JP2021509583A - シーケンシングベースのアッセイの妥当性を確保するための品質管理鋳型 - Google Patents

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Abstract

方法及び／又はシステムの実施形態は、品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セットを生成すること；ＱＣＴ分子セットの変動領域に基づくなど、ＱＣＴ分子セットに基づきＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定すること；及びＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、コンタミネーションパラメータ及び／又は分子カウント数パラメータなど、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケンシング関連パラメータを決定することを含み得る。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，２３６号明細書の利益を主張するものであり、この参照により全体として本明細書に援用される。
本開示は、概して、遺伝子シーケンシングの技術分野に関する。
ハイスループットシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ））は、全ゲノムシーケンシング及びエクソームシーケンシングの両方とも、診断アッセイに、並びに無侵襲的出生前遺伝学的検査（ＮＩＰＴ）、リキッドバイオプシー、及び多型を検出する同様のアッセイなど、より特化した適用に用いられることが多くなっている。ハイスループットシーケンシング（例えば、ＮＧＳ）では、複数の試料（例えば、最大３８４試料等）が同じシーケンシングランで処理され得るため、クロスコンタミネーションが臨床適用上の重大な懸念である。特に、突然変異又は多型がまれで、そのアレル頻度が全体の僅か数パーセントを占めるに過ぎないようなアッセイでは、他の試料からのクロスコンタミネーションによって偽陽性が生じ得る。これは特にＮＩＰＴ及びリキッドバイオプシーについて言えることであり、これらにおいては陽性と陰性とのアウトカム差が数パーセント未満の定量差である。
ハイスループットシーケンシングの標準的なライブラリ調製実践では、当初の入力ＤＮＡ試料の増幅が必要であり得る。検査室における突然変異アレルの増幅はいずれも、ＰＣＲキャリーオーバーコンタミネーションとして一般に知られる後続試料及び実験への混入が起こり得るため、こうした増幅ステップによりクロスコンタミネーション効果は悪化し得る。この問題を防ぐため、ｑＰＣＲなどの一部の標準的診断アッセイはｄＵＴＰ／ＵＮＧキャリーオーバー防止システムを利用し、ここではＰＣＲにおいてｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰが用いられ、アッセイ後、ウラシル含有アンプリコンが酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる処理によって分解される。しかしながら、ハイスループットシーケンシング（例えば、ＮＧＳ）は感度が一層高く、且つハイスループットシーケンシングベースのアッセイが微小な定量的変化を測定することを考えると尚更喫緊に必要であるにも関わらず、ハイスループットシーケンシングベースのアッセイ（例えば、ＮＧＳベースのアッセイ等）に対しては、類似の解決法がない。
ハイスループットシーケンシングにおいてクロスコンタミネーションを完全に取り除くことは、関連するケミストリーに起因して困難であるが、それを追跡可能であれば、同様に有用であり得る。複数の例において、各試料に異なる識別可能な配列が加えられてもよく、他のウェルへのその混入を追跡することができる。しかしながら、ユーザー毎、実験毎、及び試料毎に配列ライブラリが異なるような例は厄介となることもあり、マルチプレックス化したハイスループットシーケンシングベースのアッセイ（例えば、ＮＧＳベースのアッセイ等）のクロスコンタミネーションの追跡に用いられる場合、大規模な複数の別個のライブラリ（例えば、３８４通りの別個のライブラリ；同じシーケンシングランで処理される試料の数に対応する数の別個のライブラリ；等）を管理することが必要となり得る。その上、このような例であれば、異なる実験に同じライブラリが使用されるであろうため、前の実験からのＰＣＲキャリーオーバーは追跡できないであろう。更に、大規模な複数の別個のライブラリ（例えば、３８４通りの別個のライブラリ等）の管理が困難であることに起因して、識別子配列それ自体がクロスコンタミネーションを被り得る。このように、これらの限界を打破する一方で、クロスコンタミネーションの追跡のためなどの、方法及び／又はシステムの新規の有用な実施形態が必要とされている。
図１Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図１Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図１Ｃは、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図１Ｄは、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図２は、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図３は、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。 図４Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｃは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｄは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。 図５Ａは、分子カウントへのＱＣＴ分子の使用についてのバリデーション実験からの結果の具体例を含む。図５Ｂは、分子カウントへのＱＣＴ分子の使用についてのバリデーション実験からの結果の具体例を含む。 図６は、技師マネジメント及び／又は検査室マネジメントに関連する品質面に関連する結果の具体例を含む。 図７Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図７Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図７Ｃは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。 図８Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細には生物学的標的の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図８Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細には生物学的標的の定量化に関する結果のグラフ図を含む。 図９は、ＱＣＴ分子を用いてアッセイ可能なゲノム当量を測定する具体例を含む。 図１０は、コンタミネーションパラメータを決定する具体例を含む。 図１１は、ＱＣＴ分子を複数の試料で用いて試料処理エラーを決定する具体例を含む。 図１２は、ＱＣＴ分子を異なる段階で使用する具体例を含む。 図１３Ａは、インデックスホッピングに関連する特徴付けの具体例を含む。図１３Ｂは、インデックスホッピングに関連する特徴付けの具体例を含む。 図１４は、ユニークデュアルインデックスプライマーの使用に関連する真のコンタミネーションレベルの測定を促進する具体例を含む。 図１５Ａは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｂは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｃは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｄは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。 図１６Ａは、染色体異常の診断の促進に関連する具体例を含む。図１６Ｂは、染色体異常の診断の促進に関連する具体例を含む。
本実施形態の以下の説明は、それらの実施形態に限定するのでなく、むしろ当業者による作製及び使用を可能にすることを意図している。
１．概要。
図１Ａ〜図１Ｄ及び図２〜図３に示されるとおり、方法１００の実施形態（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連する特徴付けのための；等）は、品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セット（例えば、各ＱＣＴ分子が標的関連領域、変動領域等を含む）を生成することＳ１１０；ＱＣＴ分子セットに基づき（例えば、ＱＣＴ分子セットの変動領域に基づき；等）ＱＣＴシーケンスリードクラスターセット（例えば、ＱＣＴ分子セットに対応する；等）を（例えば、計算的に；等）決定することＳ１２０；及び／又はＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケンシング関連パラメータ（例えば、コンタミネーションパラメータ、分子カウント数パラメータ等）を決定することＳ１３０を含み得る。
加えて又は代わりに、方法１００の実施形態は、１つ以上の配列ライブラリを調製することＳ１１２；１つ以上の配列ライブラリをシーケンシングすることＳ１１４；１つ以上の病態（例えば、遺伝的障害等）の１つ以上の診断を促進すること（例えば、補助すること、決定すること、提供すること等）Ｓ１４０（例えば、１つ以上のシーケンシング関連パラメータに基づく；等）；シーケンシング関連パラメータ、診断、及び／又は他の好適な構成要素に基づくなどして、１つ以上の病態に対する治療を促進すること（例えば、補助すること、決定すること、提供すること、投与すること等）Ｓ１５０；及び／又は任意の他の好適なプロセスを含み得る。
具体例において、方法１００（例えば、妊婦に関連する母体試料からの遺伝的障害の出生前診断を促進するための；等）は、遺伝的障害に関連するＱＣＴ分子セットを母体試料に加えることであって、ＱＣＴ分子セットが、内因性標的分子（例えば、遺伝的障害に関連する；等）の標的配列領域との配列類似性がある標的関連領域と、内因性標的分子の配列領域との配列非類似性がある変動領域（例えば、可変「Ｎ」塩基セットを含む埋め込み分子識別子（ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＥＭＩ）領域を含む、ここで各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択される等）とを含むこと；ＱＣＴ分子セットと標的配列領域を含む核酸分子（例えば、核酸；核酸断片；等）とを共増幅することに基づき共増幅混合物を生成すること；共増幅混合物をシーケンシングすること；シーケンシングからのＱＣＴ分子シーケンスリードから検出される別個の変動領域の数に基づき、ＱＣＴ分子セットのユニークな数を計算的に決定することであって、ＱＣＴ分子シーケンスリードがＱＣＴ分子セットに対応すること；ＱＣＴ分子シーケンスリードの数をユニークなＱＣＴ分子数で除すことに基づき平均ＱＣＴシーケンシング深度を計算すること；内因性標的分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき内因性標的分子の絶対カウント数を決定すること；内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定すること；及び内因性標的配列の絶対カウント数と内因性リファレンス配列の絶対カウント数との間の比較に基づき遺伝的障害の出生前診断を促進することを含み得る。
具体例において、方法１００（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連した、コンタミネーションを同定するなど、特徴付けのための；等）は、ＱＣＴ分子セットを生成することであって、各ＱＣＴ分子が、変動領域（例えば、１つ以上のＥＭＩ領域を含む等）及び／又は標的関連領域（例えば、生物学的標的の標的配列領域との配列類似性がある等）を含むこと；ＱＣＴ分子セットの変動領域に基づきＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することであって、例えばここでＱＣＴシーケンスリードクラスターセットが、ＱＣＴ分子セットと生物学的標的を含む試料（例えば、生物学的標的に対応する内因性標的分子を含む試料；等）とをベースに生成されるＱＣＴ混合物に対応するシーケンシングから導き出されたＱＣＴ分子シーケンスリードを含み、例えばここでシーケンシングライブラリ調製が、ＱＣＴ分子セットと生物学的標的を含む核酸分子との（例えば、標的関連領域と生物学的標的の標的配列領域との配列類似性に基づく等）共増幅を含むこと；及びＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケンシング関連パラメータを決定すること（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びハイスループットシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するコンタミネーションを記述するコンタミネーションパラメータを決定すること等）を含み得る。
具体例において、図２に示されるとおり、方法１００（例えば、ＱＣＴ分子に基づくシーケンシングベースのアッセイの妥当性を確保するための；等）は、ＱＣＴ分子のＱＣＴライブラリ又はＱＣＴライブラリ混合物を生成すること（例えば、ＱＣＴ ＤＮＡは、図２に黒色の矢印として図示されるＰＣＲプライマーを使用した共増幅を可能にするため目的の遺伝子との高い類似性がある標的関連領域を含む；ＱＣＴ ＤＮＡは、目的の遺伝子と比較して配列差異のある変動領域を含み、例えばここで変動領域は、ランダムに「Ａ」、「Ｃ」、「Ｔ」、又は「Ｇ」塩基をとることのできる「Ｎ」塩基を含むＥＭＩ領域を含んでもよく、例えばここで最大４＾４個のユニークなＥＭＩ配列が「ＮＮＮＮ」で生成されることができ、例えばここで２つのＱＣＴ分子が同じＥＭＩを有する確率は、ハッシュ衝突確率の計算に関する誕生日問題の解法を用いて見出すことができ、例えばここでＱＣＴとＨＢＢとの配列差異のサブセクションが、図２に示され得る；ＱＣＴ ＤＮＡは、シーケンシングリード中のＱＣＴライブラリと目的の遺伝子配列とを区別するためのＱＣＴ識別子（ＱＣＴ ＩＤ）領域を含む；等）；ＱＣＴライブラリをヒトＤＮＡにスパイクインすることによるなど、ＱＣＴ分子及び生物学的標的（例えば、ＨＢＢ、図２に示されるとおり；等）を含む１つ以上の試料に基づきシーケンシングライブラリを調製すること；計算論的アプローチを適用してＱＣＴ分子シーケンスリードをクラスター形成し（例えば、ＥＭＩ配列類似性に基づく；ここでＥＭＩクラスターの数は、試料にスパイクインされたＱＣＴ分子の絶対数に対応する；等）及びクラスターを異なる試料識別子（例えば、異なる試料に対応する；シーケンシングに使用された異なる試料コンパートメントに対応する；等）に割り当てること；及びかかるデータを用いて、クロスコンタミネーション、インデックスミスアサインメント、ユーザーエラー（例えば、アッセイの実行における）、アッセイパラメータとの不適合（例えば、入力ＤＮＡ量、試料中の利用可能なゲノム当量が少な過ぎる；等）などの品質管理メトリックを評価すること、及び／又はアッセイが利用可能な入力された生物学的標的の量を定量化することを含み得る。
