JP2021514479A - 全身性慢性炎症加齢を測定する方法 - Google Patents

全身性慢性炎症加齢を測定する方法 Download PDF

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Abstract

対象の慢性炎症加齢（ＳＣＩ）のレベルを測定する方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、本方法は、対象由来サンプル（例えば、血清）中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうち２つ以上の量を測定する工程と、それらタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程とを含んでもよい。【選択図】図８

Description

政府の権利
[0001]本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約番号ＡＩ０５７２２９及びＡＩ０９００１９の下の政府の支援で行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
[0002]ヒトの健康の維持及び感染症に対する保護における免疫系の役割は、１００年以上認識されてきた。しかしながら、科学者は、免疫、特に自然の武器であり、無秩序な炎症は、がん、心臓血管疾患及び神経変性障害などの高齢に関連する非感染性慢性疾患の予後にも影響するという認識に最近まで至らなかった（Ｃｒｕｓｚ及びＢａｌｋｗｉｌｌ、２０１５年；Ｋｏｔａｓ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１５年；Ｌｉｕら、２０１７年）。これらの観察から、炎症は生理的老化の調節に決定的な役割を演ずると仮定された（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ及びＣａｍｐｉｓｉ、２０１４年；Ｆｕｒｎａｎら、２０１７年）。更に、老化の確立された９つの特質（Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎら、２０１３年）（１）ゲノム不安定性、（２）テロメア長の短縮、（３）後成的修飾、（４）タンパク質恒常性の喪失、（５）無秩序な栄養分検知、（６）ミトコンドリア機能不全、（７）細胞の老化、（８）幹細胞の枯渇、及び（９）細胞内連絡の改変の全てが、少なくとも部分的に、持続的な全身性炎症によって引き起こされることが示された（Ｃａｖａｄａｓら、２０１６年；Ｅｆｅｙａｎら、２０１５年；Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖら、２０１０年；Ｈｕｎｔｅｒら、２００７年；Ｊｕｒｋら、２０１４年；Ｌａｓｒｙ及びＢｅｎ−Ｎｅｒｉａｈ、２０１５年；Ｎａｔｈａｎ及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｂｕｓｓｅｌ、２０１３年；Ｏｈら、２０１４年ａ；Ｔｈｅｖａｒａｎｊａｎら、２０１７年）。
[0003]しかしながら、感染症に対する炎症応答（急性応答）は、慢性病（慢性炎症）に関連する応答と大きく対照をなす。前者は、自然免疫細胞において発現されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）と病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される病原体の進化的に保存されている構造との相互作用によって感染因子に応答してほとんど開始される。会合すると、ＰＲＲは細胞内シグナル伝達カスケードを起動させ、そのカスケードは感染に対する宿主応答を統制する複数の炎症性サイトカインを発現させ、適応免疫の以降の活性化に対する前提条件として働く。この型の炎症において、とりわけインターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）などの標準的な炎症性メディエータの増加は、自己制限性である高悪性度の反応を鋭敏に引き起こし、組織修復機序及び治癒の活性化により刺激の除去をしばしばもたらす（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００８年）。
[0004]急性応答とは逆に、慢性及び全身性炎症は、例えば、損傷細胞によって放出される物理、化学又は代謝性有害刺激（「無菌」薬剤）及び環境的負荷によって起動され、一般に「損傷関連分子パターン」（ＤＡＭＰ）と称される。この型の炎症は、老化と関連しており、低悪性度且つ持続性があり、組織及び器官に対して副次的損傷を最終的にもたらすことによって特徴付けられる。（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＤｉｘｉｔ、２０１５年；Ｋｏｔａｓ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１５年）。この型の炎症反応は極めて重要であるにもかかわらず、慢性炎症を定義するための標準的なバイオマーカーは現在のところ存在せず、研究では矛盾する結果を一般に生じてきた（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、２０１７年；Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔｅ−Ｔｈｏｍａｓら、２０１４年）。
[0005]健康対疾患状態の免疫学的基礎を理解するために、最近の主要な試みは、類似の免疫学的構成を共有する個人の群を同定し、これらを臨床的及び表現型情報と関連付けるために行われてきた。これら研究の多くは、特定のワクチン調製品に対する特異的抗体のレベルの増大など、機能及び防御免疫系の代替物としての免疫抗原接種に対する応答に重点を置いてきた（Ｆｕｒｍａｎら、２０１４年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１３年；Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖａら、２０１６年；Ｌｉら、２０１４年；Ｎａｋａｙａら、２０１１年；Ｏｈら、２０１４年ｂ；Ｑｕｅｒｅｃら、２００９年）。ワクチン応答の質は、感染性疾患から保護する免疫系の潜在性について実際に情報を提供し得るが、感染症と戦うのに重要な免疫成分は、非伝染性慢性疾患に関連する一般的な健康を維持するものと必ずしも重複しない。
[0006]最近の研究は、免疫学、炎症、老化及び心血管健康に対するシステム生物学アプローチの非常に大きい価値を実証し（Ｆｕｒｍａｎら、２０１７年；Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら、２０１６年）、より最近の研究は、様々な細胞型の割合を使用して、通院個人のクラスターを同定し、これらを免疫学及び臨床的に関連する予後と相関させた（Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉら、２０１７年）。そのような研究において、著者は個人の細胞亜集団プロファイルに関してその連続体を同定し、そのプロファイルは、異なるサイトカイン刺激に応答する免疫細胞の能力、及びより弱い程度で、インフルエンザワクチンに対する抗体応答と相関した。
[0007]とりわけ、対象の全身性慢性炎症加齢のレベルを測定する方法が、本明細書に記載される。
[0008]本発明の一態様によると、方法は、対象の全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を評価するために提供され、（ａ）対象由来サンプル（例えば、血清）中のＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択されるタンパク質のうち２つ以上（即ち、２、３、４又は５個）の量を測定する工程と、（ｂ）前記２つ以上のタンパク質の重み付き量に基づいて対象のＳＣＩスコアを算出する工程とを含む。ガイド付き自動エンコーダ（ｇｕｉｄｅｄ−ａｕｔｏｅｎｃｏｄｅｒ）アルゴリズムを使用してＳＣＩスコアを算出する方法が本明細書に開示される。但し当技術分野において公知の他の方法が利用されてもよい。これらタンパク質の量は、例えば、多重アッセイを含めた任意の周知の方法を使用して測定され得る。例えば、ＣＸＣＬ９及びＥＯＴＡＸＩＮの量の増大がＳＣＩと正に相関し、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ及びＧＲＯＡの量の減少がＳＣＩと負に相関することを発見した。ＳＣＩスコアは、実年齢、血中コレステロール、性別及びＢＭＩのうち１つ又は複数に対して調整され得る。
[0009]本発明の別の態様によると、方法は、全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を減少させる処置を必要とする対象を同定するために提供され、（ａ）対象由来サンプル中のＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択されるタンパク質のうち２つ以上の重み付き量に基づいてＳＣＩスコアを算出する工程と、（ｂ）ＳＣＩスコアが対象の実年齢より大きい場合に、対象を処置してＳＣＩを減少させる工程とを含む。
[0010]本発明の別の態様によると、キットは、対象の全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を測定するために提供され、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択される異なるタンパク質に特異的に結合する２つ以上の捕捉薬剤、並びに使用説明書を含む。例えば、そのようなキットは、捕捉薬剤としてモノクローナル抗体を使用してもよい。選択肢として、そのようなキットは、異なるタンパク質のそれぞれ、例えば、各タンパク質の異なる部分に結合する一組の抗体、一次抗体及び二次抗体を含んでもよい。任意選択で、一次抗体は、着色されたビーズにそれぞれ連結され、二次抗体は、それぞれ標識、例えば、ビオチン化される。
[0011]本発明は、添付する図面と組み合わせて読む際に以下の詳細な説明から最もよく理解される。慣行により、図面の様々な特徴は一定の比率でないことが強調される。これに反して、様々な特徴の寸法は、明瞭性のために任意に拡大又は減少される。以下の図が、図面に含まれる。
[0012]図１は、「ＯＭＩＣＳ」手法による、免疫系の系統的分析を含む１０００イムノーム研究設計を示す図である。 [0013]図２は、免疫型の臨床的特徴付けを示す図である。免疫学的健康及び疾患の地図が、合計５２７名の対象から得た免疫型及び臨床的データ（５３個の疾患特徴を包含する）から得られた。有意な相関が、そのような疾患特徴の合計１６個について示される（年齢、性別、ＣＭＶ及びＢＭＩ調整後、ｐ＜０．０５）。がん並びに骨、筋肉及び関節を含めた他の加齢に伴う症状などの低い発生率が、他の全ての免疫型と比較して免疫型３（平均年齢２３歳、年齢範囲８〜５２歳）で示される。それに対して、免疫型８（平均年齢２３歳、年齢範囲１２〜７９歳）では、がん及び高血圧の低い発生率の呈示にもかかわらず、筋肉及び関節痛などの筋骨格症状、並びに泌尿器系疾患の高い発生率が観察される。大部分が若年成人対象で構成されるが高齢対象の小集団と免疫細胞プロファイルを共有する免疫型１２（図３を参照のこと）は、筋肉及び関節の疾患を除く疾患から大部分は保護されており（Ｐ＜０．００１）、がんの発生率は低いが有意である（Ｒ＝０．０９、Ｐ＜０．０５）。異なる疾患パターンが、加齢に伴う免疫型１３、１４及び１６に対して観察される。免疫型１３（平均年齢６０歳、年齢範囲１６〜９０歳）の個人は、高血圧及び心血管症状の発生率が高く、泌尿器及び筋骨格症状の発生率が低いが、免疫型１４（平均年齢７７歳、年齢範囲２９〜９０歳）の個人は、高血圧、心臓血管疾患、胃腸疾患及び筋肉−関節痛の発生率が低く、生殖器及び生殖症状の発生率が高い（研究コホートより高い）。免疫型１６（平均年齢６０歳、年齢範囲９〜９０歳）は、高血圧及び心血管症状の高い発生率、及び耳疾患及び骨関節炎の高い発生率、並びにアレルギー及び内分泌代謝症状のより低い発生率を示す。心臓血管疾患の臨床的関連性に基づいて、加齢に伴う免疫型１３及び１６は「不健康な老化免疫型」（ＵＡｉＴ）、及び免疫型１４は「健康な老化免疫型」（ＨＡｉＴ）に分類される。 [0014]図３Ａ〜図３Ｂは、全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）と同時罹患数との相関を示す図である。ガイド付き自動エンコーダ法を使用して、１０個の老人性疾患項目を選択し、５０種のサイトカインの分析（Ｎ＝１００１）から得られるＳＣＩの臨床的有意性を特徴付けた（図１０Ａ又は図１０Ｂ及び図１２を参照のこと）。分析した項目は、異なる疾患及び生理系：がん、心血管、呼吸、胃腸、泌尿器、神経、内分泌代謝、筋骨格、生殖器生殖及び精神医学系を含んだ。これら全ての疾患特徴は二者択一であった。研究した集団におけるＳＣＩと同時罹患数の間の有意な相関が、疾患の和（同時罹患数）とＳＣＩの間に観察される（順列による回帰分析による）（Ｎ＝５２７、Ｐ＜０．０００１）。共変量は、年齢、ＢＭＩ、性別、ＣＭＶ及び高コレステロール（同様に二者択一のカテゴリー）を含んだ。 同上。 [0015]図４は、ＳＣＩと心血管老化の間の相関を示す図である。４０名の高齢対象（年齢６０〜８９歳）が、心血管老化の研究に選択された。合計３４個の変数が、超音波心臓診断及び非侵襲性上腕足首脈波速度試験によって測定された。５００個の順列による回帰分析を行って、各回帰係数の有意性を得た。有意な正の相関（性別、年齢及びＣＭＶ調整後）が、拡張期心室間中隔寸法（ＩＶＳｄ）（Ｑ＝０．１８）、及び左室質量対容積比（ＬＶｍｖ）（Ｑ＝０．１２）について観察される。相対的壁厚（ＲＷＴ）における境界線上の有意な増大も示される（Ｑ＝０．２１）。 [0016]図５は、ＳＣＩの分解を示す図である。ＳＣＩの分解から、ケモカインＣＸＣＬ９の大きな寄与が明らかになる。炎症が心血管機能不全に関連する潜在的機序について更なる洞察を獲得するために、ＳＣＩが、各入力特徴（ヤコビアン）に関してＳＣＩの一階偏導関数を計算することによって分解された。ＳＣＩに対して正及び負両方の要因が観察される。最も可変的なヤコビアンの上位１５個は、ＣＸＣＬ９、ＥＯＴＡＸＩＮ、Ｍｉｐ−１α、ＬＥＰＴＩＮ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＦＮ−α及びＩＬ−４（正の要因）並びにＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−β、ＧＲＯ−α、ＩＬ−２、ＴＧＦ−α、ＰＡＩ−１及びＬＩＦ（負の要因）である。 [0017]図６Ａ〜図６Ｂは、マーカーに基づく心血管老化の予測を示す図である。ＣＸＣＬ９及びＬＩＦは、年齢とは無関係な健康な対象における心血管老化を予測する。９７名の健康な成人（年齢２５〜９０歳）が、厳格な疾患除外基準の下で合計１５１名の募集した対象から選択された（方法を参照のこと）。心血管年齢は、３つのパラメータを使用して評価された（１）大動脈脈波速度（ＰＷＶ）（Ａ）、血管硬化の尺度、（２）相対的壁厚（ＲＷＴ）（Ｂ）、心室再形成の尺度、及び（３）拡張早期僧帽弁輪運動速度（ｅ’）、心室弛緩の尺度。加えて、拡張終期充満圧の代替マーカーである、初期僧帽弁流入血流速度（Ｅ）とｅ’の比（Ｎａｇｕｅｈら、２００９年；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、２００５年）が測定された。加齢に伴う炎症マーカーＣＸＣＬ９及びＬＩＦ並びに研究した全ての個人から得た心血管老化測定に対する重回帰階層分析（方法を参照のこと）。年齢、性別、ＢＭＩ、心拍数、収縮期血圧、空腹時血糖値及び総コレステロール対ＨＤＬ比について調整した後、Ｐ値＜０．０１で、正の相関が、ＣＸＣＬ９とＰＷＶ（Ｒ＝０．２２）及びＲＷＴ（Ｒ＝０．３）の間で示され、負の相関が、ＬＩＦとＰＷＶ（Ｒ＝−０．２７）及びＲＷＴ（Ｒ＝−０．２２）の間で観察される（Ａ及びＢ）。本モデルに含まれるどの変数も、各因子について分散拡大係数（ＶＩＦ）＜３によって示唆される高い共直線性を有しなかった。 同上。 [0018]図７Ａ〜図７Ｅは、ＣＸＣＬ９及びその受容体の発現を示す図である。ｈｉＰＳＣから得られる内皮細胞は、ＣＸＣＬ９及びその受容体を発現し、ＳＩＲＴ３レベルを下方調節することによってＣＸＣＬ９に応答する。人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６年）を使用して、単離された線維芽細胞から得られ（Ｎ＝５、２つ組）、前述の通り明確に定義された条件下で内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）に分化された（Ｈｕら、２０１６年）。ＣＸＣＬ９及びＳＩＲＴ３の発現レベルは、方法に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲによって測定された。ＣＸＣＬ９ ｍＲＮＡ発現レベルにおいて有意な年齢依存的増大が観察され（Ｐ＜０．０１）、その増大は６回目の継代培養後にプラトーに到達する（Ａ）。ＣＸＣＬ９における増大と併存して、ＳＩＲＴ３ ｍＲＮＡの下方制御が、２回目の継代培養後に観察され得る（Ｐ＜０．０１）（Ｂ）。