JP2021122218A - 対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する技術を提供する。【解決手段】細胞を第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数）のｎ個の区画に分配する工程と、細胞の対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、検出用核酸群Ａを得る工程と、細胞を回収してプールする工程と、プールした細胞を再度第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）のｍ個の区画に分配する工程と、検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る工程と、検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る工程と、リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する工程とを含む方法。【選択図】なし
Description
本発明は、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法に関する。
複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで検出する需要がある。例えば、発明者らは、以前に、ＤＮＡ結合タンパク質と特定のゲノム領域との結合を１細胞レベルで解析する技術を開発した（特許文献１を参照。）
特許文献１に記載された方法の場合、対象核酸の塩基配列とは、ＤＮＡ結合タンパク質のゲノムＤＮＡ上の結合領域の近傍の塩基配列である。特許文献１に記載された方法により、ＤＮＡ結合タンパク質のゲノムＤＮＡ上の結合位置を１細胞レベルで解析することができる。
国際公開第２０１８／０４２７７６号
しかしながら、特許文献１に記載された方法を、複数の細胞に対して１細胞レベルで並列に実施するためには、更なる技術開発が必要である。本発明は、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法であって、前記細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する工程αと、前記第１〜第ｎの区画に分配した前記細胞の前記対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る工程βと、前記第１〜第ｎの区画から前記細胞を回収してプールする工程γと、プールした前記細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に分配する工程δと、前記第１〜第ｍの区画に分配した前記細胞の、前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る工程εと、前記第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る工程ζと、前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する工程ηと、を含む、方法。
［２］前記工程αにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した前記細胞を、前記区画の内部にアビジン−ビオチン結合により結合する、［１］に記載の方法。
［３］前記工程γにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画の内部に結合した前記細胞を、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物により剥離させて回収する、［２］に記載の方法。
［４］前記工程βにおける前記対象核酸と前記第１〜第ｎの核酸断片Ａとの連結を、トランスポザーゼを用いて行う、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程εにおける前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａと前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂとの連結を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記第１〜第ｎの核酸断片Ａ及び前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂのそれぞれが、下記表１及び表２に記載のいずれかの塩基配列を含む塩基配列を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１］複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法であって、前記細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する工程αと、前記第１〜第ｎの区画に分配した前記細胞の前記対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る工程βと、前記第１〜第ｎの区画から前記細胞を回収してプールする工程γと、プールした前記細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に分配する工程δと、前記第１〜第ｍの区画に分配した前記細胞の、前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る工程εと、前記第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る工程ζと、前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する工程ηと、を含む、方法。
［２］前記工程αにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した前記細胞を、前記区画の内部にアビジン−ビオチン結合により結合する、［１］に記載の方法。
［３］前記工程γにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画の内部に結合した前記細胞を、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物により剥離させて回収する、［２］に記載の方法。
［４］前記工程βにおける前記対象核酸と前記第１〜第ｎの核酸断片Ａとの連結を、トランスポザーゼを用いて行う、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程εにおける前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａと前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂとの連結を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記第１〜第ｎの核酸断片Ａ及び前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂのそれぞれが、下記表１及び表２に記載のいずれかの塩基配列を含む塩基配列を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する技術を提供することができる。
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
１実施形態において、本発明は、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法であって、前記細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する工程αと、前記第１〜第ｎの区画に分配した前記細胞の前記対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る工程βと、前記第１〜第ｎの区画から前記細胞を回収してプールする工程γと、プールした前記細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に分配する工程δと、前記第１〜第ｍの区画に分配した前記細胞の、前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る工程εと、前記第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る工程ζと、前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する工程ηとを含む方法を提供する。
図１は、本実施形態の方法を説明する模式図である。以下、図１を用いて本実施形態の方法を説明する。
（工程α）
まず、工程αにおいて、解析対象の細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する。例えば、細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分配してもよい。この場合、ｎは９６である。ｎの数は９６に限られず、２以上の任意の整数であってよい。ｎは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、９２１６等であってもよい。細胞の分配は、マイクロピペットを用いて手動で行ってもよいし、セルソーター等の装置を用いて行ってもよい。
まず、工程αにおいて、解析対象の細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する。例えば、細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分配してもよい。この場合、ｎは９６である。ｎの数は９６に限られず、２以上の任意の整数であってよい。ｎは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、９２１６等であってもよい。細胞の分配は、マイクロピペットを用いて手動で行ってもよいし、セルソーター等の装置を用いて行ってもよい。
ここで、細胞は、解析対象である対象核酸を有している。対象核酸は、例えば、ゲノム上の特定領域（対象ＤＮＡ結合タンパク質の近傍）であってもよいし、ｍｉＲＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡであってもよい。
あるいは、対象核酸は、核酸でない分子に標識した核酸であってもよい。核酸でない分子としては、例えば、タンパク質、代謝物等が挙げられる。例えば、解析対象であるタンパク質や代謝物に対する特異的結合物質を、対象核酸で標識し、この特異的結合物質を細胞に接触させる。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。この結果、タンパク質や代謝物が対象核酸で標識される。この対象核酸を検出することにより、タンパク質や代謝物を１細胞レベルで並列に検出することができる。
