JP2021516337A - 細胞組成物中に存在する粒子を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年2月28日付で出願された、「METHODS FOR DETECTING PARTICLES PRESENT IN A CELL COMPOSITION (細胞組成物中に存在する粒子を検出するための方法)」という名称の米国仮特許出願第62/636,840号に対する優先権を主張するものであり、その内容は全ての目的のために参照によりその全体が組み入れられる。
本開示は、細胞組成物中に存在する、ビーズ粒子のような、粒子の存在または非存在を検出、評価または判定する方法に関する。本方法で用いるための製造品およびキットも提供される。
磁性ビーズのような粒子は、抗体のような、親和性試薬を含む、生体分子の固定化のための表面として用いられる。場合によっては、そのような粒子は、細胞の検出、選択、濃縮、単離、および/または刺激におけるような、さまざまな方法で用いることができる。場合によっては、そのようなプロセスの後に、粒子は細胞に結合したままでありうるか、または細胞を含有する組成物中に存在しうる。細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための現行の方法は、細胞に結合もしくは会合したまたは組成物中に存在する粒子の実際の数を決定するために、時間がかかり、労働集約的および/または不正確でありうる。細胞組成物中の粒子を計数または検出するための改善された方法が、必要とされている。そのような要求を満たす方法、組成物、システム、およびキットが本明細書において提供される。
細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法、使用、組成物、キット、および製造品が本明細書において提供される。特定の局面において、(a) インプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたはインプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、該インプット組成物が1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含み、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、段階; ならびに(b) アウトプット組成物またはその一部分を蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の粒子の存在または非存在を判定する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
本明細書において提供されるのは、細胞組成物のサンプル中の粒子の、数または濃度を含めて、存在または非存在を判定または評価するための方法である。いくつかの態様において、本方法は、細胞に会合する非細胞粒子(以後「粒子」、例えばビーズ粒子と呼ばれる)を含むまたは潜在的に含む細胞組成物のサンプルをインキュベートする段階を伴い、1回または複数回のインキュベーションがサンプル中の細胞の溶解を誘導するのに十分な1つまたは複数の条件の下で行われる。いくつかの態様において、サンプルは、関心対象の細胞組成物の少なくとも一部分、または関心対象の細胞組成物に由来するサンプルを含む。いくつかの態様において、1回または複数回のインキュベーションによりアウトプット組成物が得られ、次いでこれを粒子(例えばビーズ粒子)の存在または非存在について測定または評価する。したがって、提供された方法では、アウトプット組成物(例えば、溶解方法後のサンプル)を評価して、サンプリングされた細胞組成物中の粒子の存在または非存在(例えば数または濃度)を判定する。場合によっては、提供される方法は、アウトプット組成物のサンプル中の粒子(例えばビーズ粒子)の効率的かつ信頼性の高い検出を可能にし、それによってサンプル中の粒子(例えばビーズ粒子)の可視化、検出および/または同定の正確性および信頼性を改善する。いくつかの態様において、アウトプット組成物中に存在する粒子の数は、粒子を可視化、検出、同定および/または定量化するための任意のいくつかの方法を用いて判定することができる。
ビーズ粒子のような、粒子を評価するための方法も本明細書において提供される。いくつかの態様において、提供される方法は、1つまたは複数の非細胞粒子(例えばビーズ粒子)を含むまたは潜在的に含むことが知られているサンプル中の、ビーズ粒子のような、粒子の存在または非存在を検出するために用いられる。いくつかの態様において、サンプルは細胞組成物の少なくとも一部を含むか、または細胞組成物に由来する。本方法の局面において、サンプルは、複数の細胞を含むサンプルであり、この複数の細胞は1つまたは複数の粒子(例えばビーズ粒子)と会合し、または会合しうる。いくつかの態様において、提供される方法は、サンプル中の粒子(例えばビーズ粒子)の存在、非存在、数および/または濃度を計数または判定するために用いることができる。
ビーズ粒子のような、粒子の存在、非存在、数、量、または濃度を検出するために本明細書において提供される方法は、1つもしくは複数の粒子(例えばビーズ粒子)を含むことが分かっているまたは潜在的に含むサンプル中の細胞を溶解する1つまたは複数の段階を含む。いくつかの態様において、サンプルは、粒子、例えばビーズ粒子を含むまたは潜在的に含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むか、および/またはインプット組成物に由来する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法で用いられるサンプルは、インプット組成物の少なくとも一部分を含むか、またはインプット組成物に由来し、インプット組成物は1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含む。いくつかの態様において、サンプルのインキュベーションは、サンプル中の細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件下である。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、溶解に供されたならびに/またはサンプルおよび/もしくはインプット組成物中の細胞の溶解を誘導する条件下でインキュベートされた組成物、例えばサンプルおよび/またはインプット組成物である。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、濃縮、分離および/または洗浄にさらに供されて、濃縮されたアウトプット組成物を結果的に生じる組成物を含むことができる。いくつかの局面において、アウトプット組成物、例えば濃縮されたアウトプット組成物は、本明細書において提供される方法を用いて分析される。
いくつかの態様において、サンプルはサンプル中の細胞の溶解を誘導するのに十分な条件でインキュベートされ、条件は、細胞を溶解することができる作用物質、例えば、1つもしくは複数の漂白剤および/または1つもしくは複数の表面活性物質、例えば界面活性剤とのインキュベーションを含む。いくつかの局面において、サンプルは、1つまたは複数の漂白剤を含む溶液とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、サンプルは、1つまたは複数の表面活性物質、例えば界面活性剤を含む溶液とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、サンプルは、漂白剤と表面活性物質、例えば界面活性剤の両方を含む溶液とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、サンプル中の細胞は、漂白剤および/または界面活性剤を用いる公知の細胞溶解方法を用いて溶解される。
場合によっては、1つまたは複数の条件はサンプル中の細胞の浸透圧溶解を誘導する。いくつかの態様において、本方法は、細胞内の浸透圧の変化を生み出す1つまたは複数の条件と1つまたは複数の粒子(例えばミクロスフェアまたはビーズ粒子)を含むまたは含みうる細胞のサンプルを混合、インキュベート、曝露、接触または再懸濁し、サンプル中の相当数の細胞が溶解するように水を細胞内に移動させる浸透圧不均衡を生じさせる段階を伴う。細胞内の浸透圧に変化を生じさせるために、種々の公知の技法を用いることができる。本方法のいくつかの局面において、細胞のサンプルが提供され、細胞を低張溶液と混合、インキュベート、曝露、接触または再懸濁することにより浸透圧溶解が誘導されて、通常は生理的オスモル濃度未満のような、細胞内部のオスモル濃度未満に低減されているオスモル濃度を有する低張細胞懸濁液が得られる。典型的には、細胞が曝露される生理的オスモル濃度はおよそ、290 mOsm/L〜300 mOsm/Lである。通常、細胞培地および他の細胞緩衝液は、血清の生理的オスモル濃度を模倣するためになど、270 mOsm/L〜330 mOsm/Lのオスモル濃度を維持するようにデザインされる。したがって、細胞の低張溶液への曝露によって引き起こされるオスモル濃度の変化、および溶液中で混合、接触または懸濁された細胞内の浸透圧の結果的な変化は、粒子(例えばビーズ粒子)を無傷のままにしながら、組成物中の細胞の実質的に全ての溶解をもたらすことができる。
いくつかの態様において、アウトプット組成物中の粒子(例えばビーズ粒子)の存在、非存在、数、および/または濃度を分析、判定または検出する前に、本方法は、サンプルを粒子(例えばビーズ粒子)について濃縮し、ならびに/または例えばアウトプット組成物の1つもしくは複数の濃縮および/もしくは分離段階、洗浄段階もしくはすすぎ段階を行うことにより、アウトプット組成物中の細胞残屑を除去もしくは低減し、結果的に濃縮されたアウトプット組成物をもたらすための1つまたは複数の段階をさらに含むことができる。いくつかの態様において、洗浄段階またはすすぎ段階は、2回、3回、4回またはそれ以上などの、複数回の洗浄またはすすぎを含む。
