JP2021500868A - ノズリスポル酸の異種生合成 - Google Patents
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Abstract
Description
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチドをコードするベクターに関する。
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチド、TUおよび/またはベクターを含む、単離宿主細胞に関する。
別の側面において、本発明は、3−ゲラニルゲラニルインドール(GGI)2からNAA 10を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の単離ポリペプチドあるいはその機能的断片または変異体に関する。
別の側面において、本発明は、NAA 10の生合成増加を導く遺伝子修飾を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する。
本発明の他の側面は、例としてのみ提供される以下の説明から、そして付随する図を参照して、明らかになりうる。
用語「含む(comprising)」は、本明細書および請求項において、「少なくとも部分的にからなる」を意味し;これはすなわち、「含む」を含む、本明細書および請求項における言及を解釈する際、各言及において、この用語が前に置かれた特徴がすべて存在する必要があるが、他の特徴もまた存在してもよいことを意味する。関連する用語、例えば「含む(comprise)」および「含まれる(comprised)」は、類似の方式で解釈されるものとする。
用語「認識部位」および「制限部位」は、本明細書において交換可能に用いられ、そして同じものを意味する。制限酵素に関連する、本明細書で用いるようなこれらの用語は、所定の制限酵素のポリヌクレオチド上の結合部位を定義する核酸配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。
用語「遺伝子構築物」は、通常は二本鎖DNAであるポリヌクレオチド分子であって、別のポリヌクレオチド分子にコンジュゲート化されている、前記ポリヌクレオチド分子を指す。1つの限定されない例において、遺伝子構築物は、例えば当該技術分野に知られるような制限/連結によって、第二のポリヌクレオチド分子内に第一のポリヌクレオチド分子を挿入することによって、作製される。いくつかの態様において、遺伝子構築物は、単一のポリヌクレオチドモジュール、少なくとも2つのポリヌクレオチドモジュール、または単一の連続ポリヌクレオチド分子に組み立てられた一連の多数のポリヌクレオチドモジュール(本明細書において、また、「マルチ遺伝子構築物」とも称される)を含むが、これらに限定されない。
用語「マーカー」は、本明細書において、選択可能マーカーまたはスコア化可能マーカーをコードする、ポリヌクレオチドにおける核酸配列を意味する。
「制御要素」は、本明細書において、ベクター、遺伝子構築物または発現カセットからのポリヌクレオチド挿入物の発現を制御するかまたはこれに影響を及ぼす、任意の核酸配列要素を指し、そしてこれには、プロモーター、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、組織特異的制御要素、一時的制御要素、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサーおよびターミネーターが含まれる。制御要素は、本明細書に記載するような遺伝子構築物、発現カセットまたはベクターから発現しようとするポリヌクレオチド挿入物に対して、「同種(homologous)」であってもまたは「異種(heterologous)」であってもよい。本明細書に記載するような遺伝子構築物、発現カセットまたはベクターが細胞中に存在する場合、制御要素は、細胞に関して、「内因性」、「外因性」、「天然存在」および/または「非天然存在」であってもよい。
「GGI 2からNAA 10を導く生合成経路における生化学反応」は、基質分子GGI 2から、以下の中間体:モノエポキシ化(mono−expoxidized)GGI 3a、エミンドールSB 4a、NAF 5a、NAE 6a、NAD 7a、NAC 8、NAB 9を通じた、NAA 10までの転換に関与する特異的酵素の1つによって触媒される特異的反応の1つを意味し、そしてこれには、類似の機能を有しうるが、上にあげた特定の中間体に作用しない、宿主細胞内の類似の酵素は含まれない。
用語「組換え」は、天然背景において取り巻かれている配列から取り出され、そして/または天然背景において存在しない配列と組み換えられている、ポリヌクレオチド配列を指す。「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列からの翻訳によって産生される。