対象核酸は細胞内に存在していてもよいし、細胞表面に存在していてもよい。また、対象核酸は、１細胞あたり１分子存在していてもよいし、１細胞あたり複数分子存在していてもよい。ここで、複数とは、例えば２〜１０個であってもよいし、例えば２〜１０，０００個であってもよいし、例えば２〜１，０００，０００個であってもよい。
工程αにおいて、第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した細胞を、区画の内部に固定してもよい。例えば、区画がウェルプレートにより構成されている場合には、ウェルの表面に細胞を固定してもよい。細胞を固定することにより、洗浄が必要な反応を行うことが可能になる。洗浄が必要な反応としては、例えば、抗原抗体反応、後述するＣｈＩＬ法による反応等が挙げられる。
従来、細胞を固相に固定し、所望の反応を行った後、再び細胞を固相から剥離して回収することは困難であった。これに対し、発明者らは、細胞を固相に結合し、更に回収することができる方法を見出した。
具体的には、第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した細胞を、区画の内部にアビジン−ビオチン結合により結合してもよい。
例えば、細胞にビオチン化試薬を反応させることにより、細胞表面にビオチンを結合させることができる。ビオチン化試薬としては、例えば、スクシンイミド基、マレイミド基、ヨードアセチル基、ピリジルジスルフィド基、ヒドラジド基、アルコキシアミン基等を含む化学リンカーを用いることができる。また、ビオチン化試薬の内部に切断可能な結合を有していてもよい。切断可能な結合としては、ジスルフィド結合等が挙げられる。
より具体的なビオチン化試薬としては、例えば、ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｌｋｏｘｙａｍｉｎｅ−ＰＥＧ４−ＳＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ、ＨＰＤＰ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＢＭＣＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｌｋｏｘｙａｍｉｎｅ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能である。）等が挙げられるがこれらに限定されない。
細胞表面がビオチン化された細胞を、アビジンコートされたウェルプレートに分注すると、ウェルの表面にアビジン−ビオチン結合により結合することができる。アビジンとして、ストレプトアビジンを用いてもよい。また、細胞表面をアビジン化し、ウェルの表面をビオチン化してもよい。
固相に結合した細胞を固相から剥離して回収する方法としては、例えば、固相に結合した細胞に細胞を破壊しない程度のマイルドな酵素を作用させることが挙げられる。このような酵素としては、タンパク質分解活性を有する酵素及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物が挙げられ、より具体的には、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク社）等が挙げられる。
また、ビオチン化試薬の内部にジスルフィド結合が存在する場合には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等の還元剤を作用させて、当該ジスルフィド結合を切断してもよい。これにより、細胞を固相から剥離することができる。更に、固相に結合した細胞に、酵素及び還元剤の双方を作用させることにより、細胞を固相から剥離して回収してもよい。
（工程β）
続いて、工程βにおいて、第１〜第ｎの区画に分配した細胞の対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る。
続いて、工程βにおいて、第１〜第ｎの区画に分配した細胞の対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る。
核酸断片Ａの連結方法は特に限定されず、例えばトランスポザーゼを用いて行ってもよいし、例えばポリメラーゼ連鎖反応により行ってもよいし、例えば、ライゲーション反応により行ってもよい。
例えば、核酸断片Ａの塩基配列を含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合、得られた増幅産物は対象核酸と核酸断片Ａが連結したものとなる。例えば、ライゲーション反応により、核酸断片Ａの塩基配列を含む核酸断片と対象核酸とを連結させることもできる。トランスポザーゼを用いる方法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、ＣｈＩＬ法）については後述する。
核酸断片Ａは、細胞がどの区画に分配されていたかを識別可能な識別配列を含む。核酸断片Ａは識別配列以外に付加的な塩基配列を含んでいてもよい。また、核酸断片Ａは１つの連続した核酸断片から構成されていてもよいし、２以上の核酸断片から構成されていてもよい。例えば、核酸断片Ａはセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組み合わせから構成されていてもよい。また、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの双方が識別配列を含んでいてもよい。ここで、センスプライマーが含む識別配列とアンチセンスプライマーが含む識別配列は異なっていてもよく、これらの識別配列の組み合わせが核酸断片Ａの識別配列として機能してもよい。
識別配列としては、確率的に出現頻度が低い塩基配列であれば特に制限されず、例えば約４〜２０塩基程度の任意の塩基配列を用いることができる。第１〜第ｎの核酸断片Ａのそれぞれは、例えば、上記表１及び表２に記載のいずれかの塩基配列からなる識別配列を含む塩基配列を有することができる。上記表１には、３８４個の塩基配列が記載されている。上記表２には、３２４個の塩基配列が記載されている。上記表１及び表２に記載の塩基配列は、人工的に作出した塩基配列であり、１細胞レベルで細胞を識別する際に、識別配列に基づいて細胞をより正確に分離させるために、シーケンスエラーを考慮し、少なくとも２塩基以上が互いに異なるように設計されている。
図１の例では、９６ウェルプレートの各ウェルに分配した細胞の対象核酸に、ウェルごとに塩基配列が異なる第１〜第９６の核酸断片Ａを連結する。この結果、核酸断片Ａの塩基配列がウェルごとに異なる、第１〜第９６の検出用核酸群Ａが得られる。ここで、検出用核酸群Ａとは、塩基配列が異なる検出用核酸Ａの混合物を意味する。検出用核酸Ａは、対象核酸と核酸断片Ａが連結したものである。図１の例では、核酸断片Ａの種類ごとに細胞の図のパターンを変化させている。
（工程γ）
続いて、工程γにおいて、第１〜第ｎの区画から細胞を回収してプールする。工程αにおいて、第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した細胞が、区画の内部に結合している場合には、本工程において、細胞を、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物により剥離させて回収してもよい。
続いて、工程γにおいて、第１〜第ｎの区画から細胞を回収してプールする。工程αにおいて、第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した細胞が、区画の内部に結合している場合には、本工程において、細胞を、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物により剥離させて回収してもよい。
また、上述したように、細胞がアビジン−ビオチン結合により区画の内部に結合しており、アビジン−ビオチン結合を還元剤により切断可能な場合には、還元剤を作用させて細胞を剥離させてもよい。アビジン−ビオチン結合を還元剤により切断可能な場合としては、例えば、使用したビオチン化試薬の内部にジスルフィド結合が存在する場合が挙げられる。還元剤としては、上述したものと同様であり、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール等が挙げられる。
また、固相に結合した細胞に、酵素及び還元剤の双方を作用させることにより、細胞を固相から剥離して回収してもよい。
（工程δ）
続いて、工程δにおいて、プールした細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に再分配する。例えば、細胞を３８４ウェルプレートの各ウェルに分配してもよい。この場合、ｍは３８４である。図１の例では、細胞を２４枚の３８４プレートの各ウェルに分配している。この場合、ｍは９２１６である。細胞の分配は、マイクロピペットを用いて手動で行ってもよいし、セルソーター等の装置を用いて行ってもよい。
続いて、工程δにおいて、プールした細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に再分配する。例えば、細胞を３８４ウェルプレートの各ウェルに分配してもよい。この場合、ｍは３８４である。図１の例では、細胞を２４枚の３８４プレートの各ウェルに分配している。この場合、ｍは９２１６である。細胞の分配は、マイクロピペットを用いて手動で行ってもよいし、セルソーター等の装置を用いて行ってもよい。
ｍの数は３８４や９２１６に限られず、２以上の任意の整数であってよい。ｍは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、９２１６等であってもよい。
（工程ε）
続いて、工程εにおいて、第１〜第ｍの区画に分配した細胞の細胞内又は細胞表面に存在する、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る。
続いて、工程εにおいて、第１〜第ｍの区画に分配した細胞の細胞内又は細胞表面に存在する、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る。
核酸断片Ｂの連結方法は、上述した核酸断片Ａの連結方法と同様であり、例えばトランスポザーゼを用いて行ってもよいし、例えばポリメラーゼ連鎖反応により行ってもよいし、例えば、ライゲーション反応により行ってもよい。
例えば、核酸断片Ｂの塩基配列を含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った場合、得られた増幅産物は検出用核酸群Ａと核酸断片Ｂが連結したものとなる。例えば、ライゲーション反応により、核酸断片Ｂの塩基配列を含む核酸断片と検出用核酸群Ａとを連結させることもできる。
核酸断片Ｂは、核酸断片Ａと同様に、細胞がどの区画に分配されていたかを識別可能な識別配列を含む。核酸断片Ｂは識別配列以外に付加的な塩基配列を含んでいてもよい。また、核酸断片Ｂは１つの連続した核酸断片から構成されていてもよいし、２以上の核酸断片から構成されていてもよい。例えば、核酸断片Ｂはセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組み合わせから構成されていてもよい。また、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの双方が識別配列を含んでいてもよい。ここで、センスプライマーが含む識別配列とアンチセンスプライマーが含む識別配列は異なっていてもよく、これらの識別配列の組み合わせが核酸断片Ｂの識別配列として機能してもよい。