いくつかの態様において、本方法は、アウトプット組成物、例えば濃縮されたアウトプット組成物を分析して、アウトプット組成物、例えば濃縮されたアウトプット組成物中の粒子の存在または非存在を判定する段階を伴う。いくつかの態様において、分析段階は蛍光画像を得ることを伴う。いくつかの態様において、分析段階は、アウトプット組成物、例えば濃縮されたアウトプット組成物中に存在する粒子(例えばミクロスフェアまたはビーズ粒子)の存在、非存在、数、および/または濃度を判定するために得られた蛍光画像を分析することを伴う。
いくつかの局面において、提供される方法を用いて細胞組成物中の、非細胞粒子、例えばビーズ粒子の存在または非存在を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法で用いられるサンプルは、細胞組成物の少なくとも一部分を含むか、または細胞組成物に由来する。いくつかの局面において、細胞組成物は、養子細胞療法のために対象に投与するための組み換え受容体を発現するように操作された細胞、例えば、T細胞を含むことができる。いくつかの局面において、操作された細胞は、細胞組成物中の特定の細胞の刺激のためおよび/または濃縮のため、非細胞粒子との細胞のインキュベーションを伴うプロセスを用いて作製することができる。いくつかの局面において、プロセスはまた、インキュベーション後の、そのような非細胞粒子、例えばビーズ粒子の除去を伴う。いくつかの局面において、提供される自動化された方法を用いて、除去段階後にサンプル中に残存するビーズのような、細胞組成物に存在する残留非細胞粒子、例えばビーズを計数することができる。場合によっては、提供される方法を用いて、非細胞粒子、例えばビーズ粒子の除去の効率を判定することができ、ビーズ粒子の不完全な除去から生じうる有害または有毒な影響を低減することができる。
いくつかの態様において、細胞は1つまたは複数の粒子(1つまたは複数の非細胞粒子)とインキュベートまたは接触される。場合によっては、本明細書において記載する粒子(例えばビーズ粒子)は、本明細書において記載する親和性試薬(例えば抗体)のような、親和性試薬などの、生体分子を結合し、それによって細胞の表面上の1つまたは複数の巨大分子、例えば細胞表面タンパク質の発現または発現レベルに基づき細胞集団中の1つまたは複数の細胞型の分離、濃縮、選択、単離、活性化、刺激および/または拡張を容易にすることができる固体支持体またはマトリックスを提供する。いくつかの態様において、細胞は、細胞の表面上の巨大分子に特異的に結合することができる、親和性試薬などの、生体分子に典型的にはコンジュゲートまたは連結している粒子とインキュベートまたは接触させることができる。いくつかの態様において、粒子は固体表面でありまたは固体表面を含む。いくつかの態様において、粒子はビーズ粒子である。いくつかの態様において、粒子は自家蛍光粒子である。いくつかの態様において、自家蛍光粒子は、例えば、蛍光イメージングを用いて検出および分析され、細胞組成物から得られたおよび/または導出されたサンプル中に存在する粒子(例えばミクロスフェアまたはビーズ粒子)の存在、非存在、数、および/または濃度を判定することができる。
いくつかの態様において、細胞組成物中の細胞または本明細書において記載する細胞組成物の調製のために処理された細胞は通常、哺乳動物細胞のような、真核細胞であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、先天性免疫または適応性免疫の細胞、例えば、リンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞を含む骨髄性細胞またはリンパ系細胞のような、免疫系の細胞であるかまたはそれらを含む。いくつかの態様において、免疫系の細胞(例えば免疫細胞)は、T細胞、B細胞、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー(NK)細胞または樹状細胞である。いくつかの態様において、細胞組成物は、CD4+またはCD8+ T細胞のような、免疫系の1つまたは複数の細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球および/もしくは好塩基球であり、または細胞組成物は単球または顆粒球、例えば、骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球および/もしくは好塩基球を含む。他の例示的な細胞には、人工多能性幹細胞(iPSC)を含む、多分化能および多能性幹細胞のような、幹細胞が含まれる。細胞は、典型的には、対象から直接単離されたものおよび/または対象から単離され凍結されたものなどの、初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。
いくつかの態様において、細胞組成物は、投与のための細胞の治療的有効量を含む薬学的組成物または処方物である。いくつかの態様において、薬学的組成物または処方物は、所与の用量での投与のための細胞の数またはその一部を含む単位用量形態の組成物であってよい。薬学的組成物および処方物は通常、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は少なくとも1つのさらなる治療剤を含む。
ポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されることはない。
提供される方法のいずれかを実施するための試薬または成分を含む製造品またはキットも提供される。製造品は、提供される方法を実施するための使用説明書を通常は含む、1つまたは複数の容器、典型的には複数の容器、包装材料、ならびに容器および/または包装上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書を含む。
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語、表記ならびに他の技術的および科学的用語または専門用語は、主張される主題が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するように意図される。場合によっては、明確にするためおよび/または容易に参照するため、一般に理解されている意味を有する用語を、以下を含め、本明細書において定義しているが、本明細書におけるそのような定義の包含は当技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
提供される態様には、以下のものがある:
1. 細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、:
(a) インプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたはインプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、該インプット組成物が1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含み、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、段階; ならびに
(b) アウトプット組成物またはその一部分を蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の粒子の存在または非存在を判定する段階
を含む、方法。
2. 細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、アウトプット組成物またはその一部分を蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の粒子の存在または非存在を判定する段階を含み、
アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下で、細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートすることにより産生される、方法。
3. 分析の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮される、態様1または態様2記載の方法。
4. 蛍光イメージングによるアウトプット組成物の分析が、アウトプット組成物またはその一部分の蛍光顕微鏡写真を取得する段階、および任意で、蛍光顕微鏡写真から画像オブジェクトの蛍光強度を判定する段階を含む、態様1〜3のいずれか記載の方法。
5. アウトプット組成物またはその一部分の明視野顕微鏡写真を取得する段階をさらに含む、態様1〜4のいずれか記載の方法。
6. アウトプット組成物の分析が、蛍光顕微鏡写真または明視野顕微鏡写真から画像オブジェクトのサイズ、面積、および/または真円度を判定する段階をさらに含む、態様4または態様5記載の方法。
7. アウトプット組成物が、粒子を検出するための作用物質を含まず、任意で、作用物質が検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含む、または検出可能なシグナルを生成することができる; あるいは
分析が、粒子を検出するための作用物質であって、任意で検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含むか、または検出可能なシグナルを生成することができる、該作用物質をアウトプット組成物に添加する段階を含まない
態様1〜6のいずれか記載の方法。
8. 以下の段階
(i) アウトプット組成物またはその一部分を1つまたは複数の光源で照射して、照射されたサンプルを作製する段階であって、少なくとも1つの光源が蛍光分子を励起することができる、段階;
(ii) 照射されたサンプルの1つまたは複数の画像をキャプチャする段階であって、少なくとも1つの画像が蛍光画像である、段階;
(iii) サイズ、面積、蛍光強度(FI)、明視野強度、および/または真円度から選択される1つまたは複数のパラメータについて1つまたは複数の画像から画像オブジェクトの存在または非存在を分析する段階
を含み、
アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下で、1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートすることにより産生される、
細胞組成物中の粒子の存在または(of)非存在を検出するための方法。
