成物は、原線維コンフォーマーのアモルファス凝集体への部分的または完全な変換を引き起こす。リモデリングは、尿素を使用する変性試験（例えば、Ａβの形態に関して）またはサルコシル溶解度アッセイ（例えば、タウの形態に関して）によって測定され得る。リモデリングの増加は、アミロイドがチオフラビンＴ（ＴｈＴ）に結合しないまたは結合できず、その結果ＴｈＴ蛍光が低減することによって検出され得る。リモデリングはまた、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して検出してもよい。
「アミロイド凝集を阻害する」と記載される本発明のポリペプチド、核酸、または組成物は、アミロイドの凝集を部分的または完全に防止する。アミロイド凝集の阻害は、ＴｈＴ蛍光アッセイによって測定され得る（例えば、より低い蛍光は、より低いパーセンテージのアミロイド凝集を示す）。
本明細書においてバクテリオファージ、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸配列に関連して使用される用語「バリアント」（例えば、ＧＡＩＭバリアント）は、参照物質と比較して少なくとも１つのアミノ酸の差（置換、挿入、または欠失である少なくとも１つの変異）を含有する対応する物質を指す。ある特定の実施形態では、「バリアント」は、参照配列と比較して高いアミノ酸配列相同性、ならびに／または保存的アミノ酸置換、欠失、および／もしくは挿入を有する。一部の実施形態では、バリアントは、参照配列と比較して２５個以下、２０個以下、１７個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸の差を有する。本明細書に記載されるバリアントは、参照配列と比較してアミロイド結合活性、アミロイド結合特異性、および／またはタンパク質の品質を保存し得るか、または増加させ得る。本明細書に記載されるバリアントは、脱グリコシル化され得る。本明細書に記載されるバリアントは、免疫原性を低減させ得るか、または消失させ得る。
「保存的置換」は、第１のアミノ酸の、ｇ３ｐタンパク質またはｇ３ｐのアミロイド結合性断片の化学的、物理的、および／または機能的特性を実質的に変化させない第２のアミノ酸による置換を指す（例えば、ｇ３ｐタンパク質またはアミロイド結合性断片は、同じ電荷、構造、極性、疎水性／親水性を保持し、ならびに／またはアミロイドの認識、結合、および／もしくは低減能などの機能を保存する）。そのような保存的アミノ酸改変は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。保存的置換として互換可能であり、および様々な前述の特徴を考慮に入れるアミノ酸の例示的なセットは、当業者に周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
用語「免疫原性の」または「免疫原性」は、本明細書において、組成物に曝露されている哺乳動物において組成物が免疫応答を誘発する能力を指すために使用される。一部の態様では、本発明は、低減された免疫原性を有するか、または完全に脱免疫されたポリペプチドまたは組成物に関する。完全な脱免疫は、それらのエピトープ配列における１つまたは複数の変異によって、天然のＧＡＩＭアミノ酸配列に存在するＴ細胞認識エピトープの５つ全てを除去することを示す。そのような脱免疫変異は、エピトープにおける１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、もしくは欠失を構成し得るか、またはエピトープ配列の部分的もしくは完全な欠失を構成し得る。
Ｇ３ｐの全般的アミロイド相互作用モチーフ（ＧＡＩＭ）およびそのＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体
全般的アミロイド相互作用モチーフ（ＧＡＩＭ）は、ｇ３ｐのＮ１およびＮ２ドメインを含む２ドメインポリペプチドである。ＧＡＩＭ Ｎ２ドメインは、３つの別個の構造エレメント：構造がＮ１に類似する球状部分（Holliger et al. (1999) J Mol Biol, 288:649-57）、アルファ−ヘリックス、およびＮ１ドメインとＨ結合の広範なネットワークを形成する無秩序な領域からなる。Ｎ２ヒンジ領域はまた、いくつかのプロリン残基も含有し、そのうちの１つ（Ｐ２１３）は、ＧＡＩＭをオープンのＴｏｌＡ結合コンピテント状態で維持することに関係している。ＧＡＩＭ単量体のＮ１およびＮ２ドメインは、芳香族アミノ酸の非対称分布を有する。ＧＡＩＭ Ｎ２ドメインは、１１個のチロシン（Ｔｙｒ）残基および１個の露出したトリプトファン（Ｔｒｐ）残基を含有し；Ｎ１ドメインは、３個のＴｒｐおよび３個のＴｙｒ残基を含有する。このように、チロシンおよびトリプトファン残基の内因性の蛍光によってそれぞれ、Ｎ２およびＮ１ドメインにおけるコンフォメーションの変化の特異的モニタリングが可能となり（Martin and Schmid (2003) J Mol Biol, 405:989-1003）、ＧＡＩＭのオープンコンフォメーションの検出が可能となる。
Ｈ／Ｄ交換試験は、ＧＡＩＭが、Ａβ４２線維の中心コアに結合することを示している。図２によって実証されるように、Ｈ／Ｄ交換試験はまた、ＧＡＩＭが、原線維−コアにおいて不連続な配列に会合し、芳香族残基（例えば、Ａβ４２における残基１７〜２５）および脂肪族残基（例えば、Ａβ４２における残基３１〜４０）に富む配列の両方に結合することも示している。これは、アミロイド集合の強力な阻害およびアモルファス凝集体への線維の効率的なリモデリングをもたらす（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol, 426:2500-19）。
一部の態様では、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む組成物は、ＧＡＩＭバリアントを含む。一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、参照配列と比較して２５個以下のアミノ酸の差を有する。一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、参照配列と比較して１７個以下のアミノ酸の差を有する。一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、参照配列と比較して１０個以下のアミノ酸の差を有する。一部の実施形態では、バリアントは、参照配列と比較して７個以下のアミノ酸の差を有する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１２（ＰＢ１２０のＧＡＩＭ部分）である。一部の実施形態では、参照隊列は、配列番号１４（ＰＢ１０６のＧＡＩＭ部分）である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１６（「ＰＢ１０６＋ＥＤＧＳ」のＧＡＩＭ部分（「ＥＤＧＳ」は配列番号５４に開示される））である。
特に明記していなければ、全てのＧＡＩＭアミノ酸配列のナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列に基づき、全てのＧＡＩＭ−Ｉｇアミノ酸配列ナンバリングは、短いリンカーＡＲＳによってＣ末端でヒトＩｇＧ１−Ｆｃアミノ酸配列に融合された配列番号１６を構成する、配列番号１５のアミノ酸配列に基づく。
本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるＧＡＩＭバリアントのいずれかを含む。本明細書に開示されるＧＡＩＭバリアントは、配列番号３（ＤＤＫＴＬＤ；配列番号１３に対してアミノ酸２４〜２９）の、配列番号４（ＥＧＤＳ）での置換を含む。この置換は、参照配列である配列番号１６に存在し、オープンコンフォメーション（「オープン」または「アンロックド」）ＧＡＩＭバリアントを有する本発明のＧＡＩＭバリアントをもたらす。
本発明のＧＡＩＭバリアントはまた、（ｉ）代替のＴ細胞エピトープ１−脱免疫変化、（ｉｉ）Ｔ細胞エピトープ２−脱免疫変化、および（ｉｉｉ）Ｎ２安定化変化から選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つの追加のセットも含む。
一部の実施形態では、アミノ酸変化の少なくとも１つの他のセットは、アミロイド親和性を増加させるが、なおもＴ細胞エピトープ１が脱免疫されている。参照の配列番号１６では、脱免疫されたＴ細胞エピトープ１は、アミノ酸Ｇ４７からＨ５５に及ぶ。その配列中のＨ５５が脱免疫を引き起こす；野生型ｇ３ｐ（この中で、Ｔ細胞エピトープ１は脱免疫されない）は、対応する位置でトレオニンを有する。配列番号１６のアミノ酸５５でトレオニンからヒスチジンへの変化を含むｇ３ｐポリペプチドバリアントでは、アミロイド親和性は有意なままであるが、野生型と比較すると、この親和性はいくぶん低減されている。興味深いことに、天然のｇ３ｐに存在する配列ＹＧＴは、ＴｏｌＡ結合モチーフであることが報告されている（S Pommier et al, J. Bacteriol. (2005), 187 (21), pp. 7526-34）。理論に拘束されたくはないが、本発明者らは、ＧＡＩＭ−アミロイド結合がｇ３ｐ−ＴｏｌＡ結合と類似のアミノ酸相互作用を必要とし得ると考えている。このように、本発明者らは、Ｈ５５Ｔ置換を作製すること（例えば、野生型Ｔ細胞エピトープ１配列に復帰させること）によって、および脱免疫に影響を及ぼす、新たに再生されたＴ細胞エピトープ中の代替の置換を調べることによって、配列番号１６における５３ＹＧＴ５５配列の再生を探索した。本発明者らは、Ｔ５０置換が、アミロイド親和性に影響を及ぼすことなくＴ細胞エピトープ１の脱免疫を引き起こすことを見出した。したがって、一部の実施形態では、本発明のＧＡＩＭバリアントは、Ｈ５５Ｔ置換を伴うＴ５０置換を含む。これらの実施形態の一部の態様では、Ｔ５０置換は、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｇ、またはＴ５０Ｈである。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０置換はＴ５０Ｈである。
一部の実施形態では、アミノ酸変化の少なくとも１つの他のセットは、アミロイド親和性を有意に変化させることなくＴ細胞エピトープ２を脱免疫する。参照の配列番号１６では、Ｔ細胞エピトープ２は、アミノ酸Ｍ１３４からＮ１４２に及び（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９８８，４４４Ｂ２号および米国特許出願公開番号２０１８／０２０７２３１Ａ１号を参照されたい）、対応する野生型ｇ３ｐ配列と比較して不変である。本発明の前では、本発明者らは、アミロイド結合を有意に低減させることなく、および／または得られたＧＡＩＭの安定性を有意に減少させることなくこのエピトープを脱免疫することは不可能であった。本発明者らは今では、Ｎ１４２および／またはＮ１３７の、別のアミノ酸での置換が、アミロイドの結合または安定性に有意な影響を及ぼすことなくＴ細胞エピトープ２を脱免疫することを発見した。このように、一部の実施形態では、本発明のＧＡＩＭバリアントは、Ｎ１４２の置換を含む。これらの実施形態の一部の態様では、Ｎ１４２置換はＮ１４２Ａである。代替の実施形態では、本発明のＧＡＩＭバリアントは、Ｎ１３７の置換を含む。これらの実施形態の一部の態様では、Ｎ１３７置換はＮ１３７Ｇである。他の代替の実施形態では、本発明のＧＡＩＭバリアントは、Ｎ１３７の置換およびＮ１４２の置換を含む。これらの実施形態の一部の態様では、Ｎ１３７置換はＮ１３７Ｇであり、Ｎ１４２置換はＮ１４２Ａである。
一部の実施形態では、アミノ酸変化の少なくとも１つの他のセットは、Ｎ２の安定性を増加させる。これらの変化は、図３Ｃに表すように、アミノ酸１３５〜１３８（ＦＱＮＮ；配列番号５；ターン１）、１４３〜１４６（ＲＱＧＡ；配列番号６；ターン２）、および１５６〜１６２（ＱＧＴＤＰＶＫ；配列番号７；ターン３）に及ぶ、配列番号１６に存在するいわゆる緩慢折り畳みループの１つまたは複数を標的とする。本発明者らは、これらの領域の１つもしくは複数におけるある特定のアミノ酸置換および／または欠失がＧＡＩＭにおけるＮ２の安定性を増加させることを発見した。このように、一部の実施形態では、アミノ酸変化の少なくとも１つの他のセットは：（ｉ）Ｎ１３７Ｇ；（ｉｉ）Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、および必要に応じてＡ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、またはＡ１４６Ｋ；ならびに（ｉｉｉ）Ｖ１６１Ｇ、Ｔ１５８、Ｄ１５９、およびＰ１６０の欠失、必要に応じてＱ１５６ＶまたはＱ１５６Ｙ、および必要に応じてＧ１５７Ｎから選択される。上記で提供したように、ターン１での緩慢折り畳みループを除去することによってＮ２を安定化するＮ１３７Ｇ置換もまた、Ｔ細胞エピトープ２を脱免疫する。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、ターン１、ターン２、およびターン３のうちの１つのみにアミノ酸変化を含み、例えば：（ｉ）Ｎ１３７Ｇ；（ｉｉ）Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、および必要に応じてＡ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、またはＡ１４６Ｋ；ならびに（ｉｉｉ）Ｖ１６１Ｇ、Ｔ１５８、Ｄ１５９、およびＰ１６０の欠失、必要に応じてＱ１５６ＶまたはＱ１５６Ｙ、および必要に応じてＧ１５７Ｎのうちの１つを含む。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、ターンの少なくとも２つにアミノ酸変化を含み、例えば、（ｉ）Ｎ１３７Ｇ；（ｉｉ）Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、および必要に応じてＡ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、またはＡ１４６Ｋ；ならびに（ｉｉｉ）Ｖ１６１Ｇ、Ｔ１５８、Ｄ１５９、およびＰ１６０の欠失、必要に応じてＱ１５６ＶまたはＱ１５６Ｙ、および必要に応じてＧ１５７Ｎのうちの２つを含む。これらの実施形態の一部の態様では、アミノ酸変化はＮ１３７Ｇであり、アミノ酸１３５〜１３８の配列番号８をもたらす。これらの実施形態の一部の態様では、アミノ酸変化は、Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖであり、アミノ酸１４３〜１４６の配列番号９をもたらす。これらの実施形態の一部の態様では、アミノ酸変化は、Ｔ１５８、Ｄ１５９、およびＰ１６０の欠失、ならびに置換Ｖ１６１Ｇであり、アミノ酸１５６〜１６２の置換として配列番号１０をもたらす。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、ＧＡＩＭバリアントは、ターンの３つ全てにアミノ酸変化を含まない。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記の代替のＴ細胞エピトープ１脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセット、および上記のＴ細胞エピトープ２脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセットを有するＧＡＩＭバリアントを含む。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、上記の代替のＴ細胞エピトープ１脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセット、および上記のＮ２安定化変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセットを有する。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、上記のＴ細胞エピトープ２脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセット、および上記のＮ２安定化変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセットを有する。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、上記の代替のＴ細胞エピトープ１脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセット、上記のＴ細胞エピトープ２脱免疫変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセット、および上記のＮ２安定化変化のいずれかから選択されるアミノ酸変化の少なくとも１つのセットを有する。
上述のタイプの変化の各々に関するアミノ酸変化の特定のセットの選択は、その所定のタイプに関して本明細書に記載される変化のいずれかから作製することができる。アミノ酸変化のセットの非限定的な例は、表１に見出すことができる。
Figure 2021527407
本発明のポリペプチドは、脱グリコシル化ＧＡＩＭバリアントを含む。参照配列である配列番号１６は、それが野生型ｇ３ｐと比較してＴ４０Ｇ変異を含むことから脱グリコシル化され、このようにＮＡＧに対する天然のＮＡＴグリコシル化シグナルを変化させる。他の脱グリコシル化ｇ３ｐ変異体および／またはバリアントの例は、米国特許出願公開第２０１８／０２０７２３１Ａ１号に見出すことができる。しかし、天然のグリコシル化シグナルにおいて異なるおよび／または追加の脱グリコシル化変異を有するＧＡＩＭバリアントもまた、本発明の一部である。例えば、Ｘが任意のアミノ酸である３アミノ酸配列ＮＸ（Ｔ／Ｓ）は、公知のグリコシル化シグナルである。そのような配列中のアスパラギン（Ｎ）をシステイン以外の任意のアミノ酸に置換すると、グリコシル化シグナルを破壊する。同様に、そのような配列中のトレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）をシステイン以外の任意のアミノ酸に置換しても、グリコシル化シグナルを破壊する。
このように、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧＡＩＭバリアントは、配列番号１６と比較してＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換を含み、さらに代替のＴ細胞エピトープ１脱免疫変化、Ｔ細胞エピトープ２脱免疫変化、および／またはＮ２安定化変化のうちの１つまたは複数を含む。これらの実施形態の一部の態様では、Ｎ３８の置換はＮ３８Ａである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、Ｇ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸への置換をさらに含む。
一部の代替の実施形態では、本明細書に記載されるＧＡＩＭバリアントは、配列番号１６と比較してＧ４０の、システイン、トレオニン、またはセリン以外の任意のアミノ酸での置換を含み、さらにＴ細胞エピトープ１脱免疫変化、Ｔ細胞エピトープ２脱免疫変化、および／またはＮ２安定化変化のうちの１つまたは複数を含む。
