JP2021526800A - 熱安定性ルシフェリンと共に生物発光アッセイに使用するためのルシフェラーゼ酵素 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2018年6月5日に出願の米国特許仮出願第62/680,899号の優先権及び利益を主張し、これはその全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含め、本文書が優先する。本明細書に記載されるものと同様または同等な方法及び材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書において開示される材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
1)アラニン(A)及びグリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)及びグルタミン(Q);
4)アルギニン(R)及びリジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、及びバリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)及びトリプトファン(W);
7)セリン(S)及びトレオニン(T);ならびに
8)システイン(C)及びメチオニン(M)。
本開示の実施形態は、熱安定性5,5−二置換ルシフェリンアナログと組み合わされる場合に高い活性(例えば、10倍〜100,000,000倍の改善)を付与する変異を含有する改善及び増強されたルシフェラーゼ酵素バリアント(例えば、配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアント)を含む。これらの増強されたルシフェラーゼ酵素の熱安定性ルシフェリンアナログとの組み合わせは、改善された熱的安定性、活性、及び寿命を有する生物発光アッセイを実行するための生物発光アッセイ系/プラットフォームを含む。この増強された生物発光アッセイ系/プラットフォームは、例えば、現行の制限を越える幅広い温度領域で一定期間安定している簡略化された単一の液体試薬配合物を最小限の性能の損失で可能にすることによって、現在利用可能なシステム/プラットフォームを超える顕著な利点を提供する。熱安定性ルシフェリンアナログとしては、図1に示す5,5−二置換ルシフェリンまたはルシフェリンアナログが挙げられる。5,5−二置換ルシフェリンまたはルシフェリンアナログは予想外の熱的安定性を示し、ルシフェリン分解生成物(例えば、デヒドロルシフェリン)によって引き起こされる阻害が実質的に低減されたルシフェラーゼ検出システムを提供し得る。
幾つかの実施形態では、5,5−二置換ルシフェリンは、他の公知のルシフェリンより優れた熱的安定性を示す。デヒドロルシフェリンは、溶液中での経時的なD−ルシフェリンの分解によりもたらされる主な生成物として同定された。デヒドロルシフェリンはルシフェラーゼを阻害し、このことは、光出力の減少をもたらし、ルシフェラーゼアッセイへの顕著な影響を引き起こす。5,5−ジメチルルシフェリンでは(例えば、6−OH化合物及び6−NH2化合物では)ごくわずかな分解しか起こらないが、非置換ルシフェリンでは、対応するデヒドロルシフェリンの生成を伴う顕著な分解が起こるために、本開示の5,5−二置換ルシフェリンアナログは、溶液中で改善された熱的安定性を示す。幾つかの実施形態では、5,5−二置換は、デヒドロルシフェリン形成の可能性を排除することにより、ルシフェリンアナログ化合物の全体的な熱的安定性を改善する。
5,5−二置換ルシフェリンアナログ化合物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントと共に使用された場合に十分な光を生成して、ルシフェラーゼアッセイに使用するための好適な基質となる。幾つかの実施形態では、本明細書において開示されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、様々な条件下のルシフェラーゼアッセイにおいて、5,5−ジメチルルシフェリンを用いて他のルシフェラーゼにより見られるよりも非常に強い光シグナルを提供する。本開示以前では、任意の特定の5,5−二置換ルシフェリンアナログがルシフェラーゼアッセイで有用となるのに十分な光を生成するかどうかが、以前の研究からは明らかでなかった。
本開示の実施形態は、生物発光アッセイにおいて熱安定性5,5−二置換ルシフェリンアナログと組み合わされた場合に高い活性(例えば、10倍〜1,000,000倍以上の改善)を付与するアミノ酸置換を含有する、改善及び増強されたルシフェラーゼ酵素バリアント(例えば、配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアント)を提供する。熱安定性5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して改善された活性(例えば、生物発光シグナル)を有するバリアントを同定する試みの一部として、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドが、図2A〜2Bに示すように、Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(ATG−2287または配列番号1)の配列に基づいて作製された。図2A及び2Bは、活性部位飽和スクリーニング、合理的突然変異誘発、デヒドロLH2耐性スクリーニング、組み合わせ解析、線形回帰解析、ならびにエラープローンPCR及びDNAシャフリングを使用した、これらのルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドの作製を要約する。本開示のルシフェラーゼポリペプチドにおいて同定される配列番号1と比較したアミノ酸置換を、以下の表1に提供する。
表1:増強されたルシフェラーゼポリペプチド
