ES2960493T3 - Motivo de interacción amiloide general (GAIM) - Google Patents
Motivo de interacción amiloide general (GAIM) Download PDFInfo
- Publication number
- ES2960493T3 ES2960493T3 ES19739769T ES19739769T ES2960493T3 ES 2960493 T3 ES2960493 T3 ES 2960493T3 ES 19739769 T ES19739769 T ES 19739769T ES 19739769 T ES19739769 T ES 19739769T ES 2960493 T3 ES2960493 T3 ES 2960493T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- gaim
- amyloid
- polypeptide
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 66
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 60
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 197
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 188
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 183
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 181
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 177
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 109
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 43
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 33
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 claims description 31
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 20
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 18
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 claims description 18
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 17
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 17
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 17
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims description 16
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 16
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 15
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 claims description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 claims description 12
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 claims description 12
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 claims description 11
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 claims description 9
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims description 9
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 claims description 9
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 claims description 7
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 claims description 7
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 claims description 7
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 claims description 7
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 7
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 claims description 7
- 102200068707 rs281865211 Human genes 0.000 claims description 7
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002339 Frontotemporal Lobar Degeneration Diseases 0.000 claims description 6
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 5
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 5
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 claims description 4
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010016202 Familial Amyloidosis Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004878 Gelsolin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 claims description 4
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 claims description 4
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 claims description 4
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000018282 ACys amyloidosis Diseases 0.000 claims description 3
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 claims description 3
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 claims description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009093 Diffuse Neurofibrillary Tangles with Calcification Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 3
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 3
- 208000010577 Niemann-Pick disease type C Diseases 0.000 claims description 3
- 102100027069 Odontogenic ameloblast-associated protein Human genes 0.000 claims description 3
- 101710091533 Odontogenic ameloblast-associated protein Proteins 0.000 claims description 3
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 claims description 3
- 208000036757 Postencephalitic parkinsonism Diseases 0.000 claims description 3
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037550 Semenogelin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710089345 Semenogelin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 102100021398 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000007930 Type C Niemann-Pick Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 108700006666 betaIG-H3 Proteins 0.000 claims description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 3
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000002593 pantothenate kinase-associated neurodegeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000170 postencephalitic Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 claims description 3
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 claims description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002739 subcortical effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000027121 wild type ATTR amyloidosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017227 ADan amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023761 AL amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022385 ALys amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010001881 Alveolar proteinosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022099 Alzheimer disease 2 Diseases 0.000 claims description 2
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 claims description 2
- 102000007372 Ataxin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010032963 Ataxin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004321 Atrophin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000806 Atrophin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010011659 Cutaneous amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010016207 Familial Mediterranean fever Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004176 Gelatinous drop-like corneal dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032849 Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 101000775732 Homo sapiens Androgen receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 201000000194 ITM2B-related cerebral amyloid angiopathy 2 Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005531 Immunoglobulin Light-chain Amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 2
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 claims description 2
- 241000940612 Medina Species 0.000 claims description 2
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 108010007125 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007620 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Human genes 0.000 claims description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 claims description 2
- 206010044604 Trichiasis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 108010073614 apolipoprotein A-IV Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 2
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010011005 corneal dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 claims description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 claims description 2
- 208000017105 hereditary amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008319 inclusion body myositis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003775 lattice corneal dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015413 lichen amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 claims description 2
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030153 prolactin-producing pituitary gland adenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 claims description 2
- 201000003489 pulmonary alveolar proteinosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 claims description 2
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 claims 5
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 99
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 88
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 88
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 abstract description 45
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 13
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 5
- 101710192393 Attachment protein G3P Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710179596 Gene 3 protein Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 169
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 124
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 89
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 44
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 37
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 34
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 25
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 25
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 23
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 23
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 21
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 230000008859 change Effects 0.000 description 19
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 11
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 10
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 10
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- FPVVYTCTZKCSOJ-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol distearate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC FPVVYTCTZKCSOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102220497670 Leukotriene B4 receptor 1_N38A_mutation Human genes 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 6
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 5
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 5
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 101150054547 galM gene Proteins 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 5
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 5
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000350158 Prioria balsamifera Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- YNDIAUKFXKEXSV-CRYLGTRXSA-N florbetapir F-18 Chemical compound C1=CC(NC)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(OCCOCCOCC[18F])N=C1 YNDIAUKFXKEXSV-CRYLGTRXSA-N 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 208000007153 proteostasis deficiencies Diseases 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 3
- 238000012879 PET imaging Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 102200158871 rs33955330 Human genes 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 2
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000010291 Primary Progressive Nonfluent Aphasia Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 2
- 208000018642 Semantic dementia Diseases 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 2
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 2
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 102220094195 rs876660417 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007921 solubility assay Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- YNDIAUKFXKEXSV-NSCUHMNNSA-N 4-[(e)-2-[6-[2-[2-(2-fluoroethoxy)ethoxy]ethoxy]pyridin-3-yl]ethenyl]-n-methylaniline Chemical compound C1=CC(NC)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(OCCOCCOCCF)N=C1 YNDIAUKFXKEXSV-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010087614 Apolipoprotein A-II Proteins 0.000 description 1
- 102000009081 Apolipoprotein A-II Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091077621 MAPRE family Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000024571 Pick disease Diseases 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 208000014675 Prion-associated disease Diseases 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010001122 alpha(2)-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- PLOPBXQQPZYQFA-AXPWDRQUSA-N amlintide Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CSSC1)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PLOPBXQQPZYQFA-AXPWDRQUSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001507 asparagine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007697 cis-trans-isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 208000017004 dementia pugilistica Diseases 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 208000037957 feline spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a variantes del motivo de interacción amiloide general (GAIM) de la proteína del gen 3 del bacteriófago (g3p) y a sus proteínas de fusión. Las variantes de GAIM y las proteínas de fusión de la invención están parcial o totalmente desinmunizadas y demuestran una unión y especificidad superiores a una variedad diversa de proteínas amiloides, y exhiben una remodelación amiloide mejorada y una inhibición de la agregación amiloide. La presente invención se refiere además a ácidos nucleicos, vectores, células huésped y métodos para elaborar variantes de GAIM y proteínas de fusión de los mismos. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y métodos para aumentar la infectividad de bacteriófagos, métodos para detectar agregados amiloides y métodos para diagnosticar y/o tratar una enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Motivo de interacción amiloide general (GAIM)
Esta solicitud reivindica la prioridad respecto la solicitud provisional estadounidense n.° 62/685.757, presentada el 15 de junio de 2018, y la solicitud provisional estadounidense n.° 62/749.499, presentada el 23 de octubre de 2018.
La invención se refiere a polipéptidos que comprenden una variante del motivo de interacción amiloide general (GAIM) de la proteína del gen 3 del bacteriófago filamentoso (“g3p”, también conocida como “p3” o “pIN”) de manera que los polipéptidos están parcial o totalmente desinmunizados y demuestran potencia superior, estabilidad estructural superior y mayor especificidad de unión a proteínas amiloides con relación a la técnica anterior. Se abarcan constructos y moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos, células huésped transformadas con tales moléculas de ácido nucleico y métodos para fabricar tales polipéptidos de manera recombinante. Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones de diagnóstico y farmacéuticas que comprenden los polipéptidos dados a conocer en el presente documento, al uso de composiciones de diagnóstico para detectar agregados amiloides y/o diagnosticar una enfermedad asociada con proteína mal plegada y/o agregada, y al uso terapéutico y/o profiláctico de composiciones farmacéuticas para disminuir la carga de amiloide, prevenir la agregación, desagregar el amiloide o tratar o prevenir de otro modo una enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada, tal como enfermedades amiloides sistémicas y periféricas, enfermedades neurodegenerativas que incluyen tauopatías neurodegenerativas y encefalopatías espongiformes transmisibles (enfermedades asociadas a priones). Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de fusión y porciones de unión a amiloide de las mismas.
El bacteriófago g3p se une directamente a fibras amiloides, y la desagregación de amiloide mediada por bacteriófago (por ejemplo, remodelación) depende de esta etapa de unión inicial. Véase, por ejemplo, el documento WO 2013/082114 A1. Los inventores identificaron previamente una secuencia mínima de g3p requerida para la unión a amiloide, la desagregación de amiloide y/o la prevención de la formación de agregados de amiloide. Id. Esta secuencia mínima está abarcada por el motivo de interacción amiloide general (GAIM), que comprende los dominios N1 y N2 de g3p, y conduce a la generación de polipéptidos de g3p (incluidos mutantes, fragmentos, proteínas de fusión o composiciones farmacéuticas de los mismos) que son capaces de unirse a la proteína amiloide y/o desagregar proteínas amiloides. Véanse Id.; documento W o 2014/055515 A1. Los polipéptidos de g3p divulgados en los documentos WO 2013/082114 A1 y WO 2014/055515 A1 son eficaces para la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas con proteínas amiloides mal plegadas y/o agregadas. Id. Sin embargo, estos polipéptidos de g3p también comprenden epítopos de células T humanas que pueden provocar una respuesta inmune no deseada en los pacientes. Por tanto, se desarrollaron polipéptidos de g3p parcialmente desinmunizados, que comprenden mutaciones que eliminan hasta cuatro de los cinco epítopos de células T presentes en g3p nativo. Véase el documento WO 2014/193935 A1.
Adicionalmente, la producción recombinante en células animales de polipéptidos de g3p que se unen al amiloide, y que son útiles para la detección, el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de enfermedades o afecciones relacionadas con el amiloide, estaba limitada por la presencia de un posible sitio de N-glicosilación. Por tanto, se generaron polipéptidos de g3p mejorados, incluidos polipéptidos de g3p parcialmente desinmunizados, en los que el sitio potencial de N-glicosilación se eliminó mediante una o más mutaciones. Véase el documento WO 2016/090022 A8.
A pesar de estos avances, sigue existiendo la necesidad en la técnica de polipéptidos de g3p que sean más estables, potentes y específicos, así como también completamente o casi completamente desinmunizados.
La generación de polipéptidos con estos conjuntos de cualidades terapéuticas ha planteado hasta ahora un desafío significativo, al menos en parte debido a ciertas relaciones inversas en los polipéptidos de g3p: En primer lugar, los intentos anteriores de eliminar el epítopo 2 de células T, que se requiere para la desinmunización completa de un polipéptido de g3p, han dado como resultado constantemente una capacidad de unión a amiloide reducida. En segundo lugar, los intentos anteriores de aumentar la estabilidad de los dominios N1-N2 de GAIM también han provocado constantemente una actividad de unión a amiloide reducida. Por ejemplo, una variante de GAIM super estabilizada, PB113, muestra una escasa capacidad de unión a amiloide. En tercer lugar, la inestabilidad del dominio N2 genera interacciones promiscuas con sustratos distintos de amiloide como proteínas solubles, estructuras de glóbulos fundidos pegajosos y polímeros fibrilares distintos de amiloide, tales como colágeno y elastina. Por lo tanto, la desestabilización de N2 para aumentar la actividad de unión a amiloide sacrifica la especificidad, mientras que la estabilización de N2 para evitar la unión inespecífica sacrifica la unión a amiloide. De manera sorprendente, las tres relaciones inversas se superaron generando proteínas de fusión que comprendían variantes de GAIM y fusiones de las mismas en una conformación “abierta y estabilizada.”
A diferencia de la técnica anterior, los polipéptidos abiertos y estabilizados descritos en el presente documento demuestran potentes actividades de unión a amiloide y remodelación a través de una amplia gama de amiloides mientras mantienen la estabilidad proteica y la especificidad de unión. Por lo tanto, en algunos aspectos, la presente invención se refiere a variantes abiertas y estabilizadas de GAIM (GAIM), a proteínas de fusión GAIM-inmunoglobulina (GAIM-Ig) o a composiciones farmacéuticas de las mismas, que están al menos parcialmente desinmunizadas y tienen actividad de unión a amiloide, especificidad de unión a amiloide y actividad de remodelación de amiloide superiores. En algunos aspectos, estas variantes de GAIM abiertas y estabilizadas, proteínas de fusión GAIM-Ig o composiciones farmacéuticas de las mismas se desinmunizan completamente sin sacrificar la unión a amiloide potente y específica y sin sacrificar la estabilidad estructural. Las variantes de GAIM abiertas y estabilizadas y las fusiones GAIM-Ig descritas en el presente documento son capaces de acoplarse a y eliminar amiloides en cerebro y órganos periféricos y constituyen un nuevo conjunto de polipéptidos con capacidad superior para detectar, diagnosticar, prevenir, retrasar la aparición y/o tratar enfermedades asociadas con proteína amiloide mal plegada y/o agregada.
Objetivos y ventajas adicionales de la presente invención se exponen en parte en la descripción siguiente, y resultarán obvios a partir de la descripción, o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los objetivos y ventajas de la invención se realizarán y alcanzarán por medio de los elementos y combinaciones señaladas particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada que sigue son únicamente a modo de ejemplo y explicativas y no son restrictivas de la invención según se reivindica.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es una representación gráfica de la estructura terciaria de los dominios N1 y N2 de GAIM (mostrados usando la estructura 2G3P de PDB). Las cadenas p sometidas a mutagénesis dirigida a sitio se muestran en gris oscuro. Las flechas indican la ubicación de residuos polares en N1 y residuos hidrófobos en N2. La figura 1B es una representación gráfica de una fusión GAIM-Ig de la invención. La figura 1C es una representación gráfica de un dímero de GAIM.
La figura 2 representa resultados de estudios de intercambio de hidrógeno/deuterio (H/D) que muestran las secuencias de interacción con GAIM en fAp42.
La figura 3A compara porciones correspondientes de la secuencia de aminoácidos de la porción N1 de g3p del fago fd (SEQ ID NO: 1) y la porción N1 correspondiente de g3p del fago IF1 (SEQ ID NO: 2). El recuadro abierto representa, en la parte superior, los aminoácidos 23-28 (DDKTLD; SEQ ID NO: 3) de PB106 y el armazón de GAIM PB120 (derivado de PB106) y, en la parte inferior, la sustitución de EGDS (SEQ ID NO: 4) presente en las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas de la invención (EGDS = SEQ ID NO: 4). La figura 3B es una representación gráfica de la estructura terciaria de los dominios N1 y N2 de GAIM (mostrados usando la estructura 2G3P de PDB). El recuadro abierto en la figura 3B muestra la ubicación de SEQ ID NO: 3 en fd g3p. La figura 3C es una representación gráfica de tres bucles de plegado lento (también denominados “giros”) implicados en la estabilización del dominio N2. T1 =<Giro 1>(FQNN;<SEQ ID NO:>5);<T2 = Giro 2>(RQGA;<SEQ ID NO:>6);<T3 = Giro 3>(QGTDPVK- SEQ<|D NO: 7). Tal>como se demuestra más adelante, la eliminación de uno o más de T1, T2 o T3 mediante mutagénesis estabiliza el dominio N2. La figura 3D representa cambios en la unión y estabilidad basados en sustituciones de aminoácidos seleccionados de T50.
Las figuras 4A y 4B muestran datos representativos de experimentos de fusión térmica de una fusión GAIM-Ig en comparación con un dímero o monómero de GAIM. La fusión térmica se monitorizó mediante la unión de SYPRO® Orange. La primera transición, Tm1, se calculó mediante ajuste no lineal a partir de intensidades de fluorescencia normalizada.
Las figuras 5A y 5B representan espectros de emisión de fluorescencia de GAIM a 0 M de clorhidrato de guanidina (GuHCl) (líneas discontinuas), 2 M de GuHCl (líneas continuas) y 5 M de GuHCl (líneas de puntos) con excitación a 295 nm (figura 5A) y 280 nm (figura 5B). La figura 5C representa el despliegue en equilibrio de dímero de GAIM por GuHCl. La figura 5C muestra dos transiciones, la primera entre 1 M y 2 M de GuHCl y la segunda entre 2 M y 4 M de GuHCl. Las intensidades de fluorescencia relativa a 340 nm (excitación a 280 nm) se representaron gráficamente a diversas concentraciones de GuHCl. La figura 5D representa el despliegue del dominio N2 a 1,5 M de GuHCl. La figura 5E representa el despliegue del dominio N1 a 2,6 M de GuHCl.
Las figuras 6A y 6B representan el mapeo de residuos de GAIM que modulan la unión a amiloide. La figura 6A es una gráfica de dispersión que muestra la potencia de unión a fibra de Ap42 de variantes de GAIM que se correlacionan con Tm1 (coeficiente de correlación de Spearman = 0,703, p <0,0001). La figura 6B es una gráfica de dispersión que muestra la potencia de unión a fibra de ftau de variantes de GAIM que se correlacionan con Tm1 (coeficiente de correlación de Spearman = 0,878, p <0,0001). Las variantes con escasa unión a ftau se presentan como CE<50>= 1000 nM debido a la inexactitud en el ajuste de la curva para variantes que no alcanzan la saturación en el ELISA. Tanto para la figura 6A como para la figura 6B, el armazón PB120 de GAIM está representado por un triángulo gris y las variantes están representadas por círculos. Una disminución en Tm1 indica una conformación más abierta de GAIM, lo que da como resultado un aumento de la unión, mientras que las variantes estabilizadas con Tm1 más alta tienden a perder actividad de unión.
Las figuras 7A y 7B muestran la unión a amiloide para proteínas de fusión GAIM-Ig seleccionadas. La figura 7A compara la unión a amiloide para el armazón de GAIM (círculo cerrado) y variantes estabilizadas del mismo. FQNN i VNGVy QGGK son SEQ ID NO: 8-10, respectivamente. La figura 7B muestra la unión superior de proteínas de fusión GAIM-Ig abiertas y estabilizadas (pero no super estabilizadas). Polipéptidos abiertos y estabilizados (distintos del polipéptido super estabilizado PB113, que se muestra en el extremo derecho) se indican dentro del recuadro abierto.
