JP2021523133A - ケトキサール誘導体に関連する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年5月8日に出願された米国仮特許出願第62/668,543号および2018年5月9日に出願された米国仮特許出願第62/668,994号に対する優先権の恩典を主張し、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたHG008935の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
態様は概して、分子生物学および細胞生物学に関する。特に、態様は、核酸を標識するための方法および組成物を目的とする。
RNAフォールディングの知識は様々なRNA種の機能を理解するために不可欠である(Wan et al., Nat. Rev. Genet. 12:641-55, 2011(非特許文献1))。化学プローブはトランスクリプトーム全体のRNA二次構造研究において重要な役割を果たしてきた(Kubota et al., Nat. Chem. Biol. 11:933-41, 2015(非特許文献2))。ハイスループットRNA構造マッピングについてのますます増加する方法が近年開発されている(Kertesz et al., Nature 467:103-7, 2010(非特許文献3); Underwood et al., Nat. Methods 7:995-1001, 2010(非特許文献4); Lucks et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 108:11063-68, 2011(非特許文献5); Rouskin et al., Nature 505:701-5, 2014(非特許文献6); Ding et al., Nature 505:696-700, 2014(非特許文献7); Talkish et al., RNA 20:713-20, 2014(非特許文献8); Wan et al., Nature 505:706-9, 2014(非特許文献9); Spitale et al., Nature 519:486-90, 2015(非特許文献10); Zubradt et al., Nat. Methods 14:75-82, 2016(非特許文献11); Siegfried et al., Nat. Methods 11:959-65, 2014(非特許文献12); Lee et al., RNA 23:169-74, 2017(非特許文献13); Feng et al., Nat. Chem. Biol. 14:276-83, 2018(非特許文献14))。化学プローブの2つの注目すべきクラスであるDMSおよびSHAPEは、トランスクリプトーム全体のインビボRNAストラクチュロームマッピングを可能にする(Lu and Chang, Curr. Opin. Struct. Biol. 36:142-48, 2016(非特許文献15))。方法は両方とも非常に有効であるが、改善の余地が依然としてかなりあり;DMSは、非常に有毒であり、非特異的であり、m1Aだけでなくm7Gおよびm3Aもメチル化することができ、これは構造決定を潜在的に複雑にし、一方、SHAPE分子は、加水分解的に不安定であり、塩基の代わりに糖2’-OHを標識する(NTP (National Toxicology Program) 2016, Report on Carcinogens, Fourteenth Edition.; Research Triangle Park, NC: U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service.URL ntp.niehs.nih.gov/go/roc/(非特許文献16); Merino et al., J. Am. Chem. Soc. 127:4223-31, 2005(非特許文献17))。
を有する化合物に関し、式中、Yは、アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、ジエンオフィル(dieneophile)、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、およびアルケンより選択されるクリックケミストリー部分であり得;かつ、Xはリンカーであり得る。ある局面において、クリックケミストリー部分(Y)はアジドである。リンカー(X)は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、〜C10アルキル(1つまたは複数の態様は具体的に除外され得る)またはポリエチレングリコールリンカーであり得る。ある局面において、リンカー(X)はCH2である。ある局面において、Xは、アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、ジエンオフィル、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、およびアルケンより選択されるクリックケミストリー部分であり得;かつ、Yはリンカーであり得る。ある局面において、クリックケミストリー部分(X)はアジドである。リンカー(Y)は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、〜C10(1つまたは複数の態様は具体的に除外され得る)アルキルまたはポリエチレングリコールリンカーであり得る。ある局面において、リンカー(Y)はCH2である。
(a) (i)テトラヒドロフラン(THF)中で水素化ナトリウムを2-アジドエタノールと混ぜ合わせて第1の中間混合物を形成すること、
(ii)2-ブロモプロピオン酸エチルを第1の中間混合物へ添加して第1の反応混合物を形成すること、
(iii)第1の反応混合物を窒素(N2)雰囲気下で室温にてインキュベートして2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を形成すること、
(iv)反応を水でクエンチすること、(v)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸をLiOH水溶液へ添加し、室温でインキュベートすること、および
(vi)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を洗浄し、単離し、無水Na2SO4で乾燥させること
によって、2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸中間体を生成する工程;
(b) (i)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を無水CH2Cl2およびジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解すること、
(ii)塩化オキサリルを添加し、室温で撹拌すること、
(iii)溶媒および過剰な塩化オキサリルを除去して残留物を形成すること、
(iv)残留物を無水CH3CNおよび(トリメチルシリル)ジアゾメタン中に溶解すること、
(v)ジエチルエーテルを滴下して第2の反応混合物を形成すること、
(vi)第2の反応混合物を0℃で一晩撹拌すること、
(vii)溶媒を蒸発させて3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンを単離すること
によって、3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オン中間体を生成する工程;ならびに
(c) (i)3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンをアセトン中のジメチルジオキシラン(DMD-アセトン)へ添加して第3の反応混合物を形成すること、
(ii)第3の反応混合物を室温で撹拌してN3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを形成すること、および
(iii)N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを単離すること
によって、N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを生成する工程。
(a) (i)テトラヒドロフラン(THF)中で水素化ナトリウムを2-アジドエタノールと混ぜ合わせて第1の中間混合物を形成すること、
(ii)2-ブロモプロピオン酸エチルを第1の中間混合物へ添加して第1の反応混合物を形成すること、
(iii)第1の反応混合物を窒素(N2)雰囲気下で室温にてインキュベートして2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を形成すること、
(iv)反応を水でクエンチすること、
(v)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸をLiOH水溶液へ添加し、室温でインキュベートすること、および
(vi)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を洗浄し、単離し、無水Na2SO4で乾燥させること
によって、2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸中間体を生成する工程;
(b) (i)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を無水CH2Cl2およびジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解すること、
(ii)塩化オキサリルを添加し、室温で撹拌すること、
(iii)溶媒および過剰な塩化オキサリルを除去して残留物を形成すること、
(iv)残留物を無水CH3CNおよび(トリメチルシリル)ジアゾメタン中に溶解すること、
(v)ジエチルエーテルを滴下して第2の反応混合物を形成すること、
(vi)第2の反応混合物を0℃で一晩撹拌すること、
(vii)溶媒を蒸発させて3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンを単離すること
によって、3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オン中間体を生成する工程;ならびに
(c) (i)3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンをアセトン中のジメチルジオキシラン(DMD-アセトン)へ添加して第3の反応混合物を形成すること、
(ii)第3の反応混合物を室温で撹拌してN3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを形成すること、および
(iii)N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを単離すること
によって、N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを生成する工程。
本明細書において使用される場合、用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の窒素含有複素環式部分を指す。好適な核酸塩基の非限定的な例としては:天然および合成誘導体を含む、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、5-メチルシトシン、プソイドイソシトシン、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)およびN8-(8-アザ-7-デアザアデニン)が挙げられる。記載される様々な態様において有用な核酸塩基は、RNA分子への結合およびRNA分子の転写を可能にし、さらに、転写されたRNAの検出および精製に有用なレポーター部分をそれらへ結合させていてもよい。当業者は、修飾形態および機能的類似体核酸塩基も具体的に考慮されることを認識するだろう。
