JP2021518437A - 癌の予防、治療及び/または検出において使用するための新規ペプチドベースの化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
−GFTFSDYW(配列番号1)、IRLKSNNYAA(配列番号2)及びTFGNSFAY(配列番号3)からなる群から選択される少なくとも3つの異なるアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド配列と、
−TGAVTTNNY(配列番号4)、GTN(配列番号5)及びALWYSNHWV(配列番号6)からなる群から選択される、少なくとも3つの異なるアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド配列と、を含み、
または配列番号1〜配列番号6のアミノ酸配列のうちのいずれか1つのバリアントは、1つ以上の位置に異なるアミノ酸を有し、
化合物またはバリアントは、TA−MUC1に結合することができる。
GFTFSDYW(配列番号1)−IRLKSNNYAA(配列番号2)−TFGNSFAY(配列番号3)、
GFTFSDYW(配列番号1)−TFGNSFAY(配列番号3)−IRLKSNNYAA(配列番号2)、
IRLKSNNYAA(配列番号2)−TFGNSFAY(配列番号3)−GFTFSDYW(配列番号1)、
IRLKSNNYAA(配列番号2)−GFTFSDYW(配列番号1)−TFGNSFAY(配列番号3)、
TFGNSFAY(配列番号3)−GFTFSDYW(配列番号1)−IRLKSNNYAA(配列番号2)、
TFGNSFAY(配列番号3)−IRLKSNNYAA(配列番号2)−GFTFSDYW(配列番号1)。
TGAVTTNNY(配列番号4)−GTN(配列番号5)−ALWYSNHWV(配列番号6)、
TGAVTTNNY(配列番号4)−ALWYSNHWV(配列番号6)−GTN(配列番号5)、
GTN(配列番号5)−TGAVTTNNY(配列番号4)−ALWYSNHWV(配列番号6)、
GTN(配列番号5)−ALWYSNHWV(配列番号6)−TGAVTTNNY(配列番号4)、
ALWYSNHWV(配列番号6)−TGAVTTNNY(配列番号4)−GTN(配列番号5)、
ALWYSNHWV(配列番号6)−GTN(配列番号5)−TGAVTTNNY(配列番号4)。
(i)このバリアントの少なくとも1つのグリシン(Gly)が、Ala、Val、Leu、及びlieからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(ii)このバリアントの少なくとも1つのアラニン(Ala)が、Gly、Val、Leuからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(iii)このバリアントの少なくとも1つのバリン(Val)が、Gly、Ala、Leu、及びlieからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(iv)このバリアントの少なくとも1つのロイシン(Leu)が、Gly、Ala、Val、及びlieからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(v)このバリアントの少なくとも1つのイソロイシン(lie)が、Gly、Ala、Val、及びLeuからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(vi)バリアントの少なくとも1つのアスパラギン酸(Asp)が、Glu、Asn、及びGinからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(vii)バリアントの少なくとも1つのアスパラギン(Asn)が、Asp、Glu、及びGinからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(viii)バリアントの少なくとも1つのグルタミン(Gin)が、Asp、Glu、及びAsnからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(ix)バリアントの少なくとも1つのフェニルアラニン(Phe)は、Tyr、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはTyr及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(ix)バリアントの少なくとも1つのチロシン(Tyr)は、Phe、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはPhe及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(xi)このバリアントの少なくとも1つのアルギニン(Arg)は、Lys及びHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(xii)このバリアントの少なくとも1つのリジン(Lys)が、Arg及びHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(xiii)バリアントの少なくとも1つのプロリン(Pro)が、Phe、Tyr、Trp、及びHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、
(xiv)バリアントの少なくとも1つのシステイン(Cys)が、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gin、Ser、Thr、及びTyrからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換されている。
(i)A、G;(ii)Q、N、S、T;(iii)E、D;(iv)Q、N、S、T;(v)H、K、R;(vi)L、P、I、V、M、F、Y、W。
−構造A1−x−A2−y−A3を含む第1のポリペプチド配列であって、
A1は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、
A2は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、