配列番号１６は、Ｎ末端アミノ酸Ｍ１およびＡ２を含む。動物細胞株におけるＧＡＩＭの組換えによる産生は、Ｍ１、またはＭ１およびＡ２の両方を欠損する（「Ｎ末端トランケーション」）ポリペプチドをもたらし得る。そのようなＮ末端トランケーションは、アミロイド結合活性に影響を及ぼさない。このように、一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、必要に応じて配列番号１６のアミノ酸１（ΔＭ１）、またはアミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）の両方を欠如し、それに加えてＴ細胞エピトープ１脱免疫変化、Ｔ細胞エピトープ２脱免疫変化、および／またはＮ２安定化変化のうちの１つまたは複数を含む。本明細書で使用される場合、アミノ酸１またはアミノ酸１もしくは２の両方を欠如するＧＡＩＭバリアントは、Ｎ末端トランケーション（すなわち、翻訳後の除去）または欠失変異を指し得る。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、置換Ｎ１３７Ｇを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１を欠如する（例えば、ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１および２を欠如する（例えば、ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、および必要に応じてＡ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、またはＡ１４６Ｋを含む配列番号１６のバリアントである。ある特定の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、アミノ酸１を欠如する（例えば、ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、アミノ酸１および２を欠如する（例えば、ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、Ｔ５０の、他の任意のアミノ酸での置換、置換Ｈ５５Ｔ、および置換Ｎ１３７Ｇを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０の置換は、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒから選択される。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０の置換はＴ５０Ｈである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、（ｉ）Ｎ１４２Ａ置換を含む；（ｉｉ）Ｎ３８および／またはＧ４０の脱グリコシル化変異を含む；（ｉｉｉ）アミノ酸１またはアミノ酸１および２の両方を欠如する；または（ｉｖ）その任意の組合せである。例えば、これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１を欠如する（例えば、ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１および２を欠如する（例えば、ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
ある特定の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、置換Ｎ１３７ＧおよびＮ１４２Ａを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、（ｉ）Ｔ５０の、他の任意のアミノ酸での置換ならびに置換Ｈ５５Ｔを含む；（ｉｉ）Ｎ３８および／またはＧ４０の脱グリコシル化変異を含む；（ｉｉｉ）アミノ酸１またはアミノ酸１および２の両方を欠如する；または（ｉｖ）その任意の組合せである。これらの実施形態のある特定の態様では、Ｔ５０の置換は、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒから選択される。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０の置換はＴ５０Ｈである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１を欠如する（例えば、ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１および２を欠如する（例えば、ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
ある特定の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、以下の置換：Ｎ１４２Ａ、Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、および必要に応じてＡ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、またはＡ１４６Ｋを含む配列番号１６のバリアントである。ある特定の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、以下の置換：Ｎ１４２Ａ、Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、（ｉ）Ｔ５０の、他の任意のアミノ酸での置換、ならびに置換Ｈ５５Ｔを含む；（ｉｉ）Ｎ３８および／またはＧ４０の脱グリコシル化変異を含む；（ｉｉｉ）アミノ酸１もしくはアミノ酸１および２の両方を欠如する；または（ｉｖ）その任意の組合せである。これらの実施形態の一部の態様では、Ｔ５０の置換は、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒから選択される。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０の置換はＴ５０Ｈである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１を欠如する（ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１および２を欠如する（ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
ある特定の実施形態では、ＧＡＩＭバリアントは、以下の置換：ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、Ｖ１６１Ｇ、および必要に応じて（ｉ）Ｑ１５６ＶもしくはＱ１５６Ｙ、および／または（ｉｉ）Ｇ１５７Ｎを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態のある特定の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、以下の置換：ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇを含む配列番号１６のバリアントである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、（ｉ）Ｔ５０の、他の任意のアミノ酸での置換、ならびに置換Ｈ５５Ｔを含む；（ｉｉ）Ｎ３８および／またはＧ４０の脱グリコシル化変異を含む；（ｉｉｉ）アミノ酸１またはアミノ酸１および２の両方を欠如する；または（ｉｖ）その任意の組合せである。これらの実施形態の一部の態様では、Ｔ５０の置換は、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒから選択される。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｔ５０の置換はＴ５０Ｈである。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１を欠如する（ΔＭ１）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントは、アミノ酸１および２を欠如する（ΔＭ１およびΔＡ２）。これらの実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭバリアントはさらに、Ｎ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換、Ｇ４０の、システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸での置換、またはＮ３８の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換とＧ４０の、システイン以外の任意のアミノ酸での置換との両方を含む。これらの実施形態の少なくとも１つの態様では、Ｎ３８置換はＮ３８Ａである。
少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＧＡＩＭバリアントを含む。
上記のＧＡＩＭバリアントのいずれかを、直接または短いリンカーによってＣ末端で免疫グロブリン定常領域に融合し、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質をもたらすことができる。本明細書に記載されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質の免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの免疫グロブリン定常領域であり得る。一部の態様では、免疫グロブリン定常領域はＩｇＧである。ある特定の態様では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。他の態様では、ＩｇＧはＩｇＧ２である。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、またはその断片である。本発明の融合タンパク質にとって適したヒトＩｇＧのＦｃ部分は、野生型または改変Ｆｃ部分を含む。例えばヒトＩｇＧの適した改変Ｆｃ部分は、融合タンパク質を安定化させ、および／または野生型Ｆｃと比較してその半減期を増加させ得る。改変Ｆｃの非限定的な例は、米国特許第７，０８３，７８４号、米国特許第７，２１７，７９７号、米国特許第７，２１７，７９８号、米国特許出願第１４／２１４，１４６号、およびＷＯ−１９９７０３４６３１号に開示される改変Ｆｃを含む。少なくとも１つの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分である。少なくとも１つの実施形態では、免疫グロブリン定常領域はヒトＩｇＧ２のＦｃ部分である。一部の実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質の免疫グロブリン定常領域は、Ｃ末端リシン（例えば、Ｋ４８５）を含む。他の実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、Ｃ末端リシンを欠如する（例えば、ΔＫ４８５）。
一部の実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、本明細書で開示される任意のＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドおよびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１９に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１９およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２９（ＰＢ１０８）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２９のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２０に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２０に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２０およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３０（ＰＢ１２２）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３０のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２１に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２１およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３１（ＰＢ１１６）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３１のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２２に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２２に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２２およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３２（ＰＢ１１４）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３２のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２３に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２３に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２３およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３３（ＰＢ１０９）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３３のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２４に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２４に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２４およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３４（ＰＢ１１０）のアミノ酸配列から本質的になる。一部の実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３４のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２５に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２５に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２５およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３５（ＰＢ１０５）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３５のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
少なくとも１つの実施形態では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２６に記載される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列、およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。本実施形態の一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質のＧＡＩＭ部分のアミノ酸配列は、配列番号２６に記載される配列と１０〜１５、１〜１０、または１〜５個の保存的置換によって異なる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号２６およびヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分から本質的になる。例えば、一部の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３６（ＰＢ１２７）のアミノ酸配列から本質的になる。本実施形態の他の態様では、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号３６のバリアントが、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）、またはアミノ酸１、２、および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２、およびΔＫ４８５）を欠如する該バリアントから本質的になる。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のＧＡＩＭ部分およびＩｇ部分は、低分子リンカーによって接続される。一部の実施形態では、低分子リンカーは、グリシン、セリン、および／またはトレオニンに富み、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のグリシン、セリン、および／またはトレオニンを含む。一部の実施形態では、低分子リンカーは、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、７０％、もしくは７５％のグリシン、セリン、および／またはトレオニンを含む。一部の実施形態では、低分子リンカーは、実質的にまたは完全にグリシン、セリン、および／またはトレオニンで構成される。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の低分子リンカーは、最大２５アミノ酸長、例えば１〜５アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長、５〜１０アミノ酸長、５〜２５アミノ酸長、または１０〜２５アミノ酸長であり得る。低分子リンカーは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸を有し得る。一部の実施形態では、低分子リンカーは、ヒトＴ細胞エピトープを含有せず、ＧＡＩＭバリアントまたはそれが結合するＦｃドメインのいずれかを有するヒトＴ細胞エピトープを作製しない。例示的な低分子リンカーは、様々な数の配列ＧＧＧＧＳ（４ＧＳ；配列番号２７）またはＧＧＧＳ（３ＧＳ；配列番号２８）のリピート、例えばそのような配列の２、３、４から５個のリピートを有するリンカーを含む。例示的な低分子リンカーは、１つまたは複数のリシン残基を含み得る。他の例示的な低分子リンカーは、アミノ酸配列ＡＲＳを含む。
本明細書で開示されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、先行技術に対していくつかの利点を実証する。アルツハイマー病（ＡＤ）の脳におけるＡβの病的形態を同定することをねらいとする研究は、不溶性プラークおよび可溶性Ａβの両方が、ＮおよびＣ末端トランケート型Ａβペプチドの不均一な集団からなり（Wildburger et al., (2017) Sci Rep 7:9520）、構造的に多様なコンフォメーションを形成する（Condello et al. (2018) PNAS, 115:E782-91; Rasmussen et al. (2017) PNAS, 114:13018-23; Liu et al. (2016) Sci Rep, 6:33079）ことを示している。同様に、Ｎ末端トランケート型Ａβ断片の大部分が、アミロイド斑の主要な部分を構成することも観察されている（Wildburger et al., (2017) Sci Rep 7:9520）。しかし、アミロイド凝集またはミスフォールディングに対する抗体関連治療の大部分は、少なくとも部分的にそれらがＮ末端トランケート型または改変型のアミロイドに有効に会合できないために臨床では成功していない。本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、これらの融合体が、様々なＡβ凝集体、異なる形態および凝集特性を有する凝集体であっても会合することが可能であることから、多様なアミロイドタンパク質を標的とすることができる組成物のこれまでのアンメットニーズに取り組む。