識別配列としては、確率的に出現頻度が低い塩基配列であれば特に制限されず、例えば約４〜２０塩基程度の任意の塩基配列を用いることができる。第１〜第ｍの核酸断片Ｂのそれぞれは、例えば、上記表１及び表２に記載のいずれかの塩基配列からなる識別配列を含む塩基配列を有することができる。
図１の例では、２４枚の３８４ウェルプレートの各ウェルに分配した細胞の対象核酸に、ウェルごとに塩基配列が異なる第１〜第９２１６の核酸断片Ｂを連結する。この結果、核酸断片Ｂの塩基配列がウェルごとに異なる、第１〜第９２１６の検出用核酸群Ｂが得られる。ここで、検出用核酸群Ｂとは、塩基配列が異なる検出用核酸Ｂの混合物を意味する。検出用核酸Ｂは、対象核酸、核酸断片Ａ及び核酸断片Ｂが連結したものである。図１の例では、核酸断片Ａ及び核酸断片Ｂの組み合わせの種類ごとに細胞の図のパターンを変化させている。
以上の操作により、図１の例では、９６×２４×３８４種類、すなわち、約８×１０５種類の核酸断片Ａ及び核酸断片Ｂの組み合わせを形成することができる。この場合、１細胞ごとに、核酸断片Ａ及び核酸断片Ｂの異なる組み合わせを対応させることが可能となる。したがって、図１の例では、約８×１０５個の細胞について、それぞれの細胞に存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出することができる。
（工程ζ）
続いて、工程ζにおいて、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る。塩基配列の決定には、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。
続いて、工程ζにおいて、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る。塩基配列の決定には、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。
（工程η）
続いて、工程ηにおいて、前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する。
続いて、工程ηにおいて、前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する。
［ＣｈＩＬ法］
ここで、トランスポザーゼを用いて、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法である、ＣｈＩＬ法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）について説明する。
ここで、トランスポザーゼを用いて、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法である、ＣｈＩＬ法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）について説明する。
ＣｈＩＬ法は、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程（ａ）と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程（ｂ）と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程（ｃ）と、を含む。
ＣｈＩＬ法によれば、免疫沈降を行うことなく、ＤＮＡ結合タンパク質と特定のゲノム領域との結合を解析することができる。したがって、ＣｈＩＬ法によれば、免疫沈降を必須の工程とする従来技術では解析が困難であったＤＮＡ結合タンパク質について、ＤＮＡとの結合を解析することができる。また、従来技術では、１細胞レベルでＤＮＡ結合タンパク質の解析を行うことは困難であった。これに対し、ＣｈＩＬ法によれば、１細胞レベルでＤＮＡ結合タンパク質の解析を行うこともできる。
解析対象となるＤＮＡ結合タンパク質は、特に制限されず、例えば、ヒストン、転写因子、リン酸化ポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質として、特定のリン酸化状態のＲＮＡポリメラーゼＩＩを解析することにより、遺伝子の転写状態を解析することができる。
以下、図２〜７を参照しながらＣｈＩＬ法について説明する。図２〜７は、ＣｈＩＬ法を説明する模式図である。図２は、ゲノムＤＮＡ１０がヒストン２０に巻きついてクロマチン構造を形成した状態を示す。図２の例では、ＤＮＡ結合タンパク質はヒストン２０である。
図２の例では、特異的結合物質３０は、ヒストン２０を認識する抗体である。特異的結合物質３０には、リンカー４４を介してＤＮＡ断片４０が結合されている。ＤＮＡ断片４０は、トランスポザーゼ結合配列４１と、所望の塩基配列とを含む塩基配列を有している。図２の例では、所望の塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列である。図２〜７において、Ｔ７プロモーター配列４２の矢印は、Ｔ７ポリメラーゼによる転写の向きを示す。ＤＮＡ断片４０は、上述した核酸断片Ａ又は核酸断片Ｂに対応する。
リンカー４４は、ＤＮＡ断片４０をヒストン２０の結合領域１１に近接させるためのつなぎひも（ｔｅｔｈｅｒ、テザー）の役割を有している。図２の例では、リンカー４４はＤＮＡ断片であり、例えば５０〜７０塩基の長さを有している。しかしながら、リンカー４４は、テザーとして機能するものであれば特に制限されず、例えばポリエチレングリコール等のポリマーで構成されていてもよい。
（工程（ａ））
図２の例では、パラホルムアルデヒド固定された細胞を試料としてＣｈＩＬ法を実施している。まず、ヒストン２０に対する特異的結合物質３０を利用して、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させる。ここで、特異的結合物質３０を利用して近接させるとは、図２の例のようにＤＮＡ断片４０が結合した特異的結合物質３０を、その抗原であるヒストン２０に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。あるいは、特異的結合物質３０が、例えばヒストン２０に対するマウスＩｇＧ抗体であり、このマウスＩｇＧ抗体を１次抗体としてヒストン２０に結合させ、続いて、ＤＮＡ断片４０が結合した抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として上記の１次抗体に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。
図２の例では、パラホルムアルデヒド固定された細胞を試料としてＣｈＩＬ法を実施している。まず、ヒストン２０に対する特異的結合物質３０を利用して、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させる。ここで、特異的結合物質３０を利用して近接させるとは、図２の例のようにＤＮＡ断片４０が結合した特異的結合物質３０を、その抗原であるヒストン２０に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。あるいは、特異的結合物質３０が、例えばヒストン２０に対するマウスＩｇＧ抗体であり、このマウスＩｇＧ抗体を１次抗体としてヒストン２０に結合させ、続いて、ＤＮＡ断片４０が結合した抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として上記の１次抗体に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。
ヒストン２０に対する特異的結合物質３０を利用して、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させる工程は、図２の例のように、固定された細胞内で実施することができる。この工程は、免疫染色と同様に、複数の抗体を同時に使用することも可能である。したがって、ＣｈＩＬ法によれば、複数のＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍にそれぞれ異なる所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入することもできる。ここで、識別配列４３に、ＤＮＡ結合タンパク質ごとに区別可能な配列を含めることにより、複数のＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を区別して検出することもできる。
（工程（ｂ））
続いて、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させる。図３は、試料にトランスポザーゼ５０を添加して、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させた状態を示す。
続いて、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させる。図３は、試料にトランスポザーゼ５０を添加して、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させた状態を示す。
トランスポザーゼとしては、核内に入りやすい観点から、大きさが小さなものが好ましい。例えば、分子量が５０ＫＤａ以下のトランスポザーゼが好ましい。また、認識する配列の配列特異性が高いものが好ましい。また、ＤＮＡ型トランスポザーゼが好ましい。また、活性を制御できるトランスポザーゼが好ましく、例えば、２価の金属イオン等のカチオンをバッファー中に添加すると活性化されるトランスポザーゼが挙げられる。好ましいトランスポザーゼとしては、例えば、ＴＮ５トランスポザーゼ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ（ＳＢ１０）、ＴＮ１０等が挙げられる。トランスポザーゼ結合配列４１は、使用するトランスポザーゼに応じて決定すればよい。
（工程（ｃ））
続いて、上記のトランスポザーゼ５０を活性化する。トランスポザーゼ５０の活性化は、例えば、２価の金属イオンをバッファー中に添加すること等により実施することができる。
続いて、上記のトランスポザーゼ５０を活性化する。トランスポザーゼ５０の活性化は、例えば、２価の金属イオンをバッファー中に添加すること等により実施することができる。
また、トランスポザーゼ５０の種類によっては、ＤＮＡ断片を転移させる活性を発揮するためにダイマーを形成する必要がある場合がある。また、トランスポザーゼ５０がダイマーを形成するために、トランスポザーゼ５０がトランスポザーゼ結合配列４１に結合している必要がある場合がある。例えば、上述したＴＮ５、ＳＢ１０、ＴＮ１０等はこのようなトランスポザーゼである。このような場合には、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させることによってもトランスポザーゼ５０を活性化することができる。
また、トランスポザーゼ５０の種類によっては、トランスポザーゼ５０を活性化するために、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させ、且つ２価の金属イオンをバッファー中に添加することが必要な場合がある。
