JP2021515042A - ムチンに作用するプロテアーゼを含む製剤 - Google Patents

Abstract

患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアを開示する。本発明のマイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持し、生理的条件に暴露されると、このプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている。さらに、本発明のマイクロスフェアを含む医薬組成物および本発明のマイクロスフェアを使用した治療方法を開示する。

Description

本発明は、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持するマイクロスフェアに関する。一態様において、本発明は、ムチン産生がんおよびムチンが関与するその他の疾患の治療において使用するための、ムチンに作用するプロテアーゼ（ブロメラインなど）を含むマイクロスフェアに関する。

ムチンは、消化管、肺、腎臓、卵巣、乳房、膵臓などに存在する上皮組織により産生される高度に糖鎖修飾された高分子量タンパク質のファミリーである。ムチンは、通常の生理的条件では上皮組織の保護を担う。一方で、ムチンは様々な疾患に関与している場合がある。たとえば、特定の種類のムチン（たとえば、MUC1、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC16など）の過剰発現は、特定の種類のがんと関係している。上皮細胞の表面におけるムチンの合成は、通常は高度に制御されているが、腫瘍では、ヒトムチンの発現が上昇することなどによって、ムチンの産生が増加する。上皮由来のがんではムチンの発現および組成が変化し、上皮由来のがんに罹患した患者では、粘液の産生が負の予後因子となることが知られている。

ムチンの異常な蓄積は、患者の健康状態に悪影響を及ぼすことがあり、嚢胞性線維症や慢性閉塞性肺疾患などの非がん性疾患を引き起こす場合がある。

したがって、ムチンが関与する疾患は治療を行う必要があり、ムチンが関与する疾患に罹患した患者に対してより良い転帰を提供する必要がある。ムチン関連疾患は、たとえば、粘液溶解剤で治療することができ、この薬剤は、（たとえばムチンタンパク質を分解または破壊することにより）ムチンタンパク質に作用してその粘性を低下させ、生体によるムチンの除去を促したり、（たとえば腫瘍がムチンで覆われている場合などに）細胞傷害剤を浸透しやすくする。

ムチンに作用するプロテアーゼは、粘液溶解剤の１種であり、ムチンタンパク質のタンパク質分解を引き起こすタンパク質分解酵素である。しかしながら、ムチンに作用するプロテアーゼは、一般に複雑な特性を有し、副作用を伴うリスクがあることから、ムチンに作用するプロテアーゼを患者に効果的に送達することが難しい場合がある。また、ムチンに作用するプロテアーゼは、生理的条件下での安定性の問題もある。

たとえば、ムチンに作用するプロテアーゼとしてブロメラインが挙げられる。ブロメラインは、植物の一種であるパイナップル（Ananas Comosus）の抽出物で、様々なチオールプロテアーゼを含む。ブロメラインは、インビトロおよびインビボでタンパク質分解活性を有し、抗浮腫活性、抗炎症活性、抗血栓活性および線維素溶解活性を有することから、深部静脈血栓症や血液凝固障害などの疾患の治療に使用することができる。また、ブロメラインは、インビトロモデルおよびインビボモデルにおいて、単独でも別の化学療法剤との併用でも特定の種類のがんに対して抗がん特性を示す。

したがって、ブロメラインは、特定の種類のがんやムチンが関与するその他の疾患を治療するための治療剤として提案されている。しかし、（過去の動物試験で見られたように）ブロメラインの治療有効量の全身投与にはリスク（特に線維素溶解作用や出血作用）が伴うことから、ブロメラインの全身投与に関する臨床試験は行われていない。

副作用の可能性を最小限に抑えられる方法で、ムチンに作用するプロテアーゼ（ブロメラインなど）の治療有効量を患者に送達できると有利である。

第１の態様において、本発明は、患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアを提供する。このマイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されており、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている。

患者の体内への局所送達を目的として特定の薬剤をマイクロスフェア内に担持させることは、たとえば、経動脈化学塞栓療法（TACE）として知られる技術において公知である。Biocompatibles UK Ltdからディーシービーズ（DC Bead）（登録商標）の商標名で市販されているマイクロスフェアは、たとえば、原発性肝臓がんおよび二次性肝臓がんの治療用抗がん剤であるドキソルビシンおよびイリノテカンの動脈内送達に適応されている。しかし、持続放出を目的としてディーシービーズ内に担持可能とされる薬剤は、いずれも正に帯電した比較的小さな（約600Daの）分子であり、ドキソルビシンやイリノテカン以外の薬剤は、このマイクロスフェア内に適切に保持できないとされている。実際、このマイクロスフェア内に担持可能であったとしても、薬剤の多くは生理的条件下でほぼ瞬時に放出されてしまう（通常「バースト放出」と呼ばれる）。その他のマイクロスフェア（そのうちの数種は後述する）も同様に、ドキソルビシンやイリノテカンなどの低分子との使用に限って適応されている。

このような低分子とは対照的に、ムチンに作用するプロテアーゼは、高分子量を有する酵素（または酵素混合物）である。ブロメラインの場合、たとえば、いくつかの酵素は分子量が約33,000Daであると報告されている。したがって、先行技術の教示によると、ブロメラインなどの、ムチンに作用するプロテアーゼをディーシービーズなどのマイクロスフェア内に担持させることは不可能であると考えられ、ムチンに作用するプロテアーゼをこのようなマイクロスフェアに担持させることが可能であったとしても、生理的条件下において、このプロテアーゼを活性な形態でマイクロスフェアから持続的に放出できるとは考えられない。実際、本発明者らや別の研究者による過去の研究では、ブロメラインをマイクロスフェア内に担持させる試みは失敗に終わっている。これらの試みのいくつかでは、たとえば、マイクロスフェア内へのブロメラインの担持自体に失敗している。別の試みでは、ブロメラインがマイクロスフェアを分解し、ブロメライン自体が周囲条件で分解するか、生理的条件に暴露されたブロメラインが「バースト放出」する（全身送達された場合と同じ効果となる）ことが分かった。

このような先行技術の教示があることから、本明細書に記載するようなマイクロスフェアは、一般に、適応外の分子の持続的送達には有用ではなく、ましてや活性状態にある大きな酵素や、大きな酵素を含む酵素混合物の持続的送達には有用ではないと考えられていた。

本発明者らは、予想外にも、ブロメラインが、実際は本明細書で述べるマイクロスフェア（ディーシービーズなど）内に担持可能であり（後にパパインも担持可能であることが判明している）、ブロメラインを担持させたマイクロスフェアを患者の体内に局所送達できるという驚くべき知見を見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。さらに、驚くべきことに、かつ予想外にも、マイクロスフェアに担持されたブロメラインは、生理的条件に暴露されると、マイクロスフェアから活性な状態のまま持続的に溶出されることが明らかになった。ブロメラインは、通常は周囲条件で不安定であることを考えると、ブロメラインが長期間にわたり活性を維持することは本発明者らにとって驚くべきことであった。このように、本発明者らは、従来の知見に反して、ブロメラインをマイクロスフェア内に担持させ、ブロメラインを持続的に放出するように構成できることを発見した。本発明者らによる後続の実験では、ムチンに作用する別のプロテアーゼであるパパインも、ブロメラインと同等の担持特性および溶出特性が認められることが明らかになった。したがって、本発明者らは、ムチンに作用するその他のプロテアーゼも、本発明において有用性を有するという合理的な予測を立てている。たとえば、パパインとフィシンは、構造と機能が類似している。

本発明者らは、これらの発見によって、副作用の可能性を最小限に抑えることが可能な、ブロメラインまたはムチンに作用するその他のプロテアーゼの治療有効量の局所送達用媒体を提供できることを見出した。このような特徴が顕著な利点であることは当業者には明らかであり、これについては後で説明する。

第２の態様において、本発明は、医薬組成物であって、患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアと薬学的に許容される担体とを含み、該マイクロスフェアが、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持し、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている医薬組成物を提供する。

第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

第４の態様において、本発明は、ムチンに作用するプロテアーゼをマイクロスフェア内に担持する方法を提供する。この方法は、酸性ｐＨ（たとえばｐＨ２またはｐＨ２．５といった低いｐＨ）を有する溶液にマイクロスフェアを加える工程；前記マイクロスフェアを含む前記溶液を、ムチンに作用するプロテアーゼを含む溶液と混合する工程；および前記ムチンに作用するプロテアーゼが前記マイクロスフェア内に担持されるのに十分な時間にわたって前記混合物を振盪する工程を含む。マイクロスフェアを加える溶液は、任意で、患者の体内の標的領域と同等のイオン強度を有していてもよい。

第５の態様において、本発明は、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を治療する方法を提供する。この方法は、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持するマイクロスフェアの治療有効量を患者に投与する工程を含み、前記マイクロスフェアは、投与後に、前記ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている。

前述のように、切除不能な肝細胞癌などのがんの治療のための、経動脈化学塞栓療法（TACE）と呼ばれる方法において、ドキソルビシンまたはイリノテカンを担持させたマイクロスフェアが使用される。このマイクロスフェアは、腫瘍の上流の動脈に注入され、動脈径が小さい部位において塞栓を形成する。その後、腫瘍につながる血管に極めて近い位置にあるマイクロスフェアからドキソルビシンまたはイリノテカンが溶出されて、この血管に直接送達され、薬剤の局所濃度を高くすることができる。このような正確に標的を絞った薬剤送達によって、薬剤に関連する有害事象をほとんどなくすことができる。

本発明者らは、本発明によるマイクロスフェアが患者に動脈内送達された場合でも、ムチンに作用するプロテアーゼを同様に効果的に局所送達することができると考えている。また、本発明者らは、マイクロスフェアの病巣内送達、腹腔内送達または体腔内送達（たとえば腹腔または胸膜腔への送達）が、その他の関連疾患の治療にも同様に効果的であると予測しており、これについては後述する。

第６の態様において、本発明は、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を治療する方法であって、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアまたは本発明の第２の態様もしくは第３の態様に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記疾患の治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法を提供する。

第７の態様において、本発明は、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬品を製造するための、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアの使用を提供する。

第８の態様において、本発明は、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療のための、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアの使用を提供する。

第９の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアを提供する。

第１０の態様において、本発明は、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用するための、本発明の第１の態様に記載のマイクロスフェアを提供する。

第１１の態様において、本発明は、ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む組成物であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている組成物を提供する。

第１２の態様において、本発明は、ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む注射用組成物であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている注射用組成物を提供する。

第１３の態様において、本発明は、ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む持続放出製剤であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている持続放出製剤を提供する。

本発明のその他の態様、特徴および利点を以下で説明する。

前述のように、本発明は、患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアを提供する。本発明のマイクロスフェアは、ムチンに作用する１種（またはそれ以上の種類）のプロテアーゼを内部に担持し、生理的条件に暴露されると、このプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている。

マイクロスフェアの動脈内送達は比較的よく確立された分野であり、腫瘍への局所送達を目的とした、化学療法剤を含む生体適合性マイクロスフェアは、特定の種類の腫瘍の治療に使用されている。たとえば、化学療法剤であるドキソルビシンまたはイリノテカン（いずれも正に帯電した低分子）を含有するポリビニルアルコール（PVA）ヒドロゲルマイクロスフェアが、ディーシービーズの商標名でBiocompatibles UK Ltdから市販されており、ディーシービーズは、経動脈化学塞栓療法（TACE）として知られる技術により腫瘍に局所送達することによって、原発性肝臓がんまたは二次性肝臓がんの治療に使用されている。また、このような薬剤を溶出するPVAヒドロゲルビーズは、放射能を標識して使用され、たとえば、選択的内部放射線療法（SIRT）にも使用されている。

本発明者らは、ディーシービーズ（および後述のその他のマイクロスフェア）などのマイクロスフェア内にブロメラインを担持可能であるという驚くべき予想外な知見を見出した後（後にパパインもマイクロスフェアに担持可能であると判明している）、実験（後述）を実施したところ、さらに驚くべきことに、ブロメラインが、インビトロの生理的条件下において活性な形態で持続的にマイクロスフェアから溶出されることが明らかになった。本発明者らは、これらの予備実験データから、別の種類のマイクロスフェアでも同じ方法でブロメライン（およびムチンに作用する別のプロテアーゼ）を担持させ、含有させ、溶出させることが可能であると合理的に予測できると考えた。患者の生体に生体適合性があり、内部に含まれるプロテアーゼと不利な相互作用を起こさない物質から作製されたマイクロスフェアは、本発明において有用な可能性があり、日常的な試験や実験を実施して、特定の種類のマイクロスフェアが、内部に含まれるプロテアーゼの持続的な溶出に適しているかどうかを確認することができる。

ムチンに作用するプロテアーゼ
前述したように、ムチンに作用するプロテアーゼは、タンパク質分解酵素の１種であり、ムチンタンパク質のタンパク質分解を引き起こすことによって治療効果を付与することができる。本明細書において、「ムチンに作用する」とは、たとえば、ムチンの液化もしくは分解（すなわち、粘性を低くし、生体による排除を促す）またはムチンの破壊などの、治療効果のある方法でムチンに作用することを指す。このような作用を有するプロテアーゼは、ムチン産生がん（ムチン分泌がん、ムチン含有がんおよび／またはムチン産生がんを含んでいてもよい（これについては後で定義する））ならびにムチンが関与するその他の疾患（たとえば後述する疾患）の治療に有用である場合がある。本発明者らの考えでは、ムチンに作用するプロテアーゼであればどのようなものであっても本発明において使用してもよく、ムチンに作用する特定のプロテアーゼが適切か否かを調べるためには、（本明細書に記載の教示に照らして）必要とされる日常的な試験および実験を実施するだけでよい。

以下、いずれもムチンに作用する植物由来プロテアーゼ酵素であるブロメラインおよびパパインに主に関連して本発明を説明する。しかしながら、当業者であれば、日常的な試験および実験を使用して、本明細書に記載の教示を、ムチンに作用するその他のプロテアーゼにも適応可能であることを理解するであろう。