9. 照射の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮される、態様8記載の方法。
10. 細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
(a) 1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、段階;
(b) アウトプット組成物またはその一部分を光学的に分析して、1つまたは複数の画像オブジェクトの1つまたは複数のパラメータの存在または非存在を評価する段階であって、1つまたは複数のパラメータが、サイズ、面積、蛍光強度(FI)、明視野強度、および/または粒子の真円度から選択される、段階
を含む、方法。
11. 細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
アウトプット組成物またはその一部分を光学的に分析して、1つまたは複数の画像オブジェクトの1つまたは複数のパラメータの存在または非存在を評価する段階であって、該1つまたは複数のパラメータが、サイズ、面積、蛍光強度(FI)、明視野強度、および/または粒子の真円度から選択される、段階
を含み、
アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下で、細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートすることにより産生される、方法。
12. 分析の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮される、態様10または態様11記載の方法。
13. アウトプット組成物が、粒子を検出するための作用物質を含まず、任意で、作用物質が検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含む、または検出可能なシグナルを生成することができる; あるいは
分析が、粒子を検出するための作用物質であって、任意で検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含むか、または検出可能なシグナルを生成することができる、該作用物質をアウトプット組成物に添加する段階を含まない
態様8〜12のいずれか記載の方法。
14. 以下の場合、画像オブジェクトが非細胞粒子である、態様4、6および8〜13のいずれか記載の方法:
(i) 画像オブジェクトが0.5、0.6、0.7、0.8もしくは0.9または少なくとも0.5、0.6、0.7、0.8もしくは0.9の真円度を含む;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて5 μmと10 μmの間の直径を含む; および/または
(iii) 画像オブジェクトが25 μm2と50 μm2の間の面積を含む;
(iv) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを上回る、蛍光シグナルを含む; および/または
(v) 画像オブジェクトが蛍光強度(florescent intensity; FI)を含み、任意でFIが対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルよりも大きい。
15. 対照サンプルが、1つまたは複数の細胞を含むが1つまたは複数の非細胞粒子を含まない、または含まない可能性が高い細胞組成物をインキュベートすることによって産生される組成物であり、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、態様14記載の方法。
16. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが自家蛍光性である、態様1〜15のいずれか記載の方法。
17. 分析がコンピュータにより実現される画像分析を用いて実行される、態様1〜16のいずれか記載の方法。
18. 方法の1つまたは複数の段階が、高速大量処理であり、かつ/または自動化されている、態様1〜17のいずれか記載の方法。
19. 方法の1つまたは複数の段階が、機械、ロボット、および/またはコンピュータにより実現されるアルゴリズムによって実行される、態様1〜18のいずれか記載の方法。
20. インプット組成物が、インプット組成物中の1つもしくは複数の細胞の表面に結合した1つもしくは複数の非細胞粒子を含むかまたは含むことが疑われ;
インプット組成物が、残留粒子を含むかまたは含むことが疑われ;
インプット組成物が、1つもしくは複数の非細胞粒子に結合した1つもしくは複数の細胞を含有する組成物に由来し; および/あるいは
インプット組成物が、1つもしくは複数の非細胞粒子に結合した1つもしくは複数の細胞を含有する組成物に由来し、1つもしくは複数の非細胞粒子を除去することによってさらに処理される、
態様1〜19のいずれか記載の方法。
21. インプット組成物が
(1) 1つまたは複数の細胞を1つまたは複数の非細胞粒子と混合する段階; および
(2) 細胞から1つまたは複数の非細胞粒子を除去する段階
を含む方法によって産生される、態様1〜20のいずれか記載の方法。
22. インプット組成物が細胞組成物からの1つまたは複数の非細胞粒子の除去後に存在する残留非細胞粒子を含むか、もしくは含む可能性が高いか、またはそれを含みうる、態様1〜21のいずれか記載の方法。
23. 1つまたは複数の粒子が、細胞の表面上の巨大分子に結合することができる1つまたは複数の生体分子を含む、態様1〜22のいずれか記載の方法。
24. 細胞の溶解を誘導する条件の下でインキュベートすることは、界面活性剤および/または漂白剤とともにサンプルをインキュベートすることを含む、態様1〜23のいずれか記載の方法。
25. 界面活性剤がTriton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、ジギトニン、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)およびCHAPSOの1つまたは複数である、態様24記載の方法。
26. 漂白剤が塩素系の漂白剤である、態様24または態様25記載の方法。
27. サンプルが濃度約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、もしくは8% (v/v)の漂白剤、または前記の値のいずれか2つによって定義される範囲での漂白剤とともにインキュベートされる、態様24〜26のいずれか記載の方法。
28. インキュベーションが、少なくとももしくは少なくとも約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、20分、もしくは30分間行われ; あるいは
インキュベーションが、30秒〜30分、1分〜20分、1分〜10分、もしくは1分〜5分、または約30秒〜30分、約1分〜20分、約1分〜10分、もしくは約1分〜5分行われる、
態様1〜27のいずれか記載の方法。
29. 粒子がアウトプット組成物を磁場に曝露することによって濃縮される、態様3〜7、9および12〜28のいずれか記載の方法。
30. 濃縮がアウトプット組成物から細胞残屑を低減または除去する、態様3〜7、9および12〜29のいずれか記載の方法。
31. 分析またはキャプチャする前に、アウトプット組成物をすすぐまたは洗浄する段階をさらに含む、態様1〜30のいずれか記載の方法。
32. アウトプット組成物をすすぐまたは洗浄する段階が、1つまたは複数の非細胞粒子をペレット化することおよびアウトプット組成物のある量を除去することまたはある量を低減することを含む、態様31記載の方法。
33. サンプル中の細胞の濃度が、少なくとももしくは少なくとも約2×105細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×105細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×106細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×106細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×107細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×107細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×108細胞/mLまたは少なくとももしくは少なくとも約5×107細胞/mLである、態様1〜32のいずれか記載の方法。
34. アウトプット組成物の量が、10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mL、または約10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mLであるか、あるいは少なくとももしくは少なくとも約10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mL、または前記の値のいずれか2つによって定義される範囲である、態様1〜33のいずれか記載の方法。
35. 1つまたは複数の非細胞粒子がビーズを含む、態様1〜34のいずれか記載の方法。
36. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、0.001 μm超、0.01 μm超、0.1 μm超、1.0 μm超、10 μm超、50 μm超、100 μm超または1000 μm超の直径を有する、態様1〜35のいずれか記載の方法。
37. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、1.0 μm〜500 μm、1.0 μm〜150 μm、1.0 μm〜30 μm、1.0 μm〜10 μmまたは1.0 μm〜5.0 μmの直径を有する、態様1〜36のいずれか記載の方法。
38. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、
細胞組成物中の細胞の平均直径と実質的に同じであるか、または細胞組成物中の細胞の平均直径よりも5倍、4倍、3倍、2倍もしくは1.5倍大きいもしくは小さい範囲内である直径