方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、生物学的標的の存在量を正確に定量化し、コンタミネーション（例えば、異なる試料間、異なる実験間でのクロスコンタミネーション；ユニークデュアルインデックスプライマーの使用に関連する真のコンタミネーションレベル；等）を正確に追跡し及び／又はその程度を定量化し、シーケンシングベースのアッセイの実行におけるユーザーエラーを同定し、シーケンシングインデックスミスアサインメントをモニタし、アッセイパラメータとの不適合を決定し、コンタミネーション及び／又はインデックスホッピングを起こすプライマーを同定し及び／又はその除去を促進し、及び／又は診断及び／又は治療の改善のためなど、シーケンシングライブラリ調製及び／又はシーケンシングに関連する任意の好適な側面を改善する働きをし得る。
ある例において、試料セットに単一の試薬（例えば、ＱＣＴ分子セットを含む等）が加えられてもよく、全ての試料に単一の試薬を加えることによりクロスコンタミネーション並びに他のユーザーエラーを追跡することができ、本明細書に開示される。ある例において、ＱＣＴ分子を加えると、ハッシュ衝突に関する誕生日問題の解法に基づくカスタムの数学的及び計算論的分析パイプラインを伴うとき、異なるユーザー間、異なる実験間、及び異なる試料間でのクロスコンタミネーションを同時に追跡することができる。複数の例において、ユーザーフレンドリー性及び利便性の向上のためなど、全ての試料（例えば、ハイスループットシーケンシングに関連する；等）に単一のＱＣＴライブラリが加えられてもよい。具体例において、別個のＱＣＴライブラリ（例えば、異なるＱＣＴ識別子領域、例えばＱＣＴ ＩＤなどに対応する等）が試料調製の異なる段階で加えられてもよく、任意のユーザーエラー又は入力試料の損失を追跡することができる。複数の例において、自動化されたフィンガープリント・オン・ディスペンス（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ−ｏｎ−ｄｉｓｐｅｎｓｅ）手法を適用することができ、ここでは各試料をＱＣＴ分子によって（例えば、ＱＣＴ分子の変動領域；ＱＣＴ分子のＱＣＴ識別子領域に基づき；等）識別することができる。複数の例において、ＰＣＲキャリーオーバーに起因するコンタミネーションが測定されてもよく、かかるコンタミネーションは臨床環境及び／又は他のコンテクストにおける懸念であり得る。具体例において、ＱＣＴ分子を使用して各ＰＣＲチューブに分子フィンガープリントを割り当てることができ、所与の検査場所又は検査室で実施されるあらゆるＰＣＲチューブに関連する全ての変動領域（例えば、ＥＭＩ領域のＥＭＩ配列等）のデータベースを管理することにより、ＰＣＲキャリーオーバーを検出及び定量化し得る。後続のアッセイにおけるキャリーオーバーＰＣＲは、次には歴史的データベースで変動領域フィンガープリント（例えば、ＥＭＩフィンガープリント類似性等）を計算的に検索することにより同定し得る。
実施形態は、加えて又は代わりに、ハイスループットシーケンシング（例えば、ＮＧＳ等）に関する重要な懸念、即ち「インデックススイッチング」又はインデックスミスアサインメントに対する品質保証に用いることができる。複数の例において、いかなるクロスコンタミネーションもない場合であっても、同じフローセルでのマルチプレックス化時に１つの試料からのシーケンシングリード又はシグナル（例えば、最大５〜１０％；等）が別の試料に誤って割り当てられ得る。複数の例において、簡便なフィンガープリント・オン・ディスペンス手法を実施して、あらゆる試料におけるミスアサインメントの程度を正確に定量化することができる。具体例において、図４Ａ〜図４Ｄに示されるとおり、近隣のウェルにおけるクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントの累積効果を９０％を超える感度で検出することができる。具体例において、図４Ａに示されるとおり、ｉ７及びｉ５インデックスの全９６通りの組み合わせを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕｓｅｑ ＨＴライブラリを調製することができ、ここでは各ウェルがＨＢＢアンプリコンシーケンシング実験に対応し、各ウェルに４００、２００、１００、又は０個のＱＣＴ分子が加えられる；各ウェルには、クロスコンタミネーションと同定されるＱＣＴリードの比率が示され、ここでこの実験では、クロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントは１％未満１３％以下の範囲であった；Ｄ７１０〜Ｄ７１２列はＱＣＴ分子が０個であるため、これらのウェルにおける比率は、方法１００の実施形態の変形形態がクロスコンタミネーションを検出し得る感度を示す；及びここで図４Ｂは、×で示した、Ｄ７０２／Ｄ５０４に見られる混入リードの数及び混入源（左）；並びに〇で示した、Ｄ７０２／Ｄ５０４に由来する混入リードの数及び混入先（右）を図示し；及びここで図４Ｃは、図４Ｂと類似の、但しウェルＤ７０７／Ｄ５０４についての分析を図示し；及びここで図４Ｄは、ウェルＤ７１０／Ｄ５０４及びＤ７１１／Ｄ５０４の混入源を図示し、ここでこれらのウェルにＱＣＴ分子を加えていないことと一致して、これらのウェルに由来する混入リードは認められなかった。
実施形態は、加えて又は代わりに、リード深度が十分な場合（例えば、別個のＱＣＴ分子１個当たり２０リード深度より高い；等）など、生物学的標的の正確な分子カウント（例えば、ＱＣＴ分子セットの変動領域セットの使用に基づく等）を可能にすることができ、これは複雑な配列の付加を用いる手法において正確な標的定量の取得に役立ち得る。実施形態は、リード深度が十分に高い場合に、アッセイされる利用可能な生物学的標的を定量化することができる。ある例において、アンプリコンシーケンシングによる無侵襲的出生前遺伝学的検査に用いられる突然変異の検出に関して、各試料に４００個未満のＱＣＴ分子を加えると、複雑な配列についてかかる高いリード深度が得られ、例えばここでＭｉＳｅｑランで９６個のかかる試料がマルチプレックス化される（例えば、図７Ｃに示されるとおり）。しかしながら、分子カウント及び／又は他の好適な機能の促進のため、１つ以上の試料に任意の好適な数のＱＣＴ分子を加えることができる。具体例において、図５Ａ〜図５Ｂに示されるとおり、シーケンスリード数と分子数（例えば、シーケンスリード及びＱＣＴ分子に関連する処理に基づき決定される；等）とは相関することができ、及びここで分子数とリード数との比は２〜３倍異なり得ることから、所与の試料中の分子数の決定にＱＣＴ分子を使用することに関連する改善（例えば、リード数それ自体を使用することと比べた信頼度の改善；等）が指摘される。
複数の例において（例えば、１つ以上の生物学的標的の分子カウント絶対数を定量化する例等）、方法１００及び／又はシステム２００を用いると、ａ）アッセイの診断アウトカムを決定するためのアルゴリズムに用いるパラメータを決定し、ｂ）実験又はアッセイの種々の段階における入力ＤＮＡの損失を追跡し、ｃ）標的分子数が少な過ぎる場合にノーコール結果を返し（例えば、アッセイが信頼できない場合を決定する等）、ｄ）特定の遺伝子座における又は遺伝子座間でのコピー数変異を検出するアッセイを設計し、及び／又はｅ）診断アッセイ結果に基づく治療上及び臨床上の意思決定を支援することができる。
実施形態は、加えて又は代わりに、技師マネジメント及び／又は検査室マネジメント（例えば、臨床検査室マネジメント；等）に関連する幾つかの品質面を評価及び／又は改善することができる。図６に示されるとおり、具体例において、方法１００及び／又はシステム２００を用いて異なる技師又は検査室による問題のある試料処理を同定することができ、ここで試料Ａ０１〜Ａ０６と、それに対する試料Ｂ３１〜Ｂ３５のランは、２つの異なる検査室において異なるＰＣＲ前／ＰＣＲ後分離実施技法で行われた；処理前に、同じキットからの同じ容積のＱＣＴ分子（概略で約２００分子に対応する）を各試料に加えた；「ｎｕｍ＿ｓｅｑｓ」は、各試料について同定された別個のＥＭＩクラスター数を示す；「ｃｏｎｔａｍ＿ｆｒａｃ」は、各試料中に同定された混入リードの総比率を示す；「ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ＿ｆｒａｃ」は、２つの有効なＥＭＩクラスターがどの程度２つの異なる試料に見られるかを同定する；「ｃｏｎｔａｍ＿ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ＿ｆｒａｃ」は前述の２つのメトリックを結合する；「ｉｄｅｎｔ＿ｆｒａｃ」は、有効なＥＭＩにマッピングされるリード数を当該の特定の試料についての総リード数で除したものである；「ｒｅａｄｓ＿ｐｅｒ＿ｑｃｔｍｏｌ」は、ＥＭＩの平均リード深度を示す；これらの導き出されたメトリックにフィルタ閾値を使用して、品質管理（ＱＣ）を通過する又は通過しない試料を同定した；ここで検査室Ａについては６例中１例の試料のみがＱＣメトリックを通過した一方、検査室Ｂについては５例中５例の試料がＱＣメトリックを通過した；及びここでこれらの結果を用いて、試料処理及びＰＣＲ前／ＰＣＲ後分離をどのように行い得るかを変更することができる（例えば、ここで検査室Ａでは、試料処理の改善を伴う次のランにおいて、試料は同じＱＣメトリックを通過した；等）。図７Ａ〜図７Ｃに示されるとおり、具体例において、同じプールから分注される複数のＱＣＴ種を含めることにより、ＱＣＴ分子カウント絶対数の相関を用いてピペットのランダムエラーを測定することができ（例えば、図７Ｃに示されるとおり）、及び／又は系統的ピペット及び／又は定量エラーが、加えて又は代わりにトレース可能であり得る（例えば、図７Ａに示されるとおり、中央のパネルと左右のパネルとの比較に基づくなど）。具体例において、図７Ａ〜図７Ｃに示されるとおり、スパイクインされたＱＣＴ分子の絶対的定量を決定することができる。具体例において、図７Ａに示されるとおり、ＱＣＴ１、ＱＣＴ２、及びＱＣＴ３ライブラリ（例えば、異なるＱＣＴ分子セットに対応する；等）を調製し、プールし、及びＱＣＴライブラリ当たり１００、２００、又は４００分子でＰＣＲ反応物にスパイクインすることができる；多くても２塩基の変化でＥＭＩシーケンスリードを集約することにより、各ＱＣＴライブラリのＥＭＩをクラスター形成することができる；エラーバーは２４レプリケートの平均値±標準偏差を表し得る；及びグラフ線は線形回帰フィットを表し、網掛けが平均値の９５％信頼区間に対応し得る。具体例において、図７Ｂに示されるとおり、リード深度に対するＱＣＴカウントのロバスト性を決定するため、全リードの１／２をランダムに選択することによりシーケンシングリードをダウンサンプリングしてもよい；ダウンサンプリングしたシーケンシングリードから回収されたＥＭＩクラスターの数を完全なデータセットに対してプロットすることができる；点の色はＥＭＩクラスター当たりのダウンサンプリング後のリード深度を表してもよく、ここで黒色の線は、傾き＝１、切片＝０である；ＱＣＴ分析は、ＱＣＴ分子当たりのリード深度が２０を超えるときロバストであり、これは分子カウントの信頼性を支援し得る；及びＱＣＴクラスターの数が４００のとき、ダウンサンプリング後のリード深度は１分子当たり２０未満である。具体例において、図７Ｃに示されるとおり、ＱＣＴ分子カウント数はＱＣＴライブラリ間で無相関であり得る（例えば、予想どおり等）；ここで１００ＱＣＴ分子入力レベルでの図７Ａからの各ＰＣＲレプリケートについてＱＣＴ３クラスター数対ＱＣＴ１クラスター数の散布図を示すことができる。
実施形態は、加えて又は代わりに、種々のシーケンシングライブラリ調製段階（例えば、試料調製段階）及び／又はシーケンシング段階でＱＣＴライブラリを展開して試料損失をトレースすることができる。具体例において、試料採取時点で第１のＱＣＴ分子セット（例えば、ＱＣＴ１分子；第１の共有ＱＣＴ識別子領域を含む第１のＱＣＴ分子；等）が分注され、試料精製後に等量の第２のＱＣＴ分子セット（例えば、ＱＣＴ２分子；第２の共有ＱＣＴ識別子領域を含む第２のＱＣＴ分子；等）が分注される場合、第１のＱＣＴ分子セット及び第２のＱＣＴ分子セットについての分子カウント数の比較により（例えば、ＱＣＴ１対ＱＣＴ２分子カウント数等）、精製収率が評価されてもよい。
実施形態は、加えて又は代わりに、生物学的材料のうちアッセイが利用可能な分量を、ＱＣＴ分子を使用することに基づく生物学的標的の定量化によるなどして決定することができ、これは利用可能な総ゲノム材料の測定及び予想される生物学的標的濃度の計算を改善し得るものであり、というのも、全ての標的をアッセイに利用できるわけではないからである。具体例において、これは、胎児の遺伝子状態を決定するための無侵襲的出生前遺伝学的検査（ＮＩＰＴ）の適用においてアッセイされる循環遊離ＤＮＡ及び循環腫瘍ＤＮＡがアッセイされるリキッドバイオプシー適用の場合のように、ＤＮＡを短いサイズ分布に剪断することに起因し得る。具体例において、これらの適用では、目的の標的次第では利用可能なＤＮＡは２５％未満であり、ここで、図８Ａ〜図８Ｂに示されるとおり、入力ＤＮＡゲノム当量の決定はＱＣＴ分子を使用して決定することができ、例えばここでヒトゲノムＤＮＡは、目的の遺伝子のそれぞれ外側及び内側で切断するＡｌｕ又はＨｐｙのいずれかによって消化される制限酵素であってもよい；次にＱＣＴ分子を９ｎｇ〜３６ｎｇの消化済みＤＮＡ（２，５００〜１０，０００ゲノム当量に相当する）にスパイクインし、ＰＣＲ増幅し、ＭｉＳｅｑでシーケンシングすることができる；各ＰＣＲ反応物中のヒトＤＮＡのゲノム当量（Ｇ．Ｅ．）は、方法１００の実施形態の該当部分におけるＱＣＴ分子に関連する分析によって測定することができる；ＰＣＲ反応はデュプリケートで実施することができ、ここで図８Ａは線形フィット線を示し、網掛けは平均値の９５％ＣＩであり、及びここで入力ＤＮＡの測定値はレプリケート間で且つ希釈系列を通じて一貫しているが、しかし系統的にＱｕｂｉｔ測定値より一定の倍数だけ高い；及びここで、図８Ｂに示されるとおり、ヒトゲノムＤＮＡは、ピークが１００〜１５０ｂｐのサイズ分布に剪断することができる；次にＱＣＴ分子を２．３ｎｇ〜３６ｎｇの剪断ＤＮＡにスパイクインすることができ、及びアンプリコンサイズが約１５０ｂｐで、剪断ＤＮＡのゲノム当量を測定することができ、及びここで図８Ｂは、線の傾きがランダムな剪断に起因して増幅され得る分子の比率を指示していることを示す。具体例において、図９に示されるとおり、ＱＣＴ分子を使用するとアッセイ可能なゲノム当量を測定することができ、これはアッセイ毎に異なってもよく、同じアッセイであってもフットプリントで異なり得る；ここでは剪断ＤＮＡから同じ突然変異を取り囲む領域を増幅して１５０ｂｐ ＰＣＲ産物対７２ｂｐ ＰＣＲ産物（左対右）が形成され、いずれの場合にもＱＣＴ分子を使用して増幅された分子の数を測定した；ここでは５０００入力ゲノム当量に相当する１８ナノグラム（ｎｇ）のゲノムＤＮＡを約１７０ｂｐの平均長さ（例えば、循環遊離ＤＮＡの平均長さ）に剪断し、いずれの場合にも含めた（１５０ｂｐについてｎ＝８及び７２ｂｐについてｎ＝４）；及び理論的モデルと一致して、増幅することのできる分子の数は入力ＤＮＡより大幅に少なく、同じ入力ＤＮＡ質量について異なるフットプリント間で２倍もの差があり得る；及びここで図９は、なぜ他の入力ＤＮＡ測定値（濃度など）は、分子情報を必要とする正確な分子診断に十分でないことがあるのかを示し得るものであり、例えばここで分子カウント数が約２分の１に減少したならば、そのポアソン雑音は約４０％増加し、これは９５％（２σ）〜９９％（３σ）の正確度の差であり得る。