本明細書に開示されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、他の凝集体の中でも、その両方がアルツハイマー病に臨床で関連している、トランケート型１１−４２Ａβ凝集体および／または翻訳後改変ピログルタメートＡβ凝集体に結合する。表２および３にさらに示すように、本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、Ａβ凝集体、Ｎ末端トランケート型Ａβ凝集体、タウ、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の複数のコンフォーマー、および多様な形態の免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）凝集体を含むがこれらに限定されない複数のタイプのアミロイドタンパク質を標的とする。これらの標的は、本明細書に記載される疾患のリスクがあるかまたは疾患に罹っている患者において見出されるアミロイドタンパク質を含む。
先行技術の抗体関連治療もまた、それらがリン酸化タウの凝集を遮断できないことおよび／またはタウが脳の１つの領域から他の領域へと広がるのを遮断できないことから、臨床において不成功であり得る。本発明のオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、この必要性に取り組む。本発明のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、タウのリモデリングを引き起こし、このようにタウ凝集体が可溶性タウを播種するのを防止し、タウ凝集体の伝播を遮断する。
併せて考慮すると、本明細書に開示されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、病的なアミロイド凝集体を防止または除去する独自のアプローチを表す。先行技術の代替物と比較すると、本明細書に記載されるオープン安定化ＧＡＩＭ融合体は、より大きい効力、構造の安定性、ならびにＡβおよびタウ線維を含むアミロイドに対する特異性を示し、同様に、部分的または完全に脱免疫されている。
ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチド（例えば、融合タンパク質を含む１つまたは複数のＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチド）は、当技術分野で周知の技術を使用して合成することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、細胞において組換えによって合成することができる（例えば、Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.、およびAusubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい）。あるいは、本発明のポリペプチドは、固相合成などの公知の合成方法を使用して合成することができる。合成技術は、当技術分野で周知である（例えば、Merrifield, 1973, Chemical Polypeptide, (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp. 335-61;Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:257；米国特許第３，９４１，７６３号を参照されたい。あるいは、最終構築物は、組換えによって産生された融合タンパク質と本質的に同じ機能を共有し得るが、単純にライゲーションケミストリーなどの非組換え技術を使用して産生してもよい。融合タンパク質の成分は、ｇ３ｐ発現およびｇ３ｐ変異に関して記載した同じ一般的方法論を使用して調製され得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドを、融合したポリペプチドの精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合させてもよい（単独で、または別のタンパク質との融合もしくは担体分子の組込みに加えて）。マーカーアミノ酸配列は、中でもヘキサ−ヒスチジンペプチド（配列番号５３）、例えばｐＱＥベクターにおいて提供されるタグ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）であり得、その多くが市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:821-824に記載されているように、例えばヘキサ−ヒスチジン（配列番号５３）は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製にとって有用な別のペプチドタグであるヘマグルチニン（ＨＡ）タグは、インフルエンザＨＡタンパク質に由来するエピトープに対応する（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）。
医薬組成物
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＧＡＩＭバリアントを含む任意のポリペプチドを、必要に応じて薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む医薬組成物を提供する。「医薬組成物」は、生理的に適した担体および／または賦形剤を有する本明細書に記載される組成物の治療有効量を指す。医薬組成物は、生物に対して有意な刺激を引き起こさない。語句「生理的に適した担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して有意な刺激を引き起こさず、投与した組成物の生物活性および特性を抑止しない担体または希釈剤を指すために互換的に使用され得る。用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例には、食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分を薬学的に使用することができる組成物に加工するのを容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、慣習的な様式で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路および送達される組成物の性質（例えば、ポリペプチドのサイズおよび溶解度）に依存する。これらの実施形態の一態様では、医薬組成物は、患者の血流に注射または注入するために製剤化される。これらの実施形態の別の態様では、医薬組成物は、例えば直接髄内、髄腔内、または脳室内注射によって患者の脳または中枢神経系に直接投与するために製剤化される。
本明細書に記載される組成物は、非経口投与、例えばボーラス注射または持続的注入のために製剤化され得る。非経口投与のための医薬組成物は、水溶性型の組成物の水性液剤を含む。加えて、活性成分の懸濁剤は、油性または水基剤の注射用懸濁剤として調製され得る。適した親油性溶媒または媒体は、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。必要に応じて、懸濁剤はまた、適した安定剤、または活性成分の溶解度を増加させて高濃度溶液の調製を可能にする作用剤（agent）（例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）などの界面活性剤）も含有し得る。送達表面（すなわち、ＩＶバッグ、カテーテル、針など）への本発明のポリペプチドの吸着を防止するために、タンパク質基剤の作用剤、例えばアルブミンを使用してもよい。
経口投与の場合、医薬組成物は、本明細書に記載されるポリペプチドを当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって製剤化することができる。
製剤は、必要に応じて追加の保存剤と共に、単位剤形、例えばバイアル、アンプル、または多用量容器で提供され得る。組成物は、懸濁剤、液剤、または油性または水性ビヒクル中の乳剤であってもよく、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含有してもよい。単回剤形は、液体または固体剤形であり得る。単回剤形を、改変することなく患者に直接投与してもよく、または投与前に希釈もしくは再構成してもよい。ある特定の実施形態では、単回剤形は、ボーラス形態、例えば単回注射、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤などを含む経口用量を含む単回経口用量として投与され得る。代替の実施形態では、単回剤形は、一定期間にわたって、例えば注入によってまたは埋め込みポンプ、例えばＩＣＶポンプを介して投与され得る。後者の実施形態では、単回剤形は、ＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドの適切な量を予め充填した注入バッグまたはポンプリザーバーであり得る。あるいは、注入バッグまたはポンプリザーバーは、ＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドの適切な用量を注入バッグまたはポンプリザーバー溶液と混合することによって、患者に投与する直前に調製され得る。
本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物を調製する方法を含む。薬物の製剤化のための技術は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest editionに見出され得る。
本発明の文脈における使用にとって適した医薬組成物は、活性成分が、意図される目的を達成するために有効な量で含有される組成物を含む。
治療的または診断的に有効な量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力範囲内である。
投薬量および間隔は、特定の脳の疾患、障害、または状態を処置または診断するために十分であるファージディスプレイ媒体の脳内レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調整され得る。ＭＥＣは、各調製物に関して異なるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特徴に依存する。
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、その時間の１０〜９０％にわたって、好ましくはその時間の３０〜９０％の間で、最も好ましくはその時間の５０〜９０％でＭＥＣを超える脳内レベルを維持するレジメンを使用して投与すべきである。
処置される疾患の重症度および応答性に応じて、投与は、単回または複数回投与であり得、処置過程は、数日から数週間、または治癒が起こるまで、または疾患状態の減少が達成されるまで持続し得る。
投与される組成物の量は、当然、処置または診断される対象、罹患の重症度、主治医の判断などに依存する。
本発明の組成物は、所望される場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス、例えばＦＤＡが承認したキットとして提示され得る。パックは、例えば金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための指示を添付することができる。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって指示された形態で容器に関連する表示（notice）を収容することができ、表示は、組成物の形態、またはヒトもしくは動物用の投与に関する当局による承認を反映している。そのような表示は例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベル表示または承認された製品の添付文書の表示であり得る。適合する医薬担体中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、本明細書にさらに詳述するように調製され、適切な容器に入れられ、適応疾患の処置のためにラベルを貼付され得る。
治療的使用
本発明の別の態様は、トランスサイレチン、免疫グロブリン軽鎖（カッパまたはラムダ）、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、またはｆｔａｕのいずれかを伴うそれらの疾患を含むがこれらに限定されない、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する１つまたは複数の疾患の処置における本発明のポリペプチド、核酸分子、または組成物のいずれかの使用に関する。
処置の文脈において、用語「患者」、「対象」、および「レシピエント」は、互換的に使用され、ヒトならびに他の哺乳動物を含む。一部の実施形態では、患者は、タンパク質ミスフォールディング疾患に関連するバイオマーカーに対して陽性であるヒトである。一実施形態では、患者は、フロルベタピルによるＰＥＴイメージングによって検出した場合に、β−アミロイド沈着物を示す。
用語「処置する」およびその同根語は、疾患の１つまたは複数の臨床症状を示す患者における疾患の進行を低減する、遅らせる、または逆転させることを指す。「処置する」はまた、疾患の１つまたは複数の（one more）臨床症状を示す患者における疾患の症状を低減する、遅らせる、または逆転させることを指す。一実施形態では、患者は、フロルベタピルによるＰＥＴイメージングによって検出した場合に、β−アミロイド沈着物を示し、β−アミロイド沈着物の数は、処置によって低減される。一実施形態では、患者は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物によって検出した場合にβ−アミロイド沈着物を示し、β−アミロイド沈着物の数は、処置によって低減されるかまたは維持される。別の実施形態では、患者は、ＰＥＴイメージングによって検出した場合に任意のタイプのアミロイド沈着を示し、患者の認知機能は処置によって改善する。認知機能の改善は、McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 7(3):263-9 (2011)の方法および検査によってアッセイされ得る。
「予防」または「防止」（本明細書において互換的に使用される）は、処置することとは異なり、いずれかの臨床症状の発症前に個体へのポリペプチド、核酸、または組成物の投与を指す。本発明のポリペプチド、核酸、またはその組成物のいずれかを使用する予防が包含される。予防は、単に１つまたは複数の遺伝子マーカーに基づいて、疾患のリスクが増加していることが既知の個体または疾患を発症することが確実である個体に関係し得る。様々なタンパク質ミスフォールディング疾患に関して、多くの遺伝子マーカーが同定されている。例えば、ｈＡＰＰにおいてスウェーデン型変異、インド型変異、またはロンドン型変異のうちの１つまたは複数を有する個体は、早期発症型アルツハイマー病を発症するリスクが増加しており、そのため、予防の候補者である。同様に、ハンチンチン遺伝子においてトリヌクレオチドＣＡＧリピートを有する個体、特に３６個またはそれより多くのリピートを有する個体は、最終的にハンチントン病を発症し、そのため、予防の候補者である。
誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連するまたはそれによって特徴付けられる疾患は、誤って折り畳まれたアミロイドタンパク質、凝集したアミロイドタンパク質、または誤って折り畳まれたおよび凝集したアミロイドタンパク質の両方に関連する（例えば、それによって引き起こされるかまたは少なくとも部分的に相関する）疾患を包含する。アミロイドを形成し得るペプチドまたはタンパク質は、上記の通りである。例えば、一部の実施形態では、アミロイドは、Ａβ４０、Ａβ４２、Ｎトランケート型Ａβ１１−４２、Ａβ１１−４２−Ｐｙｒｏ、Ａβ３−４２−Ｐｙｒｏ、Ａβ１−４２−Ｅ２２Ｑ−オランダ型変異、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されないＡβによって形成される。一部の実施形態では、アミロイドは、プリオンタンパク質、例えばＰｒＰＳｃによって形成される。一部の実施形態では、アミロイドは、トランスサイレチンによって形成される。一部の実施形態では、アミロイドは、免疫グロブリン軽鎖、例えば免疫グロブリンカッパ軽鎖および／または免疫ブロブリンラムダ軽鎖によって形成される。一部の実施形態では、アミロイドは、タウによって形成される。一部の実施形態では、アミロイドは、α−シヌクレインによって形成される。
誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連するかまたはそれよって特徴付けられる疾患は上記の通りである。上記の誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質疾患の多くは中枢神経系（ＣＮＳ）で起こる。ＣＮＳにおいて起こる疾患の非限定的な例は、パーキンソン病；アルツハイマー病；以下の臨床症状：行動異常型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）、および意味性認知症（ＳＤ）を有する患者を含む前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；およびハンチントン病である。本発明のポリペプチド、核酸、および組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）で起こる誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質によって特徴付けられる疾患を処置するために使用され得る。
タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集はまた、ＣＮＳの外部でも起こり得る。アミロイドーシスＡ（ＡＡ）（前駆体タンパク質は、血清中の急性期アポリポタンパク質、すなわちＳＡＡである）および多発性骨髄腫（前駆体タンパク質は免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖である）は、ＣＮＳの外部で起こる２つの広く公知のタンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集タンパク質疾患である。他の例は、α２−ミクログロブリン、トランスサイレチン（例えば、ＦＡＰ、ＦＡＣ、ＳＳＡ）、（アポ）血清ＡＡ、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、およびＡＩＶ、ゲルソリン（例えば、ＦＡＰのフィンランド型）、免疫グロブリン軽鎖（カッパまたはラムダ）、リゾチーム、フィブリノゲン、シスタチンＣ（例えば、脳アミロイド血管症、アイスランド型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血）、カルシトニン、プロカルシトニン、膵島アミロイドポリペプチド（例えば、ＩＡＰＰアミロイドーシス）、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、インスリン、ラクタヘドリン、ケラトエピセリン、ラクトフェリン、歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質、およびセメノゲリンＩによって形成されるアミロイドを伴う疾患を含む。本発明のポリペプチド、核酸、および組成物は、ＣＮＳ外部で起こるタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を伴う疾患を処置するために使用され得る。
誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連するまたはそれによって特徴付けられる疾患もまた、タウ病変を伴い得る。Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24:1121-159 (2001)において論評されている。タウタンパク質は、中枢および末梢神経系ニューロンの両方の軸索において発現される微小管関連タンパク質である。神経変性性タウオパチー（時にタウオパチーと呼ばれる）が包含される。タウオパチーの例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、第１７染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン‐スパッツ病、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオ−シス、進行性核上麻痺、亜急性硬化性全脳炎、および神経原線維変化優位型認知症が挙げられる。これらの疾患の一部はまた、原線維アミロイドβペプチドの沈着も含み得る。例えば、アルツハイマー病は、アミロイドβ沈着およびタウ病変の両方を示す。同様に、プリオン媒介性疾患、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群もまた、タウ病変を有し得る（may have also have tau lesions）。このように、ある疾患が「タウオパチー」であることを示している場合、その疾患が、他の神経変性または誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質疾患の分類または群分けから除外されると解釈してはならず、これらの分類または群分けは便宜上提供されているに過ぎない。本発明のポリペプチドおよび組成物は、神経変性疾患ならびにタウ病変を伴う疾患を処置するために使用され得る。
一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、アミロイドの存在に関連する症状を示すか、またはタンパク質ミスフォールディング疾患に関連するバイオマーカーに対して陽性である患者におけるアミロイドを低減させる方法であって、本明細書に記載される医薬組成物または製剤の有効量を患者に投与するステップを含む方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、アミロイドの存在に関連する症状を示すか、またはタンパク質ミスフォールディング疾患に関連するバイオマーカーに対して陽性である患者におけるアミロイドレベルを維持する方法であって、本明細書に記載される医薬組成物または製剤の有効量を患者に投与するステップを含む方法において使用するためのものである。これらの実施形態の一部の態様では、バイオマーカーはβ−アミロイドであり、これは、放射性医薬であるフロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）によって検出することができる。これらの実施形態の一部の態様では、投与経路は髄腔内注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入である。
一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、患者におけるアミロイドを脱凝集またはリモデリングする方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳におけるアミロイド形成を低減させる方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳におけるアミロイドクリアランスを促進する方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳におけるアミロイド凝集を阻害する方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳における毒性オリゴマーを除去する方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳における毒性オリゴマーの形成を防止する方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、アミロイドによる損傷からニューロンを保護する方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、α−シヌクレイン凝集体の細胞−細胞間伝播を低減させる方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、α−シヌクレイン凝集体の細胞−細胞間伝播を遮断する方法において使用するためのものである。これらの実施形態の一部の態様では、ポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、それを必要とする患者に髄腔内注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入によって投与される。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳におけるＡβアミロイド沈着物の脱凝集を引き起こす方法であって、それを必要とする患者の脳にポリペプチド、医薬組成物、または製剤の有効量を直接注射し、こうして脳におけるＡβアミロイド沈着の低減を引き起こすステップを含む方法において使用するためのものである。他の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、脳におけるＡβアミロイド沈着物の脱凝集を引き起こす方法であって、それを必要とする患者にポリペプチド、医薬組成物、または製剤の有効量を静脈内送達によって注射し、こうして脳におけるＡβアミロイド沈着物の低減を引き起こすステップを含む方法において使用するためのものである。
一実施形態では、アミロイドによる損傷からニューロンを保護するために使用するための本発明の医薬組成物または製剤は、予防的に投与される。
一部の実施形態では、患者は、タンパク質ミスフォールディングおよび／または凝集疾患に関連するバイオマーカーに対して陽性である。一実施形態では、バイオマーカーはβ−アミロイドであり、β−アミロイドを検出するために使用される作用剤は、フロルベタピル（ＡＶ４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）である。
先行技術の抗体に基づく治療（例えば、６Ｅ１０）とは異なり、本明細書に記載されるＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、非構造化または部分的構造化Ｎ末端残基ではなくてアミロイドのコアを標的とし、優れたリモデリング活性を実証する（図１０Ａ）。このように、一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、医薬組成物、または製剤は、アミロイドをリモデリングする方法において使用するためのものである。これらの実施形態の一部の態様では、投与経路は、髄腔内注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入、または静脈内注射もしくは注入である。
一般的に、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質と少なくとも同程度に有効にアミロイドに結合する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効にアミロイドに結合する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効にアミロイドをリモデリングする。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効にアミロイド凝集を阻害する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効に毒性オリゴマーを除去する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効にα−シヌクレイン凝集体の細胞−細胞間伝播を低減させる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効にアミロイドを検出する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効に、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患を防止する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質より有効に、誤って折り畳まれたおよび／または凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患を処置する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、Ｍ１３ファージ、ｇ３ｐ、または先行技術に開示されるｇ３ｐのバリアントもしくは融合タンパク質と比較して患者においてより小さい免疫応答を誘発する。少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、患者において免疫応答を誘発しない。
別の実施形態では、上記の疾患のいずれも、本発明の核酸分子（すなわち、低減された免疫原性を示すかまたは免疫原性を示さず、アミロイドに結合する能力、アミロイドを脱凝集／リモデリングする能力、および／またはアミロイドの凝集を阻害する能力を保有するＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドをコードする）を、単独でまたは適した担体、例えば脂質ナノ粒子、ポリマー担体、またはベクター、例えばウイルスベクターに会合させて任意の適した経路、例えば吸入および静脈内注入によって患者に直接投与することによって処置され得る。ＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドをコードする核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
診断
診断用組成物が、本発明によって包含され、上記の本発明のポリペプチドのいずれも（例えば、ＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチド、例えば、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を含むポリペプチドを含み得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチド、医薬組成物および製剤は、本明細書において記載される種々の疾患と関連する診断適用において使用される。例えば、本発明のポリペプチドの、アミロイドタンパク質への結合は、結合しているアミロイドタンパク質を検出するために使用され得る。同様に、本発明のポリペプチドの結合は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでイメージング剤として使用される場合、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質凝集または本明細書において記載される神経変性性疾患の診断の一部であり得る。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドはアミロイドイメージング剤として使用され、ここで、アミロイドイメージング剤はアミロイドタンパク質を検出でき、誤って折り畳まれたおよび／もしくは凝集したアミロイドタンパク質に関連する疾患を診断できる。本明細書において記載されるポリペプチドは、線維の種類にかかわらずアミロイドと結合するので、それらは、任意のアミロイド凝集体（Αβ、タウ、α−シヌクレイン、トランスサイレチン、免疫グロブリン軽鎖など）を画像化および検出でき、幅広いアミロイド関連疾患および状態を診断し得る。一部の実施形態では、アミロイドイメージング剤として使用されるポリペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。
種々の標識が、タンパク質を標識するための標準技術を使用して本明細書において記載されるようなＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドに結合され得る。標識の例として、蛍光標識および放射標識が挙げられる。使用され得る様々な放射標識があるが、一般に、標識は、それだけには限らないが、１８Ｆ、１１Ｃおよび１２３Ｉを含む放射標識から選択されることが多い。これらおよび他の放射性同位元素は、周知の化学反応を使用してタンパク質に結合され得る。一実施形態では、標識は、陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）を使用して検出される。しかし、放射性同位元素の検出のための任意の他の適した技術も、放射性トレーサを検出するために使用され得る。
本発明のポリペプチドおよび組成物は、β−アミロイドに特異的であるイメージング剤、例えば、Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙなどと組み合わせて診断用イメージング剤として使用され得る。β−アミロイド特異的イメージング剤と一緒の本発明の診断用組成物の使用は、分別検出に基づく非β−アミロイド凝集体の検出をもたらすので、一実施形態では、本発明の診断用組成物は、非β−アミロイド凝集体を検出するためにβ−アミロイドイメージング剤と組み合わせてイメージング剤として使用される。
一部の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドまたはその組成物は、脳を含むＣＮＳにおいてβ−アミロイドを検出するために使用される。
本発明の診断用組成物は、治療用組成物のために記載される同一経路を使用して投与され得る。一部の実施形態では、投与の経路は、髄腔内注射もしくは注入、直接脳室内注射もしくは注入、実質内注射もしくは注入または静脈内注射もしくは注入である。
組換え技術
一部の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。例えば、本発明は、本明細書に開示されたような免疫グロブリン定常領域に直接または低分子リンカーによって結合されたＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドを含むＧＡＩＭバリアントを含むポリペプチドをコードする核酸配列に関する。一般に、ＧＡＩＭバリアントまたはＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を含むポリペプチドをコードする核酸は、従来の組換えＤＮＡ技術、例えば、変異体ＧＡＩＭドメインのクローニング、直接ＤＮＡ合成を使用して、または例えば、Ｍ１３配列をプローブとして使用してライブラリーから対応するＤＮＡを単離することによって調製される。例えば、Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。ＧＡＩＭバリアントまたはＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を含むポリペプチドをコードする核酸はまた、以下の実施例に提供されるように調製され得る。
組換えによる産生のために、本発明の核酸配列のいずれも、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳に必要なエレメントを含有する、適当な発現ベクター中に挿入され得る。コード核酸は、適切なリーディングフレームでベクター中に挿入される。したがって、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。このようなベクターとして、それだけには限らないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。ベクターは、例えば、バキュロウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ＲｉプラスミドまたはＴｉプラスミドを含み得る。本発明の核酸をクローニングするための適当なベクターの選択は、発現を実施するための選択された宿主細胞とのベクターの適合性についての周知の知識を使用して当業者によって行われ得る。これは、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、真菌細胞、トランスジェニック動物細胞などのいずれかにおいて行われ得る。本明細書において記載されるポリペプチドを産生するのに適した例示的哺乳動物細胞として、それだけには限らないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。例示的細菌細胞として、それだけには限らないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が挙げられる。例示的植物細胞として、それだけには限らないが、ウキクサ細胞が挙げられる。例えば、米国特許第８，０２２，２７０号を参照されたい。これらの細胞種の各々のための適当なベクターは、当技術分野で周知であり、一般に、市販されている。限定されない例示的トランスフェクション法は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、当技術分野で公知の方法に従って所望の宿主細胞に一過性にまたは安定にトランスフェクトされ得る。