を有する、態様1〜37のいずれか記載の方法。
39. 1つまたは複数の粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、リンパ球または抗原提示細胞と同じまたはほぼ同じサイズである直径を有する、態様1〜38のいずれか記載の方法。
40. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、3.5 μm超もしくは約3.5 μm超、ただし約9 μm以下または約8 μm以下または約7 μm以下または約6 μm以下または約5 μm以下の直径を有する、態様1〜39のいずれか記載の方法。
41. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、4.5 μmまたは約4.5 μmの直径を含む、態様1〜40のいずれか記載の方法。
42. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、コア、任意で磁性コア、常磁性コアまたは超常磁性コアを含む、態様1〜41のいずれか記載の方法。
43. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、超常磁性コアを含む、態様1〜42のいずれか記載の方法。
44. コアが、金属酸化物、フェライト、金属、ヘマタイト、金属合金、およびそれらの組み合わせから選択される、態様42または態様43記載の方法。
45. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが不活性である、態様1〜44のいずれか記載の方法。
46. 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、ポリスチレン表面であるか、またはそれを含み、磁性または超常磁性コアを任意で含んでもよい、態様1〜45のいずれか記載の方法。
47. 1つもしくは複数の生体分子が抗体を含み、および/または1つもしくは複数の非細胞粒子、任意で1つもしくは複数のビーズの表面上に存在する、態様23〜46のいずれか記載の方法。
48. 1つまたは複数の生体分子が、サンプル中の1つもしくは複数の細胞を選択、単離、もしくは濃縮することができる親和性剤であるか、またはサンプル中の1つもしくは複数の細胞を刺激することができる1つまたは複数の刺激剤である、態様23〜47のいずれか記載の方法。
49. 巨大分子が細胞表面タンパク質である、態様23〜48のいずれか記載の方法。
50. 1つまたは複数の刺激剤が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる、態様48または態様49記載の方法。
51. 1つまたは複数の刺激剤が、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する一次剤およびT細胞共刺激分子に特異的に結合する二次剤を含む、態様48〜50のいずれか記載の方法。
52. 一次剤がCD3に特異的に結合し、ならびに/または共刺激分子が、CD28、CD137 (4-1-BB)、OX40、およびICOSからなる群より選択される、態様51記載の方法。
53. 一次剤が抗CD3であるかまたはそれを含み、二次剤が抗CD28であるかまたはそれを含む、態様51または態様52記載の方法。
54. 1つまたは複数の細胞が、10 μmと30 μmまたは約10 μmと30 μmの間の直径を有する、態様1〜53のいずれか記載の方法。
55. 1つもしくは複数の細胞が動物細胞であるか、または細胞組成物が動物細胞を含む、態様1〜54のいずれか記載の方法。
56. 1つもしくは複数の細胞がヒト細胞であるか、または細胞組成物がヒト細胞を含む、態様1〜55のいずれか記載の方法。
57. 1つもしくは複数の細胞が幹細胞であるか、または細胞組成物が幹細胞を含む、態様1〜56のいずれか記載の方法。
58. 幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)である、態様57記載の方法。
59. 1つもしくは複数の細胞が免疫細胞であるか、または細胞組成物が免疫細胞を含む、態様1〜58のいずれか記載の方法。
60. 免疫細胞がT細胞、B細胞、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー(NK)細胞または樹状細胞である、態様59記載の方法。
61. 1つまたは複数の細胞が1つまたは複数の非細胞粒子と混合されており、非細胞粒子がインキュベーションの前に細胞組成物中の細胞の刺激および/または活性化を行うために1つまたは複数の刺激剤を含む、態様1〜60のいずれか記載の方法。
62. 細胞がT細胞であり、1つまたは複数の刺激剤が抗CD3抗体および/もしくは抗CD28抗体またはその抗原結合断片である、態様61記載の方法。
63. 1つまたは複数の細胞が1つまたは複数の非細胞粒子と混合されており、非細胞粒子が、インキュベーションの前に細胞組成物からの細胞の選択、単離、または濃縮を行うために1つまたは複数の親和性試薬を含む、態様1〜60のいずれか記載の方法。
64. 親和性試薬が、1つまたは複数の細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、態様48または態様63記載の方法。
65. 細胞表面タンパク質が、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54 (ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BB (CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R; IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CD11a (LFA-1)、CD62L (L-セレクチン)、CD29/CD49d (VLA-4)、Notchリガンド、Delta様1/4、Jagged 1/2、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7およびCXCR3から選択される、態様64記載の方法。
66. インキュベーションが、約15℃〜30℃、18℃〜28℃または20℃〜25℃である温度で行われる、態様1〜65のいずれか記載の方法。
67. インキュベーションが、約23℃である温度で行われる、態様1〜66のいずれか記載の方法。
77. 細胞溶解を行うための漂白剤および/または界面活性剤を含む溶液を含む容器;
包装材料; ならびに
細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための使用説明書であって、
(a) インプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたはインプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、該インプット組成物が1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含み、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下で溶液を用いたものである、段階;
(b) アウトプット組成物またはその一部分を蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の粒子の存在または非存在を判定する段階
を指定する該使用説明書を含むラベルまたは添付文書
を含む、製造品。
78. 使用説明書が、アウトプット組成物またはその一部分の蛍光顕微鏡写真を取得すること、および任意で蛍光顕微鏡写真から画像オブジェクトの蛍光強度を判定することを含む蛍光イメージングによるアウトプット組成物の分析を指定する、態様77記載の製造品。
79. 使用説明書が、アウトプット組成物またはその一部分の明視野顕微鏡写真をさらに取得することを指定する、態様77または態様78記載の製造品。
80. 使用説明書は、アウトプット組成物の分析が、蛍光顕微鏡写真または明視野顕微鏡写真から画像オブジェクトのサイズ、面積、および/または真円度を判定することをさらに含むことを指定する、態様78または態様79記載の製造品。
81. 細胞溶解を行うための漂白剤および/または界面活性剤を含む溶液を含む容器;
包装材料; ならびに
細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための使用説明書であって、
(i) アウトプット組成物またはその一部分を1つまたは複数の光源で照射して、照射されたサンプルを作製する段階であって、少なくとも1つの光源が蛍光分子を励起することができる、段階;
(ii) 照射されたサンプルの1つまたは複数の画像をキャプチャする段階であって、少なくとも1つの画像が蛍光画像である、段階;
(iii) サイズ、面積、蛍光強度(FI)、明視野強度、および/または真円度から選択される1つまたは複数のパラメータについて1つまたは複数の画像から画像オブジェクトの存在または非存在を分析する段階
を指定し、
アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下で、1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートすることにより産生され、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下で溶液を用いたものである、該使用説明書を含むラベルまたは添付文書
を含む、製造品。
82. 細胞溶解を行うための漂白剤および/または界面活性剤を含む溶液を含む容器;
包装材料; ならびに
細胞組成物中の粒子の存在または非存在を検出するための使用説明書であって、
(a) 1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含むインプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたは該インプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下で溶液を用いたものである、段階; ならびに