Las figuras 8A-8D muestran la unión de una fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada representativa (círculos) a varias fibras de Ap, en comparación con la unión del armazón de control a esas fibras de Ap (recuadros). La figura 8A muestra la unión a fibras de Ap3-42-Pyro; la figura 8B muestra la unión a fibras de Ap1-42 E22Q; la figura 8C muestra la unión a fibras de Ap11-42; la figura 8D muestra la unión a fibras de Ap11-42-Pyro. Los agregados utilizados para estos experimentos muestran morfología muy diversa que va desde fibras largas no ramificadas (fibras de Ap1-42 E22Q) hasta confórmeros altamente en zigzag (fibras de Ap3-42-Pyro). Pyro = piro-glutamato.
La figura 9 muestra el efecto de mutaciones estabilizadoras de N2 sobre la unión inespecífica a colágeno. FQNN = SEQ ID NO: 8, VNGV = SEQ ID NO: 9; QGGK = SEQ ID NO: 10.
Las figuras 10A-10D abordan las eficiencias de remodelación de diferentes proteínas de fusión GAIM-Ig incubadas con fibras de Ap42. La figura 10A muestra además una comparación con la remodelación efectuada por 6E10 MAb. Círculos = media; Barras = desviación estándar. La figura 10B demuestra adicionalmente la correlación entre la unión a Ap42 y la remodelación por diversas proteínas de fusión GAIM-Ig. Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas están representadas por triángulos invertidos de color gris oscuro. El armazón de GAIM está representado por un triángulo gris claro con la punta derecha hacia arriba. Los círculos representan otras fusiones GAIM-Ig sometidas a prueba. La figura 10C compara la eficiencia de remodelación de un polipéptido abierto y estabilizado representativo (círculos) frente a la eficiencia de remodelación del armazón de GAIM (triángulos) o fibra sola (cuadrados). Barras = desviación estándar. Se demostró mayor eficiencia de remodelación mediante una mayor disolución de fibras en urea (por ejemplo, menor fluorescencia de ThT). La figura 10D muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que muestran fibras de Ap42 antes (izquierda) y después (derecha) de la incubación con 0,8 pM de PB108 a 37 °C durante seis días.
Las figuras 11A-11C abordan la eficiencias de remodelación de diferentes proteínas de fusión GAIM-Ig incubadas con fibras de tau. La figura 11A compara las eficiencias de remodelación de la proteína de fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada representativa PB108 y la proteína de fusión súper estabilizada PB113. La remodelación está indicada por la presencia de monómeros y dímeros de tauKL (panel central) en agregados tratados. La figura 11B compara las eficiencias de remodelación de dos proteínas de fusión GAIM-Ig abiertas y estabilizadas representativas y el armazón de GAIM, a diferentes concentraciones de proteína de fusión. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. La figura 11C presenta imágenes de TEM que muestran fibras de tauKL antes (izquierda) y después (derecha) de la incubación con 100 nM de PB108 a 37 °C durante tres días.
Las figuras 12A-12D representan la inhibición del ensamblaje de amiloide por proteínas de fusión GAIM-Ig de la invención. Las barras de error representan la desviación estándar de tres o más experimentos independientes. La figura 12A muestra la inhibición dependiente de la concentración del ensamblaje de fibras de Ap42. PB120 (armazón de control) está representada por círculos, PB108 por cuadrados y PB116 por triángulos. La figura 12B compara la inhibición del ensamblaje de fibras de Ap42 en la fusión de GAIM a 250 nM. La figura 12C muestra la inhibición dependiente de la concentración del ensamblaje de fibras de tauKL. PB120 (armazón de control) está representada por círculos, PB108 por cuadrados y PB116 por triángulos. La figura 12D compara la inhibición del ensamblaje de fibras de tauKL en fusión de GAIM a 250 nM.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 37 =
Definiciones
Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde se usa cada término. Ciertos términos se comentan a continuación, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar orientación adicional al experto en la técnica al describir las composiciones y métodos de la invención y cómo fabricarlas y usarlos. Los artículos “un” y “una” se refieren a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. El término “o” significa, y se usa indistintamente con el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Adicionalmente, el uso del término “que comprende”, así como otras formas, tales como “comprende” y “comprendió”, no son limitativas. Se entenderá que cualquier intervalo descrito en este documento incluye los puntos finales y todos los valores entre los puntos finales.
El término “g3p”, cuando se usa solo o en términos tales como “derivado de g3p” o “fusión de g3p”, se refiere a cualquier proteína g3p de fago filamentoso recombinante o de tipo silvestre, incluidos fragmentos, variantes y mutantes de g3p que conservan la capacidad de unirse a amiloide. Estos términos no deben interpretarse como limitados a ningún bacteriófago filamentoso g3p particular.
Los términos “bacteriófago filamentoso”, “bacteriófago” y “fago” se usan indistintamente en el presente documento e incluyen tanto bacteriófagos filamentosos de tipo silvestre como recombinantes.
El término “bacteriófago filamentoso de tipo silvestre” como se usa en el presente documento se refiere a bacteriófago filamentoso que se encuentra en la naturaleza, bacteriófago filamentoso que se ha indicado como de “tipo silvestre” en cualquier base de datos de secuencias de nucleótidos o aminoácidos, bacteriófago filamentoso que está disponible comercialmente y catalogado como “de tipo silvestre” y bacteriófago filamentoso que ha adquirido mutaciones no recombinantes con relación a cualquiera de los anteriores pasajes.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio” significa una región de un polipéptido o proteína que tiene alguna característica física distintiva o función distintiva, incluida, por ejemplo, una estructura plegada independientemente compuesta por una sección de una cadena polipeptídica. Un dominio puede contener la secuencia de la característica física distintiva del polipéptido o puede contener un fragmento de la característica física que conserva sus características de unión (por ejemplo, conserva la capacidad de unirse a un segundo dominio). Un dominio puede estar asociado con otro dominio. Por ejemplo, el dominio N2 de g3p se une a pilosidades F y el dominio N1 de g3p se une a TolA.
Tal como se usa en el presente documento, “motivo de interacción amiloide general” o “GAIM” se refiere a un polipéptido de dos dominios (dominios N1 y N2 de g3p) que media en la unión a amiloide usando una combinación de residuos tanto hidrófobos como polares que revisten las superficies internas de la molécula. Los dominios N1 y N2 del monómero de GAIM tienen una distribución asimétrica de aminoácidos aromáticos. El dominio N2 de GAIM contiene 11 residuos de tirosina (Tyr) y 1 residuo de triptófano expuesto (Trp); el dominio N1 contiene 3 residuos de Trp y 3 de Tyr. Los dominios N1 y n 2 adoptan una conformación de herradura invertida y se mantienen juntos en una conformación cerrada (conformación bloqueada) mediante una intrincada red de enlaces de hidrógeno (Weiningeret al.,2009). Una isomerización cis-trans de las prolinas en el enlazador entre dominios conduce a la rotura progresiva de los enlaces de hidrógeno y a la apertura parcial de los dos dominios. El reordenamiento de “apertura” de los dominios N1 y N2 de GAIM expone las cadenas p 4 y 5 de N1 (que comprenden residuos polares) y las cadenas p 9 y 10 de N2 (que comprenden residuos aromáticos/hidrófobos) y permite la unión a amiloide. Véase la figura 1A.
Tal como se usa en el presente documento, “armazón de control” o “armazón de GAIM” corresponde a la proteína de fusión GAIM-Ig PB-120, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. La porción de GAIM del armazón de GAIM tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. PB120 se deriva de PB106, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. La porción de GAIM de PB106 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
Tal como se usa en el presente documento, “PB106 EDGS” (“ EDGS” divulgada como SEQ ID NO: 54) representa un polipéptido de conformación abierta que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada por SEQ ID NO: 15. La porción de GAIM de “PB106 EDGS” (“EDGS” cada a conocer como SEQ ID NO: 54) tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Tal como se usa en el presente documento, fusión de GAIM o GAIM “super estabilizado” se refiere a la fusión GAIM-Ig PB113, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. La porción de GAIM de PB113 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
Los términos “fusión GAIM-Ig,” “proteína de fusión de GAIM-Ig” y “fusión de GAIM” se usan en el presente documento indistintamente y se refieren a un polipéptido que comprende dominios de GAIM de g3p conectados directamente a o a través de un enlazador pequeño a una región constante de inmunoglobulina. Como se muestra en la figura 1B, la región Fc de las fusiones GAIM-Ig de la invención se dimerizan, dando como resultado un complejo que comprende dos copias de GAIM unidas directamente o a través de un enlazador pequeño a una región constante de inmunoglobulina. Una fusión de GAIM de la invención puede comprender adicionalmente una secuencia señal. La presente invención contempla fusiones de GAIM con cualquier región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, la región constante de inmunoglobulina de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA, IgE o IgM. En algunos aspectos, la fusión GAIM-Ig es una fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada. En algunos aspectos, la fusión GAIM-Ig está parcial o totalmente desinmunizada.
“Dímero de GAIM”, como se usa en el presente documento, se refiere a los dos dominios GAIM de una fusión GAIM-Ig descrita en el presente documento. Un dímero de GAIM se representa gráficamente en la figura 1C.
Los términos “fusión abierta y estabilizada,” “fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada,” “variante abierta y estabilizada” y “variante de GAIM-Ig abierta y estabilizada” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una fusión GAIM-Ig que comprende al menos una mutación de conformación abierta y al menos una mutación estabilizadora en la porción de GAIM de la fusión. La mutación de conformación abierta de las variantes abiertas y estabilizadas descritas en el presente documento es una sustitución de SEQ ID NO: 3 (DDKTLD- aminoácidos 24-29 con respecto a SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15) con SEQ ID NO: 4 (EGDS) una mutación estabilizadora puede ser una mutación estabilizadora de N2, por ejemplo, seleccionada de la sustitución de SEQ ID NO: 5 (FQNN; aminoácidos 137-140 con respecto a SEQ ID NO: 13; aminoácidos 135-138 con respecto a SEQ ID NO: 15) con SEQ ID NO: 8 ( F Q G N )i sustitución de SEQ ID NO: 6 (RQGA; aminoácidos 145-148 con respecto a SEQ ID NO: 13; aminoácidos 143-146 con respecto a SEQ ID NO: 15) con SEQ ID NO: 9 (VNGV), sustitución de SEQ ID NO: 7 (QGTDPVK; aminoácidos 158-164 con respecto a SEQ ID NO: 13; aminoácidos 156-162 con respecto a SEQ ID NO: 15) a SEQ ID NO: 10 (QGGK) 0 una combinación de las mismas. Otras mutaciones estabilizadoras de N2 se describen a continuación. Las fusiones abiertas y estabilizadas como se describen en el presente documento pueden comprender además una o más sustituciones, inserciones o deleciones. Por ejemplo, una fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada puede modificarse adicionalmente para reducir o eliminar la inmunogenicidad, para eliminar un posible sitio de glicosilación o para modular adicionalmente la actividad de unión o la especificidad por la proteína amiloide.
Tal como se usa en el presente documento, una proteína de fusión GAIM-Ig de la invención que “consiste esencialmente” en una secuencia de aminoácidos dada puede incluir además un enlazador pequeño que conecta el dominio GAIM y el dominio Fc de la fusión, una secuencia señal N-terminal o un fragmento de la misma, una deleción de la metionina N-terminal (AM1) o una deleción tanto de la metionina N-terminal como de la alanina (AM1 y AA2), y/o una deleción de la lisina C-terminal (K) del dominio Fc de la fusión.
Tal como se usa en el presente documento, un “enlazador pequeño” se refiere a un enlazador peptídico de hasta 25 aminoácidos de longitud, que conecta el dominio GAIM y el dominio Fc de una fusión GAIM-Ig. Tal como se describe adicionalmente a continuación, un “enlazador pequeño” a modo de ejemplo que conecta los dominios GAIM y Fc de una fusión GAIM-Ig puede comprender una secuencia rica en GS o puede comprender la secuencia de aminoácidos ARS.
Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia señal” se refiere a un péptido corto de aproximadamente 16 a 30 aminoácidos presente en el extremo N-terminal de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la secuencia señal puede comprender la secuencia N-terminal de 18 aminoácidos de GenBank Ref Seq NP_510891.1. Una célula eucariota usa una secuencia señal para secretar un polipéptido de la invención. Normalmente, se escinde del polipéptido antes de la secreción y, por lo tanto, normalmente está ausente en el polipéptido secretado.
El término “amiloide” o “fibra amiloide” se usa en el presente documento como un término genérico para una estructura terciaria que se forma por plegamiento incorrecto o agregación de cualquiera de diversas proteínas diferentes y que comprende una disposición ordenada de láminas p apiladas perpendicularmente a un eje de fibra. Sundeet al.,J. Mol Biol. (1997) 273:729-39.
El amiloide, tal como se usa en el presente documento, puede formarse a partir de cualquiera de las siguientes proteínas: receptor de andrógenos; apolipoproteína AI; apolipoproteína AII; apolipoproteína AIV; amiloide A aposérico; Ap; ABri; ADan; atrofina-1; factor natriurético auricular; ataxina; calcitonin; y-cristalina; cistatina C; fibrinógeno; gelsolina; huntingtina; insulina; polipéptido amiloide de los islotes; cadena ligera kappa de inmunoglobulina; cadena ligera lambda de inmunoglobulina; queratoepitelina; queratina; lactahedrina; lactoferrina; lisozima; proteína C tensioactiva pulmonar; medina; proteína asociada a ameloblastos odontogénicos; proteína priónica; procalcitonina; prolactina; semenogelina I; amiloide A sérico; superóxido dismutasa I; p2-microglobulina; proteína de unión a caja TATA; tau; transtiretina; y a-sinucleína, o una combinación de los anteriores. El amiloide, tal como se usa en el presente documento, también puede formarse a partir de formas truncadas o modificadas postraduccionalmente de cualquiera de las proteínas anteriores. “Amiloide” o “fibra amiloide” incluye conformaciones o morfologías diferentes o múltiples de amiloide.
Tal como se usa en el presente documento, “oligómero tóxico” se refiere a un pequeño ensamblaje o agregado de monómeros que normalmente está en la ruta para la formación de amiloide.
El amiloide a modo de ejemplo incluye agregados de amiloide-p formados en la enfermedad de Alzheimer, que comprende el péptido beta-amiloide “Ap,” fragmentos internos de 39-43 aminoácidos escindidos de la proteína precursora amiloide humana (hAPP). Ap incluye formas truncadas y modificadas postraduccionalmente. Por ejemplo, Ap40 es una forma corta de Ap, y la isoforma más fibrilogénica Ap42 es una forma larga. Los ejemplos adicionales de Ap incluyen, pero no se limitan a, Ap11-42 truncado en N, Ap11-42-Pyro, Ap3-42-Pyro y Ap1-42-E22Q-mutación holandesa. Véanse Levyet al,1990; Van Broeckhovenet al,1990. Otras proteínas amiloides a modo de ejemplo incluyen a-sinucleína (asociada con enfermedad de Parkinson), huntingtina (asociada con enfermedad de Huntington), tau (asociada con enfermedad de Alzheimer), la conformación anómala de la proteína priónica, PrPSc y amiloide asociado con varias enfermedades de amiloidosis, que incluyen, pero no se limitan a: cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda), transtiretina, gelsolina y polipéptido amiloide de los islotes. Se proporcionan ejemplos adicionales a lo largo de la descripción y los conocen los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Aguzzi (2010) y Eichner y Radford, Mol. Cell (2011) 43:8-18). A menos que se especifique una proteína o péptido, el uso de los términos “amiloide” o “fibras amiloides” no debe interpretarse como limitados a ninguna proteína, morfología, enfermedad o afección particular.
El término “péptido beta amiloide” es sinónimo de “péptido p-amiloide,” “pAP,” “pA” y “Ap.” Todos estos términos se refieren a un péptido formador de amiloide derivado de la proteína precursora amiloide humana (hAPP).
Tal como se usan en el presente documento, “proteína PrP”, “PrP” y “prion” se refieren a polipéptidos que son capaces, en condiciones apropiadas, de inducir la formación de agregados responsables de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas. Por ejemplo, la proteína priónica celular normal (PrPc) se convierte en condiciones apropiadas en la correspondiente isoforma de encefalopatía espongiforme ovina (PrPSSc) que es responsable de enfermedades tales como, pero sin limitarse a, encefalopatía espongiforme bovina (BSE) (enfermedad de las vacas locas), encefalopatía espongiforme felina de gatos, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar fatal (FFI).
