JP2021500070A - Hbb遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年10月18日出願の米国仮特許出願第62/574,163号、および2018年1月24日出願の同第62/621,102号の利益を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年10月12日に作成され、606107_HMT−023PC_Sequence_Listing_ST25.txtと名付けられた、サイズが200,630バイトの、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含む。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成番号P30CA033572の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本明細書で使用される場合、「複製欠損アデノ随伴ウイルス」という用語は、RepおよびCap遺伝子を欠くゲノムを含むAAVを指す。
一態様では、本開示は、HBB遺伝子における変異を修正するのに有用な新規複製欠損AAV組成物を提供する。本明細書に開示されるAAVは一般に、AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシドと、HBB遺伝子の標的遺伝子座を編集するための修正ゲノムとを含む。
別の態様では、本開示は、細胞のHBB遺伝子における変異を修正するための方法を提供する。本方法は一般に、本明細書に開示される複製欠損AAVで細胞を形質導入することを含む。そのような方法は、HBB遺伝子における変異を修正するのに非常に効率的であり、外来性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ(TALEN)、またはCas9などのRNA誘導型ヌクレアーゼ)の作用により標的遺伝子座のゲノムを切断して、そのような修正を容易にする必要がない。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく、細胞を、本明細書に開示される複製欠損AAVで形質導入することを伴う。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される複製欠損AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。そのようなパッケージングシステムは一般に、1つ以上のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列、本明細書に開示される1つ以上のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列、および本明細書に開示されるHBB遺伝子における変異を修正するための修正ゲノムを含み、パッケージングシステムは、カプシドに修正ゲノムを封入して、AAVを形成するために細胞内で作動可能である。
本明細書に開示される組換えAAVベクターは、ヌクレアーゼ不含相同性依存修復に基づく機構により、インビトロおよびインビボでの非常に効率的な遺伝子編集を媒介する。以下の実施例は、本明細書に開示されるAAVベースのベクターを使用して、鎌状赤血球症(SCD)およびベータサラセミアなどのある特定のヒト疾患において変異するHBB遺伝子の効率的な修正を示す。これらの実施例は、図示のために提示され、制限するために提示されるものではない。
本実施例は、HBB変異細胞における、クレードF AAVカプシド、例えば、AAVHSC7、AAVHSC15、およびAAVHSC17にパッケージングされた遺伝子編集AAVベクター、AAVS1−FPの組み込み効率を特徴付ける。AAVHSC7、AAVHSC15、およびAAVHSC17は、それぞれ、AAVF7、AAVF15、およびAAVF17としても知られ、WO2016/049230A1(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に完全に記載されている。
図2に示されるhHBB−hL−014と名付けたAAVベースのHBB修正ベクターを生成した。この修正ベクターは、HBB変異、例えば、鎌状赤血球症のHBB遺伝子のエクソン1のコード領域のヌクレオチド20(開始コドンから始まる)のA〜Tへの変異を修正するように設計された。hHBB−hL−014ベクターは、HBBの一部分およびその近接するゲノム配列に隣接する5’および3’AAV2 ITRを含み、エクソン1のヌクレオチド20のA〜Tへの変異は反転された。HBBゲノム配列の一部分は、NCBI Primer Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer−blast/)を使用して設計された、表2に示される増幅プライマーを使用して野生型HBBおよびその近接する遺伝子座から得られた。PCR産物は、HBBのすべてのエクソンおよびイントロンを網羅し、HBB転写開始部位から上流の1678ヌクレオチドおよびHBBポリアデニル化配列から下流の234ヌクレオチドをさらに含んだ。鎌状赤血球症のHBB変異に対して、このベクターは、各々長さが約1.7kbの相同アーム(変異反転部位の5’および3’のゲノム配列)を含んだ。ITRの組み込みは、BglII、MscI、およびSmaIを使用して制限消化スクリーニングすること、ならびにITR特異的シーケンシングプロトコルを使用してシーケンシングすることにより確認された(Mroske et al.,Hum Gene Ther Methods(2012)23(2):128−36)。挿入断片は、本明細書の表3に示されるプライマーを使用して、制限消化およびサンガーシーケンシングにより確認された。このベクターは、HBBのエクソンおよびイントロンにおける変異だけでなく、ベータサラセミアにおいて観察されるHBB発現に影響を及ぼす5’および3’非翻訳領域における変異も修正することができた。
この実施例は、HBB遺伝子における変異を修正することができるHBBのゲノム配列を含むAAVベースのHBB修正ベクターを提供する。
図4Aに示されるHBB修正ベクターhHBB−hL−001は、すべてのエクソン、すべてのイントロン、およびポリアデニル化配列を含むHBBゲノム配列を含む。このベクターはさらに、HBB転写開始部位から上流の800bpを包含する5’領域(図4Aにおいて「HBB HAL」と称される)、およびHBBポリアデニル化配列から下流の800bpを包含する3’領域(図4Aにおいて「HBB HAR」と称される)を含む。hHBB−hL−001ベクターは、配列番号31(TI REリンカーを有する)または配列番号32(TI REリンカーを有しない)に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。このベクターは、HBBのエクソンおよびイントロンにおける変異だけでなく、ベータサラセミアにおいて観察されるHBB発現に影響を及ぼす5’および3’非翻訳領域における変異も修正する。