図４は、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させた状態を示す。図４では、試料に、トランスポザーゼ結合配列４１を有する遊離のＤＮＡ断片を添加して、当該ＤＮＡ断片にトランスポザーゼ５０を結合させている。図４に示すように、上記のＤＮＡ断片と結合したトランスポザーゼ５０は、ＤＮＡ断片４０を構成するトランスポザーゼ結合配列４１に結合したトランスポザーゼ５０とダイマーを形成する。
トランスポザーゼ５０を活性化した結果、ＤＮＡ断片４０中の所望の塩基配列（図４の例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）のＤＮＡ断片が結合領域１１の近傍に挿入される。ここで、近傍とは、空間的に近い領域であればよく、例えば結合領域１１から５００塩基以下であってもよく、例えば１００塩基以下であってもよく、例えば５０塩基以下であってもよい。
あるいは、近傍とは、空間的に近い領域であればよいため、ゲノムＤＮＡ１０の塩基配列上は結合領域１１から非常に離れた領域であって、ゲノム領域同士の相互作用により近接した領域であってもよい。すなわち、染色体構造上近接した領域であってもよい。
本工程において、トランスポザーゼ５０によるＤＮＡ断片の挿入反応が不完全に終了する場合がある。具体的には、例えば、挿入されたＤＮＡ断片が部分的に１本鎖ＤＮＡとなっている場合、挿入されたＤＮＡ断片が断片化している場合等が挙げられる。そこで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等を用いたｆｉｌｌ ｉｎ反応等により、トランスポザーゼ５０によるＤＮＡ断片の挿入反応を完全に終了させる工程を更に実施することが好ましい。
図５は、所望の塩基配列のＤＮＡ断片が結合領域１１の近傍に挿入された状態の一例を示す模式図である。図５に示すように、この例では、結合領域１１の近傍に所望の塩基配列（Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）のＤＮＡ断片が挿入されている。図５の例では、所望の塩基配列だけでなく、２つのトランスポザーゼ結合配列４１、及びリンカー４４の一部に由来する塩基配列４４’もゲノムＤＮＡ１０に挿入されている。
図６（ａ）〜（ｃ）は、上述した図３の状態からトランスポザーゼ５０が活性化した結果、ＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡ１０に挿入された場合の例を示す模式図である。図６（ａ）は、上述した図５の状態を示す。図６（ｂ）は、上述した図５とは逆向きに所望の塩基配列が挿入された状態を示す。図６（ｃ）は、トランスポザーゼ結合配列４１を有する遊離のＤＮＡ断片に結合したトランスポザーゼ５０同士がダイマーを形成した場合に、ゲノムＤＮＡ１０に挿入されうる塩基配列を示す。
図６（ｃ）においてゲノムＤＮＡ１０に挿入された塩基配列は、２つのトランスポザーゼ結合配列４１を含み、それらの間に、任意の塩基配列４５を含む場合がある。塩基配列４５は、上述したｆｉｌｌ ｉｎ反応により形成されたものである。
図６（ｃ）に示す塩基配列は、目的外の副産物であり、結合領域１１の近傍に限らず、ゲノムＤＮＡ１０上のあらゆる部分に挿入され得る。しかしながら、図６（ｃ）に示す塩基配列は、所望の塩基配列（この例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）を有していない。このため、目的とする解析における影響を排除することができる。
以上の工程により、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入することができる。
（所望の塩基配列）
また、図２〜６の例では、ゲノムＤＮＡ１０に挿入する所望の塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列であったが、所望の塩基配列はこれに限定されない。例えば、所望の塩基配列として、Ｔ７プロモーター配列４２の代わりにＳＰ６プロモーター配列等の別のプロモーター配列を用いてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、識別配列のみから構成されていてもよい。
また、図２〜６の例では、ゲノムＤＮＡ１０に挿入する所望の塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列であったが、所望の塩基配列はこれに限定されない。例えば、所望の塩基配列として、Ｔ７プロモーター配列４２の代わりにＳＰ６プロモーター配列等の別のプロモーター配列を用いてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、識別配列のみから構成されていてもよい。
ゲノムＤＮＡ１０に挿入する所望の塩基配列の長さは、例えば２０〜５００塩基であってもよく、例えば２０〜２００塩基であってもよく、例えば２０〜１００塩基であってもよい。
また、図２〜６の例では、ＤＮＡ断片４０を構成する各要素（Ｔ７プロモーター配列４２、識別配列４３及びトランスポザーゼ結合配列４１）は隣接しているが、各要素の間には任意の塩基配列のスペーサーが存在していてもよい。また、各要素の順序は図２〜６の例に示したものに限定されず、必要に応じて適宜入れ換えてもよいし、追加の要素を付加してもよい。
また、ＤＮＡ断片４０は、１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。但し、使用するトランスポザーゼの特性により、トランスポザーゼ結合配列４１が２本鎖ＤＮＡである必要がある場合には、少なくともトランスポザーゼ結合配列４１は２本鎖である必要がある。
（ＣｈＩＬ法により挿入したＤＮＡ断片を利用した解析）
ＣｈＩＬ法では、所望の塩基配列（図２〜６の例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）を起点としてＤＮＡ１０を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を含む方法により、所望のＤＮＡ断片が挿入されたゲノム上の位置を解析することができる。
ＣｈＩＬ法では、所望の塩基配列（図２〜６の例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）を起点としてＤＮＡ１０を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を含む方法により、所望のＤＮＡ断片が挿入されたゲノム上の位置を解析することができる。
（遺伝子増幅）
遺伝子増幅としては、例えば、挿入した塩基配列に相補的なプライマーとランダムプライマーとを組み合わせたＰＣＲ、ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等）を用いた転写等が挙げられる。本明細書において、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、結合領域１１の近傍に挿入された所望の塩基配列の一部又は全部を利用してゲノムＤＮＡ１０を遺伝子増幅することを意味する。
遺伝子増幅としては、例えば、挿入した塩基配列に相補的なプライマーとランダムプライマーとを組み合わせたＰＣＲ、ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等）を用いた転写等が挙げられる。本明細書において、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、結合領域１１の近傍に挿入された所望の塩基配列の一部又は全部を利用してゲノムＤＮＡ１０を遺伝子増幅することを意味する。
例えば、図２〜６の例では、ゲノムＤＮＡ１０に挿入した塩基配列にＴ７プロモーター配列４２が含まれている。そこで、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、上記のゲノムＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて転写することにより、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のゲノムＤＮＡ１０をＲＮＡに転写することであってもよい。
あるいは、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、上記のゲノムＤＮＡ１０を鋳型として、挿入した塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を有するプライマーと、ランダムプライマーとを組み合わせたＰＣＲを行うこと等により、結合領域１１の近傍のゲノムＤＮＡ１０の塩基配列を遺伝子増幅することであってもよい。
すなわち、ＣｈＩＬ法では、挿入した塩基配列がプロモーター配列を含んでおり、遺伝子増幅が、プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させてプロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより遺伝子増幅してもよい。なお、上述したように、図６（ｃ）に示す塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２を有していないため、Ｔ７ポリメラーゼを作用させても遺伝子増幅（転写）されることはない。
あるいは、挿入した所望の塩基配列を利用したＰＣＲ等により遺伝子増幅してもよい。なお、上述したように、図６（ｃ）に示す塩基配列は、所望の塩基配列（Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が結合した塩基配列）を有していないため、挿入した塩基配列を利用したＰＣＲ反応を行っても遺伝子増幅されることはない。
図７（ａ）は、図５又は図６（ａ）に示すＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のＤＮＡ１０をＲＮＡ６０に転写した状態を示す図である。また、図７（ｂ）は、図６（ｂ）に示すＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のＤＮＡ１０をＲＮＡ６０に転写した状態を示す図である。
図７（ａ）、（ｂ）の例では、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が導入されているため、ＲＮＡ６０は、識別配列４３の相補鎖４３’及び識別配列４３の下流のＤＮＡ１０の相補鎖１０’を含んでいる。
ゲノムＤＮＡにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、上記の反応により挿入したＴ７プロモーター配列４２以外の領域からＲＮＡが転写されてしまう場合がある。これに対し、識別配列４３が存在することにより、挿入したＴ７プロモーター配列４２を起点として転写されたＲＮＡとそれ以外のＲＮＡとを識別することが可能になる。すなわち、識別配列４３の相補鎖４３’を有するＲＮＡ６０は、挿入したＴ７プロモーター配列４２を起点として転写されたＲＮＡであると判断することができる。
また、上述したように、ＣｈＩＬ法では、同時に複数のＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を用いた解析を行うことができる。ここで、各特異的結合物質を利用してＤＮＡ１０に挿入されるＤＮＡ断片４０に、それぞれ異なる識別配列４３を導入しておくことにより、いずれのＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍から転写されたＲＮＡであるかを識別することも可能になる。