との標識化反応ならびにビオチン-DBCOでのビオチン化(レーン5、6)の変性ゲル電気泳動分析。N3-ケトキサール標識RNAのみがビオチン化され得る(レーン6)。下部:標識化およびビオチン化反応後のRNAのドットブロット。メチレンブルードット結果が対照として列挙される。(e)異なる期間、1、5、10、15、20分でN3-ケトキサールによって処理された、mES細胞由来の単離された全RNAのドットブロット。(f)95℃にて50 mM GTPの存在下でのN3-ケトキサール標識mRNAの可逆性のドットブロット分析。mRNA中のN3-ケトキサール修飾は、10分間インキュベーション後に完全に除去された。
(図2)図2A〜F:(a)2つの個々のssDNA-seqライブラリー間のピアソン相関。(b)ピーク数および2つの個々のssDNA-seqライブラリー間のそれらの重複。(c)異なるゲノム特徴上のssDNAピークの分布。(d)同じ遺伝子座での対応するATAC-seq、H3K4me3 ChIP-seq、H3K36mes ChIP-seq、GRO-seqおよびPol II ChIP-seqプロフィールを伴った、UCSCゲノムブラウザ上での整列されたssDNA-seqリードのスナップショット。(e)ATAC-seq、H3K36me3 ChIP-seq、R-ChIPおよびGRO-seqと比較した、遺伝子コーディング領域上のssDNA-seqピークの分布。(f)ssDNA-seqと他の転写関連ゲノムワイドシーケンシングアッセイとの相関。
(図3)図3A〜E:(a)全ての発現遺伝子を、高、中または低RNAレベルを有する3つの群へ分類する。(b)(a)に示される3つの群中のssDNA、ATAC-seq H3K36me3およびH3K27acシグナル。(c)対照、DRB処理およびトリプトライド処理細胞中のssDNAピーク数(各条件について2つのレプリケートを行った、Trip = トリプトライド)。(d)対照、DRB処理およびトリプトライド処理条件における、遺伝子コーディング領域上のssDNA-seqピークの分布。(e)全ての遺伝子を、対照およびDRB処理条件下でのそれらのssDNA形成に従って異なるPol II休止および活性を有する4つの群へ分類した。各群中の一例をUCSCゲノムブラウザ上に示した。
(図4)図4A〜G:(a)ケトキサール補助RNA-RNA相互作用(KARRI)のスキーム。ボールはPAMAMデンドリマーを表す。ドットおよびロッドは、それぞれ、ビオチンおよびDBCO部分を表す。(b)〜(c)N3-ケトキサール標識RNAに対するDBCOおよびビオチン装飾PAMAMデンドリマーによる架橋の効率のゲル電気泳動(b)およびドットブロット(c)分析。(d)2つの個々のKARRIライブラリー間のピアソン相関。(e)デンドリマーを添加しなかったまたは近接ライゲーションを行わなかった2つの対照実験を伴う、KARRIによって明らかにされた45S rRNAの相互作用マップ。(f)PARISによって明らかにされた45S rRNAの相互作用マップ。(g)KARRIはRPL17 mRNAの2つの代替コンフォメーションを明らかにする。
(図5)図5A〜C:(a)KARRIがインビトロおよびインビボでのRNA二次構造間の差異を検出することを示す2つの例。ハリングトニン処理細胞において、インビボ特異的構造は損なわれ、一方、いくつかのインビトロ特異的特徴が現われた。関心対象の領域は円である。(b)インビトロ、インビボ、CHXおよびHT処理サンプル中の分子内mRNA二次構造のメタジーンプロフィール(metagene profile)。(c)HepG2 mRNAの全てのキメラリードのモチーフ解析結果。AGAGAAはeIF4AIIIの公知の結合モチーフと同様である。
(図6)図6A〜C:(a)光補助RNA標識化のスキーム。365 nm UVは光脱ケージ化反応を誘発し、生成物は、「クリック」ケミストリーを通してN3-ケトキサール標識核酸へ捕捉およびコンジュゲートされ得る。(b)光補助RNA標識化の質量スペクトル分析。(c)フォト-DBCO-OHの2つの潜在的な官能化戦略ならびにインサイチュRNAシーケンシングおよびイメージングにおけるそれらの潜在的な適用。
(図7)図7A〜F:Keth-seq法およびrG4領域周りのプロフィール。(a)keth-seqのライブラリー調製のための戦略の図。(b)N3-ケトキサールサンプルについてのレプリケート間の逆転写(RT)停止リード分布の散布図。挿入円グラフは、レプリケート2(左上)およびレプリケート1(右下)についてのRT停止塩基分布を示す。(c)全ての転写物についてのketh-seqおよびicSHAPE間の相関係数の累積プロット。各々の共通の転写物について、ピアソン相関係数をグアニン塩基の構造シグナルについて計算する。(d)予測される18SリボソームRNA構造およびプロービング構造プロフィール間の比較。予測される18S rRNA構造はRNA STRANDデータベース(id: CRW_00356)に由来する。(e)PDSおよび対照サンプル間の一般に知られているrG4領域のGINI指数。rG4領域はKit et.al., 2016, Nature methodに由来する(n = 13,423)。105個の領域が構造情報を有し、プロットされている(50ヌクレオチド長へ延長される)。(f)以前に同定されたインビトロrG4領域周りの構造プロフィールの2つの例。
(図8)4種類のRNA核塩基とのN3-ケトキサールのHPLC結果。N3-ケトキサールはグアニン(G)のみと反応することができ、A、C、およびUでは不活性であったことが示された。
(図9)N3-ケトキサールおよびSHAPE分子NAIのRNA反応性の比較。NAIを以前の報告された方法に従って合成した(Spitale et al., Nature Chemical Biology 9:18, 2012)。上部のグラフ:12 mer RNAオリゴの分子量(MW)。中央のグラフ:12 mer RNAオリゴとN3-ケトキサールとの反応の生成物のMW。下部のグラフ:RNAオリゴとNAIとの反応の生成物のMW。結果は、全てのグアニン(4つのグアニン)がN3-ケトキサールによって修飾されたことを示した。NAI反応について、いくつかのオリゴは1個のNAIによってのみ反応され、いくつかは2または3個によって標識された。原則として、RNAオリゴのリボース(12個のリボース)中の全ての2’-OH基がNAIの標的である。従って、N3-ケトキサールはRNAへのより高い反応性を示した。
(図10)RNA中におけるN3-ケトキサール標識化およびビオチン化反応のスキーム(上部)および質量スペクトル(下部)分析。4つのグアニンを有する10mer RNAをこの実験において使用した。
(図11)細胞状況におけるN3-ケトキサールによるG標識化の時間依存。1分間および5分間のN3-ケトキサールによる処理後、mES細胞のRNAを単離し、keth-seqを行い、これは、G停止部位が1分間から5分間へ向かって増加したことを示す。
(図12)図12A〜C:N3-ケトキサール標識RNAの可逆性。(a)スキームは、過剰なGTPの存在下でのN3-ケトキサール-グアニン反応の平衡変化を示す。N3-ケトキサール-グアニンは、過剰なGTPを用いて元の未反応RNAへ解離するのが遥かにより容易である。(b)MALDI-TOFモニタリングによるN3-ケトキサール標識RNAの可逆性。ケトキサール修飾は、37℃で中性緩衝液中で50 mM GTPと共に2時間インキュベーション後、大部分が除去され、6時間まで延長された場合はほぼ除去された。(c)上部:異なるインキュベーション期間中のPBS緩衝液(pH = 7.4)中95℃での50 mM GTPと共のN3-ケトキサール標識mRNAのドットブロット結果。下部:上部ドットブロットサンプルと同じ異なるインキュベーション条件下でのRNA断片の変性ゲル電気泳動。断片化RNAの長さは、過剰なGTPの存在下での10分間以内の95℃にてほとんど影響を受けなかった。
(図13)図13A〜C:ホウ酸緩衝液によるケトキサール標識RNAの固定。(a)グアニン-ケトキサールの付加物の隣接ジオール基は、ケトキサール修飾を固定するためにボレート分子と結合させることができる。(b)MALDI-TOF検出によるグアニン-ケトキサール-ホウ素複合体の形成。グアニン-ケトキサールの付加物を4-(アミノメチル)ベンゼンボロン酸と共にインキュベートした。(c)ホウ酸緩衝液の存在下でのグアニン-ケトキサール-ホウ素複合体の安定性試験。大部分のグアニン-ケトキサール付加物がホウ酸緩衝液固定によって保持され、一方、ホウ酸緩衝液の非存在下では全てのグアニン-ケトキサール付加物が消滅した。
(図14)図14A〜D:keth-seq法の品質管理。(a)N3-ケトキサール(左)および未処理対照(右)サンプルについてのレプリケート間のRPKM相関。(b)RTは、N3-ケトキサール、N3-ケトキサール除去サンプル、および未処理対照サンプルについてのレプリケートのリード分布を止めた。(c)インビボおよびインビトロmRNAサンプルの構造シグナル。(d)構造情報を有するmRNAおよび+PDSサンプル中の公知のrG4領域の重複。
(図15)異なるサンプル間のリード分布の例。タンパク質をコードするRNA mt-Atp8について、末端が97から108までの位置内にあった全てのマッピングされたリードを示す。リードは末端位置によってグループ化および着色されている。ここで、N3-ケトキサールサンプルにおいて、リードの大部分はグアニンで止まり、一方、N3-ケトキサール除去および未処理対照サンプルにおいて、リードは遥かにより均一に分布し、従って、N3-ケトキサール分子の高特異性を示唆している。リード群の大部分について、対照よりも除去サンプルにおいて同じ末端でより多くのより長いリードがある(例えば、強調された青緑色および赤色リード群)。対照サンプルに対する除去サンプル中の完全長リード突出のより高い比率は、より高い信頼性を有するRT停止部位を示し得る。
(図16)天然および+PDS条件の両方の下でのケトキサールおよび対照サンプルの潜在的なrG4領域周りのカバレッジトラックを示す2つの例。
(図17)N3-ケトキサールサンプル、N3-ケトキサール除去サンプル、および未処理対照サンプルのライブラリー調製の詳細なフローチャート。
(図18)図18A〜B:(a)ケトキサール-Daz CLIPの略図。RNAは、インキュベーションおよび365 nm UV照射後にインサイチュでRNA結合性タンパク質へ共有結合的に架橋される。これに、細胞溶解、および架橋された複合体の精製が続く。タンパク質を消化し、精製されたRNAを逆転写し(retrotranscribe)、次世代シーケンシングへ供した。(b)ケトキサール-Dazの分子構造。
核酸の化学的標識化は、核酸構造、核酸位置、核酸近接情報、転写および翻訳のプロービングのような、様々な適用に極めて有用である。典型的な標識化戦略は、修飾ヌクレオチドがDNA/RNA合成中にポリメラーゼによって酵素的に組み込まれる代謝標識、および、既存のDNA/RNAと反応するために合成小分子を採用する合成後標識を含む。代謝標識は、古いDNA/RNAと新しく合成されたDNA/RNAとを識別し、一方、合成後標識は、異なる微小環境を有するDNA/RNAへの選択性を得ることができる。効率的なDNA/RNAインサイチュ標識化を開発することは、依然として重要な課題ある。
本明細書に記載されるように、N3-ケトキサール(ケトキサール誘導体を代表する)は、一本鎖DNAおよびRNAにてグアニンと選択的に反応することが示される。これらの反応は、穏やかな標準細胞培養条件下で高効率的であり、組織へ直接適用され得る。細胞ベースの標識化は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分間以内で(1つまたは複数の態様は具体的に除外され得る)完了し得、このプローブを、現在まで当技術分野において見られたことがない独特のプローブとすることが分かった。DNAに対するその反応性は、一本鎖DNAのゲノムワイドマッピングを初めて可能にする。遺伝子コーディング領域上での一本鎖DNAの形成は遺伝子転写と強く相関する。N3-ケトキサール補助RNA標識は、RNA二次構造およびRNA-RNA相互作用決定をもたらす。インビトロおよびインビボでのRNA構造を比較することは、遺伝子翻訳およびRNA結合性タンパク質のような、生細胞中におけるRNA構造ダイナミクスを媒介する因子を同定する。さらに、N3-ケトキサールを他の技術と組み合わせることによる、N3-ケトキサール光制御インサイチュRNA標識、曝露RNAマッピング、単一分子DNA/RNAイメージング、小分子RNA結合剤スクリーニングなどのようなさらなる適用。任意の化学部分が、本明細書に記載される方法を使用して、ケトキサール誘導体上に取り付けられ得る。本発明のいくつかの局面に従う特定の使用の中には、クリックケミストリーハンドルがある。クリックケミストリーハンドルは、クリックケミストリー反応に参加し得る反応基を提供する化学部分である。クリックケミストリー反応およびクリックケミストリー反応のための好適な化学基は、当業者に周知であり、末端アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、ジエンオフィル、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、およびアルケンを含むが、これらに限定されない。例えば、いくつかの態様において、アジドおよびアルキンがクリックケミストリー反応において使用される。ある局面において、「クリックケミストリー適合性」化合物またはクリックケミストリーハンドルは、末端アジド官能基を含む。
