CN112136048A - 测量全身性慢性炎性衰老的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于测量受试者的慢性炎性衰老(SCI)水平的方法。在一些实施例中，所述方法可以包括测量来自受试者的样品(例如血清)中的蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的两种或更多种的量，并根据那些蛋白质各自的加权量来计算得分。

Description

测量全身性慢性炎性衰老的方法
政府权利
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合约AI057229和AI090019的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
一百多年来，人们已经认识到免疫系统在维持人类健康和防止感染方面的作用。不过，直到最近，科学家才意识到免疫力，尤其是固有免疫和炎症失调，也决定了与老年人相关的非传染性慢性疾病(其中例如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等)的结果(Crusz和Balkwill，2015；Kotas和Medzhitov，2015；Liu等人，2017)。根据这些观察结果，推测炎症在调节生理衰老中起着关键作用(Franceschi和Campisi，2014；Furman等人，2017)。此外，公认的九个衰老标志(Lopez-Otin等人，2013)：(1)基因组不稳定性，(2)端粒长度缩短，(3)表观遗传修饰，(4)蛋白质稳态的丧失，(5)营养感知失调，(6)线粒体功能障碍，(7)细胞衰老，(8)干细胞耗尽，和(9)细胞内通讯改变，都已表明至少部分是由持续的全身性炎症引起的(Cavadas等人，2016；Efeyan等人，2015；Grivennikov等人，2010；Hunter等人，2007；Jurk等人，2014；Lasry和Ben-Neriah，2015；Nathan和Cunningham-Bussel，2013；Oh等人，2014a；Thevaranjan等人，2017)。
但是，对感染的炎症反应(急性反应)与慢性疾病(慢性炎症)相关的反应大不相同。前者主要是通过先天免疫细胞中表达的模式识别受体(PRR)与病原体上的进化上保守的结构(称为病原体相关分子模式(PAMP))之间的相互作用来响应传染原而启动的。参与后，PRR触发细胞内信号传导级联，最终导致多种炎症细胞因子的表达，这些细胞因子协调宿主对感染的反应，并成为随后激活适应性免疫的先决条件。在这种类型的炎症中，其中诸如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等典型的炎症介质的升高，会急剧引起高等级的反应，这种反应是自限性的，通常会导致刺激消除，并激活组织修复机制并愈合(Medzhitov，2008)。
与急性反应相反，慢性和全身性炎症是由物理、化学或代谢有害刺激物(“无菌”剂)触发的，例如由受损细胞和环境危害释放的那些，通常称为“损害相关分子模式”(DAMP)。这种类型的炎症与衰老有关，其特征是低程度和持续性，最终导致对组织和器官的附带损害(Goldberg和Dixit，2015；Kotas和Medzhitov，2015)。尽管这种类型的炎症反应极为重要，但目前尚无标准的生物标志物来定义慢性炎症，并且研究通常产生矛盾的结果(Franceschi等人，2017；Morrisette-Thomas等人，2014)。
为了了解健康与疾病状态的免疫基础，最近作了大量的努力，以识别同享相似免疫学组成的个体群体，并将其与临床和表型信息相关联。这些研究中许多都集中在对免疫挑战的反应上，作为功能性和保护性免疫系统的替代品，例如针对某种疫苗制剂的特异性抗体水平的提高(Furman等人，2014；Furman等人，2013；Haralambieva等人，2016；Li等人，2014；Nakaya等人，2011；Oh等人，2014b；Querec等人，2009)。尽管疫苗反应的质量确实可以告知免疫系统保护免受传染性疾病影响的可能性，然而对抵抗感染至关重要的免疫成分并不必然与维持总体健康的那些重叠，因为它与非传染性慢性疾病有关。
最近的研究证实系统生物学方法对免疫学、炎症、衰老和心血管健康的巨大价值(Furman等人，2017；Shen-Orr等人，2016)，并且在最近的研究中，各种细胞类型的比例被用于识别非卧床个体的集群，并将这些与免疫学和临床相关结果相关联(Kaczorowski等人，2017)。在所述研究中，作者对其细胞亚群特征确定了连续的个体，其与免疫细胞对不同细胞因子刺激的反应能力相关，在较小程度上与对流感疫苗的抗体反应相关。
发明内容
本文中尤其描述了一种用于测量受试者的全身性慢性炎性衰老水平的方法。
根据本发明的一方面，提供了用于评估受试者的全身性慢性炎性衰老(SCI)的方法，包括：(a)测量选自受试者样品(例如血清)中由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组中的两种或更多种(即2、3、4或5)蛋白质的量；并且，(b)根据所述两种或更多种蛋白质的加权量计算受试者的SCI得分。尽管可以采用本领域中已知的其它方法，本文公开的是一种使用引导的自编码器算法来计算SCI得分的方法。这些蛋白质的量可以使用任何公知的方法来测量，包括例如在多重测定中。例如，我们已经发现CXCL9和EOTAXIN的增加的量与SCI正相关，而TRAIL、IFNG和GROA的减少的量与SCI负相关。可以针对以下一项或多项来调整SCI得分：实足年龄、血胆固醇、性别和BMI。
根据本发明的另一方面，提供了用于识别需要治疗以减少全身性慢性炎性衰老(SCI)的受试者的方法，方法包括：(a)根据选自受试者样品中由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组中的两种或更多种蛋白质的加权量来计算SCI得分；并且，(b)如果SCI得分大于受试者的实足年龄，则治疗受试者以降低SCI。
根据本发明的另一方面，提供了用于测量受试者的全身性慢性炎性衰老(SCI)的试剂盒，包括：两种或更多种捕获剂，其与选自由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组中的不同蛋白质特异性结合；和使用说明。例如，所述试剂盒可以使用单克隆抗体作为捕获剂。作为替代方案，所述试剂盒可以包括抗体组-一抗和二抗-与每种不同蛋白质(例如，每种蛋白质的不同部分)结合。可选地，一抗各自连接至有色珠粒，而二抗各自被标记，例如，生物素标记。
附图说明
当结合附图阅读时，根据以下详细描述可以最好地理解本发明。要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，各个特征的尺寸被任意地扩大或缩小。附图中包括以下附图。
图1示出了1000个免疫组学研究设计，包括通过“OMICS”方法的免疫系统的系统分析。
图2示出了免疫类型的临床特征。免疫健康和疾病的图谱来源于从总共527名受试者获得的免疫类型和临床数据(涵盖53种疾病特征)。对总共16个所述疾病特征显示出显著相关性(年龄，性别，CMV和BMI校正后，P<0.05)。与所有其它免疫类型相比，对免疫类型3(平均年龄23，年龄范围8-52)显示癌症和其它与年龄相关的状况(如涉及骨骼、肌肉和关节的状况)的发生率较低。相反，免疫类型8(平均年龄23，年龄范围12-79)尽管表现出较低的癌症和高血压发生率，观察到其肌肉骨骼状况(如肌肉和关节疼痛)以及泌尿系统疾病的发生率较高。免疫类型12，主要由年轻的成年人受试者组成，但与一小群较大年龄者同享免疫细胞谱(见图3)，除了肌肉和关节疾病外，大多数情况下不受疾病侵害(P<0.001)，并且具有较低但明显的癌症发生率(R＝0.09，P<0.05)。对与年龄相关的免疫类型13、14和16观察到不同的疾病模式。免疫类型13(平均年龄60，年龄范围16-90)的个体的高血压和心血管状况的发生率较高，泌尿科和肌肉骨骼状况的发生率较低，而免疫类型14的个体(平均年龄77，年龄范围29-90)的高血压、心血管疾病、胃肠道疾病和肌肉关节疼痛的发生率较低，生殖器和生殖状况的发生率较高(高于研究人群)。免疫类型16(平均年龄60，年龄范围9-90)显示高血压和心血管状况的发生率较高，以及耳部疾病和骨关节炎的发生率较高，并且过敏和内分泌代谢状况的发生率较低。根据心血管疾病的临床相关性，与年龄相关的免疫类型13和16被归类为“非健康衰老免疫类型”(UAiT)，而免疫类型14被归类为“健康衰老免疫类型”(HAiT)。
图3A-3B示出了全身性慢性炎性衰老(SCI)与合并症之间的相关性。使用引导自动编码器方法，选择了十种与年龄相关的疾病项目来表征来自对50种细胞因子的分析(N＝1001)的SCI的临床意义(见图10A-10B和12)。分析的项目包括不同的疾病和生理系统：癌症、心血管疾病、呼吸道疾病、胃肠道疾病、泌尿科疾病、神经疾病、内分泌代谢疾病、肌肉骨骼疾病、生殖器-生殖疾病和精神疾病。所有这些疾病特征都是二元的。在疾病总和(合并症)和SCI之间(通过置换排列的回归分析)，观察到了研究群体中SCI与合并症之间的显著相关性(N＝527，P<0.0001)。协变量包括年龄、BMI、性别、CMV和高胆固醇(也是二元类别)。
图4示出了SCI与心血管衰老之间的相关性。选择40名年龄较大的受试者(年龄60->89)进行心血管衰老研究。通过超声心动图和非侵入性臂踝脉搏波速度测试测量了总共34个变量。进行了具有500个置换排列的回归分析，以获得每个回归系数的显著性。对舒张心室间隔尺寸(IVSd)(Q＝0.18)和左心室质量体积比(LVmv)(Q＝0.12)观察到显著正相关(性别、年龄和CMV校正)。还显示了相对壁厚(RWT)的边界线显著增加(Q＝0.21)。
图5示出了SCI的分解。SCI的分解显示趋化因子CXCL9的巨大贡献。为了进一步了解炎症与心血管功能障碍相关的潜在机制，通过计算关于每个输入特征(雅可比行列式)的SCI的一阶偏导数来分解SCI。观察到对SCI的正负贡献者。前15个最易变的雅可比行列式是CXCL9、EOTAXIN、Mip-1α、LEPTIN、IL-1β、IL-5、IFN-α和IL-4(正贡献者)和TRAIL、IFN-β、GRO-α、IL-2、TGF-α、PAI-1和LIF(负贡献者)。
图6A-6B示出了基于标志物对心血管衰老的预测。CXCL9和LIF独立于年龄预测健康受试者的心血管衰老。在严格的疾病排除标准(请参见Methods)下，从总共151名征募的受试者中选择了97名健康成年人(年龄25-90)。使用以下三个参数评估心血管年龄：(1)主动脉脉搏波速度(PWV)(A)，一种对血管僵硬度的测量；(2)相对壁厚(RWT)(B)，一种心室重构的测量，(3)舒张早期二尖瓣环速度(e')，一种心室舒张的测量。此外，测量了早期二尖瓣流入速度(E)与e'的比率，它是舒张末期充盈压的替代标志(Nagueh等人，2009；Redfield等人，2005)。与年龄相关的炎症标记物CXCL9和LIF的多元回归分层分析以及从所有研究对象中获得的心血管衰老测量值(请参见Methods)。在调整了年龄、性别、BMI、心率、收缩压、空腹血糖和总胆固醇与HDL的比率后并在P值<0.01，在CXCL9与PWV(R＝0.22)和RWT(R＝0.3)之间显示出正相关，而在LIF和PWV(R＝-0.27)和RWT(R＝-0.22)(A和B)之间观察到负相关。模型中没有任何变量具有高共线性，如由方差膨胀因子(VIF)<3对每个因子所提议的。