Tal como se usa en el presente documento, una “enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada” incluye pero no se limita a la enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Alzheimer de aparición temprana; enfermedad de Alzheimer de aparición tardía; enfermedad de Alzheimer presintomática; amiloidosis AL; esclerosis lateral amiotrófica (ALS); complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia; demencia de granos argirófilos; amiloidosis medial aórtica; amiloidosis ApoAl; amiloidosis ApoAII; amiloidosis ApoAIV; amiloidosis auricular; demencia británica/danesa; cataratas; degeneración corticobasal; amiloidosis corneal asociada con triquiasis; enfermedad relacionada con placas de cistatina C; enfermedad coronaria relacionada con placas de cistatina C; enfermedad renal relacionada con placas de cistatina C; amiloidosis cutánea por liquen; demencia pugilística; atrofia dentatorubral-palidoluisiana; ovillos neurofibrilares difusos con calcificación; demencia con cuerpos de Lewy; síndrome de Down; cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC); polineuropatía amiloidótica familiar (FAP); demencia británica familiar; demencia danesa familiar; encefalopatía familiar; fiebre mediterránea familiar; amiloidosis por fibrinógeno; amiloidosis hereditaria finlandesa; demencia frontotemporal con parkinsonismo; degeneración lobular frontotemporal (FTLD); demencia del lóbulo frontotemporal; enfermedad de Hallervorden-Spatz; amiloidosis relacionada con hemodiálisis; angiopatía amiloide cerebral hereditaria; hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis; distrofia corneal reticular hereditaria; enfermedad de Huntington; angiopatía amiloide cerebral hereditaria islandesa; miositis por cuerpos de inclusión; amiloidosis localizada por inyección; amiloidosis de polipéptido amiloide de los islotes; amiloidosis por lisozima; mieloma múltiple; distrofia miotónica; enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; enfermedad de motoneuronas no guameña con ovillos neurofibrilares; enfermedad de Parkinson; amiloidosis periférica; enfermedad de Pick; prolactinoma hipofisario; parkinsonismo postencefalítico; angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica; enfermedad mediada por priones; kuru; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD); enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS); insomnio familiar fatal (FFI); encefalopatía espongiforme ovina; encefalopatía espongiforme; proteinosis alveolar pulmonar; gliosis subcortical progresiva; parálisis supranuclear progresiva; amiloidosis sistémica senil; amiloidosis sérica AA; atrofia muscular espinal y bulbar; ataxia espinocerebelosa (SCA1, SCA3, SCA6 o SCA7); panencefalitis esclerosante subaguda; amiloidosis sistémica; amiloidosis familiar; amiloidosis de tipo silvestre; demencia por ovillos únicamente; y tauopatías. Véanse, por ejemplo, Chiti & Dobson, Annu Rev Biochem (2006) 75:333-66; y Josephset al.,Acta Neuropathol (2011) 122:137-153. Existe una gran necesidad de prevenir y/o reducir la formación de agregados de amiloide (es decir, proteínas mal plegadas y/o agregadas) para tratar o reducir los síntomas o la gravedad de estas enfermedades.
Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido, composición, formulación o ácido nucleico que “reduce el amiloide” hace una o más de las siguientes acciones: inhibe la formación de amiloide, provoca la desagregación de amiloide, provoca la remodelación de amiloide, promueve la eliminación de amiloide, inhibe la agregación de amiloide, bloquea y/o previene la formación de oligómeros tóxicos y/o promueve la eliminación de oligómeros tóxicos.
Los polipéptidos, ácidos nucleicos o composiciones descritos en el presente documento como “desagregantes” o “mediadores de la desagregación” reducen los agregados que ya se han formado. La desagregación puede medirse mediante el ensayo de trampa de filtro (Wankeret al.,Methods Enzymol (1999) 309:375-86) u otros métodos conocidos en la técnica. El ensayo de trampa de filtro puede usarse tanto para detectar agregados como para monitorizar la desagregación mediada por las composiciones de la invención. La desagregación se detecta como una disminución de la retención de amiloide en el filtro, como se muestra por una disminución de la tinción, en presencia de concentraciones crecientes del agente de desagregación.
Los polipéptidos, ácidos nucleicos o composiciones descritos en el presente documento como “protectores de neuronas frente al daño por amiloide” impiden la acumulación de amiloide nuevo y/o impiden la formación de oligómeros tóxicos. Los productos o composiciones de la invención descritos como “protectores de neuronas frente al daño por amiloide” pueden tomarse de forma profiláctica. Si un producto o composición protege o no a las neuronas del daño por amiloide puede medirse mediante un ensayo de citotoxicidad de cultivo de células neuronales como se describe en el documento WO 2014/055515, incorporado por el presente documento como referencia en su totalidad.
Los polipéptidos, ácidos nucleicos o composiciones descritos en el presente documento como “remodelador” de amiloide provocan la transformación parcial o completa de los confórmeros fibrilares en agregados amorfos. La remodelación puede medirse mediante estudios de desnaturalización usando urea (por ejemplo, para formas de Ap) o un ensayo de solubilidad de sarcosilo (por ejemplo, para formas de tau). El aumento de la remodelación puede detectarse por la pérdida o el fracaso de la unión de amiloide a tioflavina T (ThT), lo que da como resultado una reducción de la fluorescencia de ThT. La remodelación también puede detectarses mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
Los polipéptidos, ácidos nucleicos o composiciones descritos en el presente documento como “inhibidores de la agregación de amiloide” impiden parcial o completamente la agregación de amiloide. La inhibición de la agregación de amiloide puede medirse mediante un ensayo de fluorescencia de ThT (por ejemplo, indicando una menor fluorescencia un menor porcentaje de agregación de amiloide).
El término “variante” tal como se usa en el presente documento junto con un bacteriófago, proteína, polipéptido o secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una variante de GAIM), se refiere a una sustancia correspondiente que contiene al menos una diferencia de aminoácidos (al menos una mutación, que es una sustitución, inserción o supresión) en comparación con la sustancia de referencia. En ciertas realizaciones, una “variante” tiene una alta homología de secuencia de aminoácidos y/o sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de referencia. Una variante como se describe en el presente documento puede conservar o aumentar: la actividad de unión a amiloide, la especificidad de unión a amiloide y/o la calidad de la proteína en comparación con la secuencia de referencia. Una variante como se describe en el presente documento puede estar desglicosilada. Una variante como se describe en el presente documento puede reducir o eliminar la inmunogenicidad.
Una “sustitución conservadora” se refiere al reemplazo de un primer aminoácido por un segundo aminoácido que no altera sustancialmente las propiedades químicas, físicas y/o funcionales de la proteína g3p o del fragmento de unión a amiloide de g3p (por ejemplo, la proteína g3p o el fragmento de unión a amiloide retiene la misma carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o conserva funciones tales como la capacidad de reconocer, unirse a y/o reducir el amiloide). Tales modificaciones conservadoras de aminoácidos se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los conjuntos de aminoácidos a modo de ejemplo que son intercambiables como sustituciones conservadoras, y que tienen en cuenta varias de las características anteriores, los conocen bien los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
El término “inmunogénico” o “ inmunogenicidad” se usa en el presente documento para referirse a la capacidad de una composición para provocar una respuesta inmune en un mamífero que ha estado expuesto a la composición. En algunos aspectos, la presente invención se refiere a polipéptidos o composiciones con inmunogenicidad reducida o que están completamente desinmunizados. La desinmunización completa indica la eliminación de los cinco epítopos de reconocimiento de células T presentes en la secuencia de aminoácidos de GAIM nativa mediante una o más mutaciones en esas secuencias epitópicas. Tales mutaciones desinmunizantes pueden constituir una sustitución, inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos en un epítopo, o pueden constituir una deleción parcial o total de la secuencia epitópica.
Motivo de interacción amiloide general (GAIM) de G3p y fusiones GAIM-Ig del mismo
El motivo de interacción amiloide general (GAIM) es un polipéptido de dos dominios que comprende los dominios N1 y N2 de g3p. El dominio N2 de GAIM consiste en tres elementos estructurales distintos: una parte globular que se asemeja a N1 en estructura (Holligeret al.(1999) J Mol Biol, 288:649-57), una hélice alfa y una región desordenada que forma una extensa red de enlaces H con el dominio N1. La región de bisagra de N2 también contiene varios residuos de prolina, uno de los cuales (P213) se ha implicado en el mantenimiento de GAIM en un estado abierto, competente para la unión a TolA. Los dominios N1 y N2 del monómero de GAIM tienen una distribución asimétrica de aminoácidos aromáticos. El dominio N2 de GAIM contiene 11 residuos de tirosina (Tyr) y 1 residuo de triptófano (Trp) expuesto; el dominio N1 contiene 3 residuos de Trp y 3 de Tyr. Por lo tanto, la fluorescencia intrínseca de los residuos de tirosina y triptófano permite la monitorización específica de los cambios conformacionales en los dominios N2 y N1, respectivamente (Martin y Schmid (2003) J Mol Biol, 405:989-1003), lo que permite la detección de una conformación abierta de GAIM.
Estudios de intercambio de H/D muestran que GAIM se une al núcleo central de fibras de Ap42. Tal como se demuestra en la figura 2, los estudios de intercambio de H/D también muestran que GAIM se acopla a secuencias discontinuas en el núcleo de fibrillas y une tanto secuencias ricas en residuos aromáticos (por ejemplo, residuos 17-25 en Ap42) como residuos alifáticos (por ejemplo, residuos 31-40 en Ap42). Esto da como resultado una fuerte inhibición del ensamblaje del amiloide y la remodelación eficiente de fibras en agregados amorfos (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426:2500-19).
En algunos aspectos, un polipéptido o composición que comprende el polipéptido comprende una variante de GAIM. En algunas realizaciones, una variante de GAIM no tiene más de 25 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, una variante de GAIM no tiene más de 17 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, una variante de GAIM no tiene más de 10 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, una variante no tiene más de 7 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 16 (porción de GAIM de “PB106 EDGS” (“EDGS” dada a conocer como SEQ ID NO: 54)).
A menos que se especifique lo contrario, toda la numeración de secuencias de aminoácidos de GAIM se basa en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y toda la numeración de secuencias de aminoácidos de GAIM-Ig se basa en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, que constituye SEQ ID NO: 16 fusionada en el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos de IgG1-Fc humana mediante el enlazador corto ARS.
Los polipéptidos de la invención comprenden cualquiera de las variantes de GAIM descritas en el presente documento. Las variantes de GAIM divulgadas en el presente documento comprenden una sustitución de SEQ ID NO: 3 (DDKTLD-<aminoácidos 24-29 con respecto a SEQ ID NO: 13) con SEQ ID NO: 4 (EGDS). Esta sustitución está>presente en la secuencia de referencia SEQ ID NO: 16 y da como resultado que las variantes de GAIM de la invención tengan una variante de GAIM de conformación abierta (“abierta” o “desbloqueada”).
Las variantes de GAIM de la invención también incluyen al menos un conjunto adicional de cambios de aminoácidos seleccionados de (i) cambios alternativos que desinmunizan el epítopo 1 de células T, (ii) cambios que desinmunizan el epítopo 2 de células T y (iii) cambios estabilizadores de N2.
En algunas realizaciones, el al menos otro conjunto de cambios de aminoácidos aumenta la afinidad por el amiloide mientras todavía se desinmuniza en el epítopo 1 de células T. Con referencia a SEQ ID NO: 16, el epítopo 1 de células T desinmunizadas abarca desde los aminoácidos G47 hasta H55. El H55 en esa secuencia provoca la desinmunización; g3p de tipo silvestre (en la que el epítopo 1 de células T no está desinmunizado) tiene una treonina en la posición correspondiente. Aunque la afinidad por el amiloide sigue siendo significativa para las variantes del polipéptido g3p que comprenden el cambio de treonina a histidina en el aminoácido 55 de SEQ ID NO: 16, esta afinidad está algo reducida con relación al tipo silvestre. De manera interesante, se ha notificado que la secuencia YGT, que está presente en g3p nativa, es un motivo de unión a TolA (S Pommieret al.,J. Bacteriol. (2005), 187 (21), págs. 7526 34). Sin estar ligados por la teoría, se cree que la unión GAIM-amiloide puede requerir interacciones de aminoácidos similares a la unión de g3p-TolA. Por lo tanto, se exploró la regeneración de la secuencia 53YGT55 en SEQ ID NO: 16 haciendo una sustitución H55T (por ejemplo, revirtiendo a la secuencia del epítopo 1 de células T de tipo silvestre) y buscando una sustitución alternativa en el epítopo de células T ahora regenerado que afectaría a la desinmunización. Se encontró que una sustitución de T50 provoca la desinmunización del epítopo 1 de células T sin afectar a la afinidad por el amiloide. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de GAIM de la invención comprende una sustitución de T50 acompañada de una sustitución H55T. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50R, T50K, T50G o T50H. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50H.
En algunas realizaciones, el al menos otro conjunto de cambios de aminoácidos desinmuniza el epítopo 2 de células T sin alterar significativamente la afinidad por el amiloide. En SEQ ID NO: 16 de referencia, el epítopo 2 de células T abarca desde el aminoácido M134 hasta N142 (véase la patente estadounidense n.° 9.988.444 B2 y la publicación de patente estadounidense US 2018/0207231 A1, cada una incorporada como referencia en su totalidad), y no cambia en comparación con la correspondiente secuencia de g3p de tipo silvestre. Antes de la presente invención, no se había podido desinmunizar este epítopo sin una reducción significativa en la unión a amiloide y/o una disminución significativa en la estabilidad del GAIM resultante. Ahora se ha descubierto que la sustitución de N142 y/o N137 con otro aminoácido desinmuniza el epítopo 2 de células T sin un efecto significativo sobre la unión a o estabilidad del amiloide. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de GAIM de la invención comprende una sustitución de N142. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de N142 es N142A. En realizaciones alternativas, una variante de GAIM de la invención comprende una sustitución de N137. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de N137 es N137G. En otras realizaciones alternativas, una variante de GAIM de la invención comprende una sustitución de N137 y una sustitución de N142. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de N137 es N137G y la sustitución de N142 es N142A.
En algunas realizaciones, el al menos otro conjunto de cambios de aminoácidos aumenta la estabilidad de N2. Estos cambios se dirigen a uno o más de los denominados bucles de plegado lento presentes en SEQ ID NO: 16, los cuales abarcan los aminoácidos 135-138 (FQNN; SEQ ID NO: 5; Giro 1), 143-146 (RQGA; SEQ ID NO: 6; giro 2) y 156-162 (QGTDPVK; SEQ ID NO: 7; giro 3), como se representa en la figura 3C. Los inventores han descubierto que ciertas sustituciones y/o deleciones de aminoácidos en una o más de estas regiones aumentarán la estabilidad de N2 en un GAIM. Por lo tanto, en algunas realizaciones, al menos otro conjunto de cambios de aminoácidos se selecciona de: (i) N137G; (ii) R143V, Q144N y, opcionalmente, A146V, A146T o A146K. Como se proporcionó anteriormente, la sustitución N137G que estabiliza N2 al eliminar el bucle de plegado lento en el giro 1 también desinmuniza el epítopo 2 de células T. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende cambios de aminoácidos en solo uno del giro 1, giro 2 y giro 3, por ejemplo, uno de: (i) N137G; (ii) R143V, Q144N y, opcionalmente, A146V, A146T o A146K; y (iii) V161G, deleción de T158, D159 y<p>16<o>, opcionalmente, Q156V o Q156Y y, opcionalmente, G157N. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende cambios de aminoácidos en al menos dos de los giros, por ejemplo, dos de (i) N137G; (ii) R143V, Q144N y, opcionalmente, A146V, A146T o A146K; y (iii) V161G, deleción de T158, D159 y P160, opcionalmente, Q156V o Q156Y y, opcionalmente, G157N. En algunos aspectos de estas realizaciones, el cambio de aminoácido es N137G, lo que da como resultado SEQ ID NO: 8 en los aminoácidos 135-138. En algunos aspectos de estas realizaciones, el cambio de aminoácido es R143V, Q144N y A146V, lo que da como resultado SEQ ID NO: 9 en los aminoácidos 143-146. En algunos aspectos de estas realizaciones, el cambio de aminoácido es la deleción de T158, D159 y P160, y la sustitución V161G, lo que da como resultado SEQ ID NO: 10 como reemplazo de los aminoácidos 156-162. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la variante de GAIM no comprende cambios de aminoácidos en los tres giros.
En algunas realizaciones, un polipéptido de la invención comprende una variante de GAIM que tiene al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 1 de células T alternativos descritos anteriormente y al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 2 de células T descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, las variantes de GAIM tienen al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 1 de células T alternativos descritos anteriormente y al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionado de cualquiera de los cambios estabilizadores de N2 descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, la variante de GAIM tiene al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 2 de células T descritos anteriormente y al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios estabilizadores de N2 descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, la variante de GAIM tiene al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 1 de células T alternativos descritos anteriormente, al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios que desinmunizan el epítopo 2 de células T descritos anteriormente y al menos un conjunto de cambios de aminoácidos seleccionados de cualquiera de los cambios estabilizadores de N2 descritos anteriormente.
La elección del conjunto específico de cambios de aminoácidos para cada uno de los tipos de cambios mencionados anteriormente puede realizarse a partir de cualquiera de los cambios descritos en el presente documento para ese tipo dado. En la tabla 1 pueden encontrarse ejemplos no limitativos de conjuntos de cambios de aminoácidos.
Tabla 1. Mutaciones de fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada en relación con SEQ ID NO: 16
* El epítopo 1 de células T de SEQ ID NO: 16 se desinmuniza mediante una sustitución T55H con respecto a g3p de tipo silvestre. Las mutaciones en el epítopo 1 de células T en las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas representan sustituciones desinmunizantes alternativas.
** La sustitución N137G desinmuniza el epítopo 2 de células T y estabiliza el dominio N2.
*** SEQ ID NO: 16 está desglicosilada por una mutación T40G con respecto a g3p de tipo silvestre. Las mutaciones en la señal de glicosilación potencial en las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas representan sustituciones desglicosilantes adicionales.
Los polipéptidos de la invención comprenden una variante de GAIM desglicosilada. La secuencia de referencia SEQ ID NO: 16 está desglicosilada porque comprende una mutación T40G con respecto a g3p de tipo silvestre, alterando así la señal de glicosilación NAT nativa a NAG. Pueden encontrarse ejemplos de otros mutantes y/o variantes de g3p desglicosilados en la solicitud de patente estadounidense US 2018/0207231 A1. Sin embargo, también son posibles variantes de GAIM que tienen mutaciones desglicosilantes diferentes y/o adicionales en la señal de glicosilación nativa. Por ejemplo, la secuencia de tres aminoácidos NX(T/S), donde X es cualquier aminoácido, es una señal de glicosilación conocida. La sustitución de la asparagina (N) en tal secuencia con cualquier aminoácido que no sea cisteína destruirá la señal de glicosilación. De manera similar, la sustitución de treonina (T) o serina (S) en tal secuencia con cualquier aminoácido que no sea cisteína destruirá la señal de glicosilación.