ｈｉＰＳＣ−ＥＣ老化の間の血管形成（管形成）の再編成段階は、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで管を形成する能力を減弱することを示す（Ｃ）。若い（７日目）ｈｉＰＳＣ−ＥＣへの漸増用量（１０〜８００ｎｇ／ｍＬ）の外来性ＣＸＣＬ９の添加は、ＳＩＲＴ３ ｍＲＮＡ発現の下方調節を誘導する（Ｄ）。ＣＸＣＬ９受容体であるＣＸＣＲ３の発現が、ｈｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）から得た若い心筋細胞並びにｈｉＰＳＣ−ＥＣ、ＨＵＶＥＣ細胞、新たに単離された線維芽細胞及びｈｉＰＳＣにおいて測定された。発現の上昇が、ｈｉＰＳＣ−ＥＣ、ＨＵＶＥＣ細胞において観察されたが、他の細胞型では観察されなかった（Ｅ）。このことは、他の細胞サブセットでなく内皮細胞が、ＣＸＣＬ９の標的であり、同様に潜在的に他のＣＸＣＲ３リガンドの標的であることを示唆するものである。 同上。 同上。 同上。 同上。 [0019]図８Ａは、健康な老化免疫型対不健康な老化免疫型における死亡率を示す図である。不健康な老化免疫型に対して健康な老化免疫型は、その実年齢と比較して死亡率がより低く、ＳＣＩがより低い。研究参加者のサブセット（Ｎ＝１１２）が２００７年から長期的に追跡された。この群から、１８名の個人が９年間の追跡調査の間に亡くなった。死亡の大部分（１３／１８名、７２％）は、ＵＡｉＴ群の対象であり、わずか２名（１１％）が、ＨＡｉＴ群に属した（Ａ）。追加の死亡（２／１８名、１１％及び１／１８名、６％）は、免疫型１５からの対象であり、それぞれ分類されなかった（Ａ）。図８Ｂは、健康な老化免疫型対不健康な老化免疫型における死亡率を示す図である。ＵＡｉＴ対ＨＡｉＴにおけるＧＡＥ方法から得られるＳＣＩと実年齢間の差異の有意差がＢに図示される（Ｐ＜１０−５、スチューデントｔ検定による）。 [0020]図９は、免疫細胞サブセット及び免疫タンパク質に対する分布型の割合を示す図である。血清タンパク質平均蛍光強度及び細胞亜集団頻度データを使用して、最尤推定（ＭＬＥ）を使用して各入力特徴について６つの異なる分布（正規、ラプラス、ログ正規、ログラプラス、ガンマ、ログガンマ）に当てはめた。各特徴について最良の分布を同定するために、５分割交差検定が各分布について実行された。ｔ検定ｐ値が、正規分布と他の分布の間で５分割検定推定に対して算出された。合計７５個の免疫特徴中、正規分布は、わずか１２％（細胞亜集団）及び１８％（循環タンパク質）に示される。最も一般的な分布は、ラプラスであり、細胞サブセットの場合にはログ正規及びガンマ、免疫タンパク質の場合には正規及びログ正規が続く。両方の免疫特徴型に対して最少の共通分布は、ログラプラスである。 [0021]図１０Ａは、ＧＡＥコード長の評価を示す図である。５分割交差検定を使用して、長さ１〜１０の中から最良のコード長を同定した。成績が、より長いコードより統計学的に有意に悪くなかった（対応のあるｔ検定ｐ値＞０．０５）コードｋの長さが選択された。各分割内で入れ子式３分割交差検定が実行されて、ハイパーパラメータ（深度、重み減衰及びガイダンス比）が選択された。実験において、もう１つコードを追加（６）しても合計損失を有意に改善しないので、最良のコード長は５である（ｐ値＝０．１８）（ａ）。図１０Ｂは、年齢予測の精度を示す図である。最良のコード長５を得た後、５分割交差検定を使用して、コード長５で全てのＧＡＥに対して最良のハイパーパラメータ設定（深度＝２、ガイダンス比＝０．２、Ｌ２＝０．００１）を選択した。最終的に、ＧＡＥは、選択した最良のハイパーパラメータ設定を用いて全体のデータセットに対して訓練され、ＳＣＩ予測因子として予測関数を得た。ＧＡＥ法は、タンパク質データ再構築及び実年齢予測に対して線形方法に優る性能を示す（ｂ）。 [0022]図１１は、心血管測定の相関ネットワークを示す図である。心血管評価が、超音波心臓診断及び動脈硬化の尺度として非侵襲性脈波速度試験を使用して研究参加者のサブセット（Ｎ＝４０）において行われた。合計２７名の測定が収集された。相関分析は、測定の全体で高い程度の正の相関を示す。ＨＲ：心拍数（ｂｐｍ）、ＰｌａｑｕｅＲ：右頸動脈におけるプラークの有意な存在、ＲＣＩＭＴ：右頸動脈内膜中膜厚、ＰｌａｑｕｅＬ：左頸動脈におけるプラークの有意な存在、ＰｌａｑｕｅＦｅｍ：大腿動脈におけるプラークの有意な存在、ＰＷＶ：脈波速度、ＩＶＳｄ：心拡張期における心室中隔径、ＬＶＩＤｄ：心拡張期における左室内径、ＰＷｄ：心拡張期における後壁厚、ＩＶＳｓ：心収縮期における心室中隔径、ＬＶＩＤｓ：心収縮期における左室内径、ＰＷｓ：心収縮期における後壁厚、ＬＶ＿ｅｎｌａ：左室拡大、ＲｅｍｏｄＲａｔｉｏ：再形成比、Ｌｖｍａｓｓ：左室質量、ＬＶＥＤＶ：左室拡張末期容積、ＬＶｍａｓｓＶｏｌ：左室質量対容積比、ＬＶｍａｓｓＢＳＡ：体表面積に索引付けされた左室質量、ＬＶＥＦ：左室駆出率、ＬＡｖｏｌＤｉａｓ：心拡張期における左房容積、ＬＡｖｏｌＩｎｄｅｘ：左房容積指数、ＬＡｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ：左房拡大、ＲＡＰ：右房圧、ＲＶＳＰ：右室収縮期圧、ＡｏｒｔｉｃＳｃｌｅｒ：大動脈弁硬化症、ＴＲ：三尖弁閉鎖不全、ＰＲ：肺動脈弁逆流。 [0023]図１２は健康な成人におけるサイトカインの発現を示す図である。サイトカインは、健康な成人において老化と有意に関連する。健康な成人（年齢２５〜９０歳）９７名の群における追跡調査が、厳格な選択基準を使用して募集した対象合計１５１名から選択された（方法を参照のこと）。合計４８種の測定した炎症マーカーから、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−１１Ｒα、ＣＸＣＬ１０及びＨＧＦ（年齢に伴って増大した）並びに減少したＧＲＯ−α及びＬＩＦを含む６種が、年齢と有意に相関した（Ｐ＜０．０５）。決定係数（Ｒ２）及びＰ値は、回帰分析から得られた。 [0024]図１３は、老人性免疫型におけるＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞頻度を示す図である。老化免疫型１３、１４及び１６（Ｎ＝９５）に関する利用可能なデータにおいてＣＤ８＋ＣＤ２８−サブセットの頻度が分析された。この細胞亜集団における有意な増大は、免疫型１３及び１６と比較して免疫型１４において観察される（Ｐ＜１０−１０、複合スチューデントｔ検定による）。 [0025]図１４は、免疫特徴及びその分布を示す図である。 [0026]図１５は、含まれる対象の数及び各研究年に使用した分析プラットフォームを示す図である。 [0027]図１６は、合計５２７名の研究参加者から得られる臨床質問表から得られる疾患特徴を示す図である。
[0028]本発明の実践は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内にある薬理学、化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の方法を利用することになる。そのような技術については、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．最新の増補）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照のこと。
[0029]前後を問わず、本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
[0030]値の範囲が提供される場合、その範囲の上下限に挟まれる各値も、文脈に別段の明確な指図がない限り下限の単位の１０分の１まで、特に開示されるものと理解される。記載される任意の値の間にあるより小さいそれぞれの範囲又は記載される範囲に挟まれる値及び記載される他の任意の値又は記載される範囲に挟まれる値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上下限は、その範囲内にそれぞれ独立に含まれても又は除外されてもよく、いずれか、いずれでもない又は両方の限度がより小さい範囲に含まれる各範囲も本発明に包含され、記載された範囲において特に除外される任意の限度に従属する。記載される範囲が限度の一方又は両方を含む場合、含まれる限度のいずれか一方又は両方を除外した範囲も、本発明に含まれる。
[0031]別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述されるそれと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実践又は試験に使用され得るが、いくつかの潜在的及び好ましい方法並びに材料について次に記載される。本明細書において述べた全ての刊行物は、その刊行物が引用されている方法及び／又は材料を開示並びに記載するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある場合には、組み込まれた刊行物のどの開示にも優先するものと理解される。
[0032]本開示を読む当業者にとって明らかであろうように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は精神を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から直ちに分離又は組み合わされ得る別々の成分及び特徴を有する。列挙された任意の方法は、列挙された事象の順序で又は論理的に考え得る他の任意の順序で実施され得る。
[0033]本明細書及び添付の請求項に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指図がない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って例えば、「アゴニスト」への言及は、２つ以上のそのようなアゴニストなどの混合物を含む。
[0034]本明細書において議論される刊行物は、本出願の出願日より前のそれら開示のためだけに提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由にそのような刊行物に先行する権利を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。更に、提供される公開日は、独立に確認される必要があり得る実際の公開日と異なり得る。
[0035]対象の慢性炎症加齢のレベルを測定する方法が提供され、用語ＳＣＩは、対象由来血清中のタンパク質、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうち２つ以上（例えば、２、３、４又は５個）の量を測定する工程を含み得る方法によって測定され、ガイド付きニューラルネットワークアルゴリズム（ガイド付き自動エンコーダ）を使用してこれらタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程を含む方法によって出力を分析する、ある期間における対象の慢性炎症の全体的なレベルを指すことを意図するものであり、スコアは対象の慢性炎症加齢のレベルを示す。方法を実行するためのキットも、提供される。タンパク質の「量」とは、絶対量（例えば、マイクログラム［μｇ］）、相対量（別のタンパク質の量を参照する）、濃度、平均蛍光強度（例えば、下記の実施例に記載の通り、ＬＵＭＩＮＥＸ［登録商標］アッセイを使用して得られるなどのタンパク質量の間接的測定）又は他の直接若しくは間接的測定のことを指す。
[0036]慢性炎症加齢（ＳＣＩ）は、心臓血管疾患及び同時罹患数と相関しており、健康的に老化している個人（即ち、全体的な健康が良好で疾患が低下している個人）においてより低く、不健康に老化している個人（全体の健康が悪く、疾患に感受性であり、同時罹患の発生率が高く及び／又は死亡率が増大している個人）においてより高い。一部の実施形態において、本方法は、対象由来血清中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうち２つ以上の量を測定する工程と、ガイド付きディープニューラルネットワーク（ガイド付き自動エンコーダ）を含む方法によってこれらタンパク質の重み付き量に基づいてスコアを算出する工程とを含んでもよい。
[0037]ＣＸＣＬ９（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド９）、別名ＭＩＧ（ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属する小さいサイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ＩＦＮ−γによって誘導されるＴ細胞化学誘引物質である。血漿ＣＸＣＬ９の上昇は、慢性ＧＶＨＤ診断と相関する。ＣＸＣＬ９については、Ｋｉｔｋｏら、Ｂｌｏｏｄ ２０１４年、１２３：７８６〜９３頁及びＪａｎｓｅｎら、ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７：５５６頁に記載されている。ＣＸＣＬ９は、ＧＲＣｈ３８アッセンブリにおいてヒト４番染色体：７６，００１，２７５〜７６，００７，４８８逆鎖にコードされている。
[0038]ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、大部分の正常組織細胞によって産生され、分泌されるサイトカインである。これは、特定の細胞死受容体に結合することによって主に腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こすと考えられている。ＴＲＡＩＬは、ＣＤ２５３（分化抗原２５３のクラスター）及びＴＮＦＳＦ１０（腫瘍壊死因子［リガンド］スーパーファミリー、メンバー１０）とも称されてきた。ＴＲＡＩＬについては、Ｗｉｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １００５ ３：６７３〜８２頁及びＰｉｔｔｉ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年 ２７１：１２６８７〜９０頁に記載されている。ＴＲＡＩＬは、ＧＲＣｈ３８アッセンブリにおいてヒト３番染色体：１７２，５０５，５０８〜１７２，５２３，５０７、逆鎖にコードされている。
[0039]ＩＮＦＧ（別名インターフェロンガンマ、ＩＦＮγ又はＩＩ型インターフェロン）は、インターフェロンのＩＩ型クラスの唯一のメンバーである二量体化可溶性サイトカインである。このタンパク質は、ウイルス、一部の細菌及び原虫性感染症に対する自然及び適応免疫に決定的である。ＩＮＦＧは、マクロファージの重要な活性化因子であり、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子発現の誘導因子である。逸脱したＩＮＦＧ発現は、多数の自己炎症性及び自己免疫性疾患に関連する。ＩＮＦＧについては、Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７年 ９６：４１〜１０１頁及びＧｒａｙ、Ｎａｔｕｒｅ．１９８２年 ２９８：８５９〜６３頁に記載されている。ＩＮＦＧは、ＧＲＣｈ３８アッセンブリにおいてヒト１２番染色体：６８，１５４，７６８〜６８，１５９，７４７、逆鎖にコードされている。
[0040]エオタキシン（別名Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１１又は好酸球走化性タンパク質）は、ＣＣケモカインファミリーに属する小さいサイトカインである。エオタキシンは、好酸球走化性を誘導することによってそれらを選択的に集め、従って、アレルギー性応答に関係する。エオタキシンによる効果は、ケモカイン受容体として公知のＧタンパク質結合型受容体への結合によって媒介される。ＣＣＬ１１がリガンドであるケモカイン受容体には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５がある。エオタキシンについては、Ｋｉｔａｕｒａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６年 ２７１：７７２５〜３０頁、及びＪｏｓｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９４年 １７９：８８１〜７頁に記載されている。エオタキシンは、ＧＲＣｈ３８アッセンブリにおいてヒト１７番染色体：３４，２８５，６６８〜３４，２８８，３３４、順鎖にコードされている。
[0041]ＧＲＯＡ（別名ＣＸＣＬ１、ＧＲＯ１癌遺伝子、ＧＲＯα、ＫＣ、好中球活性化タンパク質３［ＮＡＰ−３］及び黒色腫成長刺激活性アルファ［ＭＳＧＡ−α］）は、ヒト黒色腫細胞によって分泌され、有糸分裂誘発特性を有し、黒色腫の病因に関わる。ＧＲＯＡは、マクロファージ、好中球及び上皮細胞によって発現され、好中球化学誘引物質活性を有する。このケモカインは、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２を経由するシグナル伝達によってその効果を誘発する。ＧＲＯＡについては、Ｈａｓｋｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９０ ８７（１９）：７７３２〜６頁に記載されている。ＧＲＯＡは、ＧＲＣｈ３８アッセンブリにおいてヒト４番染色体：７３，８６９，３９３〜７３，８７１，２４２、順鎖にコードされている。