图7A-7E示出了CXCL9及其受体的表达。源自hiPSC的内皮细胞表达CXCL9及其受体，并通过下调SIRT3水平来响应CXCL9。使用Yamanaka因子(Takahashi和Yamanaka，2006)从分离的成纤维细胞(N＝5，一式两份)中获得诱导性多能干细胞(hiPSC)，并在如前所述的明确定义的条件下将其分化为内皮细胞(hiPSC-EC)(Hu等人，2016)。如Methods中所述，通过RT-PCR测量CXCL9和SIRT3的表达水平。观察到CXCL9 mRNA表达水平显著的年龄依赖性增加(P<0.01)，在第六次细胞传代后达到平稳期(A)。第二次细胞传代后可以观察到与CXCL9的增加、SIRT3 mRNA的下调相伴(P<0.01)(B)。在hiPSC-EC衰老过程中，血管新生(管形成)的重组阶段显示出细胞体外形成管的能力下降(C)。向年轻(第7天)hiPSC-EC添加增加的剂量(10至800ng/ml)的外源CXCL9诱导SIRT3 mRNA表达的下调(D)。在源自hiPSC(hiPSC-CM)的年轻心肌细胞以及hiPSC-EC、HUVEC细胞、新鲜分离的成纤维细胞和hiPSC中测量了CXCL9受体CXCR3的表达。在hiPSC-EC、HUVEC细胞中观察到表达升高，但在其它细胞类型中则未观察到(E)，表明内皮而不是其它细胞亚群是CXCL9和可能还有其它CXCR3配体的靶标。
图8示出了健康衰老免疫类型与非健康衰老免疫类型的死亡率。健康衰老免疫类型与非健康衰老免疫类型相比，相较于其实足年龄具有较低的死亡率和较低的SCI。从2007年开始，对研究参与者的小组(N＝112)进行了纵向跟踪。从这组，在为期9年的随访中有18个人死亡。绝大多数死亡(13/18，72％)是来自UAiT组的受试者，只有2例(11％)属于HAiT组(A)。其它的死亡(2/18，11％和1/18，6％)是分别来自免疫类型15和未分类的受试者(A)。B中示出了从GAE方法得出的SCI与UAiT相比于HAiT中实足年龄之间差别的显著差异(P<10-5，按Student’s t-测试)。
图9示出了免疫细胞亚群和免疫蛋白的分布类型的比例。使用最大似然估计(MLE)将血清蛋白平均荧光强度和细胞亚群频率数据用于拟合每个输入特征的6种不同分布(正态、拉普拉斯(Laplace)、对数正态、对数拉普拉斯(log-Laplace)、伽马(Gamma)、对数伽马)。为了确定每个特征的最佳分布，对每种分布进行了5倍交叉验证测试。计算了正态分布与其它分布之间的5倍测试可能性的t检验p值。在总共75个免疫特征中，仅12％(细胞亚群)和18％(对于循环蛋白)显示正态分布。最常见的分布是拉普拉斯，其次是细胞亚群的对数正态和伽马以及免疫蛋白的正态和对数正态。对两种免疫特征类型最不常见的分布是对数拉普拉斯。
图10A-10B示出了GAE代码长度的估计和年龄预测的准确性。5倍交叉验证用于识别长度在1到10之间的最佳代码长度。选择代码k的长度，其性能在统计学上不明显差于较长代码(配对t检验p值>0.05)。在每个倍数内，进行嵌套的3倍交叉验证以选择超参数(深度、重量衰减和引导比)。在我们的实验中，最佳代码长度为5(a)，因为再添加一个代码(6)不显著改善总损耗(p值＝0.18)。获得最佳代码长度为5后，使用5倍交叉验证来选择代码长度为5的所有GAE的最佳超参数设置(深度＝2，引导比＝0.2，L2＝0.001)。最后，GAE用选定的最佳超参数设置在整个数据集上进行训练，并获得作为SCI预测器的预测功能。GAE方法优于线性方法进行蛋白质数据重建和实足年龄预测(b)。
图11示出了心血管测量值的相关性网络。使用超声心动图和无创脉搏波速度测试在一小组的研究参与者(N＝40)中进行了心血管评估，作为动脉僵硬度的测量。收集了总共27个测量值。相关性分析显示测量值之间存在高度正相关。HR：心率(bpm)，PlaqueR：右颈动脉中有明显斑块的存在，RCIMT：右颈动脉内膜媒介厚度，PlaqueL：左颈动脉中有明显斑块的存在，PlaqueFem：股动脉中有明显斑块的存在，PWV：脉搏波速度，IVSd：舒张期心室间隔直径，LVIDd：舒张期左心室内径，PWd：舒张期后壁厚度，IVSs：收缩期心室间隔直径，LVIDs：收缩期左心室内径，PWs：收缩期后壁厚度，LV_enla：左心室扩大，RemodRatio：重塑比例，Lvmass：左心室质量，LVEDV：左心室舒张末期容积，LVmassVol：左心室质量与体积比，LVmassBSA：左心室质量与体表面积成指数，LVEF：左心室射血分数，LAvolDias：舒张期左心房容积，LAvolIndex：左心房容积指数，LAenlargement：左心房增大，RAP：右心房压力，RVSP：右心室收缩压，AorticScler：主动脉瓣硬化，TR：三尖瓣关闭不全，PR：肺动脉瓣关闭不全。
图12示出了健康成年人中细胞因子的表达。细胞因子与健康成年人的衰老显著相关。使用严格的选择标准(参见Methods)，从总共151名招募的受试者中选择了97名健康成年人(年龄25-90)的组进行随访研究。在总共测量的48个炎症标记中，有6个与年龄显著相关(P<0.05)，包括CXCL9、IL-11Rα、CXCL10和HGF(随年龄增加)以及GRO-α和LIF(减少)。由回归分析获得测定系数(R2)和P值。
图13示出了与年龄相关的免疫类型中的CD8+CD28-T细胞频率。分析了衰老免疫类型13、14和16(N＝95)的可用数据中CD8+CD28-子集的频率。与免疫类型13和16相比，在免疫类型14中观察到该细胞亚群的显着增加(P<10-10，通过组合的Student’s t检验)。
图14示出了免疫特征及其分布。
图15示出了每个研究年度包括的受试者数量和使用的分析平台。
图16示出了从总共527名研究参与者获得的临床问卷获得的疾病特征。
具体实施方式
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规药理学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers,Inc.，current addition)；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第二版，1989年)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均在此以其全文形式被援引加入本文。
在提供数值的范围的情况，应当理解的是，除非上下文另外明确指出，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，直到下限的单位的十分之一。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括或排除在该范围内，并且其中限值中的一个或两个都不包含或包含在较小范围内的每个范围也包括在本发明内，以规定范围中任何明确排除的限值为准。当规定范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此被援引加入本文，以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解的是，本公开内容在存在矛盾的程度上取代了所援引的出版物的任何公开内容。
对于本领域技术人员而言，在阅读本公开内容后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施例具有分立的组件和特征，其可以容易地与其它几个实施例中的任何一个的特征分离或组合在一起，而不会脱离本发明的范围或精神。可以按事件记载的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来执行任何记载的方法。
必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数所指对象，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“激动剂”包括两种或更多种所述激动剂的混合物，诸如此类。
提供的本文讨论的出版物仅针对本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容均不得被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的公开日可能与实际公开日有所不同，实际公开日可能需要独立确认。
提供了一种用于测量受试者的慢性炎性衰老水平的方法，其中术语SCI旨在指通过一种方法测量的一段时间内受试者的慢性炎性衰老的总体水平，所述方法可以包括测量受试者血清中的蛋白CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的两种或多种(例如，两种、三种、四种或五种)的量，并通过一种方法来分析输出，该方法包括根据每种这些蛋白质的加权量使用引导神经网络算法(引导自动编码器)来计算得分，其中得分表示受试者的慢性炎性衰老水平。还提供了用于执行所述方法的试剂盒。蛋白质的“量”是指绝对量(例如，微克[ug])、相对量(相对于另一种蛋白质的量)、浓度、平均荧光强度(间接测量蛋白质量，例如如以下实例所述的使用
Figure BDA0002641505290000091
分析来获得)，或其它直接或间接测量值。
慢性炎性衰老(SCI)与心血管疾病和合并症相关，健康衰老的个体(即总体健康状况较好且疾病减轻的个体)较低，而不健康衰老的个体(整体健康状况较差、对疾病易感、合并症的发生率较高和/或死亡率增加的个体)较高。在一些实施例中，所述方法可以包括测量来自受试者的血清中的蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的两种或更多种的量，并且通过包括引导深度神经网络(引导自动编码器)的方法根据这些蛋白质的加权量来计算得分。
CXCL9(C-X-C基序配体9)也称为MIG(由γ干扰素诱导的单核因子)是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子。CXCL9是由IFN-γ诱导的T-细胞化学引诱物。血浆CXCL9升高与慢性GVHD诊断相关。CXCL9在Kitko等人，Blood 2014 123：786-93中以及在Jansen等人，BMCInfect.Dis.17：556中有描述。CXCL9在组装GRCh38中由人类染色体4：76,001,275-76,007,488反向链编码。
TRAIL(TNF相关的细胞凋亡诱导配体)是一种细胞因子，由大多数正常组织细胞产生和分泌。据认为主要通过与某些死亡受体结合而在肿瘤细胞中引起细胞凋亡。TRAIL也已经被命名为CD253(分化簇253)和TNFSF10(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10)。TRAIL在Wiley等人，Immunity 1005 3：673-82以及Pitti J.Biol.Chem.1996 271：12687-90中有描述。TRAIL在组装GRCh38中由人类染色体3：172,505,508-172,523,507反向链编码。
INFG(也称为干扰素γ、IFNγ或II型干扰素)是二聚化的可溶性细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。该蛋白对于抵抗病毒、某些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫至关重要。INFG是巨噬细胞的重要激活剂，并且是II类主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。异常INFG表达与多种自身炎症和自身免疫性疾病相关。INFG在Schoenborn等人，Adv.Immunol.2007 96：41-101以及Gray，Nature.1982 298：859-63中有描述。INFG在组装GRCh38中由人类染色体12：68,154,768-68,159,747反向链编码。
嗜酸性粒细胞趋化因子(也称为C-C基序趋化因子11或嗜酸性粒细胞趋化蛋白)是属于CC趋化因子家族的小型细胞因子。嗜酸性粒细胞趋化因子选择性通过诱导其趋化性来募集嗜酸性粒细胞，因此涉及过敏反应。嗜酸性粒细胞趋化因子的作用通过其与称为趋化因子受体的G蛋白连接受体的结合而介导。CCL11是配体的趋化因子受体包括CCR2、CCR3和CCR5。嗜酸性粒细胞趋化因子在Kitaura等人，The Journal of Biological Chemistry1996 271：7725-30和Jose等人,The Journal of Experimental Medicine 1994 179：881-7中有描述。嗜酸性粒细胞趋化因子在组装GRCh38中由人类染色体17：34,285,668-34,288,334正向链编码。