方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、１つ以上の病態に関連して（例えば、１つ以上の病態に関する過程の特徴付け、診断、治療、及び／又は実施に関連して；等）用いることができ、ここで病態は、無侵襲的出生前遺伝学的検査（ＮＩＰＴ）（例えば、２１トリソミー又はダウン症候群、１８トリソミー又はエドワーズ症候群、１３トリソミー又はパトー症候群、ターナー症候群などの性染色体異数性、他の好適な異数性など、異数性を含む染色体異常；ディジョージ症候群を含めた染色体異常の存在についての遺伝子スクリーニングに関する；単一遺伝子病についての遺伝子スクリーニングに関する；等）；他の出生前検査；出生前コンテクスト以外での異数性分析及び／又は他の好適な分析；遺伝的障害（例えば、鎌状赤血球症を含めた単一遺伝子病；染色体異常；遺伝子増幅に関連する障害；遺伝子欠失；部分染色体異常；２２ｑ１１．２欠失症候群又はディジョージ症候群；シャルコー・マリー・トゥース症候群、嚢胞性線維症、ハンチントン病；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；血友病、サラセミア；等）、染色体異常に関連する他の適用（例えば、追加的な、欠損している、不規則な染色体ＤＮＡ等）、癌（例えば、任意の好適な癌遺伝子、癌バイオマーカー、及び／又は他の癌関連標的に関連する分析を通じて；リキッドバイオプシーに関連する分析を通じて）、及び／又は任意の他の好適な病態のうちの１つ以上を含んでもよく、及び／又は他の形でそれに関連してもよい。ある例において、方法１００は、無侵襲的出生前遺伝学的検査及びリキッドバイオプシーの少なくとも一方に関連する診断を促進するため、標的分子カウント数（例えば、試料中の標的分子の数に対応する；ＱＣＴ分子の使用に基づく；等）を決定することを含んでもよい。病態は、加えて又は代わりに、精神医学的及び行動的病態（例えば、心理的障害；抑欝；精神病；等）；コミュニケーション関連病態（例えば、表出性言語障害；吃音；音韻障害；自閉症障害；発声病態；聴覚病態；眼病態；等）；睡眠関連病態（例えば、不眠症；睡眠時無呼吸；等）；心血管関連病態（例えば、冠動脈疾患；高血圧；等）；代謝関連病態（例えば、糖尿病等）、リウマチ様関連病態（例えば、関節炎等）；体重関連病態（例えば、肥満症等）；疼痛関連病態；内分泌関連病態；慢性疾患；及び／又は任意の他の好適な種類の病態を含んでもよい。
方法１００及び／又はシステム２００の１つ以上の実施形態に関連するシーケンシング（例えば、Ｓ１１２に関する）は、好ましくはハイスループットシーケンシングを含み、これは、ＮＧＳ、ＮＧＳ関連技術、超並列シグネチャシーケンシング、Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ１分子シーケンシング、１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、いずれかの世代数のシーケンシング技術（例えば、第２世代シーケンシング技術、第３世代シーケンシング技術、第４世代シーケンシング技術等）、アンプリコン関連シーケンシング（例えば、ターゲットアンプリコンシーケンシング）、メタゲノム関連シーケンシング、合成によるシーケンシング、トンネル電流シーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析シーケンシング、顕微鏡法ベースの技法、及び／又はハイスループットシーケンシングに関する任意の好適な技術のいずれか１つ以上を含んでもよく、及び／又はそれに関連してもよい。加えて又は代わりに、シーケンシングは任意の好適なシーケンシング技術（例えば、サンガーシーケンシング、キャピラリーシーケンシング等）を含むことができる。
方法１００及び／又は本明細書に記載されるプロセスの実施形態の１つ以上の工程及び／又は部分は、非同期的に（例えば、逐次的に）、同時に（例えば、並行して；生体試料をマルチプレックスの自動化された方法で同時に処理すること；システム処理能力の向上のためシーケンスリードを同時に計算処理すること；等）、トリガーイベントとの時間的関係において、及び／又は任意の他の好適な順序で、任意の好適な時点及び頻度で、システム２００、本明細書に記載される構成要素、及び／又は実体の実施形態の１つ以上の工程により、及び／又はそれを用いて実施されてもよい。
加えて又は代わりに、本明細書に記載されるデータ（例えば、クラスター、シーケンシング関連パラメータ、識別子、リード深度、シーケンスリード、配列領域決定、ＱＣＴ分子設計、プライマー設計等）は、データがいつ収集され、決定され、送信され、受信され、及び／又は他に処理されたかを指示する時間的インジケータ；シーケンシングライブラリ調製段階及び／又はシーケンシング段階の順番を指示する時間的インジケータなど、データによって記述される内容に文脈を付与する時間的インジケータ；時間的インジケータの変化（例えば、経時的データ；データの変化；データパターン；データ傾向；データ外挿及び／又は他の予測；等）；及び／又は時間に関する任意の他の好適なインジケータのうちの１つ以上を含む任意の好適な時間的インジケータ（例えば、秒、分、時間、日、週、期間、時点、タイムスタンプ等）に関連し得る。
加えて又は代わりに、本明細書に記載されるパラメータ、メトリック、入力、出力、及び／又は他の好適なデータは、スコア、バイナリ値、分類、信頼水準、識別子（例えば、試料識別子、ＱＣＴ分子識別子等）、スペクトルに沿った値、及び／又は任意の他の好適な値の型のうちの任意の１つ以上を含む値の型に関連し得る。本明細書に記載される任意の好適な型のデータが、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態に関連する任意の好適な構成要素についての入力として使用され、出力として生成され、及び／又は任意の好適な方法で操作されることができる。
システム２００の実施形態は、加えて又は代わりに、分子（例えば、ＱＣＴ分子；ＱＣＴライブラリ；等）を生成し、生体試料を処理し、及び／又は他の好適なプロセスを実施するように構成された試料ハンドリングネットワーク；生体試料とＱＣＴ分子とをベースに生成される混合物からの処理された遺伝子材料をシーケンシングするように構成されたシーケンシングシステム；シーケンスリードを分析し、ＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定し、シーケンシング関連パラメータを決定し、診断を促進し、治療を促進し、及び／又は他の好適なプロセス（例えば、計算プロセス）を実施するように構成された計算システム（例えば、リモート計算システム；ローカル計算システム；等）；及び／又は任意の他の好適な構成要素を含み得る。システム２００の構成要素は、何らかの方法で（例えば、方法１００の実施形態の一部に関してなど、構成要素間で機能を何らか好適に分散して；等）物理的に及び／又は論理的に統合されてもよい。しかしながら、方法１００及びシステム２００は任意の好適な方法で構成されることができる。
２．１ ＱＣＴ分子を生成する。
方法１００の実施形態は、ＱＣＴ分子セットを生成することＳ１１０を含んでもよく、これは、下流の計算処理を促進するためなど（例えば、配列関連パラメータ決定を促進するためのＱＣＴシーケンスリードクラスター決定；等）、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシング（例えば、ハイスループットシーケンシング等）のうちの少なくとも一方の１つ以上の段階（例えば、ステップ、フェーズ、期間、時期等）で使用される（例えば、加えられる、処理される、シーケンシングされる等）ことになる分子を生成する働きをし得る。
ＱＣＴ分子は好ましくは、標的関連領域（例えば、ＱＣＴ分子１個当たり１つ以上の標的関連領域；等）を含む。図２に示されるとおり、標的関連領域は好ましくは、１つ以上の標的分子（例えば、内因性標的分子；１つ以上の生物学的標的に対応する；等）の１つ以上の標的配列領域との配列類似性（例えば、完全な配列類似性；閾値条件を満たす配列類似性；指定された数の塩基の配列類似性；等）を含むが、加えて又は代わりに、１つ以上の標的分子の任意の好適な構成要素との任意の好適な関連性を含んでもよい。標的関連領域は好ましくは、対応するＱＣＴ分子（例えば、標的関連領域を含む等）と標的配列領域を含む核酸分子（例えば、核酸、核酸断片等）との共増幅を可能にし、これは分子カウントにおける（例えば、分子カウント数パラメータの決定における；増幅バイアスを考慮することによる；等）正確度の改善を促進し得るが、加えて又は代わりに、シーケンシングライブラリ調製、シーケンシング、及び／又は方法１００の実施形態の一部に関連する任意の好適なプロセスを可能にし得る。ある例において、シーケンシングライブラリ調製（例えば、シーケンシングライブラリ調製を実施する Ｓ１１２）は、ＱＣＴ分子セットと生物学的標的を含む核酸分子との、標的関連領域と生物学的標的の標的配列領域との配列類似性に基づく共増幅を含んでもよく、及びここでシーケンシング関連パラメータを決定することは、シーケンシングに関連する生物学的標的の分子の数を記述する標的分子カウント数をＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき決定することを含み得る。
変形形態において、ＱＣＴ分子は標的関連領域を省略することができる。例えば、ＱＣＴ分子は、標的関連性なしに（例えば、生物学的標的の標的配列領域との所定の類似性を有することなしに）、及び／又は試料の構成要素（例えば、標的配列領域を含む核酸分子；等）との対応する共増幅なしに、生物学的標的を含む試料の構成要素と共に使用することができる。複数の例において、ＱＣＴ分子は、シーケンシングに適合するように前処理することができ、例えばここで前処理されたＱＣＴ分子をシーケンシングに好適な処理済みの試料に加えることにより、（例えば、ユーザーフレンドリー性の改善のため）共増幅する必要なしに同時シーケンシングすることができる。標的関連領域を省略するＱＣＴ分子は、好ましくはコンタミネーションパラメータ決定の促進に有用であるが、加えて又は代わりに、任意の好適なシーケンシング関連パラメータ決定の促進に使用することができる。具体例において、ＱＣＴ分子セットは後続のシーケンシング（例えば、ＮＧＳなどのハイスループットシーケンシング；等）に適合させることができ、ここでＱＣＴ分子セットを生成することは、ＱＣＴ分子セットの第１のＱＣＴ分子サブセット（例えば、各々が第１の共有ＱＣＴ識別子領域を含む；等）を増幅すること；及びＱＣＴ分子セットの第２のＱＣＴ分子サブセット（例えば、各々が第２の共有ＱＣＴ識別子領域を含む；等）を増幅することを含んでもよく、ここでＱＣＴ分子シーケンシングリードは、第１のＱＣＴ分子サブセットと生物学的標的を含む（例えば、生物学的標的に対応する第１の標的分子を含む；等）試料とをベースに生成されるＱＣＴ混合物、及び第２のＱＣＴ分子サブセットと生物学的標的を含む（例えば、生物学的標的に対応する第２の標的分子を含む；等）追加的な試料とをベースに生成される追加的なＱＣＴ混合物に対応するシーケンシングから導き出され、ここで試料及び追加的な試料は、それぞれ、試料コンパートメントの第１の試料コンパートメント及び第２の試料コンパートメントに対応する。しかしながら、標的関連領域及び／又は標的関連領域を省略するＱＣＴ分子は、任意の好適な方法で構成することができる。
ＱＣＴ分子は好ましくは、１つ以上の変動領域（例えば、ＱＣＴ分子１個当たり１つ以上の変動領域；隣接する変動領域；離れた変動領域；等）を含む。図２に示されるとおり、変動領域は好ましくは、標的分子の１つ以上の配列領域（例えば、標的配列領域と別個の；等）との配列非類似性（例えば、完全な配列非類似性；指定される数の塩基の非類似性；部分的配列非類似性；等）を含む。変動領域は、加えて又は代わりに、１つ以上のＥＭＩ領域を含むことができる。変形形態において、ＥＭＩ領域は可変「Ｎ」塩基セット（例えば、１つ以上の可変「Ｎ」塩基等）を含むことができ、ここで各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択される（例えば、ランダムに選択される；所定の統計的分布及び／又は確率に従い選択される；等）。変形形態において、ＥＭＩ領域は、ＱＣＴシーケンスリードクラスター決定を（例えば、ＥＭＩ領域間のペアワイズハミング距離を最大化することにより；等）促進するように設計された合成領域など、１つ以上の指定された塩基（例えば、設計及び合成された塩基；等）を含む合成領域（例えば、マイクロアレイ上の；シリコンベースの合成を用いる；等）を含むことができる。変形形態において、ＱＣＴ分子は、加えて又は代わりに、複数のＥＭＩ領域（例えば、複数のＥＭＩ領域；隣接するＥＭＩ領域；離れたＥＭＩ領域；可変「Ｎ」塩基を含むＥＭＩ領域；合成領域を含むＥＭＩ領域を含む変動領域；等）を含むことができる。例えば、ＱＣＴ分子セットの各変動領域は、可変「Ｎ」塩基セットを含む埋め込み分子識別子領域を含むことができ、ここで各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択され、ここでＱＣＴ分子セットの各ＱＣＴ分子は、追加的な可変「Ｎ」塩基セットを含む追加的なＥＭＩ領域を更に含み、ここで追加的なＥＭＩ領域はＥＭＩ領域とＱＣＴ分子の配列領域によって隔てられており、例えばここで可変「Ｎ」塩基セット及び追加的な可変「Ｎ」塩基セットは、各々が、決められた（例えば、所定の）数の「Ｎ」塩基（例えば、３より多い「Ｎ」塩基、任意の好適な数より多い「Ｎ」塩基、正確にある数の「Ｎ」塩基；等）を含むことができ、及びここでシーケンシング関連パラメータ（例えば、コンタミネーションパラメータ）を決定することは、ＱＣＴ分子セットのＥＭＩ領域及び追加的なＥＭＩ領域に基づき（例えば、ＥＭＩ領域と追加的なＥＭＩ領域との対に対応する別個のＥＭＩシーケンスリードに基づき；等）導き出されるＱＣＴシーケンスリードクラスターに基づくことができる。変形形態において、変動領域は、加えて又は代わりに、合成されたを含むことができる