[0042]対象におけるＣＸＣＬ９及びＥＯＴＡＸＩＮの増大（対照集団における平均的発現との比較）は、ＳＣＩと正に相関し、一方で対象におけるＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ及びＧＲＯＡの減少（対照集団における平均的発現との比較）は、ＳＣＩと負に相関することを発見した。
[0043]本方法は、対象由来サンプル中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうちの２、３、４又は５個（例えば、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、並びにＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ及びＥＯＴＡＸＩＮ又はＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ及びＧＲＯＡ）の量を測定する工程と、例えば、それだけには限らないが、ガイド付き自動エンコーダを使用してこれらタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程を含む方法を使用して出力データを分析する工程とを含んでもよい。そのようなタンパク質を含有する他のサンプル、例えば、全血、組織などが使用され得るが、血清が適したサンプルである。
[0044]また、本方法は、対象由来血清中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうち４つ以上（例えば、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ及びＥＯＴＡＸＩＮ、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ及びＧＲＯＡ、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡ又はＣＸＣＬ９、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡ）の量を測定する工程と、これらのタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程を含む方法を使用して出力データを分析する工程とを含んでもよい。
[0045]また、本方法は、対象由来血清中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡの全ての量を測定する工程と、これらタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程を含む方法を使用して出力データを分析する工程とを含んでもよい。
[0046]任意の適切な方法を使用して、タンパク質の量を測定し得る。例えば、タンパク質の量は、ウェスタンブロッティング、質量分析又はＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイを使用することにより測定されてもよい。これら方法の多くは、タンパク質に特異的に結合する捕捉薬剤、例えばＣＸＣＬ９に特異的に結合する捕捉薬剤、ＴＲＡＩＬに特異的に結合する捕捉薬剤、ＩＦＮＧに特異的に結合する捕捉薬剤、ＥＯＴＡＸＩＮに特異的に結合する捕捉薬剤及びＧＲＯＡに特異的に結合する捕捉薬剤とタンパク質を含有するサンプルと結合させる工程と、捕捉薬剤に結合しているタンパク質の量を次いで測定する工程とを含む。従って、一部の実施形態において、タンパク質の量は、多重化されたアッセイにおいて測定されてもよい。
[0047]捕捉薬剤には、抗体（ポリクローナル及びモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ナノボディ、ダイアボディ、並びにその多量体及び二重特異性抗体又は抗体断片を含める）、アプタマー、アフィマー、ノッチン、等があるがこれに限定されない。
[0048]多重アッセイは、フローサイトメトリー、化学発光又は電気化学発光技術の利用に基づく異なるいくつかの形式で利用可能である。フローサイトメトリーによる多重アレイ、別名ビーズ型多重アッセイには、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）システム及びＬｕｍｉｎｅｘ製のＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックス分析物プロファイリング技術がある。これらのプラットフォームは両方とも、フローサイトメトリー下で識別可能な専用のビーズセットを利用する。各ビーズセットは、特異的捕捉抗体で被覆されており、蛍光又はストレプトアビジン標識検出抗体が、ビーズセット上の特異的タンパク質−捕捉抗体複合体に結合する。従って生物学的液体サンプル中の複数のタンパク質は、フローサイトメトリー分析を使用して検出される色素形成又は蛍光放出を用いる両方のビーズセットの差異によって認識及び測定され得る。多重ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｑｕａｎｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）は、マルチウェルマイクロプレートの同じウェル中の複数の場所で複数の特異的捕捉抗体を被覆する（１つの場所に１つの抗体）工程を含む。従来のＥＬＩＳＡにおける色素形成検出より感度が高い化学発光技術を次いで利用して、プレート上の対応する場所で複数のサイトカインを検出する。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製多重キットは、電気配線マイクロプレート上の対応する場所に被覆された複数の特異的捕捉抗体を用いる電気化学発光技術を利用する。検出抗体は、電界中の射出光線により励起される専用のタグにコンジュゲートされる。
[0049]一部の実施形態において、ビーズ型のアッセイが使用されてもよい。ビーズ型のアッセイは、ポリスチレン又は常磁性ビーズ（微小球とも呼ばれ得る）を使用し、ビーズは、互いと区別され得るように異なる色、強度及び／又は比率の蛍光団で内部的に染色される。次いで個々のビーズセットは、特定の１つの分析物に適当な捕捉抗体で被覆される。次いで複数の分析物に特異的なビーズが単一ウェル中で組み合わせられ得る。この方法において、サンプルは、分析物特異的捕捉抗体で予め被覆された色分けされているビーズの混合物に添加される。抗体は、対象となる分析物に結合する。対象となる分析物に特異的なビオチン化検出抗体が添加され、抗体−抗原サンドイッチを形成する。フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートしたストレプトアビジンが添加され、そのストレプトアビジンがビオチン化検出抗体に結合する。ポリスチレンビーズは、二重レーザーフロー型検出器で読み取られ、その中で１つのレーザーはビーズを分類し、検出される分析物を決定する。第２のレーザーは、ＰＥ由来シグナルの大きさを決定し、その大きさは結合している分析物の量に正比例する。別法として、磁気ビーズは磁石を使用して単層に磁気ビーズを捕捉し、保持して読み取られ得、スペクトル的に固有の２つの発光ダイオード（ＬＥＤ）が、ビーズを照明する。一方のＬＥＤは検出される分析物を同定し、第２のＬＥＤはＰＥ由来シグナルの大きさを決定する。典型的なビーズ型のアッセイについては、Ｄｕｐｏｎｔら（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年 ６６：１７５〜９１頁）及びＫｈａｌｉｆｉａｎら（Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１５年 １３５：１〜５頁）に記載されている。
[0050]捕捉薬剤へのタンパク質の結合は、光学的に検出可能な（例えば、蛍光標識された又は発光する）二次抗体、プラスモン共鳴、又は磁気抵抗、等の使用を含めた任意の手段で測定され得る。
[0051]タンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡの測定において、各タンパク質の絶対量が決定されてもよく、又は１つ又は複数の対照タンパク質と比較して各タンパク質の量が決定され、ガイド付き自動エンコーダを使用してこれらタンパク質のそれぞれの重み付き量に基づいてスコアを算出する工程を含む方法を使用して出力データを分析してもよい。
[0052]対象のＳＣＩを測定するためにコンピュータ実装された方法も提供される。本方法は、対象由来血清中のタンパク質ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡのうち２つ以上（例えば、３、４個又は全て）の測定した量を受信する工程と、ガイド付き自動エンコーダを使用してタンパク質のそれぞれの量に基づいてＳＣＩを算出するアルゴリズムを実行する工程とを含んでもよい。一部の実施形態において、この方法は、コンピュータに測定値を入力する工程と、ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡレベルの決定からの入力測定値を使用してＳＣＩを算出できるガイド付き自動エンコーダアルゴリズムを実行する工程とを含んでもよい。
[0053]一部の実施形態において、本方法は、対象の慢性炎症加齢のレベルを、例えば、電子形態で示す報告書を作成する工程と、医師又は他の医学専門家に報告書を転送して、適切な行動方針を同定する、例えば、対象にとって適切な治療を同定することを助ける工程とを含み得る。報告書は、対象が疾患又は症状を有するかどうか確定する診断として他の測定基準と共に使用されてもよい。
[0054]任意の実施形態において、報告書は「遠隔地」に転送され得、ここで「遠隔地」とは画像が検討される場所以外の場所を意味する。例えば、遠隔地は、同じ都市内の別の場所（例えば、事務所、研究室等）、異なる都市内の別の場所、異なる州内の別の場所、異なる国内の別の場所、等である可能性がある。従って、一方の項目が他方から「遠くにある」と示される場合に意味されることは、２つの項目が、区切られている同室内に、又は少なくとも異なる部屋若しくは異なる建物内にあり得る、及び少なくとも１．６ｋｍ（１マイル）、１６ｋｍ（１０マイル）又は少なくとも１６０ｋｍ（百マイル）離れ得るということである。「通信」情報は、適切な通信経路（例えば、民間又は公共通信網）を介して電気信号としてその情報を表すデータの伝送を参照付ける。項目を「転送する」とは、その項目を物理的に輸送するか又は（可能な場合に）別の方法によるかに関わらず、ある場所から次の場所へとその項目を移すための任意の手段のことを指し、少なくともデータの場合、データを保有する媒体を物理的に輸送する又はデータを通信することを含む。媒体を通信する例には、無線若しくは赤外線伝送経路、並びに別のコンピュータ若しくはネットワーク化した装置へのネットワーク接続、及びインターネット又はウェブサイト上に記録された電子メールの伝送及び情報などがある。特定の実施形態において、報告書はＭＤ又は他の有資格医学専門家によって分析されてもよく、画像の分析結果に基づく報告書は、サンプルが得られた患者に転送されてもよい。
[0055]コンピュータ関連の実施形態において、システムは、処理装置、格納コンポーネント（即ち、メモリー）、表示コンポーネント、及び汎用コンピュータに一般に存在する他のコンポーネントを含有するコンピュータを含んでもよい。格納コンポーネントは、処理装置によって実行され得る指示を含む処理装置で利用可能な情報及び処理装置によって取り出し、操作又は格納され得るデータを格納する。
[0056]格納コンポーネントは、入力として上述の測定を使用して対象のＳＣＩを決定するための指示を含む。コンピュータ処理装置は、格納コンポーネントに連結され、格納コンポーネント中に格納されている指示を実行して１つ又は複数のアルゴリズムにより患者データを受信し、患者データを分析するように構成されている。表示コンポーネントは、患者の診断に関する情報を表示し得る。
[0057]格納コンポーネントは、ハードディスク、メモリカード、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュドライブ、書き込み可能な及び読出し専用メモリなど、処理装置で利用可能な情報を格納する能力がある任意の型でもよい。処理装置は、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ製処理装置など任意の周知の処理装置でもよい。別法として、処理装置はＡＳＩＣなど専用の制御装置でもよい。
[0058]指示は、処理装置によって直接（機械コードなど）又は間接的に（スクリプトなど）実行される任意の組みの指示でもよい。その点で、用語「指示」、「工程」及び「プログラム」は、本明細書において互換的に使用されてもよい。指示は、処理装置による直接処理のためのオブジェクトコード形式で、又は要求に応じて解釈される若しくは前もってコンパイルされる独立したソースコードモジュールのスクリプト若しくはコレクションを含めた他の任意のコンピュータ言語で格納されてもよい。
[0059]データは、指示に従って処理装置によって取り出し、格納又は修飾されてもよい。例えば、診断システムはいかなる特定のデータ構造にも限定されないが、データは複数の異なるフィールド及びレコードを有する表、ＸＭＬ文書、又はフラットファイルとしてリレーショナルデータベースでコンピュータレジスタ内に格納されてもよい。データは、限定するものではないが、二進値、ＡＳＣＩＩ又はＵｎｉｃｏｄｅなどコンピュータ読み込み可能な任意の形式でフォーマットされてもよい。更に、データは、数、説明文、専用コード、ポインタ、他のメモリ（他の通信網の場所を含める）内に格納されているデータ又は関連データを算出する機能に使用される情報の引用など、関係情報を同定するのに十分な任意の情報を含んでもよい。
処置
[0060]対象由来サンプル中のＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択されるタンパク質のうち２つ以上の量を測定する工程と、タンパク質の重み付き量に基づいて対象のＳＣＩを算出する工程とを含む、対象の全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を測定する方法を提供した。このように測定されるＳＣＩに基づいて、対象は、全身性慢性炎症加齢を減少させる公知の方法（１）抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェン及びナプロキセンなどのＮＳＡＩＤ）又は副腎皮質ステロイドがあるがこれに限定されない薬物処置、（２）魚油、リポ酸及びクルクミン、又はショウガ、ニンニク及び唐辛子などのスパイスがあるがこれに限定されない栄養補給食品若しくは栄養補助剤、（３）オリーブ油、葉物野菜（例えば、ケール及びホウレンソウ）、トマト、脂肪が多い魚（例えば、サケ、イワシ及びサバ）、木の実及び果物（例えば、サクランボ、ブルーベリー及びオレンジ）など酸化防止剤及びポリフェノールが多い食物の摂取の増大並びに／又は精製した炭水化物（例えば、白パン及びペーストリー）、揚げ物、赤身肉及び加工肉など炎症を増大させ得る食物の摂取の低下があるがこれに限定されない食事の変更、（４）喫煙及びアルコール摂取を排除又は減少、健康な体重の維持、並びにストレスレベルの減少があるがこれに限定されない生活様式変更、のいずれかを単独で又は組み合わせて処置されてもよい。
キット
[0061]上述の対象の方法を実践するための試薬を含有するキットも本開示によって提供される。対象のキットは、上述した成分のいずれかを１つ又は複数含有する。一部の実施形態において、キットは、例えば、ＣＸＣＬ９に特異的に結合する捕捉薬剤、ＴＲＡＩＬに特異的に結合する捕捉薬剤、ＩＦＮＧに特異的に結合する捕捉薬剤、ＥＯＴＡＸＩＮに特異的に結合する捕捉薬剤、ＧＲＯＡに特異的に結合する捕捉薬剤のうち２つ以上（例えば、３、４個又は全部）を含んでもよい。任意の実施形態において、捕捉薬剤は抗体であり得る。一部の実施形態において、各タンパク質について、キットは一次抗体及び二次抗体を含有してもよく、一次及び二次抗体は、タンパク質の異なる部分に結合する。一部の実施形態において、一次抗体は色分けされたビーズに連結されてもよく、二次抗体は標識、例えば、ビオチン化されてもよい。抗体は、アレイ形態であり得る。
[0062]キットの様々な成分は別々の容器中に存在してもよく、又は所望の通り、特定の混合可能な成分は単一容器中に予め組み合わせられてもよい。
[0063]上述の成分に加えて、対象のキットは、キットの成分を使用して対象の方法を実践するための説明書、即ち、サンプル分析の説明書を更に含んでもよい。対象の方法を実践する説明書は、適切な記録媒体上に一般に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチック、等などの基材に印刷されてもよい。従って、説明書は、添付文書としてキット内、キットの容器又はその成分のラベル（即ち、包装又は個包装に関連する）、等に存在してもよい。他の実施形態において、説明書は適切なコンピュータ読み込み可能な格納媒体上に存在する電子格納データファイルとして存在する。更に他の実施形態において、実在の説明書はキット内に存在しないが、インターネットによるなど、遠隔ソースから説明書を得る手段が提供される。本実施形態の例は、説明書を見ることができる及び／又は説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得る手段は適切な基材上に記録されている。