変異体ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列に対して、少なくとも50%、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも71%、好ましくは少なくとも72%、好ましくは少なくとも73%、好ましくは少なくとも74%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも76%、好ましくは少なくとも77%、好ましくは少なくとも78%、好ましくは少なくとも79%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも81%、好ましくは少なくとも82%、好ましくは少なくとも83%、好ましくは少なくとも84%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも86%、好ましくは少なくとも87%、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、好ましくは少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも96%、好ましくは少なくとも97%、好ましくは少なくとも98%、および好ましくは少なくとも99%の同一性を示す。同一性は、本発明の方法にしたがって用いられるかまたは同定されるポリヌクレオチドの少なくとも8ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも10ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも20ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも27ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも40ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも70ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも80ヌクレオチド位、好ましくは全長に渡る比較ウィンドウに渡って見出される。
変異体ポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列とは異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。ATG(メチオニン)およびTGG(トリプトファン)を除き、同じアミノ酸に関する他のコドンを、当該技術分野が認識する技術によって、例えば特定の宿主生物においてコドン発現を最適化させるために変化させてもよい。
変異体ポリペプチドには、アミノ酸配列が、1つまたはそれより多くの保存的アミノ酸、あるいはペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない非保存的置換、欠失、付加または挿入によって、本明細書のポリペプチドと異なる、ポリペプチドが含まれる。
ペニシリウム・パキシリにおけるIDTパキシリン6bに関する生合成の同定6、13−16以来、7つの他のIDT生合成経路における遺伝子機能性が解明されてきている17−22。これらのIDT経路は、IDT生合成における最初の3つの工程のための酵素をコードする、相同遺伝子を共有する(図2):(I)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(GGPPS)は、ファルネシルピロリン酸およびイソペンチルピロリン酸をGGPP 1aに変換し、(II)ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ(GGT)は、GGPP 1aおよびインドール−3−グリセロールリン酸1bのインドール縮重を触媒して、GGI 2を作製し、そして(III)位置選択的フラビン・アデニン二ヌクレオチド(FAD)依存性エポキシダーゼは、単一および/または二重エポキシ化GGI産物3a/3bを生成する。IDT環化を伴う第四の酵素工程で、経路は4つの重要な分岐に分かれ、エミンドールSB 4aおよびパスパリン4bのようなモノ/ジ酸素化アンチマルコフニコフ由来環状コア、あるいはアフラビニン4cおよびエミンドールDB 4dのようなモノ/ジ酸素化マルコフニコフ由来環状コアを生じさせる。これらの環状コアは、しばしば、装飾性酵素でさらに修飾されて、IDTに渡って見られる生物活性多様性を生成する。
したがって、1つの側面において、本発明は、配列番号:NodW(配列番号3)、NodR(配列番号6)、NodX(配列番号9)、NodM(配列番号12)、NodB(配列番号15)、NodO(配列番号18)、NodJ(配列番号21)、NodC(配列番号24)、NodY1(配列番号27)、NodD2(配列番号30)、NodD1(配列番号33)、NodY2(配列番号36)、NodZ(配列番号39)、NodS(配列番号50)、およびNodI(配列番号56)あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。
好ましくは、NodO(配列番号18)あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはFAD依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