Por tanto, en algunas realizaciones, una variante de GAIM descrita en el presente documento comprende una sustitución de N38 con cualquier aminoácido distinto de cisteína en comparación con SEQ ID NO: 16, y comprende además uno o más de un cambio que desinmuniza el epítopo 1 de células T alternativo, un cambio que desinmuniza el epítopo 2 de células T y/o un cambio estabilizador de N2. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de G40 con cualquier aminoácido distinto de cisteína.
En algunas realizaciones alternativas, una variante de GAIM descrita en el presente documento comprende una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina en comparación con SEQ ID NO: 16, y además comprende uno o más de un cambio que desinmuniza el epítopo 1 de células T, un cambio que desinmuniza el epítopo 2 de células T y/o un cambio estabilizador de N2.
SEQ ID NO: 16 incluye los aminoácidos N-terminales M1 y A2. La producción recombinante de GAIM en líneas de células animales puede dar como resultado polipéptidos a los que les falta M1 o tanto M1 como A2 (un “truncamiento N-terminal”). Tales truncamientos N-terminales no afectan a la actividad de unión a amiloide. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de GAIM carece opcionalmente del aminoácido 1 (AM1) o ambos aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2) de SEQ ID NO: 16, además de comprender uno o más de un cambio que desinmuniza el epítopo 1 de células T, un cambio que desinmuniza el epítopo 2 de células T y/o un cambio estabilizador de N2. Tal como se usa en el presente documento, una variante de GAIM que carece del aminoácido 1 o tanto del aminoácido 1 como del 2 puede denominarse un truncamiento N-terminal (es decir, eliminación después de la traducción) o una mutación por deleción.
En algunas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende la sustitución N137G. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece del aminoácido 1 (por ejemplo, AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece de los aminoácidos 1 y 2 (por ejemplo, AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En algunas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende R143V, Q144N y, opcionalmente, A146V, A146T o A146K. En determinadas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende R143V, Q144N y A146V. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece adicionalmente del aminoácido 1 (por ejemplo, AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece además de los aminoácidos 1 y 2 (por ejemplo, AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En algunas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende una sustitución de T50 con cualquier otro aminoácido, la sustitución H55T y la sustitución N137G. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 se selecciona de T50H, T50G, T50K y T50R. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50H. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM además (i) comprende una sustitución N142A; (ii) comprende una mutación desglicosilante de N38 y/o G40; (iii) carece del aminoácido 1 o tanto del aminoácido 1 como del aminoácido 2; o (iv) cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, en algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece del aminoácido 1 (por ejemplo, AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece de los aminoácidos 1 y 2 (por ejemplo, AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En ciertas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende las sustituciones N137G y N142A. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM además (i) comprende una sustitución de T50 con cualquier otro aminoácido, así como la sustitución H55T; (ii) comprende una mutación desglicosilante de N38 y/o G40; (iii) carece del aminoácido 1 o de ambos aminoácidos 1 y 2; o (iv) cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de T50 se selecciona de T50H, T50G, T50K y T50R. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50H. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece del aminoácido 1 (por ejemplo, AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece de los aminoácidos 1 y 2 (por ejemplo, AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En ciertas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende las siguientes sustituciones: N142A, R143V, Q144N y, opcionalmente, A146V, A146T o A146K. En ciertas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende las siguientes sustituciones: N142A, R143V, Q144N y A146V. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM además (i) comprende una sustitución de T50 con cualquier otro aminoácido, así como la sustitución H55T; (ii) comprende una mutación desglicosilante de N38 y/o G40; (iii) carece del aminoácido 1 o de ambos aminoácidos 1 y 2; o (iv) cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de T50 se selecciona de T50H, T50G, T50K y T50R. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50H. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece del aminoácido 1 (AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece de los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En ciertas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende las siguientes sustituciones: AT158, AD159, AP160, V161G y, opcionalmente, (i) Q156V o Q156Y y/o (ii) G157N. En ciertos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM es una variante de SEQ ID NO: 16 que comprende las siguientes sustituciones: AT158, AD159, AP160 y V161G. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM además (i) comprende una sustitución de T50 con cualquier otro aminoácido, así como la sustitución H55T; (ii) comprende una mutación desglicosilante de N38 y/o G40; (iii) carece del aminoácido 1 o de ambos aminoácidos 1 y 2; o (iv) cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos de estas realizaciones, la sustitución de T50 se selecciona de T50H, T50G, T50K y T50R. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de T50 es T50H. En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece del aminoácido 1 (AM1). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM carece de los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2). En algunos aspectos de estas realizaciones, la variante de GAIM comprende además una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina, o tanto una sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína como una sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína. En al menos un aspecto de estas realizaciones, la sustitución de N38 es N38A.
En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de S<e>Q ID NO: 22. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. En al menos una realización, un polipéptido de la presente invención comprende una variante de GAIM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
Cualquiera de las variantes de GAIM descritas anteriormente puede fusionarse en el extremo C-terminal, directamente o mediante un enlazador corto, a una región constante de inmunoglobulina, para producir una proteína de fusión GAIM-Ig. La región constante de inmunoglobulina de las proteínas de fusión GAIM-Ig descritas en el presente documento puede ser la región constante de inmunoglobulina de IgG (incluidas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA, IgD, IgE o IgM. En algunos aspectos, la región constante de inmunoglobulina es IgG. En ciertos aspectos, la IgG es IgG1. En otros aspectos, la IgG es IgG2. En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina es una región constante de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina es la porción Fc de una IgG humana, o un fragmento de la misma. Las porciones Fc de una IgG humana adecuadas para las proteínas de fusión de la invención incluyen porciones Fc de tipo silvestre o modificadas. Por ejemplo, una porción Fc modificada adecuada de una IgG humana puede estabilizar la proteína de fusión y/o aumentar su semivida con respecto a Fc de tipo silvestre. Los ejemplos no limitativos de Fc modificado incluyen los divulgados en la patente estadounidense n.° 7.083.784, la patente estadounidense n.° 7.217.797, la patente estadounidense n.° 7.217.798, la solicitud de patente estadounidense n.° 14/214.146 y el documento WO-1997034631. En al menos una realización, la región constante de inmunoglobulina es la porción Fc de IgG1 humana. En al menos una realización, la región constante de inmunoglobulina es la porción Fc de IgG2 humana. En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina de la proteína de fusión GAIM-Ig comprende una lisina C-terminal (por ejemplo, K485). En otras realizaciones, la fusión GAIM-Ig carece de una lisina C-terminal (por ejemplo, AK485).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en un polipéptido que comprende cualquier variante de GAIM descrita en el presente documento y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 19 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAIM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 19 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 19 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (PB108). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 29 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 20 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAIM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 20 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (PB122). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 30 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1,2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 21 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de<g>A<i>M de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 21 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 21 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (PB116). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 31 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1,2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 22 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAlM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 22 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 22 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (PB114). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 32 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 23 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAlM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 23 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 23 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (PB109). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 33 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 24 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAlM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 24 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 24 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (PB110). En algunas realizaciones, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 34 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 25 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAlM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 25 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 25 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (PB105). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 35 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En al menos una realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una secuencia al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la descrita por SEQ ID NO: 26 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En algunos aspectos de esta realización, la secuencia de aminoácidos de la porción de GAlM de la proteína de fusión GAIM-Ig difiere de la descrita por SEQ ID NO: 26 en 10-15, 1-10 o 1-5 sustituciones conservadoras. En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en SEQ ID NO: 26 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (PB127). En otros aspectos de esta realización, la proteína de fusión GAIM-Ig consiste esencialmente en una variante de SEQ ID NO: 36 en la que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
La porción de GAIM y la porción de Ig de las fusiones GAIM-Ig descritas en el presente documento pueden conectarse por un enlazador pequeño. En algunas realizaciones, el enlazador pequeño es rico en glicina, serina y/o treonina, comprendiendo al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de glicina, serina y/o treonina. En algunas realizaciones, el enlazador pequeño comprende al menos o aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 70 % o 75 % de glicina, serina y/o treonina. En algunas realizaciones, el enlazador pequeño está compuesto sustancial o completamente por glicina, serina y/o treonina. Un enlazador pequeño de una fusión GAIM-Ig puede tener hasta 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, de 1 a 5 aminoácidos de longitud, de 1 a 20 aminoácidos de longitud, de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 5 a 25 aminoácidos de longitud o de 10 a 25 aminoácidos de longitud. Los enlazadores pequeños pueden tener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos. Idealmente, el enlazador pequeño no contiene un epítopo de células T humanas ni crea un epítopo de células T humanas con o bien la variante de GAIM o bien el dominio Fc al que está unido. Los enlazadores pequeños a modo de ejemplo incluyen enlazadores que tienen varios números de repeticiones de la secuencia GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 27) o G<g>GS (3GS; SEQ ID NO: 28), tales como de 2, 3, 4, a 5 repeticiones de tal secuencia. Los enlazadores pequeños a modo de ejemplo pueden incluir uno o más residuos de lisina. Otros enlazadores pequeños a modo de ejemplo incluyen la secuencia de aminoácidos ARS.
Las fusiones GAIM-Ig descritas en el presente documento demuestran varias ventajas sobre la técnica anterior. Estudios dirigidos a identificar las formas patológicas de Ap en el cerebro con enfermedad de Alzheimer (AD) han demostrado que tanto la placa insoluble como el Ap soluble consisten en una población heterogénea de péptidos Ap truncados de manera N- y C-terminal (Wildburgeret al.,(2017) Sci Rep 7: 9520) que forma conformaciones estructuralmente diversas (Condelloet al.(2018) PNAS, 115: E782-91; Rasmussenet al.(2017) PNAS, 114: 13018 23; Liuet al. (2016) Sci Rep, 6: 33079). También se observa que la mayoría de los fragmentos de Ap truncados de manera N-terminal constituyen la parte principal de la placa amiloide (Wildburgeret al.,(2017) Sci Rep 7: 9520). Sin embargo, la mayoría de las terapias relacionadas con anticuerpos contra la agregación o el plegamiento incorrecto de amiloide han fracasado en la práctica clínica, al menos en parte, debido a su incapacidad para acoplarse eficazmente con formas de amiloide truncadas o modificadas de manera N-terminal. Las fusiones GAIM-Ig de la invención abordan la necesidad previamente no satisfecha de una composición que pueda dirigirse a una variedad de proteínas amiloides, ya que estas fusiones son capaces de acoplarse a diversos agregados de Ap, incluso agregados que tienen diferentes morfologías y propiedades de agregación.
Las fusiones GAIM-Ig divulgadas en el presente documento se unen a, entre otros agregados, los agregados de Ap 11-42 truncados y/o agregados de Ap de piro-glutamato modificados postraduccionalmente, ambos de los cuales son clínicamente relevantes para la enfermedad de Alzheimer. Tal como se muestra más adelante en las tablas 2 y 3, las fusiones GAIM-Ig de la invención se dirigen a múltiples tipos de proteína amiloide, incluidos, pero sin limitación, agregados de Ap, agregados de Ap truncados de manera N-terminal, tau, múltiples confórmeros de transtiretina (TTR) y diversas morfologías de agregados de cadena ligera de inmunoglobulina (LC). Estas dianas incluyen proteína amiloide que se encuentra en pacientes con riesgo o que padecen las enfermedades descritas en el presente documento.
Las terapias relacionadas con anticuerpos de la técnica anterior también pueden fallar en la práctica clínica porque fallan en bloquear la agregación de tau fosforilada y/o fallan en bloquear la propagación de tau de una región del cerebro a otra. Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas de la presente invención abordan esta necesidad. Las fusiones GAIM-Ig de la invención causan la remodelación de tau, evitando así que los agregados de tau siembren tau soluble y bloqueando la propagación de agregados de tau.
Tomadas en conjunto, las fusiones GAIM-Ig divulgadas en el presente documento presentan un enfoque único para prevenir o eliminar agregados de amiloide patológicos. Con relación a las alternativas de la técnica anterior, las fusiones de GAIM abiertas y estabilizadas descritas en el presente documento muestran mayor potencia, estabilidad estructural y especificidad por amiloide, incluidas tanto fibras de Ap como tau, y también están parcial o totalmente desinmunizadas.
Preparación de polipéptidos
Los polipéptidos de la invención (por ejemplo, polipéptidos que comprenden una o más variantes de GAIM, incluidas proteínas de fusión) pueden sintetizarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse de manera recombinante en células (véanse, por ejemplo, Sambrooket al.1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY y Ausubelet al.1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley lnterscience, NY). Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse usando métodos de síntesis conocidos tales como síntesis en fase sólida. En la técnica se conocen bien técnicas de síntesis (véanse, por ejemplo, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis y Panayotis eds.) págs. 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Daviset al.1985, Biochem. Intl. 10:394; Finnet al.1976, The Proteins (3a ed.) 2:105; Eriksonet al.1976, The Proteins (3a ed.) 2:257; la patente estadounidense n.° 3.941.763. Alternativamente, el constructo final puede compartir esencialmente la misma función que una proteína de fusión producida de manera recombinante, pero simplemente puede producirse usando técnicas no recombinantes, tales como química de ligación. Los componentes de las proteínas de fusión pueden prepararse usando la misma metodología general descrita para la expresión de g3p y mutaciones de g3p.
En algunas realizaciones, el polipéptido puede fusionarse con una secuencia marcadora, tal como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado (o bien solo o bien adicionalmente a la fusión con otra proteína o la incorporación de una molécula portadora). La secuencia de aminoácidos marcadora puede ser un péptido de hexahistidina (SEQ ID NO: 53) tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentzet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 821-824, por ejemplo, la hexahistidina (SEQ ID NO: 53) proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra etiqueta peptídica útil para la purificación, la etiqueta de hemaglutinina (HA), corresponde a un epítopo derivado de la proteína Ha de influenza (Wilsonet al,(1984) Cell 37:767).
Composiciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquier polipéptido que comprenda una variante de GAIM descrita en el presente documento, opcionalmente junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una “composición farmacéutica” se refiere a una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición tal como se describe en el presente documento con un portador y/o excipiente fisiológicamente adecuado. Una composición farmacéutica no causa una irritación significativa a un organismo. Las frases “portador fisiológicamente adecuado” y “portador farmacéuticamente aceptable” pueden usarse indistintamente para referirse a un portador o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades de la composición administrada. El término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, incluyen solución salina, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y tensioactivos, incluido, por ejemplo, polisorbato 20.
Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de una manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los principios activos en composiciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida y de la naturaleza de la composición administrada (por ejemplo, el tamaño y la solubilidad del polipéptido). En un aspecto de estas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para inyección o infusión en el torrente sanguíneo de un paciente. En otro aspecto de estas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración directa al cerebro o al sistema nervioso central del paciente, por ejemplo, mediante inyección intramedular, intratecal o intraventricular directa.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de la composición en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones de inyección oleosas o basadas en agua. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados (por ejemplo, tensioactivos tales como polisorbato (Tween 20)) que aumentan la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas. Puede usar un agente a base de proteínas como, por ejemplo, albúmina para prevenir la adsorción del polipéptido de la invención a la superficie de administración (es decir, bolsa IV, catéter, aguja, etc.).
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden formularse combinando los polipéptidos descritos en el presente documento con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en viales, ampollas o en contenedores de múltiples dosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Las formas de dosificación individuales pueden estar en forma líquida o sólida. Las formas de dosificación individuales pueden administrarse directamente a un paciente sin modificación o pueden diluirse o reconstituirse antes de la administración. En ciertas realizaciones, puede administrarse una forma de dosificación individual en forma de bolo, por ejemplo, inyección individual, dosis oral individual, incluida una dosis oral que comprende múltiples comprimidos, cápsulas, píldoras, etcétera. En realizaciones alternativas, puede administrarse una forma de dosificación individual durante un período de tiempo, tal como por infusión, o mediante una bomba implantada, tal como una bomba ICV. En la última realización, la forma de dosificación individual puede ser una bolsa de infusión o un depósito de bomba precargado con la cantidad apropiada de un polipéptido que comprende una variante de GAIM. Alternativamente, la bolsa de infusión o el depósito de bomba pueden prepararse justo antes de la administración a un paciente mezclando una dosis apropiada del polipéptido que comprende una variante de GAIM con la bolsa de infusión o la disolución del depósito de bomba.
Pueden encontrarse técnicas para la formulación de fármacos, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto.
La determinación de una cantidad terapéutica o diagnósticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles cerebrales del vehículo de presentación en fago que sean suficientes para tratar o diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección cerebral particular (concentración mínima eficaz, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero puede estimarse a partir de datosin vitro.Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales.
Los intervalos de dosificación también pueden determinarse usando el valor de la MEC. Las preparaciones deben administrarse usando un régimen que mantenga los niveles cerebrales por encima de la MEC durante el 10-90 % del tiempo, preferiblemente entre el 30-90 % del tiempo y lo más preferiblemente el 50-90 % del tiempo.
Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la enfermedad que va a tratarse, la dosificación puede ser de una o una pluralidad de administraciones, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúa la curación o se logra la disminución del estado patológico.
La cantidad de una composición que va a administrarse dependerá, por supuesto, del sujeto que esté tratándose o diagnosticándose, la gravedad de la aflicción, el juicio del médico que prescribe, etcétera.
Si se desea, las composiciones de la presente invención pueden presentarse en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el principio activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una hoja de metal o plástico, como un paquete de blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. En el paquete o dispensador también puede incorporarse un aviso asociado con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser un etiquetado aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos para fármacos con receta o un prospecto de producto aprobado. También pueden prepararse composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una enfermedad indicada, tal como se detalla adicionalmente en el presente documento.
Usos terapéuticos
Otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la invención, para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades asociadas con proteínas amiloides mal plegadas y/o agregadas, incluidas, pero no sin limitarse a, aquellas enfermedades que implican cualquiera de: transtiretina, cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda), fAp42, fasyn, fNM o ftau.