変形形態において、図２に示されるとおり、ＱＣＴ分子は、ＱＣＴ分子セットに属するＱＣＴ分子を識別する共有ＱＣＴ識別子領域（例えば、共有配列領域、標的分子の１つ以上の配列領域との非類似性がある等）など（例えば、ここで異なるＱＣＴ識別子領域は異なるＱＣＴ分子セットにユニークである等）、ＱＣＴ分子（及び／又は他の好適なＱＣＴ分子）を識別するＱＣＴ識別子領域を含むことができる。ある例において、第１のＱＣＴ分子セットの各ＱＣＴ分子の変動領域は、第２のＥＭＩ領域と少なくとも第１のＱＣＴ識別子領域によって隔てられている第１のＥＭＩ領域を含むことができ、ここで第２のＱＣＴ分子セットの各追加的なＱＣＴ分子は、第２の追加的なＥＭＩ領域と少なくとも第２のＱＣＴ識別子領域によって隔てられている第１の追加的なＥＭＩ領域を含むことができる。ある例において、第１の、第２の、第１の追加的な、及び第２の追加的なＥＭＩ領域は可変「Ｎ」塩基セットを含むことができ、及びここで各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択され、及びここでＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することは、第１及び第２のＱＣＴ識別子領域に基づいて、並びに第１の、第２の、第１の追加的な、及び第２の追加的なＥＭＩ領域に基づいてＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定することを含んでもよい。ある例において、第１のＱＣＴ分子セットの各ＱＣＴ分子について、対応するＱＣＴ分子配列は、第１のＱＣＴ識別子領域、第１のＥＭＩ領域、及び第２のＥＭＩ領域を除く生物学的標的の第１の配列鋳型との完全な配列類似性によって特徴付けられ；及びここで、第２のＱＣＴ分子セットの各追加的なＱＣＴ分子について、対応する追加的なＱＣＴ分子配列は、第２のＱＣＴ識別子領域、第１の追加的なＥＭＩ領域、及び第２の追加的なＥＭＩ領域を除く第２の配列鋳型との完全な配列類似性によって特徴付けられる。具体例において、ＱＣＴ分子配列は、先に決定された別個のＱＣＴ識別子領域（例えば、ユニークな識別子配列等）によって分断されている５Ｎ配列の２つの離れたセクションを除き、標的分子配列（例えば、標的分子配列の１つ以上の領域；等）と同一であってもよい。具体例において、ＱＣＴ識別子領域（例えば、ユニークなＱＣＴ ＩＤ配列、図２に示されるとおり等）を用いると、内部対照のため１つの段階で加えられるか、又は入力された生物学的標的の損失若しくは他のユーザーエラーを追跡するため種々の段階で加えられてもよい複数のＱＣＴライブラリの使用が可能となり得る。加えて又は代わりに、ＱＣＴ識別子領域は、任意の好適な方法で構成することができる。しかしながら、ＱＣＴ分子は、任意の好適な種類の領域の任意の好適な組み合わせを含むことができる（例えば、ここで異なるＱＣＴ分子は、同じ又は異なる種類及び／又は数の領域を含む；標的分子の配列領域との任意の好適な配列類似性及び／又は非類似性がある；等）。
変形形態において、方法１００は、加えて又は代わりに、１つ以上のＱＣＴライブラリを生成すること（例えば、各ＱＣＴライブラリがＱＣＴ分子を含む等）を含んでもよく、例えばここでＱＣＴライブラリは複数のＱＣＴ分子セットを含むことができ、例えばここで各ＱＣＴ分子セットは異なるＱＣＴ識別子領域によって識別可能である。ある例において、ＱＣＴライブラリを生成することは、異なるＱＣＴ分子セットを増幅することを含み得る（例えば、シーケンシングの調製のため、例えばここでＱＣＴ分子は、ＱＣＴ混合物の生成のため試料の１つ以上の構成要素に加える前に増幅される；等）。複数の例において、ＱＣＴライブラリを生成することは、ＱＣＴライブラリに含めるＱＣＴ分子の数を決定することを含んでもよい。具体例において、ＱＣＴ分子の特有の多様性を所与として各試料に含まれるべきユニークなＱＣＴ分子の最大数を誕生日問題の解法を用いて決定することができ、例えばここで、ＱＣＴ分子中の１０個の可変Ｎ塩基によって生成され得る４＾１０個の配列について、約０．５の確率の単一の有効なＥＭＩ衝突として最大１２００個のＱＣＴ分子を使用することができ（ｅｘｐ（−１２００×１１９９／２／４＾１０）≒０．５）、及びここで２００個のＱＣＴ分子では、単一の有効な衝突の確率は約２％である。具体例において、ＱＣＴライブラリを生成することは、試料セットの各試料につき０．００００１ナノグラム未満（及び／又は他の好適な量）の増幅可能なＱＣＴ分子の展開（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びハイスループットシーケンシングのうちの少なくとも一方の一段階における等）に適合したＱＣＴライブラリを生成することを含んでもよい。しかしながら、ＱＣＴライブラリに含めるＱＣＴ分子の数を決定すること、及びＱＣＴライブラリを生成することは、任意の好適な方法で実施することができる。
ある例において、ＱＣＴライブラリは、可変「Ｎ」配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド配列に対する相補鎖を合成することにより生成されてもよい。具体例において、ＱＣＴウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）を相補的なプライマー配列と再懸濁してアニールし、クレノウ断片（ｅｘｏ−）を使用して配列を伸長させ、及びエキソヌクレアーゼＩで処理することにより、二本鎖ＱＣＴライブラリが生成されてもよい。最終産物を精製して未使用の一本鎖ＤＮＡ分子が除去されてもよく、及びＱＣＴライブラリはＱｕｂｉｔ ＨＳアッセイなどの蛍光定量アッセイを用いて定量化することができ、そこから各試料に加えるＱＣＴ分子の数が、この二本鎖ＱＣＴ分子の予想分子量を用いることにより計算されてもよい。
しかしながら、ＱＣＴ分子を生成することＳ１１０は、任意の好適な方法で実施することができる。
２．２ ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定する。
方法１００の実施形態は、１つ以上のＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定することＳ１２０を含んでもよく、これは、シーケンシング関連パラメータ決定を促進するため、ＱＣＴ分子シーケンスリードを（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングの後に等）クラスター形成する働きをし得る。
ＱＣＴシーケンスリードクラスターは好ましくは、ＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、１つ以上のＱＣＴ分子セットと生物学的標的を含む１つ以上の試料とをベースに生成される１つ以上のＱＣＴ混合物に対応するシーケンシングから導き出される；等）を含むが、加えて又は代わりに、任意の好適なリード及び／又はシーケンシングに関連する成分を含むことができる。
ＱＣＴ分子シーケンスリードは、各試料に分注された１つ以上のＱＣＴ分子セットの識別情報を決定するためなど、計算的にクラスター形成することができる。様々な計算論的クラスター形成手法を用いることができ、限定はされないが、主成分分析、Ｋ平均法、階層クラスタリング、及び／又は任意の配列同一性に基づくクラスター形成手法が挙げられる。加えて又は代わりに、クラスター形成、クラスター形成に関連する計算論的分析（例えば、前処理、フィルタリング等）、及び／又は方法１００の実施形態の任意の他の好適な一部は、教師あり学習（例えば、ロジスティック回帰を用いる、バックプロパゲーションニューラルネットワークを用いる、ランダムフォレストを用いる、決定木等）、教師なし学習（例えば、アプリオリアルゴリズムを用いる、Ｋ平均クラスタリングを用いる）、半教師あり学習、深層学習アルゴリズム（例えば、ニューラルネットワーク、制限ボルツマンマシン、ディープビリーフネットワーク法、畳み込みニューラルネットワーク法、再帰型ニューラルネットワーク法、積層自己符号化器法等）、強化学習（例えば、Ｑ学習アルゴリズムを用いる、時間差学習を用いる）、回帰アルゴリズム（例えば、通常最小二乗法、ロジスティック回帰、段階的回帰、多変量適応型回帰スプライン、局所推定散布図平滑化等）、事例ベースの方法（例えば、ｋ最近傍法、学習ベクトル量子化、自己組織化マップ等）、正則化法（例えば、リッジ回帰、最小絶対収縮と選択演算子、エラスティックネット等）、決定木学習法（例えば、分類及び回帰木、反復二分器３（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｓｅｒ ３）、Ｃ４．５、カイ二乗自動相互作用検出、決定株、ランダムフォレスト、多変量適応型回帰スプライン、勾配ブースティングマシン等）、ベイズ法（例えば、単純ベイズ、平均１従属推定器（ａｖｅｒａｇｅｄ ｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）、ベイジアンビリーフネットワーク等）、カーネル法（例えば、サポートベクターマシン、動径基底関数、線形判別分析等）、クラスタリング法（例えば、ｋ平均クラスタリング、期待値最大化等）、相関ルール学習アルゴリズム（例えば、アプリオリアルゴリズム、エクラアルゴリズム等）、人工ニューラルネットワークモデル（例えば、パーセプトロン法、バックプロパゲーション法、ホップフィールドネットワーク法、自己組織化マップ法、学習ベクトル量子化法等）、次元削減法（例えば、主成分分析、部分的最小二乗回帰（ｐａｒｔｉａｌ ｌｅｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、サモンマッピング、多次元尺度構成法、射影追跡等）、アンサンブル法（例えば、ブースティング、ブートストラップ集約、アダブースト（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、積層一般化、勾配ブースティングマシン法、ランダムフォレスト法等）、及び／又は任意の好適な人工知能手法のいずれか１つ以上を含む人工知能手法（例えば、機械学習手法等）を適用することができる。
ＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定することは、好ましくは、ＱＣＴ分子の１つ以上の領域（例えば、変動領域；ＱＣＴ識別子領域；等）に基づくが（例えば、ＱＣＴ分子のそれらの領域に対応するシーケンスリードに基づく；等）、加えて又は代わりに、任意の好適なデータに基づいてもよい。具体例において、ＱＣＴ分子（例えば、標的に関連する品質管理鋳型等）が試料の成分と組み合わされ、標的配列領域及びＱＣＴ分子配列（例えば、ＱＣＴ分子の標的関連領域；等）の両方に相補的なプライマーを用いて生物学的標的（例えば、標的配列領域を含む核酸分子；等）が増幅された後、それらの分子はマルチプレックス化のためインデックスが付加され、シーケンシングされてもよく、及びシーケンシングリードがそのマルチプレックスインデックスに基づき分けられてもよい。具体例において、インデックスが付加されたリードは、次にＱＣＴ識別子領域（例えば、ＱＣＴ ＩＤ配列；等）別に異なるＱＣＴグループにクラスター形成することができ、又は予想ＱＣＴ配列との正確な配列一致（ＥＭＩ領域などの変動領域を除く等）に基づき同定することができる。ある例において、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを（例えば、計算的に等）決定することは、第１の条件（例えば、閾値数より少ない非類似性の塩基；等）を満たす変動領域配列類似性（例えば、第１のＱＣＴ分子の第１の変動領域、及び第２のＱＣＴ分子の第２の変動領域との間の；等）に基づき、第１のＱＣＴ分子シーケンスリード及び第２のＱＣＴ分子シーケンスリードをＱＣＴシーケンスリードクラスターセットのＱＣＴシーケンスリードクラスターにクラスター形成すること、及びＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの各ＱＣＴシーケンスリードクラスターについて、その試料セットを識別する試料識別子セットの試料識別子への（例えば、シーケンシングライブラリ調製及び／又はシーケンシングに関連する試料への、試料コンパートメントへの等）ＱＣＴシーケンスリードクラスターのアサインメントを決定することを含んでもよく、例えばここでシーケンシング関連パラメータ（例えば、コンタミネーションパラメータ等）を決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットと試料識別子セットの試料識別子へのＱＣＴシーケンスリードクラスターのアサインメントとに基づいてもよい。具体例において、第１及び第２のＱＣＴシーケンスリードをクラスター形成することは、３個未満の点置換の変動領域配列類似性に基づいて、及び第２の条件（例えば、ＱＣＴシーケンスリードクラスター当たり２０リード深度より高い；３０リード深度より高い；任意の好適なリード深度より高い；等）を満たすＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連するリード深度に基づいて第１及び第２のＱＣＴシーケンスリードをＱＣＴシーケンスリードクラスターにクラスター形成することを含んでもよい。具体例において、ＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、ＥＭＩ領域配列を含むシーケンスリード）は、同じウェルにおいてより高いリード深度で点置換が２個以下の別のＱＣＴ分子シーケンスリードが観察された場合に集約することができる。具体例において、各ＥＭＩが特定の試料並びに対応するウェル及びインデックス又はインデックス対に割り当てられる。
変形形態において、ＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定することは、非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスター（例えば、非有効なＥＭＩクラスター等）を決定及び／又は破棄すること（例えば、フィルタリングによって取り除くこと等）を含んでもよい。ある例において、図１０に示されるとおり、非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターは、リード深度が閾値を下回る及び／又は閾値である（例えば、２０リード以下；３０リード以下；任意の好適なリード深度の閾値；等）、及び／又は任意の好適な条件（例えば、所定のリード深度条件に適合するリード数；等）を満たすＱＣＴシーケンスリードクラスターを含んでもよく、例えばここで分子カウントに際して非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターは破棄され得る。具体例において、有効なＱＣＴシーケンスリードクラスター（例えば、非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターを破棄した後の残りのＱＣＴシーケンスリードクラスター等）を使用して、各試料についてのシーケンシングリードカウント数に対する品質管理鋳型数の比を決定することができる（例えば、ここでこの比を補正係数として使用して標的分子数を定量化することができる等）。具体例において、図１０に示されるとおり、３０を超える平均ＥＭＩリード深度では、有効対非有効ＱＣＴシーケンスリードクラスター（例えば、ＥＭＩクラスター等）はシーケンシング深度の顕著な低下によって明確に識別することができ、より低い平均リード深度では、適応手法（例えば、適応リード深度閾値決定；等）を用いて有効対非有効ＥＭＩを識別することができる。具体例において、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定することは、フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセット（例えば、有効なＱＣＴシーケンスリードクラスター等）を、そのフィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットに対応するリード深度（例えば、リード深度閾値条件及び／又は他の好適な条件を満たす；等）に基づき決定することを含んでもよく、例えばここでシーケンシング関連パラメータ（例えば、元の試料中に存在する標的分子数のものなど、標的分子カウント数；等）を決定することは、フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットに基づきＱＣＴ分子カウント数を決定すること（例えば、ここでフィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセット中のＱＣＴシーケンスリードクラスターの数がＱＣＴ分子カウント数に対応し得る；等）；ＱＣＴ分子カウント数とＱＣＴ分子シーケンスリードとに基づき（例えば、ＱＣＴ分子カウント数をＱＣＴ分子シーケンスリードで除す；等）補正係数比を決定すること；及び補正係数比と、シーケンシングから導き出された標的分子シーケンスリードであって、生物学的標的に関連する（例えば、標的分子の標的配列領域を含む；等）標的分子シーケンスリードとに基づき（例えば、標的分子シーケンスリード数に補正係数比を乗じる；等）標的分子カウント数を決定することを含んでもよい。具体例において、方法１００は、ＱＣＴ分子シーケンスリードのリード深度分布特徴に基づきリード深度閾値を適応的に決定することを含んでもよく、及びここでフィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットを決定することは、リード深度が適応的に決定されたリード深度閾値を満たすかどうかに基づきフィルタリング後のサブセットを決定することを含んでもよい。具体例において、リード深度の各リード深度は、フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットの対応するＱＣＴシーケンスリードクラスターについて２０リード（及び／又は他の好適なリード数；等）より高いものに対応してもよい。複数の例において、シーケンシングエラー及びＰＣＲエラーに起因して、非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターはコンタミネーション以外の側面に起因して非有効であり得る。加えて又は代わりに、有効又は非有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定することは、任意の好適な方法で実施することができる。しかしながら、ＱＣＴシーケンスリードクラスターを決定することＳ１２０は、任意の好適な方法で実施することができる。