ムチンに作用するプロテアーゼは、たとえば、ムチンに作用する植物由来プロテアーゼ、ムチンに作用する真菌プロテアーゼ、およびムチンに作用する細菌プロテアーゼからなる群のうちの１種（またはそれ以上）から選択してもよい。

植物由来のタンパク質分解酵素の中には、ブロメラインと同じ特性を発揮するものがあり、ムチン（たとえばムチンの産生）に対して治療効果を有する植物由来プロテアーゼ酵素であればどのようなものであっても、本発明において使用することができると本発明者らは予想しており、日常的な実験を行うことによって特定の植物由来プロテアーゼ酵素が適切か否かを確認することができる。たとえば、いくつかの実施形態において、植物由来プロテアーゼ酵素は、ブロメライン、パパイン（パパイヤから抽出されたプロテアーゼ）、フィカイン（イチジクから抽出されたプロテアーゼ）、アクチニダイン（キーウィフルーツ、パイナップル、マンゴー、バナナ、パパイヤなどの果物から抽出されたプロテアーゼ）、ジンギパイン（ショウガから抽出されたプロテアーゼ）およびFastuosain（ブロメリア・ファスツオサ（Bromelia fastuosa）から抽出されたシステインプロテイナーゼ）からなる群のうちの１種以上から選択してもよい。アスパラガス、マンゴー、キーウィフルーツ、パパイヤなどに由来する別のプロテアーゼを使用してもよい。

また、本発明者らは、ムチンに作用する真菌プロテアーゼおよびムチンに作用する細菌プロテアーゼはいずれも、本発明において同様に有用である可能性があると考えている。好適な真菌プロテアーゼとしては、アスペルギルス由来のプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（サブチリシンファミリー）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシンファミリー）、およびメタロプロテアーゼ（これらのいくつかは、上皮細胞壁を標的とする抗がん活性を有することが知られている）が挙げられる。好適な細菌プロテアーゼとしては、カイコのペプチザイム由来のプロテアーゼが挙げられる。

本明細書において、「ブロメライン」は、植物であるパイナップル（Ananas Comosus）の抽出物中に見出され、ムチンに作用し、かつその他の治療効果を有していてもよい１種以上の治療活性物質を包含する。ブロメラインは、様々な物質（様々なチオールエンドペプチダーゼおよびその他の成分（ホスファターゼ、グルコシダーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ、および数種類のプロテアーゼ阻害剤など））の混合物であり、マイクロスフェア内に担持されたこれらの物質の一部が、（たとえば、ムチンタンパク質のタンパク質分解を引き起こすことにより）少なくともムチンに作用することができるのであれば、抽出物中に存在するすべての物質をマイクロスフェアに担持する必要はないと考えられる。本明細書に記載の実験で使用したブロメラインは、Challenge Bioproducts Co Ltd製の市販品であった。

適応
ムチンに作用するプロテアーゼを含む本発明のマイクロスフェアを患者の体内の標的領域に送達し、該ムチンに作用するプロテアーゼが有効な何らかの疾患または状態を治療してもよい。ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されており、生理的条件に暴露されると、該プロテアーゼを持続的に溶出するように構成された本発明のマイクロスフェアは、ムチンが関与する何らかの疾患の治療に使用することができ、特に、ムチンに作用するプロテアーゼの全身送達により問題が生じうる疾患の治療に使用することができる。

たとえば、前述のように、ブロメラインは、インビトロおよびインビボでタンパク質分解活性を有することが知られている。ブロメラインは、抗浮腫活性、抗炎症活性、抗血栓活性および線維素溶解活性も有し、抗がん剤としても期待されている。しかし、ブロメラインを全身投与すると、ブロメラインの線維素溶解作用と出血作用による問題が生じうるためリスクがあり、このため、ブロメラインは、がんの臨床治療にはいまだ使用されていない。一方、本発明によれば、ブロメラインを局所に持続放出できることから、全身毒性のリスクを伴うことなく、患者の体内の標的領域においてブロメラインの局所濃度を高くすることができる。本発明は、がんへの薬剤の浸透を向上させて、特定の化学療法剤の細胞傷害性に対して相乗効果をもたらすこともできる。

本発明は、たとえば、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患の治療に対して提供してもよい。ムチンに作用するプロテアーゼがさらなる治療活性を有する場合、本発明は、別の状態の治療に対して提供してもよい。たとえばブロメラインの場合、本発明は、深部静脈血栓症および血液凝固障害の治療に対して提供してもよい。

ムチンに作用するプロテアーゼは、ムチンタンパク質のタンパク質分解を引き起こすため、患者の体内の標的領域に送達されると、この標的領域のムチンに（たとえば分解などにより）作用する。したがって、患者の体内の標的領域（たとえばムチン産生腫瘍）に本発明のマイクロスフェアを送達することによって、最低限でも、その領域（たとえば腫瘍の周囲）のムチンに作用し、何らかの治療効果（たとえば、標的領域におけるムチン塊の減少、血流の改善または消化能力）をもたらすことができる。さらに、共投与された治療剤（たとえば後述の治療剤）は、ムチンが何ら影響を受けていない場合よりも効果的に標的領域（たとえば腫瘍）内に浸透できる。当業者であれば理解できるように、このようにすることによって極めて有用な治療効果を得ることができ、既存の治療計画の有効性を著しく高め、共投与される治療剤の用量を低減することができる。

本発明は、ムチン産生がんの治療に使用してもよい。本明細書において、「ムチン産生」がんは、ムチンを含むがんおよびムチンを産生するがんの両方を意味する。ムチンを含むがんとしては、たとえば、印環細胞がんおよび杯細胞がんが挙げられる。ムチンは、印環細胞や杯細胞として識別されない細胞の細胞質内にも存在しうる。ムチンを産生するがんとしては、たとえば、偽粘液腫などのムチン分泌型がん、ムチンを過剰発現するがん、細胞（細胞膜）の周囲にムチンを分泌するがんが挙げられ、分泌されたムチンは、化学療法剤の浸透に対する障壁として働き、免疫細胞の認識も妨げる。

ムチンを産生するがんとしては、たとえば、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がん、虫垂がん、腹膜がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、中皮腫、神経芽腫、小腸がん、リンパ腫および白血病が挙げられる。これらのがんの多くは、従来の治療法で治療することが難しい。肝細胞癌（原発性肝臓がん）、肝転移（二次性肝臓がん）および膵臓がんの治療は、本発明の特に好ましい適用である。また、本発明のマイクロスフェアは、腺癌の治療にも使用できる。特に、腺癌は印環細胞がんであってもよい。また、本発明のマイクロスフェアは、腹膜偽粘液腫の治療に使用してもよい。

肝細胞癌（原発性肝臓がん）は、一般に、Ｂ型肝炎やＣ型肝炎の感染症、アルコールなどを原因とする肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、およびあまり一般的ではないその他の原因によって起こる。現在の治療法には、肝臓の移植、切除および熱焼灼が含まれるが、これらの治療有効性のある方法によって治療可能な患者はわずかである。大多数の患者は、TACEとドキソルビシンのマイクロスフェア送達による治療を受けるが、奏効率はそれほど高くなく、患者の多くでは生存率もそれほど高くない。

肝転移（二次性腫瘍）は、大腸がん、胃がんおよび膵臓がんや、腹部およびその他の体内の部位から生じた腺癌および腫瘍などの様々ながんから起こりうる。肝切除術は最適な治療法であるが、特定の症例では、現在は熱焼灼でも同等の帰結が得られうる。全身化学療法は広く用いられているが、帰結はそれほど良くない。イリノテカンを担持したマイクロスフェアの送達は、大腸がんを起源とする肝転移の緩和療法として用いられている。

本発明のマイクロスフェアを、栄養動脈（たとえば肝臓がんの治療の場合、肝動脈）から患者の腫瘍内へと送達することによって、ムチンに作用するプロテアーゼの持続放出による効果を最大限に発揮させ、全身送達に伴う副作用のリスクを低下することができるが、このようなマイクロスフェアの送達によって、ムチンに作用するプロテアーゼを標的部位に送達することができるため、非常に侵襲性の低い方法で肝腫瘍または膵腫瘍を治療することができる。

さらに、ムチンに作用するプロテアーゼのいくつかは、それ自体が抗がん活性を有している場合がある。たとえば、ブロメラインは、たとえば、膵臓がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、甲状腺がん、胃がん、虫垂がん、腹膜がん、肝細胞がん、中皮腫、腹膜偽粘液腫およびその他の腹膜がん、卵巣がん、肺がん、小腸がんなどの数多くのがんに対して抗がん活性を有することが明らかになっている。パパインは、たとえば、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、卵巣がん、神経芽腫、リンパ腫、白血病、その他の固形がんなどのがんの治療に使用してもよい。したがって、ブロメラインまたはパパインを含む本発明のマイクロスフェアを、ムチン産生腫瘍に送達することによって、腫瘍の周囲のムチンに作用させることができ（たとえば破壊または分解することができ）、それによって、ブロメラインまたはパパインをより効果的に腫瘍内に浸透させることができ、（特に、ある一定の時間にわたって持続的に送達できることから）ブロメラインまたはパパインの抗がん活性の有効性を向上させることができる。

腹膜偽粘液腫（PMP）は、腫瘍細胞によってムチンが分泌され、腹腔内にムチンが過剰に蓄積されることを特徴とする腫瘍の一形態である。この腫瘍細胞は主に虫垂起源であるが、結腸、直腸、胃、胆嚢、小腸、膀胱、肺、乳房、膵臓および卵巣の播種性がんもこの疾患に寄与しうる。分泌されたムチンは塊となって腹腔内に蓄積し、消化管への内圧を上昇させ、この結果、栄養失調になるため、病状が悪化し、死に至る。

従来、PMP患者にとって好ましい治療法として、開腹術によりムチン塊を除去し、腫瘍細胞を切除した後、腹腔内温熱化学療法（HIPEC）が行われている。しかし、この疾患は進行性であるため、病状が悪化して死に至ることもあり、疾患の経過中にいくつかの種類の治療法が必要となる場合がある。

本発明のマイクロスフェアを患者の腹腔内に送達することによって、ムチンに作用するプロテアーゼの持続放出による効果を最大限に発揮させ、全身送達に伴う副作用のリスクを低下することができるが、ムチンに作用するプロテアーゼが、蓄積されたムチンを液化するため（すなわち、体内からムチンを排除しやすくなったり、液化されたムチンを腹腔から吸引しやすくなるため）、非常に非侵襲的な方法でムチン塊を除去することができ、（たとえば、プロテアーゼの抗がん活性または共投与される化学療法剤などの抗がん活性によって）がんを治療することもできる。

本発明を使用して、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患を治療してもよい。嚢胞性線維症は、肺および消化器系を損傷する疾患である。この疾患は、粘液、汗および消化液を産生する細胞に病変を起こし、粘液、汗および消化液の粘度を高めて粘着質にすることで、管腔、導管および流路を閉塞することがある。慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、気流が遮断されるため呼吸が困難になる肺疾患群（肺気腫および慢性気管支炎を含む）である。ムチンに作用するプロテアーゼを患者の肺へと持続的に局所送達することによって、効果的な治療計画を達成できると期待される。

いくつかの実施形態において、ムチンに作用するプロテアーゼのうち特定のものは、ムチンに作用する特性に加えて、別の治療用途を有していてもよい。このような実施形態の例を以下に説明する。

血栓の形成は、心筋梗塞、冠動脈疾患、脳卒中、広範型肺塞栓症および急性虚血肢などの様々な重篤疾患の原因である。ステントを装着している患者でも血栓症になる可能性が増加することがある。抗凝固薬（ヘパリンやワルファリンなど）を使用して血栓症を治療してもよい。しかし、このような抗凝固剤は、血栓の形成の抑制や、既存の血栓の成長の抑制にしか効果がない。プロテアーゼを患者に投与すると、一般に血液凝固が低下するというエビデンスがいくつかある。ブロメラインなどのプロテアーゼの場合、たとえば、このような治療効果は十分に報告されている。したがって、ブロメラインを含む本発明の実施形態において、本発明のマイクロスフェアは、（少なくとも）深部静脈血栓症、血液凝固障害、血友病、心筋梗塞、冠動脈疾患、脳卒中、広範型肺塞栓症、急性虚血肢、ステント血栓症、関節血症などの疾患の治療に有用であってもよい。前述と同様に、患者の体内の適切な領域にブロメラインを局所送達すると、ブロメラインの全身送達よりも非常に効果的であり、副作用が少なくなる。

さらに、ムチンに作用するプロテアーゼを、治療に有効な別の薬剤と併用した場合、相乗効果が得られる場合がある。たとえば、ブロメラインを別の粘液溶解剤（詳細は後述する）と併用した場合、滲出性中耳炎（グルーイヤー）、痰貯留、胸部感染症、胆道ステント／膵臓ステントの留置に伴う粘液貯留および細胞残屑などの、ムチンが関与するその他の疾患の治療において本発明のマイクロスフェアの有効性が向上する場合がある。

本明細書で述べたように、たとえば、ブロメラインなどの、ムチンに作用するプロテアーゼを別の化学療法剤または別の複数種の化学療法剤と併用することによって、ブロメラインが、（たとえば）化学療法剤の腫瘍内への（さらに深部への）侵入を促進するという相乗効果も得られる。当業者であれば理解できるように、このような機構によって、化学療法剤の有効性を高め、投与量を低減できる可能性がある。

マイクロスフェア
本発明のマイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持可能であり（かつその活性に顕著な悪影響を与えることなく、治療に重要な期間にわたって保持可能であり）、患者の体内の標的領域に送達でき、かつ生理的条件に暴露されると（すなわち標的領域に到達すると）プロテアーゼを持続的に溶出可能であれば、どのような好適な形態を取ってもよく、どのような好適な生体適合性物質またはその組み合わせから作製してもよい。

マイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼをその内部に保持するために、どのような好適な機構を利用してもよい。いくつかの実施形態では、たとえば、マイクロスフェアの化学的電荷または官能基によってプロテアーゼが保持される。あるいは（または前述に加えて）、生理的条件に暴露されるまでの間、立体効果（たとえば孔径）によってマイクロスフェア内にプロテアーゼが保持される。これと同様に、ムチンに作用するプロテアーゼのマイクロスフェアからの溶出は、どのような好適な機構を利用してもよい。いくつかの実施形態では、たとえば、生理的条件下において、プロテアーゼがマイクロスフェアの細孔から浸出してもよい。いくつかの実施形態では、マイクロスフェア自体が生理的条件下で生分解し、マイクロスフェアが分解するにつれて、プロテアーゼが持続的に放出されてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアが生理的条件に暴露されると、化学的要因（たとえば、マイクロスフェアの化学的電荷または官能基）が変化して、これによりマイクロスフェアがプロテアーゼを保持できなくなり、プロテアーゼが持続的に放出されてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアが生理的条件に暴露されると、マイクロスフェアの細孔が大きくなって、プロテアーゼが持続的に放出されてもよい。

先の段落で述べた要因および本明細書に記載の教示に基づいて、ムチンに作用する特定のプロテアーゼを使用した本発明において特定のマイクロスフェアが有用であるかどうかを合理的に予測可能であると本発明者らは考えている。この予測を確認するため、（状況に応じて適宜適合される）後述の従来の実験を行うことができる。

マイクロスフェアは、たとえば、前述のプロテアーゼ酵素を担持可能なマトリックスを含んでいてもよい（あるいは、このようなマトリックスであると定義されてもよい）。（たとえば後述するように）適切な条件下で、ムチンに作用するプロテアーゼとマイクロスフェアを互いに接触させると、プロテアーゼがマトリックスに取り込まれて、マイクロスフェア内に担持される。

本発明者らは、マイクロスフェアは、通常、（ヒトへの治療用途に承認済みの）市販品として購入されることを想定しているが、プロテアーゼを含む組成物からマイクロスフェアを作製することも可能である。このような実施形態では、酵素の周囲にマトリックスが形成され、このようにして形成されたマイクロスフェアでは、マイクロスフェアの全体に酵素がより均質に分散するため、標的部位においてマイクロスフェアから酵素をより長時間にわたって持続放出させることができる。

たとえば、マイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持可能なヒドロゲルを含んでいてもよい（あるいは、このようなヒドロゲルであると定義されてもよい）。好適なヒドロゲルとして、ポリビニルアルコール（PVA）ヒドロゲルが挙げられる。PVAヒドロゲルから形成されたマイクロスフェアのうち、本発明者らによって試験が行われたものは、Biocompatibles UK Ltdからディーシービーズの商標名で販売されている市販の生体適合性ポリビニルアルコール（PVA）ヒドロゲルマイクロスフェアである。このマイクロスフェアは、スルホネート基で修飾されたポリビニルアルコール（PVA）ヒドロゲルから製造されたものであり、化学療法剤であるドキソルビシンまたはイリノテカンの制御下での担持および送達において過去に使用されており、経動脈化学塞栓療法（TACE）でも使用されている。市販のディーシービーズの別の種類のものは、たとえば、「Hydrogel biomedical articles」の名称でWO2001/68722に記載されている（この文献の内容は参照により本明細書に援用される）。ディーシービーズは、様々なサイズのものが販売されており、７０〜１５０μｍ、１００〜３００μｍ、３００〜５００μｍおよび５００〜７００μｍのサイズのものがある。

別の好適なヒドロゲルとして、ポリ（ビニルアルコール−ｃｏ−アクリル酸ナトリウム）ヒドロゲルが挙げられる。ポリ（ビニルアルコール−ｃｏ−アクリル酸ナトリウム）ヒドロゲルから形成されたマイクロスフェアのうち、本発明者らによって試験が行われたものは、ヘパスフィア（HepaSphere）^TMマイクロスフェアの商標名で販売されている市販のマイクロスフェアである。ヘパスフィアマイクロスフェアは、酸性環境において酢酸ビニルとアクリル酸メチルから製造される。ドキソルビシンなどの抗がん薬をヘパスフィアマイクロスフェア内に担持させることができ、このマイクロスフェアは、前述のTACE法による患者への送達に適応がある。ヘパスフィアマイクロスフェアは、様々なサイズのものが販売されており、３０〜６０μｍ、５０〜１００μｍ、１００〜１５０μｍおよび１５０〜２００μｍのサイズのものがある。

別の好適なヒドロゲルは、ポリメタクリル酸ナトリウムからなるヒドロゲルコアと、ポリ（ビス［トリフルオロエトキシ］ホスファゼン）の外側シェルとからなるヒドロゲルである。このようなヒドロゲルから形成されたマイクロスフェアのうち、本発明者らによって試験が行われたものは、Boston Scientific社からEmbozene TANDEM^TMの商標名で販売されている市販のマイクロスフェアである。前述のマイクロスフェアと同様に、TACE法で使用するために、ドキソルビシン−HClまたはイリノテカン−HClをEmbozene TANDEMマイクロスフェア内に担持させることができる。Embozene TANDEMは、４０±１０μｍ、７５±１５μｍまたは１００±２５μｍのサイズのものが販売されている。

しかしながら、前述したように、ディーシービーズ、ヘパスフィアマイクロスフェアおよびEmbozene TANDEMマイクロスフェアの内部に担持可能であるとされている持続放出用の分子は、いずれも正に帯電した比較的小さな（約６００Ｄａの）分子であり、これら以外の薬剤は、マイクロスフェア内に適切に保持できないとされている。したがって、ブロメラインやパパインなどのタンパク質分解酵素をマイクロスフェア内に担持でき、このマイクロスフェア内に安定に保持可能であり、次いでこのマイクロスフェアから持続的に溶出できることは全く以て驚くべき事実である。

本発明者らがその存在を認識しており、本発明における使用に好適であろうと考えている別の市販のマイクロスフェアとして、Terumo Europe NV社からLifePearlの商標名で販売されているマイクロスフェアが挙げられる。このマイクロスフェアは、ポリ（エチレングリコール）とアクリル酸３−スルホプロピルのヒドロゲルネットワークからなる。本発明者らは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（PLGA）ヒドロゲルネットワークから形成されたマイクロスフェア、およびポリ乳酸（PLLA）ヒドロゲルネットワークから形成されたマイクロスフェアも、本発明における使用に好適であると考えている。

いくつかの実施形態では、本発明のマイクロスフェアは外側コーティングを含んでいてもよく、このようなコーティングによってマイクロスフェアに有利な特性が付与される。たとえば、プロテアーゼ酵素が溶出し始めるよりも前に溶解する（または除去される）コーティングでマイクロスフェアをコーティングすると有利な場合がある。このように、たとえば、マイクロスフェアの送達後、（たとえば）腫瘍部位に到達して酵素の溶出が始まるまでには時間がかかる。また、マイクロスフェアの送達後、適切な生理的条件（たとえば、標的領域におけるｐＨおよびイオン濃度）に達するまでにマイクロスフェアを保護するコーティングでマイクロスフェアをコーティングすると有利な場合がある。

たとえば、アルギン酸塩からなる外側コーティングを有するマイクロスフェアは、生理的条件に暴露した後の、プロテアーゼ酵素の持続放出の開始を遅らせることができることを本発明者らは見出している。別のコーティング剤、たとえばキトサンを含むコーティング剤なども本発明において有用である可能性がある。

本発明者らは、ガラス製マイクロスフェア、樹脂製マイクロスフェアおよびセラミック製マイクロスフェアも本発明において有用であると予想している。たとえば、TheraSphere（登録商標）の商標名で販売されているガラス製マイクロスフェアは、いくつかの国において、肝細胞癌（HCC）の放射線治療に適応されている。このガラス製マイクロスフェア（直径２０〜３０μｍ）は放射性を有し、肝臓の腫瘍に栄養を供給する動脈内に注入されると、肝臓の毛細血管中で塞栓を起こし、イットリウム９０からの高い放射線量が悪性腫瘍に照射される。本発明者らは、本発明の教示による使用を目的として、ムチンに作用するプロテアーゼを担持できるようにTheraSphereガラス製マイクロスフェアを構成可能であると考えている。同様に、たとえばCeramispheresの商標名で販売されているセラミック製マイクロスフェア、またはたとえばSIR-spheres（登録商標）の商標名で販売されている樹脂製マイクロスフェアも、本発明の教示による使用を目的として、ムチンに作用するプロテアーゼを担持できるように構成可能であると考えている。

いくつかの実施形態では、種類の異なるマイクロスフェアを組み合わせて、患者に共投与してもよいと想定される。種類の異なるマイクロスフェアにおいて、ムチンに作用するプロテアーゼは同一のものであってもよく、異なるものであってもよく、後述するような別の活性薬剤をマイクロスフェアに含有させてもよい。種類の異なるマイクロスフェアは、サイズ、粒度分布および／または組成の点で異なっていてもよい。

本発明においてマイクロスフェアを有用なものとするため、マイクロスフェアは、概して球形で、マイクロメートルオーダーのサイズであることが望ましい。球形のマイクロスフェアは、たとえば、血管を通して送達される際に血流に対する抵抗が低いことから、塞栓術に好適である。さらに、特定の寸法を有する球形の粒子は、特定の体積において高密度になりうる。

マイクロスフェアは、（直径で測定した場合に）マイクロスフェアであると定義されるサイズであればどのようなサイズであってもよく、特定の用途に有用なマイクロスフェアのサイズは、いくつかの要因に応じて決まり、このような要因として、マイクロスフェア内に担持するための、ムチンに作用するプロテアーゼの特性および量（たとえば、担持させるプロテアーゼの量が多いほど、必要なマイクロスフェアの量は多くなる）、ならびにマイクロスフェアの患者への送達経路（たとえば、塞栓術を使用した治療では、塞栓が誘導される血管のサイズによって、マイクロスフェアに必要なサイズが決まる）が挙げられる。当業者であれば理解できるように、マイクロスフェアの各バッチは、常に直径の範囲が規定される。

いくつかの実施形態では、たとえば、マイクロスフェアの直径は、約３０〜約７００μｍであってもよく、腹腔内送達および腹腔での適用には、１０００μｍをわずかに下回る直径が適切な場合がある。いくつかの実施形態では、たとえば、マイクロスフェアの直径は、約３０〜約５００μｍ、約５０〜約４００μｍ、約６０〜約３００μｍ、約８０〜約２００μｍ、約６０〜約１００μｍ、約５０〜約１００μｍ、約４０〜約８０μｍ、約３０〜約６０μｍ、約３０〜約５０μｍまたは約４０〜約１００μｍであってもよい。いくつかの実施形態では、たとえば、マイクロスフェアの直径は、約７００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３００μｍ、約２００μｍ、約１００μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍまたは約３０μｍであってもよい。

一般に、マイクロスフェアのサイズが大きいほど、体腔内経路を介した送達（たとえば腹膜偽粘液腫（PMP）やその他の腹膜がんの治療のための腹腔内送達）においてより有用であり、ムチンに作用するプロテアーゼ（および任意で別の活性薬剤）の量が多いほど有益である。また、一般に、マイクロスフェアのサイズが小さいほど、動脈内送達経路により有用であり、動脈内送達では、マイクロスフェアが動脈内を流れて標的領域で塞栓を形成する。

本発明のマイクロスフェアは、標的領域に送達されると、ムチンに作用するプロテアーゼが持続的に溶出されるように構成されている。持続的な溶出が達成される限り、プロテアーゼが溶出される機構は重要ではない。前述のように、マイクロスフェアは、たとえば、プロテアーゼを溶出可能な細孔を多数有していてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロスフェア自体が生理的条件下で分解することによって、担持されたプロテアーゼが露出されてもよい。

本明細書において、「持続的」は、マイクロスフェア内に含まれ、ムチンに作用する１種または複数種のプロテアーゼが、治療上有益な時間にわたって溶出することを意味する。ムチンに作用するプロテアーゼが担持されたマイクロスフェアが初めて生理的条件に暴露された場合、特定の割合のプロテアーゼが急速に溶出する「バースト放出」が起こることが多いが、その後、プロテアーゼの溶出速度は低下し、マイクロスフェア内に残存したプロテアーゼが、数時間、数日間、あるいは数週間にもわたって溶出する。プロテアーゼの放出速度は、溶出時間の全体を通して一定でなくてもよい。

プロテアーゼがマイクロスフェアから溶出する際の速度と、それにかかる時間は、特定の用途に応じて変動しうる。しかし、通常、少なくとも、標的領域の細胞の複製に要する時間にわたってプロテアーゼが放出されることが望ましい。このように、プロテアーゼ（およびマイクロスフェアに含まれる別の活性薬剤）は、細胞の複製を抑制し、細胞死をもたらすと考えられる。

通常、プロテアーゼが標的領域に送達され溶出した後に排除される速度を考慮に入れる必要がある。たとえば、比較的血流の多い領域に送達した場合、比較的血流の少ない領域に送達した場合よりも、プロテアーゼが速やかに排除されると予想される（ただし、血流量は塞栓により顕著に妨げられる可能性があることに留意されたい）。マイクロスフェアからのプロテアーゼの放出速度は、このような事項を考慮に入れて適合させる必要があると考えられる。

特定の一実施形態では、たとえば、標的領域に送達されたマイクロスフェアからムチンに作用するプロテアーゼを、最大で約１２０時間またはそれ以上の時間にわたって持続的に放出させてもよい。いくつかの実施形態では、たとえば、約１０時間〜約１２０時間、約２０時間〜約１００時間、約３０時間〜約８０時間、約１０時間〜約５０時間、約１５時間〜約４０時間、約１０時間〜約３０時間または約１０時間〜約２０時間にわたって、マイクロスフェアからムチンに作用するプロテアーゼを放出させてもよい。