(b) アウトプット組成物またはその一部分を光学的に分析して、1つまたは複数の画像オブジェクトの1つまたは複数のパラメータの存在または非存在を評価する段階であって、1つまたは複数のパラメータが、サイズ、面積、蛍光強度(FI)、明視野強度、および/または粒子の真円度から選択される、段階
を指定する該使用説明書
を含む、ラベルまたは添付文書
を含む、製造品。
83. アウトプット組成物が、粒子を検出するための作用物質を含まず、任意で作用物質が、検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含むか、または検出可能なシグナルを生成することができる; あるいは
使用説明書は、分析が、粒子を検出するための作用物質をアウトプット組成物に添加することを含まないことを指定し、任意で作用物質が、検出可能な部分であるか、もしくは検出可能な部分を含むか、または検出可能なシグナルを生成することができる、
態様77〜82のいずれか記載の製造品。
84. 使用説明書は、分析の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮されることをさらに指定する、態様77〜80のいずれか記載の製造品。
85. 使用説明書は、照射の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮されることをさらに指定する、態様81記載の製造品。
86. 使用説明書は、分析の前に、アウトプット組成物が1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮されることをさらに指定する、態様82記載の製造品。
87. 1つもしくは複数の非細胞粒子が自家蛍光性であり; および/または
使用説明書が、自家蛍光性である非細胞粒子を含みうるサンプルまたは組成物に対して実行される段階をさらに指定する、
態様77〜86のいずれか記載の製造品。
88. 使用説明書は、
(i) 画像オブジェクトが0.5、0.6、0.7、0.8もしくは0.9または少なくとも0.5、0.6、0.7、0.8もしくは0.9の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて5 μmと10 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが25 μm2と50 μm2の間の面積を含む場合;
(iv) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含む場合; および/または
(v) 画像オブジェクトが蛍光強度(florescent intensity; FI)を含み、任意でFIが対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルよりも大きい場合、
非細胞粒子が検出されることを指定する、態様78および80-のいずれか記載の製造品。
89. 対照サンプルは、1つまたは複数の細胞を含むが、1つまたは複数の非細胞粒子を含まない、または含む可能性が低い細胞組成物をインキュベートすることによって産生される組成物であり、インキュベーションは細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、態様88記載の製造品。
90. 界面活性剤がTriton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、ジギトニン、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)およびCHAPSOの1つまたは複数である、態様77〜89のいずれか記載の製造品。
91. 漂白剤が塩素系の漂白剤である、態様77〜90のいずれか記載の製造品。
92. サンプルが濃度約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%もしくは8% (v/v)の漂白剤、または前記の値のいずれか2つによって定義される範囲での漂白剤とともにインキュベートされる、態様77〜91のいずれか記載の製造品。
93. 1つまたは複数の粒子が1つまたは複数のビーズである、態様77〜92のいずれか記載の製造品。
以下の実施例は例示の目的のためだけに含まれており、本発明の範囲を限定することを意図しない。
例示的な自動化(自動蛍光)法を用いて、ビーズ粒子の存在下でインキュベートされた細胞組成物中に存在する非細胞粒子、特にビーズ粒子の数を定量化した。いくつかの局面において、例えば養子細胞療法のために対象に投与するための組み換え受容体を発現するように操作されたT細胞を含む、細胞組成物は、細胞組成物中の特定の細胞の刺激および/または濃縮のために抗体またはその抗原結合断片が付着されているビーズ粒子との細胞のインキュベーションを伴うプロセスを用いて作製することができる。いくつかの局面において、プロセスは、そのようなインキュベーション後のビーズ粒子の除去も伴う。いくつかの局面において、例示的な自動化法を用いて、除去段階後にサンプル中に残存するビーズのような、細胞組成物中に存在する残留ビーズを計数することができる。検出は、例えば細胞刺激または活性化に用いられる抗CD3/抗CD28にコンジュゲートされた直径4.5 μMの超常磁性ポリスチレンビーズ粒子に存在するような、固有の自家蛍光特性を、細胞を操作するためのプロセスにおいて特定のタイプのビーズが示す場合のような、蛍光法によって容易にされる。場合によっては、例示的な方法を用いて、例えばビーズ粒子の不完全な除去の結果として、そのようなレベルにより生じうる有害または有毒な作用を低減するために閾値レベルを超える残留ビーズを含みうる操作された細胞組成物の同定を容易にするためにビーズ粒子の除去の効率を判定することができる。
例示的な方法では、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作された初代T細胞を含む、ヒトドナーからの凍結保存された操作済のCD4+またはCD8+ T細胞組成物を用いた。操作された細胞組成物は、CARをコードする核酸の導入前に抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされた常磁性ポリスチレンコーティングビーズ粒子の存在下で刺激され、その後に磁場への曝露によりビーズ粒子を除去する段階が続けて行われたドナーから単離された初代CD4+またはCD8+ T細胞より作製された。操作段階の後、操作された細胞を含む得られた細胞組成物を凍結保存し、融解し、プールし、それに規定数のビーズ粒子を混合(スパイク)して、方法の特異性、直線性、正確さ、精度および範囲を評価した。
上記のようにスパイクされたビーズ粒子を含む融解された操作細胞組成物を、ボルテックスすることによって混合し、溶解および自動化(自動蛍光)ビーズ計数に供した。スパイクされたビーズを含む細胞組成物400 μLを1200×gで2分間遠心分離して、細胞およびビーズ粒子を回収した。上清を除去した後に、遠心分離されたサンプルを溶解緩衝液(0.1% Tween-20を有する1×リン酸緩衝生理食塩水(PBST) 800 μL; 8.25%漂白剤200 μL)に再懸濁し、室温でおよそ2分間インキュベートした。溶解されたサンプルを、常磁性ポリスチレンビーズ用にデザインされた磁石上に2分間置いて、常磁性ビーズ粒子を細胞残屑から分離した。上清を除去し、サンプルからの残留ビーズをPBST 1 mLで2回洗浄した。洗浄されたビーズをPBST (サンプルビーズ) 75 μLに再懸濁し、384ウェルプレート中のウェルに入れた。PBSTをさらに75 μLを用いて、試験管(洗浄ビーズ)の側面をすすぎ、384ウェルプレートの別のウェルに入れた。
ビーズ粒子の添加のない(0個のビーズ/mLスパイクビーズ) CD4+操作細胞組成物の3つの独立したバイアルにおけるビーズカウントを分析することによって方法の特異性を評価した。ビーズ粒子の添加のない操作された細胞組成物は、残留ビーズを含まないと予想された。表1bに示されるように、全3つのバイアルにおけるビーズ濃度は、方法の定量限界(LOQ)未満であった。システムのアーチファクトまたは操作された細胞組成物からの有意な干渉は観察されなかった。
方法の直線性は、分析されているサンプルにおいて観察されたビーズ濃度と予想されたビーズ濃度との間の相関を判定することによって評価された。いくつかの局面において、直線性は、サンプル中の分析物の濃度(量)に正比例する試験結果を得るための(所与の範囲内の)能力をいうことができる。三つ組で個別に調製された、600、400、300、200、100および50個のビーズ/mLのスパイクビーズを含む操作された細胞組成物中のビーズ濃度を、本実施例において記載するように評価した。
中間精度を含む、方法の再現性および精度が評価された。いくつかの局面において、精度は一連の測定結果間の一致の近さをいうことができる。方法の精度は、一連の測定結果の標準偏差および/または相対標準偏差(%変動係数)を判定することにより評価された。アッセイ法の精度に対する適格性研究因子(qualification study factor)の寄与は、予測実験結果に対して分散成分分析を行うことによって判定された。JMP(登録商標) Pro (SAS Institute, Inc.)を用いて分散成分分析を実行し、制限付き最尤推定法(REML)で混合モデル分析を行った。
式中、
はそれぞれ、合計、操作者、日および残差(バイアル)分散を表した。表3には分散成分分析に基づく方法の精度(再現性および中間精度)が記載されている。いくつかの局面において、全てのビーズカウント測定結果の分散は、全ての要因(操作者、日およびバイアル)を含み、中間精度である。再現性はバイアル間でのビーズカウントのバラツキである。
いくつかの局面において、真値/許容基準値と方法によって判定された値との間の一致の近さとして定義できる方法の精度を評価した。記載された例示的な(自家蛍光)法では、データ分析の一環として、ソフトウェアは、ビーズを他の残屑またはアーチファクトから区別するために設定されたパラメータに基づいて自動ビーズカウント値を提供した。例示的な方法の正確さを、定量化プロセス中に収集された未加工の画像から、ヒト操作者による目視検査および手動列挙によって評価した。ヒト操作者による手動計数から得られた値を、ソフトウェアによって判定された自動ビーズカウントと比較した。各標的ビーズ濃度での自動ビーズカウントの正確さは、次のように計算された回収率として報告された: %回収 = 100%×(自動ビーズカウント/手動ビーズカウント)。