２．３ シーケンシング関連パラメータを決定する。
方法１００の実施形態は、１つ以上のシーケンシング関連パラメータを決定することＳ１３０を含み得る。
シーケンシング関連パラメータには、コンタミネーションパラメータ（例えば、異なるユーザー間、試料間、実験間などでの、シーケンシングライブラリ調製及び／又はシーケンシングに関連するコンタミネーションを記述する等）；分子カウント数パラメータ（例えば、標的分子及び／又はＱＣＴ分子など、所与の試料及び／又は混合物中に当初存在する分子の数を記述する；等）；試料追跡パラメータ（例えば、試料損失に関連する；等）；試料処理エラーパラメータ（例えば、ノイズ；ピペットエラーなどの誤った試料処理操作；系統エラーを記述する；等）；定量エラーパラメータ（例えば、定量エラーを記述する；等）；分析エラーパラメータ（例えば、計算論的分析エラーを記述する；等）；及び／又はシーケンシングライブラリ調製、シーケンシング、関連性分析、及び／又は他の好適な側面に関連する任意の好適なパラメータのいずれか１つ以上が含まれてもよい。ある例において、図１１に示されるとおり、複数の試料間で決定されたＱＣＴ分子の数を用いて、ノイズ及び／又は誤った試料処理を記述する試料処理エラーを決定することができる；ここでＰＣＲ前に各試料に、約２００個のユニークなＱＣＴ分子におよそ対応する同容積のＱＣＴ分子を加えることができ、ＰＣＲ及びシーケンシング後にシーケンシングデータから有効なＱＣＴシーケンスリードクラスター（例えば、ＥＭＩクラスター等）を決定することができる；ここで約２００個のＱＣＴ分子の予想変動係数（ＣＶ）はｓｑｒｔ（２００）／２００≒７％であり、これは１２例の試料間での図１１に示す観察データと一致する；ここで任意の試料が特定の閾値（例えば、３σ、２００−３×ｓｑｒｔ（２００）≒１５０又は約２００／２≒１００のあまり厳しくない閾値）を下回る場合、この結果を用いて当該の特定の試料についての試料処理エラーを同定することができる；及びここでＱＣＴ分子の数は増加させてもまたよく、プロセスにおける７％未満のＣＶに対応する追加的な試料処理エラーパラメータを決定することができる。ある例において、シーケンシング関連パラメータを決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットのＱＣＴシーケンスリードクラスターにアサインメントされないＱＣＴシーケンスリードを同定すること；及びアサインメントされないＱＣＴシーケンスリードの数及びＱＣＴシーケンスリード総数からシーケンシングエラー率及びポリメラーゼエラー率のうちの少なくとも一方（例えば、エンド・ツー・エンドシーケンシング及びポリメラーゼエラー率；等）を決定することを含んでもよい。具体例において、標的又はリファレンス配列に対する可変領域（例えば、標的変動領域、リファレンス変動領域等）を有するが、配列の点でＱＣＴリードクラスター配列と同一でない任意の配列は、配列又はポリメラーゼエラーに起因する。具体例において、これらの配列のリードカウント数をＱＣＴリードカウント総数で除したものが、総合シーケンシング及びポリメラーゼエラー頻度である。前者のシーケンシングエラーは線形過程によって生じてもよい一方、ポリメラーゼエラーは指数関数的過程によって生じてもよく（例えば、線形ＰＣＲが用いられない限り）、ここで初期ＰＣＲサイクルにおけるエラーの効果は指数関数的に増幅し得る。従って、具体例において、ＱＣＴリードクラスターにアサインメントされない配列のリードカウント数の分布を分析することにより、シーケンシングエラー対ポリメラーゼエラーの寄与を計算することができる。しかしながら、シーケンシングエラー率及び／又はポリメラーゼエラー率を決定することは、任意の好適な方法で実施することができる。
変形形態において、シーケンシング関連パラメータを決定することは、複数のＱＣＴ分子セット（例えば、異なる共有ＱＣＴ識別子領域によって識別される異なるＱＣＴ分子セット；シーケンシングライブラリ調製及び／又はシーケンシングに関連する異なる段階で展開される異なるＱＣＴ分子セット；等）を伴う処理に基づいてもよく、例えば異なるＱＣＴ分子セットに対応する異なるＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットに基づいてもよい。ある例において、方法１００は、ＱＣＴ分子セットを生成することであって、各ＱＣＴ分子が、ＱＣＴ分子セット間で共有の、且つＱＣＴ分子を識別するように適合された第１のＱＣＴ識別子領域を含むこと；追加的なＱＣＴ分子セットを生成することであって、各追加的なＱＣＴ分子が、追加的なＱＣＴ分子セット間で共有の、且つ追加的なＱＣＴ分子を識別するように適合された第２のＱＣＴ識別子領域を含むこと；第１及び第２のＱＣＴ識別子領域に基づきＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定すること；及びＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づきシーケンシング関連パラメータを決定することを含んでもよい。具体例において、ＱＣＴ分子セットは、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方の第１の段階での展開に適合されてもよく、ここで追加的なＱＣＴ分子セットは、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方の第２の段階での展開に適合され、ここでＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの第１のサブセットを（例えば、対応する第１のＱＣＴ分子の第１のＱＣＴ識別子領域及び第１の変動領域に基づき；等）決定することであって、第１のサブセットが第１のＱＣＴ識別子領域に対応し、且つ第１の段階に関連すること；及びＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの第２のサブセットを（例えば、対応する第２のＱＣＴ分子の第２のＱＣＴ識別子領域及び第２の変動領域に基づき；等）決定することであって、第２のサブセットが第２のＱＣＴ識別子領域に対応し、且つ第２の段階に関連することを含み；及びここでシーケンシング関連パラメータを決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの第１及び第２のサブセットに基づいて、試料損失に関連する試料追跡パラメータを決定することを含む。
ある例において、シーケンシング関連パラメータを決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、それぞれＱＣＴ分子セット及び追加的なＱＣＴ分子セットに対応する第１の絶対カウント数及び第２の絶対カウント数を決定すること、及び第１及び第２の絶対カウント数に基づきピペットエラーパラメータ及び定量エラーパラメータのうちの少なくとも一方を決定することを含んでもよい。
具体例において、図１２に示されるとおり、異なる段階でＱＣＴ分子を使用すると、異なる試料調製手法の比較が可能となり；例えばここでＤＮＡ精製前に各血漿試料に２００個のＱＣＴ１分子（及び／又は任意の好適な数のＱＣＴ分子）を加えることによりＤＮＡ精製手法を評価してもよく；ここでＤＮＡは血漿から精製方法＃１又は精製方法＃２によって精製したものであり、得られたＤＮＡ試料はＰＣＲ増幅し及びシーケンシングした；ここで２００個のＱＣＴ２分子（及び／又は任意の好適な数のＱＣＴ分子）はＤＮＡ精製後、ＰＣＲ増幅前に加えた；ここでＱＣＴ２分子に対応する有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターの数は２つの試料間で同様であった（約２５％以内）ことから、これらの２つの試料について精製後の処理に違いはなかったことが指摘される；及びここで精製方法＃１についてのＱＣＴ１の有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターは約３分の１の少なさであったことから、精製方法＃１は（例えば、ｃｆＤＮＡの）大幅な試料損失を生じさせることが指摘される。
しかしながら、シーケンシング関連パラメータを決定することＳ１３０は、任意の好適な方法で実施することができる。
２．３．Ａ コンタミネーションパラメータを決定する。
シーケンシング関連パラメータを決定することＳ１３０は、加えて又は代わりに、１つ以上のコンタミネーションパラメータを決定することＳ１３２を含んでもよい。コンタミネーションパラメータは、クロスコンタミネーションパラメータ（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連する試料及び／又は試料コンパートメント間でのクロスコンタミネーション；異なるユーザー間でのクロスコンタミネーションを記述する；等）、キャリーオーバーコンタミネーションパラメータ（例えば、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方の複数の工程間でのキャリーオーバーコンタミネーションを記述する；等）、インデックスホッピングコンタミネーションパラメータ（例えば、インデックスホッピングプライマーに関連するインデックスホッピングコンタミネーションを記述する等）のうちの１つ以上を含んでもよい。コンタミネーションパラメータは、インデックスミスアサインメント（例えば、ハイスループットシーケンシングに関連する等）の程度を記述することができ、例えばここでコンタミネーションパラメータは、クロスコンタミネーション（及び／又は他の好適なコンタミネーション）（例えば、その累積効果）及びインデックスミスアサインメントの両方、及び／又はシーケンシングライブラリ調製及び／又はシーケンシングに関連する任意の他の好適な特性を記述することができる。
ある例において、コンタミネーションパラメータを決定することは、特定の試料について混入配列（例えば、特定の試料に関連することが見出される；その試料に対応する試料コンパートメントに見出される；等）のリード深度を足し合わせ、リード総数（又は有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連するＱＣＴ分子シーケンスリード総数）で除すことに基づき総コンタミネーション割合又は比率を決定することを含んでもよい。具体例において、図１０に示されるとおり、コンタミネーションパラメータが決定されてもよく、ここで試料Ａのシーケンシングについて非有効なＥＭＩクラスターの配列が別の試料（試料Ｂ）に有効なＥＭＩクラスターとして見られる場合、それは試料Ａ中のこのリードが試料Ｂからのコンタミネーションに起因することを指示し；ここで、かかる混入配列全てを見つけ出し、そのリード深度を足し合わせ、及びリード総数（又は有効なＥＭＩクラスターにマッピングされるリードの総数）で除すことにより、特定の試料についての総コンタミネーション割合又は比率を決定することができ；及びここで総コンタミネーション割合又は比率は、臨床アッセイが報告し得る分析感度及び特異度の最大レベルの分析に用いることができ、及び／又は偽陽性の代わりに不成功のアッセイ及び／又はノーコール結果を報告するための閾値として用いることができ；例えばここで、特定のアッセイが０．１％アレル比率の検出を必要とする場合、当該試料について０．１％である、それを上回る、又はそれに近い総コンタミネーション率がノーコール結果の同定に用いられてもよく；及びここで、代わりに、混入試料からのアレル比率の知識を用いてこの閾値を採用することができる（即ち、所与の試料中の特定のアレルの測定について、同じアレルについて１０％である別の試料からの１％コンタミネーションは、当該アレルが１％である試料からの１０％コンタミネーションと同じ効果がある）。
具体例において、図４Ａ〜図４Ｄに示されるとおり、コンタミネーションは、各試料コンパートメント（例えば、ウェル等）におけるＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、ＥＭＩシーケンスリード等）の混入源及び混入先を同定することにより測定されてもよい。具体例において、複数の試料コンパートメント（例えば、複数のウェル等）に同じＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、同じＥＭＩシーケンスリード）が観察される場合、そのＱＣＴ分子シーケンスリードは、複数の試料コンパートメントのうち最高リード深度の試料コンパートメントに由来するものとして特徴付けることができ、複数の試料コンパートメントの他の試料コンパートメント（例えば、他の１つ又は複数のウェル；等）における混入物と見なすことができる。具体例において、コンタミネーションパラメータを決定することは、共有される変動領域配列に対応する第１及び第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターを識別することであって、第１及び第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターのアサインメントが、試料識別子セットの別個の試料識別子（例えば、別個の試料コンパートメント；別個の試料を識別する；等）へのものであること；第１のＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連する第１のリード深度と第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連する第２のリード深度との間のリード深度比較を生成すること；及びリード深度比較に基づき、それらの別個の試料識別子のうちのある別個の試料識別子によって識別される試料に関連するコンタミネーションパラメータを決定することを含んでもよい。