A3は、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含み、x、yは、0以上の連結アミノ酸であり;
−構造A4−x−A5−y−A6を有する第2のポリペプチド配列であって、
A4は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含み、
A5は、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含み、
A6は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、x、yは、0以上の連結アミノ酸であり;
または配列番号1から配列番号6のアミノ酸配列のうちのいずれか1つのバリアントは、1つ以上の位置に異なるアミノ酸を有する。本発明によれば、化合物またはバリアントは、TA−MUC1に結合することができる。
本発明の化合物の有益な治療及び診断効果は、hu−TA−MUC1(=α−hu−TA−MUC1)の結合部位を担持し、以下の組成を有するタンパク質構築物を用いて試験を行った:
試験化合物の第1のポリペプチド配列は、アミノ酸配列EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVADIRLKSNNYA AHYAESVKGRFTVSRDDSKSSVYLQMNNLRTEDTGFYYCTFGNSFAYWGQGTLVTVSA(配列番号7)を含む。
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTNNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRGPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(配列番号8)のアミノ酸配列を含む。
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVADIRLKSNNYAAHYAESVKGRFTVSRDDSKSSVYLQMNNLRTEDTGFYYCTFGNSFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTNNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRGPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(配列番号9)。
図1には、TA−MUC1に対するヒト乳癌生検の組織学的染色を示す。mAbは、上記の構築物(α−hu−TA−MUC1)の下にある。ヒトHR+乳癌組織の142切片及びヒト乳房上皮組織の10切片をα−hu−TA−MUC1により染色した。α−hu−TA−MUC1による健康な組織の治療は、いずれの場合も無色であった。対照的に、すべての乳癌組織切片は、α−hu−TA−MUC1で明確に染色できた。乳癌組織切片の染色の正確な分析により、染色の強度に応じて、2つの集団を区別できることが明らかになった。したがって、TA−MUC1発現の強さ(染色強度)と無転移(MFS)及び無再発患者(RFS)の生存率との間に相関関係が確立された。患者の累積生存率の分析は、TA−MUC1発現のレベルと明らかに相関していた。腫瘍マーカーが多く発現している場合は、有意に悪い生存率となった。免疫組織学的分析により、合成乳癌ワクチンの抗原として使用されたTA−MUC1−糖ペプチドの高い特異性が確認された。In vivoでのこれらのワクチンの治療効果を評価するために、前臨床乳癌マウスモデルを確立した。
データは、α−hu−TA−MUC1が生物学的及び薬学的に有効な化合物であり、正常な上皮細胞では見られないが、腫瘍細胞に見られるように、hu−TA−MUC1に結合することによって腫瘍組織を特異的に検出するのに好適であることを示している。本発明の6つの結合部位を担持する化合物では、組織サンプル内での腫瘍組織の選択的検出が可能になる。データはまた、乳房腫瘍によって示されるように、α−hu−TA−MUC1が上皮腫瘍の治療に好適であることを示している。予防的免疫化により、乳房腫瘍に罹患した患者の生存が延長する。したがって、本発明のタンパク質化合物は、乳癌、膵癌、前立腺癌、B細胞白血病、多発性骨髄腫、結腸癌または卵巣癌などのTA−MUC1を発現する癌の治療、予防及び/または診断に好適である。したがって、TA−MUC1を発現する任意の腫瘍細胞は、配列番号1〜配列番号6に定義される6つの同定された結合部位を担持している本発明の化合物の有効な標的である。本発明者らのデータは、乳癌患者において、高いTA−MUC1レベルが、改善された全生存(MFS、RFS)と負の相関関係にあることを示している。
ヒト乳癌生検の組織学的染色
アジュバント療法においてタモキシフェンによる治療を受けた患者の142のホルモン受容体陽性(HR+)乳癌組織のパネルを、診断ツールとして、α−hu−TA−MUC1を使用してTA−MUC1の発現について調べた。サンプルをα−hu−TA−MUC1(1pg/ml)で染色し、さらに二次抗体としてビオチン化ヤギ抗マウス抗体により染色し、SA−HPOとの発色反応を加えた。TA−MUC1を強く発現するヒト乳癌細胞(MCF−7)は、陽性対照として機能させ、健康な腺組織のパラフィン切片及びHR+乳房癌腫瘍のパラフィン切片を調べた。さらに、TA−MUC1の発現の大きさは、Sinnet PR et al.(Sinnet PR et al.,Comparative Study on The Diagnostic Accuracy of The Ripasa Score Over Alvarado Score In The Diagnosis of Acute Appendicitis Jebmh.2016;3(80):4318−21)のスコアリングシステムに従って、転移に対する累積生存率(MFS)及び無再発(RFS)生存率の相関関係においてスコアリングした。
ヒトMUC1発現前臨床乳癌マウスモデル
Hu−TA−MUC1−糖ペプチド−TToxワクチン