好ましくは、NodY1(配列番号27)あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはFAD依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
別の側面において、本発明は、配列番号:NodW(配列番号3)、NodR(配列番号6)、NodX(配列番号9)、NodM(配列番号12)、NodB(配列番号15)、NodO(配列番号18)、NodJ(配列番号21)、NodC(配列番号24)、NodY1(配列番号27)、NodD2(配列番号30)、NodD1(配列番号33)、NodY2(配列番号36)、NodZ(配列番号39)、NodS(配列番号50)、およびNodI(配列番号56)あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
試料において、対応する全長ポリヌクレオチド配列を同定するため、当該技術分野に周知の方法において、部分的なポリヌクレオチド配列をプローブとして用いてもよい。こうした方法には、当該技術分野に知られるようなPCRに基づく方法、5’RACEおよびハイブリダイゼーションに基づく方法、コンピュータ/データベースに基づく方法が含まれる。検出可能標識、例えば放射性同位体、蛍光、化学発光および生物発光標識を用いて、検出を容易にしてもよい。逆PCRはまた、当該技術分野において知られ、そして用いられるように、既知の領域に基づくプライマーから出発して、本明細書に開示するポリヌクレオチド配列に隣接する未知の配列の獲得を可能にする。該方法は、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域における適切な断片を生成する。次いで、分子内連結によって、断片を環状化して、そしてPCRテンプレートとして用いる。既知の領域から、発散性(divergent)プライマーを設計する。全長クローンを物理的に組み立てるため、当該技術分野に知られるような標準的な分子生物学アプローチを利用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの増幅を可能にするプライマーおよびプライマー対もまた、本発明のさらなる側面を形成する。
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離核酸配列を含むベクターに関する。
1つの態様において、ベクターは、プラスミド、BAC、PAC、YAC、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。好ましくは、ベクターはプラスミドである。1つの態様において、ベクターは発現ベクターである。
1つの態様において、遺伝子構築物は、少なくとも2つのTUを含むマルチ遺伝子構築物である。1つの態様において、マルチ遺伝子構築物は、少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、好ましくは少なくとも5つ、好ましくは少なくとも6つ、好ましくは少なくとも7つ、好ましくは少なくとも8つ、好ましくは少なくとも9つ、好ましくは少なくとも10のTUを含む。
1つの態様において、TUは、T3、T7またはSP6細胞質発現系によって駆動されてもよい。
1つの態様において、単離宿主細胞は、原核または真核細胞である。宿主細胞として最も一般的に使用される原核生物は、大腸菌(Escherichia coli)(E. coli)の株である。他の原核宿主には、シュードモナス属(Pseudomonas)、バチルス属(Bacillus)、セラチア属(Serratia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、リステリア属(Listeria)、サルモネラ属(Salmonella)およびマイコバクテリウム属(Mycobacteria)が含まれるが、これらに限定されない。
1つの態様において、ポリペプチドは、本発明記載のポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片である。
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、本発明記載の単離核酸配列、TUまたはベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも1つのヒポキシロン属種ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片を作製する方法に関する。
1つの態様において、少なくとも1つのヒポキシロン属種ポリペプチドは、配列番号:NodW(配列番号3)あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号:NodW(配列番号3)から本質的になるかまたは該配列からなる。1つの態様において、単離宿主細胞は、ペニシリウム属、好ましくはP.パキシリの真菌菌糸体を含む。
1つの態様において、少なくとも1つの異種ポリペプチドは、NAF 5aの形成を導く生合成経路において、基質の転換を触媒する。