En el contexto de los tratamientos, los términos “paciente”, “sujeto” y “receptor” se usan indistintamente e incluyen seres humanos, así como otros mamíferos. En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano que es positivo para un biomarcador asociado con una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas. En una realización, el paciente presenta depósitos de p-amiloide detectados por obtención de imágenes de PET con florbetapir.
El término “tratar” y sus afines se refieren a reducir, ralentizar o revertir la progresión de una enfermedad en un paciente que presenta uno o más síntomas clínicos de una enfermedad. “Tratar” también se refiere a reducir, ralentizar o revertir los síntomas de una enfermedad en un paciente que presenta uno más de los síntomas clínicos de una enfermedad. En una realización, el paciente presenta depósitos de p-amiloide tal como se detectó mediante la obtención de imágenes de PET con florbetapir y el tratamiento reduce el número de depósitos de p-amiloide. En una realización, el paciente presenta depósitos de p-amiloide tal como se detectó por el polipéptido o las composiciones polipeptídicas de la presente invención y el número de depósitos de p-amiloide se reduce o se mantiene mediante el tratamiento. En otra realización, el paciente presenta cualquier tipo de depósito de amiloide tal como se detectó por la obtención de imágenes por PET y el tratamiento mejora la función cognitiva del paciente. La mejora de la función cognitiva puede evaluarse mediante los métodos y pruebas de McKhannet al.,Alzheimer's & Dementia 7 (3):263-9 (2011).
“Profilaxis” o “prevención” (usados en el presente documento indistintamente) es distinto del tratamiento y se refiere a la administración de un polipéptido, ácido nucleico o composición a un individuo antes de la aparición de cualquier síntoma clínico. Se abarca la profilaxis usando cualquiera de los polipéptidos, ácidos nucleicos o composiciones de los mismos de la presente invención. La profilaxis puede estar implicada en individuos que se sabe que tienen un mayor riesgo de padecer una enfermedad, o que tienen la certeza de desarrollar una enfermedad, únicamente basándose en uno o más marcadores genéticos. Se han identificado muchos marcadores genéticos para las diversas enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas. Por ejemplo, los individuos con una o más de mutación sueca, mutación Indiana o mutación London en hAPP tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer de inicio temprano y, por lo tanto, son candidatos para la profilaxis. Del mismo modo, los individuos con repeticiones CAG de trinucleótidos en el gen de la huntingtina, particularmente aquellos con 36 o más repeticiones, finalmente desarrollarán la enfermedad de Huntington y, por lo tanto, son candidatos para la profilaxis.
Las enfermedades asociadas con o caracterizadas por proteína amiloide mal plegada y/o agregada abarcan enfermedades asociadas con (por ejemplo, causadas o correlacionadas al menos en parte por) proteína amiloide mal plegada, proteína amiloide agregada o tanto proteína amiloide agregada como mal plegada. Los péptidos o proteínas que pueden formar amiloide se describieron anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el amiloide está formado por Ap, que incluye, pero no se limita a Ap40, Ap42, Ap11-42 truncado en N, Ap11-42-Pyro, Ap3-42-Pyro, Ap1-42-E22Q-mutación holandesa, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el amiloide se forma como proteína priónica, por ejemplo, PrPSc. En algunas realizaciones, el amiloide está formado por transtiretina. En algunas realizaciones, el amiloide está formado por una cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, cadena ligera kappa de inmunoglobulina y/o cadena ligera lambda de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el amiloide está formado por tau. En algunas realizaciones, el amiloide está formado por a-sinucleína.
Las enfermedades asociadas con o caracterizadas por proteína amiloide mal plegada y/o agregada se describieron anteriormente. Muchas de las enfermedades por proteínas amiloides mal plegadas y/o agregadas anteriores se producen en el sistema nervioso central (CNS). Ejemplos no limitativos de enfermedades que se producen en el CNS son la enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; demencia frontotemporal (FTD) incluidos aquellos pacientes que tienen los siguientes síndromes clínicos: FTD variante de comportamiento (bvFTD), afasia progresiva no fluente (PNFA) y demencia semántica (SD); degeneraciones lobulares frontotemporales (FTLD); y enfermedad de Huntington. Los polipéptidos, ácidos nucleicos y composiciones de la invención pueden usarse para tratar enfermedades caracterizadas por proteína amiloide mal plegada y/o agregada que se produce en el sistema nervioso central (CNS).
El plegamiento incorrecto y/o la agregación de proteínas también pueden producirse fuera del CNS. La amiloidosis A (AA) (para la cual la proteína precursora es la apolipoproteína de fase aguda sérica, SAA) y el mieloma múltiple (proteínas precursoras de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada) son dos enfermedades ampliamente conocidas de plegamiento incorrecto de proteína y/o proteína agregada que se producen fuera del c Ns . Otros ejemplos incluyen enfermedad que implica amiloide formado por a2-microglobulina, transtiretina (por ejemplo, FAP, FAC, SSA), AA (apo)sérica, apolipoproteínas AI, AII y AIV, gelsolina (por ejemplo, forma finlandesa de FAP), cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda), lisozima, fibrinógeno, cistatina C (por ejemplo, angiopatía amiloide cerebral, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, tipo islandés), calcitonina, procalcitonina, polipéptido amiloide de los islotes (por ejemplo, amiloidosis IAPP), factor natriurético auricular, prolactina, insulina, lactahedrina, queratoepitelina, lactoferrina, proteína asociada a ameloblastos odontogénicos y semenogelina I. Los polipéptidos, ácidos nucleicos y composiciones de la invención también pueden usarse para tratar enfermedades que implican plegamiento incorrecto y/o agregación de proteínas que se producen fuera del CNS.
Las enfermedades asociadas con o caracterizadas por proteína amiloide mal plegada y/o agregada también pueden implicar lesiones de tau. Revisado en Leeet al.,Annu. Rev. Neurosci. 24:1121-159 (2001). Las proteínas tau son proteínas asociadas a microtúbulos que se expresan en axones de neuronas tanto del sistema nervioso central como periférico. Se abarcan tauopatías neurodegenerativas (a veces denominadas tauopatías). Los ejemplos de tauopatías incluyen enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complejo de parkinsonismo-demencia, demencia de granos argirófilos, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, síndrome de Down, demencias frontotemporales incluida demencia frontotemporal con parkinsonismo ligada al cromosoma 17, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, enfermedad de motoneuronas no guameña con ovillos neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, giosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda y demencia por ovillos únicamente. Algunas de estas enfermedades también pueden incluir depósitos de péptidos de amiloide p fibrilares. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer presenta tanto depósitos de amiloide p como lesiones de tau. De manera similar, las enfermedades mediadas por priones tales como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas y síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker también pueden tener lesiones de tau. Por lo tanto, una indicación de que una enfermedad es una “tauopatía” no debe interpretarse como que excluye la enfermedad de otras clasificaciones o agrupaciones de enfermedades neurodegenerativas o de proteínas amiloides mal plegadas y/o agregadas, que se proporcionan simplemente por conveniencia. Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden usarse para tratar enfermedades neurodegenerativas, así como también enfermedades que implican lesiones de tau.
En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método de reducción de amiloide en un paciente que presenta síntomas relacionados con la presencia de amiloide o que es positivo para un biomarcador asociado con una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición o formulación farmacéutica como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método para mantener el nivel de amiloide en un paciente que presenta síntomas relacionados con la presencia de amiloide o que es positivo para un biomarcador asociado con una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición o formulación farmacéutica como se describe en el presente documento. En algunos aspectos de estas realizaciones, el biomarcador es p-amiloide, que puede detectarse con el radiofármaco florbetapir (AV-45, Eli Lilly). En algunos aspectos de estas realizaciones, la vía de administración es inyección o infusión intratecal, inyección o infusión intraventricular directa, inyección o infusión intraparenquimatosa o inyección o infusión intravenosa.
En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método de desagregación o remodelación de amiloide en un paciente. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método para reducir la formación de amiloide en el cerebro. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para promover la eliminación de amiloide en el cerebro. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para inhibir la agregación amiloide en el cerebro. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para eliminar oligómeros tóxicos en el cerebro. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para prevenir la formación de oligómeros tóxicos en el cerebro. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para proteger neuronas del daño por amiloide. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método para reducir la propagación de célula a célula de agregados de a-sinucleína. En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación es para su uso en un método de bloqueo de la propagación de célula a célula de agregados de asinucleína. En algunos aspectos de estas realizaciones, el polipéptido, composición farmacéutica o formulación se administra a un paciente que lo necesita mediante inyección o infusión intratecal, inyección o infusión intraventricular directa, inyección o infusión intraparenquimatosa o inyección o infusión intravenosa.
En algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para causar la desagregación de depósitos de Ap-amiloide en el cerebro, que comprende inyectar directamente en el cerebro de un paciente que lo necesite una cantidad eficaz del polipéptido, composición farmacéutica o formulación, causando así una reducción de los depósitos de Ap-amiloide en el cerebro. En otras realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método para causar la desagregación de los depósitos de Ap-amiloide en el cerebro, que comprende inyectar mediante administración intravenosa en un paciente que lo necesita una cantidad eficaz del polipéptido, composición farmacéutica o formulación, causando así una reducción de los depósitos de Ap-amiloide en el cerebro.
En una realización, se administra profilácticamente una composición o formulación farmacéutica de la invención para su uso en la protección de neuronas del daño por amiloide.
En algunas realizaciones, el paciente es positivo para un biomarcador asociado con una enfermedad de agregación y/o plegamiento incorrecto de proteínas. En una realización, el biomarcador es p-amiloide y el agente usado para detectar el p-amiloide es florbetapir (AV45, Eli Lilly).
A diferencia de las terapias basadas en anticuerpos de la técnica anterior (por ejemplo, 6E10), las fusiones GAIM-Ig tal como se describen en el presente documento se dirigen al núcleo de amiloides en lugar de a residuos N-terminal no estructurados o parcialmente estructurados y demuestran actividad de remodelación superior (figura 10A). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido, composición farmacéutica o formulación de la invención es para su uso en un método de remodelación de amiloide. En algunos aspectos de estas realizaciones, la vía de administración es inyección o infusión intratecal, inyección o infusión intraventricular directa, inyección o infusión intraparenquimatosa o inyección o infusión intravenosa.
En general, los polipéptidos divulgados en el presente documento se unen al amiloide al menos tan eficazmente como el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento se unen al amiloide más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento remodelan el amiloide más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento inhiben la agregación de amiloide más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento eliminan los oligómeros tóxicos más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento reducen la propagación de célula a célula de agregados de a-sinucleína más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento detectan el amiloide más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento previenen una enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada más eficazmente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento son para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada más efectivamente que el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento provocan una respuesta inmune más pequeña en un paciente en comparación con el fago M13, g3p o una variante o proteína de fusión de g3p divulgada en la técnica anterior. En al menos una realización, los polipéptidos divulgados en el presente documento no provocan una respuesta inmunitaria en un paciente.
En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención puede usarse para tratar cualquiera de las enfermedades descritas (es decir, que codifica para un polipéptido que comprende una variante de GAIM que presenta inmunogenicidad reducida o nula y que posee la capacidad de unirse a amiloide, desagregar/remodelar el amiloide y/o inhibir la agregación de amiloide) solo o asociado con un portador adecuado, por ejemplo, una nanopartícula lipídica, un portador polimérico o un vector, tal como un vector viral directamente a un paciente por cualquier vía adecuada, por ejemplo, inhalación e infusión intravenosa. La molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido que comprende una variante de GAIM puede ser ADN o ARN.
Diagnóstico
Se abarcan composiciones de diagnóstico en la presente invención y pueden comprender cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos anteriormente (por ejemplo, un polipéptido que comprende una variante de GAIM), tal como un polipéptido que comprende una fusión GAIM-Ig. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los polipéptidos, las composiciones farmacéuticas y las formulaciones descritas en el presente documento se usan en aplicaciones de diagnóstico asociadas con las diversas enfermedades descritas en el presente documento. Por ejemplo, la unión de un polipéptido de la invención a proteína amiloide puede usarse para detectar la proteína amiloide unida. De manera similar, la unión de un polipéptido de la invención cuando se usa como agente de obtención de imágenesin vivooin vitropuede ser parte de un diagnóstico de una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas, agregación de proteínas o neurodegenerativa descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, un polipéptido descrito en el presente documento puede ser para su uso como agente de obtención de imágenes de amiloide, en donde el agente de obtención de imágenes puede detectar proteína amiloide y diagnosticar una enfermedad asociada con una proteína amiloide mal plegada y/o agregada. Debido a que los polipéptidos descritos en el presente documento se unen a amiloide independientemente del tipo de fibra, pueden obtenerse imágenes y detectar cualquier agregado de amiloide (Ap, tau, a-sinucleína, transtiretina, cadena ligera de inmunoglobulina, etcétera) y pueden diagnosticarse una amplia gama de enfermedades y afecciones asociadas con amiloide. En algunas realizaciones, el polipéptido usado como agente de obtención de imágenes de amiloide comprende además una etiqueta detectable.
Pueden unirse diversas etiquetas a un polipéptido que comprende una variante de GAIM como se describe en el presente documento usando técnicas estándar para etiquetar proteínas. Los ejemplos de etiquetas incluyen etiquetas fluorescentes y radioetiquetas. Existe una amplia variedad de radioetiquetas que pueden usarse, pero en general la etiqueta se selecciona a menudo de radioetiquetas que incluyen, pero no se limitan a, 18F, 11C y 123I. Estos y otros radioisótopos pueden unirse a la proteína usando química bien conocida. En una realización, la etiqueta se detecta usando tomografía por emisión de positrones (TEP). Sin embargo, puede usarse cualquier otra técnica adecuada para la detección de radioisótopos para detectar el radiotrazador.
Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden usarse como agentes de obtención de imágenes de diagnóstico en combinación con un agente de obtención de imágenes que sea específico para p-amiloide tal como, por ejemplo, F18-AV-45, Eli Lilly. Debido a que el uso de una composición de diagnóstico de la invención junto con un agente de obtención de imágenes específico de p-amiloide dará como resultado la detección de agregados distintos de p-amiloide basándose en detección diferencial, en una realización, se usa una composición de diagnóstico de la invención como agente de obtención de imágenes en combinación con un agente de obtención de imágenes de pamiloide para detectar agregados distintos de p-amiloide.
En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en el presente documento, o composiciones de los mismos, se usan para detectar p-amiloide en el CNS, incluido el cerebro.
Las composiciones de diagnóstico de la invención pueden administrarse usando las mismas vías descritas para las composiciones terapéuticas. En algunas realizaciones, la vía de administración es inyección o infusión intratecal, inyección o infusión intraventricular directa, inyección o infusión intraparenquimatosa o inyección o infusión intravenosa.
Técnicas recombinantes
En algunos aspectos, la presente invención se refiere a oligonucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para polipéptidos que comprenden una variante de GAIM, incluidos polipéptidos que comprenden una variante de GAIM unida directamente o mediante un enlazador pequeño a una región constante de inmunoglobulina, como se divulga en el presente documento. En general, los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que comprende una variante de GAIM o fusión GAIM-Ig se preparan usando técnicas de ADN recombinante convencionales, tales como clonación de dominios GAIM mutantes, síntesis directa de ADN o aislando el ADN correspondiente de una biblioteca usando, por ejemplo, la secuencia de M13 como sonda. Véanse, por ejemplo, Sambrooket al.1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; Ausubelet al.1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley lnterscience, N.Y. Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprende una variante de GAIM o fusión GAIM-Ig también pueden prepararse como se proporciona en los ejemplos más adelante.
Para la producción recombinante, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede insertarse en un vector de expresión apropiado que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para su replicación y traducción. El ácido nucleico codificante se inserta en el vector en el marco de lectura apropiado. Por consiguiente, la invención proporciona vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de ADN, vectores de fagos, vectores virales, vectores retrovirales, etcétera. Los vectores pueden incluir, por ejemplo, baculovirus, virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, plásmido Ri o plásmido Ti. Los expertos en la técnica pueden elegir el vector apropiado con el cual clonar los ácidos nucleicos de la invención usando conocimientos del dominio general del campo técnico acerca de la compatibilidad del vector con la célula huésped elegida en la que llevar a cabo la expresión. Esto puede hacerse en cualquiera de células de mamíferos, células vegetales, células de insectos, células bacterianas, células fúngicas, células animales transgénicas, etcétera. Las células de mamíferos a modo de ejemplo adecuadas para producir polipéptidos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a células HEK293, células derivadas de HEK293, células CHO, células derivadas de CHO, células HeLa y células COS. Las células bacterianas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células deE. coli.Las células vegetales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células de lenteja de agua. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.022.70. Los vectores apropiados para cada uno de estos tipos de células se conocen bien en la técnica y generalmente están disponibles comercialmente. Se describen métodos de transfección a modo de ejemplo no limitativos en Sambrooket al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Press (2001). Los ácidos nucleicos pueden transfectarse de manera transitoria o estable en las células huésped deseadas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 19 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 21 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 22 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 23 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 24 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 25 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 26 y la porción Fc de una IgG humana (por ejemplo, IgG1 humana).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (PB108). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (PB122). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (PB116). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (PB114). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (PB109). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (PB110). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (PB105). En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (PB127). Como se describió anteriormente, estas realizaciones abarcan un ácido nucleico que codifica para una variante de SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 en las que la variante carece del aminoácido 1 (AM1), los aminoácidos 1 y 2 (AM1 y AA2), el aminoácido 485 (AK485), los aminoácidos 1 y 485 (AM1 y AK485) o los aminoácidos 1, 2 y 485 (AM1, AA2 y AK485).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención comprende SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 comprende además un ácido nucleico que codifica para la porción Fc de IgG (por ejemplo, IgG1 o IgG2 humana). En al menos una realización, el ácido nucleico que codifica para una variante de GAIM abierta y estabilizada y el ácido nucleico que codifica para la porción Fc de IgG están conectados por un ácido nucleico que codifica para un enlazador pequeño. En al menos una realización, el ácido nucleico codifica para el enlazador pequeño ARS. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica además para una secuencia señal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica además para una secuencia señal que tiene la secuencia N-terminal de 18 aminoácidos de GenBank Ref Seq NP_510891.1.