ケトキサールおよびその類似体は、1950年代以来、RNAウイルスと反応しこれを不活性化することが初めて報告された(Staehelin, Biochimca Biophysica Acta 31:448-54, 1959)。ケトキサールの1,2-ジカルボニル基はグアニンに対して高特異性を示し、このため、それはRNA二次構造のプロービングにおいて非常に有用である。さらに、他のケトキサール誘導体、例えば、ケトキサールビス(チオセミカルバゾン)(KTS)(Booth and Sartorelli, Nature 210:104-5, 1966)は有望な抗癌活性を示し、ビケトキサール(Brewer et al., Biochemistry 22:4303-9, 1983)は、インタクトなリボソーム30Sおよび50Sサブユニット内のRNAおよびタンパク質を架橋する能力を示した。しかし、ケトキサールおよびその誘導体の合成はめったに報告されないことは驚くべきである。文献のレビューは、ケトキサール調製は、二酸化セレンによる酸化、続いての減圧蒸留による精製に大部分は基づいたことを示す(Brewer et al., Biochemistry 22:4303-9, 1983; Tiffany et al., Journal of the American Chemical Society 79:1682-87, 1957; Lo et al., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 44:S654-S656, 2001)。この方法はいくつかの制限を有する。第一に、金属酸化反応は常に副生成物を生じさせる。第二に、過剰なセレンは除去するが困難であった。第三に、他の官能基を有するケトキサール誘導体の合成は困難であり、何故ならば、官能基を有する試薬は、還流条件下で二酸化セレンと共には存続しない場合があるためである。例えば、研究は、アジド-およびチオール-修飾ケトキサールが二酸化セレン酸化によっては調製できないことを示す。最後に、減圧蒸留精製は、高分子量を有するケトキサール誘導体に適していない。
スキームS1 - 様々な官能基(R基)からのケトキサール誘導体の合成
N3-ケトキサールは一本鎖DNAおよびRNA中のグアニンと反応する
ケトキサール(1,1-ジヒドロキシ-3-エトキシ-2-ブタノン)は、ワトソン-クリック界面にて特にN1およびN2位でグアニンと反応することが公知である(Shapiro et al., Biochemistry 8:238-45, 1969)。合成における課題に起因して、以前、ケトキサールはさらに官能化されず、核酸標識へ広く適用されてこなかった。N3-ケトキサール(図1a)の開発を本明細書に記載し、これは、その親分子からグアニンに対する反応性を受け継ぐだけでなく、「クリック」ケミストリーを通してさらに官能化される生体直交型ハンドルとして役立つアジド基も含有する。MALDI-TOF分析を用いて、N3-ケトキサールはRNA上のグアニンを効率的に標識し、一方、他の塩基において反応性は観察されなかったことが示された。ゲル電気泳動を使用することによって、一本鎖DNA/RNAに対するN3-ケトキサールの選択性がさらに実証された。N3-ケトキサールと共のインキュベーション後、ゲル上の一本鎖RNAにおいてシフトが観察され、これはRNA-ケトキサール複合体の形成を示しており、一方、二本鎖RNAではそのようなシフトは検出されなかった。N3-ケトキサールは高細胞浸透性であり、5分以内に生細胞中のDNAおよびRNAを標識することができることも示され、このためそれはさらなる適用に適している。
N3-ケトキサール分子(図1a)は、一本鎖RNA(ssRNA)中のグアニンのワトソン-クリック界面でのN1およびN2位の特異的標識化についての要件を満たす;上記を参照のこと。ケトキサールは、ケトキサール誘導体の合成における課題に部分的に起因して、トランスクリプトーム全体のプロービングについてさらに修飾されたことがなく;多くの官能基がケトキサール合成の比較的厳しい条件に耐えることができなかった。本明細書に記載される新しい合成スキーム設計を用いて、アジド-ケトキサール(N3-ケトキサール)は、市販の出発原料から3ステップで首尾よく調製することができる。アジド基は、ビオチンまたは濃縮もしくは他の適用のための任意の色素で容易に修飾され得る生体直交型ハンドルを提供する(Spitale et al. Nature 519:486-90, 2015)。さらに、アルカリ性または加熱条件下でのケトキサール-グアニン付加物の可逆性は公知であり(Xu and Culver, Method. Enzymol. 468:147-65, Academic Press, 2009)、ケトキサール標識の除去後にリードスルー対照を生成することを介してRT停止に基づくRNA構造マッピングにおける追加の利点を提供する。
N3-ケトキサールはゲノムワイド一本鎖DNAマッピング(ssDNA-seq)を可能にする
一本鎖核酸に対するN3-ケトキサールの感受性および選択性の利点を活かし、本発明者らは、先ず、ゲノムの一本鎖領域をマッピングするためにN3-ケトキサールを適用し、これは以前に達成されたことがなかった。採取前に、標識化を促進するために、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞を、10分間N3-ケトキサール含有培地中で培養した。ゲノムDNAを次いで精製し、「クリック」ケミストリーを通じてビオチン化反応へ供した。ビオチン化DNAを精製し、断片化し、続いてストレプトアビジンコートビーズで免疫沈降した。濃縮されたDNAおよびそれらの対応のインプットを使用してライブラリーを作製し、これを次いで配列決定および整列させた。
ssDNA形成および転写間の関係を立証するために、同じ細胞株に対してRNA-seqを行い、全ての発現遺伝子をそれらのRNAレベルに従って3つの群に分類した(高、中および低、図3a)。ssDNAピークは、中または低RNAレベルを有するものと比べて、高RNAレベルを有する遺伝子において有意により強いと分かった(図3b)。RNA-seqは定常状態RNAレベルのみを反映し、しかしリアルタイム転写状態を明らかにすることができないため、次の2つのPol II阻害剤、トリプトライドおよび5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシルベンゾイミダゾール(DRB)を適用して、対応のssDNA変化を研究した。トリプトライドはPol II分解を誘発し、一方、DRBは、Pol II CTD脱リン酸化を阻害し、従って、Pol II伸長を妨げる(Bensaude, Transcription 2:103-08, 2011)。DRB処理後、ssDNAピーク数は、43,000超から約16,000へ減少した(図3c)。より強いピークがTSSで観察され、一方、遺伝子本体およびTES上のピークは排除され、これは、増加したPol II休止および弱いPol II伸長と一致する(図3d)。トリプトライドは、約3,700への劇的なssDNAピーク数減少をもたらした(図3c)。予想通りに、遺伝子コーディング領域上の大部分のピークが、全体的なPol II分解に起因して消滅した(図3d)。
ssDNAについての一つの手順は以下の工程のうちの1つまたは複数を含み得る。第1の工程は、N3-ケトキサールまたはケトキサール誘導体を細胞培養培地へ添加することによって標識培地を調製することであり得る。所望の時間の間、所望の温度で、所望の条件下にて、細胞を標識培地中でインキュベートする。転写阻害研究は、N3-ケトキサールまたはケトキサール誘導体含有培地中でインキュベートする前に、DRBまたはトリプトライドまたは等価な試薬下で細胞を処理することによって行うことができる。インキュベーション後、細胞を採取し、細胞から全DNAを単離する。DNAをH2O中にかつDBCO-PEG4-ビオチン(DMSO溶液)の存在下で懸濁し、適切な温度で適切な時間の間、例えば、37℃で2時間、インキュベートすることができる。RNアーゼAを反応混合物へ添加し、混合物を、適切な温度で適切な時間の間、例えば、37℃で15分間、インキュベートすることができる。7.DNAを反応混合物から回収し、ライブラリーを構築するために使用することができる。ライブラリーは、様々な商業的ライブラリー構築キット、例えば、Accel-NGS Methyl-seq DNAライブラリーキット(Swift)またはKapa Hyper Plusキット(Kapa Biosystems)を使用して構築することができる。次の工程は、例えばNextseq SR80モードにおいてライブラリーを配列決定することを含み、下流の解析を行うことができる。
RNAに対するN3-ケトキサールの反応性を考慮して、ケトキサール補助RNA-RNA相互作用マッピング(KARRI)を、相互作用RNA-RNAのN3-ケトキサール標識およびデンドリマー架橋に基づいて開発した。KARRIマッピングを実証するために、ホルムアルデヒド固定マウス胚性幹細胞(mESC)をN3-ケトキサールで処理し、次いで、表面にて2つのジベンゾシクロオクチン(DBCO)分子および1つのビオチン分子で装飾されたPAMAMデンドリマー(Esfand and Tomalia, (2001) Drug Discov. Today 6:427-36)と共にインキュベートした(図4a)。各PAMAMデンドリマーは、「クリック」反応を通じて2つの近接N3-ケトキサール標識グアニンを化学的に架橋し、その上のビオチン部分を通じて濃縮のためのハンドルを提供する。架橋後、RNAを単離し、断片化し、ストレプトアビジンビーズによる免疫沈降へ供した(図4a)。近接ライゲーションを次いでビーズ上において行い、生成物RNAをライブラリー構築のために使用した(図4a)。シーケンシングリードを、RNA-RNA相互作用解析のために使用されたキメラリードとのみ整列させた。
インビトロRNAフォールディングと比較して、RNA二次構造および分子間RNA-RNA相互作用は、非常に複雑な様式でRNA修飾およびRNA結合性タンパク質(RBP)のような様々な細胞因子によって調節される(Lewis et al., Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 18:202-10, 2017)。追加の研究を行い、どのようにRNA構造および相互作用が生細胞において形成および調節されるかを研究した。精製されたRNAをインビトロでリフォールディングし、KARRIを行い、インビボKARRI結果と比較した。予想通りに、インビボで検出されたいくつかの構造特徴が消滅し、一方、いくつかの新しい構造が熱力学的に安定なRNA自己フォールディングコンフォメーションとして出現した(図5a)。