（プロテアーゼが担持され、サイズに制約がある）本発明のマイクロスフェアにおいて、ムチンに作用するプロテアーゼの含有量は、関連する疾患に治療効果をもたらすことができる量であればどのような量であってもよい。特定のマイクロスフェア内に担持可能なプロテアーゼの量は、通常、放出特性だけでなく、症例ごとに経験則に基づいて決定する必要がある。マイクロスフェア内に担持され、その後、患者の体内に送達される前記プロテアーゼの量は、治療の対象となる疾患の特性、プロテアーゼの持続放出速度、およびプロテアーゼの放出が必要とされる時間などの様々な要因に応じて決定される。

いくつかの実施形態では、プロテアーゼの特定の放出特性を得るため、かつ／または特定の量のプロテアーゼを送達するため、比較的大量のマイクロスフェアを送達する必要がある場合がある。直径３００〜５００μｍのマイクロスフェアを使用してブロメラインを送達する場合、たとえば、６０μＬのマイクロスフェアに約１８００μｇものブロメラインを担持させてもよい。たとえば、特定の部位に局在する腫瘍をブロメラインで治療する場合、ブロメラインを担持させたマイクロスフェアの必要量に影響を及ぼす主な要因として、腫瘍の特性および大きさが挙げられる。

本発明のマイクロスフェアは、患者の体内の標的領域に送達することができる。マイクロスフェアが実質的に無傷のまま、かつムチンに作用するプロテアーゼ（またはその他の薬剤）を内部に保持したままできるだけ失うことなく標的領域に到達することが可能な送達方法を本発明において使用してもよい。

通常、マイクロスフェアは、（治療の対象となる疾患に主に依存して決定される）標的領域に局所送達されるように構成される。このような局所送達により、マイクロスフェアの送達が必要な体内の領域に送達されるマイクロスフェアの個数を最大とすることが可能になり（それに応じて、ムチンに作用するプロテアーゼの量を最大とすることが可能になり）、その結果、治療効果を最大にすることができ、かつ副作用の可能性を最小限に抑えることができる。たとえば、マイクロスフェアは、患者に動脈内送達、病巣内送達、腹腔内送達または体腔内送達（たとえば患者の腹腔または胸膜腔への送達）されるように構成してもよい。その他の体腔内送達経路として、鼻腔内送達経路および気管支内送達経路（嚢胞性線維症などの治療に有用だと考えられる）、膀胱腔内送達経路、または胆管内送達経路（たとえば胆管癌に有用だと考えられる）が挙げられる。

患者の体内の標的領域は、腫瘍であってもよい。腫瘍は、たとえば、患者の腹部（たとえば、患者の膵臓、肝臓、結腸、卵巣または前立腺）に位置していてもよい。腫瘍は、たとえば、患者の肺に位置していてもよい。前述の経動脈化学塞栓療法（TACE）と同様に、このような腫瘍の栄養血管にマイクロスフェアを投与することによって、持続投与期間において、ムチンに作用するプロテアーゼの局所濃度を高くすることができる。さらに長期間にわたる持続放出が治療に有益であれば、マイクロスフェアの追加投与量を送達してもよい。

別の方法において、腹膜偽粘液腫またはその他の腹膜がんを治療する場合、本発明のマイクロスフェアを腹腔内注射により送達してもよい。前述のように、患者の腹腔などの体腔にサイズの大きいマイクロスフェアを送達することができ、これは、高用量のプロテアーゼ（またはその他の薬剤）を投与できることを意味する。

別の方法において、深部静脈血栓症などの血栓症を治療する場合、本発明のマイクロスフェアを注射により血栓部位に送達してもよい。

本発明のマイクロスフェアは、生理的条件に暴露されると、プロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている。当業者であれば理解できるように、様々な投与方法を使用することによって、患者の生体の様々な部位（たとえば動脈内または体腔内）にマイクロスフェアを送達することができ、この場合、マイクロスフェアは様々な生理的条件に暴露されることになる。たとえば、患者の体温は全身でほぼ一定であると考えられるが、（たとえば）ｐＨおよび電解質濃度は動脈と体腔で異なりうる。したがって、当業者であれば、（必要に応じて事前に試験を行うことにより）これらのパラメーターを評価することによって、本発明のマイクロスフェアを生理的条件に応じて適合させることができる。

さらなる薬剤
本発明のマイクロスフェアに含まれ、ムチンに作用するプロテアーゼは、それ自体が有効性を有しているが（すなわち、前述のように、ムチンが関与する疾患に対して効果を発揮するが）、さらなる薬剤と併用してもよい。このようなさらなる薬剤の具体例は後述する。必要に応じて（または有益である場合）、このようなさらなる薬剤の量は、必要に応じて、極めて日常的な試験および実験を実施することにより決定してもよい。

ムチンに作用するプロテアーゼに加えて、さらなる薬剤をマイクロスフェア自体に含有させてもよい（すなわち、プロテアーゼとさらなる薬剤を共担持させる）。あるいは、マイクロスフェアと併用して、患者（つまり標的領域）にさらなる薬剤を送達してもよい（同一の経路または異なる経路を介して、マイクロスフェアとさらなる薬剤を一緒に投与してもよく、（たとえば、任意の順序で連続して）別々に投与してもよい）。さらなる薬剤は、たとえば、マイクロスフェアの担体中に存在していてもよく、マイクロスフェアの表面に化学結合していてもよい。別の方法において、またはこれに加えて、ムチンに作用するプロテアーゼを含むマイクロスフェアとは別のマイクロスフェアにさらなる薬剤を含有させてもよく、これらのマイクロスフェアを組み合わせて患者に送達してもよい（どちらを先に投与してもよく、後に投与してもよく、同時に投与してもよい）。ムチンに作用するプロテアーゼ（ブロメラインなど）を含むマイクロスフェアの腫瘍への局所送達を、たとえば、全身化学療法レジメン（すなわち化学療法剤の経口送達または静脈内送達）と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロスフェアの送達前、送達中または送達後に、（たとえば経口投与または静脈内投与により）さらなる薬剤を全身送達してもよい。

さらなる薬剤は、たとえば、化学療法剤、放射線療法剤、別の粘液溶解剤および造影剤からなる群のうちの１種以上から選択してもよい。以下、各さらなる薬剤について詳細に説明する。

化学療法剤は、がんの治療に使用される薬理学的薬剤である。本発明において有用であると考えられる化学療法剤の例は、WO2014/094041に記載されている（この文献の内容は参照により本明細書に援用される）。本発明において使用してもよい化学療法剤として、具体的には、たとえば、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル（もしくはその類似薬）および／またはシスプラチンが挙げられる。本発明者らは、これらの化学療法剤のうちのいくつかをブロメラインまたは別の粘液溶解剤と共投与した場合に望ましい相乗効果が観察されることを過去に報告しており、このような相乗効果も本発明において利用可能であると想定される。特に、ドキソルビシン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、パクリタキセル、タキソール、オキサリプラチンおよびシスプラチンは、いずれもブロメラインとの相乗効果を示すことが本発明者らによって観察されている。

たとえば、前述のとおり、１種または複数種の化学療法剤が全身送達されるか、同じマイクロスフェアに共担持されるか、あるいは別のマイクロスフェアに担持されるか（同時投与または連続投与）にかかわらず、マイクロスフェア内に担持されたブロメラインを動脈内投与することによって、化学療法の有効性が向上すると期待される。本発明者らは、マイクロスフェアに担持されたブロメラインの標的領域への送達は、肝細胞癌すなわち原発性肝臓がん、肝転移および膵臓がんの代替治療になり、ドキソルビシンなどの化学療法剤の抗腫瘍作用を向上させることができると考えている。

たとえば、送達部位を明示し、かつ／またはムチンに作用するプロテアーゼの有効性を向上させるために、ムチンに作用するプロテアーゼを含むマイクロスフェアと一緒に放射線療法剤を共送達してもよい。たとえば、ブロメラインは公知のPARP阻害剤であり、放射性物質と共投与することによって、放射線によって損傷されたDNAの修復を妨げ、局所的な細胞死をもたらしてもよい。

理論的には、プロテアーゼを含むマイクロスフェア内に放射線療法剤を共担持してもよいが、放射線療法剤を共担持させてもプロテアーゼが損傷を受けず、かつ治療活性に影響が及ばない方法を構築する必要がある。このような共担持ではなく、プロテアーゼを含むマイクロスフェアとは別個に放射線療法剤を患者に送達し、ムチンに作用するプロテアーゼへの放射線による損傷を最小限に抑えてもよい。

たとえば、QuiremSpheres（登録商標）やSIR-spheres（登録商標）Y-90樹脂マイクロスフェアの商標名で市販されているマイクロスフェアなどの、ガラス製スフェア、樹脂製スフェアまたはセラミック製スフェアに放射線療法剤を担持させることにより、別個に提供してもよい。別の方法において（または前述に加えて）、腫瘍の感受性を向上させることができる外部照射放射線療法または密封小線源療法によって、放射線療法剤を共送達してもよい。

前述のように、粘液溶解剤は、（たとえば破壊や溶解などにより）粘液に作用し、現在、呼吸困難の軽減を促すために使用されている。ムチンに作用するプロテアーゼは粘液溶解剤の一種であるが、本明細書で述べる粘液溶解剤は、本発明の説明において、酵素性薬剤ではないと定義され、この点において、ムチンに作用するプロテアーゼとは異なるものである。このような粘液溶解剤を、ムチンに作用するプロテアーゼと組み合わせると有利である可能性があり、このような態様のいくつかを本明細書で説明している。

本発明者らのうちの何名かによるWO2014/094041では、粘液溶解剤（Ｎ−アセチルシステインなど）または化学療法剤とブロメラインを一緒に投与した場合のブロメラインの有益な効果について述べている。ブロメラインと粘液溶解剤の組み合わせは、ムチン産生がん細胞に対する化学療法剤の効果および細胞傷害性を顕著に増強すること、がん細胞の生存能力と増殖に対して直接的な抗腫瘍作用および抑制作用を発揮すること、腫瘍によるムチンの産生に顕著な影響を与えること、ならびに腫瘍から産生されるムチンの液化に非常に効果的であることが判明している。ブロメラインの利点として、がん細胞への化学療法剤の浸透性の向上、腫瘍間質への化学療法剤の浸透性の向上、および特定の化学療法剤との相乗効果が認められた。また、ブロメラインは、特に線維被膜を有する腫瘍または癒着に囲まれた腫瘍において、腫瘍への進入を容易にするという利点もある。

本発明者らのうちの何名かによるWO2017/063023（この文献の内容は参照により本明細書に援用される）では、粘液溶解剤であるシステアミン（またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ）と一緒にブロメラインを投与した場合に、ブロメラインの驚くべき予想外の相乗効果が認められることを述べている。この組み合わせは、固形腫瘍または硬い腫瘍の治療に非常に効果的であることが明らかとなった。

本発明のマイクロスフェアが粘液溶解剤を含んでいる場合、本発明のマイクロスフェアは、（前述したような）ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、滲出性中耳炎（グルーイヤー）、嚢胞性線維症、痰貯留、胸部感染症、胆道ステント／膵臓ステントの留置に伴う粘液貯留および細胞残屑などの、ムチンが関与する疾患；ならびに血友病、心筋梗塞、冠動脈疾患、脳卒中、広範型肺塞栓症、急性虚血肢、ステント血栓症または関節血症などの、血栓が関与する疾患の治療に対する有効性がさらに向上すると考えられる。これらの疾患は、ムチンに作用するプロテアーゼを単独で使用して治療することもできるが、さらなる粘液溶解剤を共投与することによって治療の有効性が向上することがある。

粘液溶解剤は、たとえば、ムチンのジスルフィド結合を低減または破壊するチオール含有粘液溶解剤であってもよい。粘液溶解剤の具体例としては、Ｎ−アセチルシステイン（「NAC」）、システアミン、ナシステリン、メルカプトエタンスルホン酸塩、カルボシステイン、N-acystelyn、エルドステイン、ドルナーゼα、ゲルゾリン、サイモシンＰ４、デキストランおよびヘパリンが挙げられる。NACは、抗酸化剤および抗遺伝毒性剤でもあり、ヒト患者の主に呼吸器疾患において高用量での長期安全性が十分に確立されている。別の粘液溶解剤は、WO2014/094041およびWO2017/063023に記載されている（これらの文献は参照により本明細書に援用される）。

造影剤を使用することによって、たとえば、送達されたマイクロスフェアの位置を検出できたり、正確な投与部位を特定することができたりする利点がある場合、マイクロスフェアに造影剤を含有させてもよい。造影剤の蛍光によって、正確な部位を視覚的に確認することが容易になり、用量分布の確認も容易になると考えられる。

マイクロスフェアの形成方法
本発明は、さらに、ムチンに作用するプロテアーゼをマイクロスフェア内に担持する方法を提供する。この方法は、酸性ｐＨを有し、任意で患者の体内の標的領域と同等のイオン強度を有する溶液に、マイクロスフェアを加える工程；前記マイクロスフェアを含む前記溶液を、ムチンに作用するプロテアーゼを含む溶液と混合する工程；および前記ムチンに作用するプロテアーゼが前記マイクロスフェア内に担持されるのに十分な時間にわたって前記混合物を振盪する工程を含む。

本発明者らは、ムチンに作用するプロテアーゼをマイクロスフェア内に担持する際のｐＨが、担持可能なプロテアーゼの量に影響を及ぼすことがあり、その後の生理的条件に暴露された際のプロテアーゼの放出速度にも影響を及ぼすことがあることを発見した。ブロメラインの場合、たとえば、ｐＨを低下させると、マイクロスフェア内への担持量が多くなり、標的領域に送達された後では放出速度が遅くなることが明らかになった。特定の理論に拘束されるものではないが、これらの効果は、ｐＨが低いほどブロメラインの正味電荷が増加することによるものであり、かつ／またはｐＨを低下させると孔径に影響が及ぶことから、マイクロスフェアの放出パターンに影響が及ぶと本発明者らは推測している。