En al menos una realización, el ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención es SEQ ID NO: 45. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 46. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 47. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 48. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 49. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 50. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 51. En al menos una realización, el ácido nucleico es SEQ ID NO: 52.
Los vectores usados en la transformación normalmente contendrán un marcador seleccionable usado para identificar transformantes. En sistemas bacterianos, esto puede incluir un gen de resistencia a antibióticos tal como ampicilina o kanamicina. Los marcadores seleccionables para su uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable es el gen DHFR. Otro marcador amplificable es el ADNe de DHFRr (Simonsen y Levinson, PNAS (1983) 80: 2495). Los marcadores seleccionables se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) y la elección de los marcadores seleccionables está dentro del nivel de los expertos en la técnica. Los elementos de expresión de los sistemas de expresión varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema de huésped/vector utilizado, puede usarse cualquiera de los muchos elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores constitutivos e inducibles, en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago X, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac), y similares; cuando se clona en sistemas de células de insectos, pueden usarse promotores tales como el promotor del poliedro de baculovirus; cuando se clona en sistemas de células vegetales, pueden usarse promotores derivados del genoma de células vegetales (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor de la proteína de unión a clorofila a/b) o de virus vegetales (por ejemplo, promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de la proteína de cubierta de TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K de virus vaccinia); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias del producto de expresión, pueden usarse vectores basados en SV40, BPV y EBV con un marcador seleccionable apropiado. En casos en los que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de secuencias que codifican para formas lineales o no cicladas del producto de expresión de la invención puede dirigirse por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores virales tales como los promotores de A<r>N 35S y ARN 19S de CaMV (Brissonetal.,Nature (1984) 310:511-514), o el promotor de la proteína de cubierta de TMV (Takamatsuet al.,EMBO J (1987) 6:307-311); alternativamente, pueden usarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISc O (Coruzziet al.,EMBO J. (1984) 3:1671-1680; Broglieet al.,Science (1984) 224: 838-843) o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurleyet al.,Mol. Cell. Biol. (1986) 6:559-565). Estos constructos pueden introducirse en células vegetales usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etcétera. Véanse, por ejemplo, Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, sección VIII, págs. 421-463; y Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2a ed., Blackie, Londres, cap. 7-9. En un sistema de expresión de insectos que puede usarse para producir proteínas de la invención, se usa el virus de la polihidrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV) como vector para expresar los genes foráneos. El virus crece en células deSpodoptera frugiperda.Puede clonarse una secuencia codificante en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen del poliedro) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor del poliedro). La inserción exitosa de una secuencia codificante da como resultado la inactivación del gen del poliedro y la producción de virus recombinante no ocluido, es decir, virus que carece de la cubierta proteica codificada por el gen del poliedro. Estos virus recombinantes se usan para infectar células deSpodoptera frugiperdaen las que se expresa el gen insertado. Véase, por ejemplo, Smithet al.,J. Viral. (1983) 46:584; la patente estadounidense n.° 4.215.051. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de este sistema de expresión en Ausubelet al.,Eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience.
En células huésped de mamífero, puede usarse cualquiera de varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, puede ligarse una secuencia codificante a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, la secuencia líder tripartita y de promotor tardío. Este gen de fusión puede insertarse luego en el genoma del adenovirus mediante recombinaciónin vitrooin vivo.La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar péptidos en huéspedes infectados (véase, por ejemplo, Logan & Shenk, PNAS (1984) 81:3655). Alternativamente, puede usarse el promotor de 7,5 K de vaccinia (véanse, por ejemplo, Mackettet al.,PNAS (1982) 79:7415; Mackettet al.,J. Viral. (1984) 49:857; Panicaliet al.,PNAS (1982) 79:4927). Otros sistemas de expresión viral incluyen virus adenoasociados y lentivirus.
En otra realización, la invención provee una célula huésped que alberga el vector que contiene un ácido nucleico de la invención. Se conocen en la técnica métodos para transfectar o transformar u obtener de otro modo un vector de la invención en una célula huésped. Una célula que alberga el vector, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, producirá los polipéptidos de la invención. Como se indicó anteriormente, las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, células animales transgénicas, células vegetales, células de insectos, células bacterianas y células de hongos. Por ejemplo, las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células HEK293, células derivadas de HEK293, células CHO, células derivadas de CHO, células HeLa y células COS.
Las células huésped que comprenden constructos de ácido nucleico (por ejemplo, vectores) se hacen crecer en un medio de crecimiento apropiado. Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de crecimiento apropiado” significa un medio que tiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de las células. Los polipéptidos de la invención producidos de manera recombinante pueden aislarse del medio de cultivo usando técnicas conocidas en la técnica.
Se exponen ejemplos específicos de vectores y células usados para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención en los ejemplos a continuación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión de TauK18P301L, purificación y ensamblaje de fibras
Se expresó el fragmento de TauK18P301L humano correspondiente a los residuos 244-372 de Tau-441 (2N4R) con la mutación P213L y se purificó como se describe para tau-MTBR (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426:2500-19). Se ensamblaron fibras de Tau-K18P301L añadiendo 40 |iM de heparina de bajo peso molecular (Fisher Scientific) a 40 |iM de monómero de TauK18P301L en tampón acetato de sodio 0,1 M pH 7,0 que contenía 2 mM de DTT e incubando durante 3 días a 37 °C. La formación de fibras se confirmó mediante Tioflavina T (ThT).
Ejemplo 2: Ensamblaje de fibras de Ap
Se disolvieron AP1-42 (rPéptido), AP11-42 truncado en N (Bachem), Ap11-42-Pyro (AnaSpec), Ap3-42-Pyro (AnaSpec) y Ap1-42-E22Q (AnaSpec) en hexafluoroisopropanol (HFIP) y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas hasta que se desarrolló una disolución clara. La disolución de péptido se secó al vacío durante 1 hora. Las fibras se ensamblaron tal como se describió por Stineet al.,2003. Se disolvieron cien microgramos de péptido de Ap en 40 |il de DMSO, se diluyeron hasta 1140 |il en disolución 10 mM de HCl y se incubaron con agitación a 500 rpm durante 24 horas a 37 °C. La formación de fibras fue confirmada por ThT.
Ejemplo 3: Generación de proteínas de fusión GAIM-Ig
Se realizó mutagénesis específica de sitio del armazón de control PB120 en cadenas p que miran hacia la ranura interna de los dominios GAIM (figura 1A). Estas cadenas p, 4 y 5 en el dominio N1 y 9 y 10 en el dominio N2, facilitan interacciones entre dominios en el estado cerrado de GAIM y evitan la exposición del sitio de unión de TolA (Hoffman-Thomset al.(2013) J Biol Chem, 288: 12979-91) que se ha mostrado previamente que se superpone en parte con el motivo de unión a amiloide en GAIM (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426: 2500-19). Adicionalmente, se mutaron sitios en la región de bisagra de N2 implicados en el ensamblaje de dominios N1-N2 y regiones específicas en N2 importantes para la unión a pilosidades F (Weiningeret al.(2009) PNAS, 106:12335-40; Deng y Perham (2002) J Mol Biol, 319:603-14) para investigar cómo la actividad de unión a amiloide de GAIM se traduce en su función durante infección por fago.
Se expresaron proteínas de fusión GAIM-Ig usando el sistema de expresión Expi293™ (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La purificación de las proteínas se realizó en una columna HiTrap® MabSelect™ SuRe™ (GE Healthcare Lifesciences) en 20 mM de fosfato de sodio, con un pH de 7,0 seguido de una elución en gradiente en 20 mM de acetato de sodio de pH 4,0 a pH 3,6 sobre 20 CV usando el sistema de FPLC AKTA™ Pure. Las proteínas de fusión se dializaron en D-PBS pH 7 y se esterilizaron por filtración (columnas de centrifugación Ultrafree®-MC, Millipore). La pureza de la proteína se analizó mediante el sistema de gel Bis-Tris al 4 12 % NuPAGE™ con tampón de ejecución MES SDS (Thermo Fisher Scientific) seguido de la disolución de tinción InstantBlue™ (Expedeon). Además, se usó SEC analítica para evaluar la pureza de las fusiones GAIM-IgG usando una columna de 5 |iM TSKgel® G3000SW XL, 7,8 mm de DIx30 cm, (TOSOH BIOSCIENCES) en un sistema enfocado de UHPLC UltiMate™ 3000 (ThermoFisher Scientific). Para cada muestra, se inyectaron 7,5 |ig de proteína en la columna de SEC, la separación se realizó en una fase móvil de D-PBS a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. La pureza máxima se analizó usando el software Chromeleon™ 7. Las variantes de fusión GAIM-IgG se sintetizaron mediante ATUM.
Ejemplo 4: Generación de dímeros de GAIM
Se generaron dímeros de GAIM a partir de las fusiones GAIM-Ig utilizando la enzima FabRICATOR® (IdeS) (Genovis), que recorta específicamente la fusión en la bisagra de inmunoglobulina para producir dímeros de GAIM unidos por dos enlaces disulfuro (figura 1C), durante 2 horas a 37 °C. A la escisión le siguió la separación de Fc por Capto™ Adhere de acuerdo con el protocolo del fabricante. La pureza del dímero de GAIM se confirmó en un sistema de gel de Bis-Tris al 4-12 % NuPAGE™ separado en tampón de ejecución MES SDS. Se incubó el dímero de GAIM (0,5 |iM) durante 2 horas a 25 °C en 100 mM de fosfato de potasio, pH 7,0 con concentraciones crecientes de guanidina (Sigma). La fluorescencia se midió en células de 10 mm a 310 nm y 340 nm después de la excitación a 280 nm y a 360 nm después de la excitación a 295 nm. Los datos se analizaron usando un modelo de plegado de dos estados asumiendo una dependencia lineal de las emisiones de fluorescencia de la concentración de clorhidrato de guanidina. Después de confirmar el tamaño molecular esperado y el aclaramiento de los fragmentos Fc en gel de SDS-PAGE, la proteína se sometió a estudios de despliegue.
Ejemplo 5: Despliegue térmico de GAIM monitorizado mediante ensayo de unión a SYPRO® Orange
Se llevó a cabo un ensayo de unión a SYPRO® Orange para monitorizar la separación del dominio GAIM y la estabilidad del dominio n 2. SYPRO® Orange se une escasamente a la conformación cerrada de GAIM plegado en una disolución acuosa. Cuando los dos dominios GAIM se disocian y exponen residuos hidrófobos, el tinte se une a las superficies hidrófobas expuestas y muestra una mayor fluorescencia. Se mezcló una fusión GAIM-Ig micromolar en PBS con un exceso de 20x de SYPRO® Orange (n.° de cat. de Invitrogen S-6650) en una placa de 96 pocillos y se selló. El despliegue térmico se monitorizó por RT-PCR Roche LightCycler® 480 mediante un aumento continuo de la temperatura desde 20 °C hasta 95 °C a una velocidad de 0,24 °C/minuto. La excitación se fijó a 465 nm y la emisión a 580 nm con un factor de fusión en 1, factor cuantitativo en 10 y tiempo máximo de integración durante dos segundos. La unidad arbitraria de la señal fluorescente se registró y se normalizó a una escala de 0 a 100 (Layton y Hellinga, 2011).
El despliegue térmico del monómero GAIM monitorizado por la unión a SYPRO® Orange mostró una única transición alrededor de 43 °C que corresponde a la apertura del dominio y la transición del despliegue de N2 (figuras 4A-4B). Los dímeros GAIM obtenidos de acuerdo con el ejemplo 4 mostraron perfiles de fusión idénticos a los de los monómeros en disolución, mientras que las fusiones GAIM-Ig en disolución mostraron tres transiciones distintas tras el despliegue térmico (figuras 4A-4B). La primera transición, Tm1, se produjo a alrededor de 44 °C, tal como se observa en los monómeros y dímeros GAIM (figura 4B). Dos transiciones adicionales a 64 °C y 81 °C son como las transiciones de despliegue de dominios Fc (Traxlmayret al.,2012, Biochim Biophys Acta, 1824:524-529). La comparación de la Tm1 específica de GAIM mostró que los dominios GAIM y Fc permanecen como dominios de plegamiento independientes y no se generan nuevos elementos estructurales en la molécula quimérica.
Ejemplo 6: GAIM conserva su estabilidad conformacional nativa en el dímero de fusión de IgG
La estabilidad conformacional de GAIM en la fusión de IgG se investigó usando el despliegue del dímero de GAIM inducido por clorhidrato de guanidina (GuHCl) por fluorescencia intrínseca. Se generaron dímeros de GAIM tal como se describió en el ejemplo 4 y se equilibraron en disoluciones de GuHCl 0, 2 y 5 M a 25 °C durante 2 horas. La excitación selectiva de los residuos de Trp a 295 nm mostró un cambio mínimo en las intensidades de fluorescencia del dímero de GAIM entre las concentraciones de 0 y 2 M, sin cambios en la emisión Xmáx (345 nm) (figura 5A). A 5 M de GuHCl, la fluorescencia de Trp se desplazó al rojo en 15 nm (Xmáx 360 nm) y la intensidad de fluorescencia fue significativamente mayor que las muestras de 0 y 2 M. Los dímeros GAIM se excitaron entonces a 280 nm (residuos de Trp y Tyr) y se registraron los espectros de emisión de fluorescencia (figura 5B). La intensidad de la emisión de fluorescencia a 340 nm disminuyó entre 0 y 2 M de GuHCl y luego aumentó en un margen similar a 5 M de GuHCl. También se observaron cambios espectrales similares en g3p (Martin y Schmid, 2003, J Mol Biol, 328:863-75), lo que indica que GAIM en las variantes de fusión GAIM-Ig retuvo la estabilidad conformacional nativa de GAIM en g3p nativa.
Se generaron perfiles de desnaturalización detallados de dímeros de GAIM registrando intensidades de emisión de fluorescencia a 310, 340 y 360 nm en un intervalo de concentraciones de GuHCl. Los dímeros de GAIM mostraron un perfil de desnaturalización bifásico a 340 nm cuando se excitaron a 280 nm (figura 5C). La primera transición se produjo entre 1 y 2 M de GuHCl y la siguiente entre 2 y 3 M de GuHCl. Después se ajustaron los perfiles de desnaturalización de 310 nm (excitación 280 nm) y 360 nm (excitación 295 nm) a un modelo de despliegue de proteínas de dos estados (figuras 5D-5E) y se calcularon las transiciones de desnaturalización de los dominios N2 y N1 a 1,5 M y 2,6 M de GuHCl respectivamente. La primera transición a 1,5 M de GuHCl representa la separación de los dos dominios N1 y N2 y el despliegue simultáneo del dominio N2 menos estable. La segunda transición representa el despliegue del dominio N1 más estable a 2,6 M de GuHCl. Estos valores corresponden a las transiciones de desnaturalización notificadas previamente en g3p (Martin y Schmid, 2003, J Mol Biol, 328:863-75). Por lo tanto, estos datos indican que cada GAIM en el dímero de GAIM en la fusión GAIM-Ig forma una unidad de plegado independiente y adopta una conformación similar a la proteína de punta g3p de fagos filamentosos.
Ejemplo 7: Las fusiones GAIM-Ig se unen a fibras de Ap y Tau
Se añadieron cincuenta microlitros de fibras de Ap (0,8 pM) o fibras de tauK18P301L (1 pM) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6 por pocillo en una placa MaxiSorp® de 96 pocillos (Thermo Fisher) y se incubaron 16 horas a 4 °C. Los pocillos se lavaron 3 veces con DPBS-Tween (0,05 %) y 2 veces con DPBS, seguido del bloqueo con SuperBlock™ (Thermo Scientific) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS. La fusión GAIM-Ig se añadió en PBS-T de alta concentración (14,7 mM de KH<2>PO<4>, 80,6 mM de Na2HPO4-7H2O, 27 mM de KCl, 1,38 M de NaCl, Tween al 0,05 %) a las concentraciones indicadas y se incubó a 37 °C durante 2 horas seguido de 3 lavados en DPBS-Tween (0,05 %) y 3 lavados con DPBS. Se añadió el anticuerpo Fc-HRP específico humano (Jackson ImmunoResearch, número de catálogo 109-035-008) diluido en 1:5000 en DPBS-Tween (0,05 %) que contenía gelatina al 0,2 % durante 45 minutos a 37°C. Después de 2 lavados en DPBS-Tween (0,05 %) y 2 lavados en DPBS, se reveló la señal con disolución de TMB (Thermo Fisher), se detuvo la reacción mediante la adición de 0,25 N de HCl y se registró la absorbancia a 450 nm con un lector de placas Tecan Infinite® M1000 PRO.
Se encontró que la mayoría de las mutaciones en los residuos de N1 y N2 que miran hacia la ranura interna de GAIM afectan a la unión a fibras de Ap1-42 por ELISA (figura 6A). Las actividades de unión de las variantes de GAIM mutadas oscilaron entre 0,7 nM y 175 nM de CE<50>, lo que representa un cambio de más de 250 veces en la afinidad de unión a fAp42. Hubo una fuerte correlación (valor de P 10'4, rs = 0,703) entre la eficacia de unión (CE<50>) y la primera transición de fusión (Tm1). Una disminución en Tm1 representa una conformación más abierta de GAIM con unión aumentada, las variantes estabilizadas con Tm1 más alta tienden a perder su actividad de unión. Esto sugiere que se expone un motivo de unión a fibra amiloide en GAIM cuando las interacciones entre dominios se debilitan y concuerda con datos anteriores que muestran que la unión de GAIM depende de la temperatura (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426:2500-19).