KARRI法は以下の工程のうちの1つまたは複数を含み得る。細胞を、固定剤、例えば、ホルムアルデヒド溶液中に懸濁し、軽く回転させながら室温でインキュベートすることができる。反応は、例えばグリシンを添加することによって、クエンチすることができる。翻訳阻害剤処理について、細胞をシクロヘキシミドまたはハリングトニンで処理する。細胞を収集し小分けする。N3-ケトキサールまたはケトキサール誘導体を、適切な溶媒、例えばDMSOを使用して、1:5に希釈し、標識緩衝液(N3-ケトキサールまたはケトキサール誘導体、溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.2 IGEPAL CA630)およびプロテイナーゼ阻害剤カクテル)中へ組み入れることができる。細胞を標識緩衝液中に懸濁し、インキュベーション後に細胞を収集することができる。収集された細胞を、氷冷溶解緩衝液中で1、2、3回またはそれ以上洗浄することができる。細胞ペレットを、架橋剤を含有するMeOH中に懸濁し、細胞を収集することができる。RNAを抽出し、精製することができる。RNAペレットを、DNアーゼI緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2)、DNアーゼI、RNアーゼ阻害剤と共に、H2O中に懸濁し、軽く振盪しながらインキュベートすることができる。混合物を次いでプロテイナーゼKへ曝露する。RNAをフェノール-クロロホルムで抽出し、RNAをEtOH沈降によって精製する。RNAペレットをH2O、およびRNアーゼ阻害剤を含む断片化緩衝液に懸濁し、インキュベートする。断片化を断片化停止緩衝液の添加によって停止し、サンプルを氷上に置いて反応をクエンチする。架橋されたRNAを、洗浄済みストレプトアビジンビーズを使用することによって濃縮する。ビーズをDNAと混合し、混合物を軽く回転させながら室温でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを洗浄した。洗浄されたビーズを、PNK緩衝液およびT4 PNK、RNアーゼ阻害剤を含むH2O中に懸濁し、第1インキュベーション期間の間振盪し、次いで、別のアリコートのT4 PNKおよびATPを添加し、第2インキュベーション期間の間振盪する。ビーズを洗浄し、リガーゼ溶液中に懸濁する。リガーゼ溶液中におけるインキュベーション後、ビーズを洗浄する。RNAを加熱によって溶出し、RNAを回収する。回収されたRNAの半分をライブラリー構築のために使用する。ライブラリーを配列決定し、下流の解析を行う。
N3-ケトキサールは光によってインサイチュ核酸標識を可能にする
N3-ケトキサール標識DNA/RNAのさらなる官能化は、アジド基を有するDNA/RNAとDBCOコンジュゲート化分子との間の「クリック」反応に依存する。「クリック」ケミストリーは光によって制御され得、従って、生細胞中における部位特異的DNA/RNA標識化を達成する。原理の証明として、DBCO分子のケージ化形態(フォト-DBCO-OH)(Nainar et al., J. Am. Chem. Soc. 139:8090-93, 2017)を含め、これは、その天然状態ではアジド基と反応することができないが、UV光へ曝露されると、活性化形態(DBCO-OH)へ変換され、N3-ケトキサール標識核酸と反応する(図6a)。9-mer合成RNAオリゴを、まずN3-ケトキサールと共にインキュベートし、精製し、次いで365 nm UV曝露下で10分間、フォト-DBCO-OHと共にインキュベートした。質量スペクトル分析は、首尾よい光脱ケージ化および続いての「クリック」反応を示した(図6b)。ビオチンまたはローダミンBとコンジュゲートされたフォト-DBCOを合成し、これらは、光制御インサイチュ空間特異的RNAシーケンシングおよびイメージングのために潜在的に使用され得る(図6c)。
関心対象のタンパク質へ結合するRNAをプルダウンして、それらのRNAのライブラリーを作製する、およびタンパク質が結合および/または修飾されるRNAの領域を同定するための方法を、本明細書に記載する。タンパク質に近接しているRNAへのタンパク質の有効な架橋が、CLIP-seqを行い、タンパク質-RNA相互作用を研究するために使用され得る。細胞をインサイチュで固定し、ケトキサール誘導体を細胞中へ導入し、続いてタンパク質架橋剤を活性化する。細胞中で架橋されたタンパク質-RNA複合体を、次いで、断片化し、免疫沈降させ、かつ/または分析することができる(図18)。
水素化ナトリウム(鉱油中60%分散液, 6 g, 0.15 mol)を250 mL二つ口フラスコへ添加し、次いで無水THF 50 mLをN2条件下で添加した。懸濁液を激しく撹拌し、0℃へ冷却した。20 mL無水THF中の2-アジドエタノール(8.7 g, 0.1 mol)を20分間にわたって滴下した。溶液を周囲温度で15分間撹拌し、次いで再び0℃へ冷却した。10 mL THF中の2-ブロモプロピオン酸エチル(27.15 g, 0.15 mol)を滴下した。反応混合物を室温へ加温し、N2雰囲気下で一晩撹拌した。100 mL水を使用して反応をクエンチし、結果として生じた混合物をジエチルエーテルによって3回(3 × 100 mL)洗浄した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させた。粗製生成物を50 ml THF中に溶解し、LiOH水溶液(40 ml, 1 M)へ添加した。混合物を室温で16時間撹拌した。THFを除去し、HCl (2 M)をpH 2まで添加した。次いで、THFをジエチルエーテルによって3回(3 × 100 ml)抽出した。合わせた有機層を無水NaSO4で乾燥させた。濃縮およびシリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル:石油エーテル = 1:7)後、生成物2が無色オイル(6.67 g, 26 %)として収集された。
N2条件下で、2 (1.59 g, 10 mmol)を15 mL無水CH2Cl2および1滴のDMF中に溶解した。塩化オキサリル(926μL, 15 mmol)を溶液へ添加し、室温で2時間撹拌した。その後、溶媒および過剰な塩化オキサリルを除去した。残留物を無水CH3CN 50 mL中に溶解し、0℃へ冷却し、ジエチルエーテル(4 mL, 10 mmol)中の(トリメチルシリル)ジアゾメタン溶液2 Mを滴下した。反応混合物を0℃で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル:石油エーテル = 1 : 7)を行い、生成物3が黄色オイル(620 mg, 33.8 %)として得られた。
Adamの手順に従って、アセトン溶液中のジメチルジオキシラン(DMD)を調製した。化合物3 (183 mg, 1 mmol)へ、11 mL DMD-アセトンをいくつかの部分に分けて添加した。明らかなガス発生が観察された。反応混合物を、TLCモニター下で反応が完全になるまで室温で撹拌し、アジド-ケトキサール1およびそのハイディエート(hydyate)4が黄色オイルとして得られた。
N3-ケトキサール合成のための全ての化学試薬を商業的供給源から購入した。RNAオリゴを、Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)およびTakara Biomedical Technology Co., Ltd.から購入した。N3-ケトキサール合成のための緩衝塩および化学試薬を商業的供給源から購入した。Superscript III、Dynabeads(登録商標)MyOne(商標)ストレプトアビジンC1をLife technologiesから購入した。T4 PNK、T4 RNL2tr K227Q、5’-デアデニラーゼ、RecJfを、New England Biolabsから購入した。CircLigaseIIをEpicenter社から購入した。DBCO-ビオチンをClick Chemistry Tools LLC (A116-10)から購入した。全てのRNアーゼフリー溶液をDEPC処理MilliQ水から調製した。
グアニンとのN3-ケトキサール反応の立証
N3-ケトキサールおよびグアニン反応を立証した。グアニン(100μM, 2μL)、N3-ケトキサール(DMSO中1 M, 1μL)、カコジル酸ナトリウム緩衝液(0.1 M, pH = 7.0, 1μL)および6μL ddH2Oを、37℃で10分間、1.5 mL微小遠心管中へ一緒に添加した。HRMS C11H14N8O4 +[M+H]+calculated 323.1216, found 323.1203。
N3-ケトキサールおよびRNAの反応
N3-ケトキサールおよびRNAの反応を概して以下のプロトコルで行った:100 pmol RNAオリゴおよび1μmol N3-ケトキサールを、37℃で10分間、PBS緩衝液中合計10μL溶液中でインキュベートした。修飾RNAをMicro Bio-Spin(商標)P-6ゲルカラム(Biorad, 7326222)によって精製し、残存する化学物質を除去した。精製された標識RNAは、質量分析、ゲル電気泳動、およびビオチン-DBCOとの銅フリークリック反応のような、さらなる研究のために使用され得る。
N3-ケトキサール修飾消去の詳細なプロトコルを、keth-seqプロトコル中の下記「N3-ケトキサール除去サンプル調製」に記載する。概して、精製されたN3-ケトキサール修飾RNAを、37℃で6時間または95℃で10分間、高濃度のGTP (1/2体積の反応溶液、最終濃度50 mM)と共にインキュベートした。より高い温度がN3-ケトキサール修飾の除去に役立つ。
RNA中の不安定なN3-ケトキサール修飾をホウ酸緩衝液の存在下で固定することができる。N3-ケトキサール標識RNAの溶液を、1/10体積のストックホウ酸緩衝液と混合した(最終濃度: 50 mM; ストックホウ酸緩衝液: 500 mMホウ酸カリウム, pH 7.0;500 mMホウ酸へ水酸化カリウムペレットを添加しながら、pHをモニターした)。ホウ酸緩衝液固定をketh-seqプロトコルの様々な工程において使用した;下記を参照のこと。
N3-ケトキサール標識RNAをMicro Bio-Spin(商標)P-6ゲルカラムによって精製した。合間に、PBS緩衝液から、これは追加の脱塩工程無しでMALDI-TOF-MS実験において直接使用することができるトリス緩衝液へ緩衝液を交換した。1マイクロリットルの生成物溶液を、8:1体積比の2'4'6'-トリヒドロキシアセトフェノン(THAP、50% CH3CN/H2O中10 mg/mL):クエン酸アンモニウム(H2O中50 mg/mL)を含む1マイクロリットルのマトリックスと混合した。次いで、混合物をMALDIサンプルプレート上にスポットし、乾燥させ、Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF質量分析計によって分析した。
ゲル電気泳動によるSSRNAへのN3-ケトキサールの選択性
相補的RNAオリゴ
を、全てのFS1がdsRNAの形成に関与することを確実にするために、FS1:S2 = 1.2:1の比率で二本鎖RNA(dsRNA)へハイブリダイズさせた。N3-ケトキサールとの反応後、Micro Bio-Spin(商標)P-6ゲルカラムによる精製生成物を、変性ゲル電気泳動(Novex(商標)TBE-尿素ゲル, 15%, Invitrogen, EC6885BOX)によって分析した。ゲルイメージングをPharos FX Molecularイメージャー(Bio-Rad, USA)において収集した。
N3-ケトキサール標識RNAのビオチン化
インビトロ研究:
精製されたN3-ケトキサールRNAを、RNアーゼ阻害剤、ホウ酸緩衝液の存在下で37℃にて2時間、DBCO-ビオチンと共にインキュベートした(下記keth-seqプロトコルのビオチン化を参照のこと)。RNAオリゴについて、ビオチン化された生成物を、Micro Bio-Spin(商標)P-6ゲルカラムによって精製し、ドットブロットアッセイおよびMALDI-TOF-MS検出へ供し;全RNAまたはmRNAについて、生成物を、RNA clean & concentrator 5 (Zymo Research, R1015)によって精製した。
10μL N3-ケトキサールを、ほぼ80%コンフルエントなmES細胞を含む100 mm細胞培養皿中の細胞培養培地中へ添加した。特定の時間の間、CO2インキュベーター中37℃でのインキュベーション後、培地を吸引し、細胞をPBSによって3回洗浄した。全RNAをトリゾール(商標)試薬(Invitrogen, 15596026)またはQiagen RNeasy(商標)plus miniキット(Qiagen, 74134)によって単離した。mRNAをDynabeads(商標)mRNA DIRECT(商標)精製キット(Invitrogen, 61011)によって単離した。ビオチン化工程はインビトロ研究と同じであった。ビオチン化RNAをRNA clean & concentratorによって精製した。
1マイクロリットルのRNA (100 ng/uL)サンプルを、Amersham Hybond-N+膜(RPN119B, GE Healthcare)上へスポットし、UVP HL-2000 HybriLinkerによって膜へUV架橋した。膜を、1 x PBST (0.1% tween-20)を使用して洗浄し、4℃にて一晩、1 x PBST中5%脱脂粉乳でブロッキングした。10分間隔で1x PBSTを使用して4回洗浄後、3% BSAを含む1x PBST中のストレプトアビジン-ホースラディシュペルオキシダーゼ(1:15000希釈、ストレプトアビジン-HRP, Life Technologies, S-911)を添加し、室温で40分間インキュベートした。次いで、再び10分間隔で1x PBSTを使用して膜を洗浄し、SuperSignal(商標)West Pico PLUS化学発光基質(Thermo Scientific, 34577)によって現像した。膜を再び1x PBSTによって洗浄し、メチレンブルー溶液(0.3 M酢酸ナトリウムpH 5.2中0.02%メチレンブルー)によって染色した。