続いて、転写されたＲＮＡ６０の塩基配列を解析することにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したゲノム上の位置を特定することができる。ＲＮＡ６０の塩基配列の解析は、例えば、次世代シークエンサーにより行ってもよいし、ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション等により行ってもよい。
上述した図７（ａ）、（ｂ）の例では、ＲＮＡ６０に転写される領域が互いに異なっているが、いずれの例においても、ＲＮＡ６０は結合領域１１の近傍から転写されるＲＮＡである。したがって、ＲＮＡ６０の塩基配列を解析することにより、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（図２〜７の例ではヒストン２０）の結合領域のゲノム上の位置を特定することができる。すなわち、所望の塩基配列が挿入される向きは、解析結果に影響しない。
（結合体）
ここで、ＣｈＩＬ法に用いる結合体について説明する。ここで、結合体とは、トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質とが結合したものである。
ここで、ＣｈＩＬ法に用いる結合体について説明する。ここで、結合体とは、トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質とが結合したものである。
結合体において、トランスポザーゼ結合配列、所望の塩基配列、特異的結合物質については、上述したものと同様である。すなわち、所望の塩基配列は識別配列を含む。また、所望の塩基配列は、識別配列の上流にプロモーター配列を更に含んでいてもよい。
結合体において、ＤＮＡ断片は、リンカーを介してＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質と結合していることが好ましい。リンカーについては上述したものと同様である。
「所望のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質との結合体」は、例えば、１次抗体に所望のＤＮＡ断片が結合した結合体を意味する。すなわち、結合体は、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質に直接上記のＤＮＡ断片が結合した結合体であってもよい。
また、「所望のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体」は、例えば、２次抗体に所望のＤＮＡ断片が結合した結合体を意味する。すなわち、所望のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質には結合しておらず、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質に結合する特異的結合物質に結合していてもよい。より具体的には、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質がマウスＩｇＧであった場合、所望のＤＮＡ断片と抗マウスＩｇＧ抗体との結合体等が挙げられる。
特異的結合物質１分子あたりの所望のＤＮＡ断片の数は特に制限されず、例えば１〜１０個程度であることができる。また、特異的結合物質にＤＮＡ断片を結合する方法は特に制限されず、例えば、スクシンイミド基、マレイミド基等を有する化学架橋剤を用いて結合してもよい。例えば、ＤＮＡ断片の５’末端にアミノ基を結合させておき、当該アミノ基と特異的結合物質に存在するアミノ基、カルボキシ基等の官能基を適宜の化学架橋剤で共有結合することが挙げられる。あるいは、例えば、アビジンとビオチンの結合等を利用して特異的結合物質にＤＮＡ断片を結合させてもよい。
［ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法］
ここで、ＣｈＩＬ法を、多数の細胞に対して１細胞レベルで並列に実施する方法（以下、「ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法」という場合がある。）について説明する。図８は、ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法の一例を説明する模式図である。
ここで、ＣｈＩＬ法を、多数の細胞に対して１細胞レベルで並列に実施する方法（以下、「ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法」という場合がある。）について説明する。図８は、ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法の一例を説明する模式図である。
まず、工程αにおいて、細胞を第１〜第９６の９６個の区画に分配する。図８の例では、９６ウェルプレートの各ウェルに細胞を分配している。
続いて、工程βにおいて、第１〜第９６の区画に分配した細胞の対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第９６の核酸断片Ａ（ＣｈＩＬプローブ）を連結し、第１〜第９６の検出用核酸群Ａを得る。図８において、菱形、円、星型五角形の記号は、それぞれ核酸断片Ａの例を示す。
続いて、工程γにおいて、第１〜第９６の区画から細胞を回収してプールする。
続いて、工程δにおいて、プールした前記細胞を第１〜第９２１６の９２１６個の区画に分配する。図８の例では、セルソーターを使用して、２４枚の３８４ウェルプレートの各ウェルに細胞を分配している。
続いて、工程εにおいて、第１〜第９２１６の区画に分配した細胞の、第１〜第９６の検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第９２１６の核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第９２１６の検出用核酸群Ｂを得る。図８において、三角形及び六角形の記号の組み合わせ、５角形及び星型七角形の記号の組み合わせは、それぞれ核酸断片Ｂの例を示す。
図８の例では、第１〜第９６の検出用核酸群Ａを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した核酸断片を鋳型として、第１〜第９２１６のプライマーセットを用いたＰＣＲにより核酸断片Ｂを連結している。このように、核酸断片Ｂは、検出用核酸群Ａそのものではなく、検出用核酸群Ａの転写物、検出用核酸群Ａの相補鎖等に結合してもよい。
続いて、工程ζにおいて、第１〜第９２１６の検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る。
続いて、工程ηにおいて、リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する。
図８の例の場合、９６種類の核酸断片Ａ及び９２１６種類（２４枚の３８４ウェルプレートの各ウェルに対応する。）の核酸断片Ｂの組み合わせである、８８４，７３６種類の識別配列の組み合わせにより対象核酸を識別することができる。８８４，７３６種類の識別配列の組み合わせのそれぞれが１細胞に対応する。すなわち、同じ識別配列の組み合わせを有するリードは、同一の１細胞に由来する。以上の方法により、ＣｈＩＬ法を、多数の細胞に対して１細胞レベルで並列に実施することができる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（細胞の固定・剥離条件の検討）
細胞を９６ウェルプレートに固定してＣｈＩＬ法を行った後、剥離して回収する条件検討を行った。細胞としては、マウス骨格筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を使用した。
（細胞の固定・剥離条件の検討）
細胞を９６ウェルプレートに固定してＣｈＩＬ法を行った後、剥離して回収する条件検討を行った。細胞としては、マウス骨格筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を使用した。
《細胞表面のビオチン化》
まず、細胞１×１０６個をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１５ｍＬチューブに入れた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
まず、細胞１×１０６個をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１５ｍＬチューブに入れた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
続いて、沈殿した細胞のペレットに、ＰＢＳに溶解し氷冷した、１ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（カタログ番号「Ａ３９２５８」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４℃で３０分間回転させた。これにより、細胞表面に、ビオチンが、ジスルフィド結合を有する化学リンカーで結合した。
続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、氷冷したクエンチバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を１ｍＬ加えた。続いて、チューブをローテーターにセットして４℃で３０分間回転させた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
《細胞の固定》
続いて、沈殿した細胞のペレットに、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを１ｍＬ加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４室温で５分間回転させた。これにより、細胞が固定された。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、沈殿した細胞のペレットに、２００μＬのＰＢＳを加えて懸濁し、遠心することを２回繰り返して洗浄した。
続いて、沈殿した細胞のペレットに、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを１ｍＬ加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４室温で５分間回転させた。これにより、細胞が固定された。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、沈殿した細胞のペレットに、２００μＬのＰＢＳを加えて懸濁し、遠心することを２回繰り返して洗浄した。
《細胞のウェル表面への結合》
続いて、細胞表面がビオチン化された細胞を、１０，０００個／５０μＬとなるようにＰＢＳ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に懸濁した。続いて、アビジンコートされた９６ウェルプレート（カタログ番号「１５５０７」、ピアス社）に、１０，０００個／ウェルで分注した。続いて、プレートをシェーカーにセットし、４℃で一晩穏やかに振とうした。これにより、細胞が、９６ウェルプレートの表面に固定された。