この点において、ムチンに作用するプロテアーゼがブロメラインである場合、ｐＨ２またはｐＨ２．５といった低いｐＨでプロテアーゼを担持させると有利となりうることが、本発明者らの予備実験において示されている。

同様に、本発明者らは、ムチンに作用するプロテアーゼをマイクロスフェア内に担持させる際の担持用溶媒が、その後の生理的条件に暴露された際のプロテアーゼの放出速度に影響を及ぼしうることを発見した。

本発明者らは、通常、患者の体内の標的領域と同等であると予測されるイオン濃度および酸性ｐＨを有する担持用溶媒を使用することによって、マイクロスフェア内にプロテアーゼを良好に担持させることができ、その後にプロテアーゼを持続放出させることができることを見出している。ブロメラインまたはパパインを特定のマイクロスフェア内に担持させた具体例は、実施例でより詳細に説明する。

医薬組成物
本発明は、さらに、医薬組成物であって、患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェア（たとえば前述のマイクロスフェア）と薬学的に許容される担体とを含み、該マイクロスフェアが、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持し、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体は、該医薬組成物の投与経路に応じて決定される。液状製剤としては、液剤、懸濁剤および乳剤を挙げることができ、たとえば、非経口注射用、腹腔内投与用または腹腔内注射用の水溶液またはプロピレングリコール水溶液を挙げることができる。本発明の医薬組成物に使用される好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、デキストロース溶液、リンゲル液などが挙げられる。

本発明のマイクロスフェアを含む液状製剤およびエアロゾル製剤は、たとえば嚢胞性線維症の治療における鼻腔内投与にも有用であると考えられる。吸入に適したエアロゾル製剤としては、たとえば、液剤および粉末状固形物を挙げることができ、圧縮された不活性ガス（たとえば窒素ガス）などの薬学的に許容される担体と組み合わせてもよい。

患者への送達に適した医薬組成物は、患者の体内に送達する直前に調製してもよく、あるいは予め調製し、送達するまで適切に保存しておいてもよい。

本発明の医薬組成物および医薬品は、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてもよい。これらの担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントは、本発明の医薬組成物または医薬品のその他の成分およびその送達方法と適合性の点において「許容される」ものでなければならず、通常、レシピエントに対して無害である。いくつかの実施形態での使用に適切であると考えられる薬学的に許容される担体または希釈剤としては、脱イオン水または蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油などの植物性油；ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはヤシ油などのゴマ油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンなどのポリシロキサン類を含むシリコーン油；揮発性シリコーン；液体パラフィン、軟パラフィン、スクアランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；エタノールやイソプロパノールなどの低級アルカノール；低級アラルカノール；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなどの低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアラビアゴム；およびワセリンが挙げられるが、これらに限定されない。通常、１種または複数種の担体は、本発明の医薬組成物または医薬品の約１０重量％〜約９９．９重量％を占める。

本発明のマイクロスフェアまたは医薬組成物中の成分のいくつかは、その代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグの形態で提供することが適切な場合、このような形態で提供してもよい。

本発明のマイクロスフェア中の成分の「代謝物」とは、代謝中間体および代謝生成物を指す。

薬学的に許容される担体や賦形剤などにおける「薬学的に許容される」とは、薬理学的に許容され、前記の特定の化合物が投与される対象に対して実質的に毒性を有していないことを意味する。

「薬学的に許容される塩」とは、元の成分の生物学的有効性および生物学的特性を保持している従来の酸付加塩または塩基付加塩を指し、適切で毒性のない有機酸、無機酸、有機塩基または無機塩基から形成される。酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来する塩、およびｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩の例としては、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および第４級水酸化アンモニウム（水酸化テトラメチルアンモニウムなど）に由来する塩が挙げられる。医薬化合物（すなわち薬剤）を化学修飾して塩の形態に変換することによって、化合物の物理的安定性、化学的安定性、吸湿性、流動性および溶解性を改善する技術は薬剤師によく知られている。たとえば、H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995)のp.196およびp.1456〜1457を参照されたい（この文献は参照により本明細書に援用される）。

本発明のマイクロスフェアまたは医薬組成物中の成分のいくつかが、「プロドラッグ」または「溶媒和物」である場合も想定される。「プロドラッグ」は、インビボで変換されて、本発明により所望される化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を生じる化合物（たとえば薬物前駆物質）を意味する。この変換は様々な機構（たとえば、代謝や化学的プロセス）で起こりうる。プロドラッグの使用に関する考察は、A.C.S. Symposium Series のT. Higuchi and W. Stella, “Prodrugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14、およびBioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987で述べられている。

治療方法
本発明は、さらに、ムチンに作用するプロテアーゼの活性が治療に有効なムチン関連疾患およびムチン関連状態を治療する方法を提供する。たとえば、ブロメラインは、ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、深部静脈血栓症および血液凝固障害の治療に対して、治療に有効な活性を有する。さらに、ブロメラインを別の化学療法剤と共投与すると、この化学療法剤が腫瘍内に浸透しやすくなるため、さらに有効性が向上する。パパインは、いくつかのムチン産生がんやその他の状態の治療に対して治療に有効な活性を有する。ムチンに有効なその他のプロテアーゼも類似の活性を有すると予想され、本明細書の記載に従って、このようなプロテアーゼを持続的に局所送達することにより、利点を得ることができる（たとえば、全身送達に関連する問題を解決または改善することができる）。

本発明は、患者のムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患を治療する方法を提供する（前述したように、マイクロスフェアに担持されるプロテアーゼの種類に応じて治療可能なその他の疾患または状態も含む）。この方法は、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持するマイクロスフェア（たとえば前述のマイクロスフェア）の治療有効量を患者に投与する工程を含み、このマイクロスフェアは、投与後に、該プロテアーゼを持続的に放出するように構成されている。

前述のように、ブロメラインには、抗がん活性などの様々な治療上のベネフィットがあるが、全身投与した場合に副作用が生じるため、臨床試験段階に入れずにいる。しかし、ブロメラインを含むマイクロスフェアは、治療を必要とする生体領域を特異的な標的とすることができ、（全身投与に必要とされる量と比べて）比較的少量のブロメラインを局所送達することができ、副作用を顕著に軽減することができると考えられる。ブロメラインを含むマイクロスフェアが治療に有効ながんとしては、前述のとおり、肝細胞癌、膵臓がんおよび大腸がんなどの、血液供給が多いがんが挙げられる。

前記方法は、マイクロスフェアの動脈内送達を含んでいてもよく、この方法では、（他の部位に通じる血管を閉塞しないように）腫瘍の栄養血管のできるだけ近くにカテーテルを予め配置し、このカテーテルを通してマイクロスフェアを注入する。このようにして、マイクロスフェアは、腫瘍内に直接（またはその極めて近傍に）送達され、送達部位において塞栓を形成し、ブロメライン（またはムチンに作用するその他のプロテアーゼ）を持続的に放出する。このような方法は、前述した経動脈化学塞栓療法（TACE）において現在実施されている方法に類似している。

ムチンに作用するプロテアーゼを担持したマイクロスフェアを腫瘍内に直接注入（病巣内注入）することも、有用な送達方法であると考えられる。このようにして、ムチンに作用するプロテアーゼを治療に有効な投与量で比較的大量に腫瘍へと直接送達してもよく、その有効性を最大限に発揮させつつ、ほとんど標的化されない送達方法に伴う副作用のリスクを最小限に抑えることができる。

この方法は、患者の体腔（たとえば腹腔または胸膜腔）へのマイクロスフェアの体腔内送達を含んでいてもよい。前述のとおり、このような方法は、腹膜偽粘液腫やその他の腹膜がん、または肺もしくは胸膜に関連するがんの治療に特に有用であると考えられる。本発明のマイクロスフェアまたは医薬組成物を、脊髄内注射、皮下注射または筋肉内注射などの経路でレシピエントに投与してもよい。

本明細書において、「治療有効量」は、本発明において使用される薬剤または組成物の、毒性を発揮することなく所望の治療効果をもたらすのに十分な量を意味する。必要とされる正確な投与量は、様々な要因に応じて対象ごとに異なり、このような要因として、治療の対象となる動物種、対象の年齢や全身状態、治療の対象となる疾患の重症度、投与される特定の薬剤、投与方法などが挙げられる。したがって、すべての実施形態に適用できる正確な「有効量」を定義することは不可能である。しかし、どのような症例であっても、適切な「有効量」は、当業者が日常的な実験を行うだけで決定することができる。

通常、本発明のマイクロスフェアおよび医薬組成物は、投与経路およびレシピエントの身体的特性（健康状態など）に適合し、かつ所望の効果が誘導されるような方法で投与することができる。たとえば、適切な投与量は、対象の身体的特性（たとえば、年齢、体重、性別など）、単剤療法または補助療法としての薬剤、組成物または医薬品の使用、治療の対象となる疾患または状態の進行度（すなわち病状）、当業者であれば容易に理解できるその他の要因など（ただし、これらに限定されない）の様々な要因に応じて決定してもよい。薬剤、組成物および医薬品の適切な投与量を決める際に考慮される様々な一般的な事項は、たとえば、Gennaro et al. (Eds), (1990), “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USAおよびGilman et al., (Eds), (1990), “Goodman And Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics” Pergamon Pressに記載されている。

本発明のマイクロスフェアは、通常、所望の目的を達成するのに有効な量で投与してもよい。より具体的には、本発明のマイクロスフェアは治療有効量で投与してもよく、これは、標的とする疾患または状態の発症を予防するのに有効な量、または標的とする疾患または状態の既存の症状を緩和するのに有効な量であることを意味する。有効量の決定は、当業者であれば容易に行うことができる。たとえば、特定のマイクロスフェアの治療に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイを利用して推定することができる。たとえば、細胞培養で求められたIC50を含む血中濃度範囲が達成されるように、特定の投与量を動物モデルに対して処方することができる。このような情報を利用して、ヒトなどの哺乳動物の対象に有用な投与量をより正確に決定することができる。

通常、本発明のマイクロスフェアは、治療効果が得られる特定の量で患者に投与してもよい。治療効果の特性は、治療の対象となるムチン関連疾患またはムチン関連状態や、投与されるムチンに作用するプロテアーゼなどの要因に左右される。たとえば、腫瘍を治療する場合、適切な投与量を決定する際に、体重よりも腫瘍の体積などの要因を考慮に入れることがより適切であると本発明者らは考えている。たとえば、膵臓腫瘍の平均的な大きさは、約２０ｃｍ^３±１６ｃｍ^３であると推定される。（たとえば）膵臓細胞に対して十分な細胞傷害作用を発揮するのに必要な（インビトロで測定された）ブロメラインの濃度は、２０μｇ／ｍＬを超える必要があるため、２０ｃｍ^３の大きさの腫瘍に対して４００μｇを超えるブロメラインを局所送達するのに十分な量のブロメラインをマイクロスフェアから送達する必要がある（これは、ブロメラインを単独で使用した場合の量であり、化学療法剤と併用する場合、必要な量は少なくなる場合があることに留意されたい）。また、前述のように、標的領域からのプロテアーゼのクリアランス速度も、腫瘍へのプロテアーゼの送達量および送達速度の計算の際に考慮に入れる必要がある。

通常、治療用途において、病状または状態が継続している期間に治療を行ってもよい。さらに、当業者であれば、最適な投与量および各投与間の間隔は、治療の対象となる病状または状態の特性とその程度；投与形態、投与経路および投与部位；治療の対象となる特定の対象の特性に応じて決定できることを容易に理解できるであろう。最適な投与量は、従来技術を使用して決定することができる。当業者であれば、治療計画を決定するための従来の試験を使用して、投与計画が最適であるか否かを確認できることも容易に理解できるであろう。

２種以上のもの（たとえば薬剤や医薬品）を「一緒に」対象に投与する場合、単一の組成物としてこれらを同時に投与してもよく、別々の組成物として同時に投与してもよく、別々の組成物として別の時間に投与してもよく、別の時間に投与する場合は、どちらを先に投与してもよく、どちらを後で投与してもよい。

たとえば、本発明の特定の実施形態は、マイクロスフェアまたは医薬組成物を、複数回の投与量に分けて投与することを含んでいてもよい。したがって、本明細書に記載の治療方法は、複数回に分けた投与量を所定の期間にわたって対象に投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、プライミング用量を投与することを含んでいてもよく、その後にブースター用量を投与してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のマイクロスフェアまたは医薬組成物を、少なくとも１回、２回、３回またはそれ以上の回数で投与してもよい。

治療に有効な投与量とは、治療中の対象の症状を緩和し、かつ／またはその生存を延長するのに必要とされるマイクロスフェア（およびムチンに作用するプロテアーゼ）の量を指す。酵素などの毒性と治療有効性は、細胞培養における標準的な薬学的アッセイおよび／または実験動物により測定することができる（たとえばＬＤ５０（集団の５０％が死に至る投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある投与量）を求めることによって測定することができる）。毒性作用を有する投与量と治療作用を有する投与量の比率は、ＬＤ５０とＥＤ５０の比率で表すことのできる治療指数である。高い治療指数を示す薬剤、組成物および医薬品が好ましい。細胞培養アッセイおよび／または動物試験から得られたデータを使用して、ヒトまたはその他の哺乳動物において使用するための投与量範囲を求めてもよい。このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を含み、かつ毒性が見られないか、毒性がほとんどない血中濃度範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて前記範囲内で変動しうる。正確な処方、投与経路および投与量は、対象の状態を考慮して、担当医師により難なく選択することができる（たとえば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1のFinglら(1975)による記載を参照されたい（この文献は参照により本明細書に援用される）。

本発明を使用して適切な患者または対象を治療してもよい。いくつかの実施形態では、患者は哺乳類の対象である。通常、患者はヒト患者であるが、その他の対象も本発明による恩恵を受けてもよい。たとえば、対象は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または社会的、経済的または研究に重要なその他の哺乳動物であってもよい。