KETH-SEQライブラリー調製
わずかな変更を伴ってicSHAPEプロトコルに従って、ライブラリーを調製した(Spitale et al., Nature 519:486-90, 2015)。詳細なプロトコルを下記に記載する。インビトロライブラリー調製について、RNAを単離し、先ずRNAフォールディングミックス緩衝液(100 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2)中でリフォールディングした。リフォールディングされたRNAをN3-ケトキサールで処理し、次いでライブラリー構築のために利用した。インビボ研究について、N3-ケトキサールをmES細胞の培養培地中へ添加し、RNAを単離し、ライブラリー構築のために利用した。
ライブラリー構造はicSHAPE技術と類似しているため、同様の戦略を使用してシーケンシングリードを前処理した。icSHAPEプロトコルからのパイプラインを使用してデータ解析を行い、全てのスクリプトは、URL github.com/qczhang/icSHAPEでアクセスすることができる。最初に、スクリプトreadCollapse.plを使用し、デフォルトパラメーターでリードをコラプスした。次いで、trimming.plを使用し、可能性のあるアダプター配列を切断した(-l 13 -t 0 -c phred33 -a adapter.fa -m 0, アダプター配列:
次に、クリーンリードをリボソームRNAへマッピングし、マッピングされないリードを、デフォルトパラメーターでBowtieを使用して全トランスクリプトーム(Gencode、マウスについてのmm10およびヒトについてのhg38)へマッピングした。逆転写(RT)停止シグナルを、スクリプトcalcRT.plを使用して計算した。異なるレプリケート間の相関を評価した(correlationRT.pl)後、後の解析のためにレプリケートのRTシグナルを組み合わせた(combineRTreplicates.pl)。個々にケトキサールおよび対照サンプルの両方について、RTシグナルを正規化する(normalizeRTfile.pl -m mean:vigintile2 -d 32 -l 32)。各転写物についての強化された反応性を、スクリプトcalcEnrich.pl (-w factor5:scaling1 -x 0.25)を使用してケトキサールサンプル(フォアグラウンド)対対照サンプル(バックグラウンド)を比較することによって計算した。最後に、特定の基準を使用し、より確信的なシグナルを保持した(filterEnrich.pl -T 2 -t 200 -s 5 -e 30)。
N3-ケトキサールインビボ標識
mES細胞を50%コンフルエンシーで10 cmプレート中に前日に継代する。2日目の午前は、ほぼ約80%コンフルエンシーである。5 mL培地を除去し、次いで10μLのN3-ケトキサールを添加する。37℃で様々な時間(分)にわたってインキュベートする。培地を吸引し、PBS洗浄を2回使用し、1mL PBSを添加し、細胞を1.5 mLチューブ中へ掻き集める。4℃にて5分間2000 rpmで遠心沈殿する。上澄みを吸引する。Qiagen RNeasy plus miniキットを使用して全RNAを単離し、次いで、Dynabeads(登録商標)mRNA精製キットを使用し、全RNAサンプルからmRNAを単離する。
(a)ほぼ2μgの全RNAまたはmRNAを取り、20 mM WS DBCO-ビオチン(Click Chemistry tool, A116)を1.5 mLチューブに添加し、37℃で2時間水浴を行う。10 x PBS (10μL)、500 mMホウ酸緩衝液(5μL)、20mM WS DBCO-ビオチン(5μL)、SUPERase In RNアーゼ阻害剤(2μL)、RNA溶液 + H2O (78μL)。反応物は合計100μLとなり、37℃で2時間インキュベートする。(ホウ酸緩衝液:500 mMホウ酸カリウム(pH 7.0);500 mMホウ酸への水酸化カリウムペレットを用いてのpH) (b)100μL RNA反応溶液についてのRNA回収。Qiagen RNeasy MinEluteキット。350μL緩衝液RLTを100μL反応溶液へ添加し、次いで900μL 100 %エタノールを混合物へ添加する。溶液をQiagen MinEluteカラムへロードし、2回の500μL RPE洗浄を行い、1回の無緩衝液スピンを行い、カラムを乾燥させる。2つの50μL RNアーゼフリー水はRNA溶液を溶出する。(任意選択)ドットブロットを使用し、ビオチン化の効率を確認する。
(a)RNA溶液をBioruptor NGS 0.65 mL Microtubeへ移す。30秒オン/30秒オフを含む30サイクルの超音波処理をする。(b)3μLまで凍結乾燥し、ライゲーションを行う。
(a)T4 PNK末端修復(PCRチューブ、サーモサイクル):RNAサンプル(3μL)、10 x T4 PNK緩衝液(1μL)、SUPERase In RNアーゼ阻害剤(1μL)、ホウ酸緩衝液(1μL)、10 mM ATP (1μL)、T4 PNK酵素(2μL)、およびFastAP (1μL)。合計10μLとなり、37℃で1時間インキュベートし、3’-末端ライゲーションを直接行う。
GTP溶液を添加し、N3-ケトキサール修飾を除去し、N3-ケトキサール除去サンプルを生成する。RNA溶液(1.5μL)、SUPERase In RNアーゼ阻害剤(1μL)、100mM dGTP (5μL)、およびH2O (2.5μL)。95℃で10分間インキュベートする。次いで、40μL H2Oを添加し、RNAをZymo RNA clean & concentrator 5キットによって回収する。6μL H2Oで2回溶出し、次いでcDNA合成工程へ移る。(i)100μL RNA結合緩衝液を50μL反応溶液へ添加し、次いで150μL 100%エタノールを混合物へ添加し、混合する。(ii)カラムへ溶液、400μL RNA prep緩衝液、700μL RNA洗浄緩衝液をロードし、次いで1回の無緩衝液スピンを行い、カラムを乾燥させる。(iii)2つの6μL RNアーゼフリー水はRNA溶液を溶出する。
(a)RNAサンプルをPCRチューブへ移す。1μL 5μM RTプライマーを添加し、混合する。N3-ケトキサール除去:RNA溶液(10.5μL)、5μM RTプライマー(1μL)、およびH2O (1μL)。N3-ケトキサール:RNA溶液(10.5μL)、5μM RTプライマー(1μL)、およびホウ酸緩衝液(1μL)。合計12.5μL混合物をサーモサイクルにおいて70℃で5分間加熱し、次いで25℃へ徐々に冷却し(1秒当たり1℃、45ステップ)、25℃で1分間保持する。
ビオチン結合緩衝液:100 mM Tris-HCl pH 7.0、10 mM EDTA、1 M NaCl。ビオチン洗浄緩衝液:10 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA、4 M NaCl、0.2 % Tween。10x RNアーゼH緩衝液:500 mM HEPES、750 mM NaCl、30 mM MgCl2、1.25 %サルコシル、0.25 %デオキシコール酸ナトリウム、50 mM DTT。
(a)N3-ケトキサール除去サンプルのcDNAを、以下の溶液を20μL RT反応溶液へ添加することによって溶出する:10 x RNアーゼH緩衝液(5μL)、RNアーゼA/T1カクテル(2μL)、RNアーゼH (2μL)、およびH2O (21μL)。合計50μL溶液を37℃で30分間インキュベートした。(b)cDNAを、改変法でDNA Clean & Concentrator-5キットを使用して精製する:50μL cDNA溶出溶液、350μlのDNA結合緩衝液および350μlの100%エタノールを添加する。よく混合する。製造業者の説明書に従って精製を継続する(200μL洗浄緩衝液洗浄2回、次いで空のスピン1回)。cDNAを10μL H2Oで2回溶出する。合計約20μL cDNA溶液を得る。約5μL溶液まで凍結乾燥する。
5μL TBU 2Xローディング色素を添加し、サイズ選択のために6% TBE-尿素ゲルへロードし、ならびにサンプルを95℃へ2分間加熱し、PAGE分離(180 V, 40分間)の直前に氷中に挿入する。Sybr Gold染色し、画像化し、ゲル中の> 70ヌクレオチド(70〜500)を切断する。cDNAをゲルから精製する。各ゲル切片を、無菌の注射針を使用して、底部に開けられた穴を有する0.5 ml微小遠心管へ移し、チューブキャップを閉める。1.5 mlチューブの内側に各0.5 mlチューブを置き、微量遠心機中で約12,000 × gで2分間遠心分離し、ゲル切片を細切れにする。0.5 mlチューブを除去し、廃棄する。各1.5 ml収集チューブへ、ヌクレアーゼフリー水(400μL)、5 M酢酸アンモニウム(40μL)、および10 % SDS (2μL)を添加する。サンプルを50℃で3時間超穏やかに揺り動かし、破壊されたゲル切片からcDNAを溶出する。スラリーを新しい1.5 mlフィルターチューブへ移し、マキシ速度で約2分間遠心分離し、溶出されたcDNA溶液から破壊されたゲル片を分離する。各水溶液へ、2μlのグリコーゲンおよび700μlの100 %イソプロパノールを添加する。-80℃で> 1時間保存する。チューブを4℃にて30分間 > 12,000 gで遠心分離し、cDNAをペレット化する。ペレットを氷冷80 %エタノールで洗浄し、空気乾燥させる。ペレットを14μlのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁する。
(a)14μL cDNA溶液をPCRチューブへ移し、次いで以下の通りに試薬を添加する:cDNA/H2O (14μL)、10 x CircLigaseII緩衝液(2μL)、1 mM ATP (1μL)、50 mM MnCl2(1μL)、およびCircLigase I (2μL)。合計20μLを60℃で2時間インキュベートする。(b) CircDNAを、改変法でDNA Clean & Concentrator-5キットを使用して精製する:30μL H2OをcDNA溶液へ添加し、50μL溶液を得、次いで、350μlのDNA結合緩衝液および350μlの100 %エタノールを添加する。よく混合する。製造業者の説明書に従って精製を継続する(200μL洗浄緩衝液洗浄2回、次いで空のスピン1回)。cDNAを10μL H2Oで2回溶出する。合計約20μL CircDNA溶液を得る。
(a)1μL CircDNAをqPCRモニタリングのために使用し、PCRサイクル数を最適化する。RP/RPIショートプライマー20mer 5μM (1μL)、cDNA環化工程からのCircDNA(1μL)、H2O (8μL)、およびqPCR 2 x Masterミックス(10μL)。示唆されたサイクル数は、シグモイド曲線の半分に位置するものである。(b)ショートプライマーによるPCR(RP/RPIショート20 mer)。Phusion MM (25μL)、RP/RPIショートプライマー20mer 5μM (1μL)、CircDNA溶液(5μL)、およびH2O (19μL)。合計50μL、PCRパラメーター:98℃30秒、次いで98℃10秒/60℃30秒/72℃30秒 各サイクル。(c)Bio-rad Greenスピンカラムを使用してPCR産物を精製する。5μLまで凍結乾燥し、2μL DNA 6Xローディング色素を添加し、サイズ選択のために6% TBEゲルへロードする(180 V, 30分間)。Sybr-Gold染色し、画像化し、ゲル中の> 80ヌクレオチド(80〜300)を切断する。cDNAを工程8中のプロトコル通りに精製する。ペレットを20μlのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁する。(d)シーケンシングプライマーによるPCR(RP/RPIインデックスX、3〜5サイクル)。Phusion MM (25μL)、RPプライマー10μM (1μL)、RPIインデックスx 10μM (1μL)、精製されたDNA (20μL)、およびH2O (3μL)。合計50μL、PCRパラメーター:98℃30秒、次いで98℃10秒/60℃30秒/72℃30秒、3〜5サイクル。(e)シーケンシングPCR後、3%低融点アガロースゲルを使用し、PCR産物を精製し(プライマー二量体を除去する、90 V, 45分間)、Qiagen QIAquickゲル抽出キットによって回収する。DNAライブラリーを20μL H2Oによって溶出する。