続いて、細胞表面がビオチン化された細胞を、１０，０００個／５０μＬとなるようにＰＢＳ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に懸濁した。続いて、アビジンコートされた９６ウェルプレート（カタログ番号「１５５０７」、ピアス社）に、１０，０００個／ウェルで分注した。続いて、プレートをシェーカーにセットし、４℃で一晩穏やかに振とうした。これにより、細胞が、９６ウェルプレートの表面に固定された。
図９（ａ）は、ウェルの表面の代表的な位相差顕微鏡写真である。倍率は４倍である。その結果、ウェルの表面に細胞が固定されたことが確認された。
続いて、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で２０分間静置した。続いて、各ウェルからＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除去し、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて洗浄した。
続いて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ（ナカライテスク社）を２００μＬ／ウェル加えて２０分間静置し、ブロッキングした。続いて、各ウェルからＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐを除去し、ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加えて洗浄した。
《ＤＮＡ断片のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域への近接》
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ／ＰＢＳで希釈した抗ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩマウスＩｇＧ抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で６時間反応させた。続いて、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて室温で５分間静置後除去することを３回繰り返して洗浄した。
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ／ＰＢＳで希釈した抗ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩマウスＩｇＧ抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で６時間反応させた。続いて、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて室温で５分間静置後除去することを３回繰り返して洗浄した。
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ，０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳで希釈した核酸標識２次抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩反応させた。２次抗体としては、抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。この結果、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域とが近接した。
ここで、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。
配列番号１に記載の塩基配列において、第６２〜８０番目の塩基配列はＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であり、第４〜２３番目の塩基配列はＴ７プロモーター配列であり、第４１〜４６番目の塩基配列は識別配列であり、第１〜３塩基はリンカーの一部の塩基配列であった。また、識別配列としては、９６ウェルの各ウェルごとに塩基配列が異なるものを、上記表１に記載の塩基配列から選択して使用した。
また、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と相補的なＤＮＡ断片であり、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とアニールすることにより、２本鎖ＤＮＡであるＴＮ５トランスポザーゼの結合配列を形成した。
《トランスポザーゼの結合》
続いて、ＴＮ５トランスポザーゼを０．０８８μｇ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間放置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。
続いて、ＴＮ５トランスポザーゼを０．０８８μｇ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間放置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。
《トランスポザーゼの活性化及びＤＮＡ断片の挿入》
続いて、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のＤＮＡ断片（以下、「ｏｌｉｇｏ３−４」という。）を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ｏｌｉｇｏ３−４は、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。ｏｌｉｇｏ３−４の２本鎖ＤＮＡ領域は、ＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であった。
続いて、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のＤＮＡ断片（以下、「ｏｌｉｇｏ３−４」という。）を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ｏｌｉｇｏ３−４は、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。ｏｌｉｇｏ３−４の２本鎖ＤＮＡ領域は、ＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であった。
続いて、各ウェルを１×ＴＮ５透析バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２），０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％グリセロール）で洗浄した。
続いて、１×ＴＡＰＳ−ＤＭＦバッファー（１０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間静置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片に結合したトランスポザーゼが活性化し、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域の近傍に挿入された。
続いて、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳ １００μＬ／ウェルで３回洗浄した。これにより、トランスポザーゼを失活させて除去した。なお、トランスポザーゼの失活及び除去は、まず、５０ｍＭ ＥＤＴＡを１００μＬ／ウェルずつ添加して５０℃で３０分間静置し、続いて、ＰＢＳ １００μＬ／ウェルで３回洗浄することによっても行うことができる。
続いて、各ウェルを１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応バッファーで洗浄し、下記表３に組成を示すｆｉｌｌ ｉｎ反応溶液を５０μＬ／ウェルずつ加え室温で３０分間反応させた。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域の近傍に確実に挿入させた。
続いて、上清を除去し、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳで３回洗浄した。これにより、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させて除去した。なお、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩの失活及び除去は、まず、５０ｍＭ ＥＤＴＡを１００μＬ／ウェルずつ添加して５０℃で３０分間静置し、続いて、ＰＢＳ １００μＬ／ウェルで３回洗浄することによっても行うことができる。
《細胞の剥離》
続いて、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて室温で１０分間静置した。なお、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）は、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を持つ酵素を主成分とする温和な細胞剥離液である。
続いて、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて室温で１０分間静置した。なお、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）は、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を持つ酵素を主成分とする温和な細胞剥離液である。
続いて、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）／０．０１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）溶液（カタログ番号「１４１３０−４１」、ナカライテスク社）を０．５μＬ／ウェルずつ加えて３７℃で１０分間静置した。続いて、各ウェルから上清を回収した。
図９（ｂ）は、上清を回収した後のウェルの表面の代表的な位相差顕微鏡写真である。倍率は１０倍である。その結果、ウェルの表面から細胞が剥離されたことが確認された。以上の結果から、本実験例の条件により、細胞をウェルの表面に固定化し、更に剥離して回収できることが明らかとなった。
［実験例２］
（ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法）
ＣｈＩＬ法により、ＤＮＡ結合タンパク質である、ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩの、ゲノムＤＮＡ上の結合位置を１細胞レベルで多数の細胞に対して並列に解析した。また、分配する細胞数の検討も行った。細胞としては、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。
（ハイスループットシングルセルＣｈＩＬ法）