Para discernir si el cambio en la actividad de unión para fAp42 se traslada a otras proteínas amiloides, se sometió a prueba un subconjunto de las variantes mediante ELISA para determinar la unión a fibras amiloides formadas a partir de la región de unión a microtúbulos de tau. La comparación de las actividades de unión de las variantes de GAIM-Ig (CE<50>) para fAp42 y ftau (valor de P 10'4, rs = 0,878; figura 6B) mostró una estrecha correlación en la actividad de unión de GAIM-Ig (valor de P 10'4, rs = 0,862) para los dos amiloides diferentes.
Ejemplo 8: Unión superior de proteínas de fusión GAIM-Ig abiertas y estabilizadas sobre proteínas de fusión GAIM-Ig estabilizadas
Varias mutaciones en GAIM que estabilizaron el dominio N2 y favorecieron una interacción más fuerte con el dominio N1 condujeron a una disminución de la unión a amiloide. La eliminación de un bucle que contiene prolina en el dominio N2 por la sustitución del bucle Qi56GTDPVKi62 (SEQ |D NO:<7>) con Q G G K (SEQ ID NO: 10) aumentó la Tm1 en 3,6 °C y dio como resultado una pérdida de 18 veces de la unión a fAp42 (figura 7A). Asimismo, las sustituciones de aminoácidos de F<135>Q N N<138>(SEQ ID NO: 5) a FQGN (SEQ ID NO: 8) y R<143>Q G A<146>(SEQ |D NO: 6) a VNGV (SEQ ID NO: 9) estabilizaron N2 (Tm1) en 1,8 °C y 2,5 °C respectivamente. Estas variantes estabilizadas mostraron una actividad de unión a fAp42 reducida en comparación con el armazón de GAIM (figura 7A). Igualmente, la introducción de la mutación Q128H, que estabiliza las interacciones del subdominio de bisagra de N2 y N1, disminuyó la unión a fibras (figura 7A). Las sustituciones de T1, T2 o T3 en el dominio N2 redujeron todas la unión no específica al colágeno, aunque Q128H mostró un aumento marginal de 1,4 veces (figura 9). Tales mutantes indican una relación inversa entre la potencia de la actividad de unión a amiloide de una variante de GAIM y su estabilidad.
<Para crear una conformación más abierta de GAIM, el bucle>D24DKTLD29<(SEQ ID NO: 3) en N1 (figura 3A) se reemplazó con la secuencia homologa>EGDS<(SEQ ID NO: 4) del fago filamentoso IF1 y se sometió a prueba en>combinación con mutaciones estabilizadoras de N2 (por ejemplo, en uno o más giros/bucles indicados en la figura 3C). Las supuestas variantes GAIM abiertas y estabilizadas en N2 se sometieron a prueba para determinar la calidad de la proteína y la actividad de unión a amiloide. Todas las variantes abiertas y estabilizadas muestran una actividad de unión a fibras mejorada con CE<50><1,5 nM; consecuente con un sitio de unión de fibras de amiloide más expuesto<y accesible (figura 7B). Una excepción fue la variante>EGDS<(SEQ ID NO: 4) con un N2 súper estabilizado (PB113;>SEQ ID NO: 17; Tm1 = 52,7 °C), que contenía las tres mutaciones estabilizadoras de N2 combinadas ( F135QGN138, V143NGV146, y Q156GGK162) (respectivamente, SEQ ID NO: 8, 9 , 10), dando como resultado una pérdida de actividad de unión de fAp42 (figura 7B). Esto podría deberse a cambios estructurales importantes en N2 que enmascaran el/los sitio(s) de interacción con amiloide en GAIM, ya sea introduciendo interacciones intradominio o sobreestabilizando el dominio N2. Las variantes abiertas y estabilizadas con un aumento de la unión a fibras perdieron la correlación entre Tm1 y la unión a fAp42, lo que sugiere un desacoplamiento del/de los sitio(s) de unión a amiloide<y la estabilidad de N2 en estas variantes. Todas las variantes estabilizadas de>EGDS-N2! (“EGDS”<divulgada como>SEQ ID NO: 4) mostraron una buena calidad de proteína mediante SDS-PAGE y se presentaron como monómeros mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Adicionalmente, hubo un cambio en el tiempo de retención por SEC que indicó además una molécula de confórmero de GAIM más abierta.
Ejemplo 9: Las fusiones GAIM-Ig se dirigen a múltiples amiloides con diversas mrfologías
Se sometió a prueba la capacidad de fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas para acoplarse a diferentes tipos y conformaciones de agregados de Ap. Se fibrilizaron diversos péptidos Ap modificados y se midieron las afinidades de unión de las fusiones GAIM-Ig a estos agregados. Se agregaron Ap11-42 truncado en N, Ap11-42-Pyro, Ap3-42-Pyro y Ap1-42-E22Q-mutación holandesa (Levyet al,1990; Van Broeckhovenet al,1990) en las mismas condiciones que Ap42 y la formación de fibras se verificó mediante ThT (figuras 8A-8D) y TEM (datos no mostrados). Los agregados formados usando estos péptidos mostraron morfologías muy diversas. Por ejemplo, pyro-glu 3-42 forma fibras que tienen varias curvas en su estructura, la variante E22Q forma fibras largas y lisas y los péptidos 11-42 forman varias fibras cortas. Se encontró que tanto la variante PB108 abierta y estabilizada como el armazón PB120 se acoplaban a estas fibras mediante ELISA. PB108 mostró una unión mejorada en ~20 veces a los diversos agregados en comparación con PB120, CE<50>0,9-1,9 nM (figuras 8A-8D). De manera similar, se observó unión superior para las otras fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas sometidas a prueba (tabla 2).
Tabla 2. Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas se unen a y remodelan la proteína amiloide.
*ND = No se recogieron datos.
Tabla 3. Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas se dirigen a una variedad de proteínas amiloides.
*ND = No se recogieron datos. Unión determinada por ELISA a menos de que se indique otra cosa.
La capacidad de las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas para unirse a diferentes tipos y conformaciones de proteína amiloide se muestra adicionalmente en las tablas 2 y 3. Por ejemplo, las tablas 2 y 3 muestran la unión de fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas a Ap42 y tauKL con baja afinidad nanomolar, y la tabla 3 demuestra adicionalmente su unión a agregados morfológicamente diversos de cadena ligera de inmunoglobulina (LC) y transtiretina (TTR) con baja afinidad nanomolar. Estos datos muestran un direccionamiento superior a través de una amplia gama de fibras amiloides en comparación con el armazón de control y son consecuentes con estudios de RMN previos que muestran que GAIM se acopla a las secuencias media y C-terminal en fibras de Ap42 (Krishnanet al.
(2014) J Mol Biol 426:2500-19).
Ejemplo 10: Las fusiones GAIM-Ig se unen específicamente a proteína amiloide
Para descartar la unión no específica, se sometieron a prueba fusiones GAIM-Ig a concentraciones elevadas (1,8 |iM, 100 veces más altas que la CE<50>para un sustrato verdadero como fAp42) para determinar la unión inespecífica a otras especies fibrilares como el colágeno. Se inmovilizaron doscientos veinticinco nanogramos por pocillo de colágeno humano (n.° de cat. de Sigma C5483) en D-PBS en placas MaxiSorp® de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) durante 16 horas a 37 °C seguido del bloqueo en SuperBlock™ (Thermo Fisher Scientific) durante 1 hora a temperatura ambiente. La fusión GAIM-Ig en PBS-Tween (0,05 %) se incubó a 37 °C durante 1 hora seguido de 3 lavados de 5 minutos en PBS-Tween (0,05 %). Se añadió anticuerpo Fc-HRP específico humano (Jackson ImmunoResearch, número de catálogo 109-035-008) 1:5000 en PBS-Tween (0,05 %) durante 45 minutos a 37 °C seguido de 3 lavados de 5 minutos en PBS-Tween (0,05 %) y 2 lavados de 5 minutos en PBS. La señal se reveló con disolución de TMB (Sigma), la reacción se detuvo mediante la adición de 0,25 N de HCl y se registró la absorbancia a 450 nm con un lector de placas Tecan Infinite® M1000 PRO. Las fusiones GAIM-Ig mostraron una unión mínima a sustratos distintos de amiloide mediante ELISA (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426: 2500-19).
Ejemplo 11: Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas presentan remodelación mejorada de fibras de Ap
Se llevaron a cabo ensayos de remodelación en tubos de microcentrífuga de baja retención (Fisher Scientific 02-681 320). Los tampones usados en estos ensayos contienen azida de sodio al 0,05 % para prevenir el crecimiento microbiano. Para asegurarse de que no hubiera contaminación por proteasa en ninguna muestra, todos los complejos remodelados se procesaron en un gel de SDS-PAGE y se verificaron en busca de degradación. Para los ensayos que usan <1 |iM de fibras, la calidad de la proteína se confirmó en cambio mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
Se coincubaron fibras de Ap42 (2,5 |iM) con o sin variantes de fusión GAIM-Ig durante tres días a 37°C. A continuación, se incubaron alícuotas de los complejos con concentraciones variables de urea. La fluorescencia de ThT de los complejos en urea se representó gráficamente frente a la concentración de urea. La eficiencia de remodelación a una concentración fija de urea se representó gráficamente como porcentaje de pérdida de fluorescencia de ThT en comparación con fibras sin ningún tratamiento con fusión GAIM-Ig.
Se seleccionaron fusiones GAIM-Ig con diferentes potencias de unión a fibras de Ap42 para determinar si las eficiencias de remodelación dependen de las potencias de unión y del estado conformacional abierto. La figura 10A muestra las eficiencias de remodelación de diferentes fusiones de GAIM incubadas con fibras de Ap42 en condiciones y concentraciones idénticas. Las variantes abiertas y estabilizadas con unión a fAp42 nanomolar baja mostraron un aumento de 2 a 3 veces en la actividad de remodelación, con una actividad de remodelación promedio del 83 % en comparación con el armazón de control (35 %). La figura 10B revela una correlación positiva entre la actividad de remodelación y unión a fAp42 alterada, de manera tal que las fusiones GAIM-Ig con unión a Ap superior también presentan una actividad de remodelación superior.
Las figuras 10A-10C, así como los datos de microscopía electrónica de transmisión (véase el ejemplo 13; figura 10D), demuestran adicionalmente que las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas remodelan las fibras de amiloide provocando una pérdida de la arquitectura fibrilar, en lugar de simplemente adherirse y enmascarar las estructuras fibrilares. Por ejemplo, cuando se incubaron en concentraciones crecientes de urea, pero sin exposición a una fusión GAIM-Ig, las fibras de Ap42 resistieron la desnaturalización y mostraron menos del 10 % de cambio estructural en 1 M de urea tal como se mide mediante fluorescencia de ThT (figura 10C). En concentraciones más altas de urea, la fluorescencia de ThT disminuyó drásticamente, lo que sugiere una pérdida de la estructura fibrilar. Por el contrario, las fibras tratadas con cantidades subestequiométricas de fusión GAIM-Ig comenzaron a mostrar un 30-90 % de unión reducida a ThT en 1 M de urea. Este hallazgo sugiere que las fusiones GAIM-Ig se unen a y alteran las estructuras fibrilares a un estado que no puede unirse a ThT y que la actividad de remodelación GAIM varía entre diferentes fusiones GAIM Ig, demostrando fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas una alta actividad de remodelación.
Ejemplo 12: Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas presentan remodelación potenciada de fibras de TauK18P301L
También se realizaron ensayos de remodelación mediante la coincubación de fibras de Tau-K18P301L con fusiones GAIM-Ig para demostrar que la remodelación de agregados es genérica para proteína amiloide.
Se llevaron a cabo ensayos de remodelación en tubos de microcentrífuga de baja retención (Fisher Scientific 02-681 320). Los tampones utilizados en estos ensayos contienen azida de sodio al 0,05 % para prevenir el crecimiento microbiano. Para asegurarse de que no hubiera contaminación por proteasa en ninguna muestra, todos los complejos remodelados se procesaron en un gel SDS-PAGE y se verificaron en busca de degradación. Para los ensayos que usan <1 |iM de fibras, la calidad de la proteína se confirmó en cambio mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western.
A diferencia de las fibras de fAp42, las fibras de Tau-k18P301L se disuelven fácilmente en disoluciones de urea de baja concentración. Por lo tanto, se investigaron las eficiencias de remodelación de las fusiones GAIM-Ig contra Tau-K18P301L usando ensayos de solubilidad de sarcosilo. Las fibras de TauK18P301L (1 |iM) se coincubaron con o sin variantes de fusiones GAIM-Ig a 37 °C durante 5 días. Las fibras y los complejos se incubaron con o sin sarcosilo al 1 % durante 15 minutos y se centrifugaron a 100.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante de cada muestra se retiró cuidadosamente y se cargó en geles NuPAGE® (Invitrogen) al 4-12 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se estudiaron con sonda para TauK18P301L. El porcentaje de remodelación se calculó cuantificando las bandas de gel usando un sistema Biorad Chemidoc™.
Las fibras ensambladasin vitrousando Tau-K18P310L (no expuestas a una fusión GAIM-Ig) mostraron resistencia a la disolución cuando se incubaron con sarcosilo al 1 %. Las fibras de Tau-K18P301L tratadas con fusión GAIM-Ig se disolvieron en sarcosilo al 1 % más fácilmente que las fibras no tratadas (figura 11A), lo que indica que estas fibras también pueden remodelarse como fAp42. Cuando se incubaron con concentraciones variables de fusiones GAIM-Ig, estas fibras se disolvieron de una manera dependiente de la concentración (figura 11B).
La eficiencia de remodelación de PB120 se comparó con las eficiencias de remodelación de fusiones GAIM IgG abiertas y estabilizadas. PB113, un GAIM súper estabilizado sin disulfuro con infectividad reducida (Katheret al.,2005, J Mol Biol, 354:666-78) no tiene actividad de unión a fibras de AP1-42 o Tau-K18P301L (datos no mostrados) y se añadió como control negativo. Las proteínas de fusión GAIM-Ig abiertas y estabilizadas mostraron actividades de remodelación potenciadas en comparación con PB120 (figura 11B), mientras que PB113 no tuvo actividad de remodelación (figura 11A).
Se investigó si las fusiones de GAIM remodelan las fibras de Tau-K18P301L y liberan especies de TauK18P301L solubles cuando se coincubaron las muestras. A concentraciones de fusión de GAIM que producen una remodelación potente (por ejemplo, 10-250 nM), no se observaron especies solubles en el sobrenadante de complejos que no se hayan sometido a tratamiento con sarcosilo (figura 11A), lo que sugiere que el material remodelado no libera monómeros o especies de TauK18P301L solubles al unirse a fusiones de GAIM.
Ejemplo 13: Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas hacen que las fibras amiloides pierdan la arquitectura fibrilar
Se aplicaron fibras de AP1-42 (15 |il de muestra de 20 |iM) sobre rejillas de cobre revestidas de carbono (n.° de cat. de TedPella 01844-F). Después, las muestras se lavaron suavemente con 0,5 ml de agua, se invirtieron y se hicieron flotar sobre una gota de una disolución de acetato de uranilo al 2 %. Después de 30 segundos, se retiraron las rejillas y se secaron eliminando el exceso de líquido del borde de las rejillas usando un papel de filtro. Se usó FEI Tecnai™ Spirit TEM para obtener imágenes de las fibras. La figura 10D muestra imágenes de TEM representativas de fibras de AP42 incubadas con fusión GAIM-Ig subestequiométrica abierta y estabilizada. Cuando se expusieron a fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas, las fibras de AP42 perdieron su arquitectura fibrilar (figura 10D). De manera similar, el análisis de TEM mostró que las fibras de Tau-K18P301L pierden su conformación fibrilar característica cuando se coincuban con una fusión GAIM-Ig abierta y estabilizada (figura 11C).
Ejemplo 14: Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas presentan una mayor inhibición de la agregación de amiloide
Se sometieron a prueba proteínas de fusión GAIM-Ig abiertas y estabilizadas para determinar la actividad de inhibición del ensamblaje mediante coincubación con monómeros de AP42 a 37°C durante 10 horas. Se siguió la formación de fibras de amiloide por fluorescencia de ThT y se comparó con la formación de fibras sin GAIM, así como también en presencia del control negativo PB113.
Se disolvieron cien microgramos de muestra monomérica de AP1-42 (rPéptido) tratada con HFIP en 80 |il de DMSO, se mezclaron completamente mediante pipeteo, se agitaron en vórtex y se diluyeron en 5,4 ml de D-PBS hasta una concentración final de AP1-42 de 4,04 |iM. Las muestras de fusión GAIM-Ig se diluyeron en PBS hasta disoluciones madre intermedias de 10, 2,5, 0,63 y 0,16 |iM. Se distribuyeron ochenta microlitros de disolución de monómero de Api-42 en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos de fondo redondo (LVL, número de catálogo 225.LS.PP). Se añadieron diez microlitros de cada disolución madre de fusión GAIM-Ig a los pocillos que contenían AP1-42, seguido de la adición de 10 |il de ThT (33 |iM en PBS), para una concentración final de 3,2 |iM de AP1-42 y 3,3 |iM de ThT por pocillo. La placa se selló con película transparente y se registró la fluorescencia de ThT a 430/485 nm (Ex/Em) cada 20 minutos durante 14 horas en un lector de placas Tecan Infinite® M1000 PRO mientras se incubaba a 37 °C con agitación vertical de 3 segundos cada 20 minutos. El porcentaje de agregación de AP42 para cada concentración de fusión GAIM-Ig se calculó en relación con los pocillos de AP42 no tratados (pocillos de control positivo).