一本鎖DNA(SSDNA)マッピングのための実験手順
ssDNAを以下によって行う:(1)各10 cm皿について5 mL予熱細胞培養培地へ5μL純粋N3-ケトキサールを添加することによって、標識培地を調製する。(2)細胞を標識培地中で37℃、5% CO2で10分間インキュベートする。(3)転写阻害実験について、細胞を100μM DRBまたは1μMトリプトライド下で2時間処理し、その後、N3-ケトキサール含有培地中でインキュベートした。(4)10分間インキュベーション後に細胞を採取し、製造業者のプロトコルに従ってPureLinkゲノムDNAミニキットによって細胞から全DNAを単離する。(5)85μL H2O中に5μg全DNAを懸濁させ、次いで、10μL 10x PBSおよび5μL 20 mM DBCO-PEG4-ビオチン(DMSO溶液)を添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートする。(6)5μL RNアーゼAを反応混合物へ添加し、混合物を37℃でさらに15分間インキュベートする。(7)製造業者のプロトコルに従ってDNA Clean & Concentratorキットによって反応混合物からDNAを回収する。
(8a)Accel-NGS Methyl-seq DNAライブラリーキット(Swift)の使用:(i)工程7からの2μgの回収DNAを、30サイクルについて30秒オン/30秒オフ設定下での超音波処理によって断片化する。(ii)断片化DNAの5%をインプットのためにセーブし、残りの95%を使用し、僅かな変更を伴って製造業者のプロトコルに従って10μL洗浄済みストレプトアビジンC1ビーズによってビオチンタグ化DNAを濃縮する。ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液中で3回洗浄し、その後、0.1% tween-20を含む95μL 2x結合および洗浄緩衝液中に再懸濁させた。ビーズをDNAと混合し、混合物を軽く回転させながら室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で5回洗浄した。(iii)濃縮されたDNAを、ビーズを30μL H2O中で95℃で10分間加熱することによって溶出する。セーブされたインプットを同時に95℃で10分間処理する。インプットおよびIPサンプルの両方を直ちに氷上に置く。(iv)Accel-NGS Methyl-seq DNAライブラリーキットからのプロトコルに従ってライブラリー構築へ進む。
(8b)Kapa Hyper Plusキット(Kapa Biosystems)の使用:(i)1μg全DNAを35μL H2O中に懸濁し、5μL Kapa断片化緩衝液および10μL Kapa断片化酵素を添加する。混合物を37℃で30分間インキュベートする。(ii)断片化DNAを製造業者のプロトコルに従ってDNA Clean & Concentratorキットによって回収する。(iii)Kapa Hyper Plusキットからのプロトコルに従ってA-テーリングおよびアダプターライゲーションを行う。(iv)DNAの5%をインプットのためにセーブし、残りの95%を使用し、僅かな変更を伴って製造業者のプロトコルに従って10μL洗浄済みストレプトアビジンC1ビーズによってビオチンタグ化DNAを濃縮する。ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液中で3回洗浄し、その後、0.1% tween-20を含む95μL 2x結合および洗浄緩衝液中に再懸濁させた。ビーズをDNAと混合し、混合物を、軽く回転させながら室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で5回洗浄した。(v)濃縮されたDNAを、ビーズを25μL H2O中で95℃で10分間加熱することによって溶出する。(vi)Kapa Hyper Plusキットからのプロトコルに従ってインプットおよびIPサンプルの両方についてライブラリーをPCR増幅する。(9)Nextseq SR80モードにおいてライブラリーを配列決定し、下流の解析を行う。
ケトキサール補助RNA-RNA相互作用(KARRI)についての実験手順
KRRIを以下によって行う:(1)1x106/mLで1%ホルムアルデヒド溶液中に生細胞を懸濁させ、軽く回転させながら室温で10分間インキュベートする。次いで、グリシンを125 mMの最終濃度まで添加することによってこの反応をクエンチし、混合物を室温で5分間回転させる。翻訳阻害剤処理について、細胞を、37℃にて10分間、100μg/mLシクロヘキシミドまたは3μg/mLハリングトニンで処理した。(2)2x106細胞を収集および採取する。N3-ケトキサールを、DMSOを使用して1:5に希釈する。3μL 100xプロテイナーゼ阻害剤カクテルを含む290μL溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.2 IGEPAL CA630)中へ10μL N3-ケトキサールを添加することによって、標識緩衝液を作る。(3)細胞を標識緩衝液中に懸濁させ、室温で30分間回転させ、次いで、4℃にて5分間2500 gで遠心分離し、細胞を収集する。(4)細胞ペレットを500μL氷冷溶解緩衝液で3回洗浄する。(5)10μMデンドリマーを含有する500μL MeOH中にペレットを懸濁させ、37℃で1時間回転させる。次いで、4℃にて5分間2500 gで遠心分離し、細胞を収集する。(6)細胞ペレットを500μL氷冷溶解緩衝液で2回洗浄する。(7)細胞を385μL溶解緩衝液中に再懸濁し、50μL 10% SDS、30μLプロテイナーゼK、10μL RNアーゼ阻害剤、25μL 500 mM K3BO3を添加し、65℃で2時間振盪する。(8)500μLフェノール-クロロホルムを添加し、RNAを抽出し、RNAをEtOH沈降によって精製する。(9)RNAペレットを104μL H2O中に懸濁させ、12μL 10x DNアーゼI緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 7.4, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2)、2μL DNアーゼI (Thermo)、2μL RNアーゼ阻害剤を添加し、軽く振盪しながら37℃で30分間インキュベートする。(10)130μL 2xプロテイナーゼK緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% SDS)、10μLプロテイナーゼKを反応へ添加し、振盪しながら65℃で30分間インキュベートする。(11)RNAを300μLフェノール-クロロホルムで抽出し、RNAをEtOH沈降によって精製する。(12)RNAペレットを61μL H2O中に懸濁させ、7μL 10x断片化緩衝液(Thermo)、2μL RNアーゼ阻害剤を添加し、70℃で15分間インキュベートし、次いで、8μL断片化停止緩衝液(Thermo)を添加し、サンプルを直ちに氷上に置いて反応をクエンチする。(13)僅かな変更を伴って製造業者のプロトコルに従って30μL洗浄済みストレプトアビジンC1ビーズを使用することによって、架橋されたRNAを濃縮する。ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後、0.1% tween-20を含む80μL 2x結合および洗浄緩衝液中に再懸濁させた。ビーズをDNAと混合し、混合物を、軽く回転させながら室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で3回、1x PNK緩衝液(NEB)で1回洗浄した。(14)ビーズを、41μL H2O、5μL 10x PNK緩衝液(NEB)、3μL T4 PNK (NEB)、1μL RNアーゼ阻害剤中に懸濁させ、37℃で30分間振盪し、次いで、別の3μL T4 PNKおよび6μL 10 mM ATPを添加し、37℃でさらに30分間振盪する。(15)ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で2回、1xライゲーション緩衝液(NEB)で1回洗浄する。(16)ビーズを、668μL H2O、100μL 10xリガーゼ緩衝液(NEB)、10μL RNアーゼ阻害剤、2μL 10 mM ATP、20μL T4 RNAリガーゼ2 (高濃度) (NEB)、200μL 50% PEG 8000中に懸濁させ、16℃で16時間回転させる。(17)ビーズを、0.05% tween-20を含む1x結合および洗浄緩衝液で2回、H2Oで1回洗浄する。次いで、ビーズを30μL H2O中で加熱しそしてビーズを95℃で10分間振盪することによって、RNAを溶出する。(18)製造郷社からのプロトコルに従うことによってSMARTer Stranded Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input (Takara)を使用して、回収されたRNAの半分をライブラリー構築のために取る。(19)Novaseq PE150モードにおいてライブラリーを配列決定し、下流の解析を行う。
[本発明1001]
式:
を有する化合物であって、
式中、Yが、アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、ジエンオフィル(dieneophile)、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、およびアルケンより選択されるクリックケミストリー部分であり;かつ、Xがリンカーである、
前記化合物。
[本発明1002]
Xがアジドである、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
リンカーが、C1〜C10アルキルまたはポリエチレングリコールリンカーである、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1004]
YがCH 2 である、本発明1001〜1003のいずれかの化合物。
[本発明1005]
式:
を有する化合物。
[本発明1006]
グアニン塩基を標識するための方法であって、
反応混合物を形成するために、標識されるグアニンを本発明1001の化合物と接触させる工程、および
反応混合物を30〜40℃で少なくとも5分間インキュベートする工程
を含む、前記方法。
[本発明1007]
前記化合物がN 3 -ケトキサールである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ポリヌクレオチド中にグアニンがさらに含まれている、本発明1006または1007の方法。
[本発明1009]
前記ポリヌクレオチドがリボ核酸(RNA)である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸(DNA)である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
RNAがRNA転写物である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
細胞中の一本鎖核酸を標識するための方法であって、
(i)ケトキサール誘導体標識グアニン塩基を有する核酸を含む処理細胞を形成するために、標的細胞を本発明1001の化合物と接触させる工程;
(ii)処理細胞を少なくとも2つのクリックケミストリー反応性部分およびタグを含む架橋部分と接触させる工程であって、ここで、該架橋部分が、2つの近接ケトキサール誘導体標識グアニンを架橋して架橋核酸を形成する、工程;および
(iii)断片化し、かつ該タグに対する親和性を有する試薬を使用して架橋核酸を単離する工程
を含む、前記方法。
[本発明1013]
前記タグがビオチンである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記タグに対する親和性を有する試薬が、ストレプトアビジンである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
クリックケミストリー反応性部分が、ジベンゾシクロオクチン部分である、本発明1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