GROA(也称为CXCL1、GRO1癌基因、GROα、KC、嗜中性粒细胞活化蛋白3(NAP-3)和黑色素瘤生长刺激活性α(MSGA-α))由人类黑色素瘤细胞分泌，具有促有丝分裂特性，并且涉及黑色素瘤发病机制。GROA由巨噬细胞、嗜中性粒细胞和上皮细胞表达，并具有嗜中性粒细胞化学引诱物活性。该趋化因子通过趋化因子受体CXCR2发出信号来引发其作用。GROA在Haskill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.190 87(19)：7732-6中有描述。GROA在组装GRCh38中由人类染色体4：73,869,393-73,871,242正向链编码。
我们发现，受试者中CXCL9和EOTAXIN的增加(相对于对照人群的平均表达)与SCI正相关，而受试者中TRAIL IFNG和GROA的降低(相对于对照人群的平均表达)与SCI负相关。
所述方法可以包括测量来自受试者的样品中的蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的两种、三种、四种或五种的量(例如，CXCL9、TRAIL和IFNG，CXCL9、TRAIL和EOTAXIN或CXCL9、TRAIL和GROA)，并使用一种方法来分析输出数据，该方法包括根据这些蛋白质各自的加权量来计算得分(例如但不限于使用引导的自动编码器)。血清是合适的样品，尽管也可以使用含有所述蛋白质的其它样品，例如全血、组织等等。
所述方法还可以包括测量来自受试者的血清中的蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的四种或更多种的量(例如CXCL9、TRAIL、IFNG和EOTAXIN，CXCL9、TRAIL、IFNG和GROA，CXCL9、TRAIL、EOTAXIN和GROA，或CXCL9、IFNG、EOTAXIN和GROA)，并使用一种方法来分析输出数据，该方法包括基于这些蛋白质各自的加权量来计算得分。
所述方法还可以包括测量来自受试者的血清中所有蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA的量，并使用一种方法来分析输出数据，该方法包括基于这些蛋白质各自的加权量来计算得分。
可以使用任何合适的方法来测量蛋白质的量。例如，可以通过蛋白质印迹、质谱或使用免疫测定法例如ELISA来测量蛋白质的量。这些方法中的许多都涉及将包含蛋白质的样品与与蛋白质特异结合的捕获剂结合，例如与CXCL9特异性结合的捕获剂，与TRAIL特异性结合的捕获剂，与IFNG特异性结合的捕获剂，与EOTAXIN特异性结合的捕获剂，以及与GROA特异性结合的捕获剂，然后测量与捕获剂结合的蛋白质的量。这样，在一些实施例中，可以在多重测定中测量蛋白质的量。
捕获剂包括但不限于抗体(包括多克隆和单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、纳米抗体双抗体及其多聚体以及双特异性抗体或抗体片段)、适体、affimer、菌素(knottin)等。
基于流式细胞术、化学发光或电化学发光技术的应用，多重测定可以以几种不同的形式进行。流式细胞计数多重测定也称为基于珠粒的多重测定，包括BD Biosciences的细胞计数珠粒测定(CBA)系统和Luminex的Luminex多分析物分析技术。这些平台均采用专有的磁珠组，在流式细胞仪下可区分。每个珠粒组都涂有特异性捕获抗体，并且荧光或链霉亲和素标记的检测抗体与珠粒组上的特定蛋白捕获抗体复合物结合。因此，可以通过两种珠粒组的差异识别和测量生物液体样品中的多种蛋白质，其中使用流式细胞术分析来检测显色或荧光发射。多重ELISA(例如，来自Quansys Biosciences)涉及在多孔微板的同一孔中的多个点涂覆多种特异性捕获抗体(一个点处一种抗体)。化学发光技术(比传统ELISA中的显色检测更为灵敏)然后用于检测平板上相应点的多种细胞因子。来自Meso ScaleDiscovery的Multiplex试剂盒采用电化学发光技术，其中将多种特异性捕获抗体涂覆在有线微孔板上相应的点。检测抗体与专有标记结合，该专有标记被电场中的发射束激发。
在一些实施例中，可以使用基于珠粒的测定。基于珠粒的测定使用聚苯乙烯或顺磁性珠粒(也可以称为微球)，它们内部用不同颜色、强度和/或比率的荧光团进行染色，从而可以使珠粒彼此区分。然后用适合一种特异性分析物的捕获抗体包被单个珠粒组。然后可以将多个分析物特异性的珠粒合并到一个孔中。在本方法中，将样品添加到预先涂有分析物特异性的捕获抗体的颜色编码的珠粒的混合物中。抗体与感兴趣的分析物结合。添加对感兴趣的分析物具有特异性的生物素化的检测抗体，并形成抗体-抗原三明治结构。加入藻红蛋白(PE)结合的链霉亲和素，其与生物素化的检测抗体结合。在基于双激光流的检测器上读取聚苯乙烯珠粒，在该检测器中，一激光器对珠粒进行分类并确定正在检测的分析物。第二激光器确定PE衍生信号的幅度，它与所结合分析物的量成正比。可替换地，可以使用磁铁读取磁珠，以捕获磁珠并将磁珠固定在单层中，同时两个光谱不同的发光二极管(LED)照亮珠粒。一个LED识别正在检测的分析物，第二个LED确定PE衍生信号的幅度。在Dupont等人(J.Reprod Immunol.2005 66：175-91)和Khalifian等人(J InvestDermatol.2015 135：1-5)中描述了示例性的基于珠粒的测定。
蛋白质与捕获剂的结合可以通过任何方式来测量，包括使用光学可检测的(例如，荧光标记的或发光的)二抗、等离子共振或磁阻等。
在测量蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中，可以确定每种蛋白质的绝对量，或者可以确定每种蛋白质相对于一种或多种对照蛋白质的量，并使用一种方法分析输出数据，该方法包括使用引导自动编码器基于这些蛋白质各自的加权量来计算得分。
还提供了用于测量受试者的SCI的计算机实现的方法。该方法可以包括接收来自受试者的血清中的蛋白质CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA中的两种或更多种(例如，三种、四种或全部)的测得的量，以及执行算法，所述算法使用引导自动编码器基于蛋白质各自的量来计算SCI。在一些实施例中，该方法可以包括将测量值输入计算机，并执行引导自动编码器算法，该算法可以利用来自确定CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA水平的输入测量值来计算SCI。
在一些实施例中，该方法可涉及创建报告，所述报告例如以电子形式显示受试者的慢性炎性衰老水平，并且将报告转发给医生或其它医学专业人员以帮助确定合适的行动方针，例如，以确定适合受试者的疗法。报告可以与其它指标一起用作诊断以确定受试者是否有疾病或状况。
在任何实施例中，报告可以被转发到“远程位置”，其中“远程位置”表示除了检查影像的位置以外的位置。例如，远程位置可以是同一城市中的另一个位置(例如，办公室、实验室等)，不同城市中的另一个位置，不同州中的另一个位置，不同国家中的另一个位置等。这样，当一个项目被表示为与另一项目“远程”时，这意味着这两个项目可以在同一房间但分开，或者至少在不同的房间或不同的建筑物中，并且可以至少相隔一英里、十英里或至少一百英里。“通信”信息指的是通过适当的通信通道(例如，专用或公共网络)将表示该信息的数据作为电信号传送。“转发”项目是指将该项目从一个位置转移至下一个的任何方式，无论是通过物理方式运输该项目还是通过其它方式(在可能的情况下)，并且包括(至少在数据的情况下)物理运输携带数据或传达数据的介质。通信介质的示例包括无线电或红外线传输通道以及到另一台计算机或联网设备的网络连接，以及互联网或包括记录在网站上的电子邮件传输和信息等。在某些实施例中，报告可以由医学博士或其它合格的医学专业人员进行分析，并且可以将基于图像/影像分析结果的报告转发给从其获得样品的患者。
在与计算机有关的实施例中，系统可以包括计算机，该计算机包含处理器、存储部件(即，存储器)、显示部件以及通常存在于通用计算机中的其它部件。存储部件存储处理器可访问的信息，包括可以由处理器执行的指令和可以由处理器取回、操纵或存储的数据。
存储部件包括用于利用上述测量值作为输入来确定受试者的SCI的指令。计算机处理器连接到存储部件，并且被设置成执行存储在存储部件中的指令，以便根据一种或多种算法来接收患者数据并分析患者数据。显示部件可以显示关于患者诊断的信息。
存储部件可以是能够存储处理器可访问的信息的任何类型，例如硬盘驱动器、存储卡、ROM、RAM、DVD、CD-ROM、USB闪存驱动器、具有写入能力的存储器和只读存储器。处理器可以是任何熟知的处理器，例如英特尔公司的处理器。可替换地，处理器可以是专用控制器，例如ASIC。
指令可以是将由处理器直接执行(例如，机器代码)或间接执行(例如，脚本)的任何指令集。在这方面，术语“指令”、“步骤”和“程序”在本文中可以互换使用。指令可以以目标代码形式存储以供处理器直接处理，或者以任何其它计算机语言存储，包括脚本或独立源代码模块的集合，这些脚本或集合按需进行解释或预先编译。
数据可以根据指令由处理器取回、存储或修改。例如，尽管诊断系统不受任何特定数据结构的限制，但是数据可以存储在计算机寄存器中，作为具有多个不同字段和记录的表格、XML文档或平面文件在相关数据库中。数据也可以以任何计算机可读格式进行格式化，例如但不限于二进制值、ASCII或Unicode。此外，数据可以包括足以识别相关信息的任何信息，例如数字、描述性文本、专有代码、指针、对存储在其它存储器(包括其它网络位置)中的数据的引用或功能用于计算相关数据的信息。
治疗
我们提供了用于测量受试者的全身慢性炎性衰老(SCI)的方法，包括测量来自受试者的样品中两种或更多种选自由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组的蛋白质的量，并根据蛋白质的加权量来计算受试者的SCI。基于以这种方式测得的SCI，可以通过任何已知的减少全身性慢性炎性衰老的方法来治疗受试者，无论是单独使用还是组合使用：(1)药物治疗，包括但不限于抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬和萘普生)或皮质类固醇；(2)营养保健品或营养补品，包括但不限于鱼油、硫辛酸和姜黄素，或调味料如生姜、大蒜和辣椒；(3)饮食变化，包括但不限于增加抗氧化剂和多酚含量高的食物的摄入，例如橄榄油、绿叶蔬菜(例如羽衣甘蓝和菠菜)、西红柿、肥鱼(例如鲑鱼、沙丁鱼和鲭鱼)、坚果和水果(例如樱桃、蓝莓和橘子)，和/或减少可能增加炎症的食物的摄入，例如精制碳水化合物(例如白面包和糕点)、油炸食品、红肉和加工过的肉类；(4)生活方式的改变，包括但不限于戒除或减少吸烟和饮酒、保持健康的体重和减轻压力。
试剂盒
如上所述，本公开内容还提供了包含试剂的试剂盒用于实施上文所述的本主题方法。主题试剂盒包含上述任何一个或多个成分。在一些实施例中，试剂盒可包括例如两种或更多种(例如3、4或全部)：特异性结合CXCL9的捕获剂、特异性结合TRAIL的捕获剂、特异性结合IFNG的捕获剂、特异性结合EOTAXIN的捕获剂、特异性结合GROA的捕获剂。在任何实施例中，捕获剂可以是抗体。在一些实施例中，对于每种蛋白质，试剂盒可包含一抗和二抗，其中一抗和二抗结合至蛋白质的不同部分。在一些实施例中，一抗可以与颜色编码的珠粒连接，而二抗可以被标记，例如被生物素化。抗体可以是阵列形式。
试剂盒的各种成分可以存在于单独的容器中，或者根据需要可以将某些兼容的成分预组合到单个容器中。
除上述成分外，主题试剂盒还可包括使用试剂盒的成分实施主题方法的说明书，即样品分析说明书。一般将用于实施本主题方法的说明书记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在诸如纸或塑料等的基质上。这样，说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其它实施例中，说明书以电子存储数据文件的形式存在于合适的计算机可读存储介质上。在其它实施例中，试剂盒中不存在实际的说明书，但是提供了用于例如经由互联网从远程源获得说明书的装置。该实施例的一个示例是一种试剂盒，其包括网址，在该网址上可以查看和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的装置被记录在合适的基质上。