[0064]以下の例は、本発明の実施及び使用の方法の完全な開示並びに説明を当分野の技術者に提供するために記載したものであり、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が全て又は唯一の実行された実験であることを表すことを意図したものでもない。使用される数字（例えば量、温度、等）に関する精度を確実にするために努力が行われたが、若干の実験誤差及び逸脱があるものと考えるべきである。特に明記しない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又はその近くである。標準的な略語が使用され得る、例えば、室温（ＲＴ）、塩基対（ｂｐ）、キロベース（ｋｂ）、ピコリットル（ｐＬ）、秒（ｓ又はｓｅｃ）、分（ｍ又はｍｉｎ）、時（ｈ又はｈｒ）、日（ｄ）、週（ｗｋ又はｗｋｓ）、ナノリットル（ｎＬ）、マイクロリットル（μＬ）、ミリリットル（ｍＬ）、リットル（Ｌ）、ナノグラム（ｎｇ）、マイクログラム（μｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、グラム（［ｇ］、質量の文脈において）、キログラム（ｋｇ）、重力相当（［ｇ］、遠心分離の文脈において）、ナノモル（ｎＭ）、マイクロモル（μＭ）、ミリモル（ｍＭ）、モル（Ｍ）、アミノ酸（ａａ）、キロベース（ｋｂ）、塩基対（ｂｐ）、ヌクレオチド（ｎｔ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹膜内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）など。
[0065]本研究において、目標は、ヒト免疫学の最初の大要である１０００ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ（１ＫＩＰ）を確立することであり、１００１名の対象由来サンプルが、１つのデータセンター施設；Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＩＭＣ）において包括的に研究され、末梢血標本が厳密に標準化された手順を使用して処理及び分析される。全ゲノムトランスクリプトーム、血清プロテオーム、細胞サブセット存在量、複数の刺激に対する細胞の応答及びサイトメガロウイルス感染に対する血清陽性を測定する複数の技術的プラットフォームを使用して、完全な免疫特徴付けが行われた。５３個の特徴の臨床質問表を使用して包括的な健康評価が、半分以上の参加者から得られた。
[0066]合計１６個の固有の免疫型が同定され、その型から、高齢成人の２つのクラス：慢性炎症のレベル並びに心血管症状の発生率及び死亡率を含めた複数の免疫特徴における主要な差異によって特徴付けられた健康及び不健康な老化免疫型、の存在が明らかになった。深層学習方法を使用して、多次元タンパク質データを低次元空間へと簡潔に表し、それによりＳＣＩを得、そのレベルは、同時罹患数及び心血管老化と有意に相関した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおける心血管の２７個の特徴表現型検査スクリーニングに加えて、同じ炎症マーカーについてＨＩＭＣでも監視された９７名の健康な高齢成人の追跡調査において、ＳＣＩに対する最も強力な要因、インターフェロン関連ケモカインＣＸＣＬ９が、不顕性心臓肥大を探知したと決定された。本ケモカインは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から得られる老化した内皮によっても大量に発現され、心臓保護的脱アセチル化酵素ＳＩＲＴ３のｍＲＮＡ発現の下方調節を誘導した。
[0067]結果は、老化及び心臓血管疾患における炎症に対する決定的な役割を実証する。
実施例１
材料及び方法
実験モデル及び対象の詳細
[0068]１０００ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｓ研究コホート：１ＫＩＰは、老化及び予防接種の研究（Ｎ＝６０５）（Ｂｌａｚｋｏｖａら、２０１７年；Ｂｒｏｄｉｎら、２０１５年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１７年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１４年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１３年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１５年；Ｐｒｉｃｅら、２０１３年；Ｒｏｓｋｉｎら、２０１５年；Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら、２０１６年；Ｗａｎｇら、２０１４年）及び慢性疲労症候群の独立した研究（Ｍｏｎｔｏｙａら、２０１７年）のために２００７年〜２０１６年にスタンフォード大学で募集した１００１名の通院個人（男性３３９名及び女性６６２名）で構成され、参加者の対照組みからのデータ（Ｎ＝３９６）だけを利用した。
[0069]老化及び予防接種研究コホート：研究参加者は、２００７年〜２０１６年にＳｔａｎｆｏｒｄ−ＬＰＣＨ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｇｒａｍでインフルエンザワクチン研究に登録された。ベースラインサンプルはインフルエンザワクチンによる予防接種前に全ての個人から得られたので、本研究に対してランダム化又は盲検化は行わなかった。本研究のプロトコールはスタンフォード大学における研究コンプライアンス事務局の施設内倫理委員会の承認を得た。インフォームドコンセントを全ての対象から得た。全ての個人は通院であった。最初の登録時に、志願者は、臨床的に観察される肝疾患、インスリンで処置される真性糖尿病、中等度から重度の腎疾患、スクリーニング時の血圧＞１５０／９５、慢性Ｂ型若しくはＣ型肝炎、免疫抑制薬物の最近若しくは現在の使用を含め、急性全身性若しくは重篤な併発疾病がなく、免疫不全の既往歴もなく、免疫学的機能のいかなる公知の又は疑わしい機能障害もない。加えて、一年毎の予防接種日において、いずれの志願者も、それぞれ過去６カ月間及び６週間以内に血液若しくは血液製剤のレシピエント又はドナーでなく、誰も、ベースライン採血日に熱性疾病のいかなる徴候も示さなかった。末梢血サンプルは静脈穿刺から得、単核細胞をＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ（ＣＴＲＵ）で分離し、貯蔵した。全血を使用して、遺伝子発現分析した（下）。血清を、凝固血の遠心分離によって分離し、ＣＭＶ血清学、サイトカイン及びケモカイン決定の前に−８０℃で貯蔵した。
[0070]慢性疲労研究コホート：研究参加者は、２０１０年３月２日〜２０１１年９月１日に北カリフォルニアから募集された。その末梢血を、登録の当日の午前８時３０分〜午後３時３０分の間に採取した。これらのサンプルは、各参加者のベースラインで収集された（採血前にいかなる運動もしない）。加えて、各ＭＥ／ＣＦＳ患者を研究に募集したので、患者２００名及び対照４００名の標的サンプルサイズが達成されるまで、２つの対応する、年齢及び性別を一致させた対照を同時に登録した。本手法により、患者及び対照は、研究への参加に組み入れられた。８ミリリットルの血液が、ＣＴＲＵの静脈切開チームによって赤色の蓋の血清管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に採取された。血清は、血液を４０分間凝固させることによって得られた。凝固したら、血液管を、冷却した（４℃）遠心分離機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、２０００×Ｇで１５分間遠心分離した。血清を単離し、２ミリリットルの滅菌、血清学的ピペット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して管内で完全に混合して、貯蔵管に分注する前に均質な溶液を得た。血清を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＩＭＣ）アリコートガイドラインによってアリコートに分配し、−８０℃で凍結した。サイトカインアッセイの日に、ＭＥ／ＣＦＳ事例及び健康対照の一致させたセットを全てのプレートにおいて常に混合して、プレート作為による交絡事例状況を減少させた。要約すると、ＭＥ／ＣＦＳ患者及び対照を、募集及び血清取り扱いプロトコールに関して同じく処置した。
[0071]心血管研究コホート：スタンフォードの施設内倫理委員会による承認後に、国立衛生研究所に支援されている５Ｕ１９ ＡＩ０５０８６研究及びＳｔａｎｆｏｒｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｇｉｎｇ Ｓｔｕｄｙに参加している１５１名の対象を、研究に含めるためにスクリーニングした。スクリーニング工程は、Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ質問表を含めた包括的な健康質問表を含んだ。除外基準は、以下を含んだ：アテローム性動脈硬化症、全身性高血圧、真性糖尿病若しくは認知症などの急性又は慢性疾病の既往歴、早期の心臓血管疾患（＜５５歳）の家族既往歴、非ステロイド系抗炎症薬若しくは定期的な吸入ステロイド中、悪性腫瘍の既往歴、昨年内の手術の既往歴、アトピー性皮膚疾患の既往歴、上気道感染症若しくは尿感染症を含めて直近３カ月以内の感染症の既往歴、及び過去３カ月以内の予防接種の既往歴。軽度の全身性高血圧の既往があるが、診察時に正常血圧（血圧＜１４０／９０ｍｍＨｇ）である８０歳より年上の患者は、研究から除外されなかった。選択及び除外基準に基づいて、９７名の対象を、研究に含めた。患者を、予め指定した年齢境界（即ち、２５〜４４、４５〜６０、６０〜７５及び７５〜９０歳）に従って４つの群に分けた。
[0072]ヒトｉＰＳＣ生成及び培養：患者血液の単離及び使用プロトコールは、スタンフォード大学Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ施設内倫理委員会による承認を得た。患者血液の単離、及びｈｉＰＳＣの生成、培養、特徴付けの詳細は、これまでに発表されている（Ｍａｔｓａら、２０１６年）。
[0073]内皮細胞へのヒトｉＰＳＣ分化：ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）をマトリゲルプレートに播種し、ｈｉＰＳＣ培地中で４日間増殖させて集密度７５〜８０％にした。ＥＣへの分化を、インスリン培地を含まないＲＰＭＩ−Ｂ２７中の６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｈｉＰＳＣを処置し、その後インスリン培地を含まないＲＰＭＩ−Ｂ２７中の２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１の別の処置２日間によって開始した。これら処置の後、分化ｈｉＰＳＣを、２日毎に培地を交換しながら５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４及び２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦｂで補充した内皮培地ＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ）に７日間供した。１２日目に、誘導したＥＣを、ＭＡＣソーティングを使用して単離し、細胞をトリプシンによって最初に分散させ、次いでＣＤ１４４抗体とインキュベートし、最後にＣＤ１４４コンジュゲートした磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含有するＭＡＣＳカラムに通した。ソートした細胞を、次いで０．２％ゼラチンで被覆したプレート上に播種し、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦｂ阻害剤）で補充したＥＧＭ２培地中で維持した。ｈｉＰＳＣ−ＥＣをコンフルエンスになったら継代し、ＥＧＭ２培地中で維持した。
[0074]ヒトｉＰＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ単層心筋細胞分化：心筋細胞分化を誘導するために、およそ１×１０５個の未分化ｉＰＳＣをマトリゲル被覆した６ウェルプレートの各ウェルに播種し、これまでのプロトコール（Ｇｕら、２０１７年；Ｌｉａｎら、２０１２年）に従って分化培地中で培養した。ＦＢＳ及び乳酸塩で補充したグルコース不含ＭＥＭαを利用して、加湿したインキュベーター内で、３７℃、２０％ Ｏ２及び５％ ＣＯ２で４８時間毎に培地を交換しながら９８．０％ αアクチニン陽性に細胞を富化し、細胞が８０〜９０％コンフルエンスに到達したら、細胞を継代した。ヒトｉＰＳＣ−ＣＭを、富化直後に処置した。
[0075]細胞系：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｌｏｎｚａから購入し、そのプロトコールに従って培養した。線維芽細胞は、前述の通り培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。
方法の詳細
[0076]心血管表現型検査：心血管年齢は、３つのパラメータを使用して評価された（１）大動脈脈波速度（ＰＷＶ）、血管硬化の尺度、（２）相対的壁厚（ＲＷＴ）、心室再形成の尺度、及び（３）拡張早期僧帽弁輪運動速度（ｅ’）、心室弛緩の尺度。加えて、拡張終期充満圧の代替マーカーである、初期僧帽弁流入血流速度（Ｅ）とｅ’の比（Ｎａｇｕｅｈら、２００９年；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、２００５年）が、測定された。
[0077]大動脈ＰＷＶを、脈波距離（メートル）と経過時間（秒）の比として算出した。９．０ＭＨｚのＰｈｉｌｌｉｐｓリニアアレイプローブを使用して、頸動脈（主動脈、球及び内頚動脈）及び近位大腿動脈を評価した。脈波距離（Ｄ）を、頸切痕から大腿動脈の距離（Ｘｄｉｒｅｃｔ）として測定し、頸切痕から近位下行大動脈への距離を減算した（Ｄ＝Ｘｄｉｒｅｃｔ−Ｘｎｏｔｃｈ−ａｏｔａ）。交差接線法を使用して、参照ＥＣＧシグナル及び脈波の足（ｆｏｏｔ）からの時間を測定した。心拍数は、頸動脈及び大腿シグナル間で２ｂｐｍ以内でなければならなかった。全てのドップラー信号を１５０ｍｍ／ｓで記録した。観察者間の変動性を、研究室内の５０名のサンプルに対して算出し、クラス内相関係数は、２名の独立した観察者によって測定されたＰＷＶの場合０．９４であった（経路長及び経過時間の独立した測定）。
[0078]超音波心臓診断を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍの推奨に従ってＰｈｉｌｌｉｐｓ ＩＥ３３心エコーシステムを使用して実行した（Ｌａｎｇら、２００５年）。全ての研究は、年齢並びに臨床及び生物学的データを盲検化された１名の医師（ＦＨ）によって解釈された。全てのパラメータを３つ組で測定し、平均化した。心室寸法及び壁厚を、Ｍモードから得られる測定を使用して測定し；中隔束を中隔の測定から及び腱索を後壁の測定から除外した。ＲＷＴを、中隔及び左室内寸法によって分かれている後部壁の和として算出した。心室質量を、ＬＶを長楕円とするモデルに基づくＡＳＥに推薦される公式を使用して推定した（Ｌａｎｇら、２００５年）。左室駆出率を、シンプソンバイプレーン法を使用して推定した。組織ドップラーｅ’速度は、中隔及び外側輪の平均を表す（Ｎａｇｕｅｈら、２００９年；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、２００５年）。観察者間の変動性を、５０名のサンプルに対して算出し；研究室におけるクラス内相関は、ＬＶｍａｓｓ測定の場合０．９３である。
[0079]ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞及び内皮細胞：ｉＰＳＣを５名の健康な個人から得、細胞系は、多能性及びゲノム安定度に関する共通の評価を通過した。これらｉＰＳＣを、純度＞８５％の心筋細胞及び純度＞９０％の内皮細胞に分化させた。ｉＰＳＣ−ＣＭを３０日目に分化させ、ｉＰＳＣ−ＥＣを１４日目に分化させた。両方の型の細胞が、成熟細胞マーカーを発現した。本研究の実験的な成分は、ＩＮＦ−γシグナル伝達経路の異なる３つの成分に重点を置いた。
[0080]遺伝子発現ＣＸＣＲ３を分析するために、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して産生し、リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標） Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実行した。全てのＰＣＲ反応を３つ組で実行し、ＧＡＰＤＨ内在性対照遺伝子に対して正規化し、比較Ｃｔ法を使用して評価した。