上記のPyMTxhuMUC1−tgマウスを予防的ワクチン接種研究の前臨床乳癌モデルとして確立するために、PyMTxhuMUC1−tgマウスの腫瘍組織を最初に、hu−TA−MUC1−糖タンパク質の発現に関して試験した。この目的のために、蛍光標識されたα−hu−TA−MUC1(AF647N:遠赤色蛍光色素)の結合を蛍光顕微鏡により試験した。腫瘍をex vivoで除去し、液体窒素で凍結し、組織切片を調製した。切片をスライドに移し、DAPI(1/1000)及びAF647N−α−hu−TA−MUC1(5pg/ml)により染色し、3回洗浄し、カバーガラスに載せた。huMUC1−tgマウスの乳腺切片及びPyMT−tgマウスの腫瘍切片を対照として使用した。DMi8顕微鏡及びZeissLSM510METAレーザー走査型顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡LEICATCS SP8を使用して、蛍光画像を得た。
PyMTxhuMUC1−tg及びPyMT−tgマウスからex vivoで単離され
予防的ワクチン接種後の乳房腫瘍の成長を詳細に監視することを目的として、本発明者らは、PyMTxhuMUC1−tgマウスの腫瘍に由来する原発腫瘍細胞株を生成した。この目的のために、腫瘍組織を抽出し、コラゲナーゼA(Roche、2mg/ml)及びRQ1DNAse(Promega,1:2000)で消化させ、IMDM+10%FCS+1%グルタミン+1%ピルビン酸ナトリウムで培養した。PyMTxhuMUC1腫瘍細胞及びPyMT細胞は、6週間後に採取した。huMUC1の発現の試験は、定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)によって行い、α−hu−TA−MUC1の結合の試験は、FACS分析によって両方の細胞株のhu−TA−MUC1−糖タンパク質に対して行った(以下を参照のこと)。
qRT−PCR:
RT−2x106の腫瘍細胞のトータルRNAは、TRIzol試薬(Invitrogen(登録商標)、Life technologies,Carlsbad,CA)を製造業者の指示に従って使用して調製した。RNAの濃度及び品質は、測光(Eppendorf BioPhotometer plus)により測定した。逆転写は、MMLV逆転写酵素(Thermo Scientific,Dreieich,Germany)を製造業者の指示に従って使用し、qRT−PCRデータは、5xHot Start Taq EVA Green(rock非含有)ミックス(Axon,Kaiserslautern,Germany)をMylQ iCycler(Biorad,Munich,Germany)内で用いて、データ分析用に提供されたソフトウェア(Bio−Rad iQ5 Standard Version2.0)を用いて、以下のプライマーにより得た:huMUCI:5’−GTGCCCCCTAGCAGTACCG−3’、rev:5’−GACGTGCCCCTACAAGTTGG−3’、及び参照遺伝子として:EF−1a:5’−TGGATGCTCCAGGCCATAAGGA−3’、rev:5’−TGCTCTCGTGTTTGTCCTCCAG−3。ヒト乳癌細胞株T47D及びヒト乳腺上皮細胞株(HMEC)は、huMUC1発現の陽性対照として機能させた。B16F10マウスメラノーマ細胞株は、huMUC1発現の陰性対照として機能させた。
2x105 PyMTxhuMUC1及びPyMT腫瘍細胞を、それぞれ1pg/ml α−hu−TA−MUC1と共に4℃で20分間インキュベートした。細胞を100mlのPBSで2回洗浄し、次に、二次抗体ヤギ−α−マウス−lgG Alexa Fluor488(PBS中で1:1000希釈)及び固定可能な生存性色素eFluor780(PBS中で1:1000希釈)と共に4℃で20分間インキュベートし、偽陽性死細胞を排除した。再度細胞を100mlPBSで2回洗浄した。次に、細胞を100mlのPBSに取り込み、BD Biosciences FACS LSRIIマシンで分析した。各サンプルについて、104個の細胞を分析した。
PyMTxhuMUC1−tg及びPyMT−tgマウス(後者は対照)を、6週齢から開始して、2週間間隔で3回免疫化した(i.p.10pg/40ml)。各ワクチン接種の5日後、尾静脈から血液を採取し、そこから血清を採取した。誘導された抗体の抗体力価及びアイソタイプ力価は、ELISAによって決定した(1回目及び2回目の免疫化のデータは示されていない)。免疫化されたマウス及び未治療のマウスは、20週間後に屠殺し、すべての腫瘍を単離し、ノギスにより定量化した。腫瘍が楕円形であり、波状の表面であるため、長さx幅を計算した(mm2)。いずれのPyMTxhuMUC1−tg及びPyMT−tgマウスも、4〜5個の乳腺腫瘍を発症した。腫瘍サイズは、各マウスの腫瘍数の平均として示す。未治療のPyMTxhuMUC1−tgマウスと比較した免疫化されたPyMTxhuMUC1−tgマウスの生存は、生後数日に得られた。マウスの生存は、倫理的ガイドラインに従って監視した。
hu−TA−MUC1−糖ペプチド特異的誘導抗体のIgG力価を分析するために、ELISAを適用した。96ウェルプレート(NuncMaxiSor(登録商標)平底)を、37℃でhu−TA−MUC1−糖ペプチド−BSAコンジュゲート(2.5pg/ml)/コーティング緩衝液(0.1M Na2HP04/水、pH9.3)50ml/ウェルでインキュベートした。洗浄ステップ(3回)は、100mlのブロッキング緩衝液(1%BSA、0.2%Tween−20を含むPBS)を使用して処理した。続いて、遊離結合部位を飽和させるために、コーティングされたプレートを、50mlのブロッキング緩衝液と共に37℃で20分間インキュベートした。抗血清をブロッキング緩衝液で希釈し(96ウェルプレートの最初のカラムで1:100、次に1:1の比率で段階希釈)、ELISAプレートにピペットで移し、37℃で45分間インキュベートした。さらに3回の洗浄ステップ後、サンプルをビオチン化ヒツジ−α−マウスIgG抗体(c=0.48pg/ml、ストック溶液250pg/ml)と共に、50ml/ウェルのブロッキング緩衝液中で37℃で45分間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:1000)を含む50mLのブロッキング緩衝液と共に15分間インキュベートした。3回洗浄した後、各ウェルを1mg/mlの2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)、0.01%過酸化水素(1:4000)を含むクエン酸緩衝液(40mMクエン酸、60nM Na2HP04xH20、pH4.5)で処理した。各ウェルの光学密度は、分光光度計を使用して410nmで測定した(Tecan Reader,Genios)。