ＣｈＩＬ法により、ＤＮＡ結合タンパク質である、ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩの、ゲノムＤＮＡ上の結合位置を１細胞レベルで多数の細胞に対して並列に解析した。また、分配する細胞数の検討も行った。細胞としては、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。
《細胞表面のビオチン化》
まず、細胞１×１０６個をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１５ｍＬチューブに入れた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
まず、細胞１×１０６個をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１５ｍＬチューブに入れた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
続いて、沈殿した細胞のペレットに、ＰＢＳに溶解し氷冷した、１ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（カタログ番号「Ａ３９２５８」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４℃で３０分間回転させた。これにより、細胞表面に、ビオチンが、ジスルフィド結合を有する化学リンカーで結合した。
続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、氷冷したクエンチバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を１ｍＬ加えた。続いて、チューブをローテーターにセットして４℃で３０分間回転させた。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。
《細胞の固定》
続いて、沈殿した細胞のペレットに、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを１ｍＬ加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４室温で５分間回転させた。これにより、細胞が固定された。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、沈殿した細胞のペレットに、２００μＬのＰＢＳを加えて懸濁し、遠心することを２回繰り返して洗浄した。
続いて、沈殿した細胞のペレットに、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを１ｍＬ加えて懸濁した。続いて、チューブをローテーターにセットして４室温で５分間回転させた。これにより、細胞が固定された。続いて、３００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。続いて、沈殿した細胞のペレットに、２００μＬのＰＢＳを加えて懸濁し、遠心することを２回繰り返して洗浄した。
《細胞のウェル表面への結合》
続いて、細胞表面がビオチン化された細胞を、１０，０００個／５０μＬとなるようにＰＢＳ−０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に懸濁した。続いて、アビジンコートされた９６ウェルプレート（カタログ番号「１５５０７」、ピアス社）に、１０，０００個／ウェルで分注した。続いて、プレートをシェーカーにセットし、４℃で一晩穏やかに振とうした。これにより、細胞が、９６ウェルプレートの表面に固定された。
続いて、細胞表面がビオチン化された細胞を、１０，０００個／５０μＬとなるようにＰＢＳ−０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に懸濁した。続いて、アビジンコートされた９６ウェルプレート（カタログ番号「１５５０７」、ピアス社）に、１０，０００個／ウェルで分注した。続いて、プレートをシェーカーにセットし、４℃で一晩穏やかに振とうした。これにより、細胞が、９６ウェルプレートの表面に固定された。
続いて、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で２０分間静置した。続いて、各ウェルからＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除去し、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて洗浄した。
続いて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ（ナカライテスク社）を２００μＬ／ウェル加えて２０分間静置し、ブロッキングした。続いて、各ウェルからＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐを除去し、ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加えて洗浄した。
《ＤＮＡ断片のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域への近接》
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ／ＰＢＳで希釈した抗ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩマウスＩｇＧ抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で６時間反応させた。続いて、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて室温で５分間静置後除去することを３回繰り返して洗浄した。
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ／ＰＢＳで希釈した抗ＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩマウスＩｇＧ抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で６時間反応させた。続いて、ＰＢＳを２００μＬ／ウェルずつ加えて室温で５分間静置後除去することを３回繰り返して洗浄した。
続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ−Ｐ，０．５Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳで希釈した核酸標識２次抗体２μｇ／ｍＬを１００μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩反応させた。２次抗体としては、抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。この結果、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域とが近接した。
ここで、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。
《トランスポザーゼの結合》
続いて、ＴＮ５トランスポザーゼを０．０８８μｇ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間放置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。
続いて、ＴＮ５トランスポザーゼを０．０８８μｇ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間放置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。
《トランスポザーゼの活性化及びＤＮＡ断片の挿入》
続いて、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のＤＮＡ断片（以下、「ｏｌｉｇｏ３−４」という。）を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ｏｌｉｇｏ３−４は、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。ｏｌｉｇｏ３−４の２本鎖ＤＮＡ領域は、ＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であった。
続いて、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のＤＮＡ断片（以下、「ｏｌｉｇｏ３−４」という。）を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。ｏｌｉｇｏ３−４は、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。ｏｌｉｇｏ３−４の２本鎖ＤＮＡ領域は、ＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であった。
続いて、各ウェルを１×ＴＮ５透析バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２），０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０％グリセロール）で洗浄した。
続いて、１×ＴＡＰＳ−ＤＭＦバッファー（１０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃で１時間静置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片に結合したトランスポザーゼが活性化し、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域の近傍に挿入された。
続いて、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳ １００μＬ／ウェルで３回洗浄した。これにより、トランスポザーゼを失活させて除去した。
続いて、各ウェルを１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応バッファーで洗浄し、上記表３に組成を示すｆｉｌｌ ｉｎ反応溶液を５０μＬ／ウェルずつ加え室温で３０分間反応させた。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域の近傍に確実に挿入させた。
続いて、上清を除去し、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳで３回洗浄した。これにより、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させて除去した。
《細胞の剥離及び回収》
続いて、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて室温で１０分間静置した。続いて、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）−０．０１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）溶液（カタログ番号「１４１３０−４１」、ナカライテスク社）を０．５μＬ／ウェルずつ加えて３７℃で１０分間静置した。続いて、各ウェルから細胞を回収して混合した。