Las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas mostraron una inhibición del ensamblaje dependiente de la dosis cuando se añadieron durante 10 horas a las concentraciones indicadas (figura 12A). Las fusiones abiertas y estabilizadas mostraron además una mayor actividad de inhibición del ensamblaje en comparación con el armazón de control, PB120 (figuras 12A-12B). Por ejemplo, a 250 nM, las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas representativas PB108 y PB116 mostraron un aumento del 40-20 % en el bloqueo de la formación de fibras en comparación con PB120 (figura 12B). La capacidad de cantidades subestequiométricas de fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas para bloquear de manera potente la formación de fibrillas de amiloide sugiere que las fusiones bloquean la formación de fibras de amiloide al unirse a las hebras P centrales en la fibra en crecimiento o semillas implicadas en el ensamblaje de fibras dependientes de nucleación (Krishnanet al.(2014) J Mol Biol, 426:2500-19).
De manera similar, las fusiones GAIM-Ig abiertas y estabilizadas mostraron una inhibición del ensamblaje dependiente de la dosis contra las fibras de tau (figura 12C). Se establecieron reacciones de ensamblaje de TauK18P301L incubando 10 |iM de monómeros de tau en un tampón acetato de sodio 0,1 M pH 7,0 con 2 |iM de heparina de bajo peso molecular (Fisher Scientific) a 37 °C durante 3 días en presencia de concentraciones variables de fusiones de GAIM (0-500 nM). La fluorescencia ThT de las reacciones de ensamblaje se registró diluyendo las muestras hasta 1 |iM en una disolución de 5 |iM de ThT. Los efectos inhibidores de GAIM sobre el ensamblaje de TauK18P301L se calcularon comparando el ensamblaje de TauK18P301L sin fusión de GAIM.
El ensamblaje de fibrasin vitrode tau de longitud completa o secuencias truncadas tales como MTBR o K18 requiere la presencia de heparina para promover la nucleación y el ensamblaje posterior. Las fusiones de GAIM sometidas a prueba inhibieron el ensamblaje de ftauKL en presencia de heparina. Además, las fusiones de GAIM abiertas y estabilizadas bloquearon la nucleación de tres a cinco veces mejor en comparación con PB120 (figura 12C-12D). Juntos, estos resultados indican que las fusiones de GAIM abiertas y estabilizadas se unen a productos intermedios en ruta de tanto Ap como tau e inhiben el ensamblaje de agregados de amiloide.
Claims (36)
- REIVINDICACIONESi . Un polipéptido que comprende una variante del motivo de interacción amiloide general (GAIM) de la proteína del gen 3 del bacteriófago filamentoso (g3p) de la secuencia de aminoácidos de partida SEQ ID NO: 16, en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 16 en uno o más conjuntos de cambios de aminoácidos seleccionados de:a) sustitución de T50 con cualquier aminoácido y H55T;b) N137G;c) N142A;d) R143VyQ144N; oR143V, Q144N y A146V; oR143V, Q144N y A146T; oR143V, Q144N y A146K; ye) Q156V, G157N, AT158, AD159, AP160 y V161G; oQ156Y, G157N, AT158, AD159, AP160 y V161G; oG157N, AT158, AD159, AP160 y V161G; oAT158, AD159, AP160 y V161G;en donde la variante opcionalmente difiere además de SEQ ID NO: 16 en uno o más conjuntos de cambios de aminoácidos seleccionados de:f) AM1; oAM1 y AA2; yg) sustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína; osustitución de N38 con cualquier aminoácido que no sea cisteína y sustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína; osustitución de G40 con cualquier aminoácido que no sea cisteína, treonina o serina.
- 2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la sustitución de T50 se selecciona del grupo que consiste en T50G, T50H, T50K y T50R.
- 3. El polipéptido de la reivindicación 2, en donde la sustitución de T50 es T50H.
- 4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 16 al menos en AM1 y AA2.
- 5. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la variante difiere de SEQ ID NO: 16 al menos en N137G y/o N142A.
- 6. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde la variante difiere además de SEQ ID NO: 16 en uno o más conjuntos de cambios de aminoácidos seleccionados de:a) sustitución de T50 con cualquier aminoácido y H55T; yb) R143VyQ144N; oR143V, Q144N y A146V; oR143V, Q144N y A146T; oR143V, Q144N y A146K;
- 7. El polipéptido de la reivindicación 6, en donde la sustitución de T50 se selecciona del grupo que consiste en T50G, T50H, T50K y T50R.
- 8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde la sustitución de T50 es T50H.
- 9. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la variante de SEQ ID NO: 16 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.
- 10. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además una región constante de inmunoglobulina.
- 11. El polipéptido de la reivindicación 10, en donde la secuencia de región constante de inmunoglobulina es la porción Fc de una IgG humana.
- 12. El polipéptido de la reivindicación 11, que consiste en el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y la porción Fc de una IgG humana.
- 13. El polipéptido de la reivindicación 12, en donde la IgG humana es IgG1 humana.
- 14. Un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:a) SEQ ID NO: 29;b) SEQ ID NO: 30;c) SEQ ID NO: 31;d) SEQ ID NO: 32;e) SEQ ID NO: 33;f) SEQ ID NO: 34;g) SEQ ID NO: 35; yh) SEQ ID NO: 36;en donde la variante opcionalmente tiene uno o más conjuntos de cambios de aminoácidos seleccionados de:i) AM1; oAM1 y AA2; yj) AK485.
- 15. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un portador farmacéuticamente aceptable.
- 16. Un oligonucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
- 17. El oligonucleótido de la reivindicación 16, en donde el ácido nucleico que codifica para el polipéptido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44.
- 18. El oligonucleótido de la reivindicación 16, en donde el ácido nucleico que codifica para el polipéptido consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52.
- 19. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18.
- 20. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 19.
- 21. La célula huésped de la reivindicación 20, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula de insecto, una célula fúngica, una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula de mamífero y una célula animal transgénica.
- 22. La célula huésped de la reivindicación 21, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células HEK293, células derivadas de HEK293, células CHO, células derivadas de CHO, células HeLa y células COS.
- 23. Un método para fabricar una proteína que se une a amiloide, que comprende expresar la proteína codificada por el ácido nucleico en el vector de la reivindicación 19 y aislar la proteína expresada.
- 24. Una proteína que se une a amiloide, producida expresando la proteína codificada por el ácido nucleico en el vector de la reivindicación 19 y aislando la proteína expresada.
- 25. La proteína de la reivindicación 24, en donde la proteína se expresa cultivando la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 20-22.
- 26. Un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o la composición farmacéutica de la reivindicación 15 para su uso para reducir el amiloide, inhibir la formación de amiloide, inhibir la agregación de amiloide o eliminar y/o prevenir la formación de oligómeros tóxicos en un sujeto que lo necesite.
- 27. El polipéptido o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 26, en donde el amiloide o los oligómeros comprenden una proteína seleccionada de un receptor de andrógeno; apolipoproteína AI; apolipoproteína AlI; apolipoproteína AIV; amiloide A aposérico; Ap; ABri; ADan; atrofina-1; factor natriurético auricular; ataxina; calcitonina; y-cristalina; cistatina C; fibrinógeno; gelsolina; huntingtina; insulina; polipéptido amiloide de los islotes; cadena ligera kappa de inmunoglobulina; cadena ligera lambda de inmunoglobulina; queratoepitelina; queratina; lactaedrina; lactoferrina; lisozima; proteína C tensioactiva pulmonar; medina; proteína asociada a ameloblastos odontogénicos; proteína priónica; procalcitonina; prolactina; semenogelina I; amiloide A sérico; superóxido dismutasa I; p2-microglobulina; proteína de unión a caja TATA; tau; transtiretina; y a-sinucleína.
- 28. Un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o composición farmacéutica de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, en donde la enfermedad se selecciona de enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Alzheimer de aparición temprana; enfermedad de Alzheimer de aparición tardía; enfermedad de Alzheimer presintomática; amiloidosis AL; esclerosis lateral amiotrófica (ALS); complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia; demencia de granos argirófilos; amiloidosis medial aórtica; amiloidosis ApoAI; amiloidosis ApoAII; amiloidosis ApoAIV; amiloidosis auricular; demencia británica/danesa; cataratas; degeneración corticobasal; amiloidosis corneal asociada con triquiasis; enfermedad relacionada con placas de cistatina C; enfermedad coronaria relacionada con placas de cistatina C; enfermedad renal relacionada con placas de cistatina C; amiloidosis cutánea por liquen; demencia pugilística; atrofia dentatorubral-palidoluisiana; ovillos neurofibrilares difusos con calcificación; demencia con cuerpos de Lewy; síndrome de Down; miocardiopatía amiloidótica familiar (FAC); polineuropatía amiloidótica familiar (FAP); demencia británica familiar; demencia danesa familiar; encefalopatía familiar; fiebre mediterránea familiar; amiloidosis por fibrinógeno; amiloidosis hereditaria finlandesa; demencia frontotemporal con parkinsonismo; degeneración lobular frontotemporal (FTLD); demencia del lóbulo frontotemporal; enfermedad de Hallervorden-Spatz; amiloidosis relacionada con hemodiálisis; angiopatía amiloide cerebral hereditaria; hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis; distrofia corneal reticular hereditaria; enfermedad de Huntington; angiopatía amiloide cerebral hereditaria islandesa; miositis por cuerpos de inclusión; amiloidosis localizada por inyección; amiloidosis de polipéptido amiloide de los islotes; amiloidosis por lisozima; mieloma múltiple; distrofia miotónica; enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; enfermedad de motoneuronas no guameña con ovillos neurofibrilares; enfermedad de Parkinson; amiloidosis periférica; enfermedad de Pick; prolactinoma hipofisario; parkinsonismo postencefalítico; angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica; enfermedad mediada por priones; kuru; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD); enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS); insomnio familiar fatal (FFI); encefalopatía espongiforme ovina; encefalopatía espongiforme; proteinosis alveolar pulmonar; gliosis subcortical progresiva; parálisis supranuclear progresiva; amiloidosis sistémica senil; amiloidosis sérica AA; atrofia muscular espinal y bulbar; ataxia espinocerebelosa (SCA1, SCA3, SCA6 o SCA7); panencefalitis esclerosante subaguda; amiloidosis sistémica; amiloidosis familiar; amiloidosis de tipo silvestre; demencia por ovillos únicamente; y tauopatías.
- 29. El polipéptido o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 28, en donde la enfermedad se selecciona de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington.
- 30. El polipéptido o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 29, en donde la enfermedad es enfermedad de Alzheimer.
- 31. El polipéptido o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 28, en donde la enfermedad es una enfermedad mediada por priones seleccionada de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, kuru, insomnio familiar fatal y enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker.
- 32. Un agente de obtención de imágenes de amiloide que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y una etiqueta detectable.
- 33. El agente de obtención de imágenes de amiloide de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicha etiqueta detectable incluye etiquetas fluorescentes o radioetiquetas, tales como 18F, 11C y 123I.
- 34. El agente de obtención de imágenes de amiloide de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, en donde el agente de obtención de imágenes puede detectar proteína amiloide y diagnosticar una enfermedad asociada con proteína amiloide mal plegada y/o agregada.
- 35. El usoin vitrodel agente de obtención de imágenes de amiloide de acuerdo con la reivindicación 32 o 33 para detectar depósitos de amiloide en una muestra de un sujeto.
- 36. Un agente de obtención de imágenes de amiloide de acuerdo con la reivindicación 32 o 33 para su uso en el diagnósticoin vivode una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas, agregación de proteínas o neurodegenerativa.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862685757P | 2018-06-15 | 2018-06-15 | |
US201862749499P | 2018-10-23 | 2018-10-23 | |
PCT/US2019/037179 WO2019241628A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-06-14 | General amyloid interaction motif (gaim) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2960493T3 true ES2960493T3 (es) | 2024-03-05 |
Family
ID=67263052
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES19739769T Active ES2960493T3 (es) | 2018-06-15 | 2019-06-14 | Motivo de interacción amiloide general (GAIM) |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11692017B2 (es) |
EP (2) | EP3806884B1 (es) |
JP (1) | JP7549536B2 (es) |
CN (1) | CN112672755A (es) |
AU (1) | AU2019287623A1 (es) |
BR (1) | BR112020025111A2 (es) |
CA (1) | CA3102841A1 (es) |
ES (1) | ES2960493T3 (es) |
IL (1) | IL279333B2 (es) |
MX (1) | MX2020013525A (es) |
PL (1) | PL3806884T3 (es) |
SG (1) | SG11202012091WA (es) |
WO (1) | WO2019241628A1 (es) |
ZA (1) | ZA202100071B (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2019287623A1 (en) * | 2018-06-15 | 2021-01-07 | Amyl Therapeutics Srl | General amyloid interaction motif (GAIM) |
EP3927725A4 (en) * | 2019-02-22 | 2023-06-14 | Loyola Marymount University | AMYLOID PEPTIDE VARIANTS |
WO2024119183A1 (en) | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Alzheon, Inc. | Methods for treating neurodegenerative disorders with tramiprosate |
CN117343200B (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-30 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | 一种包含淀粉样核心多肽的融合蛋白、制备方法及其应用 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3941763A (en) | 1975-03-28 | 1976-03-02 | American Home Products Corporation | PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates |
US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
CA2249195A1 (en) | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
US8022270B2 (en) | 2000-07-31 | 2011-09-20 | Biolex Therapeutics, Inc. | Expression of biologically active polypeptides in duckweed |
EP1355919B1 (en) | 2000-12-12 | 2010-11-24 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
EP1673395A1 (en) | 2003-10-15 | 2006-06-28 | PDL BioPharma, Inc. | Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig |
CN104093414A (zh) * | 2011-11-29 | 2014-10-08 | 神经噬菌体制药股份有限公司 | 噬菌体的p3作为淀粉样蛋白结合剂的用途 |
DK2906235T3 (en) | 2012-10-02 | 2017-09-25 | Proclara Biosciences Inc | USE OF P3 OF BACTERIOPHAGIC FUSION PROTEINS AS AMYLOID BINDING AGENTS |
EA030389B1 (ru) * | 2013-05-28 | 2018-07-31 | Проклара Байосайенсиз, Инк. | ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ |
EP3227313B1 (en) * | 2014-12-03 | 2022-02-09 | Proclara Biosciences, Inc. | Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence lacking a glycosylation signal |
AU2019287623A1 (en) * | 2018-06-15 | 2021-01-07 | Amyl Therapeutics Srl | General amyloid interaction motif (GAIM) |
-
2019
- 2019-06-14 AU AU2019287623A patent/AU2019287623A1/en active Pending
- 2019-06-14 PL PL19739769.8T patent/PL3806884T3/pl unknown
- 2019-06-14 WO PCT/US2019/037179 patent/WO2019241628A1/en active Search and Examination
- 2019-06-14 CN CN201980049538.2A patent/CN112672755A/zh active Pending
- 2019-06-14 MX MX2020013525A patent/MX2020013525A/es unknown
- 2019-06-14 JP JP2020569166A patent/JP7549536B2/ja active Active
- 2019-06-14 SG SG11202012091WA patent/SG11202012091WA/en unknown
- 2019-06-14 EP EP19739769.8A patent/EP3806884B1/en active Active
- 2019-06-14 CA CA3102841A patent/CA3102841A1/en active Pending
- 2019-06-14 ES ES19739769T patent/ES2960493T3/es active Active
- 2019-06-14 EP EP23188404.0A patent/EP4389154A2/en active Pending
- 2019-06-14 BR BR112020025111-9A patent/BR112020025111A2/pt unknown
- 2019-06-14 US US17/251,351 patent/US11692017B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-09 IL IL279333A patent/IL279333B2/en unknown
-
2021
- 2021-01-05 ZA ZA2021/00071A patent/ZA202100071B/en unknown
-
2023
- 2023-05-19 US US18/320,697 patent/US20230279064A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112020025111A2 (pt) | 2021-04-06 |
SG11202012091WA (en) | 2021-01-28 |
CN112672755A (zh) | 2021-04-16 |
IL279333B2 (en) | 2023-06-01 |
US20230279064A1 (en) | 2023-09-07 |
US20210246179A1 (en) | 2021-08-12 |
EP3806884B1 (en) | 2023-08-02 |
ZA202100071B (en) | 2023-04-26 |
AU2019287623A1 (en) | 2021-01-07 |
PL3806884T3 (pl) | 2023-11-20 |
MX2020013525A (es) | 2021-02-26 |
WO2019241628A1 (en) | 2019-12-19 |
CA3102841A1 (en) | 2019-12-19 |
EP4389154A2 (en) | 2024-06-26 |
JP7549536B2 (ja) | 2024-09-11 |
US11692017B2 (en) | 2023-07-04 |
EP3806884A1 (en) | 2021-04-21 |
EP3806884C0 (en) | 2023-08-02 |
JP2021527407A (ja) | 2021-10-14 |
IL279333A (en) | 2021-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2960493T3 (es) | Motivo de interacción amiloide general (GAIM) | |
US10526377B2 (en) | Fusion proteins comprising P3 of bacteriophage | |
ES2283463T3 (es) | Agentes terapeuticpos y metodos de uso de los mismos para tratar una enfermedad amiloidogenica. | |
JP6921006B2 (ja) | 老化関連症状を治療するための方法および組成物 | |
ES2762672T3 (es) | Proteínas de fusión de P97-IDS | |
JP6440765B2 (ja) | アミロイド結合剤としてのバクテリオファージのp3の使用 | |
ES2910017T3 (es) | Polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos modificada de g3p de bacteriófago que carece de una señal de glicosilación | |
US20240000971A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of tauopathy | |
EA046070B1 (ru) | Общий амилоид-взаимодействующий мотив (gaim) | |
US20100104550A1 (en) | Cleavage of bip by subtilase cytotoxin | |
PT1025121E (pt) | Péptidos capazes de inibir a interacção entre as presenilinas e o péptido beta-amilóide ou o seu precursor |