实例
提出以下实例以向本领域普通技术人员提供有关如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且并不旨在限制发明人视为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或仅进行的实验。已经尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，室温(RT)；碱基对(bp)；千碱基(kb)；皮升(pl)；秒(s或sec)；分钟(m或min)；小时(h或hr)；天(d)；周(wk或wks)；纳升(nl)；微升(ul)；毫升(ml)；升(L)；纳克(ng)；微克(ug)；毫克(mg)；克((g)，以质量计)；千克(kg)；重力的当量((g)，在离心作用下)；纳摩尔(nM)；微摩尔(uM)，毫摩尔(mM)；摩尔(M)；氨基酸(aa)；千碱基(kb)；碱基对(bp)；核苷酸(nt)；肌内(i.m.)；腹膜内(i.p.)；皮下(s.c.)；等等。
在这项研究中，目标是建立人类免疫学的第一纲要，即1000免疫组计划(1KIP)，其中来自1001名受试者的样本在单个以数据为中心的设施中进行全面研究；斯坦福大学人类免疫监测中心(HIMC)使用严格的标准化程序对外周血标本进行处理和分析。使用多种技术平台进行完整的免疫表征，以测量全基因组转录组、血清蛋白质组、细胞亚群丰度、细胞对多种刺激的反应以及对巨细胞病毒感染的血清阳性。从超过一半的参与者获得了使用53个特征的临床问卷进行的全面健康评估。
鉴定出总共16种不同的免疫类型，揭示了两类老年人的存在：健康的和不健康的衰老免疫类型，其特征在于多个免疫特征(包括其慢性炎症水平)，以及心血管状况的发生率和死亡率存在主要差异。深度学习方法用于将多维蛋白质数据紧凑地表示到低维空间中，以得出SCI的水平与合并症和心血管衰老显著相关。在一项针对97名健康老年人的随访研究中(他们还在HIMC监测了相同的炎症标志物，并在斯坦福心血管研究所进行了心血管27项特征表型筛查)，确定了SCI的最有力贡献者，干扰素相关趋化因子CXCL9，跟踪亚临床心脏肥大。该趋化因子还通过源自人诱导的多能干细胞(hiPSC)的老龄内皮细胞大量表达，并诱导心脏保护性脱乙酰基酶SIRT3的mRNA表达下调。
结果证实了炎症在衰老和心血管疾病中起关键作用。
实例1
材料和方法
实验模型和受试者细节
1000个免疫组研究队列：1KIP包括2007年至2016年间在斯坦福大学招募的1001名非卧床个体(339名男性和662名女性)进行衰老和疫苗接种研究(N＝605)(Blazkova等人，2017；Brodin等人，2015；Furman等人，2017；Furman等人，2014；Furman等人，2013；Furman等人，2015；Price等人，2013；Roskin等人，2015；Shen-Orr等人，2016；Wang等人，2014)，以及一项关于慢性疲劳综合征的独立研究(Montoya等人，2017)，从中利用仅来自对照组参与者的数据(N＝396)。
衰老和疫苗接种研究队列：研究参与者在2007年至2016年期间参加了斯坦福大学-LPCH疫苗计划的流感疫苗研究。由于在用流感疫苗接种之前从所有个体获得了基线样品，因此该研究没有进行随机化或盲法化。这项研究的方案由斯坦福大学研究合规办公室的机构审查委员会批准。获得所有受试者的知情同意。所有的个体都是非卧床的。最初招募时，志愿者没有急性全身性或严重并发疾病，没有免疫缺陷病史，也没有任何已知或怀疑的免疫功能损害，包括临床观察到的肝脏疾病、接受胰岛素治疗的糖尿病、中度至重度肾脏疾病、筛查时血液压力>150/95、慢性乙型或丙型肝炎、近期或当前使用免疫抑制药物。此外，在每个年度疫苗接种日，没有志愿者分别在过去的6个月和6周内成为血液或血液制品的接受者或捐赠者，并且在基线采血的当天没有任何发热疾病的迹象。由静脉穿刺获得外周血样品，并将单核细胞分离并储存在斯坦福大学临床与转化研究部门(CTRU)。全血用于基因表达分析(下文)。通过离心凝结的血液分离血清，并在CMV血清学、细胞因子和趋化因子测定之前储存在-80℃。
慢性疲劳研究队列：研究参与者于2010年3月2日至2011年9月1日从北加利福尼亚招募。在入组当天的上午8:30至下午3:30之间抽取他们的外周血。为每个参与者在基线收集这些样本(在取血样之前不做运动)。此外，在招募每位ME/CFS患者进入研究时，同时招募了两个相应年龄和性别相匹配的对照，直到达到200名患者和400名对照的目标样本量。这种方法导致患者和对照进入研究的时间被插入。CTRU的放血团队将8毫升血液抽入红顶血清管(Fisher Scientific)中。通过使血液凝结40分钟获得血清。一旦凝结，将血管在冷藏(4℃)离心机(Allegra X-15R，Beckman Coulter)中以2000xG离心15分钟。分离血清并将其用2毫升无菌血清移液管(Fisher Scientific)在管中充分混合，以获得均匀的溶液，然后分配到存储管中。根据斯坦福人类免疫监测中心(HIMC)的等分试样指南将血清分装成等分试样，并在-80℃冷冻。在细胞因子检测的当天，始终将匹配的ME/CFS病例组和健康对照组混合在所有平板中，以减少与平板伪影混淆的病例状态。总之，就招募和血清处理方案而言，ME/CFS患者和对照处理相同。
心血管研究队列：经斯坦福大学机构审查委员会批准，参加美国国立卫生研究院(National Institute of Health)赞助的5U19 AI05086研究和斯坦福心血管研究所衰老研究的151位受试者经过筛选以纳入研究中。筛选过程包括全面的健康调查表，包括伦敦卫生学院心血管调查表。排除标准包括以下内容：急性或慢性病病史，例如动脉粥样硬化，系统性高血压，糖尿病或痴呆症，早期心血管疾病的家族病史(<55岁)，定期使用非类固醇抗炎药或吸入类固醇，恶性肿瘤病史，去年内的手术史，特应性皮肤病史、最近3个月内包括上呼吸道感染或尿路感染的感染史，以及过去3个月内的疫苗接种史。研究未排除80岁以上曾有轻度系统性高血压病史但访视时血压正常(血压<140/90mmHg)的患者。根据纳入和排除标准，研究纳入了97名受试者。根据预先设定的年龄界限(即25至44岁、45至60岁、60至75岁和75至90岁之间)将患者分为4组。
人iPSC产生和培养：斯坦福大学人类受试者研究机构审查委员会批准了分离和使用患者血液的方案。先前已经发布了有关患者血液分离以及hiPSC的产生、培养、表征的详细信息(Matsa等人，2016)。
人iPSC向内皮细胞的分化：将人iPSC(hiPSC)接种在基质胶平板上，并在hiPSC培养基中生长4天，达到75-80％融合。通过在没有胰岛素培养基的RPMI-B27(LifeTechnologies)中用6μM CHIR99021处理hiPSC 2天，然后在没有胰岛素培养基的RPMI-B27中用2μM CHIR99021另外处理2天，从而开始分化为EC。在这些处理之后，使分化的hiPSC接受补充有50ng/mL VEGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml FGFb的内皮培养基EGM2(Lonza)处理7天，每两天更换一次培养基。在第12天，使用MAC分选分离诱导的EC，其中细胞首先通过胰蛋白酶分散，然后与CD144抗体一起孵育，最后通过包含结合了CD144的磁微珠的MACS柱(Miltenyi Biotec)。然后将分选的细胞接种在0.2％明胶包被的平板上，并维持在补充有10μM SB431542(TGFb抑制剂)的EGM2培养基中。hiPSC-EC在融合时传代，并维持在EGM2培养基中。
人iPSC的体外单层心肌细胞分化：为了诱导心肌细胞分化，将大约1×105未分化的iPSC接种在基质胶包被的6孔板的每个孔中，并按照先前的方案/流程在分化培养基中进行培养(Gu等人，2017；Lian等人，2012)。采用补充了FBS和乳酸盐的无葡萄糖MEMα，在37℃，20％O2和5％CO2的湿润培养箱(每48小时更换一次培养基)使细胞富集至98.0％α-辅肌动蛋白阳性，一旦细胞达到80-90％融合就会传代细胞。富集后立即对人iPSC-CM进行处理。
细胞系：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自Lonza，并按照其操作流程进行培养。如前所述培养成纤维细胞(Takahashi和Yamanaka，2006)。
方法细节
心血管表型：使用3个参数来评估心血管年龄：(1)主动脉脉搏波速度(PWV)，一种对血管僵硬度的测量；(2)相对壁厚(RWT)，一种心室重构的测量，(3)舒张早期二尖瓣环速度(e')，一种心室舒张的测量。此外，测量了早期二尖瓣流入速度(E)与e'的比率，它是舒张末期充盈压的替代标志(Nagueh等人，2009；Redfield等人，2005)。
主动脉PWV计算为脉搏波距离(以米为单位)与通过时间(以秒为单位)的比值。9.0MHz飞利浦线阵探头用于评估颈动脉(主要是颈总动脉、球颈动脉和颈内动脉)和股骨近端动脉。脉搏波距离(D)被测量为从胸骨切迹到股动脉的距离(xdirect)，减去从胸骨切迹到近端降主动脉的距离(D＝xdirect-xnotch-aota)。相交切线方法用于测量从参考ECG信号和脉搏波的底脚的时间。颈动脉和股骨信号之间的心率必须在2bpm之内。所有多普勒信号均以150mm/s记录。在实验室中对50个样本计算了观察者间的变化性，并且由2位独立观察员(独立测量路径长度和通过时间)测量的PWV的类内相关系数为0.94。
根据美国超声心动图学会的建议，使用飞利浦IE33超声心动图系统执行超声心动图。(Lang等人，2005)所有研究均由一位不了解年龄以及临床和生物学数据的医师(FH)解释。所有参数均一式三份测量并取平均值。使用M-模式衍生的测量方法测量心室尺寸和壁厚；隔膜的测量不包括隔束，并且后壁的测量不包括脊索。RWT被计算为间隔和后壁的总和除以左心室内部尺寸。使用ASE推荐的公式基于将LV建模为长椭圆形来估计心室质量(Lang等人，2005)。使用辛普森(Simpson)双平面方法来估计左心室射血分数。组织多普勒e'速度代表间隔和侧环的平均值(Nagueh等人，2009；Redfield等人，2005)。观察者之间的差异针对50个样本计算得出；对于LV质量测量，实验室中的组内相关性为0.93。
诱导的人多能干细胞衍生的心肌细胞和内皮细胞：iPSC衍生自5个健康个体，并且细胞系通过了对于多能性和基因组稳定性的通用评估。这些iPSC分化为纯度>85％的心肌细胞和纯度>90％的内皮细胞。iPSC-CM在第30天分化，iPSC-EC在第14天分化。两种类型的细胞均表达成熟的细胞标志物。本研究的实验部分集中在INF-γ信号通路的3个不同部分。
为了分析基因表达CXCR3，使用RNeasy Plus试剂盒(QIAGEN)分离RNA，使用HighCapacity RNA-to-cDNA试剂盒(LifeTechnologies)产生cDNA，并使用TaqManGeneExpression Assays、TaqManGene Expression Master Mix和StepOnePlusTM实时PCR系统(Life Technologies)进行实时PCR。所有PCR反应均一式三份进行，针对GAPDH内源性对照基因进行标准化，并使用比较Ct方法进行评估。
量化实时PCR：为了分析CXCL9和SIRT3的基因表达模式，使用Qiagen RNA分离试剂盒(Qiagen 74104)提取RNA，并使用qScript cDNA SuperMix(QuantaBio)合成cDNA。使用TaqMan Gene Expression Assays(GAPDH，Hs02758991_g1，CXCL9，Hs00171065_m1，SIRT3，Hs00953477_m1)、TaqMan Master Mix和7900HT实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)进行实时PCR。所有PCR反应均一式三份进行，针对GAPDH看家基因进行标准化，并使用ΔΔCt相对定量(RQ)方法进行评估。