少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号１９およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２０およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２１およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２２およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２３およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２４およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２５およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号２６およびヒトＩｇＧのＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１）から本質的になるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、核酸は、配列番号２９のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１０８）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３０のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１２２）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１１６）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３２のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１１４）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３３のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１０９）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３４のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１１０）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３５のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１０５）をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３６のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド（ＰＢ１２７）をコードする。上記のように、これらの実施形態は、バリアントは、アミノ酸１（ΔＭ１）、アミノ酸１および２（ΔＭ１およびΔＡ２）、アミノ酸４８５（ΔＫ４８５）、アミノ酸１および４８５（ΔＭ１およびΔＫ４８５）またはアミノ酸１、２および４８５（ΔＭ１、ΔＡ２およびΔＫ４８５）を欠如する、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６のバリアントをコードする核酸を包含する。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３７を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３８を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号３９を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４０を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４１を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４２を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４３を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４のいずれかを含む核酸は、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２）のＦｃ部分をコードする核酸をさらに含む。少なくとも１つの実施形態では、オープン安定化ＧＡＩＭバリアントをコードする核酸およびＩｇＧのＦｃ部分をコードする核酸は、低分子リンカーをコードする核酸によって接続される。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、低分子リンカーＡＲＳをコードする。一部の実施形態では、核酸は、シグナル配列をさらにコードする。一部の実施形態では、核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＰ＿５１０８９１．１の１８アミノ酸のＮ末端配列を有するシグナル配列をさらにコードする。
少なくとも１つの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４５である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号４６である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号４７である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号４８である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号４９である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号５０である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号５１である。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、配列番号５２である。
形質転換に使用されるベクターは、普通、形質転換体を同定するために使用される選択マーカーを含有する。細菌系では、これは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリンまたはカナマイシンを含み得る。培養哺乳動物細胞において使用するための選択マーカーとして、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。１つの増幅可能な選択マーカーとして、ＤＨＦＲ遺伝子がある。別の増幅可能なマーカーとして、ＤＨＦＲｒ ｅＤＮＡがある（Simonsen and Levinson, PNAS (1983) 80:2495）。選択マーカーは、Thilly(Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA)に総説されており、選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現系の発現エレメントは、その強度および特異性が変わる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成および誘導プロモーターを含む多数の適した転写および翻訳エレメントのいずれも、発現ベクターにおいて使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導プロモーター、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などが使用され得る；昆虫細胞系においてクローニングする場合には、バキュロウイルス多面体プロモーター（baculovirus polyhedron promoter）などのプロモーターが使用され得る；植物細胞（plant ceil）系においてクローニングする場合には、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用され得る；哺乳動物細胞系においてクローニングする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る；複数のコピーの発現産物を含有する細胞株を作製する場合には、適当な選択マーカーと共にＳＶ４０−、ＢＰＶ−およびＥＢＶ−ベースのベクターが使用され得る。植物発現ベクターが使用される場合には、本発明の発現産物の線形のまたは非環状形態をコードする配列の発現は、いくつかのプロモーターのうちいずれかによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター（Brisson et al., Nature (1984) 31 0:511-514）またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamatsu et al., EMBO J (1987) 6:307-311）が使用され得る；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター（Coruzzi et al., EMBO J. (1984) 3:1671-1680; Broglie et al., Science (1984) 224:838-843）または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Gurley et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:559-565）も使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞中に導入され得る。例えば、Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463;およびGrierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9を参照されたい。本発明のタンパク質を産生するために使用され得る１つの昆虫発現系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（AcNPV）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、多面体遺伝子）中にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の制御下に置かれ得る。コード配列の挿入の成功は、多面体遺伝子の不活性化および排除されない組換えウイルス、すなわち、多面体遺伝子によってコードされるタンパク質性コートを欠くウイルスの生成をもたらす。これらの組換えウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染するために使用され、挿入された遺伝子が発現される。例えば、Smith et al., J. Viral. (1983) 46:584;米国特許第4,215,051号を参照されたい。この発現系のさらなる例は、Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceにおいて見出すことができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系のいずれも使用され得る。アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合には、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列にライゲーションされ得る。この融合遺伝子は、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染宿主において生存可能な、ペプチドを発現可能である組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan & Shenk、PNAS (1984) 81:3655を参照されたい）。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが使用され得る（例えば、Mackett et al., PNAS (1982) 79:7415; Mackett et al., J. Viral. (1984) 49:857; Panicali et al., PNAS (1982) 79:4927）。他のウイルス発現系として、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含有するベクターを有する宿主細胞を提供する。宿主細胞に本発明のベクターをトランスフェクトまたは形質転換する、またはその他の形で入れる方法は、当技術分野で公知である。ベクターを有する細胞は、適当な条件下で培養されると、本発明のポリペプチドを産生する。上記のように、適した宿主細胞として、それだけには限らないが、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞および真菌細胞が挙げられる。例えば、適した宿主細胞として、それだけには限らないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
核酸構築物（例えば、ベクター）を含む宿主細胞を、適当な成長培地で成長させる。本明細書で使用される場合、用語「適当な成長培地」とは、細胞の成長に必要な栄養分を有する培地を意味する。本発明の組換えによって産生されたポリペプチドは、当技術分野で公知の技術を使用して培養培地から単離され得る。
本発明のポリペプチドの組換え産生のために使用されるベクターおよび細胞の具体例は、以下の実施例に示される。
（実施例１）
タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ発現、精製および線維集合
Ｐ２１３Ｌ変異を有するタウ−４４１（２Ｎ４Ｒ）の残基２４４〜３７２に対応するヒトタウＫ１８Ｐ３０１Ｌ断片を、タウ−ＭＴＢＲについて記載されたとおりに発現させ、精製した（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol, 426:2500-19）。２ｍＭ ＤＴＴを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０バッファー中の４０μＭのタウＫ１８Ｐ３０１Ｌ単量体に、４０μＭの低分子量ヘパリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することおよび３７℃で３日間インキュベートすることによって、タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維を集合させた。線維形成は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）によって確認した。
（実施例２）
Ａβ線維集合
Ａβ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、Ｎトランケート型Ａβ１１−４２（Ｂａｃｈｅｍ）、Ａβ１１−４２−Ｐｙｒｏ（ＡｎａＳｐｅｃ）、Ａβ３−４２−Ｐｙｒｏ（ＡｎａＳｐｅｃ）およびＡβ１−４２−Ｅ２２Ｑ（ＡｎａＳｐｅｃ）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解し、透明溶液が生じるまで室温で２４時間インキュベートした。ペプチド溶液を、真空下で１時間乾燥させた。Stine et al., 2003によって記載されたとおりに線維を集合させた。１００マイクログラムのＡβペプチドを、４０μＬのＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ ＨＣｌ溶液で１１４０μＬに希釈し、５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。線維形成は、ＴｈＴによって確認した。
（実施例３）
ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質の作製
対照足場ＰＢ１２０の部位特異的な変異誘発を、ＧＡＩＭドメインの内溝に面するβ鎖において実施した（図１Ａ）。これらのβ鎖、Ｎ１ドメイン中の４および５ならびにＮ２ドメイン中の９および１０は、閉じた状態のＧＡＩＭにおいてドメイン間相互作用を促進し、ＧＡＩＭ中のアミロイド結合モチーフと一部重複するとこれまでに示されている（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol、426:2500-19）ＴｏｌＡ結合部位の露出を防ぐ（Hoffman-Thoms et al. (2013) J Biol Chem、288:12979-91）。さらに、Ｎ１−Ｎ２ドメイン集合に関与するＮ２−ヒンジ領域中の部位およびＦ線毛結合にとって重要なＮ２中の特定の領域を変異させて（Weininger et al. (2009) PNAS、106:12335-40; Deng and Perham (2002) J Mol Biol、319:603-14）、ファージ感染の際にＧＡＩＭアミロイド結合活性がその機能を変換する方法を調べた。
ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造業者の指示に従って使用して発現させた。タンパク質の精製を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中のＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標） ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、それに続いて、ＡＫＴＡ（商標）Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステムを使用する２０ＣＶにわたるｐＨ４．０からｐＨ３．６への２０ｍＭ酢酸ナトリウムでの勾配溶出によって実施した。融合タンパク質をＤ−ＰＢＳ ｐＨ７中で透析し、フィルター滅菌した（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＭＣスピンカラム、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、それに続くＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）染色溶液（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いるＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルシステムによってタンパク質純度を解析した。さらに、ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＵＨＰＬＣ集束システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷ ＸＬ、７．８ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ、５μＭカラム（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）を使用し、分析用ＳＥＣを使用して、ＧＡＩＭ ＩｇＧ−融合体の純度を評価した。各試料について、７．５μｇのタンパク質をＳＥＣカラムに注入し、０．５ｍＬ／分の流速でＤ−ＰＢＳ移動相において分離を実施した。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）７ソフトウェアを使用してピーク純度を解析した。ＡＴＵＭ によってＧＡＩＭ ＩｇＧ−融合体バリアントを合成した。
（実施例４）
ＧＡＩＭ二量体の作製
３７℃で２時間、免疫グロブリンヒンジで融合体を特異的に切って、２つのジスルフィド結合によって連結されたＧＡＩＭ二量体をもたらすＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）（ＩｄｅＳ）酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を使用して、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体からＧＡＩＭ二量体を生成した（図１Ｃ）。切断後、製造業者のプロトコールに従ってＣａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅによってＦｃから分離した。ＧＡＩＭ二量体の純度は、ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファーで分離されたＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ゲルシステムで確認した。ＧＡＩＭ二量体（０．５μＭ）を、漸増濃度のグアニジン（Ｓｉｇｍａ）を有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０中、２５℃で２時間インキュベートした。蛍光を、１０ｍｍセル中、２８０ｎｍで励起後３１０ｎｍおよび３４０ｎｍで、ならびに２９５ｎｍで励起後３６０ｎｍで測定した。グアニジン塩酸濃度に対する蛍光発光の線形依存を仮定する２つの状態のフォールディングモデルを使用してデータを解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの予測された分子サイズおよびＦｃ断片のクリアランスを確認した後、タンパク質を、アンフォールディング研究に付した。
（実施例５）
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ結合アッセイによってモニターされたＧＡＩＭの熱的アンフォールディング