Claims (15)
- 化合物であって、
−GFTFSDYW(配列番号1)、IRLKSNNYAA(配列番号2)及びTFGNSFAY(配列番号3)からなる群から選択される少なくとも3つの異なるアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド配列と、
−TGAVTTNNY(配列番号4)、GTN(配列番号5)及びALWYSNHWV(配列番号6)からなる群から選択される少なくとも3つの異なるアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド配列と、を含む、化合物、
または1つの位置に異なるアミノ酸を有する配列番号1〜配列番号6の前記アミノ酸配列のうちのいずれか1つのバリアントであって、
腫瘍関連ムチン−1(TA−MUC1)に結合することができる、化合物またはバリアント。 - −構造A1−x−A2−y−A3を含む第1のポリペプチド配列であって、
A1は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、
A2は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、
A3は、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含み、x、yは、0以上の連結アミノ酸である第1のポリペプチド配列と;
−構造A4−x−A5−y−A6を有する第2のポリペプチド配列であって、
A4は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含み、
A5は、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含み、
A6は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、x、yは、0以上の連結アミノ酸である第2のポリペプチド配列と;を含む請求項1に記載の化合物、
または1つの位置に異なるアミノ酸を有する配列番号1〜配列番号6のアミノ酸配列のうちのいずれか1つのバリアントであって、
哺乳動物TA−MUC1、好ましくはヒトTA−MUC−1(hu−TA−MUC1)に結合することができる、化合物またはバリアント。 - 前記第1のポリペプチド配列及び少なくとも1つの前記第2のポリペプチド配列が、リンカーによって共有結合される、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記リンカーが、S及びGからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸、好ましくは1〜25のアミノ酸を含む、請求項3に記載の化合物。
- 前記化合物が、タンパク質、抗体、scFvまたはハイブリッド融合タンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記化合物が、89Zrまたは117Luで標識されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記化合物が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヒスチジン、発光または蛍光色素、ナノ粒子またはアルカリホスファターゼに結合している、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記化合物が、CD3+細胞傷害性T細胞を誘引するためにmAb CD3の誘導体に結合される、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物。
- 前記化合物が、15〜100kDa、好ましくは25〜50kDaの分子量を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第1のポリペプチド配列は、抗体の重鎖(VH)の可変領域の一部であり、前記第2のポリペプチド配列は、抗体または抗体断片の軽鎖(VL)の可変領域の一部である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記第1のポリペプチド配列は、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチド配列は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含む請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物、または1つの位置に異なるアミノ酸を有する配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列のうちのいずれか1つのバリアントであって、哺乳動物のTA−MUC1、好ましくはhu−TA−MUC1に結合することができる、バリアント。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の化合物であって、前記第1及び第2のポリペプチド配列は、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部である化合物、または1つの位置に異なるアミノ酸を有する配列番号9のアミノ酸配列のバリアントであって、哺乳動物のTA−MUC1、好ましくはhu−TA−MUC1に結合することができる、バリアント。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- TA−MUC1発現腫瘍細胞を特徴とする、癌の予防、治療、及び/または検出に使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記癌が、前立腺癌、膵癌、乳癌、B細胞白血病、多発性骨髄腫、結腸癌、及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項14に記載の化合物。
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