ある例において、コンタミネーションパラメータを決定することは、ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、シーケンシングライブラリ調製の第１の工程における第１の増幅に関連する第１の分子フィンガープリントを決定すること；追加的なＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、シーケンシングライブラリ調製の第２の工程における第２の増幅に関連する第２の分子フィンガープリントを決定すること；及び第１及び第２の分子フィンガープリント間の比較に基づき、第１の工程から第２の工程へのキャリーオーバーコンタミネーションを記述するキャリーオーバーコンタミネーションパラメータを決定することを含んでもよい。
ある変形形態において、コンタミネーションパラメータを決定することは、インデックスホッピングコンタミネーションパラメータを決定することを含んでもよい。具体例において、図１３Ａ〜図１３Ｂに示されるとおり、ＱＣＴ分子を用いると、コンタミネーション及び／又はインデックスホッピングを生じるプライマーの識別及び除去を促進することができる；ここで、図１３Ａに示されるとおり、各試料には対応するＤ７ｘｘインデックス付加用プライマーによってバーコードを付加し、及びバリデーション実験のため同じシーケンシングフローセルレーン上でランを行った；ここで可能性として、Ｄ７０１及びＤ７０７インデックス付加用オリゴが同じオリゴ合成カラムで合成されること、合成エラー、又はインデックスホッピングに起因して、Ｄ７０１及びＤ７０７が互いに由来し合う高いコンタミネーション率であることが判明したとともに、ここでこのレベルは５％で有意であり、及び臨床アウトカムに影響を及ぼし得るものであり；及びここで、図１３Ｂに示されるとおり、臨床試料による後続のランではインデックス付加用プライマーは使用しなかったため、最大コンタミネーションレベルが１％未満にまで低下した。
具体例において、図１４に示されるとおり、ＱＣＴ分子を使用すると、ユニークデュアルインデックスプライマーの使用に関連する真のコンタミネーションレベルの測定を促進することができる；ここで標準的なデュアルインデックス付加用プライマーは、真の試料間コンタミネーション、インデックスホッピング、及び／又はインデックス付加用オリゴコンタミネーションの組み合わせに起因して０．１％のコンタミネーションを生じさせ得る（試料１〜９に示されるとおり）；ここでユニークデュアルインデックスの付加により、インデックスホッピング及びインデックス付加用オリゴコンタミネーションの効果は０．００１×０．００１≒１ｅ−６に低下するものと予想される；しかしここで測定値はデュアルユニークインデックスを付加した反応物中で最大０．０３％（３ｅ−５）のコンタミネーション率を示し（試料１０〜２９に示されるとおり）、これは予想される１ｅ−６コンタミネーションよりも高く、これは所与のアッセイについての検査室条件下における真のコンタミネーションレベルの検出を示唆し得る。
しかしながら、コンタミネーションパラメータを決定することＳ１３２は、任意の好適な方法で実施することができる。
２．３．Ｂ 分子カウント数パラメータを決定する。
シーケンシング関連パラメータを決定することＳ１３０は、加えて又は代わりに、１つ以上の分子カウント数パラメータを決定することＳ１３４を含んでもよい。分子カウント数パラメータは、標的分子カウント数（例えば、当初の試料中にあるなどの、標的分子の絶対分子カウント数；当初の試料中にあるなどの、内因性標的分子の絶対カウント数；等）；リファレンス分子カウント数（例えば、内因性リファレンス分子の絶対カウント数；当初の試料中にあるなどの；等）；ＱＣＴ分子カウント数（例えば、有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターの数に対応する；試料の成分に加えられる別個のＱＣＴ分子の数に対応する；等）；関連する比（例えば、補正係数；分子カウント数と関連するシーケンスリード数との間の比；等）；及び／又は分子カウント数に関連する任意の他の好適なパラメータのうちの１つ以上を含んでもよい。
分子カウント数パラメータは好ましくは、１つ以上の診断の促進に用いられるが、加えて又は代わりに、方法１００の実施形態の任意の好適な一部に（例えば、その入力として）用いることができる。
変形形態において、分子カウント数パラメータ（例えば、標的分子カウント数；等）を決定することは、標的分子シーケンスリード数に補正係数比を乗じることによるなど、ＱＣＴ分子カウント数（例えば、有効なＱＣＴシーケンスリードクラスターの数など、ＱＣＴシーケンスリードクラスターの数に対応する；等）及びＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、ＱＣＴシーケンスリードクラスターに対応するＱＣＴ分子シーケンスリードの数；等）に基づき決定される補正係数比に基づいてもよい。具体例において、有効な非混入ＱＣＴシーケンスリードクラスターの数（例えば、２リード以下の、及び／又は任意の好適な数以下のリードであるＱＣＴシーケンスリードクラスターを破棄した後の残りのＱＣＴシーケンスリードクラスター；等）は、ＱＣＴ分子カウント数（例えば、特定の試料コンパートメントについて；特定の試料について；特定の試料識別子についてのＱＣＴ分子数；等）を指示し得る。具体例において、ＱＣＴ分子カウント数を対応するＱＣＴ分子から得られたシーケンシングリードで除すことにより補正係数が求められてもよく、例えばここで補正係数にその標的分子（例えば、特定の試料コンパートメント中の；特定の試料からの；特定の試料識別子に関連する；等）に属するシーケンシングリードを乗じれば、標的分子カウント数（例えば、増幅のためアッセイが利用可能であった当初の生物学的標的分子の絶対数；等）が得られることになる。ある例において、内因性標的分子の絶対カウント数及び内因性リファレンス分子の絶対カウント数の決定に用いられる平均ＱＣＴシーケンシング深度は、その対応するＱＣＴとは別に決定される。
代わりに、実施形態の変形形態において、ＱＣＴシーケンスリードクラスターを（例えば、分子カウント数パラメータ及び／又は好適なシーケンシング関連パラメータを決定するため；等）破棄する際のリード深度閾値は、ＱＣＴ分子シーケンスリード（例えば、ＥＭＩシーケンスリード）深度分布の特徴に基づき適応的に決定されてもよい。例えば、閾値は、各インデックス付加した試料について、各試料内での平均ＥＭＩリード深度を計算し、この平均リード深度の平方根を計算し、及びリード深度が平均リード深度の平方根未満であるＱＣＴシーケンスリードクラスターを破棄することにより設定されてもよい。加えて又は代わりに、ＱＣＴシーケンスリードクラスターを破棄する際のリード深度閾値は、任意の好適な方法で計算することができる。
しかしながら、分子カウント数パラメータを決定することＳ１３４は、任意の好適な方法で実施することができる。
２．４ 診断を促進する。
方法１００の実施形態は、加えて又は代わりに、診断を促進することＳ１４０を含んでもよく、これは１つ以上の病態についての１つ以上の診断を補助し、決定し、提供し、及び／又は他の形で促進する働きをし得る。
１つ以上の診断を促進することは、１つ以上の診断を決定すること（例えば、１つ以上のシーケンシング関連パラメータに基づく；等）；１つ以上の診断を提供すること（例えば、１人以上のユーザーに；１人以上の医療提供者に、１人以上の医療提供者による患者への医学的診断の提供における使用のためなど；等）；１つ以上の診断を補助すること（例えば、診断の決定における使用のため、他のデータと組み合わせるなどして、１人以上の医療提供者及び／又は他の好適な実体に１つ以上のシーケンシング関連パラメータ及び／又は他の好適なパラメータを提供すること；等）；及び／又は診断に関連する任意の好適なプロセスのいずれか１つ以上を含んでもよい。例えば、診断を補助することは、無侵襲的出生前遺伝学的検査及びリキッドバイオプシーのうちの少なくとも一方に関連するアッセイについての診断アウトカムの決定における使用に適合されたコンタミネーションパラメータを（例えば、ユーザーに；医療提供者に；等）提供することを含んでもよい。ある例において、標的分子カウント数（及び／又は好適なシーケンシング関連パラメータ等）を決定することは、無侵襲的出生前遺伝学的検査及びリキッドバイオプシーのうちの少なくとも一方に関連する診断を促進するため標的分子カウント数（及び／又は好適なシーケンシング関連パラメータ等）を決定することを含んでもよい。
変形形態において、診断を促進することは、出生前診断（例えば、無侵襲的出生前遺伝学的検査に関連する；関連する遺伝的障害及び／又は好適な病態についての；等）を促進することを含んでもよい。ある例において、診断を促進することは、標的分子カウント数パラメータ及びリファレンス分子カウント数パラメータに基づき（例えば、内因性標的配列の絶対カウント数と内因性リファレンス配列の絶対カウント数との間の比較に基づき；等）１つ以上の遺伝的障害（例えば、単一遺伝子病、染色体異常等）の出生前診断を促進することを含んでもよい。
変形形態において、診断を促進することは、１つ以上の単一遺伝子病（及び／又は好適な遺伝的障害）の診断を促進することを含んでもよい。例えば、内因性標的分子の絶対カウント数を決定することは、単一遺伝子病に関連する突然変異を含む内因性標的分子の絶対カウント数を（例えば、ＱＣＴ分子シーケンスリード数をユニークなＱＣＴ分子数で除すことにより導き出されるなどの平均ＱＣＴシーケンシング深度で内因性標的分子についての総リードカウント数を除すことに基づき；等）決定することを含んでもよく、ここで内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することは、突然変異を含まない内因性リファレンス分子の絶対カウント数を（例えば、内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき等）決定すること；及び内因性標的配列の絶対カウント数及び内因性リファレンス配列の絶対カウント数（例えば、その間の比較等）に基づき単一遺伝子病の遺伝的障害の出生前診断を促進することを含んでもよい。具体例において、図１５Ａ〜図１５Ｄに示されるとおり、試料中の疾患及び非疾患アレルの数を測定し、比較することにより、母体血から発育中の胎児の遺伝子型を決定することができる；ここで図１５Ａは、鎌状赤血球形質（ＳＣＴ）試料でＱＣＴ分子によって測定したときのＨｂＳ（突然変異型ヘモグロビン）及びＨｂＡ（正常ヘモグロビン）分子数を含み、ここでＨｂＳ及びＨｂＡアレルは同じ頻度であると予想され、これは妊娠中の母親及び発育中の胎児の両方がこの障害に関してヘテロ接合である場合に相当する；ここで図１５Ｂは、ＳＣＴ＋１０％鎌状赤血球症（ＳＣＤ）試料でＱＣＴによって測定したときのＨｂＳ及びＨｂＡ分子数を含み、これは妊娠中の母親がこの障害の保因者であり、発育中の胎児が両方の親から疾患アレルを遺伝的に受け継いでいるため、ひいては疾患を有する場合に相当する；ここで図１５Ｃは、胎児が障害を遺伝的に受け継いでいる事後確率の相対突然変異量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅ：ＲＭＤ）分析による計算に使用するための、分子数及び胎児画分測定（例えば、母親と胎児とで遺伝子型が異なる最大９遺伝子座における測定）を含む；及びここで図１５Ｄは、０％対１０％ＳＣＤをＳＣＴに加えた試料（例えば、この障害に関して保因者である妊娠中の母親からの保因者対疾患胎児に相当する）についての平均値及び９５％信頼区間を含む。しかしながら、単一遺伝子病の診断を促進することは、任意の好適な方法で実施することができる。
変形形態において、診断を促進することは、１つ以上の染色体異常（及び／又は好適な遺伝的障害）の診断を促進することを含んでもよい。例えば、内因性標的分子の絶対カウント数を決定することは、第１の染色体に関連する内因性標的分子の絶対カウント数を（例えば、内因性標的分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき；等）決定することを含んでもよく、ここで内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することは、第２の染色体に関連する内因性リファレンス分子の絶対カウント数を（例えば、内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき等）決定すること；及び内因性標的配列の絶対カウント数及び内因性リファレンス配列の絶対カウント数（例えば、その間の比較等）に基づき染色体異常の出生前診断を促進することを含んでもよい。具体例において、図１６Ａ〜図１６Ｂに示されるとおり、同様にＱＣＴ分子を使用して２１番染色体及び別の染色体の数をカウントすることにより、胎児がダウン症候群を有することを示す２１番染色体数の（例えば、別の染色体と比較した）過剰があるかどうかを決定することができる；ここで３本と２本の染色体のカウントされる差について、シグナルは遺伝性劣性疾患の半分であってもよく（例えば、ＨｂＳＳ対ＨｂＡＳは２対１のシグナルであり；１００％増加対５０％増加）、これは、母体血中の循環ＤＮＡから発育中の胎児のダウン症候群を測定するにおいて、正確度の向上のため、各染色体上で２つ以上の遺伝子座をカウントする必要があることを示すものであり得る；及びここで方法１００の実施形態の一部は、加えて又は代わりに、１８トリソミー及び／又はディジョージ症候群などの他のデノボ突然変異及び／又は染色体異常についての診断の促進に用いることができる。
変形形態において、診断を促進することは、１つ以上の染色体微小欠失の診断を促進することを含んでもよい。例えば、内因性標的分子の絶対カウント数を決定することは、内因性標的分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、微小欠失領域に関連する内因性標的分子の絶対カウント数を決定することを含んでもよく、ここで内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することは、内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、微小欠失を有しないものと予想される第２の染色体領域に関連する内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することを含んでもよく、及びここで遺伝的障害の診断（例えば、出生前診断等）を促進することは、比較に基づき染色体微小欠失の診断（例えば、出生前診断；等）を促進することを含んでもよい。
