JP2021519611A - Ssea4に結合するモノクローナル抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
SSEA4に対するマウスモノクローナル抗体を、標準的な手順を用いて産生した。簡潔には、アジュバントと一緒に、ウシ血清アルブミンに融合したSSEA4(BSA−SSEA4)を2週間に1回、10週間までマウスに注射した。血液サンプル中の抗SSEA4抗体力価を、標準的な条件下でBSA−SSEA4を結合したELISAプレートを用いて酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によりアッセイした。
培地サンプル中のmuMAb抗体の濃度を、ELISAプレート上にコーティングされた以下の一次抗体を用いてELISAによって決定した。マウスMAbの場合には、1μg/ml、100μl/ウェルのAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch 番号115−005−062)で一晩、ELISAプレートをコーティングした。ハイブリドーマ上清又は一過性トランスフェクション(下記を参照されたい)による培地サンプルの連続希釈物とのインキュベーション後、ウェルを十分に洗浄し、1:8000希釈のペルオキシダーゼAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch 番号115−035−062)を加えることにより結合した抗体を検出した。十分洗浄した後、ABTSペルオキシダーゼ基質(1成分)(KPL 番号50−66−06)を加え、405nmで各ウェルの吸光度を測定した。
以下の試薬セットを用いて抗原結合親和性の決定のため、標準的なELISA手順を実施した。1:1000希釈のBSA−SSEA4でELISAプレートをコーティングした。連続希釈したハイブリドーマ上清のサンプル又は一過性トランスフェクションサンプルを各ウェルに添加し、続いて十分に洗浄した。muMAb1に対して1:2500希釈のAffiniPureヤギ抗マウスIgG、Fcγサブクラス1特異的(Jackson ImmunoResearch 番号115−005−205)、muMAb2に対して1:2500希釈のAffiniPureヤギ抗マウスIgG、Fcγサブクラス3特異的(Jackson ImmunoResearch 番号115−005−209)、全てのヒト化抗体に対して1:2500希釈のAffiniPureヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch 番号109−005−088)の二次抗体を用いて、プレート上の抗原に結合したmuMAb及びhuMAbを検出した。
VH及びVLの抗体配列を、ハイブリドーマから以下のとおりにクローニングした。製造業者の指示のとおりにTRIZOL試薬(Invitrogen、カタログ番号15596−026)を用いておよそ5×106個〜7×106個のハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。全RNA 6μgと、マウスIgG1 VH:TATGCAAGGCTTACAACCACA(配列番号45)、マウスIgG3 VH:GGGGGTACTGGGCTTGGGTAT(配列番号46)、及びマウスカッパVL:CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(配列番号47)の遺伝子特異的プライマーとを用いて、Maxima Universal First Strand cDNA合成キット(Thermo Fisher カタログ番号K1661)を使用して第1鎖cDNAの合成を行った。
全長マウスIgG重鎖及び軽鎖発現プラスミドを以下のとおりに構築した。
muMAb1及びmuMAb2をヒト化するため、マウス配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースと比較することにより、マウス抗体配列に対して最も相同性の程度が高いヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の配列を同定した。結果は、muMAb1とmuMAb2との両方の重鎖に最も近いヒト生殖細胞系列の配列はhuIGHV4−59x01であり、muMAb1とmuMAb2との両方の軽鎖に最も近いヒト生殖細胞系列の配列はhuIGKV3−11x01であることを示した。
標準的な組み換えDNA技術を用いて、全長ヒト化重鎖及び軽鎖発現プラスミドの構築を行った。(i)CH1領域の始めにNheI制限部位を生成するために導入されたサイレント突然変異を有する全長ヒトIgG1重鎖、及び(ii)CL定常領域の始めにBsiWI制限部位を生成するために導入されたサイレント突然変異を有する全長ヒトカッパ軽鎖を含むコンストラクトに、フラグメントを適切にクローニングした。
ヒト293T胚性腎臓上皮細胞株を、10%熱不活性化胎児ウシ血清、2mM L−グルタミン、及びペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO カタログ番号15140)で補足したDMEM(HyClone カタログ番号SH30243.02)で維持した。ポリ(エチレンイミン)(PEI)媒介トランスフェクションを介して、発現コンストラクトを細胞に導入した。簡潔には、1:1の比率で重鎖と軽鎖との発現プラスミドを組み合わせることによりDNAミックスを調製した。その後、1.5:1のPEI対DNA比でPEI/DNA複合体を形成し、20分間インキュベートした後、培養細胞に添加した。トランスフェクションの2日後、培養培地を取り除き、新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクション後5日目に、分析のため上清を採取した。