1つの態様において、転換される基質はGGPP 1aおよびインドール−3−グリセロールリン酸1bであり、そして転換は縮合である。
1つの態様において、転換される基質はモノエポキシ化GGI 3aであり、そして転換は環化である。
1つの態様において、転換される基質はNAF 5aであり、そして転換は縮合である。
1つの態様において、転換される基質はNAD 7aであり、そして転換は酸化および縮合である。
1つの態様において、転換される基質はNAB 9であり、そして転換は酸化である。
別の側面において、本発明は、異種発現によって、NAA 10を導く生合成経路に関与する少なくとも1つのポリペプチドを産生する、単離宿主細胞に関する。
1つの態様において、炭水化物は培地中に含まれる。1つの態様において、培地はCDYEまたは組換え細胞の増殖を支持するその変形である。
1つの態様において、2つの異なるGGPPS酵素の1つは、GGPPS酵素をコードする天然H.プリシシドゥムの第二のコピーによってコードされる。
1つの態様において、単離株は、H.プリシシドゥムの対照株、好ましくはH.プリシシドゥムATCC 74245に比較した際、少なくとも1つのGGPPS酵素の発現増加を含む。
1つの態様において、遺伝子制御要素の修飾は、天然一次GGPPS遺伝子の別のまたは修飾されたプロモーターへの機能可能であるような連結を含む。
1つの態様において、発現増加は、本明細書に記載するようなNodクラスター中に同定される遺伝子と同等の生化学機能を有する、H.プリシシドゥムにおける異種遺伝子の発現による。
1つの態様において、発現増加は、単一エポキシ化GGI産物3aを生成するFAD依存性オキシダーゼをコードする任意の遺伝子のH.プリシシドゥムにおける異種発現による。
ゲノム配列決定およびTUM増幅のためのgDNA単離
ゲノム配列決定およびPCRによるTUM増幅のためのゲノムDNAを、修飾を伴い、Byrdら26にしたがって、ペニシリウム・パキシリ株ATCC(登録商標)26601TM(PN2013)24およびヒポキシロン・プリシシドゥム株ATCC(登録商標)74245TM、25から単離した。Milli−Q(登録商標)水中、無菌2.4%(w/v)DifcoTMジャガイモ・デキストロース・ブロス(Becton, Dickinson and Company、米国メリーランド州)を、125mL三角フラスコ中の25mLアリコットで調製し、そして5x106胞子または〜1cm2の新鮮にすりつぶした菌糸体(非胞子形成株に関して)を接種した。培養を振盪しながら(200rpm)、22℃で2〜4日間インキュベーションした。発酵ブロスを無菌の毛羽立ったライナー(nappy liner)で濾過し、そして菌糸体を無菌水で3回リンスした。菌糸体を無菌15mL遠心管に移し、そして24〜48時間、凍結乾燥のため、液体窒素中でフラッシュ凍結した。15〜20mgのフリーズドライ菌糸体を液体窒素とともに乳鉢に入れ、そしてすりつぶして粉末にした。すりつぶした菌糸体を2mLチューブに移し、そして1mL抽出緩衝液(150mM EDTA、50mM Tris−HCl、および1%(w/v)ラウロイルザルコシンナトリウム)に再懸濁した。1.6mgプロテイナーゼKをチューブに添加し、そして内容物を37℃で30分間インキュベーションした。チューブを13,000rpmで10分間遠心分離し、そして上清を新鮮な2mLチューブに移した。500μLフェノールおよび500μLクロロホルムをチューブに添加し、そして内容物をボルテックスによって混合した後、13,000rpmで10分間遠心分離した。水性相を新鮮な2mLチューブに移し、そして先に記載するように、500μLフェノールおよび500μLクロロホルムでさらに2回洗浄した。次いで、水性相を新鮮な2mLチューブに移し、そして1mLクロロホルムで洗浄した(ボルテックスおよび13,000rpmで10分間の遠心分離)。水性相を新鮮な2mLチューブに移し、そして1mLの冷却イソプロパノールと混合した。DNAを−20℃で一晩沈殿させ、そして13,000rpmで10分間、ペレットにした。上清を廃棄し、そしてDNAを1mLの1M NaClに再懸濁した。チューブを室温で10分間インキュベーションし、そして次いで、13,000rpmで10分間遠心分離して、多糖をペレットにした。上清を新鮮なチューブに移し、そして1mLイソプロパノールと混合した。チューブを室温で10分間インキュベーションし、そしてDNAを13,000rpmで10分間の遠心分離によってペレットにした。上清を廃棄し、そして1mLの冷却70%エタノールを、再懸濁なしにペレットに添加した。チューブを13,000rpmで2分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。チューブを13,000rpmで1分間遠心分離し、そして残った70%エタノールをピペットで吸い取った。ペレットを室温で風乾し、50μL Milli−Q(登録商標)水に再懸濁し、そして−20℃で保存した。