変形形態において、診断を促進することは、１つ以上のコピー数変異の診断を促進することを含んでもよい。例えば、内因性標的分子の絶対カウント数を決定することは、内因性標的分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、コピー数変異を有し得る領域に関連する内因性標的分子の絶対カウント数を決定することを含んでもよく、ここで内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することは、内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、コピー数変異を有しないものと予想される領域に関連する内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定することを含んでもよく、及びここで遺伝的障害の診断（例えば、出生前診断）を促進することは、比較に基づきコピー数変異の診断（例えば、出生前診断）を促進することを含んでもよい。
加えて又は代わりに、診断を促進することは、任意の好適な病態に関するものであってよい。
図１５Ｃ及び図１６Ｂに示されるとおり、診断を促進することは、１つ以上の胎児画分測定値に基づいてもよい。例えば出生前診断を促進することは、胎児画分測定値、内因性標的配列の絶対カウント数、及び内因性リファレンス配列の絶対カウント数に基づき遺伝的障害の出生前診断を促進することを含んでもよい。しかしながら、胎児画分測定値の使用は、方法１００の実施形態の任意の好適なプロセスに対して任意の好適な方法で実施することができ、及び診断を促進することＳ１４０は、任意の好適な方法で実施することができる。
しかしながら、方法１００の実施形態は、任意の好適な方法で実施することができる。
方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、任意の変形例（例えば、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図等）を含め、様々なシステム構成要素及び様々な方法プロセスのあらゆる組み合わせ及び並べ替えを含んでもよく、ここで方法１００及び／又は本明細書に記載されるプロセスの実施形態の一部は、非同期的に（例えば、逐次的に）、同時に（例えば、並行して）、又は任意の他の好適な順序で、システム２００及び／又は本明細書に記載される他の実体の１つ以上の工程、要素、構成要素、及び／又はその他の態様により、及び／又はそれを用いて実施されてもよい。
本明細書に記載される変形例（例えば、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図等）及び／又は本明細書に記載される変形例の任意の一部はいずれも、加えて又は代わりに、組み合わせ、集約し、除外し、使用し、連続的に実施し、並行して実施し、及び／又は他の形で適用することができる。
方法１００及び／又はシステム２００の実施形態の一部は、少なくとも一部には、コンピュータ可読命令を記憶するコンピュータ可読媒体を受け入れるように構成された機械として具現化及び／又は実装されてもよい。命令は、システムと統合されてもよいコンピュータ実行可能な構成要素によって実行されてもよい。コンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＥＥＰＲＯＭ、光デバイス（ＣＤ又はＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピードライブ、又は任意の好適なデバイスなど、任意の好適なコンピュータ可読媒体上に記憶されることができる。コンピュータ実行可能な構成要素は汎用又は特定用途向けプロセッサであってもよいが、代わりに又は加えて、任意の好適な専用ハードウェア又はハードウェア／ファームウェアの組み合わせデバイスが命令を実行してもよい。
当業者は前述の詳細な説明から、並びに図及び特許請求の範囲から認識するであろうとおり、特許請求の範囲に定義される範囲から逸脱することなく方法１００、システム２００の実施形態、及び／又は変形例に修正及び変更を加えることができる。

Claims (30)

  1. 妊婦に関連する母体試料からの遺伝的障害の出生前診断を促進するための方法において、
    ・前記母体試料に、前記遺伝的障害に関連する品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セットを加えることであって、前記ＱＣＴ分子セットが、
    ・内因性標的分子の標的配列領域との配列類似性がある標的関連領域、及び
    ・前記内因性標的分子の配列領域との配列非類似性がある変動領域
    を含むこと；
    ・前記ＱＣＴ分子セットと前記標的配列領域を含む核酸分子とを共増幅することに基づき共増幅混合物を生成すること；
    ・前記共増幅混合物をシーケンシングすること；
    ・前記シーケンシングからのＱＣＴ分子シーケンスリードから検出される別個の前記変動領域の数に基づき、前記ＱＣＴ分子セットのユニークな数を計算的に決定することであって、前記ＱＣＴ分子シーケンスリードが前記ＱＣＴ分子セットに対応すること；
    ・前記ＱＣＴ分子シーケンスリードの数をユニークなＱＣＴ分子数で除すことに基づき平均ＱＣＴシーケンシング深度を計算すること；
    ・前記内因性標的分子についての総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき前記内因性標的分子の絶対カウント数を決定すること；
    ・内因性リファレンス分子についての総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき前記内因性リファレンス分子の絶対カウント数を決定すること；及び
    ・内因性標的配列の前記絶対カウント数と内因性リファレンス配列の前記絶対カウント数との間の比較に基づき前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進すること
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、
    ・前記遺伝的障害が単一遺伝子病を含み、
    ・前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性標的分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、前記単一遺伝子病に関連する突然変異を含む前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、
    ・前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性リファレンス分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、前記突然変異を含まない前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、及び
    ・前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進することが、前記比較に基づき前記単一遺伝子病の前記出生前診断を促進することを含むことを特徴とする方法。
  3. 請求項１に記載の方法において、
    ・前記遺伝的障害が染色体異常を含み、
    ・前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性標的分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、第１の染色体に関連する前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、
    ・前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性リファレンス分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、第２の染色体に関連する前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、及び
    ・前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進することが、前記比較に基づき前記染色体異常の前記出生前診断を促進することを含むことを特徴とする方法。
  4. 請求項１に記載の方法において、前記遺伝的障害が染色体微小欠失を含み、
    ・前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性標的分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、微小欠失領域に関連する前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、
    ・前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性リファレンス分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、微小欠失を有しないものと予想される第２の染色体領域に関連する前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、及び
    ・前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進することが、前記比較に基づき前記染色体微小欠失の前記出生前診断を促進することを含むことを特徴とする方法。
  5. 請求項１に記載の方法において、前記遺伝的障害がコピー数変異を含み、
    ・前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性標的分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、コピー数変異を有し得る領域に関連する前記内因性標的分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、
    ・前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することが、前記内因性リファレンス分子についての前記総リードカウント数を前記平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づいて、コピー数変異を有しないものと予想される領域に関連する前記内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することを含み、及び
    ・前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進することが、前記比較に基づき前記コピー数変異の前記出生前診断を促進することを含むことを特徴とする方法。
  6. 請求項１に記載の方法において、前記内因性標的分子の前記絶対カウント数及び内因性リファレンス分子の前記絶対カウント数を決定することに用いられる前記平均ＱＣＴシーケンシング深度が、それらの対応するＱＣＴとは別に決定されることを特徴とする方法。
  7. 請求項１に記載の方法において、前記出生前診断を促進することが、胎児画分測定値、内因性標的配列の前記絶対カウント数、及び内因性リファレンス配列の前記絶対カウント数に基づき前記遺伝的障害の前記出生前診断を促進することを含むことを特徴とする方法。
  8. シーケンシングライブラリ調製及びハイスループットシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するコンタミネーションを同定する方法において、前記方法が、
    ・品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セットを生成することであって、各ＱＣＴ分子が、
    ・生物学的標的の標的配列領域との配列類似性がある標的関連領域、及び
    ・前記生物学的標的の配列領域との配列非類似性がある変動領域
    を含むこと；及び
    ・前記ＱＣＴ分子セットの前記変動領域に基づきＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することであって、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットが、前記ＱＣＴ分子セットと前記生物学的標的を含む試料セットとをベースに生成されるＱＣＴ混合物セットに対応する前記ハイスループットシーケンシングから導き出されたＱＣＴ分子シーケンスリードを含み、及び
    ・前記シーケンシングライブラリ調製が、前記ＱＣＴ分子セットと前記生物学的標的を含む核酸分子との、前記標的関連領域と前記生物学的標的の前記標的配列領域との前記配列類似性に基づく共増幅を含むこと；及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記ハイスループットシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するコンタミネーションを記述するコンタミネーションパラメータを決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  9. 請求項８に記載の方法において、前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することが、
    ・第１の条件を満たす変動領域配列類似性に基づき、第１のＱＣＴ分子シーケンスリード及び第２のＱＣＴ分子シーケンスリードを前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットのＱＣＴシーケンスリードクラスターにクラスター形成すること、及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの各ＱＣＴシーケンスリードクラスターについて、前記試料セットを識別する試料識別子セットの試料識別子への前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターのアサインメントを決定すること
    を含み、
    ・前記コンタミネーションパラメータを決定することが、前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットと前記試料識別子セットの前記試料識別子への前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターの前記アサインメントとに基づき前記コンタミネーションパラメータを決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  10. 請求項９に記載の方法において、前記コンタミネーションパラメータを決定することが、・共有変動領域配列に対応する第１及び第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターを同定することであって、前記第１及び前記第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターの前記アサインメントが前記試料識別子セットの別個の試料識別子へのものであること；
    ・前記第１のＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連する第１のリード深度と前記第２のＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連する第２のリード深度との間のリード深度比較を生成すること；及び