本明細書に開示されるあらゆる特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的を担う代替的な特徴により置き換えることができる。特段の定めがない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴の1つの例であるにすぎない。
Claims (20)
- 配列番号33又は配列番号40の配列を有する重鎖CDR1(H−CDR1)、配列番号34又は配列番号39の配列を有する重鎖CDR2(H−CDR2)、配列番号35又は配列番号41の配列を有する重鎖CDR3(H−CDR3)、配列番号36又は配列番号42の配列を有する軽鎖CDR1(L−CDR1)、配列番号37又は配列番号43の配列を有する軽鎖CDR2(L−CDR2)、及び配列番号38又は配列番号44の配列を有する軽鎖CDR3(L−CDR3)を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントがステージ特異的胚抗原4に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記H−CDR1が配列番号33の配列を有し、前記H−CDR2が配列番号34の配列を有し、前記H−CDR3が配列番号35の配列を有し、前記L−CDR1が配列番号42の配列を有し、前記L−CDR2が配列番号43の配列を有し、前記L−CDR3が配列番号44の配列を有する、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。
- 配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号22、配列番号24、及び配列番号26からなる群から選択される重鎖配列と、配列番号4、配列番号8、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号28、配列番号30、及び配列番号32からなる群から選択される軽鎖配列とを含む、単離されたモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がステージ特異的胚抗原4に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
- 前記重鎖配列が配列番号14であり、前記軽鎖配列が配列番号28である、請求項3に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 前記重鎖配列が配列番号14であり、前記軽鎖配列が配列番号30である、請求項3に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 前記重鎖配列が配列番号14であり、前記軽鎖配列が配列番号32である、請求項3に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 前記重鎖配列が配列番号2であり、前記軽鎖配列が配列番号4である、請求項3に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 前記重鎖配列が配列番号6であり、前記軽鎖配列が配列番号8である、請求項3に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする、核酸コンストラクト。
- H−CDR1が配列番号33の配列を有し、H−CDR2が配列番号34の配列を有し、H−CDR3が配列番号35の配列を有し、L−CDR1が配列番号42の配列を有し、L−CDR2が配列番号43の配列を有し、L−CDR3が配列番号44の配列を有する、請求項9に記載の核酸コンストラクト。
- 請求項3に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸コンストラクト。
- 重鎖配列が配列番号14であり、軽鎖配列が配列番号28である、請求項11に記載の核酸コンストラクト。
- 請求項9に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原4に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
- H−CDR1が配列番号33の配列を有し、H−CDR2が配列番号34の配列を有し、H−CDR3が配列番号35の配列を有し、L−CDR1が配列番号42の配列を有し、L−CDR2が配列番号43の配列を有し、L−CDR3が配列番号44の配列を有する、請求項13に記載の組み換え細胞。
- 請求項11に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原4に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
- 重鎖配列が配列番号14であり、軽鎖配列が配列番号28である、請求項15に記載の核酸。
- 腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する被験体を識別することと、有効量の請求項1に記載のモノクローナル抗体を前記被験体に投与することとを含み、前記腫瘍内の細胞がステージ特異的胚抗原4(「SSEA4」)を発現する、方法。
- H−CDR1が配列番号33の配列を有し、H−CDR2が配列番号34の配列を有し、H−CDR3が配列番号35の配列を有し、L−CDR1が配列番号42の配列を有し、L−CDR2が配列番号43の配列を有し、L−CDR3が配列番号44の配列を有する、請求項17に記載の方法。
- 腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する被験体を識別することと、有効量の請求項3に記載のモノクローナル抗体を前記被験体に投与することとを含み、前記腫瘍内の細胞がステージ特異的胚抗原4を発現する、方法。
- 重鎖配列が配列番号14であり、軽鎖配列が配列番号28である、請求項19に記載の方法。
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