MIDASツールキットは、Golden Gate組み立て技術に基づき27、IIS型制限酵素が、単一の反応において、多数のDNA断片をともにシームレスに連結する能力を利用する。MIDASは、3つのIIS型制限酵素、AarI、BsaIおよびBsmBIを利用し、切断に際して、使用者が定義する4bpオーバーハングを生じる。これらの使用者が定義するオーバーハングの適切な選択を通じて、そして各DNA断片に隣接するIIS型部位の適切な配向を通じて、ワンポット制限連結反応を用いて、多数の断片を、順序だった(方向性のある)方式で、レシピエントプラスミド(デスティネーションベクターとも称される)に組み立ててもよい。レシピエントプラスミドは、IIS型酵素の2つの発散性に配向する認識部位が隣接するマーカー遺伝子(典型的には、青色/白色スクリーニングのためのlacZα遺伝子)を含有し;集合的に「Golden Gateクローニングカセット」と称されるこれらの要素は、組み立て反応中に、挿入物によって置換される。
レベル1で、PCR産物として、または合成ポリヌクレオチド配列として(遺伝子合成企業より)のいずれかで、機能性TUMを生成し、そしてBsmBI仲介性Golden Gateクローニングによって、レベル1デスティネーションベクター(pML1)内にクローニングする。pML1ベクター内にクローニングするため、増幅されるTUM各々が、2つの収束性(convergent)BsmBI部位、BsmBI[CTCG]および[AGAC]BsmBIに隣接され、制限酵素切断に際して、pML1デスティネーションベクター中に存在するBsmBI部位のものと適合する粘着端を生じるように、PCRプライマーを設計する。したがって、pML1中に存在するGolden Gateクローニングカセットは、lacZαスコア化可能マーカーが隣接する2つの発散性BsmBI部位からなる:5’−[CTCG]BsmBI−lacZα−BsmBI[AGAC]−3’(図11A)。
レベル2では、BsaI仲介性Golden Gate反応を用いて、クローニングされ、そして配列が検証されたレベル1 TUMの適合セット(例えばProUTR、CDSおよびUTRtermモジュール)を、pML2デスティネーションベクターに組み立て、完全(すなわち全長)真核TUを含有するレベル2プラスミド(pML2エントリークローン)の生成を導いた。先に記載したモジュールアドレス標準は、順序だった方向性のある方式でTUの組み立てが進行し、1つのモジュールの3’端が次のモジュールの5’端と適合することを確実にする。
MIDASレベル3では、pML2プラスミド中で組み立てられたTUを、レベル3デスティネーションベクター(pML3)内に連続して装填し(バイナリー組み立てによる)、マルチ遺伝子構築物を形成する。
大腸菌のルーチンの増殖を、LBブロス中、37℃で行った。化学的にコンピテントな大腸菌HST08 Stellar細胞(Clontech Laboratories, Inc.)をルーチンの形質転換およびプラスミドの維持に用いた。この研究に用いたペニシリウム・パキシリ株を表7に示す。
スピンカラムプロトコルを用いてPCR増幅モジュールを精製し、そしてBsmBI仲介性Golden Gate組み立てによって、MIDASレベル1プラスミドpML1内にクローニングした。典型的には、ミニプレップ由来の1〜2μL(およそ50〜200ng)のpML1プラスミドDNAを、各1〜2μLの精製PCR断片、1μLのBsmBI(20U/μL)、1μLのT4 DNAリガーゼ(20U/μL)および2μLの10xT4 DNAリガーゼ緩衝液と、20μLの総反応体積中で混合した。反応を37℃で1〜3時間インキュベーションし、そしてアリコット(典型的には2〜3μL)を、熱ショックによって、30μLの大腸菌HST08 Stellarコンピテント細胞に形質転換した。回復期間(すなわち250μLのSOC培地の添加および37℃で1時間のインキュベーション)後、形質転換混合物のアリコットを、50μg/mLスペクチノマイシン、1mM IPTGおよび50μg/mL X−Galを補充したLB寒天プレート上に塗抹した。プレートを37℃で一晩インキュベーションし、そして白色コロニーを分析のために選択した。
レベル1でクローニングしたモジュールを用いて、全長TUを、BsaI仲介性Golden Gate組み立てによって、MIDASレベル2プラスミドに組み立てた。典型的には40fmоlのpML2プラスミドDNAを、各40fmоlのレベル1エントリークローンのプラスミド DNA、1μLのBsaI−HF(20U/μL)、1μLのT4 DNAリガーゼ(20U/μL)および2μLの10xT4 DNAリガーゼ緩衝液と、20μLの総反応体積中で混合した。以下のパラメータ:45サイクルの(37℃2分間および16℃5分間)、その後50℃5分間、および80℃10分間を用いて、DNA Engine PTC−200ペルチェサーマルサイクラー(Bio−Rad)中で、反応をインキュベーションした。レベル1組み立てに関して記載するように反応を形質転換し、そして75μg/mLカナマイシンおよび1.25mM 4CPを含有するLB寒天プレート上に塗抹した。37℃で一晩インキュベーションした後、分析のためコロニーを摘み取った。