幾つかの実施形態では、試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び/またはルシフェリンアナログ(及び場合によりルシフェリンアナログ分解生成物)に加えて、保存(例えば、酵素安定性のため)、取り扱い(例えば、試薬組成物の分配を容易にするため)、及び/またはアッセイ性能のための追加の構成成分を更に含む。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、塩または金属イオン(例えば、Mg2+)、界面活性剤、緩衝液などを追加的に含む。幾つかの実施形態では、追加の構成成分は、試薬組成物の一部であり、ルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンと同一の容器に保存される。幾つかの実施形態では、試薬組成物(例えば、ルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンを含む)は、キットの一部として提供され、当該キットは、当該試薬組成物とは別個の容器に保存される追加の構成成分/試薬を含む。
本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物(例えば、ルシフェラーゼバリアント及び5,5−二置換ルシフェリンアナログを含む)は、なんらの特定の方法または用途における使用に限定されないが、それらの安定性及び活性(分解生成物の存在下での安定性及び活性を含む)のために、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物は、試料中のATPの検出及び標的酵素活性の検出または定量化に特に有用である。
本開示のルシフェリンアナログ化合物(例えば、米国特許出願番号第15/829,581号/PCT出願第PCT/US2017/064284号に記載されている(これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))を試験して、コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼ、配列番号1のPpeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、及びホタルルシフェラーゼが含まれる様々なルシフェラーゼ酵素の基質としてのそれらの活性を決定した。各酵素の0.05mg/mLの溶液を、3mMのATPを含有するBRIGHT−GLO(商標)アッセイ緩衝液(Promega E263A)中に調製した。次いで、各酵素の3倍連続希釈物を、3mMのATPを含有するBRIGHT−GLO(商標)アッセイ緩衝液中に調製し、各ストックの300μLを、700μLの緩衝液中に連続希釈した。各基質の溶液(0.5mM)を、ルシフェリンを含まない水中に調製し、50μLの各基質溶液を、50μLの酵素希釈物と組み合わせた。試料を室温で1分間インキュベートし、発光をGLOMAX(登録商標)−Multi+プレートルミノメーターで測定した。試験された酵素(コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼ、配列番号1のPpeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、及びホタルルシフェラーゼ)は、本開示のジメチル基質を利用して光を生成することができた。これらの試験において、コメツキムシ酵素は、ジメチル基質を利用して、Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)及びホタルルシフェラーゼよりも強いシグナルを生成した。
図3は、Ppeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)に対して高親和性を有するルシフェリンアナログを同定するための競合阻害アッセイの結果の代表的なグラフを含む。より具体的には、図3は、ルシフェリンアナログCS0280、CS0333、CS0510、CS0326、CS0325、及びCS0431の非存在または存在下でのD/L−ルシフェリンによるPpeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)の正規化された発光を含む。これらの生物発光実験のための試薬組成物は、Bright−Glo(商標)緩衝液(Promega E263A)中の0.005mg/mLの配列番号1のPpeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、0.5mMのATP、及び100nMのLH2を含み、これに0または1mMの5,5−二置換ルシフェリンアナログが添加された。
図7は、配列番号1の244位及び339位でのアミノ酸置換を有するルシフェラーゼ酵素バリアントの、5,5−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。アッセイは、酵素を発現するE.coliの一晩培養物をDetection Reagent+ATP+基質(ルシフェリンアナログ化合物CS0280、CS0333、CS0510、及びCS0326)と組み合わせることにより調製し、発光を3分の時点で読み取った。試薬組成物は、配列番号1のPpeバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの50μlの可溶化液、0.5mMの基質、及び1mMのATPを含んだ。これらのデータは、E.coli可溶化液を使用した実験が、ATG−2889(H244W)の活性が、CS0333でバックグラウンドの約285倍超であり、その活性は、Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)のCS0333でのバックグラウンドより低かった(阻害された)活性より顕著に高かったことを実証することを示す。