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ結合アッセイを実施して、ＧＡＩＭドメイン分離およびＮ２ドメインの安定性をモニターした。ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅは、水溶液中で折り畳まれたＧＡＩＭのクローズドコンフォメーションに不十分に結合する。ＧＡＩＭの２つのドメインが解離し、疎水性残基が露出すると、色素が露出した疎水表面に結合し、蛍光の増加を示す。９６ウェルプレートにおいて、ＰＢＳ中１マイクロモル濃度のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を、×２０過剰のＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｓ−６６５０）と混合し、密閉した。０．２４℃／分の速度で２０℃から９５℃に温度を連続増加させることによってＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＲＴ−ＰＣＲにおいて、熱的アンフォールディングをモニターした。励起は、４６５ｎｍに、発光を５８０ｎｍに設定し、１の融解係数、１０のクオンツ係数（quant factor）および２秒間の最大積分時間とした。蛍光シグナルの任意単位を、記録し、０〜１００のスケールに対して正規化した（Layton and Hellinga, 2011）。
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ結合によってモニターされたＧＡＩＭ単量体の熱的アンフォールディングは、４３℃の付近でのドメイン開口およびＮ２アンフォールディング転移に対応する単一転移を示した（図４Ａ〜４Ｂ）。実施例４に従って得られたＧＡＩＭ二量体は、溶液中の単量体と同一の融解プロファイルを示したのに対し、溶液中のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、熱的アンフォールディングの際に３つの別個の転移を示した（図４Ａ〜４Ｂ）。ＧＡＩＭ単量体および二量体においてみられるように（図４Ｂ）、第１の転移、Ｔｍ１は、４４℃付近で生じた。６４℃および８１℃の２つの追加の転移は、Ｆｃドメインアンフォールディング転移と同様である（Traxlmayr et al., 2012, Biochim Biophys Acta, 1824:524-529）。ＧＡＩＭ特異的Ｔｍ１を比較することによって、ＧＡＩＭおよびＦｃドメインは、独立したフォールディングドメインのままであり、キメラ分子中に新規構造要素は生成しないことが示された。
（実施例６）
ＧＡＩＭは、ＩｇＧ融合二量体でその天然コンフォメーション安定性を保持する
ＩｇＧ融合体中のＧＡＩＭのコンフォメーション安定性を、内部蛍光によるＧＡＩＭ二量体のグアニジン塩酸（ＧｕＨＣｌ）誘導性アンフォールディングを使用して調べた。ＧＡＩＭ二量体を実施例４に記載されたとおりに作製し、０、２および５Ｍ ＧｕＨＣｌ溶液中、２５℃で２時間平衡化した。２９５ｎｍでのＴｒｐ残基の選択的励起は、０と２Ｍ濃度の間でＧＡＩＭ二量体蛍光強度の最小変化を示し、発光λｍａｘ（３４５ｎｍ）に変化はなかった（図５Ａ）。５Ｍ ＧｕＨＣｌで、Ｔｒｐ蛍光は、１５ｎｍだけ赤色移動し（λｍａｘ３６０ｎｍ）、蛍光強度は、０および２Ｍ試料の両方よりも有意に高かった。次いで、ＧＡＩＭ二量体を２８０ｎｍで励起し（ＴｒｐおよびＴｙｒ残基）、蛍光発光スペクトルを記録した（図５Ｂ）。３４０ｎｍでの蛍光発光強度は、０および２Ｍ ＧｕＨＣｌの間で低下し、次いで、５Ｍ ＧｕＨＣｌで同様のマージンだけ増加した。同様のスペクトル変化はまた、ｇ３ｐにおいても観察され（Martin and Schmid, 2003, J Mol Biol、328:863-75）、これは、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体バリアント中のＧＡＩＭは、天然ｇ３ｐ中のＧＡＩＭの天然コンフォメーション安定性を保持していたことを示す。
本発明者らは、ＧｕＨＣｌの濃度の範囲で３１０、３４０および３６０ｎｍで蛍光発光強度を記録することによってＧＡＩＭ二量体の詳細な変性プロファイルを作製した。ＧＡＩＭ二量体は、２８０ｎｍで励起した場合に３４０ｎｍで二相性変性プロファイルを示した（図５Ｃ）。第１の転移は、１〜２Ｍ ＧｕＨＣｌの間で生じたが、次のものは２〜３Ｍ ＧｕＨＣｌの間で生じた。次いで、本発明者らは、３１０ｎｍ（励起２８０ｎｍ）および３６０ｎｍ（励起２９５ｎｍ）変性プロファイルを、２つの状態のタンパク質アンフォールディングモデルにフィッティングし（図５Ｄ〜５Ｅ）、それぞれ、１．５Ｍおよび２．６Ｍ ＧｕＨＣｌでＮ２およびＮ１ドメイン変性転移を算出した。１．５Ｍ ＧｕＨＣｌでの第１の転移は、２つのドメインＮ１およびＮ２の分離ならびにより安定ではないＮ２ドメインの同時アンフォールディングを表す。第２の転移は、２．６Ｍ ＧｕＨＣｌでのより安定なＮ１ドメインのアンフォールディングを表す。これらの値は、ｇ３ｐにおけるこれまでに報告された変性転移に対応する（Martin and Schmid, 2003, J Mol Biol, 328:863-75）。したがって、これらのデータは、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体中のＧＡＩＭ二量体中の各ＧＡＩＭが、独立したフォールディングユニットを形成し、繊維状ファージ由来のｇ３ｐ先端タンパク質と同様のコンフォメーションをとることを示す。
（実施例７）
ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、Ａβおよびタウ線維と結合する
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中のウェルあたり５０ｍＭ炭酸バッファー、ｐＨ９．６中の５０マイクロリットルのＡβ線維（０．８μＭ）またはタウＫ１８Ｐ３０１Ｌ線維（１μＭ）を添加し、４℃で１６時間インキュベートした。ウェルをＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回、ＤＰＢＳで２回洗浄し、それに続いて、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温で１．５時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を、示された濃度で高濃度のＰＢＳ−Ｔ（１４．７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８０．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、２７ｍＭ ＫＣｌ、１．３８Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ）に添加し、３７℃で２時間インキュベートし、それに続いて、ＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中で３回およびＤＰＢＳで３回洗浄した。０．２％ゼラチンを含有するＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で１：５０００希釈したヒト特異的Ｆｃ−ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００８）を、３７℃で４５分間添加した。ＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中で２回洗浄し、ＤＰＢＳ中で２回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてシグナルを発生させ、０．２５Ｎ ＨＣｌを添加することによって反応を停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００ ＰＲＯプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を記録した。
ＥＬＩＳＡによって、ＧＡＩＭの内溝に面するＮ１およびＮ２残基中の変異のほとんどは、Ａβ１−４２線維結合に影響を及ぼすとわかった（図６Ａ）。変異したＧＡＩＭバリアントの結合活性は、０．７ｎＭ〜１７５ｎＭ ＥＣ５０の範囲であり、ｆＡβ４２への結合親和性の２５０倍を超える変化に相当した。結合有効性（ＥＣ５０）と第１の融解転移（Ｔｍ１）の間には、強力な相関（Ｐ値１０−４、ｒｓ＝０．７０３）があった。Ｔｍ１の低下は、結合が増加したＧＡＩＭのよりオープンなコンフォメーションを表し、より高いＴｍ１を有する安定化されたバリアントは、その結合活性を失う傾向がある。これは、ドメイン間相互作用が弱められると、ＧＡＩＭ中のアミロイド線維結合モチーフが露出することを示唆し、ＧＡＩＭ結合が温度依存性であることを示すこれまでのデータと一致する（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol、426:2500-19）。
ｆＡβ４２に対する結合活性の変化が、他のアミロイドタンパク質へ移るかどうかを見分けるために、バリアントのサブセットを、タウの微小管結合領域から形成されたアミロイド線維への結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。ｆＡβ４２およびｆタウについてＧＡＩＭ−Ｉｇバリアントの結合活性（ＥＣ５０）を比較すること（Ｐ値１０−４、ｒｓ＝０．８７８；図６Ｂ）によって、２種の異なるアミロイドについてＧＡＩＭ−Ｉｇの結合活性において緊密な相関が示された（Ｐ値１０−４、ｒｓ＝０．８６２）。
（実施例８）
安定化されたＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質にわたるオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質の優れた結合
Ｎ２ドメインを安定化し、Ｎ１ドメインとのより強力な相互作用を支持するＧＡＩＭ中のいくつかの変異は、アミロイド結合の減少につながった。Ｑ１５６ＧＴＤＰＶＫ１６２ループ（配列番号７）を、ＱＧＧＫ（配列番号１０）で置換することによるＮ２ドメインにおけるプロリン含有ループの排除によって、Ｔｍ１が３．６℃だけ上昇し、ｆＡβ４２結合の１８倍の喪失をもたらした（図７Ａ）。同様に、Ｆ１３５ＱＮＮ１３８（配列番号５）のＦＱＧＮ（配列番号８）への、およびＲ１４３ＱＧＡ１４６（配列番号６）のＶＮＧＶ（配列番号９）へのアミノ酸置換は、Ｎ２（Ｔｍ１）をそれぞれ１．８℃および２．５℃だけ安定化した。これらの安定化バリアントは、ＧＡＩＭ足場と比較してｆＡβ４２結合活性の低減を示した（図７Ａ）。同様に、Ｎ２ヒンジサブドメインおよびＮ１の相互作用を安定化するＱ１２８Ｈ変異を導入することによって、線維結合が減少した（図７Ａ）。Ｑ１２８Ｈは、わずかに１．４倍の増加を示したが、Ｎ２ドメイン中のＴ１、Ｔ２またはＴ３の置換は、全てコラーゲンへの非特異的結合を低減した（図９）。このような変異体は、ＧＡＩＭバリアントのアミロイド結合活性の効力とその安定性の間の逆相関を示す。
ＧＡＩＭのよりオープンなコンフォメーションを作出するために、Ｎ１中のＤ２４ＤＫＴＬＤ２９（配列番号３）ループ（図３Ａ）を、繊維状ファージＩＦ１由来の相同配列ＥＧＤＳ（配列番号４）で置き換え、Ｎ２安定化変異（例えば、図３Ｃにおいて示される１つまたは複数のターン／ループでの）と組み合わせて試験した。推定されるオープンな、Ｎ２安定化されたＧＡＩＭバリアントを、タンパク質品質およびアミロイド結合活性について試験した。全てのオープン安定化バリアントは、線維結合活性の改善を示し、ＥＣ５０＜１．５ｎＭを有し；より露出した、到達可能なアミロイド線維結合部位と一致する（図７Ｂ）。１つの例外は、ＥＧＤＳ（配列番号４）バリアントであり、組み合わされた３つのＮ２安定化変異の全て（Ｆ１３５ＱＧＮ１３８、Ｖ１４３ＮＧＶ１４６およびＱ１５６ＧＧＫ１６２）（それぞれ、配列番号８、９、１０）を含有する超安定化Ｎ２を有し（ＰＢ１１３；配列番号１７；Ｔｍ１＝５２．７℃）、ｆＡβ４２結合活性の喪失をもたらす（図７Ｂ）。これは、ドメイン内相互作用を導入することまたはＮ２ドメインを過剰に安定化することのいずれかによる、ＧＡＩＭ中のアミロイド相互作用部位（複数可）をマスクするＮ２における主要な構造変化による可能性がある。線維結合が増加したオープン安定化バリアントは、Ｔｍ１およびｆＡβ４２結合間の相関を失い、これは、これらのバリアントにおけるアミロイド結合部位（複数可）およびＮ２安定性のかい離（uncoupling）を示唆する。全てのＥＧＤＳ−Ｎ２（配列番号４として開示される「ＥＧＤＳ」）安定化バリアントは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって良好なタンパク質品質を示し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単量体と示された。さらに、ＳＥＣによって保持時間のシフトがあり、これは、よりオープンなＧＡＩＭコンフォーマー分子をさらに示した。
（実施例９）
ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、多様な形態を有する複数のアミロイドを標的とする
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を、種々な種類およびコンフォメーションのＡβ凝集体と会合する能力について試験した。種々の改変Ａβペプチドを線維化し、これらの凝集体へのＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の結合親和性を測定した。Ｎトランケート型Ａβ１１−４２、Ａβ１１−４２−Ｐｙｒｏ、Ａβ３−４２−ＰｙｒｏおよびＡβ１−４２−Ｅ２２Ｑ−Ｄｕｔｃｈ変異（Levy et al, 1990; Van Broeckhoven et al, 1990）を、Ａβ４２と同一条件下で凝集させ、ＴｈＴによって（図８Ａ〜８Ｄ）、およびＴＥＭによって（示されていないデータ）線維形成を検証した。これらのペプチドを使用して形成された凝集体は、極めて多様な形態を示した。例えば、ｐｙｒｏ−ｇｌｕ３−４２は、その構造にいくつかの屈曲を有する線維を形成し、Ｅ２２Ｑバリアントは、滑らかな長線維を形成し、１１〜４２ペプチドは、いくつかの短線維を形成する。ＥＬＩＳＡによって、オープン安定化バリアントＰＢ１０８および足場ＰＢ１２０の両方とも、これらの線維と会合するとわかった。ＰＢ１０８は、ＰＢ１２０と比較して約２０倍改善された種々の凝集体への結合、ＥＣ５０ ０．９〜１．９ｎＭを示した（図８Ａ〜８Ｄ）。同様に、他の試験されたオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体について、優れた結合が観察された（表２）。
Figure 2021527407
Figure 2021527407
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の、種々な種類およびコンフォメーションのアミロイドタンパク質と結合する能力は、表２および３にさらに示されている。例えば、表２および３の両方とも、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のＡβ４２との、およびタウＫＬとの低いナノモル濃度の親和性での結合を示し、表３は、形態的に多様な免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）およびトランスサイレチン（ＴＴＲ）凝集体との低いナノモル濃度の親和性でのその結合をさらに実証する。これらのデータは、対照足場と比較して多様な一群のアミロイド線維にわたる優れた標的化を示し、ＧＡＩＭがＡβ４２線維において中央およびＣ末端配列と会合することを示すこれまでのＮＭＲ研究と一致する（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol, 426:2500-19）。
（実施例１０）
ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、アミロイドタンパク質と特異的に結合する
非特異的結合を除外するために、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を高濃度（１．８μＭ、ｆＡβ４２のような真の基質のＥＣ５０よりも１００倍高い）で、コラーゲンのような他の線維性種とのオフターゲット結合について試験した。Ｄ−ＰＢＳ中の、ウェルあたり２２５ナノグラムのヒトコラーゲン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ５４８３）を、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、３７℃で１６時間固定化し、それに続いて、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中、３７℃で１時間ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体をインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中３×５分の洗浄を行った。ヒト特異的Ｆｃ−ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００８）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中で１：５０００で３７℃で４５分間添加した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中３×５分の洗浄およびＰＢＳ中２×５分の洗浄を行った。ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いてシグナルを発生させ、０．２５Ｎ ＨＣｌを添加することによって反応を停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００ ＰＲＯプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を記録した。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、ＥＬＩＳＡによって、非アミロイド基質と最小の結合しか示さなかった（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol, 426:2500-19）。
（実施例１１）
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、Ａβ線維の増強されたリモデリングを示す
リモデリングアッセイを、低保持微量遠心管（low retention microfuge tube）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ０２−６８１−３２０）中で実施した。これらのアッセイにおいて使用したバッファーは、微生物成長を防ぐために０．０５％ナトリウムアジドを含有する。いずれの試料においてもプロテアーゼ混入がないことを確かめるために、全てのリモデリングされた複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、何らかの脱凝集について調べた。＜１μＭ線維を使用するアッセイについては、ウエスタンブロット解析を使用してタンパク質の品質を代わりに確認した。
Ａβ４２線維（２．５μＭ）をＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体バリアントと共にまたは伴わずに３７℃で３日間共インキュベートした。次いで、複合体のアリコートを、様々な濃度の尿素と共にインキュベートした。尿素中の複合体のＴｈＴ蛍光を尿素濃度に対してプロットした。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体処置を全く施していない線維と比較した、固定尿素濃度でのリモデリング効率をＴｈＴ蛍光の喪失パーセントとしてプロットした。