血管管状形成：产生的hiPSC-EC的功能已在血管生成测定中进行了表征，并与hiPSC进行了比较。通过将1×104个细胞播种在涂有Matrigel(
Figure BDA0002641505290000211
Matrix)的孔中来评估产生的hiPSC-EC形成管状结构的能力，该孔中含有补充有50ng/mL VEGF的EGM2培养基，并孵育16-24小时。
流式细胞术免疫分型：该测定由斯坦福大学人类免疫监测中心进行。将PBMC在温暖的培养基中解冻，洗涤两次并以1×10^7个活细胞/mL进行重悬。每孔50μL细胞在室温下用主要来源列表(Key Resources Table)中示出的抗体染色45分钟(所有试剂均来自BDBiosciences，San Jose，CA)。将细胞用FACS缓冲液(补充2％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤3次，并重悬于200μL FACS缓冲液中。使用DIVA 6.0软件在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences)上收集每个样品100,000个淋巴细胞。使用FlowJo v9.3通过基于前向散射配置相对于侧向散射配置对活细胞进行门控来进行数据分析，然后使用前向散射面积相对于高度对单峰进行门控，然后进行细胞亚群特异性门控(进行数据分析)。
磷酸化表位流式细胞术(细胞因子刺激，pSTAT读数)：该测定法由斯坦福大学人类免疫监测中心进行。将PBMC在温暖的培养基中解冻，洗涤两次，并以0.5×10^6个活细胞/mL进行重悬。将200μL细胞铺在96孔深孔板中的每个孔中。在37℃静置1小时后，通过添加50μl细胞因子(IFNa、IFNg、IL-6、IL-7、IL-10、IL-2或IL-21)刺激细胞，并在37℃下孵育15分钟。然后将PBMC用低聚甲醛固定，用甲醇渗透，并在-80℃下保持过夜。使用Pacific Orange和Alexa-750染料(Invitrogen，Carlsbad，CA)的组合对每个孔进行条形码编码，然后合并到管中。用FACS缓冲液(补充有2％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤细胞，并用以下抗体染色(全部来自BD Biosciences，San Jose，CA)：CD3 Pacific Blue、CD4 PerCP-Cy5.5、CD20PerCp-Cy5.5、CD33 PE-Cy7、CD45RA Qdot 605、pSTAT-1 AlexaFluor488、pSTAT-3AlexaFluor647、pSTAT-5 PE。然后将样品洗涤并重悬于FACS缓冲液中。使用DIVA 6.0软件在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上收集每种刺激条件下的100,000个细胞。使用FlowJo v9.3通过基于前向散射配置相对于侧向散射配置对活细胞进行门控来进行数据分析，然后使用前向散射面积相对于高度对单峰进行门控，然后进行细胞亚群特异性门控(进行数据分析)。
CyTOF免疫分型：该测定在斯坦福大学人类免疫监测中心进行。PBMC在温暖的培养基中解冻，洗涤两次，重悬于CyFACS缓冲液(补充有2％BSA、2mM EDTA和0.1％叠氮化钠的PBS)中，并用Vicell计数活细胞。将细胞以150万个活细胞/孔的量添加到V型底部微量滴定板中，并通过沉淀和重悬于新鲜的CyFACS缓冲液中洗涤一次。用50μL重要来源列表中所示的以下抗体-聚合物偶联混合物在冰上将细胞染色60分钟。所有抗体均来自BDBiosciences、Biolegend或R&D Systems的纯化的未偶联无载体蛋白的原料。聚合物和金属同位素来自DVS Sciences。通过沉淀和重悬于250μL FACS缓冲液中将细胞洗涤两次。将细胞重悬于含有2μg/mL Live-Dead(含有天然丰度铟的DOTA-马来酰亚胺(Macrocyclics))的100μL PBS缓冲液中。通过沉淀和重悬于250μL PBS中将细胞洗涤两次。将细胞重悬于100μL2％PFA的PBS溶液中，并在4℃放置过夜。第二天，将细胞沉淀并通过重悬在新鲜的PBS中洗涤。将细胞重悬于100μL eBiosciences透化缓冲液(在PBS中1×)中，并在用250μL PBS洗涤两次之前置于冰上45分钟。如果进行了细胞内染色，则在CyFACS中洗涤两次之前，将细胞在冰上重悬于50μL CyFACS中的抗体混合物中1小时。将细胞重悬于100μL含铱的DNA嵌入剂(在PBS中1：2000稀释；DVS Sciences)中，并在室温下孵育20分钟。将细胞在250μL MilliQ水中洗涤两次。在注射到CyTOF(DVS Sciences)中之前，将细胞在MilliQ水中稀释至700μL的总体积。使用FlowJo v9.3(CyTOF设置)通过基于来自嵌入剂的铱同位素对完整细胞进行门控来进行数据分析，然后通过Ir191相对于细胞长度对单峰进行门控，然后对活细胞(Indium-LiveDead minus population)进行门控，然后通过细胞亚群特异性门控(进行数据分析)。
磷酸化表位CyTOF(细胞因子刺激，pSTAT读数)：该测定法由斯坦福大学人类免疫监测中心进行。将PBMC在温热的培养基中解冻，洗涤两次，通过Vi-cell进行计数，并以5×10^6个活细胞/mL进行重悬。将100μL细胞铺在96孔深孔板中的每个孔。在37℃静置1小时后，通过添加25μl刺激物(IFNa、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、LPS或PMA/离子霉素)刺激细胞，并在37℃孵育15分钟。然后将细胞用低聚甲醛固定，用CyFACS缓冲液(补充有2％BSA、2mMEDTA和0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤两次，并在室温下用20μL表面抗体混合物染色30分钟。用cyFACS洗涤细胞两次，用100％甲醇渗透，并在-80℃下保持过夜。第二天，将细胞用cyFACS缓冲液洗涤，并在室温下重悬于CyFACS中的20μL细胞内抗体混合物中30分钟，然后在CyFACS中洗涤两次。将细胞重悬于100μL含铱的DNA嵌入剂(在PBS中的2％PFA中以1：2000的比例稀释)中，并在室温下孵育20分钟。用cyFACS缓冲液洗涤细胞一次，并用MilliQ水洗涤两次。在注射到CyTOF中之前，将细胞在MilliQ水中稀释至750×105细胞/mL。使用FlowJov9.3(CyTOF设置)通过基于来自嵌入剂的铱同位素对完整细胞进行门控来进行数据分析，然后通过Ir191相对于细胞长度对单峰进行门控，然后进行细胞亚群特异性门控(进行数据分析)。
基因表达微阵列分析：将500ng高质量总RNA用于Illumina基因表达微阵列(HumanHT-12BeadChip，v4)实验。Illumina Direct Hyb标记方法通过逆转录和体外转录技术(将生物素标记的核苷酸整合到新生产品中)进行基于3'基因表达测量。将标记的互补RNA(cRNA)产物杂交到微珠阵列上，洗涤并用链霉亲和素-Cy3染色。HumanHT-12BeadChip上的每个阵列用超过48,000个探针靶向超过25,000个带注释的基因。使用如Whole-GenomeGene Expression Direct Hybridization Assay Guide(Catalog#BD-901-1002Part#11322355Rev.A)中所述的位于斯坦福大学功能基因组学设施(SFGF)处的IlluminaBeadArray阅读器来进行杂交和扫描。使用Illumina BeadStudio提取数据以进行进一步的数据分析。
血清免疫蛋白的测定：Luminex-聚苯乙烯微珠试剂盒。该测定法在斯坦福大学人类免疫监测中心进行。Human 50或51-plex试剂盒购自Panomics/Affymetrix，并根据制造商的建议进行使用，其中进行了如下所述的修改。简而言之，将样品与抗体连接的聚苯乙烯珠粒在96孔过滤底板上混合，并在室温下孵育2小时，然后在4℃孵育过夜。室温孵育步骤在轨道式振荡器上以500-600rpm进行。将板真空过滤并用洗涤缓冲液洗涤两次，然后与生物素化的检测抗体在室温下孵育2小时。然后将样品过滤并如上所述洗涤两次，并重新悬浮于链霉亲和素-PE中。在室温下孵育40分钟后，再进行两次另外的真空洗涤，并将样品重悬在读取缓冲液中。每个样品一式两份进行测量。使用Luminex 200仪器读取板，下界为100个珠粒每个样品每个细胞因子。将Radix Biosolutions的定制测定对照珠粒添加到所有孔中。
量化与统计分析
免疫特征的分布：输入数据包括血清蛋白微流成像(MFI)和细胞亚群频率数据。首先对数据进行对数转换，然后使用最大似然估计(MLE)将6个不同的分布(正态、拉普拉斯、对数正态、对数拉普拉斯、伽马、对数伽马)对每个输入特征进行拟合。为了确定每个特征的最佳分布，对每个分布进行了五重交叉验证测试。计算了正态分布与其它分布之间五重测试可能性的t检验p值。
免疫类型的确定：在处理后的细胞亚群数据上进行聚集聚类。为了确定最佳聚类数，使用了差距统计(gap statistic)(Tibshirani等人，2001)。差距统计利用引导程序来估计聚类质量，与数据均匀分布的零假设相比，这是一种改进。当添加另一个群集不会在聚类质量显著提高时，它选择最小的聚类数。通过1000个样本的引导程序测试，最佳聚类数被确定为16。因此，对数据执行具有16个聚类的聚集聚类，以识别16个免疫亚型。
免疫类型的免疫学分析：使用可用于所有1001名受试者的免疫蛋白数据(50种细胞因子、趋化因子和生长因子：MIG、TRAIL、IFNG、EOTAXIN、GROA、IL2、TGFA、PAI1、MIP1A、LEPTIN、IL1B、LIF、IL5、IFNA、IL4、NGF、HGF、VEGF、FGFB、TGFB、MCSF、PDGFBB、IL7、GMCSF、IL12P40、IL8、SCF、GCSF、CD40L、MIP1B、IL12P70、RESISTIN、IFNB、RANTES、TNFA、MCP1、IL17F、ENA78、IL1RA、IL10、IP10、IL13、IL1A、IL15、ICAM1、TNFB、IL6、MCP3、VCAM1和FASL)，并且使用可用于总共818名受试者的对细胞因子刺激数据(84种不同的细胞因子-细胞-磷酸化蛋白组合)的离体信号应答。为了开发区分每种免疫类型的标记，使用微阵列的预测分析(PAM)在训练集中创建分类器，随后在测试集中进行验证。微阵列的预测分析是一种创建表型特异性的“最近收缩的质心”用于分类的统计技术，因此可用于比较跨免疫类型的各免疫特征的水平。这通过在训练集中进行平衡的10重交叉验证来进行，使得人们能够选择最小化分类错误的阈值。该方法对标准最近的质心分类进行了一个重要的修改；它对所有免疫类型将每个免疫类型质心朝向总体质心“缩小”，这赋予了优势，因为它通过减少噪声特征的作用使分类器更加准确。血清蛋白水平或特定免疫类型(例如，与年龄较大的人群(13、14和16)相关的那些)的信号应答的比较通过在原始数据上改动的Fisher组合概率(Dai等人，2014)的自足测试进行。
免疫类型的临床分析：对于每种疾病，使用预测器拟合用l1罚分惩罚的逻辑回归模型：性别、年龄、BMI和免疫类型的虚拟变量。惩罚逻辑回归的训练程序使用3重以上的交叉验证来选择l1罚分的权重。为了评估模型参数的重要性，进行了排列测试。对患者的疾病分配进行了1000次排列。对于每个这样的排列，使用相同的拟合程序来获得惩罚的逻辑回归权重。评估了在实际数据上获悉的权重超过(在绝对值上)在排列的数据上计算出的权重。报道了这种发生的频率为经验p值。
代谢基因模块分析：对来自394名患者亚组的代谢基因进行模块分析。有851个基因与代谢基因集重叠(Possemato等，2011)。在标准对数转换的代谢基因表达水平上，将聚集聚类与50个聚类一起使用。对于每个聚类，计算Spearman的相关系数，并获得所有基因表达水平与患者年龄之间的p值。