図10A〜10Bは、5,5−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性に対するアミノ酸置換の効果を評価している代表的なグラフを含む。具体的には、図10Aは、Detection Reagent緩衝液を使用した実験の結果を含み、図10Bは、Bright−Glo(商標)緩衝液を使用した実験の結果を含む。ルシフェリンアナログ化合物は、DMSO中で50mM〜20mMに希釈された。ルシフェラーゼ酵素を、1×TBS+1%のPrionex中に0.01mg/mlまで希釈した。試薬組成物は、50μlのBright−Glo(商標)またはDetection Reagent緩衝液中1mMのアナログ化合物+1mMのATP+0.5mMの化合物を含み、これを1×TBS+1%のPrionex中に希釈された50μlの酵素と組み合わせた。プレートを3分の時点で読み取った。図10A及び10Bの両方に示すように、アミノ酸置換の試験された全ての組み合わせは、CS0280(ジメチルルシフェリン)またはCS0333(シクロプロピルルシフェリン)のいずれかの利用において、Ppe(配列番号1)の熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比較して改善された活性を有するルシフェラーゼ酵素バリアントをもたらした。ATG−2889バリアントは、Detection Reagent Bufferにおいて両方のアナログに対して最も高い活性を有するため、これを更なる進化スクリーニングに選択した。
ルシフェラーゼバリアントATG−2889(H244W+T344A+I396K)の活性を、ルシフェリンアナログで活性を示した唯一の既知のルシフェラーゼであったコメツキムシ緑色(CBG99)と比較した。図11A〜11Bは、ルシフェラーゼ酵素バリアントATG−2889及びコメツキムシ緑色(CBG99)と共に使用した、CS0333ルシフェリンアナログのアミノバージョン(6916−01)及びフルオロバージョン(9626−01)の効果を評価している代表的なグラフを含む。具体的には、図11Aは、Detection Reagent緩衝液を使用した実験の結果を含み、図11Bは、Bright−Glo(商標)緩衝液を使用した実験の結果を含む。ルシフェリンアナログ化合物は、Detection Reagent BufferまたはBright−Glo(商標)緩衝液中で50mM〜20mMに希釈された。ルシフェラーゼ酵素を、1×TBS+1%のPrionex中に0.01mg/mlまで希釈した。試薬組成物は、50μlのReaction Buffer+ATPを含み、これを50μlの希釈された酵素と組み合わせた。プレートを室温で30分間インキュベートして、バックグラウンドを最小限にし、5μlのルシフェリンアナログ基質を1mM(OH−ルシフェリンについては100nM)の最終濃度に添加した。プレートを、化合物添加前後の3分及び20分時点で読み取った。図11A及び11Bの両方に示すように、ATG−2889バリアントは、ルシフェリンアナログでCBG99と比較して増強された活性を示し、またATG−2889は、配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアントであるため、CBG99と比較して増強された熱安定性及び緩衝液に対する耐性も示す。更に、CS0333のアミノバージョン(6916−01)及びフルオロバージョン(9626−01)は、それらがCBG99で同程度の活性を示した場合であっても、ATG−2889バリアントではより明るくなかった。
Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)に基づいたエラープローンPCR(epPCR)ライブラリー、続いて、アミノ酸置換の最適な組み合わせを見つけるためのトップヒットのDNAシャフリングを使用して、指向性進化(DE)スクリーニングにより酵素活性の更なる改善を付与するアミノ酸置換を有するバリアントを同定した。図12Aは、CS0280、CS0333、及びCS0510ルシフェリンアナログを使用したこれらのバリアントの活性試験の代表的な結果を含む。これらの実験を実施するために、試薬組成物は、Bright−Glo(商標)(BG)緩衝液またはDetection Reagent(DR)緩衝液中の0.005mg/mlの酵素+1mMのATP+1mMの基質を含んだ。示すように、幾つかのクローンがスクリーニングにより同定され、精製されたタンパク質を用いて、CS0280(ジメチルルシフェリン)及びCS0333(シクロプロピルルシフェリン)による改善された明るさを有することが確認された。テーブルは、各列の中での相対的な発光値に従って赤色〜緑色のスペクトルにわたる色がつけられており、最も低い値は赤色に着色され、最も高い値は緑色に着色されている。
合理的突然変異誘発を使用して、ルシフェラーゼ酵素バリアントATG−2671(G245A+L285I+G315A)におけるアミノ酸置換が同定され、改善された活性を付与すると仮定された。これを試験するために、Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)及びATG−2671の両方のVmax及びKmを比較した。図15は、ルシフェラーゼ酵素バリアントATG−2671のD/L−ルシフェリンでの動力学的活性の代表的なグラフを含む。試薬組成物は、1×TBS+1%のPrionex中に0.01mg/mlまで希釈された酵素、Bright−Glo(商標)緩衝液中に2mMまで希釈されたATP、Bright−Glo(商標)緩衝液+ATP中に連続希釈されたOH−ルシフェリンを含み、Bright−Glo(商標)緩衝液+ATP中の50μlの基質が、1×TBS+1%のPrionex中に希釈された50μlの酵素と組み合わされた。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。ATG−2671は、ルシフェリンアナログ(データ非表示)では活性を示さなかったが、D/L−ルシフェリンではPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)と同程度の活性及び動力学を示し、ATG−2671がルシフェリンアナログを利用することができないのは酵素活性の欠如のためではなかったことを示唆する。
表2:熱安定性ATG−2889バリアントの増強された活性
表3:配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント及びATG−3707のVmax及びKm値