レベル2で組み立てた全長TUを用いて、AarI(pML2「白色」ベクター内にクローニングされたTUに関して)またはBsmBI(pML2「青色」ベクター内にクローニングされたTUに関して)のいずれかを用い、Golden Gate組み立てを交互に行うことによって、レベル3デスティネーションベクターにおいて、マルチ遺伝子組み立てを生成した。典型的には、40fmоlのレベル3デスティネーションベクタープラスミドDNAを、40fmоlのレベル2エントリークローンプラスミドDNA、1μLのBsaI−HF(20U/μL)、1μLのT4 DNAリガーゼ(20U/μL)および2μLの10xT4 DNAリガーゼ緩衝液と、20μLの総反応体積中で混合した。以下のパラメータ:45サイクルの(37℃2分間および16℃5分間)、その後37℃5分間、および80℃10分間を用いて、DNA Engine PTC−200ペルチェサーマルサイクラー(Bio−Rad)中で、反応をインキュベーションした。レベル1組み立てに関して記載するように反応を形質転換し、そして50μg/mLスペクチノマイシン、1mM IPTGおよび50μg/mL X−Galを補充したLB寒天プレート上に塗抹した。プレートを37℃で一晩インキュベーションした。AarI仲介性組み立て反応に関しては、分析のために白色コロニーを選択する一方、BsmBI仲介性組み立て反応に関しては、青色コロニーを選択した。
微量元素を含むCDYE(Czapex−Dox/酵母エキス)培地を脱イオン水で作製し、そして該培地は、3.34%(w/v)Czapex−Dox(Oxoid Ltd、英国ハンプシャー)、0.5%(w/v)酵母エキス(Oxoid Ltd、英国ハンプシャー)、および0.5%(v/v)微量元素溶液を含有した。寒天プレートに関しては、Select寒天(Invitrogen、米国カリフォルニア州)を1.5%(w/v)まで添加した。
形質転換用の真菌プロトプラストの調製は、修飾を伴い、Yeltonら37にしたがった。100mL三角フラスコ中、微量元素を含むCDYE培地の5つの25mLアリコットに、5x106胞子を接種し、そして振盪しながら(200rpm)、28℃で28時間インキュベーションした。5つのフラスコすべてから、発酵ブロスを無菌の毛羽立ったライナーで濾過し、そして合わせた菌糸体を無菌水で3回、そしてOM緩衝液(10mM Na2HPO4および1.2M MgSO4.7H2O、100mM NaH2PO4.2H2OでpH5.8にする)で1回リンスした。菌糸体の重量を測定し、菌糸体1グラムあたり10mLのフィルター滅菌溶解酵素溶液(トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)由来の溶解酵素(Sigma)を、OM緩衝液中、10mg/mLで再懸濁することによって調製)に再懸濁し、そして80rpmで振盪しながら30℃で16時間インキュベーションした。プロトプラストを、250mL三角フラスコ内に、無菌の毛羽立ったライナーを通じて濾過した。濾過したプロトプラストのアリコット(5mL)を15mLの無菌遠心管内に移し、そして2mLのST緩衝液(0.6Mソルビトールおよび0.1M Tris−HCl、pH8.0)を重層した。チューブを2600xg、4℃で15分間遠心分離した。各チューブ中、OMおよびST緩衝液間で形成されるプロトプラストの白色層を、無菌15mL遠心管内に移し(2mLアリコットで)、5mLのSTC緩衝液(1Mソルビトール、50mM Tris−HCl、pH8.0、および50mM CaCl2)中にピペットで再懸濁することによって穏やかに洗浄し、そして2600xg、4℃で5分間遠心分離した。上清をデカントし、そして多数のチューブからペレットにしたプロトプラストを、STC緩衝液の5mLアリコット中に再懸濁することによって合わせた。STC緩衝液洗浄を3回反復した後、プロトプラストを単一の15mL遠心管内にプールした。最終プロトプラストペレットを、500μLのSTC緩衝液に再懸濁し、そしてプロトプラスト濃度を血球計数板で概算した。プロトプラストストックを希釈して、STC緩衝液1mLあたり1.25x108プロトプラストの最終濃度にした。プロトプラストのアリコット(100μL)を真菌形質転換に直ちに用い、そして過剰なプロトプラストを、1.7mL微量遠心管中、8%PEG溶液(80μLのプロトプラストを20μLのSTC緩衝液中の40%(w/v)PEG4000に添加した)中で保持し、そして−80℃で保存した。
VollmerおよびYanofsky38、ならびにOliverら39から修飾した、真菌形質転換を、STC緩衝液中で新鮮に調製したか、または8%PEG溶液中で保存した(上述の通り)いずれかの100μL(1.25x107)プロトプラストを含有する1.7mL微量遠心管中で行った。2μLのスペルミジン(H2O中50mM)、5μLヘパリン(STC緩衝液中、5mg/mL)、および5μgのプラスミドDNA(250μg/mL)を含有する溶液を、プロトプラストに添加し、そして氷上で30分間インキュベーションした後、900μLの40%PEG溶液(STC緩衝液中、40%(w/v)PEG4000)を添加した。形質転換混合物を、氷上でさらに15〜20分間インキュベーションし、無菌50mLチューブ中、17.5mLの0.8%RGA培地(50℃にあらかじめ温める)に移し、反転によって混合し、そして3.5mLアリコットを1.5%RGAプレート上に分配した。