架橋核酸が2つ以上の核酸を含む、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
架橋核酸がRNAである、本発明1012〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
インビボでのトランスクリプトーム全体のRNA二次構造マッピングおよびRNA G-四重鎖予測のための方法であって、
(a)インビボで核酸をケトキサールクリックケミストリー誘導体で標識する工程;
(b)標識核酸をビオチン化する工程;
(c)標識化されかつビオチン化された核酸を断片化する工程;
(d)断片化/ビオチン化核酸から相補DNA(cDNA)を合成する工程;
(e)ビオチン化核酸と結合した合成cDNAを単離する工程;
(f)サイズに基づいてcDNAを分離する工程;
(g)環化cDNAライブラリーを形成するために、分離されたcDNAの環化を行う工程;および
(h)環化cDNAライブラリーを増幅する工程
を含む、前記方法。
[本発明1019]
cDNAの環化が、一本鎖DNAリガーゼでのcDNAのライゲーションを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
環化cDNAライブラリーを増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
ケトキサール誘導体タンパク質架橋に対するRNA/タンパク質相互作用を解析するための方法であって、
(a)RNAに近接しているタンパク質標的を、活性化可能なタンパク質架橋性部分に結合されたケトキサール誘導体と接触させて、標的/ケトキサール誘導体混合物を形成する工程;
(b)タンパク質架橋性部分を活性化するために標的/ケトキサール誘導体混合物を活性化因子へ曝露して、架橋された標的/ケトキサール誘導体複合体を形成する工程;
(c)架橋された標的/ケトキサール誘導体複合体を、タンパク質標的に結合する親和性物質を使用して単離する工程;および
(d)標的/ケトキサール誘導体複合体と共に単離されたRNAを同定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1022]
前記活性化可能な架橋性部分が、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、N-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド、ビスマレイミドエタン、ジアザリン(diazarine)、ヨード酢酸スクシンイミジル、N-マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸スクシンイミジルまたはベンゾフェノンである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
活性化因子が光である、本発明1021〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
光が紫外線である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
光が約350〜375 nmの波長を有する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
光が365 nmの波長を含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
アジド-ケトキサール(N 3 -ケトキサール)を合成するための方法であって、
(a) (i)テトラヒドロフラン(THF)中で水素化ナトリウムを2-アジドエタノールと混ぜ合わせて第1の中間混合物を形成すること、
(ii)2-ブロモプロピオン酸エチルを第1の中間混合物へ添加して第1の反応混合物を形成すること、
(iii)第1の反応混合物を窒素(N 2 )雰囲気下で室温にてインキュベートして2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を形成すること、
(iv)反応を水でクエンチすること、
(v)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸をLiOH水溶液へ添加し、室温でインキュベートすること、および
(vi)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を洗浄し、単離し、無水Na 2 SO 4 で乾燥させること
によって、2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸中間体を生成する工程;
(b) (i)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を無水CH 2 Cl 2 およびジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解すること、
(ii)塩化オキサリルを添加し、室温で撹拌すること、
(iii)溶媒および過剰な塩化オキサリルを除去して残留物を形成すること、
(iv)残留物を無水CH 3 CNおよび(トリメチルシリル)ジアゾメタン中に溶解すること、
(v)ジエチルエーテルを滴下して第2の反応混合物を形成すること、
(vi)第2の反応混合物を0℃で一晩撹拌すること、
(vii)溶媒を蒸発させて3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンを単離すること
によって、3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オン中間体を生成する工程;ならびに
(c) (i)3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンをアセトン中のジメチルジオキシラン(DMD-アセトン)へ添加して第3の反応混合物を形成すること、
(ii)第3の反応混合物を室温で撹拌してN 3 -ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを形成すること、および
(iii)N 3 -ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを単離すること
によって、N 3 -ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを生成する工程
を含む、前記方法。
との標識化反応ならびにビオチン-DBCOでのビオチン化(レーン5、6)の変性ゲル電気泳動分析。N3-ケトキサール標識RNAのみがビオチン化され得る(レーン6)。下部:標識化およびビオチン化反応後のRNAのドットブロット。メチレンブルードット結果が対照として列挙される。(e)異なる期間、1、5、10、15、20分でN3-ケトキサールによって処理された、mES細胞由来の単離された全RNAのドットブロット。(f)95℃にて50 mM GTPの存在下でのN3-ケトキサール標識mRNAの可逆性のドットブロット分析。mRNA中のN3-ケトキサール修飾は、10分間インキュベーション後に完全に除去された。
(図2)図2A〜F:(a)2つの個々のssDNA-seqライブラリー間のピアソン相関。(b)ピーク数および2つの個々のssDNA-seqライブラリー間のそれらの重複。(c)異なるゲノム特徴上のssDNAピークの分布。(d)同じ遺伝子座での対応するATAC-seq、H3K4me3 ChIP-seq、H3K36mes ChIP-seq、GRO-seqおよびPol II ChIP-seqプロフィールを伴った、UCSCゲノムブラウザ上での整列されたssDNA-seqリードのスナップショット。(e)ATAC-seq、H3K36me3 ChIP-seq、R-ChIPおよびGRO-seqと比較した、遺伝子コーディング領域上のssDNA-seqピークの分布。(f)ssDNA-seqと他の転写関連ゲノムワイドシーケンシングアッセイとの相関。
(図3)図3A〜E:(a)全ての発現遺伝子を、高、中または低RNAレベルを有する3つの群へ分類する。(b)(a)に示される3つの群中のssDNA、ATAC-seq H3K36me3およびH3K27acシグナル。(c)対照、DRB処理およびトリプトライド処理細胞中のssDNAピーク数(各条件について2つのレプリケートを行った、Trip = トリプトライド)。(d)対照、DRB処理およびトリプトライド処理条件における、遺伝子コーディング領域上のssDNA-seqピークの分布。(e)全ての遺伝子を、対照およびDRB処理条件下でのそれらのssDNA形成に従って異なるPol II休止および活性を有する4つの群へ分類した。各群中の一例をUCSCゲノムブラウザ上に示した。
(図4)図4A〜G:(a)ケトキサール補助RNA-RNA相互作用(KARRI)のスキーム。ボールはPAMAMデンドリマーを表す。ドットおよびロッドは、それぞれ、ビオチンおよびDBCO部分を表す。(b)〜(c)N3-ケトキサール標識RNAに対するDBCOおよびビオチン装飾PAMAMデンドリマーによる架橋の効率のゲル電気泳動(b)およびドットブロット(c)分析。(d)2つの個々のKARRIライブラリー間のピアソン相関。(e)デンドリマーを添加しなかったまたは近接ライゲーションを行わなかった2つの対照実験を伴う、KARRIによって明らかにされた45S rRNAの相互作用マップ。(f)PARISによって明らかにされた45S rRNAの相互作用マップ。(g)KARRIはRPL17 mRNAの2つの代替コンフォメーションを明らかにする。
(図5)図5A〜C:(a)KARRIがインビトロおよびインビボでのRNA二次構造間の差異を検出することを示す2つの例。ハリングトニン処理細胞において、インビボ特異的構造は損なわれ、一方、いくつかのインビトロ特異的特徴が現われた。関心対象の領域は円である。(b)インビトロ、インビボ、CHXおよびHT処理サンプル中の分子内mRNA二次構造のメタジーンプロフィール(metagene profile)。(c)HepG2 mRNAの全てのキメラリードのモチーフ解析結果。AGAGAAはeIF4AIIIの公知の結合モチーフと同様である。
(図6)図6A〜C:(a)光補助RNA標識化のスキーム。365 nm UVは光脱ケージ化反応を誘発し、生成物は、「クリック」ケミストリーを通してN3-ケトキサール標識核酸へ捕捉およびコンジュゲートされ得る。(b)光補助RNA標識化の質量スペクトル分析。(c)フォト-DBCO-OHの2つの潜在的な官能化戦略ならびにインサイチュRNAシーケンシングおよびイメージングにおけるそれらの潜在的な適用。
(図7)図7A〜F:Keth-seq法およびrG4領域周りのプロフィール。(a)keth-seqのライブラリー調製のための戦略の図。(b)N3-ケトキサールサンプルについてのレプリケート間の逆転写(RT)停止リード分布の散布図。挿入円グラフは、レプリケート2(左上)およびレプリケート1(右下)についてのRT停止塩基分布を示す。(c)全ての転写物についてのketh-seqおよびicSHAPE間の相関係数の累積プロット。各々の共通の転写物について、ピアソン相関係数をグアニン塩基の構造シグナルについて計算する。(d)予測される18SリボソームRNA構造およびプロービング構造プロフィール間の比較。予測される18S rRNA構造はRNA STRANDデータベース(id: CRW_00356)に由来する。(e)PDSおよび対照サンプル間の一般に知られているrG4領域のGINI指数。rG4領域はKit et.al., 2016, Nature methodに由来する(n = 13,423)。105個の領域が構造情報を有し、プロットされている(50ヌクレオチド長へ延長される)。(f)以前に同定されたインビトロrG4領域周りの構造プロフィールの2つの例。
(図8)4種類のRNA核塩基とのN3-ケトキサールのHPLC結果。N3-ケトキサールはグアニン(G)のみと反応することができ、A、C、およびUでは不活性であったことが示された。
(図9)N3-ケトキサールおよびSHAPE分子NAIのRNA反応性の比較。NAIを以前の報告された方法に従って合成した(Spitale et al., Nature Chemical Biology 9:18, 2012)。上部のグラフ:12 mer RNAオリゴの分子量(MW)。中央のグラフ:12 mer RNAオリゴとN3-ケトキサールとの反応の生成物のMW。下部のグラフ:RNAオリゴとNAIとの反応の生成物のMW。結果は、全てのグアニン(4つのグアニン)がN3-ケトキサールによって修飾されたことを示した。NAI反応について、いくつかのオリゴは1個のNAIによってのみ反応され、いくつかは2または3個によって標識された。原則として、RNAオリゴのリボース(12個のリボース)中の全ての2’-OH基がNAIの標的である。従って、N3-ケトキサールはRNAへのより高い反応性を示した。