表4:改善された活性を有するATG−3707のバリアント
表5:ATG−3707バリアントの動力学解析
表6:CS0280及びCS0333で改善された活性を示すバリアント
図20A〜20B及び21A〜21Bは、ATG−2624及びATG−2625がデヒドロ−F−ルシフェリンにより阻害されるが、配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアントよりは阻害されず、配列番号1のPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比べてデヒドロ−F−ルシフェリンに対する増強された耐性を示すが、完全な耐性は示さないことを示す。図20C及び21Cは、図20A〜20B及び21A〜21Bのデータの定量化を提供し、それぞれの緩衝液における、これらのルシフェラーゼ酵素バリアントのデヒドロ−F−ルシフェリンに対するKi値を示す。変異酵素のより高い値により、それらがPpeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)と比べてより耐性を示すことが確認された(すなわち、それらを阻害するのにより多くのデヒドロ−F−ルシフェリンを必要とする)。
ルシフェリンアナログのプロルシフェリンバージョンも、プロルシフェリンを分解させて、ルシフェリンまたはルシフェリンアナログから修飾部分を分離する(次いで、ルシフェリンまたはルシフェリンアナログは、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントの発光基質として機能する)ことによってプロルシフェリンを活性化する酵素(例えば、カスパーゼ−3、β−グルコシダーゼなど)と共に使用され得る。図27A〜27Bは、カスパーゼ−3活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである5,5−二置換ルシフェリンアナログ及びATG−3707バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。試薬組成物は、20mMのHEPES(pH7.5)、200mMのNaCl、10mMのMgSO4、2mMのATP中に50mMから1mMまで希釈されたルシフェリンアナログ化合物を含んだ。ATG−3707を、20mMのHEPES(pH7.5)、200mMのNaCl、10mMのMgSO4中に0.2mg/mlまで希釈した。カスパーゼ−3を、20mMのHEPES(pH7.5)、200mMのNaCl、10mMのMgSO4中に1U/μlから0.001U/μlまで10倍連続希釈した。次に、50μlの希釈されたATG−3707を、50μlの希釈されたCS0670+ATP混合物と組み合わせた。(図27AにおけるHEPESベースの緩衝液の代わりに、再構成緩衝液(100mMのMES(pH6.5)、5mMのMgCl2、0.2%のTergitol、0.002%のアジ化ナトリウム)を、図27Bにおいて使用した)。発光測定を60秒毎に行いながら、反応物を25℃で73分間インキュベートした。約50μlのカスパーゼ−3の各連続希釈物を反応物に添加し、混合し、152分の総実験時間の間、発光を60秒毎に測定した。示すように、発光はカスパーゼ−3の添加後に増加し、カスパーゼ−3は、CS0670アナログの対応する前駆体からの分離を促進し、ATG−3707の活性化を可能にした。従って、プロルシフェリンアナログ(例えば、シクロプロピルアナログ)は、本明細書に記載されるルシフェラーゼバリアントに対する効果的な基質であり得る。
図29は、Ppeの熱安定性ルシフェラーゼバリアント(配列番号1)及びATG−2877バリアントの示差走査蛍光定量(DSF)解析の代表的結果を含む。実験を実施するために、Sypro Orange(5000X)を水中に3倍希釈し、50mMのHEPES(pH7.5)、100mMのNaCl、2mMのEDTA中に5×の最終濃度で保存された酵素と組み合わせた。反応物を1分毎に1℃で30〜95℃に加熱しながら蛍光を60秒間隔で読み取った。各分での蛍光の変化を算出し、上記範囲の各温度に対してプロットした。示すように、ATG−2877におけるH244Wアミノ酸置換は、DSF解析による精製タンパク質の融解転移温度を変化させず、このアミノ酸置換が熱安定性の損失変化を引き起こさないことを示した。
追加のルシフェラーゼ酵素バリアントを作製し、それらの安定性及び活性を評価した。追加のルシフェラーゼ酵素バリアントを評価するために、0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアントを、Bright−Glo(商標)(BG)緩衝液またはDetection Reagent(DR)緩衝液中の1mMのATP+1mMの基質と混合した。以下の表7A及び7Bに示すように、幾つかのバリアントは、ATG−3707と比較してCS0280及びCS0333基質で改善された明るさを示した。(表7Aは、各列の中での相対的な発光値に従って赤色〜緑色のスペクトルにわたる色がつけられており、最も低い値は赤色に着色され、最も高い値は緑色に着色されている。)
表7A:CS0280及びCS0333で改善された活性を示すバリアント
表7B:CS0280及びCS0333で改善された活性を示すバリアント
表8:ATG3707及びATG4117のCS0280及びCS0333での活性
表9A:個々のアミノ酸置換及びアミノ酸置換の様々な組み合わせのCS0333でのルシフェラーゼ酵素バリアントに対する効果
表9B:個々のアミノ酸置換及びアミノ酸置換の様々な組み合わせのCS0333でのルシフェラーゼ酵素バリアントに対する効果
上記のPpe(配列番号1)の様々な熱安定性ルシフェラーゼバリアントの活性(すなわちVmax及びKm)を評価するための実験も実施した。これらの実験の代表的結果を以下に表に提供する。
表10:試薬組成物は、Bright−Glo(商標)緩衝液またはDetection Reagent緩衝液中の0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアント+1mMのATP、及び100fM〜1mMの基質を含んだ。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。