実験結果
ブロメラインまたはパパインの形態の、ムチンに作用するプロテアーゼを市販のマイクロスフェア内に担持させ、次いで生理的条件に暴露することによって該プロテアーゼを持続的に溶出させることに成功した本発明者らによる実験を以下で述べる。

実施例１−ポリビニルアルコール（PVA）ヒドロゲルからなるマイクロスフェアであるディーシービーズ内へのブロメラインまたはパパインの担持
ディーシービーズ（登録商標）という商標名で市販されているPVAヒドロゲルマイクロスフェアを、100〜300μmまたは300〜500μmの２種のサイズで使用して、以下の実験を行った。これらのビーズ内へのブロメラインの担持と、その後の放出を調べた。

実験１：300〜500μmのPVAビーズ（ディーシービーズ）
3mg/ml、5mg/mlまたは10mg/mlのブロメラインを含む３種の溶液をPVAヒドロゲルビーズ（300〜500μmのディーシービーズ）100μlにそれぞれ加え、激しく振盪しながら室温（23℃）で24時間インキュベートした。24時間インキュベーション後に各溶液中に残存したブロメラインの量を分析し、どのぐらいの量のブロメラインがビーズ内に担持されたのかを測定した。

この分析の後、ブロメラインが担持された各バッチのビーズを蒸留水で穏やかに洗浄し、次いで37℃の蒸留水5ml中でブロメラインを放出させた。一定時間経過ごとに各溶液から250μlずつ採取し、採取した量と同じ量の新鮮な蒸留水を各溶液に補充した。各時間点において採取した溶液をアゾカゼインアッセイにより分析し、ビーズから放出されたブロメラインの量を測定した。この分析の結果を以下の表１およびグラフ１に示す。

グラフから見て取れるように、初期のバースト放出が起こった後、残りのブロメラインがマイクロスフェアから持続的に放出されることが観察され、特に、低濃度のブロメラインを担持させたマイクロスフェアでこの傾向が見られた。この結果から、ディーシービーズ内に担持可能なブロメラインの量が判明し、担持量が多いほどバースト放出が増加することが分かった。

実験２：100〜300μmのPVAビーズ（ディーシービーズ）
実験１と同様にして、1.0mg/mlまたは3.0mg/mlのブロメラインを蒸留水中に含むブロメライン溶液200μlを、PVAヒドロゲルビーズ（100〜300μmのディーシービーズ）60μlに加え、振盪しながら室温（23℃）で24時間インキュベートした。

200μlのブロメライン溶液からビーズを回収して洗浄した後、pH7.0の蒸留水5mlに加え、溶出を開始させた。一定時間経過ごとに、この溶液から250μlずつ採取し、採取した量と同じ量の新鮮な蒸留水を各溶液に補充した。実験１と同様にして、各時間点において採取した溶液を使用してブロメラインを分析した。この分析の結果を以下の表２およびグラフ２に示す。

ブロメラインの放出速度は、経過時間に対してプロットしたブロメライン（グラフ）において、最初の30分間が経過した後の線形増加から算出する。この実験では、バースト放出が比較的小さいことが判明し、これは恐らく、ブロメラインを蒸留水中で放出させる前にビーズを洗浄したことによるものと考えられる。

実験１および実験２で述べた実験結果から、比較的多くの量のブロメラインを様々なサイズのディーシービーズ内に担持させることができ、担持させたブロメラインは、（初期のバースト放出が見られたものの、その後は）持続的に放出されることを実証することができた。

実験３−PVAヒドロゲルからなるディーシービーズ（300〜500μm）から溶出されたブロメラインの耐久性およびタンパク質分解活性の測定
以下の方法を使用して、ディーシービーズ（300〜500μm）内にブロメラインを担持させた。PVAヒドロゲルビーズ（80μl）を1.0mlの蒸留水で洗浄した後、ブロメライン溶液（1.0mg/ml、pH3.7）200μl中に浸漬し、激しく振盪しながら23℃で24時間インキュベートした。このブロメライン溶液から100μlを採取し、アゾカゼインアッセイを使用して、ブロメラインのタンパク質分解活性を分析した。この分析結果から、合計197μg（ほぼ100%）のブロメラインがマイクロスフェア内に担持されたことが示された。

次に、このようにして担持されたブロメラインを、以下のようにして、PVAビーズであるディーシービーズから溶出させた。ブロメラインを担持させたビーズを注意深く回収し、50mlの遠心管に入れた5.0mlの蒸留水（pH7.0）中に浸漬させた。ビーズを入れた遠心管を37℃の水浴に浸し、連続的に振盪した。30分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間ごとなどに、遠心管中の溶液から250μLずつ採取し、採取した量（250μL）と同じ量のpH7.0に調整した蒸留水を採取毎に補充した。各時間点において採取した溶液を使用して、ブロメラインを分析した。以下のグラフ３に結果を示す。

上記のグラフ３から見て取れるように、アゾカゼインアッセイで分析したところ、ブロメラインは、ほぼ77時間にわたってビーズから放出され、その後、タンパク質分解活性は認められなかった。これは、残存するブロメラインが、ヒドロゲルビーズ内に閉じ込められていたか、あるいはビーズから依然として放出されていたものの、恐らくは76時間を超えて37℃で維持したこと、または振盪の影響によって、タンパク質分解活性を失ったものと考えられる。しかしながら、ブロメラインは比較的熱に弱く、ほぼ80時間にわたって37℃でタンパク質分解活性が維持されたことは、本発明者らにとって驚くべき知見であった。

上記の時間内において、マイクロスフェア内に担持されたブロメラインの約37%（66μg）が、活性な形態（すなわちタンパク質分解活性を有する形態）で放出された。

3.0mg/mlのブロメライン溶液を使用して同様の操作を実施し、このブロメライン溶液200μl中にディーシービーズ（300〜500μm）60μlを浸漬させた。この実験の結果を以下のグラフ４に示す。

グラフから見て取れるように、3.0mg/mlのブロメライン溶液200μl中にディーシービーズ（300〜500μm）60μlを24時間にわたって浸漬した場合、288μg（48%）のブロメラインを担持させることができた。また、実験３と同様に溶出試験を行ったところ、活性なブロメライン（アゾカゼインアッセイで評価）が、108時間にわたってマイクロスフェアから溶出され、約55%（158μg）のブロメラインが前記時間にわたってマイクロスフェアから拡散したことが示された。

実験４−ポリビニルアルコールヒドロゲルからなるディーシービーズ（300〜500μm）内へのパパインの担持
ディーシービーズ（300〜500μm）80μLを1.5mLの遠心管に入れ、蒸留水で２回洗浄した。5mg/mLのパパイン溶液200μLを加え、混合物を緩やかに振盪しながら室温で６時間インキュベートした。次に、蒸留水でビーズを２回洗浄し、pH6.5のPBS5mL中に懸濁した。最初の試料として、30分後に250μLを採取し、以降の16時間は１時間ごとに試料を採取した。試料の採取毎に、250μLのPBSを補充した。試料中のパパイン濃度をアゾカゼインアッセイで測定し、ディーシービーズからのパパインの放出の累積量を時間の関数として以下のグラフに示した。

グラフ５から見て取れるように、パパインの持続放出が達成され、16時間を超えて持続放出が継続した。

次に、ビーズから放出されたパパインの有効性を測定するための実験を行った。この実験では、HT29細胞（ヒト大腸癌細胞株）を24ウェルプレートに播種した。24時間後、5mg/mlのパパイン（ビーズ80μlあたり500μg）を担持させたビーズをトランスウェルチャンバーに入れ、HT29細胞を播種したプレートをこのビーズで処理した。ビーズを入れたトランスウェルチャンバーを、３時間ごとに新たなウェルに移した。この操作を最大で３日間継続した。この実験から、ディーシービーズから放出されたパパインはタンパク質分解活性を維持しており、３時間後にトランスウェルチャンバー内のすべての細胞を死滅させたことが示された。

実験５−放出溶媒量および試料量が100〜300μmのディーシービーズからのブロメラインの放出に及ぼす影響の測定
腫瘍にインビボ送達される最初の薬剤濃度は、主に腫瘍の大きさに応じて決定され、その後の体液中の薬剤濃度は、生体の体積（生体の重量）によって決まる。患者の体内の様々な標的領域からの薬剤のクリアランス速度は、臓器ごとに異なる潅流量（血液の供給量）によって決まる。以下で述べるモデル（グラフ６.０、グラフ６.１、グラフ６.２、グラフ６.３および表３）は、体液中へのブロメラインの初期放出と、その後のクリアランス速度を示したものである。

前述の方法と同様にして、60μlのPVAビーズ（100〜300μm）内に81.0μgのブロメラインを担持させた。次に、PBS（pH7.4、37℃）20mL中にビーズを加え、溶出したブロメラインの量を時間の関数として測定した。先の実験と同様に、様々な時点において250μlの試料を採取し、溶出溶媒の量を維持するため、採取した量と同じ量のPBSを加えた。各時間点において採取した試料を使用して、ブロメラインの含量を分析した。上記のグラフ（グラフ６.０）から見て取れるように、20mlのPBS（pH7.4）中へのブロメラインの放出では、最初の30分間に30μgのバースト放出が示され、その後の28時間は徐放（dx/dt）＝1.78μg/時間が観察された。

ブロメラインを担持した同じビーズをPBS（pH7.4、37℃）5mL中に加え、溶出したブロメラインの量を時間の関数として測定した。グラフ６.１に結果を示す。グラフから見て取れるように、最初の30分間に８μgが放出され（バースト放出）、その後の37時間は徐放（グラフの直線部分）が観察された。dx/dt=58/37=1.57μg/時間。

このモデル（すなわちグラフ６.１に示したモデル）において、放出溶媒（pH7.4のPBS）の量はわずか5.0mlであったため、このモデルの４倍の量を使用した先のモデル（グラフ７.０）と比較すると、初期のバースト放出は非常に少なかった。この結果から、放出溶媒の量を少なくすると、バースト放出において溶出されるブロメラインの量が減少することが示された。

ブロメラインを担持した同じビーズをPBS（pH7.4、37℃）20mL中に加え、試料を採取して、溶出したブロメラインの量を時間の関数として測定した。なお、この実験では、先の実験よりも高い血流量または高い薬剤クリアランス速度を有する患者の体内の標的領域を模倣するため、試料量を250μLではなく、500μLとした。（以下の）グラフ６.２から見て取れるように、この実験ではdx/dt=2.45μg/時間となり、担持させた81μgのブロメラインの全量が23時間以内に60μlのPVAビーズから放出された。

これらの一連の実験の最後に、ブロメラインを担持した同じビーズをPBS（pH7.4、37℃）20mL中に加え、試料を採取して、溶出したブロメラインの量を時間の関数として測定した。なお、この実験では、さらに高い血流量または高い薬剤クリアランス速度を有する患者の体内の標的領域を模倣するため、試料量を500μLや250μLではなく、１mLとした。この実験の結果を上記のグラフ６.３に示す。グラフから見て取れるように、使用したその他の放出モデルと比較して、試料量が最も多かったことから（血流量またはクリアランスが高いことを示す）、担持させた81μgのブロメラインの全量が17時間以内に放出された（dx/dt=4.5μg/時間）。

インビボにおける放出速度および放出量の選択は、生体の体積、代謝速度、臓器における灌流量、pH、ビーズの送達部位などの様々な要因によって左右される。ムチンに作用するプロテアーゼが溶出した際のインビボにおけるクリアランス速度は、適切な投与計画を決定するための重要な要因になる。ここまでで説明した実験は、標的領域において増加した血流量を模擬する目的で実施されたものであり、放出溶媒量の選択によって、初期バーストの程度が変わり、試料量（すなわちインビボでのクリアランス速度）によってその後の放出速度が変わる（グラフ７参照）ことが示された。

実験６−ブロメライン担持用溶液のpHがマイクロスフェアの放出特性に及ぼす影響の測定
以下の実験では、pH2.5、pH3.4またはpH4.0といった様々なpHレベルのブロメライン溶液を使用して、300〜500μmのディーシービーズにブロメラインを担持させた。次に、ブロメラインを担持させたディーシービーズを5.0mlのPBS（pH6.5）に加えた。一定時間経過ごとに、各溶液から250μlずつ試料を採取し、採取した量と同じ量の新鮮なPBSを各溶液に補充した。この実験の結果をグラフ８および表４に示す。

この実験では、バースト放出およびその後のブロメラインの放出速度に対して、担持用溶液のpHが影響を及ぼすことが示された。これら３種のpHレベルにおいて担持量は非常によく似ていたが、放出速度は、担持用溶液のpHが2.5の場合に非常に遅くなり、担持用溶液がpH3.4およびpH4.0の場合に非常によく似た結果となった。

実験７−PVAヒドロゲルからなるディーシービーズ（100〜300μm）へのブロメラインの担持およびディーシービーズからのブロメラインの放出に及ぼすpHの影響の測定
水（pH2.8、pH3.0もしくはpH3.2）またはPBS（pH2.77）中で調製したブロメライン溶液（3.0mg/ml）200μlを100〜300μmのディーシービーズ（60μl）に加え、シェーカー上で振盪しながら周囲温度の室温（25℃）で24時間インキュベートすることによって、ディーシービーズにブロメラインを担持させた。次に、ピペットを使用して、ブロメライン溶液を注意深く採取し、残存していたブロメラインを分析し、ビーズへの総担持量を測定した。この実験の結果を以下の表５にまとめた。