続いて、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて室温で１０分間静置した。続いて、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）−０．０１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）溶液（カタログ番号「１４１３０−４１」、ナカライテスク社）を０．５μＬ／ウェルずつ加えて３７℃で１０分間静置した。続いて、各ウェルから細胞を回収して混合した。
続いて、細胞をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色した。続いて、セルソーターを使用して、細胞を２５個／ウェル、５０個／ウェル、７５個／ウェルずつ３８４ウェルプレートにソーティングした。３８４プレートには、予め下記表４に記載の組成の試薬を１００μＬ／ウェルずつ分注しておいた。
続いて、３８４プレートを３７℃で１６時間静置した。これにより、ゲノムＤＮＡに挿入したＤＮＡ断片に含まれていたＴ７ＲＮＡプロモーター配列を起点として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＤＮＡが転写された。
続いて、ＤＮａｓｅＩを０．５μＬ／ウェルずつ加え３７℃で３０分間反応させた。これにより、回収した細胞中に含まれていたＤＮＡが分解された。続いて、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡＣｌｅａｎＸＰキット（ベックマン・コールター社）を用いて転写されたＲＮＡを精製し、１０μＬ／ウェルずつの溶出液に溶出した。
《ライブラリ作成及びシーケンス》
続いて、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（イルミナ社）を用いて次世代シーケンス用のライブラリを作製した。
続いて、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（イルミナ社）を用いて次世代シーケンス用のライブラリを作製した。
まず、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成用プライマーとして、キットに含まれている３’ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ＣＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡの代わりにカスタムプライマー（配列番号５）を使用した。
続いて、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のプライマーとして、キットに含まれているＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡの代わりにＡｄ１プライマー（配列番号６）及びＡｄ２プライマー（配列番号７）を使用した。
Ａｄ１プライマーの塩基配列において、第３０〜３７番目の塩基配列は識別配列であった。また、Ａｄ２プライマーの塩基配列において、第２５〜３２番目の塩基配列は識別配列であった。また、ＰＣＲ反応に用いたＡｄ１プライマーの識別配列及びＡｄ２プライマーの識別配列の組み合わせは、３８４ウェルの各ウェルごとに塩基配列が異なるものを使用した。上記表２の第１〜第１６２番目に、Ａｄ１プライマーに使用した識別配列を示す。また、上記表２の第１６３〜３２４番目に、Ａｄ２プライマーに使用した識別配列を示す。
この結果、得られたＰＣＲ増幅産物には、対象核酸の塩基配列である、ゲノムＤＮＡ上のＣＴＤセリン２リン酸化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域の近傍の塩基配列、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片に含まれる識別配列、Ａｄ１プライマーの識別配列及びＡｄ２プライマーの識別配列が含まれることになる。
そして、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片に含まれる識別配列、Ａｄ１プライマーの識別配列及びＡｄ２プライマーの識別配列の組み合わせは、１細胞レベルで異なるものとなる。
つまり、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片に含まれる識別配列、Ａｄ１プライマーの識別配列及びＡｄ２プライマーの識別配列の組み合わせが同一であるＰＣＲ増幅産物は、同一の１細胞に由来するものである。
続いて、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ベックマン・コールター社）を用いてＰＣＲ増幅産物を精製し、定量した。続いて、次世代シーケンサー（イルミナ社）を用いてＰＣＲ増幅産物の塩基配列を網羅的にシーケンスした。
図１０（ａ）は、細胞を２５個／ウェル、５０個／ウェル、７５個／ウェルずつ３８４ウェルプレートにソーティングして、上記の反応を行った結果、得られたＰＣＲ増幅産物に含まれていた識別配列を示す図である。２５個／ウェルずつソーティングした場合の４回の実験結果、５０個／ウェルずつソーティングした場合の３回の実験結果、７５個／ウェルずつソーティングした場合の２回の実験結果を示す。
図１０（ａ）では、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片に含まれる９６種類の識別配列のいずれが検出されたかを示す。黒色は、識別配列が検出されたことを示し、白色黒色は、識別配列が検出されなかったことを示す。
また、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）の結果をグラフにしたものである。グラフの縦軸は検出された識別配列の数を示す。また、図１０（ｂ）中、「２５」は細胞を２５個／ウェルずつソーティングした結果であることを示し、「５０」は細胞を５０個／ウェルずつソーティングした結果であることを示し、「７５」は細胞を７５個／ウェルずつソーティングした結果であることを示す。
その結果、細胞を２５個／ウェルずつソーティングした場合、約２８個の識別配列が検出されたことが明らかとなった。また、細胞を５０個／ウェルずつソーティングした場合、約３８個の識別配列が検出されたことが明らかとなった。また、細胞を７５個／ウェルずつソーティングした場合、約４４個の識別配列が検出されたことが明らかとなった。
以上の結果から、細胞を１０，０００個／ウェルずつ分注して識別配列で識別し、回収してプールした後、２５個／ウェルずつ再分配して検出すると、再分配する１ウェルあたりの細胞数に対する、検出される識別配列の種類の割合が、期待値に最も近くなることが明らかとなった。
また、本実験例の方法により、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出することができることが明らかとなった。
本発明によれば、複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する技術を提供することができる。
１０…ゲノムＤＮＡ、１０’…ゲノムＤＮＡ１０の相補鎖、１１…結合領域、２０…ヒストン、３０…特異的結合物質、４０…ＤＮＡ断片、４１…トランスポザーゼ結合配列、４１’…トランスポザーゼ結合配列４１の相補鎖、４２…Ｔ７プロモーター配列、４３…識別配列、４３’…識別配列４３の相補鎖、４４…リンカー、４４’…リンカー４４の一部に由来する塩基配列、４５…任意配列、５０…トランスポザーゼ、６０…ＲＮＡ。
Claims (6)
- 複数の細胞のそれぞれに存在する対象核酸の塩基配列を１細胞レベルで並列に検出する方法であって、
前記細胞を第１〜第ｎ（ここで、ｎは２以上の整数である。）のｎ個の区画に分配する工程αと、
前記第１〜第ｎの区画に分配した前記細胞の前記対象核酸に、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｎの核酸断片Ａを連結し、第１〜第ｎの検出用核酸群Ａを得る工程βと、
前記第１〜第ｎの区画から前記細胞を回収してプールする工程γと、
プールした前記細胞を再度第１〜第ｍ（ここで、ｍは２以上の整数である。）のｍ個の区画に分配する工程δと、
前記第１〜第ｍの区画に分配した前記細胞の、前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａに、それぞれ区画ごとに塩基配列が異なる第１〜第ｍの核酸断片Ｂを更に連結し、第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂを得る工程εと、
前記第１〜第ｍの検出用核酸群Ｂの塩基配列を網羅的に決定し、複数のリードを得る工程ζと、
前記リードに含まれる対象核酸の塩基配列を、当該リードに含まれる核酸断片Ａの塩基配列及び核酸断片Ｂの塩基配列に基づいて、１細胞に対応させて検出する工程ηと、
を含む、方法。 - 前記工程αにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画に分配した前記細胞を、前記区画の内部にアビジン−ビオチン結合により結合する、請求項１に記載の方法。
- 前記工程γにおいて、前記第１〜第ｎのｎ個の区画の内部に結合した前記細胞を、タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素の混合物により剥離させて回収する、請求項２に記載の方法。
- 前記工程βにおける前記対象核酸と前記第１〜第ｎの核酸断片Ａとの連結を、トランスポザーゼを用いて行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程εにおける前記第１〜第ｎの検出用核酸群Ａと前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂとの連結を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１〜第ｎの核酸断片Ａ及び前記第１〜第ｍの核酸断片Ｂのそれぞれが、下記表１及び表２に記載のいずれかの塩基配列を含む塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
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2020
- 2020-02-04 JP JP2020017027A patent/JP2021122218A/ja active Pending
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2021
- 2021-02-03 WO PCT/JP2021/003820 patent/WO2021157589A1/ja active Application Filing
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| WO2021157589A1 (ja) | 2021-08-12 |
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