表11:試薬組成物は、Bright−Glo(商標)緩衝液またはDetection Reagent緩衝液中の0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアント+1mMのATP、及び1mMの基質を含んだ。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。
表12:試薬組成物は、Bright−Glo(商標)緩衝液またはDetection Reagent緩衝液中の0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアント+4mMのATP、及び400fM〜4mMの基質を含んだ。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。
表13:試薬組成物は、Detection Reagent緩衝液中の0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアント+2mMのATP、及び200fM〜2mMの基質を含んだ。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。
表14:試薬組成物は、Bright−Glo(商標)緩衝液中の0.005mg/mlのルシフェラーゼ酵素バリアント+2mMのATP、及び200fM〜2mMの基質を含んだ。組成物を、3分間インキュベートし、GloMax(登録商標) Multi+プラットフォーム上で読み取った。
Claims (76)
- 5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドであって、天然に存在しない前記ルシフェラーゼポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2との少なくとも70%の配列同一性、及び配列番号1との100%未満の配列同一性を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して、244位、249位、337位、及び339位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、H244W、H244G、及びH244R、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項3に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して、240位、254位、及び344位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、I240L、Y254S、及びT344A、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して300位及び396位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3及び5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、V300G及びI396K、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して245位、285位、及び315位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3、5及び7のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、G245A、L285I、及びG315A、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して109位、193位、214位、218位、228位、234位、262位、287位、294位、305位、306位、309位、316位、335位、及び533位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3、5、7、及び9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、I109V、S193A、I214L、F218L、N228D、S234T、V262A、V287I、L294H、L305F、S306P、K309E、A316S、V335G、及び/またはV533M、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して133位、233位、236位、及び503位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3、5、7、9、及び11のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、Q133H、T233S、I236V、及び/またはS503R、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して107位及び121位での少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1〜3、5、7、9、11、及び13のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、K107Q及び/またはK121N、及び/または前記少なくとも1つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項15に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、表1に列挙する配列番号2〜124のいずれか1つにおけるアミノ酸置換を含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の前記ルシフェラーゼポリペプチドのデヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