図4Bに示されるHBB修正ベクターhHBB−hLW−013は、エクソン1、2、および3のコード領域のDNA配列が、対応する野生型配列に完全に同一ではなく、約67%同一であるように沈黙改変されることを除き、HBB修正ベクターhHBB−hL−001と同じ遺伝要素を含む。低減された配列同一性は、コドン改変によって生じ、変性コドンは、コードされたアミノ酸を変更することなく、元のコドンに対して置換される。この沈黙コドン改変は、HBBの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。実際、これは、エプシロングロビン(HBE)、デルタグロビン(HBD)、ガンマグロビン1(HBG1)、ガンマグロビン2(HBG2)、およびHBB偽遺伝子HBBPなどの他のグロビン遺伝子または偽遺伝子との、HBBエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座でのこのベクターの望ましくない組換えの可能性を低減する。特定の実施例では、エクソン1、エクソン2、およびエクソン3のコード領域の沈黙改変配列は、それぞれ、配列番号43、44、および45に記載される。hHBB−hLW−013ベクターは、配列番号33(TI REリンカーを有する)または配列番号34(TI REリンカーを有しない)に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。
図4Cに示されるHBB修正ベクターhHBB−hL−011は、HBBポリアデニル化配列から下流の3’領域(図4Cにおいて、「HBB HAR」と称される)が約100bpの長さであることを除き、HBB修正ベクターhHBB−hL−001と同じ遺伝要素を含む。この修飾は、プロモーター配列が転写因子および補助因子を動員し、それにより、相同組換えの効率を低減するため、HBBポリアデニル化配列から約100bp下流に位置する他の遺伝子の転写プロモーター配列(例えば、GATA1、MYC等)の包含を最小限に抑えるために行われる。加えて、転写プロモーター配列の包含は、ベクターからのHBBの異常発現を増加させる場合がある。hHBB−hL−011ベクターは、配列番号35(TI REリンカーを有する)または配列番号36(TI REリンカーを有しない)に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。
図4Dに示されるHBB修正ベクターhHBB−hLW−012は、エクソン1、2、および3のコード領域のDNA配列が、対応する野生型配列に67%同一であるように沈黙改変されることを除き、HBB修正ベクターhHBB−hL−011と同じ遺伝要素を含む。特定の実施例では、エクソン1、エクソン2、およびエクソン3のコード領域の沈黙改変配列は、それぞれ、配列番号43、44、および45に記載される。hHBB−hLW−012ベクターは、配列番号37(TI REリンカーを有する)または配列番号38(TI REリンカーを有しない)に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。
この実施例は、HBBコード配列またはその一部分を、HBB遺伝子に、例えば、開始コドンの後またはイントロン1に挿入することができるHBB修正ベクターを提供する。挿入された配列は、天然の転写調節要素の制御下で、天然の遺伝子座から転写および翻訳され、それにより、機能性HBBタンパク質の発現を回復させることができる。
図7Aに示されるHBB修正ベクターhHBB−hA−009は、第2のコドンから終止コドン(配列番号27のヌクレオチド4〜444)に野生型HBBコード配列の一部分、続いて、上述のSV40ポリアデニル化配列を含む。ベクターは、HBB開始コドンから上流に野生型ゲノム配列を含み、かつHBB開始コドンを含む5’相同アーム(図7Aにおいて「HBB HAL」と称される)、ならびにHBB開始コドンから下流に野生型ゲノム配列を含むが、HBB開始コドンを含まない3’相同アーム(図7Aにおいて「HBB HAR」と称される)をさらに含む。5’相同アームおよび3’相同アームの各々は、長さが約800bpである。hHBB−hA−009ベクターは、配列番号39に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。5’相同アームは、一部のベータサラセミア患者において観察されるHBB発現に影響を及ぼす開始コドンおよび/または5’非翻訳領域(UTR)における変異を修正する能力を有する。結果として、HBB修正ベクターhHBB−hA−009の組み込みは、5’UTR、コード配列、または3’UTRにおける変異によって損なわれた野生型HBBの発現を回復させることができる。
図7Bに示されるHBB修正ベクターhHBB−hAW−002は、HBBコード配列の一部分が、野生型cDNA配列の対応する領域に67%同一である配列番号47に対して沈黙改変されることを除き、HBB修正ベクターhHBB−hA−009と同じ遺伝要素を含む。実施例3に記載されるように、このコドン改変は、HBBの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。代わりに、これは、他のグロビン遺伝子および偽遺伝子とのHBBエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座でのこのベクターの望ましくない組換えを低減する。hHBB−hAW−002ベクターは、配列番号40に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。
図7Cに示されるHBB修正ベクターhHBB−h1−010は、相同組換えにより野生型HBBコード配列をイントロン1に挿入するように設計される。具体的には、挿入部位は、HBB遺伝子のヌクレオチド160と161との間であり、挿入は、イントロン1の主要スプライスドナー部位の破壊を避ける。このベクターの編集要素(挿入された領域)は、5’から3’にスプライスアクセプター部位(図7Cの「SA」、例えば、配列番号14)、組み込みによりHBB開始コドンとインフレームのリボソームスキッピング要素(図7Cの「T2A」、例えば、配列番号72)、野生型HBBコード配列(配列番号27)、およびSV40ポリアデニル化配列を含む。組み込みにより、HBB遺伝子座から転写されたpre−mRNAは、5から3’に:内在性HBBのエクソン1、イントロン1の最初の68ヌクレオチド(イントロン1の5’端の内在性スプライスドナーを含む)、hHBB−h1−010ベクターにより導入されたスプライスアクセプター、リボソームスキッピング要素、HBBコード配列、およびポリ(A)テールを含む。スプライシング後、mRNAは、5’から3’に内在性HBBのエクソン1、インフレームリボソームスキッピング要素、HBBコード配列、およびポリ(A)テールを含む。リボソームスキッピング要素は、部分リボソームスキッピングペプチドと融合したエクソン1の末端で終結した切り詰められたHBBペプチド、および完全長HBBポリペプチドのN末端に融合したリボソームスキッピングペプチドからのプロリンの2つのポリペプチドの生成をもたらす。