25℃で一晩インキュベーションした後、5mLの0.8%RGA(固形培地1mL当たり、150μgの最終濃度を達成するために十分なジェネテシンを含有する)を各プレート上に重層した。プレートを25℃でさらに4日間インキュベーションし、そして個々のコロニーから胞子を摘み取り、そして150μg/mLジェネテシンを補充したCDYE寒天プレート上にストリークした。ストリークしたプレートを25℃でさらに4日間インキュベーションした。個々のコロニー由来の胞子を、50μLの0.01%(w/v)triton X−100に再懸濁し、そして胞子懸濁物の5x5μLアリコットを、150μg/mLジェネテシンを補充した新規CDYE寒天プレート上にトランスファーした。胞子形成プレートを25℃で4日間インキュベーションし、そして胞子ストックを以下のように調製した。胞子形成プレート由来のコロニープラグを、2mLの0.01%(v/v)triton X−100に懸濁し、そして800μLの懸濁した胞子を、1.7mL微量遠心管中、200μLの50%(w/v)グリセロールと混合した。胞子ストックを用いて、50mLのCDYE培地に接種し、液体窒素中でフラッシュ凍結し、そして−80℃で保存した。
真菌形質転換体を、微量元素を含む50mLのCDYE培地中、振盪装置培養(≧200rpm)において、脱脂綿でキャップした250mL三角フラスコ中、28℃で7日間増殖させた。毛羽立ったライナーを通じた濾過によって、菌糸体を発酵ブロスから単離し、50mL遠心管(Lab Serv(登録商標)、Thermo Fisher Scientific)に移し、そして2−ブタノン中で≧45分間、菌糸体を激しく振盪する(≧200rpm)ことによって、インドールジテルペンを抽出した。
2−ブタノン上清(抽出されたインドールジテルペンを含有する)を、固相シリカゲル60アルミニウムプレート(Merck)上の薄層クロマトグラフィ(TLC)分析に用いた。インドールジテルペンを、9:1のクロロホルム:アセトニトリルまたは8:2のジクロロメタン:アセトニトリルでクロマトグラフし、そしてエールリッヒ試薬(24%(v/v)HClおよび50%エタノール中の1%(w/v)p−ジメチルアミノベンズアルデヒド)で視覚化した。
TLCによって陽性結果が出た形質転換体から、液体クロマトグラフィ−質量分析(LC−MS)のために試料を調製した。したがって、2−ブタノン上清(抽出されたインドールジテルペンを含有する)の1mL試料を1.7mL微量遠心管に移し、そして2−ブタノンを一晩蒸発させた。内容物を100%アセトニトリルに再懸濁し、そしてLC−MSバイアル内に0.2μm膜を通じて濾過した。LC−MS試料を、0.200mL/分の流速で泳動する、UltiMate(登録商標)3000標準LC系(Dionex、Thermo Fisher Scientific)に取り付けた逆相Thermo Scientific Accucore 2.6μm C18(50x2.1mm)カラム上でクロマトグラフし、そして多工程勾配法を用いて、0.01%ギ酸を含有するアセトニトリル水溶液で溶出させた(表14)。maXisTM II四重極飛行時間型質量分析計(Bruker)上のインライン分析を通じて質量スペクトルを捕捉した。
高レベルの新規インドールジテルペンを産生する真菌形質転換体を、「インドールジテルペン産生および抽出」以下に記載したように、微量元素を含むCDYE培地≧1リットル中で増殖させた。菌糸体を、攪拌バーを含有する1リットルのショットボトルにプールした。2−ブタノンを添加し、そして攪拌しながら(≧700rpm)、インドールジテルペンを一晩抽出した。抽出物をCelite(登録商標)545(J.T. Baker(登録商標))を通じて濾過し、そしてシリカカラムによる粗精製のため、回転蒸発させながらシリカ上に乾燥装填(dry loaded)した後、セミ分取HPLCによって最終精製した。粗抽出物の1mLアリコットを、8.00mL/分の流速で泳動する、UltiMate(登録商標)3000標準LC系(Dionex、Thermo Fisher Scientific)に取り付けたセミ分取逆相Phenomenex 5μm C18(2)100Å(250x15mm)カラム上に注入した。多工程勾配法を、インドールジテルペンの異なるセットの精製のために最適化した。各インドールジテルペンの純度を、LC−MSによって評価し、そして構造をNMRによって同定した。
重水素化クロロホルム中でNMR試料を調製した。標準一次元プロトンおよび炭素−13 NMR、二次元相関分光測定(COSY)、異種核単一量子相関分光測定(HSQC)および異種核多重結合相関分光測定(HMBC)によって化合物を分析した。
表1. 推定上のノズリスポル酸遺伝子クラスターにおける予測される遺伝子の機能的割り当て
表3. 3−ゲラニルゲラニルインドールエポキシダーゼ(「M」酵素)の類似性マトリックス
表4. インドールジテルペンシクラーゼ(「B」酵素)の類似性マトリックス
表5. インドールジテルペンプレニルトランスフェラーゼの類似性マトリックス(NodD1およびNodD2に比較した「D」および「E」酵素)
表6. インドールジテルペンFAD依存性酸化的シクラーゼ(「O」酵素)の類似性マトリックス