(図10)RNA中におけるN3-ケトキサール標識化およびビオチン化反応のスキーム(上部)および質量スペクトル(下部)分析。4つのグアニンを有する10mer RNAをこの実験において使用した。
(図11)細胞状況におけるN3-ケトキサールによるG標識化の時間依存。1分間および5分間のN3-ケトキサールによる処理後、mES細胞のRNAを単離し、keth-seqを行い、これは、G停止部位が1分間から5分間へ向かって増加したことを示す。
(図12)図12A〜C:N3-ケトキサール標識RNAの可逆性。(a)スキームは、過剰なGTPの存在下でのN3-ケトキサール-グアニン反応の平衡変化を示す。N3-ケトキサール-グアニンは、過剰なGTPを用いて元の未反応RNAへ解離するのが遥かにより容易である。(b)MALDI-TOFモニタリングによるN3-ケトキサール標識RNAの可逆性。ケトキサール修飾は、37℃で中性緩衝液中で50 mM GTPと共に2時間インキュベーション後、大部分が除去され、6時間まで延長された場合はほぼ除去された。(c)上部:異なるインキュベーション期間中のPBS緩衝液(pH = 7.4)中95℃での50 mM GTPと共のN3-ケトキサール標識mRNAのドットブロット結果。下部:上部ドットブロットサンプルと同じ異なるインキュベーション条件下でのRNA断片の変性ゲル電気泳動。断片化RNAの長さは、過剰なGTPの存在下での10分間以内の95℃にてほとんど影響を受けなかった。
(図13)図13A〜C:ホウ酸緩衝液によるケトキサール標識RNAの固定。(a)グアニン-ケトキサールの付加物の隣接ジオール基は、ケトキサール修飾を固定するためにボレート分子と結合させることができる。(b)MALDI-TOF検出によるグアニン-ケトキサール-ホウ素複合体の形成。グアニン-ケトキサールの付加物を4-(アミノメチル)ベンゼンボロン酸と共にインキュベートした。(c)ホウ酸緩衝液の存在下でのグアニン-ケトキサール-ホウ素複合体の安定性試験。大部分のグアニン-ケトキサール付加物がホウ酸緩衝液固定によって保持され、一方、ホウ酸緩衝液の非存在下では全てのグアニン-ケトキサール付加物が消滅した。
(図14)図14A〜D:keth-seq法の品質管理。(a)N3-ケトキサール(左)および未処理対照(右)サンプルについてのレプリケート間のRPKM相関。(b)RTは、N3-ケトキサール、N3-ケトキサール除去サンプル、および未処理対照サンプルについてのレプリケートのリード分布を止めた。(c)インビボおよびインビトロmRNAサンプルの構造シグナル。(d)構造情報を有するmRNAおよび+PDSサンプル中の公知のrG4領域の重複。
(図15)異なるサンプル間のリード分布の例。タンパク質をコードするRNA mt-Atp8について、末端が97から108までの位置内にあった全てのマッピングされたリードを示す。リードは末端位置によってグループ化および着色されている。ここで、N3-ケトキサールサンプルにおいて、リードの大部分はグアニンで止まり、一方、N3-ケトキサール除去および未処理対照サンプルにおいて、リードは遥かにより均一に分布し、従って、N3-ケトキサール分子の高特異性を示唆している。リード群の大部分について、対照よりも除去サンプルにおいて同じ末端でより多くのより長いリードがある(例えば、強調された青緑色および赤色リード群)。対照サンプルに対する除去サンプル中の完全長リード突出のより高い比率は、より高い信頼性を有するRT停止部位を示し得る。
(図16)天然および+PDS条件の両方の下でのケトキサールおよび対照サンプルの潜在的なrG4領域周りのカバレッジトラックを示す2つの例。
(図17)N3-ケトキサールサンプル、N3-ケトキサール除去サンプル、および未処理対照サンプルのライブラリー調製の詳細なフローチャート。
(図18)図18A〜B:(a)ケトキサール-Daz CLIPの略図。RNAは、インキュベーションおよび365 nm UV照射後にインサイチュでRNA結合性タンパク質へ共有結合的に架橋される。これに、細胞溶解、および架橋された複合体の精製が続く。タンパク質を消化し、精製されたRNAを逆転写し(retrotranscribe)、次世代シーケンシングへ供した。(b)ケトキサール-Dazの分子構造。
Claims (27)
- Xがアジドである、請求項1記載の化合物。
- リンカーが、C1〜C10アルキルまたはポリエチレングリコールリンカーである、請求項1または2記載の化合物。
- YがCH2である、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
- グアニン塩基を標識するための方法であって、
反応混合物を形成するために、標識されるグアニンを請求項1記載の化合物と接触させる工程、および
反応混合物を30〜40℃で少なくとも5分間インキュベートする工程
を含む、前記方法。 - 前記化合物がN3-ケトキサールである、請求項6記載の方法。
- ポリヌクレオチド中にグアニンがさらに含まれている、請求項6または7記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがリボ核酸(RNA)である、請求項8記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸(DNA)である、請求項8記載の方法。
- RNAがRNA転写物である、請求項9記載の方法。
- 細胞中の一本鎖核酸を標識するための方法であって、
(i)ケトキサール誘導体標識グアニン塩基を有する核酸を含む処理細胞を形成するために、標的細胞を請求項1記載の化合物と接触させる工程;
(ii)処理細胞を少なくとも2つのクリックケミストリー反応性部分およびタグを含む架橋部分と接触させる工程であって、ここで、該架橋部分が、2つの近接ケトキサール誘導体標識グアニンを架橋して架橋核酸を形成する、工程;および
(iii)断片化し、かつ該タグに対する親和性を有する試薬を使用して架橋核酸を単離する工程
を含む、前記方法。 - 前記タグがビオチンである、請求項12記載の方法。
- 前記タグに対する親和性を有する試薬が、ストレプトアビジンである、請求項13記載の方法。
- クリックケミストリー反応性部分が、ジベンゾシクロオクチン部分である、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
- 架橋核酸が2つ以上の核酸を含む、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 架橋核酸がRNAである、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
- インビボでのトランスクリプトーム全体のRNA二次構造マッピングおよびRNA G-四重鎖予測のための方法であって、
(a)インビボで核酸をケトキサールクリックケミストリー誘導体で標識する工程;
(b)標識核酸をビオチン化する工程;
(c)標識化されかつビオチン化された核酸を断片化する工程;
(d)断片化/ビオチン化核酸から相補DNA(cDNA)を合成する工程;
(e)ビオチン化核酸と結合した合成cDNAを単離する工程;
(f)サイズに基づいてcDNAを分離する工程;
(g)環化cDNAライブラリーを形成するために、分離されたcDNAの環化を行う工程;および
(h)環化cDNAライブラリーを増幅する工程
を含む、前記方法。 - cDNAの環化が、一本鎖DNAリガーゼでのcDNAのライゲーションを含む、請求項18記載の方法。
- 環化cDNAライブラリーを増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項18記載の方法。
- ケトキサール誘導体タンパク質架橋に対するRNA/タンパク質相互作用を解析するための方法であって、
(a)RNAに近接しているタンパク質標的を、活性化可能なタンパク質架橋性部分に結合されたケトキサール誘導体と接触させて、標的/ケトキサール誘導体混合物を形成する工程;
(b)タンパク質架橋性部分を活性化するために標的/ケトキサール誘導体混合物を活性化因子へ曝露して、架橋された標的/ケトキサール誘導体複合体を形成する工程;
(c)架橋された標的/ケトキサール誘導体複合体を、タンパク質標的に結合する親和性物質を使用して単離する工程;および
(d)標的/ケトキサール誘導体複合体と共に単離されたRNAを同定する工程
を含む、前記方法。 - 前記活性化可能な架橋性部分が、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、N-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド、ビスマレイミドエタン、ジアザリン(diazarine)、ヨード酢酸スクシンイミジル、N-マレイミドアセトキシスクシンイミドエステル、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸スクシンイミジルまたはベンゾフェノンである、請求項21記載の方法。
- 活性化因子が光である、請求項21〜22のいずれか一項記載の方法。
- 光が紫外線である、請求項23記載の方法。
- 光が約350〜375 nmの波長を有する、請求項24記載の方法。
- 光が365 nmの波長を含む、請求項25記載の方法。
- アジド-ケトキサール(N3-ケトキサール)を合成するための方法であって、
(a) (i)テトラヒドロフラン(THF)中で水素化ナトリウムを2-アジドエタノールと混ぜ合わせて第1の中間混合物を形成すること、
(ii)2-ブロモプロピオン酸エチルを第1の中間混合物へ添加して第1の反応混合物を形成すること、
(iii)第1の反応混合物を窒素(N2)雰囲気下で室温にてインキュベートして2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を形成すること、
(iv)反応を水でクエンチすること、
(v)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸をLiOH水溶液へ添加し、室温でインキュベートすること、および
(vi)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を洗浄し、単離し、無水Na2SO4で乾燥させること
によって、2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸中間体を生成する工程;
(b) (i)2-(2-アジドエトキシ)プロパン酸を無水CH2Cl2およびジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解すること、
(ii)塩化オキサリルを添加し、室温で撹拌すること、
(iii)溶媒および過剰な塩化オキサリルを除去して残留物を形成すること、
(iv)残留物を無水CH3CNおよび(トリメチルシリル)ジアゾメタン中に溶解すること、
(v)ジエチルエーテルを滴下して第2の反応混合物を形成すること、
(vi)第2の反応混合物を0℃で一晩撹拌すること、
(vii)溶媒を蒸発させて3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンを単離すること
によって、3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オン中間体を生成する工程;ならびに
(c) (i)3-(2-アジドエトキシ)-1-ジアゾペンタン-2-オンをアセトン中のジメチルジオキシラン(DMD-アセトン)へ添加して第3の反応混合物を形成すること、
(ii)第3の反応混合物を室温で撹拌してN3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを形成すること、および
(iii)N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを単離すること
によって、N3-ケトキサールまたは3-(2-アジドエトキシ)-1,1-ジヒドロキシブタン-2-オンを生成する工程
を含む、前記方法。
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