上記のように、試験されたサンプルには、50〜600個のスパイクビーズ/mLの範囲が含まれていた。方法の精度および正確さを評価することによってこの方法の性能を評定した。精度(表2および3ならびに図3を参照のこと)と正確さ(表4)の許容値が観察され、50〜600個のスパイクビーズ/mLの、評定された濃度範囲内で許容される方法性能が実証された。したがって、この結果により、本方法を用いて、例えばCAR+ T細胞組成物について、許容される正確さおよび精度で残留ビーズを計数し、残留ビーズカウントの製造プロセス要件を満たしうることが示された。
CD8+ CAR+細胞組成物を用いて方法を実施し、組成物(CD4+ CAR+細胞組成物およびCD8+ CAR+細胞組成物)に存在する細胞のサブタイプによって結果が影響されるかどうかを確認した。CD8+ CAR+細胞組成物の3つのサンプルに、400個のビーズ/mLの濃度でビーズ粒子をスパイクし、上記の例示的な方法を用いてこれを個別に分析した。結果を表5に記載する。観察された平均ビーズ濃度(ビーズ/mL)は407、標準偏差(SD)は51、%相対標準偏差(RSD)は13であった。回収値は87〜110%に及び、RSD値は13%で、低いバラツキが観察された。結果から、方法の性能が組成物中の細胞のタイプによって影響されなかったことが示された。
より高い細胞密度を含む細胞組成物を用いて方法を実施し、組成物に存在する細胞の密度によって結果が影響されるかどうかを確認した。より高い細胞密度(7×107個の細胞/mL; 5×107個の細胞/mLを含む上記の組成物と比較して)の、CD8+ CAR+細胞組成物の3つのサンプルに、400個のビーズ/mLの濃度でビーズ粒子をスパイクし、上記の例示的な方法を用いてこれを個別に分析した。結果を表6に記載する。観察された平均ビーズ濃度(ビーズ/mL)は370、標準偏差(SD)は45、%相対標準偏差(RSD)は12であった。回収値は83〜105%に及び、RSD値は12%で、低いバラツキが観察された。結果から、方法の性能が、例えば7×107個の細胞/mLまでの、組成物中のより高い細胞濃度によって影響されなかったことが示された。
上記の例示的な(自動蛍光)法を、類似のサンプル調製段階を伴うが自動検出および計数を利用せず、しかし代わりに手動でのビーズの同定およびカウンティングを伴う異なる(手動)法からのビーズ計数結果と比較した。各々が6濃度のスパイクビーズ粒子(600、400、300、200、100および50個のビーズ/mL)の1つを含む、CAR+細胞組成物の個別の三つ組を、上記の例示的な(自動蛍光)方法(「方法1」)を用いて評価し、各サンプルのさらに1バイアルを、異なる(手動)方法(「方法2」)を用いて評価した。回帰分析を実施して、方法1 (「方法1カウント」)および方法2 (「方法2カウント」)を用いてビーズカウント間の同等/差異を推定した。
上記の方法の評価の前に、細胞を含まない陽性対照の単回使用アリコットひとそろいを調製した。上記の実施例1.Aで記載したさまざまな濃度のビーズを含むビーズ粒子溶液をボルテックスし、各溶液30 μLをチューブに入れ、PBSTまたはCS-10 Freeze Media (BioLife) 400 μLを各チューブに加えることによって陽性対照のアリコットを調製した。陽性対照サンプルを、本実施例で試験されたサンプルのバッチごとに調製および分析した。陽性対照サンプルの回収率(%)を用いて、本方法の局面を評定した。さらに、複数日にわたり計15個の陽性対照バイアルに対して1回の実行あたり3個の陽性対照で、2名の異なる操作者により陽性対照サンプルが個別に調製および分析された。陽性対照バイアルおよび上記の研究からのデータを用いて、陽性対照の許容差を設定した。
本実施例に記載される例示的な自動化された残留ビーズ計数法は、操作された細胞組成物中の残留ビーズの数を判定するための特異的な、線形の、精密、正確かつ適当な方法であることが実証された。
凍結保存された操作CD4+またはCD8+ T細胞組成物を、濃縮CD4+および濃縮CD8+細胞集団を別々に処理段階に供することを伴うプロセスにより、ヒトドナーから単離された初代CD4+またはCD8+ T細胞から作製した。CD4+およびCD8+細胞を、白血球除去によって得られたヒト末梢血単核細胞(PBMC)から別々に選択し、別々の濃縮CD4+および濃縮CD8+細胞組成物を作製し、これを次いで冷凍凍結した。その後、CD4+およびCD8+組成物を融解し、刺激、形質導入および拡張の段階を別々に行った。具体的には、融解したCD4+およびCD8+細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体ならびに組み換えヒトサイトカイン(例えばIL-2、IL-7および/またはIL-15)とカップリングされた常磁性ポリスチレンコーティングビーズ(直径4.5 μM)の存在下で別々に刺激し、その後、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)をコードするウイルスベクター(例えばレンチウイルスベクター)で別々に形質導入した。CD4+およびCD8+細胞組成物を次いで、組み換えヒトサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7および/またはIL-15)を含む培地の存在下での拡張のために別々に培養した。拡張前または拡張中に、磁場への曝露によって細胞組成物からビーズを除去した。拡張の閾値に達した後に、各組成物からの細胞を別々に採取し、配合し、冷凍凍結した。
実施例1および2に記載される自動蛍光ビーズ計数法を用いて、さまざまな細胞濃度の細胞組成物中のビーズ粒子の数を定量化した。ヒトドナーからの操作されたCD4+またはCD8+ T細胞組成物は、実質的に実施例2に記載されるように作製された。記載されるように、細胞を産生するためのプロセスには、CARをコードする核酸の導入に先立って抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされた常磁性ポリスチレンコーティングビーズ粒子との細胞のインキュベーションと、それに続いて磁場への曝露によりビーズ粒子を除去する段階が含まれていた。
Claims (67)
- 細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
(a) インプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたはインプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、インプット組成物が、1つまたは複数の細胞を含み、かつ自家蛍光を放出することができる1つもしくは複数の非細胞粒子を含む可能性が高いか、またはそれを含み得、インキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、段階; ならびに
(b) アウトプット組成物またはその一部分を1つまたは複数の非細胞粒子の自家蛍光の蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の1つまたは複数の非細胞粒子の存在または非存在を判定する段階
を含む、方法。 - アウトプット組成物またはその一部分を自家蛍光の蛍光イメージングにより分析して、アウトプット組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を判定する段階を含む、細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下でインキュベートされたインプット組成物の少なくとも一部分のサンプルであり、インプット組成物が1つまたは複数の細胞を含み、かつ自家蛍光を放出することができる1つもしくは複数の非細胞粒子を含む可能性が高いか、またはそれを含みうる、方法。 - 1つまたは複数の非細胞粒子が、1つまたは複数の細胞および1つまたは複数の非細胞粒子を含む細胞組成物から非細胞粒子を除去または低減する段階の後にインプット組成物中に存在する残留非細胞粒子である、請求項1または請求項2記載の方法。
- 分析の前に、アウトプット組成物が、アウトプット組成物中に存在する1つまたは複数の非細胞粒子の選択を伴う段階によって1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
(a) 細胞組成物の非細胞粒子を除去または低減する条件の下で細胞および非細胞粒子を含む細胞組成物を処理し、それによって1つまたは複数の細胞を含みかつ残留非細胞粒子である1つまたは複数の非細胞粒子を含みうるインプット組成物を産生する段階であって、1つまたは複数の非細胞粒子が自家蛍光を放出することができる、段階;
(b) インプット組成物の少なくとも一部分を含むサンプルまたはインプット組成物に由来するサンプルをインキュベートする段階であって、インキュベーションが1つまたは複数の細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、段階;
(c) アウトプット組成物中に存在する1つまたは複数の非細胞粒子の選択を伴う段階によって、アウトプット組成物中の1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮する段階; ならびに
(d) 濃縮されたアウトプット組成物またはその一部分を自家蛍光の蛍光イメージングにより分析して、サンプル中の非細胞粒子の存在または非存在を判定する段階
を含む、方法。 - 1つまたは複数の非細胞粒子が磁性または常磁性であり、選択が非細胞粒子を磁石または磁場に曝露することを含む、請求項4または請求項5記載の方法。
- 蛍光イメージングによるアウトプット組成物の分析は、アウトプット組成物またはその一部分の、蛍光画像、任意で蛍光顕微鏡写真の取得、および蛍光画像からの画像オブジェクトの蛍光強度の判定を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- アウトプット組成物またはその一部分の、明視野画像、任意で明視野顕微鏡写真を取得する段階をさらに含み、