引导自动编码器(GAE)和SCI：当处理具有大量维度的数据时，目标是找到合理的方法尽可能将数据汇总为紧凑的表示形式。这种紧凑的表示可以进一步用于特征提取、可视化或分类目的。为了获得信息的表示，提出了一种称作“引导自动编码器(Guided Auto-Encoder)”的新型模型。它基于具有组合目标的自动编码器构建。自动编码器使用数据的非线性转换。因此，它可以为更复杂的流程建模(Bengio，2009)。自动编码器的一个问题是重新参数化。使用不同的初始化，可能会有不同的结果。在具有相似汇总水平的不同类型的可视化中，通常想要一种信息化为特定靶标的表示。因此，可以构建具有两个焦点的表示：1)可以将学习到的紧凑的表示h尽可能恢复为原始数据(重构损失)；2)所学习的紧凑的表示应尽可能信息化为所需的靶标(预测损失)。因此，提出了一种新颖的结构，即引导自动编码器，其平衡了两个目标，以提供一种信息化的表示。应用GAE提取SCI。这是人体内细胞因子数据的非线性转换，既近似于真实年龄，又保留了细胞因子水平的信息。
自动编码器：给定输入数据向量x，自动编码器旨在重建输入数据向量x。考虑具有L个编码层和L个解码层的深度为L的自动编码器，并且每个层具有固定数量的隐藏节点m。为了方便起见，将输入层定义为h0(x)＝x，而第l隐藏层的输出定义为h1(x)。层1中的节点数为m1。进入网络的第1层的输入定义为：
al(x)＝hl-1(x)TWl+βl，
其中Wl是ml-1乘ml的实值权重矩阵，而β1是长度为ml-1的向量。第l隐藏层的输出是：
hl(x)＝tanh(al(x))
其中tanh是双曲正切函数：
Figure BDA0002641505290000261
定义了作为编码层的第L层hL(x)的输出。解码层是具有相同设置的从第L+1层到第2L-1层。最后，线性输出层位于最后一个解码层之上：
fAE(x)＝h2L-1(x)TW2L-1+β2L，
给定数据向量x，对自动编码器进行了训练，将数据的重建损失降至最低：
Figure BDA0002641505290000262
其中，i在样本数量范围内，θ表示自动编码器中使用的所有参数，而λ是用于正则化的权重衰减惩罚。为了优化目标(1)，使用了随机优化方法ADAM[3]。
引导自动编码器：引导自动编码器旨在减少重建损失和预测损失。给定输入x、旁边-表型(side-phenotype)y和自动编码器fAE，引导自动编码器在编码层上整合了预测功能：
fG(x)＝hL(x)TwG+βG，
具有自己的一组参数wG和βG。
使θ为GAE所有参数的集合，训练目标为：
Figure BDA0002641505290000263
其中α是介于0和1之间的实值，称为引导比率。下面示出了一个深度为2且宽度为3的示例引导自动编码器。
Figure BDA0002641505290000271
使用优化方法ADAM(Kingma和Jimmy，2014)使目标最小化。通过选择不同的引导比率，可以在预测损失和重建损失之间达到不同的平衡水平。
SCI的提取：为了对患者的免疫系统健康状况进行标记物总结，发明了一种新的量化-SCI。该量化是可以从免疫系统的状况预测患者的年龄。为了获得该量化，着重于细胞因子测量值。通过构建，SCI是细胞因子测量值的非线性函数，但也是患者真实年龄的估计。
为了构建该量化，使用了引导自动编码器(GAE)，其目的是紧凑地表示细胞因子测量值并预测侧边-表型实足年龄。使用5重交叉验证从1到10的长度中确定了最佳代码长度。选择代码k的长度，其性能在统计学上不比较长代码(配对t检验p值>0.05)明显差。在每一重中，进行嵌套的三重交叉验证以选择超参数(深度、权重衰减和引导比率)。
在获得最佳代码长度为5(图10A)后，使用五重交叉验证来选择具有代码长度为5的所有GAE上的最佳超参数设置(深度＝2，引导比率＝0.2，L2＝0.001)。最后，GAE在具有选定的最佳超参数设置的整个数据集上进行训练，并获得了作为SCI预测器的预测功能。
数据和软件可用性
数据可用性：斯坦福老龄化和疫苗接种研究的细胞亚群、免疫蛋白和细胞信号传导数据可在ImmPort Bioinformatics Repository上从以下研究ID中公开获得：SDY311(细胞因子、磷酸流分析和CyTOF表面表型)、SDY312(细胞因子、磷酸流分析和流式细胞术表面表型)、SDY314(流式细胞术表面表型)、SDY315(细胞因子、磷酸流表型和CyTOF表面表型)和SDY478(细胞因子和CyTOF表面表型)。
慢性疲劳综合征对照样本的基因表达数据可通过下面的基因表达综合数据库(GEO)获得。
结果
1000免疫组学项目的研究设计
在2007年至2016年期间，斯坦福大学(1000免疫组学项目；1KIP)招募了8岁至>89岁的非卧床的受试者(N＝1001)(339名男性，662名女性)，用于纵向研究衰老和疫苗接种(Blazkova等人，2017；Brodin等人，2015；Furman等人，2017；Furman等人，2014；Furman等人，2013；Furman等人，2015；Price等人，2013；Roskin等人，2015；Shen-Orr等人，2016；Wang等人，2014)，以及一项针对慢性疲劳综合症的独立研究(Montoya等人，2017)，其中仅包括健康对照者。纳入和排除标准可在STAR方法部分中找到。对于所有1KIP样本，在斯坦福人类免疫监测中心(HIMC)进行了深度免疫表型分析，在该中心使用严格的标准化程序对外周血标本进行处理和分析(Maecker等人，2012)。全血用于全基因组转录组分析(N＝394)；获得血清样品并用于蛋白质含量测定(包括总共50种细胞因子、趋化因子和生长因子)(N＝1001)，并用于巨细胞病毒阳性的血清学评估(N＝748)，这是免疫系统变化的主要决定因素(Brodin等人，2015；Furman等人，2015)。外周血单核细胞或全血样品用于确定细胞表型和频率(N＝935)，并用于研究对多种细胞因子刺激的体外细胞反应(N＝818)。从617/1001名受试者中收集了扩展的临床报告表格，其中231名是男性并且386名是女性(图1和表1)。
图1示出了1000免疫组学项目研究设计，包括通过“OMICS”方法对免疫系统进行的系统分析。斯坦福大学1000免疫组学项目包括2007年至2016年期间招募的1001名年龄在8岁至>89岁之间的非卧床的受试者(34％男性，66％女性)。对于所有1KIP样本，在斯坦福大学人类免疫监测中心进行了深度免疫表型分析，该中心存储了外周血标本并使用标准程序进行了分析。从静脉穿刺获得外周血样品，并将外周血单核细胞或全血样品用于确定细胞表型和频率(N＝935)，并研究对多种细胞因子刺激的体外细胞反应(N＝818)，获得血清样品并用于蛋白质含量测定(包括总共50种细胞因子、趋化因子和生长因子)(N＝1001)，并将全血用于全基因组转录组分析(N＝394)。通过临床问卷评估了总共617位受试者的临床特征，其中527位可以完成分析，因为他们完成了全组53项临床项目。从总共97名健康年轻人和老年人中，还进行了全面的心血管表型分析。表1示出了1000免疫组学项目(“1KIP”)的数据。
Figure BDA0002641505290000291
*低变异基因被移除
表1. 1KIP的可用数据
免疫细胞亚群和循环蛋白的分布
为了找到健康的免疫“指标”的目的，对外周血中50种循环蛋白水平的分布和25种主要免疫细胞的频率进行了表征。分布是样本的重要统计特征，因为它们描述了所研究人群中观察到的特定免疫性状发生的频率。为此，对于每个免疫特征，使用最大似然估计(MLE)方法对6种不同的分布进行拟合：正态、拉普拉斯、对数正态、对数拉普拉斯、伽马和对数伽马，这是在人群研究中广泛使用的概率分布的可靠估计器(Johansen和Juselius，1990)。为了确定最能解释每个免疫特征分布的模型，对MLE测试在正常分布和每个特征分布之间进行了5重交叉验证。通过这种方法，获得了P值，并确定了针对零模型的每个免疫特征分布(请参见Methods(方法))。
在75个免疫特征中，即细胞亚群和循环免疫蛋白，只有12个(16％)呈正态分布；3/25个细胞亚群(CD4+T细胞、CD8+T细胞和原初CD4+T细胞)和9/50(18％)的循环蛋白(图9和图14)。一般，最佳建模的分布表现的尾部比正态分布(例如拉普拉斯、对数正态和伽马)重(图9)，这表明为细胞频率或免疫蛋白找到具有极高值的受试者的可能性很大。最常见的是，细胞亚群表现出拉普拉斯分布(图9)。例如，表现出这种类型分布的细胞子集是B细胞，以及B细胞亚型IgG+CD27+、IgG+CD27-、IgG-CD27+和IgG-CD27-，过渡性B细胞；NK和NKT细胞；中央记忆CD4+和CD8+T细胞；以及效应记忆和原初CD8+T细胞的频率(图14)。对于循环免疫蛋白，大多数趋化因子也表现出拉普拉斯分布，而典型的炎症细胞因子IL-1β呈正态分布，而IL-6和TNF-α呈对数正态分布。
总的来说，这些结果证实，对于绝大多数血液免疫细胞和蛋白质，重尾分布比正态分布更常见，这表明极端值在人群的免疫系统中相对普遍，与现有文献一致(Kaczorowski等人，2017)。
免疫类型的确定
细胞是免疫系统的量子，因此，免疫细胞的比例和活性可以协调免疫应答的启动和结果，以及解决使得系统恢复稳态的能力。为了确定具有相似免疫组成的个体聚类并进一步将其与健康相对于疾病状态相关联，利用了可从935/1001受试者获得的细胞比例数据。数据包括使用大规模细胞计数法分析的721个样本和通过流式细胞术分析的213个样本(图15)。为了通过利用相对较大的研究样本规模发挥杠杆作用来最大化统计功效，使用了队列中通常测量的细胞类型总数。这产生了总共25个细胞亚群，在所有935个受试者中进行了一致地测量。对数据进行归一化，并对数据源进行回归分析，以使每个特征与数据源之间的线性相关性为零(请参见Methods(方法))。使用聚集聚类对处理的数据进行聚类分析。为了识别显著的聚类，使用了间隔统计。间隔统计是一种公认的方法(Tibshirani等人，2001)，该方法利用引导程序对形成的聚类的内部聚类分散创建“零”分布，从而可以估算每个聚类的统计显著性。使用一千个引导程序，聚类的最佳数量为16。对原始数据的主成分分析(PCA)表明，前三个PCA揭示了大多数此类聚类，尽管前三个PCA没有很好地分隔某些聚类，因为它们可能在另一投射有所不同。
使用免疫细胞比例可以识别出十六种不同的免疫类型。从总共935名受试者中一致地获得了细胞子集频率(N＝25)。根据每种细胞类型的比例，使用聚集聚类对个体进行聚类。为了得出重要的聚类，使用了间隔统计(Tibshirani等人，2001)。进行了1000次引导，对比较的形成的聚类的内部聚类分散创建“零”分布。
免疫类型的平均样本量为58；但是，每个聚类的受试者数量差异很大，有些聚类具有几十个样本(例如，免疫类型2、10和11)，而其它聚类具有一百多个样本(例如，免疫类型4和7)。
这16种免疫类型的人口统计学特征显示跨免疫类型的受试者的实足年龄有很大差异，鉴于众所周知的年龄对细胞子集频率的强烈影响，这不足为奇(Shen-Orr和Furman，2013)。例如，免疫类型3、4、8、10和12的大多数受试者是年轻和中年受试者(平均年龄分别为23、33、23、34和36岁)，而免疫类型1、2、5、6、9和11对应中年和老年受试者(平均年龄分别为50、53、52、50、49和49)，免疫类型13、14和16主要由老年人(平均年龄60岁及以上)组成。有趣的是，在免疫类型中还观察到了很大的年龄差异；值得注意的是，与老年人(例如，免疫类型13和16)有关的那些也包括年轻人组，这表明，在人类中，也可以在年轻健康的成年人中发现与衰老有关的细胞比例的特定组合。
跨免疫类型的平均BMI是相似的(平均值：25.9，范围：24.7-29.4)；但是，在免疫类型中发现了很大的个体差异(范围：13.1-52.1)。
观察到跨免疫类型的CMV血清阳性率的变化，在某些免疫类型(例如，免疫类型11(78％)和14(72％))中，发生率显著高于研究队列(53％)，而在其它免疫类型(例如，免疫类型3(32％)和13(35％))中，则显著较低(P<0.05)。同样，就队列中个体的性别而言，与整个队列中平均男性性别比率(34％)相比，男性的某些免疫类型得到富集(例如，免疫类型6(54％)和免疫类型10(59％))，而其它是女性富集(例如，免疫类型3(81％)、9(76％)和12(81％))。由于在大多数免疫类型中观察到BMI差异很大，并且众所周知肥胖可影响免疫系统反应和整体健康，因此BMI作为协变量用于后续关联和分析。同样，已在人类免疫系统中观察到广泛的性别效应(Blazkova等人，2017；Furman等人，2014)，并且已证实CMV感染会极大地影响免疫系统功能。因此，除了包括年龄和BMI作为协变量外，还针对性别和CMV调整了免疫类型的后续临床分析。