[0081]定量的リアルタイムＰＣＲ：ＣＸＣＬ９及びＳＩＲＴ３について遺伝子発現パターンを分析するために、ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ ７４１０４）を使用して抽出し、ｃＤＮＡをｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）を使用して合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１、ＣＸＣＬ９、Ｈｓ００１７１０６５＿ｍ１、ＳＩＲＴ３、Ｈｓ００９５３４７７＿ｍ１）、ＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び７９００ＨＴ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。全てのＰＣＲ反応を３つ組で実行し、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、ΔΔＣｔ相対定量（ＲＱ）法を使用して評価した。
[0082]脈管管状形成：生成したｈｉＰＳＣ−ＥＣの機能を血管形成アッセイにおいて特徴付け、ｈｉＰＳＣと比較した。生成したｈｉＰＳＣ−ＥＣを、５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦで補充したＥＧＭ２培地を含有するマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ［登録商標］Ｍａｔｒｉｇｅｌ［登録商標］Ｍａｔｒｉｘ）で被覆したウェルに１×１０４個細胞播種し、１６〜２４時間インキュベートすることによって管状構造を形成する能力について評価した。
[0083]フローサイトメトリー免疫表現型検査：本アッセイは、スタンフォード大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒによって実行された。ＰＢＭＣを温かい培地中に解凍し、２回洗浄し、１×１０７個生細胞／ｍＬで再懸濁した。ウェル当たり５０μＬの細胞を、キーリソーステーブル（Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｔａｂｌｅ）に示される抗体（全ての試薬はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ製）により室温で４５分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＦＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムで補充したＰＢＳ）で３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μＬに再懸濁した。サンプル当たり１００，０００個のリンパ球を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＤＩＶＡ ６．０ソフトウェアを使用して収集した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏ ｖ９．３を使用して、生細胞を前方対側方散乱プロファイル、次いで前方散乱領域対高さを使用するシングレットに基づいてゲーティングし、その後、細胞サブセット特異的ゲーティングを行うことにより実行した。
[0084]リン酸エピトープフローサイトメトリー（サイトカイン刺激、ｐＳＴＡＴ読出し）：本アッセイは、スタンフォード大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒによって実行された。ＰＢＭＣを温かい培地中に解凍し、２回洗浄し、０．５×１０６個生細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞２００μＬを、９６ウェルディープウェルプレートにウェル当たり播いた。３７℃で１時間置いた後、細胞をサイトカイン（ＩＦＮａ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２又はＩＬ−２１）５０μＬを添加することによって刺激し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＭＣを、次いでパラホルムアルデヒドで固定し、メタノールで透過化し、−８０℃で終夜保った。各ウェルを、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ及びＡｌｅｘａ−７５０色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の組合せを使用してバーコード化し、管にプールした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＦＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムで補充したＰＢＳ）で洗浄し、以下の抗体：ＣＤ３ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ２０ ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５、ＣＤ３３ ＰＥーＣｙ７、ＣＤ４５ＲＡ Ｑｄｏｔ ６０５、ｐＳＴＡＴ−１ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ｐＳＴＡＴ−３ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ｐＳＴＡＴ−５ ＰＥ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ製）で染色した。サンプルを次いで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。刺激条件当たり１００，０００個の細胞を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＤＩＶＡ ６．０ソフトウェアを使用して収集した。データ分析をＦｌｏｗＪｏ ｖ９．３を使用して、生細胞を前方対側方散乱プロファイル、次いで前方散乱領域対高さを使用するシングレットに基づいてゲーティングし、その後、細胞サブセット特異的ゲーティングを行うことにより実行した。
[0085]ＣｙＴＯＦ免疫表現型検査：本アッセイは、スタンフォード大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにおいて実行された。ＰＢＭＣを、温かい培地中で解凍し、２回洗浄し、ＣｙＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％アジ化ナトリウムで補充したＰＢＳ）中に再懸濁し、生存細胞をＶｉｃｅｌｌによって計数した。細胞を１，５００，０００個生存細胞／ウェルでＶ底マイクロタイタープレートに添加し、新しいＣｙＦＡＣＳ緩衝液中でペレット化及び再懸濁することによって１回洗浄した。細胞を、キーリソーステーブルに図示される以下の抗体−ポリマーコンジュゲートカクテル５０μＬにより氷上で６０分間染色した。全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製の精製した、コンジュゲートしていない、担体タンパク質を含まないストックからであった。ポリマー及び金属同位体は、ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。細胞をＦＡＣＳ緩衝液２５０μＬでペレット化及び再懸濁することによって２回洗浄した。細胞を、２μｇ／ｍＬ Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ（天然の存在量のインジウムを含有するＤＯＴＡ−マレイミド［Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ］）を含有するＰＢＳ緩衝液１００μＬに再懸濁した。細胞を、ＰＢＳ ２５０μＬでペレット化及び再懸濁することによって２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中の２％ ＰＦＡ １００μＬに再懸濁し、４℃に終夜置いた。次の日、細胞をペレット化し、新しいＰＢＳ中に再懸濁することによって洗浄した。細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ透過化処理緩衝液（ＰＢＳ中に１×）１００μＬに再懸濁し、ＰＢＳ ２５０μＬで２回洗浄する前に４５分間氷上に置いた。細胞内染色を実行したら、細胞を、ＣｙＦＡＣＳ中で２回洗浄する前に氷上でＣｙＦＡＣＳ中の抗体カクテル５０μＬに１時間再懸濁した。細胞を、イリジウム含有ＤＮＡインターカレーター（ＰＢＳ中に１：２０００希釈；ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬに再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。細胞をＭｉｌｌｉＱ水２５０μＬ中で２回洗浄した。細胞をＣｙＴＯＦ（ＤＶＳ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注射する前にＭｉｌｌｉＱ水中に総容積７００μＬに希釈した。データ分析をＦｌｏｗＪｏ ｖ９．３（ＣｙＴＯＦ設定）を使用して、完全な細胞をインターカレーターのイリジウム同位体、次いでＩｒ１９１対細胞長によるシングレットに基づいてゲーティングし、次いで生細胞をゲーティング（インジウム−ＬｉｖｅＤｅａｄマイナス集団）し、その後、細胞サブセット特異的ゲーティングを行うことにより実行した。
[0086]リン酸エピトープＣｙＴＯＦ（サイトカイン刺激、ｐＳＴＡＴ読出し）：本アッセイは、スタンフォード大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒによって実行された。ＰＢＭＣを温かい培地中に解凍し、２回洗浄し、Ｖｉ−細胞によって計数し、５×１０６個生細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞１００μＬを、９６ウェルディープウェルプレートにウェル当たり播いた。３７℃で１時間置いた後、細胞をｓｔｉｍ（ＩＦＮａ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＬＰＳ又はＰＭＡ／イオノマイシン）２５μＬを添加することによって刺激し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＣｙＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％アジ化ナトリウムで補充したＰＢＳ）で２回洗浄し、表面抗体カクテル２０μＬにより室温で３０分間染色した。細胞をｃｙＦＡＣＳで２回洗浄し、１００％メタノールで透過化し、−８０℃に終夜保った。次の日、細胞をｃｙＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＣｙＦＡＣＳ中で２回洗浄する前にＣｙＦＡＣＳ中の細胞内抗体カクテル２０μＬに室温で３０分間再懸濁した。細胞を、イリジウム含有ＤＮＡインターカレーター（ＰＢＳ中の２％ ＰＦＡ中に１：２０００希釈）１００μＬに再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。細胞をｃｙＦＡＣＳ緩衝液で１回及びＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。細胞をＣｙＴＯＦに注射する前にＭｉｌｌｉＱ水中に７５０×１０５個細胞／ｍＬに希釈した。データ分析をＦｌｏｗＪｏ ｖ９．３（ＣｙＴＯＦ設定）を使用して、完全な細胞をインターカレーターのイリジウム同位体、次いでＩｒ１９１対細胞長によるシングレットに基づいてゲーティングし、その後、細胞サブセット特異的ゲーティングを行うことにより実行した。
[0087]遺伝子発現マイクロアレイアッセイ：高品質のトータルＲＮＡ ５００ｎｇを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ遺伝子発現マイクロアレイ（ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ＢｅａｄＣｈｉｐ、ｖ４）実験に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｙｂ標識法は、逆転写及びビオチン標識ヌクレオチドを新生産物に組み込むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写技術による３’型の遺伝子発現測定を実行する。標識した相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）産物を、ビーズアレイ上へハイブリダイズさせ、洗浄し、ストレプトアビジンＣｙ３で染色する。ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ＢｅａｄＣｈｉｐ上の各アレイは、４８，０００個以上のプローブで２５，０００個以上の注釈付き遺伝子を標的する。ハイブリダイゼーション及びスキャンを、Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄｅ（カタログ番号ＢＤ−９０１−１００２ Ｐａｒｔ＃１１３２２３５５ Ｒｅｖ．Ａ）に記載の通りＳｔａｎｆｏｒｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＦＧＦ）でＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ読取機を使用して実行した。データを、更なるデータ分析のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを使用して抽出した。
[0088]血清免疫タンパク質の決定：Ｌｕｍｉｎｅｘ−ポリスチレンビーズキット。本アッセイは、スタンフォード大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにおいて実行された。ヒト５０又は５１−ｐｌｅｘキットをＰａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入し、下記の通り修飾して製造業者の推奨に従って使用した。簡潔には、サンプルを９６ウェルフィルター底プレート上で抗体に連結したポリスチレンビーズと混合し、室温で２時間インキュベートし、その後４℃で終夜インキュベートした。室温インキュベーション工程を、５００〜６００ｒｐｍで、回転振とう機上で実行した。プレートを真空濾過し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、ビオチン検出抗体と室温で２時間次いでインキュベートした。サンプルを次いで濾過し、上記のように２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥに再懸濁した。室温で４０分間インキュベーションした後、追加の真空洗浄を２回実行し、サンプルを読み取り緩衝液に再懸濁した。各サンプルを複製して測定した。プレートを、サイトカイン当たりサンプル当たり１００ビーズの下限でＬｕｍｉｎｅｘ ２００機器を使用して読み取った。Ｒａｄｉｘ ＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓによるＣｕｓｔｏｍ ａｓｓａｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｅａｄｓを、全てのウェルに添加する。
定量化及び統計分析
[0089]免疫特徴の分布：入力データは、血清タンパク質マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）及び細胞亜集団頻度データで構成された。データを、先に対数変換し、次いで、６つの異なる分布（正規、ラプラス、ログ正規、ログラプラス、ガンマ、ログガンマ）を、最尤推定（ＭＬＥ）を使用して各入力特徴に当てはめた。各特徴について最良の分布を同定するために、５分割交差検定を、各分布について実行した。ｔ検定ｐ値を、正規分布と他の分布の間で５分割検定推定に対して算出した。
[0090]免疫型の同定：処理した細胞亜集団データに対して凝集クラスタリングを実行した。最良のクラスター数を同定するために、ギャップ統計を使用する（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００１年）。ギャップ統計はブートストラップを利用してクラスター品質を推定し、それは、データが一様に分布しているという帰無仮説と比較した改善である。ギャップ統計は、別のクラスターを加えることがクラスター品質に有意な増大を与えないであろう場合に最小数のクラスターを選択する。１０００サンプルのブートストラップ検定で、クラスターの最良の数は１６個と決定される。それゆえ、１６個のクラスターを含む凝集クラスタリングをデータに対して実行して１６個の免疫サブタイプを同定する。