表7. 本研究で用いた真菌種の表
本発明は、インドールジテルペン化合物、特にNAの産生に産業適用を有する。
参考文献
Claims (19)
- NodW(配列番号3)、NodR(配列番号6)、NodJ(配列番号21)、NodY1(配列番号27)、NodY2(配列番号36)、NodX(配列番号9)、NodM(配列番号12)、NodB(配列番号15)、NodO(配列番号18)、NodC(配列番号24)、NodD2(配列番号30)、NodD1(配列番号33)、NodZ(配列番号39)、およびNodS(配列番号50)あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
- 請求項1のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号1、2、4、5、19、20、25、26、34、35、7、8、10、11、13、14、16、17、22、23、28、29、31、32、37、38、48および49からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは99%の核酸配列同一性を含む、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項3の少なくとも1つの単離ポリヌクレオチドを含む、転写単位(TU)。
- 請求項1の単離ポリペプチドをコードする、ベクター。
- 請求項2または請求項3の単離ポリヌクレオチド、あるいは請求項4のTUを含む、ベクター。
- 請求項1の単離ポリペプチド、請求項2または請求項3の単離ポリヌクレオチド、請求項4のTU、ならびに/あるいは請求項5または請求項6のベクターを含む、単離宿主細胞。
- 単離宿主細胞において、少なくとも1つの請求項1の単離ポリペプチド、請求項2または請求項3の単離ポリヌクレオチド、請求項4のTU、ならびに/あるいは請求項5または請求項6のベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも1つのノズリスポル酸(NA)を作製する方法。
- 3−ゲラニルゲラニルインドール(GGI)2からNAA 10を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属(Hypoxylon)種由来の単離ポリペプチドあるいはその機能的断片または変異体。
- GGI 2からNAA 10を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の少なくとも1つのポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片をコードする、単離ポリヌクレオチド。
- 単離宿主細胞において、請求項2または請求項3の単離ポリヌクレオチド、あるいは請求項5または請求項6のベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも1つのヒポキシロン属種ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片を作製する方法。
- 単離宿主細胞において、GGI 2からNAA 10を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、少なくとも1つのポリペプチドを異種発現する工程を含む、少なくとも1つのNAを作製する方法。
- GGI 2からNAA 10の形成を導く生合成経路において、基質の転換を触媒する、少なくとも1つの異種ポリペプチドを発現する、単離宿主細胞。
- GGI 2からNAA 10を導く生合成経路に関与する少なくとも1つのポリペプチドを、異種発現によって産生する、単離宿主細胞。
- 基質が少なくとも1つのNAに代謝されるように、形質転換前の細胞に比較して、配列番号3、6、21、27、36、9、12、15、18、24、30、33、39および50あるいはその機能性変異体または断片からなる群より選択されるポリペプチドの活性レベルの増加を生じる核酸で形質転換された組換え細胞と、基質を含む炭水化物を接触させる工程を含む、少なくとも1つのNAを産生する方法。
- NAA 10を導く生合成経路における酵素をコードする、少なくとも1つの異種核酸配列を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥム(Hypoxylon pulicicidum)の単離株。
- 少なくとも2つの異なるGGPPS酵素を発現する、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株。
- NAA 10の生合成増加を導く遺伝子修飾を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株。
- ヒポキシロン・プリシシドゥムにおいて、少なくとも1つの異種核酸配列を発現する工程を含む、NAA 10を作製する方法であって、少なくとも1つの異種核酸配列が、NAA 10を導く生合成経路における酵素をコードする、前記方法。
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