免疫类型的免疫特征
为了表征免疫类型的炎症水平和免疫细胞对急性攻击的反应能力，使用了可用于所有1001名受试者的免疫蛋白数据(50种细胞因子、趋化因子和生长因子)以及可用于总共818名受试者的对细胞因子刺激数据的离体信号响应(84种不同的细胞因子-细胞-磷酸蛋白组合)。使用微阵列(PAM)的预测分析来计算分析(Tibshirani等人，2002)，这是一种统计技术，通过使用最近的收缩质心比较跨免疫类型的每个免疫特征的水平(请参见Methods(方法))。该方法对标准最近的质心分类作了一个重要修改；它对所有免疫类型将每个免疫类型质心朝向总体质心“缩小”，这通过减少噪声特征的影响使分类器更加准确(请参见Methods(方法))。对于大多数情况，每种免疫类型均表现出相关的免疫蛋白水平，即，如果对于给定免疫类型，发现细胞因子相对于所有其它免疫类型处于更高或更低的水平，则大多数细胞因子倾向于沿同一方向变化；而对于信号响应观察到了类似现象。观察到免疫类型中具有较低水平的循环免疫蛋白更有效的响应，反之亦然，因此表明对急性免疫攻击的协同响应和全身性炎症的负面影响，这与Fourati S等人(2016)(Fourati等人，2016)，Shen-Orr等人(2016)(Shen-Orr等人，2016)和Verschoor CP等人(2017)(Verschoor等人，2017)最近的数据一致，表明炎症标记物是对免疫攻击的急性响应的负面预测因子。
与老年人(13、14和16)相关的免疫类型中循环免疫蛋白的水平高于所有其它免疫类型中观察到的水平(组合P<0.01)，这与众所周知的在老年人中观察到的低度慢性炎症的现象一致。一般，与年轻和中年受试者相关的免疫类型(类型3、4、8、10和12)表现的蛋白质水平与平均研究队列无异，但类型12例外，它与所有其它相比具有明显更高水平的细胞因子(P<0.01)，并包括一小群60+的老年人(N＝11)。
这些发现表明，在一般人群中，存在按时间顺序排列的年轻的并且在免疫学上与老年群体更相似的个体群(这是来自免疫类型13和16的年轻人的情况)，以及与年轻群体聚类在一起的老年人的亚组(例如，在免疫类型12中)，其尽管表现较高的炎症水平，但对保留的细胞因子刺激具有信号传导应答。
免疫类型的临床表征
为了确定免疫类型的临床影响，将每种免疫类型与疾病状态相关的图谱得自临床问卷(共53种疾病特征)(图16)，该问卷一致地从527/617名属于免疫类型3、4、7、8、10、12、13、14、15和16的参与者获得(图2)。对总共16种所述疾病特征观察到显著相关性(年龄、性别、CMV和BMI调整的，P<0.05)。如预期的那样，与所有其它免疫类型相比，对于免疫类型3(平均年龄23，年龄范围8-52)观察到癌症和其它与年龄相关的状况(如涉及骨骼、肌肉和关节的那些)的发生率较低。然而，在免疫类型8(平均年龄23，年龄范围12-79)的受试者中，尽管表现出癌症和高血压的发生率较低，但发现其肌肉骨骼状况(如肌肉和关节疼痛)以及泌尿系统疾病呈正相关(图2)。有趣的是，免疫类型12(主要由年轻受试者组成但与一小群老年受试者共享免疫概况)大多数人免受包括与生殖器和生殖系统以及胃肠道、内分泌代谢、皮肤病学和泌尿系统相关的疾病的侵害。尽管有这些观察结果，但是与所有其它免疫类型相比，免疫类型12中的受试者平均具有较高的肌肉和关节疼痛发生率(P<0.001)，而癌症的发生率较低但显著(R＝0.09，P<0.05)。
接下来研究免疫类型13、14和16。免疫类型13、14和16主要由60岁及以上的老年人组成，但具有不同的疾病发生模式。例如，免疫类型14(平均年龄77，年龄范围29-90)中的受试者胃肠道状况和肌肉关节疼痛的发生率较低，但生殖器和生殖疾病的发生率相对较高(高于研究队列)(图2)。相比之下，免疫类型13(平均年龄60，年龄范围16-90)中的个体表现出相对较低的泌尿和肌肉骨骼状况发生率，而类型16(平均年龄60，年龄范围9-90)则表现出较高的耳疾和骨关节炎发生率。
对于与死亡率相关的与年龄更相关的疾病，例如心血管疾病，免疫类型13和16中的受试者都对此类状况有较高的发生率，包括高血压和其它心血管状况的发生率，而免疫类型14中的受试者则免于受到这些疾病的困扰。与年龄相关的免疫类型14被分类为“健康衰老免疫类型”(HAiT)，而免疫类型13和16被分类为“不健康衰老免疫类型”(UAiT)。总的来说，这些结果证实，基于细胞亚群频率的概况来聚类免疫类型中的个体可以告知关于免疫系统在各种疾病和维持人类健康中的重要性。
SCI的构建
鉴于低度全身性和慢性炎症在与老年人相关的多种疾病的发展中，尤其是在心血管疾病领域中的影响日益得到认识(Furman等人，2017；Ridker等人，2017)，构建可以概括个体的炎症水平的指标很重要。这种类型的炎症被认为是由于对组织损伤、代谢功能障碍和环境危害的暴露(统称为“暴露体学”)而引起的适应不良反应(Goldberg和Dixit，2015；Kotas和Medzhitov，2015)。因此，它与急性炎症反应不同，后者是对感染或创伤的反应，是高度的和自限性的。对于急性炎症，已经验证了许多标准的标记物，这些标记物包括急性期蛋白、C反应蛋白和有效的炎症细胞因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α等。不过，在与年龄相关的慢性炎症中，不存在标准的生物标记物(Franceschi等人，2017；Morrisette-Thomas等人，2014)。因此，采取了一种无偏见的方法来紧凑地表示细胞因子网络的非线性结构。为此，将一种称为引导自动编码器(GAE)的深度学习方法应用于涵盖了来自总共1001名受试者的总共50种细胞因子、趋化因子和生长因子的循环免疫蛋白数据。
在GAE方法中，原始数据通过非线性函数合并为少量的“代码”。该方法旨在消除数据中的噪声和冗余，同时保留最相关的信息，使得稳健(robust)的GAE模型能够根据代码准确地预测原始数据(数据重构)(图10A-10B)。在分析中，计算目标是预测原始细胞因子数据，并同时预测个体的实足年龄(图10A-10B)。所得的预测值是细胞因子数据进行非线性转换的结果，这些数据都近似于真实年龄，同时在细胞因子水平上保留了信息。因此，GAE预测的年龄代表了特定个体在炎症空间或“SCI”的年龄。由于预测原始细胞因子输入数据的能力通常是GAE方法中代码数量的函数，因此首先，确定最佳代码长度非常重要。为此，对代码长度从1到10的每个GAE使用5重交叉验证(图11)。在每一重，采用了使用3重交叉验证的最佳超参数(深度、权重衰减和引导比率)(请参见Methods(方法))。计算每个模型的误差(总损失)，作为预测损失(预测年龄的准确性)和重建损失(预测细胞因子数据的准确性)的总和。最后，确定具有最小代码长度的GAE，使得添加代码不会显著改善所有5重的总损失(t检验p值<0.05)。使用这种方法，最佳代码长度为5(图11A)。
为了测试GAE方法的稳健性和质量，将年龄预测的准确性与其它使用线性方程的广泛使用的降维方法(例如弹性网和主成分分析(PCA))以及涉及非-线性方程的方法(例如普通的自动编码器和神经网络)进行比较(图10A-10B和11B)。总体而言，除了与普通神经网络(P＝0.54)的比较外，GAE方法在预测实足年龄方面优于其它方法(P<0.05)(图12B)。这些结果表明，最好使用非线性方法对衰老人类的低度慢性炎症的熟知的现象进行建模，并在此基础上，得出一种准确预测实足年龄的指标，同时保留通过循环免疫蛋白水平衡量的与总炎症水平有关的生物学信息。
SCI与合并症和心血管衰老相关
为了进一步了解慢性炎症对与年龄相关的病理学的影响，选择了10种代表不同生理系统且通常与老年相关的疾病项目，以及疾病总和(合并症)与SCI之间的计算回归分析。分析的项目是癌症、心血管、呼吸道、胃肠道、泌尿科、神经系统疾病、内分泌-代谢、肌肉骨骼、生殖器-生殖和精神病学。所有这些疾病特征都是二元的。对于这些分析，考虑到这些变量中的每一个在与年龄有关的病理学病因中的报道的影响，对年龄、BMI、性别、CMV和高胆固醇(也是二元类别)进行了调整(图3A)。在控制多项测试(通过排列测试)后，观察到在研究人群中SCI与合并症之间存在显著相关性(N＝527，P<0.0001)(图3A)。
鉴于慢性炎症在高血压和其它心血管状况中的影响日益得到认识，选择了总共40位年龄在60至>89岁的受试者(20位健康受试者和20位患病受试者)进行针对心血管衰老的随访研究。招募后，从所有研究参与者获得了知情同意，然后对他们进行基线超声心动图和脉搏波速度测试(请参见Methods(方法))，涵盖27个变量。相关网络分析显示，其中许多都是正相关的(图12)，考虑到这些变量中的许多变量是由两个或多个相关超声心动图测量值的计算得出的，这并不奇怪。例如，可将重构率或相对壁厚(RWT)(心室重构和心血管衰老的测量值)计算为舒张期室间隔尺寸(IVSd)和舒张期后壁尺寸(PWd)的总和除以左心室内尺寸(LVIDd)(请参见Methods(方法))。
为了获得回归系数的显著性，计算了回归分析并调整了通过排列程序进行的多个假设测试。使用500个排列，发现SCI仅与两个变量呈正相关(图4)：舒张期室间隔尺寸(IVSd)(Q＝0.18)和左心室质量体积比(LVmv)(Q＝0.12)。观察到相对壁厚(RWT)也呈正相关，尽管具有临界意义(Q＝0.21)(图4)。
这些结果表明，SCI是与年龄有关的合并症和心血管衰老的重要免疫特征。
CXCL9是SCI的重要组成部分，并与健康成年人的心血管衰老相关
为了进一步了解炎症与心血管功能障碍相关的潜在机制，目标是分析哪些因素对SCI的贡献最大。为此，通过计算变化最大的雅可比行列式(jacobian)(SCI的一阶偏导数)，将SCI分解为单个免疫蛋白特征。发现了SCI的正负贡献者(图5)。前15个最易变的雅可比行列式是CXCL9、EOTAXIN、Mip-1α、LEPTIN、IL-1β、IL-5、IFN-α和IL-4(正贡献者)和TRAIL、IFN-β、GRO-α、IL-2、TGF-α、PAI-1和LIF(负贡献者)(图5)。
为了将合并症的潜在混杂因素影响从先前显示SCI与心血管衰老相关的发现分离出来(图4，请参见上文)，对97名健康成年人(年龄25-90岁)的组进行了随访研究，他们是使用严格的选择标准从总共151名招募受试者中选出的，并且与心血管疾病风险概况很好的匹配(请参见Methods(方法))(表2)。
Figure BDA0002641505290000361
Figure BDA0002641505290000371
表2. 1KP的可用数据
使用48丛面板测量炎症标志物，并从所有研究参与者中获得主动脉脉搏波速度(PWV)和超声心动图。主动脉PWV计算为脉搏波距离(以米为单位)与通过时间(以秒为单位)的比值，而RWT如前所述计算(请参见Methods(方法))。
在这个健康的队列中，在48种循环免疫蛋白中，只有6种与年龄显著相关(P<0.05)，其中CXCL9、IL-11Rα、CXCL10和HGF随着年龄的增长而增加，而GRO-α和LIF则下降。相比之下，在典型的急性炎症蛋白如IL-1β(R2＝0.013，P＝0.26)、TNF-α(R2＝0.002，P＝0.64)、IL-6(R2＝0.026，P＝0.11)、或高灵敏度(hs)-CRP(R2＝0.004，P＝0.56)中，没有明显的年龄依赖性变化，表明这些标记物随年龄的增加可能是由于与年龄增大相关的潜在病理过程而非衰老本身引起。为了确定健康个体中与年龄无关并可能存在的与心血管衰老相关的炎症标记物，对该队列中与衰老相关的选定的炎症标记物(CXCL9和LIF)以及从所有研究个体中获得的心血管测量值进行了多元回归层次分析(请参见Methods(方法))。对于这些分析，对年龄、性别、BMI、心率、收缩压、空腹血糖和总胆固醇与HDL比率进行了调整。在P值<0.01，发现CXCL9与心血管衰老标志物PWV(R＝0.22)和RWT(R＝0.3)之间呈正相关，并发现LIF和PWV(R＝-0.27)和RWT(R＝-0.22)之间呈负相关(图6A和6B)。综上所述，这些结果表明，可以在否则健康的个体中发现亚临床心脏肥大和动脉僵硬度增加，具有升高的循环CXCL9水平和较低的LIF血液浓度。