害と比較して、前記デヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害に対する耐性を示す、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ルシフェラーゼポリペプチドにより生成される前記生物発光シグナルが、配列番号1の前記ルシフェラーゼポリペプチドにより生成される前記生物発光シグナルと比較して少なくとも10倍増加する、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換I240L、Y254S、T344A、及びI396K、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換N74N、H244R、V300G、及びI396K、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、及びI396K、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、T344A、及びI396K、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、T344A、I396K、V300G、L305P、及びS306P、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、T344A、I396K、S193A、N228D、L305F、S306P、及びI109V、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、I230F、V335G、及びI410M、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38S、Y108F、及びT376I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38S、F55I、V262A、及びI422V、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、Y108F、V261A、N427D、及びF431V、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、及びI230F、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、及びQ487R、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、N154S、V261A、及びI410M、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、Y183C、V261A、及びT289S、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、及びY32C、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、F246Y、及びV261A、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、及びI230F、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、K121Q、F246Y、及びV261A、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、Y254S、T344A、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、K121Q、V261A、及びV287I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してV348I、A316M、A316W、Y339M、T342S、A344I、K121Q、V261A、V287I、K107N、及びT289Sからなる群から選択される少なくとも1つの追加のアミノ酸置換、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換A316W、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してC38R、F55I、A316W、T342S、V348I、K205N、I396I、K121Q、Y339M、T344I、及びY108Fからなる群から選択される少なくとも1つの追加のアミノ酸置換、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換C38R、F55I、A316W、T342S、及びV348I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換C38R、F55I、Y108F、A316W、Y339M、及びT344I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較して、T344I、C38R、F55I、A316W、T342S、V348I、Y108F、Y339M、I240V、T284A、T289R、T289S、K353R、D435G、L437R、W510R、C257R、及びS313Tからなる群から選択される少なくとも1つの追加のアミノ酸置換、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、T344I、I396K、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38R、F55I、A316W、T342S、及びV348I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換C38R、F55I、Y108F、A316W、及びY339M、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38R、F55I、A316W、T342S、及びV348I