    ・前記リード深度比較に基づき、前記別個の試料識別子の別個の試料識別子によって識別される試料に関連する前記コンタミネーションパラメータを決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  11. 請求項９に記載の方法において、前記第１及び前記第２のＱＣＴシーケンスリードをクラスター形成することが、３個未満の点置換の前記変動領域配列類似性に基づいて、及び第２の条件を満たす前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターに関連するリード深度に基づいて前記第１及び前記第２のＱＣＴシーケンスリードを前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターにクラスター形成することを含むことを特徴とする方法。
  12. 請求項８に記載の方法において、前記コンタミネーションパラメータを決定することが、・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、前記シーケンシングライブラリ調製の第１の工程における第１の増幅に関連する第１の分子フィンガープリントを決定すること；
    ・追加的なＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、前記シーケンシングライブラリ調製の第２の工程における第２の増幅に関連する第２の分子フィンガープリントを決定すること；及び
    ・前記第１及び前記第２の分子フィンガープリント間の比較に基づき、前記第１の工程から前記第２の工程へのキャリーオーバーコンタミネーションを記述するキャリーオーバーコンタミネーションパラメータを決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  13. 請求項８に記載の方法において、前記コンタミネーションパラメータが、前記ハイスループットシーケンシングに関連するインデックスミスアサインメントの程度を記述することを特徴とする方法。
  14. 請求項１３に記載の方法において、前記コンタミネーションパラメータが、無侵襲的出生前遺伝学的検査及びリキッドバイオプシーのうちの少なくとも一方に関連するアッセイについての診断アウトカムの決定における使用に適合されることを特徴とする方法。
  15. 請求項８に記載の方法において、前記ＱＣＴ分子セットを含む単一のＱＣＴライブラリを生成することを更に含み、前記単一のＱＣＴライブラリが、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記ハイスループットシーケンシングのうちの少なくとも一方の一段階における、前記試料セットの各試料につき０．００００１ナノグラム未満の増幅可能なＱＣＴ分子の展開に適合されることを特徴とする方法。
  16. 請求項８に記載の方法において、
    ・前記ＱＣＴ分子セットの各変動領域が、可変「Ｎ」塩基セットを含む埋め込み分子識別子（ＥＭＩ）領域を含み、各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択され、
    ・前記ＱＣＴ分子セットの各ＱＣＴ分子が、追加的な可変「Ｎ」塩基セットを含む追加的なＥＭＩ領域を更に含み、前記追加的なＥＭＩ領域が前記ＥＭＩ領域と前記ＱＣＴ分子の配列領域によって隔てられ、前記可変「Ｎ」塩基セット及び前記追加的な可変「Ｎ」塩基セットが、各々、３個より多い「Ｎ」塩基を含み、及び
    ・前記コンタミネーションパラメータを決定することが、前記ＱＣＴ分子セットの前記ＥＭＩ領域及び前記追加的なＥＭＩ領域に基づき導き出される前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき前記コンタミネーションパラメータを決定することを含むことを特徴とする方法。
  17. シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連する特徴付け方法において、
    ・品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セットを生成することであって、各ＱＣＴ分子が変動領域を含むこと；
    ・前記ＱＣＴ分子セットの前記変動領域に基づきＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することであって、前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットが、前記ＱＣＴ分子セットと生物学的標的を含む試料とをベースに生成されるＱＣＴ混合物に対応する前記シーケンシングから導き出されるＱＣＴ分子シーケンスリードを含むこと；及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記シーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケンシング関連パラメータを決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  18. 請求項１７に記載の方法において、
    ・前記各ＱＣＴ分子が、前記ＱＣＴ分子セット間で共有され且つ前記ＱＣＴ分子を識別するように適合された第１のＱＣＴ識別子領域を含み、
    ・前記方法が、追加的なＱＣＴ分子セットを生成することを更に含み、各追加的なＱＣＴ分子が、前記追加的なＱＣＴ分子セット間で共有され且つ前記追加的なＱＣＴ分子を識別するように適合された第２のＱＣＴ識別子領域を含み；及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することが、前記第１及び前記第２のＱＣＴ識別子領域に基づき前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定することを含むことを特徴とする方法。
  19. 請求項１８に記載の方法において、
    ・前記ＱＣＴ分子セットが、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記シーケンシングのうちの少なくとも一方の第１の段階における展開に適合され、
    ・前記追加的なＱＣＴ分子セットが、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記シーケンシングのうちの少なくとも一方の第２の段階における展開に適合され、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することが、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの第１のサブセットを決定することであって、前記第１のサブセットが前記第１のＱＣＴ識別子領域に対応し、且つ前記第１の段階に関連すること、及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの第２のサブセットを決定することであって、前記第２のサブセットが前記第２のＱＣＴ識別子領域に対応し、且つ前記第２の段階に関連すること
    を含み；及び
    ・前記シーケンシング関連パラメータを決定することが、前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットの前記第１及び前記第２のサブセットに基づいて、試料損失に関連する試料追跡パラメータを決定することを含むことを特徴とする方法。
  20. 請求項１８に記載の方法において、前記シーケンシング関連パラメータを決定することが、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、それぞれ前記ＱＣＴ分子セット及び前記追加的なＱＣＴ分子セットに対応する第１の絶対カウント数及び第２の絶対カウント数を決定すること、及び
    ・前記第１及び前記第２の絶対カウント数に基づきピペットエラーパラメータ及び定量エラーパラメータのうちの少なくとも一方を決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  21. 請求項１８に記載の方法において、前記シーケンシング関連パラメータを決定することが、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットのＱＣＴシーケンスリードクラスターに割り当てられないＱＣＴシーケンスリードを同定すること；及び
    ・割り当てられない前記ＱＣＴシーケンスリードの数及びＱＣＴシーケンスリードの総数からシーケンシングエラー率及びポリメラーゼエラー率のうちの少なくとも一方を決定すること
    を含むことを特徴とする方法。
  22. 請求項１８に記載の方法において、
    ・前記各ＱＣＴ分子の前記変動領域が、第２のＥＭＩ領域と少なくとも前記第１のＱＣＴ識別子領域によって隔てられている第１の埋め込み分子識別子（ＥＭＩ）領域を含み、
    ・前記各追加的なＱＣＴ分子が、第２の追加的なＥＭＩ領域と少なくとも前記第２のＱＣＴ識別子領域によって隔てられている第１の追加的なＥＭＩ領域を含み、
    ・前記第１の、前記第２の、前記第１の追加的な、及び前記第２の追加的なＥＭＩ領域が可変「Ｎ」塩基セットを含み、ここで各「Ｎ」塩基が、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のいずれか１つから選択され、及び
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを計算的に決定することが、前記第１及び前記第２のＱＣＴ識別子領域に基づいて、並びに前記第１の、前記第２の、前記第１の追加的な、及び前記第２の追加的なＥＭＩ領域に基づいて前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定することを含むことを特徴とする方法。
  23. 請求項２２に記載の方法において、
    ・各ＱＣＴ分子について、対応するＱＣＴ分子配列が、前記第１のＱＣＴ識別子領域、前記第１のＥＭＩ領域、及び前記第２のＥＭＩ領域を除く前記生物学的標的の第１の配列鋳型との完全な配列類似性によって特徴付けられ；
    ・各追加的なＱＣＴ分子について、対応する追加的なＱＣＴ分子配列が、前記第２のＱＣＴ識別子領域、前記第１の追加的なＥＭＩ領域、及び前記第２の追加的なＥＭＩ領域を除く第２の配列鋳型との完全な配列類似性によって特徴付けられることを特徴とする方法。
  24. 請求項１７に記載の方法において、
    ・前記ＱＣＴ分子セットの各ＱＣＴ分子が、前記生物学的標的の標的配列領域との配列類似性がある標的関連領域を含み、
    ・前記シーケンシングライブラリ調製が、前記ＱＣＴ分子セットと前記生物学的標的を含む核酸分子との、前記標的関連領域と前記生物学的標的の前記標的配列領域との前記配列類似性に基づく共増幅を含み、及び
    ・前記シーケンシング関連パラメータを決定することが、前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、前記シーケンシングに関連する前記生物学的標的の分子数を記述する標的分子カウント数を決定することを含む
    ことを更に含むことを特徴とする方法。
  25. 請求項２４に記載の方法において、
    ・前記ＱＣＴシーケンスリードクラスターセットを決定することが、フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットを、前記フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットに対応するリード深度に基づき決定することを含み、
    ・前記標的分子カウント数を決定することが、
    ・前記フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットに基づきＱＣＴ分子カウント数を決定すること；
    ・前記ＱＣＴ分子カウント数と前記ＱＣＴ分子シーケンスリードとに基づき補正係数比を決定すること；及び
    ・前記補正係数比と、前記シーケンシングから導き出された標的分子シーケンスリードであって、前記生物学的標的に関連する標的分子シーケンスリードとに基づき前記標的分子カウント数を決定すること、
    を含むことを特徴とする方法。
  26. 請求項２５に記載の方法において、前記ＱＣＴ分子シーケンスリードについてのリード深度分布特徴に基づきリード深度閾値を適応的に決定することを更に含み、前記フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットを決定することが、前記適応的に決定されたリード深度閾値を前記リード深度が満たすかどうかに基づき前記フィルタリング後のサブセットを決定することを含むことを特徴とする方法。
  27. 請求項２５に記載の方法において、前記リード深度の各リード深度が、前記フィルタリング後のＱＣＴシーケンスリードクラスターサブセットの対応するＱＣＴシーケンスリードクラスターにつき２０リード超に対応することを特徴とする方法。
  28. 請求項２４に記載の方法において、前記標的分子カウント数を決定することが、無侵襲的出生前遺伝学的検査及びリキッドバイオプシーの少なくとも一方に関連する診断を促進するため前記標的分子カウント数を決定することを含むことを特徴とする方法。
  29. 請求項１７に記載の方法において、前記シーケンシング関連パラメータを決定することが、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記シーケンシングのうちの少なくとも一方に関連する試料コンパートメント間でのクロスコンタミネーションを記述するクロスコンタミネーションパラメータ、前記シーケンシングライブラリ調製及び前記シーケンシングのうちの少なくとも一方の複数の工程間でのキャリーオーバーコンタミネーションを記述するキャリーオーバーコンタミネーションパラメータ、及びインデックスホッピングプライマーに関連するインデックスホッピングコンタミネーションを記述するインデックスホッピングコンタミネーションパラメータのうちの少なくとも１つを含むコンタミネーションパラメータを決定することを含むことを特徴とする方法。
  30. 請求項２９に記載の方法において、
    ・前記ＱＣＴ分子セットが前記シーケンシングに適合され、
    ・前記ＱＣＴ分子セットを生成することが、
    ・前記ＱＣＴ分子セットの第１のＱＣＴ分子サブセットを増幅すること；及び
    ・前記ＱＣＴ分子セットの第２のＱＣＴ分子サブセットを増幅すること
    を含み、
    ・前記ＱＣＴ分子シーケンシングリードが、
    ・前記第１のＱＣＴ分子サブセットと前記生物学的標的を含む前記試料とをベースに生成される前記ＱＣＴ混合物、及び
    ・前記第２のＱＣＴ分子サブセットと前記生物学的標的を含む追加的な試料とをベースに生成される追加的なＱＣＴ混合物
    に対応する前記シーケンシングから導き出され、前記試料及び前記追加的な試料が、それぞれ、前記試料コンパートメントの第１の試料コンパートメント及び第２の試料コンパートメントに対応することを特徴とする方法。
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