衰老的内皮细胞表达高水平的CXCL9，其诱导保护心脏SIRT3的mRNA下调
长期以来的证据已经表明内皮在高血压和动脉僵硬的病因中起着至关重要的作用，并且最近的研究还表明，心血管衰老的更提前的迹象例如组织重构和心脏肥大通常是先兆，并且可能由衰老的内皮的功能障碍引起(Castellon和Bogdanova，2016；Harvey等人，2015；Kamo等人，2015)。为了研究CXCL9在此过程中的作用，使用Yamanaka因子(Takahashi和Yamanaka，2006)将从5个供体获得的人成纤维细胞诱导为多能干细胞(hiPSC)表型，然后细胞被分化为内皮细胞(hiPSC-EC)。为了建模衰老的影响，hiPSC-EC经过了多次传代(如图7A所示)，在如前所述(Hu等人，2016)的明确条件下，并测量了CXCL9和SIRT3的mRNA表达水平。Sirtuin-3是一种重要的脱乙酰酶，具有保护心脏特性，参与衰老过程中的线粒体体内稳态、干细胞和组织维持，并与饮食和运动在维持心血管健康和长寿方面的有益作用有关(Bonkowski和Sinclair，2016；Lu等人，2016)。
在这些分析中，通过测量hiPSC-EC衰老过程中的管形成来研究血管生成的重组阶段。观察到CXCL9转录水平有时间依赖性的增加(图7A)，其与SIRT3表达降低(图7B)和由内皮细胞形成的血管网络数量减少(图7C)相伴。用增加剂量的CXCL9(10至800ng/mL)处理年轻的hiPSC-EC(在第7天)也下调SIRT3表达(图7D)，表明年轻的内皮细胞是其它来源的CXCL9的靶标，并且暴露于CXCL9后可下调SIRT3表达。另外，确认了在年轻的hiPSC-EC中而不是在hiPSC衍生的心肌细胞中表达CXCL9受体CXCR3(图7E)。这些结果表明，CXCL9既可以以旁分泌的方式起作用，其中来自免疫源的这种趋化因子的水平升高影响内皮细胞功能；也可以以自分泌的方式作用于内皮细胞，从而产生正反馈环，其中增加这些细胞中的CXCL9剂量及其受体表达会导致衰老中内皮功能的累积恶化。
健康衰老免疫类型的受试者具有较低的死亡率，并且相对于实足年龄的SCI差异与不健康衰老免疫类型的受试者相比年轻13岁
1KIP队列中的受试者分组(N＝112)是2007年开始进行的衰老纵向研究的一部分(Furman等人，2017；Shen-Orr等人，2016)，每年受试者的数量不同。在为期9年的随访中，该分组中共有18个个体死亡。为了研究年龄相关的免疫类型HAiT和UAiT与死亡率之间的关系，选择了75岁及以上的受试者(具有已知的免疫应答的总体变化和升高的死亡风险)。对于HAiT(免疫类性14)，总共选择了23名受试者，其中2名(8.6％)在研究期间死亡。对于UAiT(免疫类型13和16合并)，共有50名≥75岁范畴的受试者，其中13名(26％)在研究过程中死亡(P＝0.089，根据Pearson卡方分布检验)。总体而言，大多数死亡(13/18，72％)发生在UAiT组的受试者，仅2例(11％)来自HAiT组(图8A)。2例(11％)死亡是来自免疫类型15的受试者，并且无法将另外1例死亡归为任何免疫类型，因为没有针对该受试者可用的免疫表型数据(图8A)。
为了研究SCI与年龄相关免疫类型之间的关系，使用Student’s t检验直接比较了两组UAiT和HAiT之间的SCI(通过GAE方法预测)，没有发现显着差异。但是，当从SCI减去实足年龄(δSCI-AGE)时，与UAiT组相比，HAiT组表现出13年的差异(根据Student’s t检验，P<10-5)(图8B)。这些结果证实，HAiT和UAiT状态可以至少部分地预测能走动的个体队列的死亡率，并且与UAiT组中发现的差异相比，HAiT个体的慢性炎症水平显著低于其实足年龄，提示心血管疾病的炎症病因转变为更高的死亡率。
讨论
在调整年龄、高胆固醇、性别和BMI后，使用GAE导出的全身性慢性炎性衰老与合并症/共病现象显著相关。这表明，这种针对人体健康与疾病的免疫“指标”可以用作辅助实验室测试，以告知医生关于患者的炎症状态。不足为奇的事实是，在由40名接受广泛的心血管功能监测的年长受试者组成的小组中，SCI还如通过动脉僵硬和心脏肥大所测得的预测了心血管衰老-已知是与年龄有关的合并症的晚期临床阶段，例如高血压、动脉僵硬，并且更通常的是代谢综合症。然而，一个惊人的发现是，在97名没有疾病迹象的非常健康的年长个体的较大队列中，SCI的主要贡献者CXCL9与亚临床水平的动脉僵硬和心脏肥大呈正相关。这些结果强烈表明，SCI也可以用作对于可能是亚临床心血管机能失常的早期分子标志物。
CXCL9，也称为由γ干扰素诱导的单核因子(CXCL9)，是由IFN-γ诱导的T-细胞趋化因子，并且主要由嗜中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生。尽管先前的数据显示CXCL9和其它CXCR3配体在高血压和左心室机能障碍的患者中显著升高(Altara等人，2015)，但这是首次在健康个体中通过CXCL9介导的炎症预测心血管功能障碍的亚临床水平。根据发现，衰老可导致至少两种来源的CXCL9介导的炎症；一种是年龄依赖性的，可在衰老的内皮中观察到，而另一种是非年龄依赖性的，可在97名受试者的健康队列中发现。由于内皮细胞而非心肌细胞表达CXCL9受体CXCR3，因此可以假设这种趋化因子以旁分泌方式(当由免疫细胞产生时)和自分泌方式(当由内皮细胞产生时)作用以下调SIRT3，SIRT3是一种重要的应激反应性脱乙酰基酶，具有保护心脏特性，参与衰老过程中的线粒体体内稳态、干细胞和组织维持(Bonkowski和Sinclair，2016；Lu等人，2016)。在7种SIRT蛋白中，SIRT3是唯一其表达增加与人类寿命相关的成员(Bellizzi等人，2005；Rose等人，2003)，但是该蛋白在心血管衰老中的作用尚不清楚，直到最近对缺乏SIRT3基因的小鼠进行观察，这些小鼠在年轻的年龄(8周龄)时会发展自发性心脏肥大和纤维化(Guo等人，2017)。已知心脏中SIRT3的这种作用潜在的机制取决于线粒体代谢。例如，先前的研究表明，SIRT3 KO小鼠改变了心脏中的线粒体脂肪酸氧化(FAO)(Alrob等人，2014；Hirschey等人，2010)，并降低了氧化磷酸化复合物的活性和ATP产生(Ahn等人，2008)。SIRT3还可以脱乙酰基酶长链酰基辅酶A脱氢酶(LCAD)，这是参与FAO的关键酶(Chen等人，2015)。有人提出SIRT3在联系炎症、细胞代谢、内皮细胞功能和心血管重构方面起着至关重要的作用，这与先前的研究表明组织修复过程中炎症和细胞代谢之间存在复杂的相互作用是一致的(Eming等人，2017)。一般来说，现在普遍认为，随着年龄的增长，新陈代谢会随之发生实质性变化，这些变化也可能与疾病表型有关(Wiley和Campisi，2016)。使用基因表达数据，还显示了从851个选定的代谢基因中产生的代谢基因模块的表达(Possemato等人，2011)在40岁后急剧下降，表明代谢可塑性下降，因此应对无菌性炎症触发的能力削弱–生育年龄之后。因此，从进化的角度来看，慢性炎症可以看作是不可避免的身体能量折衷，并且是衰老导致的代谢可塑性收缩的结果。
数据使内皮在心血管衰老中起主要作用，这与Versari等人(2009)的研究一致，他指出左心室肥大与内皮功能障碍有关，特别是如果存在同心的几何形状(Versari等人，2009年)，这就是该队列的情况(其质量与体积比通常大于1)。此外，现在普遍认为内皮细胞、心肌细胞、免疫细胞和成纤维细胞通过细胞因子和趋化因子以微调的高度协调方式相互作用，以维持组织体内稳态和适当的心血管功能(Epelman等人，2015)。显示内皮细胞可能是心脏局部炎症的一个来源，但也可能心肌细胞发挥重要作用，如在小鼠急性心肌梗死后的实验中通过炎症小体NLRP3的激活(其诱导IL-1b成熟)所示(Mezzaroma等人，2011)。最后，在非缺血性HF患者或由横向主动脉缩窄诱发的HF的小鼠中，提示了适应性免疫系统也参与肥大性反应的可能性，其中T细胞对活化的血管内皮显示出增强的粘附，并且T细胞缺陷型小鼠(TCRα(-/-))与野生型小鼠相比保留了左心室(LV)的收缩和舒张功能，减少了LV纤维化、肥大和炎症，并改善了存活率(Nevers等人，2015)。
本研究显著向先前的工作增添将炎症、细胞代谢和心血管功能联系起来，并有助于理解人类免疫系统在炎症中的变化性以及衰老和心血管疾病的发病机理。
前面仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种设置，尽管这里没有明确描述或示出，体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文记载的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步发展本领域所做出的构思，并且应解释为不限于这种具体记载的示例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能上的等同物。另外，意图是这样的等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，而与结构无关。因此，本发明的范围不旨在限于在此示出和描述的示例性实施例。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。
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Claims (13)

1.一种用于评估受试者的全身性慢性炎性衰老(SCI)的方法，包括：
(a)测量来自受试者的样品中选自由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组中的两种或更多种蛋白质的量；和
(b)根据两种或更多种蛋白质的加权量来计算受试者的SCI得分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中样品是血清。
3.根据权利要求1所述的方法，包括使用引导自动编码器算法来计算SCI得分。
4.根据权利要求1所述的方法，包括在多重测定中测量两种或更多种蛋白质的量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中增加的CXCL9和EOTAXIN与SCI正相关。
6.根据权利要求1所述的方法，其中降低的TRAIL、IFNG和GROA与SCI负相关。
7.根据权利要求1所述的方法，包括针对实足年龄调整SCI得分。
8.根据权利要求7所述的方法，包括进一步针对由血液胆固醇、性别和BMI组成的组中的一个或多个成员调整SCI得分。
9.一种识别需要治疗以减少全身性慢性炎性衰老(SCI)的受试者的方法，包括：
(a)根据来自受试者的样品中选自由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组中的两种或更多种蛋白质的加权量来计算SCI得分；和
(b)如果SCI得分大于受试者的实足年龄，则治疗受试者以降低SCI。
10.一种用于测量受试者的全身性慢性炎性衰老(SCI)的试剂盒，包括：两种或更多种捕获剂，其与选自由CXCL9、TRAIL、IFNG、EOTAXIN和GROA组成的组的不同蛋白质特异性结合；和，以供使用的说明书。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中两种或更多种捕获剂是单克隆抗体。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，包括与每个不同的蛋白质结合的一抗和二抗。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中一抗各自连接至有色珠粒，而二抗各自被标记。
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