[0091]免疫型の免疫学的分析：１００１名の対象全員に利用可能な免疫タンパク質データ（５０種のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子：ＭＩＧ、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＧＲＯＡ、ＩＬ２、ＴＧＦＡ、ＰＡＩ１、ＭＩＰ１Ａ、ＬＥＰＴＩＮ、ＩＬ１Ｂ、ＬＩＦ、ＩＬ５、ＩＦＮＡ、ＩＬ４、ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦＢ、ＴＧＦＢ、ＭＣＳＦ、ＰＤＧＦＢＢ、ＩＬ７、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ１２Ｐ４０、ＩＬ８、ＳＣＦ、ＧＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＰ１Ｂ、ＩＬ１２Ｐ７０、ＲＥＳＩＳＴＩＮ、ＩＦＮＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦＡ、ＭＣＰ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＮＡ７８、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１０、ＩＰ１０、ＩＬ１３、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１５、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦＢ、ＩＬ６、ＭＣＰ３、ＶＣＡＭ１、そして、ＦＡＳＬ）を使用し、合計８１８名の対象に利用可能なサイトカイン刺激データ（８４個の異なるサイトカイン−細胞−リンタンパク質の組合せ）に対するｅｘ ｖｉｖｏシグナル応答を使用した。各免疫型を識別する署名を開発するために、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）を使用して訓練セットに分類子を作成し、試験セットにおいて事後検証した。マイクロアレイの予測分析は、分類に対して表現型特異的な「最短収縮重心法」を作成する統計的技術であり、従ってそれを使用して、免疫型全体で各免疫特徴のレベルを比較することができる。これは、訓練セット内で両立される１０分割交差検定によって行われ、これにより分類誤差を最小限にする閾値を選択することができる。本方法は、標準的な最短重心分類に１つの重要な修飾を行い；全ての免疫型について免疫型重心のそれぞれを全体の重心の方へ「収縮」させ、ノイズが多い特徴の効果を減少させることで分類子をより正確にするので、優位性を得られる。血清タンパク質のレベル又は特定の免疫型（例えば、高齢［１３、１４及び１６］に関連する型）のシグナル応答の比較が、生データに対する改変フィッシャー複合確率（Ｄａｉら、２０１４年）の完全独立検定によって行われた。
[0092]免疫型の臨床的分析：各疾患について、Ｌ１罰則で罰則化されるロジスティック回帰モデルを、予測値：免疫型につき性別、年齢、ＢＭＩ及びダミー変数、を使用して当てはめた。罰則化ロジスティック回帰の訓練手順は、３分割を超える交差検定を使用してＬ１罰則の重みを選択した。モデルのパラメータの有意性を評価するために、順列検定を実行した。患者への疾患の割り当てを１０００回並べかえた。そのような各順列について、同じ当てはめ手順を使用して罰則化ロジスティック回帰重みを得た。実際のデータに対して学習した重みが、絶対値で、どの程度の頻度で並べかえデータに対して計算した重みを超えたか評価した。経験的ｐ値としてこの出現頻度を、報告した。
[0093]代謝遺伝子モジュール分析：モジュール分析を、患者３９４名の下位コホートからの代謝遺伝子に対して実行する。代謝遺伝子セットと重複した遺伝子が８５１個あった（Ｐｏｓｓｅｍａｔｏら、２０１１年）。凝集クラスタリングを、標準化した対数変換した代謝遺伝子発現レベルに対して５０個のクラスターで使用した。各クラスターについて、スピアマンの相関係数を算出し、ｐ値を、遺伝子発現レベル全てと患者年齢の間で得た。
[0094]ガイド付き自動エンコーダ（ＧＡＥ）及びＳＣＩ：多くの寸法を持つデータを扱う場合、目標は、データを場合によってコンパクト表現に要約する合理的な方法を見つけることであった。このコンパクト表現は、特徴抽出、視覚化又は分類目的で更に使用され得る。有益な表現を得るために、「ガイド付き自動エンコーダ」と呼ばれる新規のモデルが提案された。そのモデルは、複合的な目的を含む自動エンコーダに基づいて築かれる。自動エンコーダは、データの非線形変換を使用する。それゆえ、それはより複雑な処理をモデル化することができる（Ｂｅｎｇｉｏ、２００９年）。自動エンコーダの問題の１つは、再パラメータ化である。初期化が異なると、結果が異なる可能性がある。類似の要約レベルを持つ異なる型の視覚化の中で、特定の標的に有益である表現が通常求められる。それゆえ、２つの焦点：１）学習したコンパクト表現ｈは、可能な限り元データに回復され得る（再構築損失）；２）学習したコンパクト表現は、可能な限り所望の標的に有益であるべきである（予測損失）、を持つ表現が構築され得る。従って、２つの目的を両立させて、有益な表現を提供するために新規の構造であるガイド付き自動エンコーダ−を提案した。ＳＣＩを抽出するためにＧＡＥを適用した。ＧＡＥは、真の年齢を近似し、一方でサイトカインレベルの情報を保持する人のサイトカインデータの非線形変換である。
[0095]自動エンコーダ：入力データベクトルｘならば、自動エンコーダは入力データベクトルｘを再構築することを意図する。Ｌ個のエンコーディング層及びＬ個のデコーディング層を持つ自動エンコーダを、深度Ｌを有するとみなし、各層は一定数の隠れ節ｍを有する。便宜上、入力層をｈ０（ｘ）＝ｘと定義し、第ｌ隠れ層の出力をｈｌ（ｘ）と定義する。層ｌ中の節の数は、ｍｌである。ネットワークの第ｌ層への入力を
Figure 2021514479
と定義し、Ｗｌは、ｍｌによるｍｌ−１の実数値の重みマトリックスであり、βｌは長さｍｌ−１のベクトルである。第ｌ隠れ層の出力は
Figure 2021514479
であり、ｔａｎｈは、双曲線正接関数
Figure 2021514479
である。コーディング層として第Ｌ層の出力ｈＬ（ｘ）を定義した。デコーディング層は、同じ設定を持つＬ＋１から２Ｌ−１層である。最終的に、線形出力層は、最後のデコーディング層
Figure 2021514479
上にある。データベクトルｘならば、自動エンコーダが訓練され、データに対する再構築損失は最小化され
Figure 2021514479
ｉは、サンプル数の範囲であり、θは、自動エンコーダにおいて使用される全てのパラメータを表し、λは、正則化に使用される重み減衰罰則である。目的（１）を最適化するために、確率的最適化手法ＡＤＡＭ［３］を使用した。
[0096]ガイド付き自動エンコーダ：ガイド付き自動エンコーダは、再構築損失と予測損失両方を減少させることを意図する。入力ｘ、横の表現型ｙ及び自動エンコーダｆＡＥならば、ガイド付き自動エンコーダは、独自パラメータの組ｗＧ及びβＧを含む、コーディング層に対する予測関数
Figure 2021514479
を組み込む。
θをＧＡＥの全てのパラメータの組であるとすると、訓練目的は
Figure 2021514479
であり、αは、ガイダンス比と呼ばれる０〜１の実数の値である。深度２及び幅３を持つ例としてのガイド付き自動エンコーダを下で示す。
Figure 2021514479
[0097]最適化方法ＡＤＡＭ（Ｋｉｎｇｍａ及びＪｉｍｍｙ、２０１４年）を使用して、目的を最小化した。異なるガイダンス比を選択することによって、予測損失と再構築損失の間で異なるレベルで両立を達成できる。
[0098]ＳＣＩの抽出：患者の免疫系の健康状態のマーカー要約を提供するために、新規の量、ＳＣＩを発明した。この量は、免疫系の状態から予測可能な患者の年齢である。この量を得るために、サイトカイン測定に重点を置いた。構築により、ＳＣＩはサイトカイン測定の非線形関数であるが、患者の真の年齢の推定値でもある。
[0099]この量を構築するために、サイトカイン測定を簡潔に表し、横の表現型実年齢を予測することを意図するガイド付き自動エンコーダ（ＧＡＥ）を使用した。５分割交差検定を使用して、長さ１〜１０の中から最良のコード長を同定した。成績が、より長いコードより統計学的に有意に悪くなかった（対応のあるｔ検定ｐ値＞０．０５）コードｋの長さを選択した。各分割内で入れ子式３分割交差検定を実行して、ハイパーパラメータ（深度、重み減衰及びガイダンス比）を選択した。
[0100]最良のコード長５を得た後（図１０Ａ）、５分割交差検定を使用して、コード長５で全てのＧＡＥに対して最良のハイパーパラメータ設定（深度＝２、ガイダンス比＝０．２、Ｌ２＝０．００１）を選択した。最終的に、ＧＡＥは、選択した最良のハイパーパラメータ設定を用いて全体のデータセットに対して訓練され、ＳＣＩ予測因子として予測関数を得た。
データ及びソフトウェア有効性
[0101]データ有効性：Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ研究の細胞亜集団、免疫タンパク質及び細胞シグナル伝達データは、以下の研究ＩＤ ＳＤＹ３１１（サイトカイン、ホスホフローアッセイ及びＣｙＴＯＦ表面表現型検査）、ＳＤＹ３１２（サイトカイン、ホスホフローアッセイ及びフローサイトメトリー表面表現型検査）、ＳＤＹ３１４（フローサイトメトリー表面表現型検査）、ＳＤＹ３１５（サイトカイン、ホスホフローアッセイ及びＣｙＴＯＦ表面表現型検査）及びＳＤＹ４７８（サイトカイン及びＣｙＴＯＦ表面表現型検査）の下でＩｍｍＰｏｒｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ上で一般公開されている。
慢性疲労症候群対照サンプルの遺伝子発現データは、下のＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）上で利用可能である。
結果
１０００イムノームプロジェクトの研究設計
[0102]２００７年〜２０１６年の間、年齢８から＞８９歳の通院対象（Ｎ＝１００１）（男性３３９名及び女性６６２名）を、老化及び予防接種の経時的研究（Ｂｌａｚｋｏｖａら、２０１７年；Ｂｒｏｄｉｎら、２０１５年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１７年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１４年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１３年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１５年；Ｐｒｉｃｅら、２０１３年；Ｒｏｓｋｉｎら、２０１５年；Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら、２０１６年；Ｗａｎｇら、２０１４年）及び健康な対照だけが含まれる慢性疲労症候群（Ｍｏｎｔｏｙａら、２０１７年）の独立した研究のためにスタンフォード大学（１０００ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ；１ＫＩＰ）で募集した。選択及び除外基準は、ＳＴＡＲ Ｍｅｔｈｏｄｓセクションの下に見ることができる。１ＫＩＰの全てのサンプルについて、深層免疫表現型検査を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＩＭＣ）で行い、末梢血標本を厳密に標準化した手順を使用して処理及び分析した（Ｍａｅｃｋｅｒら、２０１２年）。全血を利用して全ゲノムのトランスクリプトームを分析し（Ｎ＝３９４）；血清サンプルを得、使用して、タンパク質（合計５０種のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を含む）の含有量を決定し（Ｎ＝１００１）、サイトメガロウイルス陽性（Ｎ＝７４８）、免疫系変動の主要決定因子を血清学的に評価した（Ｂｒｏｄｉｎら、２０１５年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１５年）。末梢血単核細胞又は全血サンプルを使用して、細胞表現型及び頻度を決定し（Ｎ＝９３５）、様々なサイトカイン刺激に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞応答を調査した（Ｎ＝８１８）。拡張臨床的報告書形式を、２３１名が男性及び３８６名が女性である６１７／１００１名の対象から収集した（図１及び表１）。
[0103]図１は、「ＯＭＩＣＳ」手法による、免疫系の系統的分析を含む１０００イムノームプロジェクト研究デザインを図示する。Ｓｔａｎｆｏｒｄ １０００ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔは、２００７年〜２０１６年の間に募集した年齢８から＞８９歳の通院対象１００１名（男性３４％、女性６６％）で構成される。１ＫＩＰの全てのサンプルについて、深層免疫表現型検査を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒで行い、末梢血標本を標準的な手順を使用して貯蔵及び分析する。末梢血サンプルを、静脈穿刺から得、末梢血単核細胞又は全血サンプルを使用して、細胞表現型及び頻度を決定し（Ｎ＝９３５）、様々なサイトカイン刺激に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞応答を調査し（Ｎ＝８１８）、血清サンプルを得、使用して、タンパク質（合計５０種のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を含む）の含有量を決定し（Ｎ＝１００１）、全血を利用して全ゲノムのトランスクリプトームを分析した（Ｎ＝３９４）。臨床的特徴付けを、合計６１７名の対象において臨床質問表によって評価し、そのうち５２７名は、５３個の臨床項目の一式を完了したので分析され得た。合計９７名の健康な若年及び高齢成人から、包括的な心血管表現型検査も、行われた。１０００ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ（「１ＫＩＰ」）のデータを、表１に示す。
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免疫細胞亜集団及び循環タンパク質の分布
[0104]健康の免疫「測定基準」を見いだす目的で、末梢血からの５０種の循環タンパク質のレベル及び２５種の主要な免疫細胞の頻度の分布を特徴付けた。分布は、研究した集団における特定の免疫形質の観察した出現頻度を記載するので、サンプルの重要な統計的特徴である。そのため、集団研究において広く使用されている確率分布の強力な推定量である最尤推定（ＭＬＥ）法を使用して、各免疫特徴について６つの異なる分布：正規、ラプラス、ログ正規、ログラプラス、ガンマ及びログガンマを当てはめた（Ｊｏｈａｎｓｅｎ及びＪｕｓｅｌｉｕｓ、１９９０年）。各免疫特徴の分布を最もよく説明するモデルを同定するために、正規と各特徴の分布間のＭＬＥ検定に対して５分割交差検定を実行した。この方法によって、Ｐ値を得、ヌルモデルに対する各免疫特徴分布を決定した（方法を参照のこと）。
[0105]細胞亜集団及び循環免疫タンパク質の７５個の免疫特徴のうち、１２個（１６％）しか正規に分布しなかった、３／２５個の細胞亜集団（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び循環タンパク質の場合９／５０（１８％）（図９及び図１４）。一般に、最もよくモデル化された分布は、正規分布（ラプラス、ログ正規及びガンマなど）より重い裾を呈し（図９）、このことは、細胞頻度又は免疫タンパク質のいずれかに対して極値を持つ対象を見いだす確率が大きいことを示す。最も一般的には、細胞亜集団はラプラス分布を呈した（図９）。例えば、この型の分布を呈する細胞サブセットは、Ｂ細胞並びにＢ細胞サブタイプＩｇＧ＋ＣＤ２７＋、ＩｇＧ＋ＣＤ２７−、ＩｇＧ−ＣＤ２７＋及びＩｇＧ−ＣＤ２７−、移行期Ｂ細胞；ＮＫ及びＮＫＴ細胞；セントラルメモリＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞；及びエフェクターメモリ及びｎａｉｖｅ ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度であった（図１４）。循環免疫タンパク質の場合、大部分のケモカインもラプラス分布を呈したが、正規分布が標準的な炎症性サイトカインＩＬ−１βに見られ、対数正規分布がＩＬ−６及びＴＮＦ−αに見られた。
[0106]まとめると、これらの結果から、血液免疫細胞及びタンパク質の圧倒的多数に関して裾の重い分布が正常なものより一般的であることが実証され、先行文献と一致して、極値がヒト集団の免疫系において比較的一般的であることを示す（Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉら、２０１７年）。
免疫型の同定
[0107]細胞は、免疫系の量子であり、それゆえ、免疫細胞の割合及び活性は、免疫応答の開始及び予後、並びに系を恒常性に戻す解決能力を統制する。類似の免疫構成を共有する個人のクラスターを同定し、健康対疾患状態にこれを更に関連付けるために、９３５／１００１名の対象から入手可能な細胞割合データを利用した。データは、質量サイトメトリーを使用して分析した７２１名のサンプル及びフローサイトメトリーを使用して分析した２１３名からなった（図１５）。比較的大きなサンプルサイズの研究を活用することによって統計的検出力を最大化するために、両方のコホートにおいて一般に測定される細胞型の合計数を使用した。これは合計２５個の細胞亜集団を生じ、その亜集団を、全９３５名の対象において一貫して測定した。データを正規化し、各特徴とデータソースの間の線形相関がゼロであるようにデータソースに対して回帰分析を行った（方法を参照のこと）。クラスタリング分析を、処理したデータに対する凝集クラスタリングを使用して行った。有意なクラスターを同定するために、ギャップ統計を使用した。ギャップ統計は、形成されたクラスターのクラスター内分散を比較し、それに対して「ヌル」分布を作成するためにブートストラップを利用するよく確立された方法であり（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００１年）、従って、各クラスターの統計的有意性の推定が可能になる。１０００個のブートストラップを使用した結果、クラスターの最善の数は１６個であった。元データに対する主成分分析（ＰＣＡ）は、最初の３つのＰＣＡがこれらクラスターの大部分を明らかにすることを示した。一部のクラスターは、別の投射において異なる可能性があったので最初の３つのＰＣＡによってよく分離されなかった。