1つまたは複数の非細胞粒子が、蛍光画像および/または明視野画像から画像オブジェクトのサイズ、面積、および/または真円度を評価することによってアウトプット組成物中の1つまたは複数の他の成分から区別される、請求項7記載の方法。 - 細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって、
(i) アウトプット組成物またはその一部分を1つまたは複数の光源で照射して、照射されたサンプルを作製する段階であって、少なくとも1つの光源が自家蛍光を励起することができ、該アウトプット組成物が、細胞の溶解を誘導する条件の下でインキュベートされたインプット組成物の少なくとも一部分のサンプルであり、インプット組成物が、1つまたは複数の細胞を含み、かつ自家蛍光を放出することができる1つもしくは複数の非細胞粒子を含む可能性が高いか、またはそれを含みうる、段階;
(ii) 照射されたサンプルの1つまたは複数の画像をキャプチャする段階であって、少なくとも1つの画像が蛍光画像であり、かつ任意で少なくとも1つの画像が明視野画像である、段階;
(iii) サイズ、面積、蛍光強度、明視野強度、および/または真円度から選択される1つまたは複数のパラメータについて1つまたは複数の画像から画像オブジェクトの存在または非存在を分析し、それによって1つまたは複数の非細胞粒子の存在または非存在を判定する段階
を含む、方法。 - 照射の前に、アウトプット組成物が、アウトプット組成物中に存在する1つまたは複数の非細胞粒子の選択を伴う段階によって1つまたは複数の非細胞粒子について濃縮される、請求項9記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子が磁性または常磁性であり、選択が磁性選択を含む、請求項10記載の方法。
- 分析が、非細胞粒子のシングレット、ダブレット、またはシングレットおよびダブレットを検出する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含み、かつ
(i) 画像オブジェクトが0.4もしくは少なくとも0.4の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて1 μmと20 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが130 μm2未満の面積を含む場合、
画像オブジェクトは非細胞粒子として検出される、請求項7〜12のいずれか一項記載の方法。 - (i) 画像オブジェクトが0.4もしくは少なくとも0.4、0.5もしくは少なくとも0.5、0.6もしくは少なくとも0.6、0.7もしくは少なくとも0.7、0.8もしくは少なくとも0.8、または0.9もしくは少なくとも0.9の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて3 μmと15 μmの間の直径を含む場合; および/あるいは
(iii) 画像オブジェクトが0.5 μm2と50 μm2の間の面積を含む場合、
画像オブジェクトは非細胞粒子として検出される、請求項13記載の方法。 - (A) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含み、かつ
(i) 画像オブジェクトが0.7もしくは少なくとも0.7の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて1 μmと7.5 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが65 μm2未満の面積を含む場合、
画像オブジェクトはシングレットの非細胞粒子として検出される; ならびに
(B) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含み、かつ
(i) 画像オブジェクトが0.4と0.6もしくは約0.4と0.6の間の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが両端の値も含めて2 μmと15 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが130 μm2未満の面積を含む場合、
画像オブジェクトはダブレットの非細胞粒子として検出される、
請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。 - (A) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含み、かつ
(i) 画像オブジェクトが0.7と1.0もしくは約0.7と1.0の間の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが1 μmと5 μmもしくは約1 μmと5 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが65 μm2未満の面積を含む場合、
画像オブジェクトはシングレットの非細胞粒子として検出される; ならびに
(B) 画像オブジェクトが、任意で対照サンプルにおけるバックグラウンドシグナルを超える蛍光シグナルを含み、かつ
(i) 画像オブジェクトが0.4と0.6もしくは約0.4と0.6の間の真円度を含む場合;
(ii) 画像オブジェクトが2 μmと10 μmもしくは約2 μmと10 μmの間の直径を含む場合; および/または
(iii) 画像オブジェクトが130 μm2未満の面積を含む場合、
画像オブジェクトはダブレットの非細胞粒子として検出される、
請求項15記載の方法。 - 対照サンプルが、1つまたは複数の細胞を含むが1つまたは複数の非細胞粒子を含まない細胞組成物をインキュベートすることによって産生される組成物であり、任意でインキュベーションが細胞の溶解を誘導してアウトプット組成物を産生する条件の下である、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
- 分析が、サンプル中に存在すると判定された非細胞粒子の数を計数することをさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 分析がコンピュータにより実現される画像分析を用いて実行される; あるいは
方法の1つまたは複数の段階が、機械、ロボット、および/またはコンピュータにより実現されるアルゴリズムによって実行される、
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。 - 方法の1つまたは複数の段階が、高速大量処理であり、かつ/または自動化されている、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が細胞組成物に由来し、細胞組成物が、1つまたは複数の細胞と、1つまたは複数の細胞の表面上の巨大分子に結合することができる生体分子を含む1つまたは複数の非細胞粒子とを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、
(1) 1つまたは複数の細胞を1つまたは複数の非細胞粒子と混合する段階; および
(2) 細胞から1つまたは複数の非細胞粒子を除去する段階
を含む方法によって産生される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。 - 1つまたは複数の非細胞粒子が、細胞の表面上の巨大分子に結合することができる1つまたは複数の生体分子を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
- 細胞の溶解を誘導する条件の下でインキュベートすることは、漂白剤を含む溶液とともにサンプルをインキュベートすることを含み、任意で漂白剤が塩素系の漂白剤である、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 漂白剤を含む溶液が界面活性剤をさらに含み、任意で界面活性剤がTriton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、ジギトニン、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)およびCHAPSOの1つまたは複数である、請求項24記載の方法。
- 細胞の溶解を誘導する条件の下でインキュベートすることが、サンプルを漂白剤とともにインキュベートすることを含み、サンプルが、濃度約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、もしくは8% (v/v)の漂白剤、または前記の値のいずれか2つによって定義される範囲の漂白剤とともにインキュベートされる、請求項24または請求項25記載の方法。
- インキュベーションが、少なくとももしくは少なくとも約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、20分、もしくは30分間行われるか; あるいは
インキュベーションが、30秒〜30分、1分〜20分、1分〜10分、もしくは1分〜5分、または約30秒〜30分、約1分〜20分、約1分〜10分、もしくは約1分〜5分行われる、
請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。 - 濃縮が、アウトプット組成物から細胞または細胞残屑を低減または除去する、請求項4〜27のいずれか一項記載の方法。
- 分析の前に、アウトプット組成物を洗浄溶液ですすぐまたは洗浄する段階をさらに含み、
任意で洗浄溶液が界面活性剤を含む、
請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。 - キャプチャする前に、アウトプット組成物を洗浄溶液ですすぐまたは洗浄する段階をさらに含み、
任意で洗浄溶液が界面活性剤を含む、
請求項9〜29のいずれか一項記載の方法。 - アウトプット組成物をすすぐまたは洗浄する段階が、1つまたは複数の非細胞粒子をペレット化すること、およびアウトプット組成物のある量を除去すること、またはある量を低減することを含む、請求項29または請求項30記載の方法。