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38R、F55I、Y108F、A316W、Y339M、T342S、及びV348I、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38R、F55I、Y108F、A316W、Y339M、T342S、V348I、T289S、K353R、D435G、及びW510R、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1と比較してアミノ酸置換H244W、S193A、N228D、L305F、S306P、I109V、C38R、F55I、Y108F、A316W、Y339M、T342S、V348I、C257R、T284A、T289S、S313T、K353R、D435G、L437R、及びW510R、及び/または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 生物発光アッセイのための試薬組成物であって、
5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドと、
前記ルシフェラーゼポリペプチドの基質と、を含む前記試薬組成物。 - 前記基質がラセミ体ルシフェリンである、請求項52に記載の試薬組成物。
- 前記基質がルシフェリンアナログである、請求項52に記載の試薬組成物。
- 前記ルシフェリンアナログが5,5−二置換ルシフェリンアナログである、請求項52に記載の試薬組成物。
- マグネシウムを更に含む、請求項52に記載の組成物。
- 緩衝液、脱泡剤、ATPアーゼインヒビター、L−ルシフェリン、アザチオチミン、酵素安定剤、界面活性剤、ATP生成酵素のインヒビター、細胞溶解剤、ATP抽出剤、補酵素A、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼインヒビター、ピロリン酸、フッ化ナトリウム、デヒドロルシフェリン、及び塩からなる群から選択される1種以上の追加成分を更に含む、請求項52または請求項53に記載の組成物。
- 前記試薬組成物が、単一の液体試薬である、請求項52〜57のいずれかに記載の組成物。
- 前記試薬組成物が、単一の乾燥試薬である、請求項52〜57のいずれかに記載の組成物。
- 固体成分及び液体成分を含む、請求項52〜57のいずれかに記載の組成物。
- 請求項52〜57のいずれかに記載の試薬組成物を含むキット。
- 生物発光アッセイを実行するための使用説明書を更に含む、請求項61に記載のキット。
- 前記生物発光アッセイが、カスパーゼ活性アッセイ、キナーゼ活性アッセイ、P450アッセイ、活性酸素種の測定、ヌクレオチドの検出もしくは定量化、細胞生存率の検出もしくは定量化、細胞障害性の検出もしくは定量化、または過酸化水素の検出もしくは定量化を含む、請求項61に記載のキット。
- 5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドと、
5,5−二置換ルシフェリンアナログと、を含むキット。 - 試料中のATPを検出または定量化するためのアッセイ系であって、
5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドを含む試薬組成物と、
5,5−二置換ルシフェリンアナログと、
ATPを含むか、または含むことが疑われる試料と、を含む、前記アッセイ系。 - 生物発光の検出及び/または測定のための装置を更に含む、請求項65に記載のアッセイ系。
- 前記試料が、細胞可溶化物試料、無細胞調製物試料、または精製酵素配合試料のうちの1種以上である、請求項65または請求項66に記載のアッセイ系。
- 前記試料が、環境試料、土壌試料、水試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、液体試料、飲料ベースの試料、または生化学試料のうちの1種以上である、請求項65または請求項66に記載のアッセイ系。
- 試料中のATPを検出または定量化する方法であって、
請求項65〜68のいずれかに記載のアッセイ系を、ATPを含むか、または含むことが疑われる前記試料に添加することと、
前記生物発光シグナルを検出または定量化することと、を含む前記方法。 - 試料中の標的酵素活性を検出または定量化するためのアッセイ系であって、
5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号1のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記5,5−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドを含む試薬組成物と、
5,5−二置換ルシフェリンアナログと、
標的酵素を含むか、または含むことが疑われる試料と、を含む前記アッセイ系。 - 前記5,5−二置換ルシフェリンアナログが、前記標的酵素の基質に結合されている、請求項70に記載のアッセイ系。
- 前記標的酵素が、プロテアーゼ、カスパーゼ、キナーゼ、シトクロム450、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、またはモノアミンオキシダーゼである、請求項70または請求項71に記載のアッセイ系。
- 生物発光の検出及び/または測定のための装置を更に含む、請求項70〜72のいずれかに記載のアッセイ系。
- 前記試料が細胞可溶化物である、請求項70〜73のいずれかに記載のアッセイ系。
- 前記試料が、環境試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、または生化学試料である、請求項70〜73のいずれかに記載のアッセイ系。
- 試料中の標的酵素活性を検出または定量化する方法であって、
請求項70〜75のいずれかに記載のアッセイ系を、標的酵素活性を含むか、または含むことが疑われる前記試料に添加することと、
前記生物発光シグナルを検出または定量化することと、を含む前記方法。
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