次に、このPVAビーズを10mlのPBS（pH6.5）に加え、37℃の水浴中で緩やかに振盪した。ブロメラインのバースト放出を測定するため、30分後に溶液を500μl採取し、分析を行った（溶液量を一定に保つため、新鮮なPBS500μlを加えた）。その後、１時間ごとに、同様の操作を行ってブロメラインを分析した。この実験結果を以下のグラフ９および表５に示す。

pH2.77のPBS中に溶解したブロメラインを使用した場合の担持量（%）はほぼ100%であり、このことから、この方法は、ブロメラインの効率的な担持に使用できる良法である可能性が示された。さらに、これと同時に、今回調査したpHのブロメライン水溶液も非常に効率的にブロメラインを担持させることができ、担持効率は86〜89%の範囲であった。

その他のpHにおける水中での担持またはPBS（pH2.77）中での担持と比較して、pH2.8の水中でブロメラインを担持させた場合にバースト放出が最も少なくなる。しかしながら、総担持量あたりの割合（%）としてバースト放出を比較した場合、pH2.8の水中での担持およびpH2.77のPBSでの担持は同じ結果となると見られる。

実験８−PVAヒドロゲルからなるディーシービーズ（100〜300μm）へのブロメラインの担持およびディーシービーズからのブロメラインの放出に及ぼす担持用PBS溶液のpHの影響の測定
pH2.0、pH2.2、pH2.4またはpH2.6のPBS中でブロメライン溶液（3.0mg/ml）を別々の試料として調製した。各ブロメライン溶液200μlにディーシービーズ（100〜300μm）60μlを加え、撹拌機上において周囲温度の室温（23℃）で24時間振盪した。各試料から上清液200μlを注意深く採取し、アゾカゼインアッセイを使用して、試料中に残存していたブロメライン含量を分析することにより、ビーズに吸着したブロメラインの量を定量した。

各ビーズを10mlのPBS（pH6.5）に加え、30分後、それ以降は１時間後、２時間後、３時間後などに各溶液を500μl採取し（これと同時に、採取した量と同じ500μlの新鮮なPBSを補充し）、バースト放出を評価した。ブロメラインの放出が確認できなくなるまで、500μlのPBS中に溶出されたブロメラインを経時的に定量した（アゾカゼインアッセイによりタンパク質分解活性を測定した）。この実験の結果を以下のグラフおよび表に示す（グラフ１０、表６.０、表６.１、表６.２）。担持用溶液の酸性度が高いほど、より長時間にわたって持続的に放出されると見られる（グラフ８と比較されたい）。

バースト放出後のブロメラインの放出速度を12時間ごとの区間に分け、経過時間に対してプロットしたグラフの直線部分からブロメラインの溶出速度を算出した。

グラフから見て取れるように、マイクロスフェア内にブロメラインを担持する際のpHは、担持可能なブロメラインの量、バースト放出、およびその後の担持されたブロメラインの溶出速度に影響を及ぼす。したがって、担持用溶媒のpHを調整することによって、特定の患者および治療計画に適切となるように、マイクロスフェアの溶出特性を調節してもよい。

たとえば、膵臓腫瘍の平均的な大きさは、約20cm³±16cm³であると推定される。pH2.6においてブロメライン（3.0mg/ml）を担持させた100〜300μmのディーシービーズ60μlを使用して、120μgをバースト放出させると、腫瘍におけるブロメラインの濃度は実質的に120/20=6μg/mlとなる。しかしながら、ブロメラインを単独投与する場合、腫瘍細胞に対する単剤として十分な細胞傷害作用を発揮させるには、20μg/mlを超える濃度のブロメラインが必要とされる（インビトロ試験において、PANC-1細胞に対するIC50値は18μg/mlであり、IC75値は50μg/mlである）。したがって、20cm³の大きさの腫瘍に対するブロメラインの濃度を60μg/mlに上昇させるには、ブロメラインを担持したビーズが600μl必要であると考えられる。

バースト放出後、100〜300μmのディーシービーズ60μlから5.33μg/時間のブロメラインが放出され、ビーズの量を10倍にすると（600μl）、最初の12時間で実質的に53.3μg/時間のブロメラインが放出されると考えられる。クリアランスが53.3μg/時間であると仮定すると、その後、少なくとも12時間にわたって60μg/mlのブロメラインを定常状態で維持することができ、その後の放出量は毎時約0.007%ずつ減少する。

80kgの痩せた患者の血液量は、約６Ｌであると考えられ、ブロメラインの放出量が53μg/時間だとすると、約8.83ng/mlに希釈され、そのうちの大部分が、アルブミン、アンチトリプシンおよびマクログロブリンと結合する。血液凝固パラメーターに対する毒性が問題になる可能性があるが、この問題は血流と関係し、肝臓がんや膵臓がんなどに使用される上流血管の塞栓術モデルではこのような問題は見られない。また、化学療法を併用した相乗効果モデルにおいて、低用量のブロメラインへの暴露を使用することもできる。

この腫瘍モデルにおいて、pH2.4でブロメラインを担持させたPVAビーズを恐らくは20倍の量で使用して、先の例と同様の治療を模擬してもよい。

実施例２：アクリル酸ナトリウム−アルコール共重合体からなる30〜60μmのヘパスフィア
実験９−様々なpHのPBS中のブロメライン溶液（3.0mg/ml）を使用した、ヘパスフィア（HEPASphere）マイクロスフェア（30〜60μm）へのブロメラインの担持およびヘパスフィアからのブロメラインの放出
様々なpH（pH2.0、pH2.2、pH2.4またはpH2.6）のPBS中のブロメライン溶液（3mg/ml）300μlをHEPAマイクロスフィア（40μl）に加え、連続的に振盪しながら24時間処理した。次に、ビーズとブロメライン溶液を含むチューブを遠心分離し、上清（300μl）を吸引採取し、残存していたブロメライン含量を分析してブロメラインの担持量を定量した。

次に、50mlの遠心管に入れた10mlのPBS（pH6.5）にHEPAビーズを加え、37℃の水浴に浸して連続的に振盪した。30分後、この溶液から500μlを採取し、その後、１時間ごとに試料を採取した。試料採取ごとに、採取した溶液（500μl）と同じ量のPBSを補充した。次に、アゾカゼインアッセイを使用して、採取した溶液中のブロメライン含量を分析した。この実験の結果を、以下のグラフ１１および表７、表７.１および表７.２に示す。

バースト放出したブロメライン量を除いたグラフの直線部分を使用して、12時間ごとの放出速度（dx/dt）を算出した。

ブロメライン900μgを含む各ブロメライン溶液（300μl）にビーズ（40μl）を暴露した。pHの違いによる担持能力の差はわずかしかなかった。pH2.2およびpH2.0では担持量は同程度であり、pH2.6およびpH2.4での担持量よりもわずかに多かった。別の実験（記載せず）において、pH3.4においてブロメライン1200μgに暴露した場合、担持能力は非常に高くなることが分かった（87%）。

pH2.6においてブロメラインを担持させた場合、バースト放出が最も多くなり（125μg：総担持量あたり19.2%）、pH2.0においてブロメラインを担持させた場合にバースト放出が最も少なくなった。pHはマイクロスフェアの孔径に影響を及ぼすことが知られており、従って、pHがバースト放出に影響を及ぼしたと考えられる。

12時間ごとに放出速度を算出したところ、ここでも、pH2.6において放出速度が最も高くなることが示され、担持時のpHと特定のpHにおけるビーズの孔径とが関係している可能性が示された。52時間後、pH2.6でブロメラインを担持させたHEPAマイクロスフェアは、担持させたブロメラインの86%を溶出し、pH2.4で担持させた場合の溶出量は48%であり、pH2.2で担持させた場合の溶出量は26%であり、pH2.0で担持させた場合の溶出量は13%であった。この結果から、担持時のpHが、放出パターンおよび特定の時点における総放出量に重要な役割を果たしている可能性が示された。

HEPAマイクロスフェアは、ポリビニルアルコール−アクリル酸ナトリウムの共重合体であり、酸性環境において、ブロメライン中の正電荷を有するプロトン化アミン基が、負電荷を有する酢酸基と結合を形成し、これによって、ブロメラインがビーズに繋ぎ止められる。ブロメラインを担持させたビーズを溶出溶媒に加えると、イオン結合が容易に破壊されてブロメラインが放出され、pH6.5のPBS中において、ビーズに結合したブロメラインと遊離のブロメラインの間で平衡に達するまでブロメラインが放出される。試料を採取する際と、新鮮なPBSを溶液に補充する際に、ブロメラインの濃度が低下するが、この結果、平衡に達するまでビーズからブロメラインがさらに放出される。本実験モデルでは、10mlのPBSを使用し、500μlの試料を採取したが、この量は５%の血流変化または５%のクリアランスに相当する。

肝腫瘍の大きさの平均値は21.8ccであることが報告されており（Dachman et al Tumor size on Computed Tomography Scans. Cancer, 2001; 91(3):555-560）、切除不能腫瘍に対しては、約20μg/mlの濃度で送達することが可能なブロメライン担持マイクロスフェアによる治療が必要とされる。pH2.6で担持させた40μlのマイクロスフェアから125μgのブロメラインがバースト放出され、これは、腫瘍では5.73μg/ccの投与量となる。腫瘍部位に160μlのマイクロスフェアを送達すると、ブロメラインの濃度は実質的に22.9μg/ccに上昇する。クリアランスが約10%/時間であると仮定すると、2.3μg/時間が排除される。最初の24時間における１時間あたりの放出速度は、約８μg/時間（×4=32μg/時間）であり、このような放出速度であることから、腫瘍部位で排除されたブロメラインが相殺される。

実施例３−75μmのTANDEMマイクロスフェア
実験１０−75μmのTANDEMマイクロスフェアへのブロメラインの担持およびTANDEMマイクロスフェアからのブロメラインの放出
TANDEMビーズ（75μm）40μLを1.5mLの遠心管に入れた。蒸留水中の5mg/mLブロメライン200μLを加えた。チューブを室温で24時間にわたり緩やかに振盪した。翌日、蒸留水でビーズを２回洗浄し、5mLの蒸留水に再懸濁した。まず、30分後に250μLの試料を採取し、その後の32時間は１時間ごとに次の試料を採取した（試料の採取毎に新鮮な水250μLを補充した）。アゾカゼインアッセイによって各試料中のブロメライン含量を測定し、測定されたブロメライン含量を使用してブロメラインの放出特性を算出した。この結果をグラフ１２.１およびグラフ１２.２に示す。

32時間後以降は、ブロメラインは放出されなかった。この実験の結果、ブロメラインは、別の形態の市販品のマイクロスフェア内に担持させることができ、その後、活性な形態のまま持続して溶出されることが示された。TANDEMマイクロスフェアからのブロメラインの放出パターンは、マイクロスフェアの大きさ、担持時のpH、担持量、コーティング、および前述したその他の技術により調節することにより変更してもよい。

実施例４−コーティングしたディーシービーズ（300〜500μm）（PVAヒドロゲルマイクロスフェア）
実験１１−アルギン酸塩でコーティングしたディーシービーズ（PVA）への担持およびコーティングしたディーシービーズからの放出
ディーシービーズ（300μm〜500μm）にブロメライン（5mg/mL）を加え、室温で24時間かけて担持させた。ビーズへのブロメラインの担持量は900μgであると算出された。次に、ビーズを蒸留水で２回洗浄し、２%アルギン酸塩溶液に浸漬し、次に2%CaCl溶液に15分間浸漬して、マイクロスフェアの最外面にアルギン酸塩のコーティングを形成させた。

次に、ブロメラインが担持され、アルギン酸塩でコーティングされたビーズを10mLの水に加え、前述と同様の方法で、次の30時間におけるブロメラインの放出を測定した。この結果をグラフ１３.２に示す。ブロメラインを担持させた（コーティングしていない）300〜500μmのディーシービーズをコントロールとして使用した（グラフ１３.１）。

上記のグラフから見て取れるように、アルギン酸塩でコーティングしたディーシービーズに含まれていたブロメラインは、非常に遅い速度で溶出され、約10時間で総ブロメライン量のわずか約10%がコーティングビーズから溶出されたが、これに対して、コーティングしていないマイクロスフェアでは約66%が溶出された。また、アルギン酸塩でコーティングしたビーズでは、バースト放出が抑制された。

実施例５−ブロメラインおよびドキソルビシンを共担持させたディーシービーズマイクロスフェア
前述の方法と同様にして、ディーシービーズ（300μm〜500μm）の３つのバッチを調製した。第１のバッチのディーシービーズには、ブロメライン（１mg/mL）を単独で担持させた。第２のバッチのディーシービーズには、0.25mg/mLのドキソルビシンを単独で担持させた。第３のバッチのディーシービーズには、まず、24時間かけて１mg/mlのブロメラインを担持させ、翌日に６時間かけて0.25mg/mLのドキソルビシンを担持させた。

CFPAC-1細胞（ヒト膵癌細胞株）を96ウェルプレートに播種した。ビーズを段階希釈し、ウェルに四連で分注し、72時間インキュベートした。インキュベーション後、SRBアッセイを実施するとともに、１ウェルあたりのビーズの個数を計数した。以下のグラフに結果をまとめた（グラフ１４.１、グラフ１４.２、グラフ１４.３）。

グラフ１４.１では、１ウェルあたり40個のビーズおよび22個のビーズを入れた場合に、増殖の抑制が認められ、用量（ビーズの希釈）に依存した効果が示されたが、１ウェルあたり９個のビーズを入れた場合には増殖抑制効果は全く認められなかった。

上記の実験結果（グラフ１４.１、グラフ１４.２およびグラフ１４.３）からはっきりと見て取れるように、ブロメラインを単独で担持させたビーズを使用した場合やドキソルビシンを単独で担持させたビーズを使用した場合と比較して、ブロメラインとドキソルビシンを共担持させたビーズを使用すると、殺傷された細胞の数が増加した。これらの実験データから、ドキソルビシン単独またはブロメライン単独と比べて、ドキソルビシンとブロメラインの相乗効果が示された。