[0108]１６個の固有の免疫型を、免疫細胞割合を使用して同定され得る。細胞サブセット頻度（Ｎ＝２５）を、合計９３５名の対象から一貫して得た。各細胞型の割合に基づいて、個人は、凝集クラスタリングを使用してクラスター化される。有意なクラスターを導くために、ギャップ統計を使用した（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００１年）。形成したクラスターのクラスター内分散を比較し、それに対して「ヌル」分布を作成するために１０００個のブートストラップを実行した。
[0109]免疫型に対する平均サンプルサイズは、５８個であった；しかしながら、各クラスターの対象数は有意に変動し、一部のクラスターは、数十個のサンプルを有し（例えば、免疫型２、１０及び１１）、その他は、１００個以上のサンプルを有した（例えば、免疫型４及び７）。
[0110]これら１６種の免疫型の人口統計学的特徴付けは、免疫型全体で対象の実年齢に大きな変動を示したが、これは、細胞サブセット頻度に対する周知の強い年齢効果を考慮すれば驚くことではない（Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒ及びＦｕｒｍａｎ、２０１３年）。例えば、免疫型３、４、８、１０及び１２の大部分の対象は、若年及び中年対象（それぞれ平均年齢２３、３３、２３、３４及び３６歳）であり、免疫型１、２、５、６、９及び１１は中年及び高齢対象（それぞれ平均年齢５０、５３、５２、５０、４９及び４９）に対応し、免疫型１３、１４及び１６は高齢成人（平均年齢６０歳及びそれ以上）に大部分含まれた。興味深いことに、大きな年齢変動も免疫型内に観察され；特に、高齢と関連する免疫型（例えば、免疫型１３及び１６）も若年成人の群を含んだことは、ヒトにおいて、老化と関連する細胞割合の特定の組合せが、若年健康成人にも見いだされ得ることを示唆している。
[0111]平均ＢＭＩは、免疫型全体で同程度であった（平均：２５．９、範囲：２４．７〜２９．４）；しかしながら、免疫型内で大きな個人的変動が見られた（範囲：１３．１〜５２．１）。
[0112]免疫型全体のＣＭＶ血清陽性の変動率は、一部の免疫型において研究コホート（５３％）より有意に高く（例えば、免疫型１１［７８％］及び１４［７２％］）、他の場合有意に低い（例えば、免疫型３［３２％］及び１３［３５％］）発生率で観察された（Ｐ＜０．０５）。同様に、コホート内の個人の性別に関しては、一部の免疫型は、全コホートの平均男性率（３４％）と比較して男性に富み（例えば、免疫型６［５４％］及び１０［５９％］）、その他は女性に富んだ（例えば、免疫型３［８１％］、９［７６％］及び１２［８１％］）。ＢＭＩの大きな変動は、大部分の免疫型に観察され、肥満が免疫系応答及び全体的な健康に影響し得ることは周知なので、ＢＭＩを、追跡関連及び分析の共変量として含めた。同様に、幅広い性別効果がヒト免疫系に観察され（Ｂｌａｚｋｏｖａら、２０１７年；Ｆｕｒｍａｎら、２０１４年）、ＣＭＶ感染症が免疫系機能に劇的に影響することが実証されてきた。従って、年齢及びＢＭＩを共変量として含めることに加えて、免疫型の追跡臨床的分析が、性別及びＣＭＶに合わせて調整された。
免疫型の免疫特徴付け
[0113]炎症レベル及び急性抗原接種に応答する免疫細胞の能力に関して免疫型を特徴付けるために、１００１名の対象全員に利用可能な免疫タンパク質データ（５０種のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子）及び合計８１８名の対象に利用可能なサイトカイン刺激データ（８４個の異なるサイトカイン−細胞−リンタンパク質の組合せ）に対するｅｘ ｖｉｖｏシグナル応答を使用した（表１）。分析は、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２年）、最短収縮重心法を使用して免疫型全体で各免疫特徴のレベルを比較する統計的技術、を使用して計算した（方法を参照のこと）。本方法は、標準的な最短重心分類に１つの重要な修飾を行い；全ての免疫型について免疫型重心のそれぞれを全体の重心の方へ「収縮」させ、ノイズが多い特徴の効果を減少させることで分類子をより正確にする（方法を参照のこと）。大部分の場合、各免疫型は、相関するレベルの免疫タンパク質を呈し、即ち、所与の免疫型の場合、サイトカインが他の全ての免疫型に対してより高い又はより低いレベルで見られ、大部分のサイトカインは同じ方向に変化する傾向があり、類似の現象がシグナル応答について観察された。循環免疫タンパク質のレベルが低い、及びその逆の免疫型においてより有力な応答が観察され、従って、このことは、炎症マーカーが、免疫抗原接種に対する急性応答の負の予測因子であることを示すＦｏｕｒａｔｉ Ｓら（２０１６年）（Ｆｏｕｒａｔｉら、２０１６年）、Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら（２０１６年）（Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら、２０１６年）及びＶｅｒｓｃｈｏｏｒ ＣＰら（２０１７年）（Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒら、２０１７年）の最近のデータと一致して、急性免疫抗原接種に協調した応答及び全身性炎症の負の効果を示す。
[0114]高齢者（１３、１４及び１６）に関連する免疫型における循環免疫タンパク質のレベルは他の全ての免疫型において観察されるそれより高く（組合せＰ＜０．０１）、このことは、高齢成人において観察される低悪性度慢性炎症の周知の現象と整合している。一般に、１２型を除いて、若年及び中年対象（３、４、８、１０及び１２型）に関連する免疫型は平均的研究コホートと全く異ならないタンパク質レベルを呈し、１２型は、他の全てと比較して有意により高いレベルのサイトカインを有し（Ｐ＜０．０１）、年齢６０＋の高齢成人の小さい群（Ｎ＝１１）を含んだ。
[0115]これらの所見は、一般的な集団において、実年齢が若く、高齢者と免疫学的により類似した個人の群（免疫型１３及び１６の若年成人の場合）、及び高い炎症性レベルを呈するにもかかわらず、サイトカイン刺激に対するシグナル応答が保持されている若年成人（例えば、免疫型１２）とクラスター形成する高齢成人のサブグループが存在することを示す。
免疫型の臨床的特徴付け
[0116]免疫型の臨床的影響を決定するために、免疫型３、４、７、８、１０、１２、１３、１４、１５及び１６に属する５２７／６１７名の参加者から一貫して得られた臨床質問表（合計して５３個の疾患特徴）（図１６）から、各免疫型を疾患状態と関連させる地図を得た（図２）。有意な相関を、そのような疾患特徴の合計１６個について観察した（年齢、性別、ＣＭＶ及びＢＭＩ調整後、ｐ＜０．０５）。予想通り、がん並びに骨、筋肉及び関節を含めた他の加齢に伴う症状などの低い発生率が、他の全ての免疫型と比較して免疫型３（平均年齢２３歳、年齢範囲８〜５２歳）で観察された。しかしながら、免疫型８（平均年齢２３歳、年齢範囲１２〜７９歳）の対象における、がん及び高血圧の低い発生率の呈示にもかかわらず、陽性相関が、筋肉及び関節痛などの筋骨格症状並びに泌尿器系疾患に見られた（図２）。興味深いことに、大部分が若年対象で構成されるが高齢対象の小集団と免疫プロファイルを共有する免疫型１２は、生殖器及び生殖系、並びに胃腸、内分泌代謝、皮膚病及び泌尿器系に関連するものを含めた疾患から大部分保護された。これらの観察にもかかわらず、免疫型１２の対象は、平均して、他の全ての免疫型と比較して筋肉及び関節痛の発生率が高く（Ｐ＜０．００１）、がん発生率は低いが、有意であった（Ｒ＝０．０９、Ｐ＜０．０５）。
[0117]免疫型１３、１４及び１６について次に研究した。免疫型１３、１４及び１６は、６０歳及びより上の年齢の高齢成人で大部分構成されたが、異なるパターンの疾患発生率を有した。例えば、免疫型１４（平均年齢７７歳、年齢範囲２９〜９０歳）の対象は、胃腸症状及び筋肉−関節痛の発生率が低いが、生殖器及び生殖疾患の発生率は比較的高かった（研究コホートより高い）（図２）。それに対して、免疫型１３（平均年齢６０歳、年齢範囲１６〜９０歳）の個人は、泌尿器及び筋骨格症状の比較的低い発生率を呈したが、型１６（平均年齢６０歳、年齢範囲９〜９０歳）は、耳疾患及び骨関節炎の高い発生率を示した。
[0118]心臓血管疾患など、死亡率に関連するより関連した老人性疾患については、免疫型１３及び１６両方の対象は、高血圧及び他の心血管症状の率が高いことを含めてそのような症状の発生率が高かったが、１４型の対象は、これらの疾患から保護されていた。加齢に伴う免疫型１４は「健康な老化免疫型」（ＨＡｉＴ）に分類され、免疫型１３及び１６は「不健康な老化免疫型」（ＵＡｉＴ）に分類された。まとめると、これらの結果は、細胞亜集団頻度のプロファイルに基づいて個人を免疫型にクラスタリングすることが様々な疾患及びヒトの健康の維持における免疫系の重要性に関する情報を提供し得ることを実証する。
ＳＣＩの構築
[0119]特に心臓血管疾患の分野において、高齢に関連する様々な疾患の発症における低悪性度の全身性及び慢性炎症のますます認識された効果（Ｆｕｒｍａｎら、２０１７年；Ｒｉｄｋｅｒら、２０１７年）を考慮すれば、個人の炎症性レベルを要約し得る測定基準を構築することが重要であった。この型の炎症は、組織損傷、代謝性機能不全及び環境的負荷への曝露（「エクスポソーム」とまとめて命名された）に応答する不適応な反応として起こると考えられる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＤｉｘｉｔ、２０１５年；Ｋｏｔａｓ及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１５年）。従ってその炎症は、急性炎症応答とは異なって感染症又は外傷に応答して起こり、高悪性度で自己制限的なものである。急性炎症の場合、多くの標準的なマーカーが検証されており、これらには、急性期タンパク質、Ｃ反応性タンパク質並びに、とりわけ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αなど有力な炎症性サイトカインがある。しかしながら、老人性慢性炎症に標準的なバイオマーカーは存在しない（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、２０１７年；Ｍｏｒｒｉｓｅｔｔｅ−Ｔｈｏｍａｓら、２０１４年）。従って、サイトカインネットワークの非線形構造を簡潔に表すために不偏な手法を企てた。そのために、ガイド付き自動エンコーダ（ＧＡＥ）と呼ばれる深層学習方法を、合計１００１名の対象からの、合計５０種のサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を包含する循環免疫タンパク質データに適用した。
[0120]ＧＡＥ法において、元データは非線形関数によって少数の「コード」に組み合わせられる。ＧＡＥ法は、強力なＧＡＥモデルが元の生データをコードから正確に予測（データ再構成）できるように、データ内のノイズ及び重複を排除し、更に大部分の関係情報を保持することを意図する（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。分析において、計算の目的は、元のサイトカインデータ、並行して個人の実年齢を予測することであった（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。得られた予想値は、両方とも真の年齢を近似するサイトカインデータの非線形変換の結果であり、一方サイトカインレベルで情報を保持する。それゆえ、ＧＡＥ予測した年齢は、炎症性スペース又は「ＳＣＩ」における所与の個人の年齢を表す。元のサイトカイン入力データを予測する能力は、通常ＧＡＥ法におけるコード数の関数なので、最初に、最良のコード長を同定することが重要であった。そのために、コード長１〜１０の各ＧＡＥ（図１１）について５分割交差検定を使用した。各分割において、３分割交差検定を使用する最良のハイパーパラメータ（深度、重み減衰及びガイド付き比）を使用した（方法を参照のこと）。予測損失（年齢を予測する精度）及び再構築損失（サイトカインデータを予測する精度）の和として各モデルの誤差（合計損失）を算出した。最後に、５つ全ての分割に対してコードの追加が合計損失を有意に改善しない（ｔ検定ｐ値＜０．０５）ような最小のコード長を持つＧＡＥを同定した。この方法を使用して、最良のコード長は５であった（図１１Ａ）。
[0121]ＧＡＥ法の堅牢性及び品質を試験するために、年齢予測の精度を、エラスチックネット（ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ）及び主成分分析（ＰＣＡ）などの線形方程式を使用する他の広く使用されている次元削減法、並びにプレーン自動エンコーダ（ｐｌａｉｎ ａｕｔｏ−ｅｎｃｏｄｅｒｓ）及びニューラルネットワークなどの非線形方程式を含む方法に対して比較した（図１０Ａ〜図１０Ｂ及び図１１Ｂ）。全体として、ＧＡＥ法は、プレーンニューラルネットワーク（Ｐ＝０．５４）との比較を除いて、実年齢の予測において他の方法を上回る性能（Ｐ＜０．０５）を示した（図１２Ｂ）。これらの結果は、高齢ヒトにおける低悪性度慢性炎症の周知の現象が、非線形方法を使用して最もよくモデル化されることを示し、これに基づいて、循環免疫タンパク質のレベルによって測定される合計炎症性レベルに関連する生物学的情報を保持しながら実年齢を正確に予測する測定基準を得ることができる。
ＳＣＩは、同時罹患数及び心血管老化と相関する
[0122]老人性病変に対する慢性炎症の効果に関して更なる洞察を獲得するために、異なる生理学系を表し、高齢に一般に関連する１０個の疾患項目、及び疾患の和（同時罹患数）とＳＣＩの間で計算した回帰分析を選択した。分析した項目は、がん、心血管、呼吸、胃腸、泌尿器学、神経、内分泌代謝、筋骨格、生殖器生殖及び精神医学的であった。これら全ての疾患特徴は二者択一であった。これらの分析の場合、調整を、年齢、ＢＭＩ、性別、ＣＭＶ及び高コレステロール（これも二者択一のカテゴリーである）（図３Ａ）について行い、老人性病変の病因におけるこれら変数のそれぞれの報告されている効果を考慮した。複合試験（順列検定による）を制御した後に、研究した集団におけるＳＣＩと同時罹患数の間の有意な相関（Ｎ＝５２７、Ｐ＜０．０００１）が、観察された（図３Ａ）。
[0123]高血圧及び他の心血管症状における慢性炎症のますます認識される効果を考慮して、年齢６０から＞８９歳の合計４０名の対象（健康対象２０名及び疾患対象２０名）を心血管老化に重点を置いた追跡研究のために選択した。募集後、インフォームドコンセントを全ての研究参加者から得、参加者を２７個の変数を包含するベースライン超音波心臓診断及び脈波速度試験（方法を参照のこと）に次いで供した。相関ネットワーク分析は、これらの多くが正に相関していることを示し（図１２）、これら変数のいくつかが、考慮に入れた２つ以上の関連する超音波心臓診断測定の算出の結果得られることを考えると、それは驚くことではなかった。例えば、心室再形成及び心血管老化の尺度である再形成比又は相対的壁厚（ＲＷＴ）は、心拡張期における心室間中隔寸法（ＩＶＳｄ）と心拡張期における後壁寸法（ＰＷｄ）の和を左室内寸法（ＬＶＩＤｄ）で割って算出され得る（方法を参照のこと）。
[0124]回帰分析が計算され、回帰係数の有意性を得るために、順列手順による複数の仮説検定を調整した。５００個の順列を使用して、ＳＣＩが、２つの変数、拡張期心室間中隔寸法（ＩＶＳｄ）（Ｑ＝０．１８）、及び左室質量対容積比（ＬＶｍｖ）（Ｑ＝０．１２）としか正に相関しないことが判明した（図４）。境界線上の有意性（Ｑ＝０．２１）であるが、正の相関が相対的な壁厚（ＲＷＴ）についても観察された（図４）。
[0125]これらの結果は、ＳＣＩが老人性同時罹患数及び心血管老化の重要な免疫特徴であることを示す。
ＣＸＣＬ９は、ＳＣＩの重要な成分であり、健康な成人において心血管老化と相関する
[0126]炎症が心血管機能不全に関連する潜在的機序について更なる洞察を獲得するために、どの因子がＳＣＩに最も寄与するか分析することが目標であった。そのために、ＳＣＩを、最も可変的なヤコビアン（ＳＣＩの一階偏導関数）を計算することによって単一の免疫タンパク質の特徴に分解した。ＳＣＩに対して正及び負の要因（図５）が、見つかった。最も可変的なヤコビアンの上位１５個は、ＣＸＣＬ９、ＥＯＴＡＸＩＮ、Ｍｉｐ−１α、ＬＥＰＴＩＮ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＦＮ−α及びＩＬ−４（正の要因）並びにＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ−β、ＧＲＯ−α、ＩＬ−２、ＴＧＦ−α、ＰＡＩ−１及びＬＩＦ（負の要因）であった（図５）。