種々なＡβ４２線維結合効力を有するＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体を選択して、リモデリング効率が結合効力およびオープンコンフォメーション状態に依存しているかを調べた。図１０Ａは、同一条件および濃度下でＡβ４２線維と共にインキュベートした種々なＧＡＩＭ融合体のリモデリング効率を示す。低いナノモル濃度のｆＡβ４２結合を有するオープン安定化バリアントは、リモデリング活性の２倍〜３倍の増加を示し、対照足場（３５％）と比較して８３％の平均リモデリング活性を有した。図１０Ｂは、変更されたｆＡβ４２結合とリモデリング活性の間の正の相関を示し、その結果、優れたＡβ結合を有するＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体はまた、優れたリモデリング活性も示す。
図１０Ａ〜１０Ｃならびに透過型電子顕微鏡データ（実施例１３；図１０Ｄを参照されたい）は、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体が、線維状構造物に単に固着すること、およびそれをマスクすることとは対照的に、アミロイド線維をリモデリングして、線維状構築物の喪失を引き起こすことをさらに実証する。例えば、漸増濃度の尿素中でインキュベートするが、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体に曝露されない場合には、Ａβ４２線維は、変性に抵抗し、ＴｈＴ蛍光によって測定されるように１Ｍ尿素中で１０％未満の構造変化しか示さない（図１０Ｃ）。より高い尿素濃度では、ＴｈＴ蛍光は、劇的に低下し、これは、線維状構造物の喪失を示唆する。対照的に、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の化学量論未満の量で処置された線維は、１Ｍ尿素で３０〜９０％低減したＴｈＴ結合を示し始めた。この知見は、ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体が、線維状構造物と結合し、ＴｈＴと結合できない状態へ変更することおよびＧＡＩＭリモデリング活性は異なるＧＡＩＭ Ｉｇ−融合体間で様々であることを示唆し、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、高いリモデリング活性を示している。
（実施例１２）
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ線維の増強されたリモデリングを示す
タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維をＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体と共インキュベートすることによってリモデリングアッセイも実施して、凝集体のリモデリングが、アミロイドタンパク質にとって一般的であることを実証した。
リモデリングアッセイを、低保持微量遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ０２−６８１−３２０）中で実施した。これらのアッセイにおいて使用したバッファーは、微生物成長を防ぐために０．０５％ナトリウムアジドを含有する。いずれの試料においてもプロテアーゼ混入がないことを確かめるために、全てのリモデリングされた複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、何らかの脱凝集について調べた。＜１μＭ線維を使用するアッセイについては、ウエスタンブロット解析を使用してタンパク質の品質を代わりに確認した。
ｆＡβ４２線維とは異なり、タウ−ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維は、低濃度尿素溶液に容易に溶解する。したがって、タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌに対するＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体のリモデリング効率は、サルコシル溶解度アッセイを使用して調べた。タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ線維（１μＭ）を、ＧＡＩＭ−Ｉｇ−融合体バリアントと共にまたは伴わずに３７℃で５日間共インキュベートした。線維および複合体を１％サルコシルと共にまたは伴わずに１５分間インキュベートし、１００，０００ｇで３０分間遠心沈殿させた。各試料から得た上清を注意深く回収し、４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に載せた。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、タウＫ１８Ｐ３０１Ｌについて探索した。Ｂｉｏｒａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（商標）システムを使用してゲルバンドを定量することによってリモデリングパーセントを算出した。
タウ−Ｋ１８Ｐ３１０Ｌを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで集合させた線維（ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体に対して曝露されていない）は、１％サルコシルと共にインキュベートされた場合に溶解に対して耐性を示した。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体処置タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維は、１％サルコシルに未処置線維よりも容易に溶解し（図１１Ａ）、これは、これらの線維もまた、ｆＡβ４２のようにリモデリングされ得ることを示す。様々な濃度のＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体と共にインキュベートすると、これらの線維は、濃度依存性に溶解した（図１１Ｂ）。
ＰＢ１２０のリモデリング効率を、オープン安定化ＧＡＩＭ ＩｇＧ融合体のリモデリング効率と比較した。ＰＢ１１３、感染力の低減した、超安定化、ジスルフィド不含ＧＡＩＭ（Kather et al., 2005, J Mol Biol, 354:666-78）は、Ａβ１−４２またはタウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維に対して結合活性を有さず（データは示さず）、陰性対照として加えた。オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＰＢ１２０と比較して増強されたリモデリング活性を示したのに対し（図１１Ｂ）、ＰＢ１１３は、リモデリング活性を有していなかった（図１１Ａ）。
本発明者らは、ＧＡＩＭ融合体が、試料と共インキュベートした場合に、タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維をリモデリングし、可溶性タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ種を放出するかどうかを調べた。強力なリモデリングをもたらすＧＡＩＭ融合体濃度（例えば、１０〜２５０ｎＭ）では、サルコシル処置に付されていなかった複合体の上清中に可溶性種は見られず（図１１Ａ）、これは、ＧＡＩＭ融合体と結合する際に、リモデリングされた材料が、可溶性タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ種または単量体を遊離しないことを示唆する。
（実施例１３）
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、アミロイド線維に線維状構築物を喪失させる
Ａβ１−４２線維（１５μｌの２０μＭ試料）を、炭素コーティングされた銅グリッド（ＴｅｄＰｅｌｌａカタログ番号０１８４４−Ｆ）に適用した。次いで、試料を０．５ｍｌの水で穏やかに洗浄し、反転し、２％酢酸ウラニル溶液の液滴上に浮かべた。３０秒後、グリッドを取り出し、グリッドの過剰の液体を、濾紙を使用してグリッドのエッジから吸い上げて除くことによって乾燥させた。ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｓｐｉｒｉｔ ＴＥＭを使用して、線維を画像化した。図１０Ｄは、化学量論未満のオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体と共にインキュベートされたＡβ４２線維の代表的なＴＥＭ画像を示す。Ａβ４２線維は、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体に曝露されると、その線維状構築物を失う（図１０Ｄ）。同様に、ＴＥＭ解析は、タウ−Ｋ１８Ｐ３０１Ｌ線維が、オープン安定化 ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体と共インキュベートされるとその特徴的な線維状コンフォメーションを失うことを示す（図１１Ｃ）。
（実施例１４）
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、アミロイド凝集の阻害の増加を示す
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合タンパク質を、Ａβ４２単量体と共に３７℃で１０時間共インキュベートすることによる集合阻害活性について試験した。アミロイド線維形成をＴｈＴ蛍光によって追跡し、ＧＡＩＭを伴わない、ならびに陰性対照ＰＢ１１３の存在下での線維形成と比較した。
１００マイクログラムのＨＦＩＰ処置Ａβ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）単量体試料を、８０μｌ ＤＭＳＯに溶解し、ピペッティングによって完全に混合し、ボルテックス処理し、５．４ｍＬ Ｄ−ＰＢＳで４．０４μＭの最終Ａβ１−４２濃度に希釈した。ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体試料をＰＢＳで１０、２．５、０．６３および０．１６μＭの中間保存溶液に希釈した。８０マイクロリットルのＡβ１−４２単量体溶液を、黒色丸底９６ウェルプレート（ＬＶＬ、カタログ番号２２５．ＬＳ．ＰＰ）の各ウェルに分配した。各ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体保存溶液の１０マイクロリットルを、Ａβ１−４２を含有するウェルに添加し、それに続いて、各ウェルあたり、３．２μＭのＡβ１−４２および３．３μＭのＴｈＴの最終濃度に対して１０μｌ ＴｈＴ（ＰＢＳ中３３μＭ）を添加した。プレートを透明フィルムで密閉し、４３０／４８５ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）でのＴｈＴ蛍光を、３７℃でインキュベートし、２０分毎に３秒の垂直振盪を行いながらＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００ ＰＲＯプレートリーダーにおいて２０分毎に１４時間記録した。各ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体濃度のＡβ４２凝集体のパーセンテージを、非処置Ａβ４２ウェル（陽性対照ウェル）に対して算出した。
オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、示された濃度で１０時間添加した場合に用量依存性集合阻害を示した（図１２Ａ）。オープン安定化融合体は、対照足場ＰＢ１２０と比較して増加した集合阻害活性をさらに示した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。例えば、２５０ｎＭで、代表的なオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体ＰＢ１０８およびＰＢ１１６は、ＰＢ１２０と比較して、線維形成のブロッキングにおいて４０〜２０％の増加を示した（図１２Ｂ）。化学量論未満の量のオープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体の、アミロイド線維形成を強力に遮断する能力は、融合体が、核生成依存性線維集合に関与する成長する線維またはシード中のコアβ鎖への結合によってアミロイド線維形成を遮断することを示唆する（Krishnan et al. (2014) J Mol Biol, 426:2500-19）。
同様に、オープン安定化ＧＡＩＭ−Ｉｇ融合体は、タウ線維に対して用量依存性集合阻害を示した（図１２Ｃ）。タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ集合反応は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０バッファー中の１０μＭのタウ単量体を、様々な濃度のＧＡＩＭ融合体（０〜５００ｎＭ）の存在下で、２μＭの低分子量ヘパリン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で３日間インキュベートすることによって設定した。集合反応物のＴｈＴ蛍光を、試料を、５μＭ ＴｈＴ溶液で１μＭに希釈することによって記録した。タウＫ１８Ｐ３０１Ｌ集合に対するＧＡＩＭの阻害効果は、ＧＡＩＭ融合体を有さないタウＫ１８Ｐ３０１Ｌの集合と比較することによって算出した。
全長タウまたはＭＴＢＲもしくはＫ１８などのトランケート型配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ線維集合は、核生成およびその後の集合を促進するために．ヘパリンの存在を必要とする。試験したＧＡＩＭ融合体は、ヘパリンの存在下でｆタウＫＬ集合を阻害した。さらに、オープン安定化ＧＡＩＭ融合体は、核生成を、ＰＢ１２０と比較して３倍〜５倍良好に遮断した（図１２Ｃ〜１２Ｄ）。総合して、これらの結果は、オープン安定化ＧＡＩＭ融合体は、Ａβおよびタウ経路上の中間体の両方と結合し、アミロイド凝集体の集合を阻害することを示す。
本発明の追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から明白であるか、または本発明の実践によって学習することができる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘した要素および組合せによって実現および達成される。前述の一般的説明および以下の詳細な説明はいずれも例示的で単なる説明に過ぎず、特許請求される本発明を制限しないと理解される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１６の開始アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、前記バリアントが：
ａ）任意のアミノ酸でのＴ５０の置換およびＨ５５Ｔ；
ｂ）Ｎ１３７Ｇ；
ｃ）Ｎ１４２Ａ；
ｄ）Ｒ１４３ＶおよびＱ１４４Ｎ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｔ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｋ；ならびに
ｅ）Ｑ１５６Ｖ、Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
Ｑ１５６Ｙ、Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ
から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とは異なり、前記バリアントが必要に応じて：
ｆ）ΔＭ１；または
ΔＭ１およびΔＡ２；ならびに
ｇ）システイン以外の任意のアミノ酸でのＮ３８の置換；または
システイン以外の任意のアミノ酸でのＮ３８の置換、およびシステイン以外の任意のアミノ酸でのＧ４０の置換；または
システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸でのＧ４０の置換
から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とはさらに異なるポリペプチド。
（項目２）
前記Ｔ５０置換が、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒからなる群から選択される、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記Ｔ５０置換がＴ５０Ｈである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記バリアントが、少なくともΔＭ１およびΔＡ２によって配列番号１６とは異なる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記バリアントが、少なくともＮ１３７Ｇおよび／またはＮ１４２Ａによって配列番号１６とは異なる、項目１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記バリアントが：
ａ）任意のアミノ酸でのＴ５０の置換、およびＨ５５Ｔ；ならびに
ｂ）Ｒ１４３ＶおよびＱ１４４Ｎ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｔ；または
Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｋ
から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とはさらに異なる、項目４に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記Ｔ５０置換が、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒからなる群から選択される、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記Ｔ５０置換がＴ５０Ｈである、項目７に記載のポリペプチド。
（項目９）
配列番号１６の前記バリアントが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択される、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１０）
免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記免疫グロブリン定常領域配列が、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
項目１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドおよびヒトＩｇＧのＦｃ部分から本質的になる、項目１１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
ａ）配列番号２９；
ｂ）配列番号３０；
ｃ）配列番号３１；
ｄ）配列番号３２；
ｅ）配列番号３３；
ｆ）配列番号３４；
ｇ）配列番号３５；および
ｈ）配列番号３６；
から選択されるアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって、
前記バリアントが、必要に応じて：
ｉ）ΔＭ１；または
ΔＭ１およびΔＡ２；ならびに
ｊ）ΔＫ４８５
から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットを有するポリペプチド。
（項目１５）