実施例６−ブロメラインを含む100〜300μmのディーシービーズマイクロスフェアの有効性
前記と同様にして、ディーシービーズ（100〜300μm）にブロメライン（400μg/mL）を担持させた。次に、マイクロスフェアを段階希釈し、実施例５と同様にしてCFPAC-1細胞に対する有効性を測定した。この実験の結果を以下のグラフ１５.１およびグラフ１５.２に示す。

これらのデータ（上記グラフ１５.１）から、膵癌細胞株CFPAC-1に対する増殖の抑制は、ビーズ１個あたり0.149μgの担持量において、１ウェルあたりのビーズの個数が62個未満になった時点で低下したことが示された。90%の細胞を殺傷するには、130個の担持ビーズが必要であった。

ビーズへの担持量を大幅に増やした場合（以下のグラフ１５.２）、膵癌細胞株CFPAC-1に対する増殖の抑制は、１ウェルあたりのビーズの個数が22個未満になった時点で低下した。グラフ１５.１では、ビーズへのブロメラインの担持量をそれほど増加させなかった場合（ビーズ１個あたり0.149μg）、90%の細胞を殺傷するのに130個のビーズが必要とされたことが示されたが、ビーズへの担持量を大幅に増やした場合（ビーズ１個あたり0.403μg）は、グラフ１５.２とほぼ同じ有効性を達成するのに、わずか43個のビーズしか必要とされなかった。

この実験では、異なる濃度のブロメラインを担持させたビーズ（ビーズ１個あたり0.149μgまたは0.403μg）の抑制作用を試験した。実験データから、ディーシービーズ１個あたりのブロメラインの担持濃度が高いほど、細胞増殖の抑制に必要とされるビーズの個数が少なくなることが示された。

実施例７−必要な暴露時間を評価するための様々な時点における試験
ヒト卵巣癌細胞株であるOVCAR-3細胞を96ウェルプレートに播種した。24時間後、ドキソルビシン（50nM）、Ｎ−アセチルシステイン（2.5mM）および様々な濃度のブロメライン（マイクロスフェアに担持していないもの）でプレートを処理した。１時間後、３時間後、６時間後、18時間後、24時間後および48時間後に各薬剤および培地を除去し、プレートをPBSで洗浄した。適切なウェルにおいてドキソルビシンによる処理を再度開始し、その他のウェルには薬剤無添加培地を加えた。すべてのプレートをさらに72時間処理した。この実験結果を以下のグラフ１６.１、グラフ１６.２およびグラフ１６.３に示す。

この試験は、ブロメラインがマイクロスフェアから溶出されて、併用投与される化学療法剤との相乗効果を発揮するのに必要とされる時間を測定することを目的とした。この実験の結果、24時間のブロメラインへの暴露、好ましくは48時間のブロメラインへの暴露によって、50nMのドキソルビシンとの良好な相乗効果が得られることが示された。100nMなどのさらに高い濃度のドキソルビシンでは（結果示さず）、たった３時間のブロメラインへの暴露であっても、がん細胞に対する相乗的な殺傷効果が得られることが観察された。

実施例８−ブロメラインおよびドキソルビシンを担持したディーシービーズの前臨床動物試験
前記と同様にして、ディーシービーズ（100〜300μm）にブロメラインを担持させた。

この安全性試験では、前記と同様にして合計５mgまたは10mgのブロメラインを担持させたディーシービーズでニュージーランドウサギを処置した。ビーズの懸濁液を総肝動脈に（すなわち動脈内経路を介して）直接注射し、ディーシービーズを血流で運び、塞栓を形成させ、ブロメラインを経時的に溶出させた。

処置の１時間後、３時間後、６時間後、24時間後または７日後にウサギを安楽死させた。安楽死後、内臓の比較観察と、血漿中および肝臓中のブロメライン濃度の測定を行った。観察結果を以下のグラフ１７.１〜１７.６に示す。

上記のグラフから見て取れるように、ディーシービーズ内に含まれていたブロメラインは、総肝動脈内に注射後、約24時間にわたって肝臓内で溶出された（グラフ１７.１、グラフ１７.２およびグラフ１７.５）。血流中のブロメライン量は、６時間後までに最低となった（グラフ１７.３、グラフ１７.４およびグラフ１７.６）。肉眼による肝臓の評価では、標的とする肝臓葉にビーズが分布していることが示された。正常組織の回復は、処置の７日後に観察された（結果示さず）。簡潔に述べると、この試験の結果から、ブロメラインが担持されたディーシービーズの安全性が示された。

実施例９−ブロメラインを担持させたディーシービーズ（100〜300μm）のがん細胞（ASPC-1細胞およびHT-29細胞）に対する細胞傷害活性
ASPC-1細胞株およびHT-29細胞株の各細胞を96ウェルプレートに播種した。24時間後、前記と同様の方法で（実施例５参照）、ディーシービーズ（100〜300μm）内に担持させた5mg/mlのブロメラインでプレートを処理した。次いでマイクロスフェアを段階希釈した。48時間後、前記薬剤および培地を除去し、SRBアッセイを使用して細胞の増殖を試験した。この実験の結果を、以下のグラフ１８.１およびグラフ１８.２に示す。

この実験では、段階希釈したブロメライン担持ビーズ（１ウェルあたり50個、30個または10個のビーズ）の抑制作用を試験した。実験データから、段階希釈したブロメライン担持ディーシービーズは、膵癌細胞株ASPC-1よりも大腸癌細胞株HT-29に対して有効性が高いことが示された（グラフ１８.１）。

実施例１０−ブロメラインを担持させたディーシービーズ（300〜500μm）の膵癌細胞（CFPAC-1）に対する活性および細胞傷害活性の持続時間
膵臓癌細胞株であるCFPAC-1細胞を24トランスウェルプレートに播種した。24時間後、トランスウェルチャンバーインサートを使用して、ディーシービーズ（300〜500μm）内に担持させたブロメラインでプレートを処理した。ビーズを入れたトランスウェルインサートを、３時間ごとに別の新たなウェルに移した。この操作を３日間継続した。SRBアッセイを使用して細胞の増殖を試験した。この実験の結果を以下のグラフ１９.１に示す。

この実験の結果、細胞傷害性を示すブロメラインの有効量が、最大で17時間にわたってビーズから放出されたことが示された。

実施例１１−がんの治療に使用可能な方法
以下の実施例は、本発明の実施形態によるマイクロスフェアを使用して、がん性腫瘍の治療（たとえば原発性肝臓がんまたは二次性肝臓がんの治療）をどのように実施すればよいのかについて、本発明者らによる考察を述べる。この治療方法は、前述のTACE法と似ており、がん性腫瘍に栄養を供給する動脈に本発明のマイクロスフェアを注射する。マイクロスフェアは、患者の動脈中を運ばれ、動脈床に到達する前に、物理的に動脈を塞ぐ。このようにして、マイクロスフェアは、腫瘍の血液供給を遮断または制限し、ブロメライン（またはムチンに作用する別のプロテアーゼ）および共担持または共投与されるさらなる薬剤を持続的に局所送達する。

ここまで述べてきたように、本発明は、副作用の可能性が最小限に抑えられる方法で、ブロメライン（またはムチンに作用し、治療適応されるその他のプロテアーゼ）の有効量を患者に送達可能な新規の送達媒体を提供する。本発明の実施形態は、既存の治療法を上回る多くの利点を提供し、そのうちのいくつかを以下にまとめる。
・本発明のマイクロスフェアは、ムチンに作用するプロテアーゼを局所送達する方法を提供し、この方法によって、ムチンに作用するプロテアーゼ（および任意でその他の活性物質）の持続放出を達成し、その結果、副作用の可能性を抑えつつ、該プロテアーゼの効果を向上させることができる。
・本発明によって、ムチンに作用するプロテアーゼの標的領域における局所濃度を高くすることができ、これに伴うベネフィットをもたらすが、全身毒性に関連したリスクは伴わない。
・本発明によって、がん（特に線維被膜を有する腫瘍、または癒着に囲まれた腫瘍）への薬剤の浸透が向上してもよく、別の化学療法剤と一緒に使用した場合、相乗効果が提供されてもよい。
・確実に細胞を死滅させるため、ムチンに作用するプロテアーゼが、疾患に関与する細胞の再生時間を超えて持続放出されるように、ムチンに作用するプロテアーゼを組換えることができる。

本発明を参照した当業者であれば、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えてもよいことを理解するであろう。このような変更はいずれも、以下の請求項の範囲内に含まれる。

先の説明は、本発明のマイクロスフェア、医薬組成物および治療方法の特定の形態について述べたものであり、このような詳細な説明は、説明のみを目的として提供されており、本発明の範囲を何ら制限するものではないと解される。

本明細書において引用された先行技術文献はいずれも、当技術分野の技術常識の一部を構成することを認めるものではないと解される。

後述の請求項および先行する本発明の説明において、用語の明示や必要な含意により非包括的な意味が文脈に必要とされる場合を除き、「comprise（含む）」という用語または「comprises」や「comprising」などのその変化形は、包括的な意味で使用され、すなわち、本発明の様々な実施形態において、述べられた特徴の存在を特定するために使用されるが、さらなる特徴の存在や付加を排除するものではない。

Claims (34)

1. 患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアであって、
   ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持し、
   生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、マイクロスフェア。
2. 前記ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたヒドロゲルを含む、請求項１に記載のマイクロスフェア。
3. ポリビニルアルコールヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール−ｃｏ−アクリル酸ナトリウム）ヒドロゲル、ポリ（エチレングリコール）とアクリル酸３−スルホプロピルからなるヒドロゲルネットワーク、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）含有ヒドロゲル、ポリ乳酸含有ヒドロゲル、またはポリメタクリル酸ナトリウムからなるヒドロゲルコアとポリ（ビス［トリフルオロエトキシ］ホスファゼン）の外側シェルとからなるヒドロゲルを含む、請求項１または２に記載のマイクロスフェア。
4. 外側コーティングを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
5. アルギン酸塩からなる外側コーティングを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
6. 直径が約３０〜約７００μｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
7. 前記ムチンに作用するプロテアーゼを約５時間〜約１２０時間かけて溶出するように構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
8. 患者に動脈内送達、病巣内送達、腹腔内送達または体腔内送達されるように構成されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
9. 患者の腹腔または胸膜腔に送達されるように構成されている、請求項８に記載のマイクロスフェア。
10. 前記ムチンに作用するプロテアーゼが、植物由来プロテアーゼ、真菌プロテアーゼおよび細菌プロテアーゼからなる群のうちの１種以上から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
11. 前記植物由来プロテアーゼが、ブロメライン、パパイン、フィカイン、アクチニダイン、ジンギパインおよびFastuosainからなる群のうちの１種以上から選択される、請求項１０に記載のマイクロスフェア。
12. さらなる薬剤を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
13. 前記さらなる薬剤が、化学療法剤、放射線療法剤、粘液溶解剤および造影剤からなる群のうちの１種以上から選択される、請求項１２に記載のマイクロスフェア。
14. 前記さらなる薬剤が、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシルおよびシスプラチンからなる群のうちの１種以上から選択される化学療法剤である、請求項１２または１３に記載のマイクロスフェア。
15. 医薬組成物であって、
    患者の体内の標的領域への送達用のマイクロスフェアと薬学的に許容される担体とを含み、
    該マイクロスフェアが、ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持し、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、医薬組成物。
16. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェアと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
17. ムチンに作用するプロテアーゼをマイクロスフェア内に担持する方法であって、
    酸性ｐＨを有し、任意で患者の体内の標的領域と同等のイオン強度を有する溶液に、マイクロスフェアを加える工程；
    前記マイクロスフェアを含む前記溶液を、ムチンに作用するプロテアーゼを含む溶液と混合する工程；および
    前記ムチンに作用するプロテアーゼが前記マイクロスフェア内に担持されるのに十分な時間にわたって前記混合物を振盪する工程
    を含む方法。
18. 前記溶液のｐＨが約２〜約６である、請求項１７に記載の方法。
19. ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を治療する方法であって、
    ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持するマイクロスフェアの治療有効量を患者に投与する工程を含み、
    前記マイクロスフェアが、投与後に、前記ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、
    方法。
20. ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を治療する方法であって、
    請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェアまたは請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記疾患の治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
21. ムチンに作用するプロテアーゼを内部に担持する前記マイクロスフェアの前記治療有効量が、患者に動脈内投与、病巣内投与、腹腔内投与または体腔内投与される、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 治療に有効なさらなる薬剤の治療有効量を共投与する工程をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記治療に有効なさらなる薬剤が、化学療法剤、放射線療法剤、粘液溶解剤および造影剤からなる群のうちの１種以上から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記治療に有効なさらなる薬剤が、前記ムチンに作用するプロテアーゼを含む前記マイクロスフェア内に担持されて共投与される、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記治療に有効なさらなる薬剤が、前記ムチンに作用するプロテアーゼを含む前記マイクロスフェアとは別個の形態で共投与される、請求項２２または２３に記載の方法。
26. 前記治療に有効なさらなる薬剤が、前記ムチンに作用するプロテアーゼを含む前記マイクロスフェアと同時にまたは連続して共投与され、前記さらなる薬剤が前記マイクロスフェアに連続して投与される場合、前記さらなる薬剤の投与が、前記マイクロスフェアの投与前または投与後に行われる、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ムチン産生がんが、肝臓がん（原発性肝臓がんまたは二次性肝臓がん）、膵臓がん、肺がん、甲状腺がん、胃がん、虫垂がん、腹膜がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、中皮腫、神経芽腫、小腸がん、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬品を製造するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェアの使用。
29. ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェアの使用。
30. 医薬品として使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
31. ムチン産生がん、腹膜偽粘液腫、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の治療において使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
32. ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む組成物であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、組成物。
33. ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む注射用組成物であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、注射用組成物。
34. ムチンに作用するプロテアーゼが内部に担持されたマイクロスフェアを含む持続放出製剤であって、該マイクロスフェアが、生理的条件に暴露されると、該ムチンに作用するプロテアーゼを持続的に溶出するように構成されている、持続放出製剤。