[0127]ＳＣＩが心血管老化に関連することを示すこれまでの所見から同時罹患数の潜在的交絡因子効果を切り離すために（図４、上を参照のこと）、厳格な選択基準を使用して募集した対象合計１５１名から選択し、心血管リスクプロファイルに関してよく一致した健康な成人（年齢２５〜９０歳）９７名の群において、追跡研究を行った（方法を参照のこと）（表２）。
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[0128]４８連のパネルを使用して炎症マーカーを測定し、全ての研究参加者から大動脈脈波速度（ＰＷＶ）及び超音波心臓診断を得た。大動脈ＰＷＶを、脈波距離（メートル）と経過時間（秒）の比として算出し、ＲＷＴをこれまでに記載されている通り算出した（方法を参照のこと）。
[0129]この健康なコホートにおいて、４８種の循環免疫タンパク質から、６種しか年齢と有意に相関せず（Ｐ＜０．０５）、中でもＣＸＣＬ９、ＩＬ−１１Ｒα、ＣＸＣＬ１０及びＨＧＦは老化とともに増大し、ＧＲＯ−α及びＬＩＦは減少した。それに対し、ＩＬ−１β（Ｒ２＝０．０１３、Ｐ＝０．２６）、ＴＮＦ−α（Ｒ２＝０．００２、Ｐ＝０．６４）、ＩＬ−６（Ｒ２＝０．０２６、Ｐ＝０．１１）又は高感度（ｈｓ）−ＣＲＰ（Ｒ２＝０．００４、Ｐ＝０．５６）などの標準的な急性炎症タンパク質において有意な年齢依存的変化は存在せず、このことは、年齢に伴うこれらマーカーの増大は高齢と関連する根本的な病理学的工程の結果得られる可能性が高く、老化そのものの結果ではないことを示唆している。年齢に無関係であり健康な個人に潜在的に存在する心血管老化に関連する炎症マーカーを同定するために、重回帰階層分析を、このコホート内の老化に関連する選択した炎症マーカー（ＣＸＣＬ９及びＬＩＦ）及び研究した全ての個人から得た心血管測定に対して実行した（方法を参照のこと）。これら分析のために、調整を、年齢、性別、ＢＭＩ、心拍数、収縮期血圧、空腹時血糖値及び総コレステロール対ＨＤＬ比について行った。Ｐ値＜０．０１で、ＣＸＣＬ９と心血管老化マーカーＰＷＶ（Ｒ＝０．２２）及びＲＷＴ（Ｒ＝０．３）と正の相関が判明し、ＬＩＦとＰＷＶ（Ｒ＝−０．２７）及びＲＷＴ（Ｒ＝−０．２２）の間に負の相関が判明した（図６Ａ及び図６Ｂ）。総合すれば、これらの結果は、不顕性心臓肥大及び動脈硬化の増大が、循環ＣＸＣＬ９レベルが上昇し、ＬＩＦの血中濃度が低い他の点では健康な個人に見られ得ることを示す。
老化内皮細胞は高レベルのＣＸＣＬ９を発現し、これは心臓保護ＳＩＲＴ３のｍＲＮＡ下方調節を誘導する
[0130]長期にわたる証拠は、高血圧及び動脈硬化の病因における内皮の決定的な役割を示唆し、より最近の仕事は、組織再形成及び心臓肥大など心血管老化のいっそう進行した徴候がしばしば先行し、老化した内皮の機能異常によって開始され得ることも示した（Ｃａｓｔｅｌｌｏｎ及びＢｏｇｄａｎｏｖａ、２０１６年；Ｈａｒｖｅｙら、２０１５年；Ｋａｍｏら、２０１５年）。この工程におけるＣＸＣＬ９の役割を研究するために、５名のドナーから得たヒト線維芽細胞を、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６年）を使用して多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）表現型に誘導し、次いで、その細胞を内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＣ）に分化させた。老化による効果をモデル化するために、ｈｉＰＳＣ−ＥＣを、以前に記載されている（Ｈｕら、２０１６年）明確に定義された条件下で、示した通り何度も継代し（図７Ａ）、ＣＸＣＬ９及びＳＩＲＴ３のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。サーチュイン３は、老化中のミトコンドリア恒常性、幹細胞及び組織の維持に関係する心臓保護特性を持つ重要な脱アセチル化酵素であり、心血管健康並びに長命の維持において食事及び運動の有益な効果と結びつけられる（Ｂｏｎｋｏｗｓｋｉ及びＳｉｎｃｌａｉｒ、２０１６年；Ｌｕら、２０１６年）。
[0131]これらの分析において、血管形成の再編成段階を、ｈｉＰＳＣ−ＥＣ老化中の管形成を測定することによって調査した。時間依存的増大が、ＣＸＣＬ９転写産物レベルにおいて観察され（図７Ａ）、それはＳＩＲＴ３発現の減少（図７Ｂ）及び内皮細胞によって形成される脈管ネットワーク数の減少と同時に起こった（図７Ｃ）。漸増用量のＣＸＣＬ９（１０〜８００ｎｇ／ｍＬ）による若いｈｉＰＳＣ−ＥＣの処置（７日目）もＳＩＲＴ３発現を下方調節し（図７Ｄ）、このことは、若い内皮が、他の供給源からのＣＸＣＬ９の標的であり、ＣＸＣＬ９に曝露するとＳＩＲＴ３発現を下方調節し得ることを示す。加えて、若いｈｉＰＳＣ−ＥＣにおいてＣＸＣＬ９受容体、ＣＸＣＲ３の発現が確認されたが、ｈｉＰＳＣ由来心筋細胞では確認されなかった（図７Ｅ）。これらの結果は、ＣＸＣＬ９が傍分泌様式で両方に作用し得ることを示し、免疫供給源由来のこのケモカインの漸増レベルは、内皮細胞機能に影響を及ぼし、内皮細胞において自己分泌様式で正のフィードバックループを作り出し、ＣＸＣＬ９の漸増用量及びこれら細胞におけるその受容体の発現は、加齢において内皮機能の累積的な悪化をもたらす。
健康な老化免疫型の対象は、不健康な老化免疫型の対象と比較して死亡率が低く、１３歳若いＳＣＩ対実年齢の差がある
[0132]１ＫＩＰコホートの対象のサブセット（Ｎ＝１１２）は、２００７年に開始した長期的な老化の研究の一部であり（Ｆｕｒｍａｎら、２０１７年；Ｓｈｅｎ−Ｏｒｒら、２０１６年）１年毎に対象の人数が変わった。このサブグループからの合計１８名の個人が、９年間の追跡調査の間に亡くなった。老人性免疫型ＨＡｉＴ及びＵＡｉＴと死亡率の関係を調査するために、年齢７５歳及びそれ以上の対象（免疫応答における著しい修飾及び死亡リスクの上昇が公知である）を選択した。ＨＡｉＴ（免疫型１４）の場合、合計２３名の対象を選択し、そのうち２名（８．６％）が研究の間に死亡した。ＵＡｉＴ（免疫型１３及び１６の組合せ）の場合、合計５０名の対象が、≧７５歳のカテゴリーであり、そのうちの１３名（２６％）が研究中に死亡した（Ｐ＝０．０８９、ピアソンのカイ二乗検定による）。全体として、死亡の大多数（１３／１８名、７２％）はＵＡｉＴ群からの対象に発生し、わずか２名（１１％）がＨＡｉＴ群からであった（図８Ａ）。２名（１１％）の死亡は免疫型１５からの対象であり、更なる１名の死亡は、免疫表現型検査データがその対象に利用できなかったので、どの免疫型にも分類できなかった（図８Ａ）。
[0133]ＳＣＩと加齢に伴う免疫型の関係を調査するために、ＳＣＩ（ＧＡＥ法によって予測される）を、スチューデントｔ検定を使用して２つの群ＵＡｉＴ及びＨＡｉＴ間で直接比較したが、有意な差異は見いだされなかった。しかしながら、実年齢をＳＣＩから減算した場合（デルタＳＣＩ−ＡＧＥ）、ＨＡｉＴ群は、ＵＡｉＴ群と比較して１３年の差異を呈した（Ｐ＜１０−５、スチューデントｔ検定による）（図８Ｂ）。これらの結果は、ＨＡｉＴ及びＵＡｉＴ状況は、通院個人のコホートにおいて死亡率を少なくとも部分的に予測することができ、ＨＡｉＴ個人の慢性炎症加齢のレベルが、ＵＡｉＴ群に見られた差異と比較してその実年齢より有意に低いことを実証し、このことは、心臓血管疾患の炎症性病因がより高い死亡率に変換することを示唆する。
考察
[0134]ＧＡＥを使用して得られる全身性慢性炎症加齢は、年齢、高コレステロール、性別及びＢＭＩに対する調整後に同時罹患数と有意に相関した。これは、ヒト健康対疾患のためのこの免疫「測定基準」をコンパニオンラボ試験として使用して、患者の炎症性状況について医師に情報を提供し得ることを示唆している。心臓血管機能を徹底的に監視した４０名の高齢対象のより小さな群において、ＳＣＩが、高血圧、動脈硬化、より一般にはメタボリックシンドロームなどの老人性同時罹患数の後期臨床段階であることが公知の動脈硬化及び心臓肥大によって測定される心血管老化も予測したという事実は驚くことではない。しかし、目ざましい発見は、疾患の徴候がない９７名の非常に健康な高齢個人のより大きなコホートにおいて、ＳＣＩの主要な要因であるＣＸＣＬ９が動脈硬化及び心臓肥大の不顕性レベルと正に相関したことであった。これらの結果は、ＳＣＩが、不顕性心血管機能異常の可能性があるものに対する初期分子マーカーとしても使用され得ることを強く示唆している。
[0135]ＣＸＣＬ９、別名ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＣＸＣＬ９）は、ＩＦＮ−γによって誘導され、好中球、マクロファージ及び内皮細胞によって大部分が産生されるＴ細胞化学誘引物質である。ＣＸＣＬ９及び他のＣＸＣＲ３リガンドが、高血圧及び左室機能不全の患者において有意に上昇することを示す先行するデータ（Ａｌｔａｒａら、２０１５年）に反して、健康な個人において、ＣＸＣＬ９媒介性炎症が心血管機能異常の不顕性レベルを予測するのはこれが初めてである。ＣＸＣＬ９媒介性炎症の少なくとも２つの源は、１つは年齢依存的で老化内皮において観察されるもの、もう１つは年齢に影響されず、９７名の対象の健康なコホートにおいて見られたものという所見に基づいて老化と共に起こり得る。心筋細胞でなく内皮細胞がＣＸＣＬ９受容体、ＣＸＣＲ３を発現したので、このケモカインが、傍分泌様式（免疫細胞によって産生される場合）及び自己分泌様式（内皮によって産生される場合）の両方に作用して、老化中のミトコンドリア恒常性、幹細胞及び組織維持に関係する心臓保護特性を持つ重要なストレス応答性脱アセチル化酵素であるＳＩＲＴ３を下方調節すると仮定した（Ｂｏｎｋｏｗｓｋｉ及びＳｉｎｃｌａｉｒ、２０１６年；Ｌｕら、２０１６年）。７つのＳＩＲＴタンパク質のうち、ＳＩＲＴ３は、発現の増大がヒトの長命と結びつけられる唯一のメンバーである（Ｂｅｌｌｉｚｚｉら、２００５年；Ｒｏｓｅら、２００３年）が、心血管老化におけるこのタンパク質の役割は、より若い年齢（８週齢）で特発性心臓肥大及び線維症を発症するＳＩＲＴ３遺伝子を欠いているマウスにおける最近の観察まで明らかでなかった（Ｇｕｏら、２０１７年）。心臓におけるＳＩＲＴ３のこの効果の根底にある機序は、ミトコンドリア代謝に依存することが公知である。例えば、先行する研究は、ＳＩＲＴ３ ＫＯマウスは、心臓におけるミトコンドリア脂肪酸酸化（ＦＡＯ）を改変し（Ａｌｒｏｂら、２０１４年；Ｈｉｒｓｃｈｅｙら、２０１０年）、酸化的リン酸化複合体活性及びＡＴＰ産生を低下させる（Ａｈｎら、２００８年）ことを示した。ＳＩＲＴ３はまた、ＦＡＯに関与する鍵となる酵素である長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＬＣＡＤ）を脱アセチル化できる（Ｃｈｅｎら、２０１５年）。ＳＩＲＴ３が、炎症、細胞代謝、内皮細胞機能及び心血管再形成を結びつける決定的な役割を演ずることが提案され、これは炎症と組織修復工程における細胞代謝の間の複雑な相互作用を示す先行する仕事と整合する（Ｅｍｉｎｇら、２０１７年）。より一般には、年齢と共に代謝に大きな変化が起こることが今では受け入れられており、これらはまた、疾患表現型につながり得る（Ｗｉｌｅｙ及びＣａｍｐｉｓｉ、２０１６年）。遺伝子発現データを使用して、選択した代謝遺伝子８５１個（Ｐｏｓｓｅｍａｔｏら、２０１１年）から生成された代謝遺伝子モジュールの発現が、４０歳後に劇的に減少することも示し、このことは、生殖年齢後の代謝可塑性の減少、それゆえ、無菌炎症性トリガーに対抗する能力の減弱を示唆している。従って、進化的な展望から、慢性炎症は、必然的な身体のエネルギー取引であり、老化による代謝可塑性の収縮の結果とみなされ得る。
[0136]データは、内皮を心血管老化における中心的なプレーヤーとし、これは、特に同心円幾何形状が存在する（Ｖｅｒｓａｒｉら、２００９年）場合に、左室肥大が内皮機能不全に関連することを示したＶｅｒｓａｒｉら、（２００９年）による研究と一致し、それはコホートの場合であった（質量対容積比＞１を一般に有した）。更に、内皮細胞、心筋細胞、免疫細胞及び線維芽細胞が、サイトカイン及びケモカインを介して細かく調整される高度に組織化された様式で相互作用して、組織恒常性及び適当な心臓血管機能を維持する（Ｅｐｅｌｍａｎら、２０１５年）ことは今では受け入れられている。内皮細胞は、心臓における局所炎症の１つの供給源であり得るが、急性心筋梗塞後のマウスの実験におけるインフラマソームＮＬＲＰ３の活性化（ＩＬ−１ｂ成熟を誘導する）によって示される通り、心筋細胞が重要な役割を演ずる可能性も存在することが示された（Ｍｅｚｚａｒｏｍａら、２０１１年）。最後に、適応免疫系が肥大性応答にも関与している可能性が、非虚血性ＨＦ患者又は横大動脈狭窄によって誘導されたＨＦマウスにおいて示唆され、Ｔ細胞は、活性化した血管内皮への接着の増強を示し、Ｔ細胞欠損マウス（ＴＣＲα［−／−］）は、野生型マウスと比較して左室（ＬＶ）収縮期及び拡張期機能を保持し、ＬＶ線維症、肥大及び炎症が減少し、生存を改善した（Ｎｅｖｅｒｓら、２０１５年）。
[0137]本研究は、炎症、細胞代謝及び心臓血管機能を結びつける先行する仕事に有意に貢献し、炎症におけるヒト免疫系の変動性並びに老化及び心臓血管疾患の病因の理解に寄与する。
[0138]前述は、発明の原則を単に例示するだけのものである。当業者が、本明細書において明示的に記載又は示されていないが、本発明の原則を具現化し、その精神及び範囲に含まれる様々な取り合わせを考案できるであろうことはいうまでもない。更に、本明細書に列挙されている全ての例及び条件付き言語は、本発明の原則及び本発明者らが技術を進展させることにより貢献した概念を理解するために読者を補助することを主に意図するものであり、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。更に、本明細書において本発明の原理、態様及び実施形態並びにその特定の例を列挙している全ての文は、構造的及び機能的両方でその等価物を包含することを意図するものである。加えて、そのような等価物が、現在公知の等価物及び将来に開発される等価物、即ち、構造に関係なく同じ機能を実行する開発されるあらゆる要素の両方を含むことを意図する。本発明の範囲は、従って、本明細書に示し、記載されている典型的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の請求項によって具現化される。
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Claims (13)

  1. （ａ）対象由来サンプル中のＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択されるタンパク質のうち２つ以上の量を測定する工程；及び
    （ｂ）前記２つ以上のタンパク質の重み付き量に基づいて前記対象のＳＣＩスコアを算出する工程、
    を含む、対象の全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を評価する方法。
  2. 前記サンプルが血清である、請求項１に記載の方法。
  3. ガイド付き自動エンコーダアルゴリズムを使用して前記ＳＣＩスコアを算出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 多重アッセイにおいて前記２つ以上のタンパク質の量を測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  5. ＣＸＣＬ９及びＥＯＴＡＸＩＮの増大が、ＳＣＩと正に相関する、請求項１に記載の方法。
  6. ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ及びＧＲＯＡの減少が、ＳＣＩと負に相関する、請求項１に記載の方法。
  7. 実年齢に対して前記ＳＣＩスコアを調整する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 血中コレステロール、性別及びＢＭＩからなる群の１つ又は複数のメンバーに対して前記ＳＣＩスコアを更に調整する工程を含む、請求項７に記載の方法。
  9. （ａ）前記対象由来サンプル中のＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択されるタンパク質のうち２つ以上の重み付き量に基づいてＳＣＩスコアを算出する工程；及び
    （ｂ）前記ＳＣＩスコアが前記対象の実年齢より大きい場合に、前記対象を処置してＳＣＩを減少させる工程、
    を含む、全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を減少させる処置を必要とする対象を同定する方法。
  10. ＣＸＣＬ９、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＧ、ＥＯＴＡＸＩＮ及びＧＲＯＡからなる群から選択される異なるタンパク質に特異的に結合する２つ以上の捕捉薬剤、並びに使用説明書を含む、対象の前記全身性慢性炎症加齢（ＳＣＩ）を測定するためのキット。
  11. 前記２つ以上の捕捉薬剤がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載のキット。
  12. 前記異なるタンパク質のそれぞれに結合する一次抗体及び二次抗体を含む、請求項１０に記載のキット。
  13. 前記一次抗体が、着色されたビーズにそれぞれ連結され、前記二次抗体が、それぞれ標識される、請求項１２に記載のキット。
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