- 界面活性剤が、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、ジギトニン、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)およびCHAPSOの1つまたは複数である、請求項29〜31のいずれか一項記載の方法。
- 界面活性剤が、Tween 20であるか、またはTween 20を含む、請求項25または請求項32記載の方法。
- インプット組成物の少なくとも一部分のサンプル中の細胞の濃度が、少なくとももしくは少なくとも約2×105細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×105細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×106細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×106細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×107細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約5×107細胞/mL、少なくとももしくは少なくとも約1×108細胞/mL、または少なくとももしくは少なくとも約5×107細胞/mLである、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
- アウトプット組成物またはその一部分の量が、50 μL、60 μL、70 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mL、または約50 μL、60 μL、70 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mL、または少なくとももしくは少なくとも約50 μL、60 μL、70 μL、75 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、もしくは10 mL、または前記の値のいずれか2つによって定義される範囲である、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
- アウトプット組成物の量が、少なくとももしくは少なくとも約70 μLであるか、または70 μLもしくは約70 μLである、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
- 分析の前に、サンプル中の1つまたは複数の細胞粒子を撹拌する条件の下でアウトプット組成物を混合する段階を含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
- 方法の1つまたは複数の段階中に、処理中の表面上のサンプル保持を低減する条件の下でアウトプット組成物が処理される、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子が、ビーズであるか、またはビーズを含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、1.0 μm〜10.0 μmまたは1.0 μm〜5.0 μmの直径を有する、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、
細胞組成物中の細胞の平均直径と実質的に同じであるか、または細胞組成物中の細胞の平均直径よりも5倍、4倍、3倍、2倍もしくは1.5倍大きいもしくは小さい範囲内である直径
を有する、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。 - 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、3.5 μm超もしくは約3.5 μm超、ただし約9 μm以下または約8 μm以下または約7 μm以下または約6 μm以下または約5 μm以下の直径または平均直径を有する、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、4.5 μmまたは約4.5 μmの直径または平均直径を含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、磁性コア、常磁性コア、または超常磁性コアを含む、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが不活性である、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズが、ポリスチレン表面であるか、またはそれを含み、任意で磁性または超常磁性コアを含む、請求項1〜45のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の生体分子が、1つまたは複数の非細胞粒子、任意で1つまたは複数のビーズの表面上に存在するか、またはそれに付着される、請求項21〜46のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の生体分子が、サンプル中の1つまたは複数の細胞を選択、単離、または濃縮することができる親和性試薬である、請求項21〜47のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の生体分子が、サンプル中の1つまたは複数の細胞を刺激することができる1つまたは複数の刺激剤である、請求項21〜48のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の生体分子が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項21〜49のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の刺激剤が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる、請求項49または請求項50記載の方法。
- 1つまたは複数の刺激剤が、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する一次剤およびT細胞共刺激分子に特異的に結合する二次剤を含む、請求項49〜51のいずれか一項記載の方法。
- 一次剤がCD3に特異的に結合し、ならびに/または共刺激分子が、CD28、CD137 (4-1-BB)、OX40、およびICOSからなる群より選択される、請求項52記載の方法。
- 一次剤が抗CD3抗体またはその抗原結合断片であるかまたはそれを含み、二次剤が抗CD28抗体またはその抗原結合断片であるかまたはそれを含む、請求項52または請求項53記載の方法。
- 1つもしくは複数の細胞が動物細胞であるか、または細胞組成物が動物細胞を含む、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
- 1つもしくは複数の細胞がヒト細胞であるか、または細胞組成物がヒト細胞を含む、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
- 1つもしくは複数の細胞が幹細胞であるか、または細胞組成物が幹細胞を含む、請求項1〜56のいずれか一項記載の方法。
- 幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項57記載の方法。
- 1つもしくは複数の細胞が免疫細胞であるか、または細胞組成物が免疫細胞を含む、請求項1〜58のいずれか一項記載の方法。
- 免疫細胞が、T細胞、B細胞、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー(NK)細胞、または樹状細胞である、請求項59記載の方法。
- 細胞がT細胞であり、1つまたは複数の非細胞粒子が1つまたは複数の刺激剤を含むかまたはそれに付着され、1つまたは複数の刺激剤が、抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片および/または抗CD28抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項60記載の方法。
- 1つまたは複数の非細胞粒子が、インキュベーションの前に細胞組成物からの細胞の選択、単離、または濃縮を行うために1つまたは複数の親和性試薬を含む、請求項1〜60のいずれか一項記載の方法。
- 親和性試薬が、1つまたは複数の細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項48または請求項62記載の方法。
- 細胞表面タンパク質が、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54 (ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BB (CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R; IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CD11a (LFA-1)、CD62L (L-セレクチン)、CD29/CD49d (VLA-4)、Notchリガンド、Delta様1/4、Jagged 1/2、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、およびCXCR3から選択される、請求項63記載の方法。
- インキュベーションが、約15℃〜30℃、18℃〜28℃、または20℃〜25℃である温度で行われる、請求項1〜64のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーションが、約23℃である温度で行われる、請求項1〜65のいずれか一項記載の方法。
- 細胞溶解を行うための漂白剤および/または界面活性剤を含む溶液を含む容器;
包装材料; ならびに
細胞組成物中の非細胞粒子の存在または非存在を検出するための使用説明書を含むラベルまたは添付文書であって、該使用説明書が請求項1〜66のいずれか一項記載の段階の実行を指定する、ラベルまたは添付文書
を含む、製造品。
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