項目１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目１６）
アミロイドを低減させる、アミロイド形成を阻害する、アミロイド凝集を阻害する、または毒性オリゴマーを除去および／もしくはその形成を防止することを必要とする対象においてアミロイドを低減させる、アミロイド形成を阻害する、アミロイド凝集を阻害する、または毒性オリゴマーを除去および／もしくはその形成を防止する方法であって、前記対象に項目１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目１５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目１７）
前記アミロイドまたはオリゴマーが、アンドロゲン受容体；アポリポタンパク質ＡＩ；アポリポタンパク質ＡＩＩ；アポリポタンパク質ＡＩＶ；アポ血清アミロイドＡ；Ａβ；ＡＢｒｉ；ＡＤａｎ；アトロフィン−１；心房性ナトリウム利尿因子；アタキシン；カルシトニン；γ−クリスタリン；シスタチンＣ；フィブリノゲン；ゲルソリン；ハンチンチン；インスリン；膵島アミロイドポリペプチド；免疫グロブリンカッパ軽鎖；免疫グロブリンラムダ軽鎖；ケラトエピセリン；ケラチン；ラクタヘドリン；ラクトフェリン；リゾチーム；肺サーファクタントタンパク質Ｃ；メディン；歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質；プリオンタンパク質；プロカルシトニン；プロラクチン；セメノゲリンＩ；血清アミロイドＡ；スーパーオキシドジスムターゼＩ；β２−ミクログロブリン；ＴＡＴＡボックス結合タンパク質；タウ；トランスサイレチン；およびα−シヌクレインから選択されるタンパク質を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
アルツハイマー病；早期発症型アルツハイマー病；後期発症型アルツハイマー病；発症前アルツハイマー病；ＡＬアミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合；嗜銀顆粒性認知症；大動脈中膜アミロイドーシス；ＡｐｏＡＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス；心房アミロイドーシス；イギリス型／デンマーク型認知症；白内障；大脳皮質基底核変性症；逆まつげに関連する角膜アミロイドーシス；シスタチンＣプラーク関連疾患；シスタチンＣプラーク関連冠動脈疾患；シスタチンＣプラーク関連腎疾患；皮膚苔癬アミロイドーシス；ボクサー認知症；歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮症；石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病；レヴィー小体認知症；ダウン症候群；家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）；家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）；家族性イギリス型認知症；家族性デンマーク型認知症；家族性脳症；家族性地中海熱；フィブリノゲンアミロイドーシス；フィンランド型遺伝性アミロイドーシス；パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；前頭側頭葉認知症；ハレルフォルデン‐スパッツ病；血液透析関連性アミロイドーシス；遺伝性脳アミロイド血管症；アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血；遺伝性格子状角膜ジストロフィー；ハンチントン病；アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症；封入体筋炎；注射部位限局性アミロイドーシス；膵島アミロイドポリペプチドアミロイドーシス；リゾチームアミロイドーシス；多発性骨髄腫；筋強直性ジストロフィー；ニーマン・ピック病Ｃ型；神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患；パーキンソン病；末梢性アミロイドーシス；ピック病；下垂体プロラクチノーマ；脳炎後パーキンソニズム；プリオンタンパク質脳アミロイド血管症；プリオン媒介性疾患；クールー；クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）；致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）；スクレイピー；海綿状脳症；肺胞タンパク症；進行性皮質下グリオ−シス；進行性核上麻痺；老年性全身性アミロイドーシス；血清ＡＡアミロイドーシス；球脊髄性筋萎縮症；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）；亜急性硬化性全脳炎；全身性アミロイドーシス；家族性アミロイドーシス；野生型アミロイドーシス；神経原線維変化優位型認知症；およびタウオパチーから選択される疾患を処置する方法。
（項目１９）
前記疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記疾患がアルツハイマー病である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記疾患が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介性疾患である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
項目１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むオリゴヌクレオチド。
（項目２３）
前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４から選択される配列を含む、項目２２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）
前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２から選択される配列からなる、項目２２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２５）
項目２２から２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
（項目２６）
項目２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目２７）
昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、およびトランスジェニック動物細胞からなる群から選択される、項目２６に記載の宿主細胞。
（項目２８）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される、項目２７に記載の宿主細胞。
（項目２９）
アミロイドに結合するタンパク質を作製する方法であって、項目２５に記載のベクター中の核酸によってコードされるタンパク質を発現させるステップ、および前記発現されたタンパク質を単離するステップを含む方法。
（項目３０）
項目２５に記載のベクター中の核酸によってコードされるタンパク質を発現させ、前記発現されたタンパク質を単離することによって産出される、アミロイドに結合するタンパク質。
（項目３１）
項目２６〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することによって発現される、項目３０に記載のタンパク質。

Claims (31)

  1. 配列番号１６の開始アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、前記バリアントが：
    ａ）任意のアミノ酸でのＴ５０の置換およびＨ５５Ｔ；
    ｂ）Ｎ１３７Ｇ；
    ｃ）Ｎ１４２Ａ；
    ｄ）Ｒ１４３ＶおよびＱ１４４Ｎ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｔ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｋ；ならびに
    ｅ）Ｑ１５６Ｖ、Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
    Ｑ１５６Ｙ、Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
    Ｇ１５７Ｎ、ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ；または
    ΔＴ１５８、ΔＤ１５９、ΔＰ１６０、およびＶ１６１Ｇ
    から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とは異なり、前記バリアントが必要に応じて：
    ｆ）ΔＭ１；または
    ΔＭ１およびΔＡ２；ならびに
    ｇ）システイン以外の任意のアミノ酸でのＮ３８の置換；または
    システイン以外の任意のアミノ酸でのＮ３８の置換、およびシステイン以外の任意のアミノ酸でのＧ４０の置換；または
    システイン、トレオニン、もしくはセリン以外の任意のアミノ酸でのＧ４０の置換
    から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とはさらに異なるポリペプチド。
  2. 前記Ｔ５０置換が、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記Ｔ５０置換がＴ５０Ｈである、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記バリアントが、少なくともΔＭ１およびΔＡ２によって配列番号１６とは異なる、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 前記バリアントが、少なくともＮ１３７Ｇおよび／またはＮ１４２Ａによって配列番号１６とは異なる、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記バリアントが：
    ａ）任意のアミノ酸でのＴ５０の置換、およびＨ５５Ｔ；ならびに
    ｂ）Ｒ１４３ＶおよびＱ１４４Ｎ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｖ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｔ；または
    Ｒ１４３Ｖ、Ｑ１４４Ｎ、およびＡ１４６Ｋ
    から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットによって配列番号１６とはさらに異なる、請求項４に記載のポリペプチド。
  7. 前記Ｔ５０置換が、Ｔ５０Ｇ、Ｔ５０Ｈ、Ｔ５０Ｋ、およびＴ５０Ｒからなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記Ｔ５０置換がＴ５０Ｈである、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 配列番号１６の前記バリアントが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  10. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記免疫グロブリン定常領域配列が、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチドおよびヒトＩｇＧのＦｃ部分から本質的になる、請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 前記ヒトＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. ａ）配列番号２９；
    ｂ）配列番号３０；
    ｃ）配列番号３１；
    ｄ）配列番号３２；
    ｅ）配列番号３３；
    ｆ）配列番号３４；
    ｇ）配列番号３５；および
    ｈ）配列番号３６；
    から選択されるアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって、
    前記バリアントが、必要に応じて：
    ｉ）ΔＭ１；または
    ΔＭ１およびΔＡ２；ならびに
    ｊ）ΔＫ４８５
    から選択されるアミノ酸変化の１つまたは複数のセットを有するポリペプチド。
  15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  16. アミロイドを低減させる、アミロイド形成を阻害する、アミロイド凝集を阻害する、または毒性オリゴマーを除去および／もしくはその形成を防止することを必要とする対象においてアミロイドを低減させる、アミロイド形成を阻害する、アミロイド凝集を阻害する、または毒性オリゴマーを除去および／もしくはその形成を防止する方法であって、前記対象に請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  17. 前記アミロイドまたはオリゴマーが、アンドロゲン受容体；アポリポタンパク質ＡＩ；アポリポタンパク質ＡＩＩ；アポリポタンパク質ＡＩＶ；アポ血清アミロイドＡ；Ａβ；ＡＢｒｉ；ＡＤａｎ；アトロフィン−１；心房性ナトリウム利尿因子；アタキシン；カルシトニン；γ−クリスタリン；シスタチンＣ；フィブリノゲン；ゲルソリン；ハンチンチン；インスリン；膵島アミロイドポリペプチド；免疫グロブリンカッパ軽鎖；免疫グロブリンラムダ軽鎖；ケラトエピセリン；ケラチン；ラクタヘドリン；ラクトフェリン；リゾチーム；肺サーファクタントタンパク質Ｃ；メディン；歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質；プリオンタンパク質；プロカルシトニン；プロラクチン；セメノゲリンＩ；血清アミロイドＡ；スーパーオキシドジスムターゼＩ；β２−ミクログロブリン；ＴＡＴＡボックス結合タンパク質；タウ；トランスサイレチン；およびα−シヌクレインから選択されるタンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. アルツハイマー病；早期発症型アルツハイマー病；後期発症型アルツハイマー病；発症前アルツハイマー病；ＡＬアミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合；嗜銀顆粒性認知症；大動脈中膜アミロイドーシス；ＡｐｏＡＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス；ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス；心房アミロイドーシス；イギリス型／デンマーク型認知症；白内障；大脳皮質基底核変性症；逆まつげに関連する角膜アミロイドーシス；シスタチンＣプラーク関連疾患；シスタチンＣプラーク関連冠動脈疾患；シスタチンＣプラーク関連腎疾患；皮膚苔癬アミロイドーシス；ボクサー認知症；歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮症；石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病；レヴィー小体認知症；ダウン症候群；家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）；家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）；家族性イギリス型認知症；家族性デンマーク型認知症；家族性脳症；家族性地中海熱；フィブリノゲンアミロイドーシス；フィンランド型遺伝性アミロイドーシス；パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；前頭側頭葉認知症；ハレルフォルデン‐スパッツ病；血液透析関連性アミロイドーシス；遺伝性脳アミロイド血管症；アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血；遺伝性格子状角膜ジストロフィー；ハンチントン病；アイスランド型遺伝性脳アミロイド血管症；封入体筋炎；注射部位限局性アミロイドーシス；膵島アミロイドポリペプチドアミロイドーシス；リゾチームアミロイドーシス；多発性骨髄腫；筋強直性ジストロフィー；ニーマン・ピック病Ｃ型；神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患；パーキンソン病；末梢性アミロイドーシス；ピック病；下垂体プロラクチノーマ；脳炎後パーキンソニズム；プリオンタンパク質脳アミロイド血管症；プリオン媒介性疾患；クールー；クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）；ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）；致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）；スクレイピー；海綿状脳症；肺胞タンパク症；進行性皮質下グリオ−シス；進行性核上麻痺；老年性全身性アミロイドーシス；血清ＡＡアミロイドーシス；球脊髄性筋萎縮症；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、またはＳＣＡ７）；亜急性硬化性全脳炎；全身性アミロイドーシス；家族性アミロイドーシス；野生型アミロイドーシス；神経原線維変化優位型認知症；およびタウオパチーから選択される疾患を処置する方法。
  19. 前記疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記疾患がアルツハイマー病である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記疾患が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介性疾患である、請求項１８に記載の方法。
  22. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むオリゴヌクレオチド。
  23. 前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４から選択される配列を含む、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２から選択される配列からなる、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
  25. 請求項２２から２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
  27. 昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、およびトランスジェニック動物細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の宿主細胞。
  29. アミロイドに結合するタンパク質を作製する方法であって、請求項２５に記載のベクター中の核酸によってコードされるタンパク質を発現させるステップ、および前記発現されたタンパク質を単離するステップを含む方法。
  30. 請求項２５に記載のベクター中の核酸によってコードされるタンパク質を発現させ、前記発現されたタンパク質を単離することによって産出される、アミロイドに結合するタンパク質。
  31. 請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することによって発現される、請求項３０に記載のタンパク質。
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