図7Dに示されるHBB修正ベクターhHBB−h1W−008は、HBBコード配列が、野生型cDNA配列の対応する領域に67%同一であるように沈黙改変されることを除き、HBB修正ベクターhHBB−h1−010と同じ遺伝要素を含む。実施例3に記載されるように、この配列修飾は、HBBの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。代わりに、これは、他のグロビン遺伝子および偽遺伝子とのHBBエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座に対するこのベクターの望ましくないものを低減する。具体的な実施例では、沈黙改変されたHBBコード配列は、配列番号47に記載される。hHBB−h1W−008ベクターは、配列番号42に記載のヌクレオチド配列を含み、5’ITR(例えば、配列番号18の配列を有する)および3’ITR(例えば、配列番号19の配列を有する)をさらに含む。
図7Eに示されるHBB修正ベクターhHBB−hE3C−001は、相同組換えにより、終止コドンの直後に、HBBコード配列をHBB遺伝子のエクソン3に挿入するように設計される。このベクターの編集要素(挿入された領域)は、5’から3’に沈黙改変されたHBBコード配列(配列番号99、野生型HBBコード配列に85%同一)とインフレームのリボソームスキッピング要素(図7Eの「P2A」、例えば、配列番号74)、およびSV40ポリアデニル化配列(配列番号77)を含む。HBBコード配列の沈黙改変は、コード配列から発現されるタンパク質のレベルを増加させる、望ましくないゲノム遺伝子座へのベクターのオフターゲットをもたらす可能性がある複雑度が低い配列を除去する、かつ/または編集要素とゲノムとの間の相同性を低減し、それにより、相同アームによってではなく、編集要素によって媒介される望ましくない組み込みを低減するように設計される。
この実施例は、前の実施例に記載されるものなどのHBB修正ベクターを調査するための動物モデルを提供する。NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJの遺伝子型を有するNSGマウスは、亜致死的に放射線を照射され、初代ヒト野生型CD34+HSCを移植することにより造血再構成を受けた。NSGマウスにおけるヒトCD34+HSCの生着レベルは、フローサイトメトリーにより、ヒトおよびマウスCD45+細胞の存在について末梢血をアッセイすることによって移植の12週間後に決定された。特定のAAVベクターの組み込み効率を評価するために、末梢血中に25%を超える循環ヒト細胞を有するマウスを使用して、インビボで初代ヒトCD34+HSCを形質導入した。
* * *
Claims (134)
- 細胞におけるベータグロビン(HBB)遺伝子の変異を修正するための方法であって、前記細胞を、
a)AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシドと、
b)(i)標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、(ii)前記標的遺伝子座の5’の第1のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の5’の5’相同アームヌクレオチド配列、および(iii)前記標的遺伝子座の3’の第2のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の3’の3’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)で形質導入することを含み、
前記細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される、方法。 - 前記細胞が、多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、造血幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、CD34+造血幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類対象内にあり、前記AAVが、前記対象の前記細胞を形質導入するのに有効な量で、前記対象に投与される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- HBB遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、
a)エクスビボで、前記対象由来の赤血球前駆細胞を、
(i)AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシドと、
(ii)(A)標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、(B)前記標的遺伝子座の5’の第1のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の5’の5’相同アームヌクレオチド配列、および(C)前記標的遺伝子座の3’の第2のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の3’の3’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損AAVで形質導入して、それにより、修正されたHBB遺伝子を有する形質導入された細胞を得ることと、
b)前記形質導入された細胞を前記対象に投与することと、を含み、
前記細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入することなく形質導入される、方法。 - 前記赤血球前駆細胞が、多能性幹細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記赤血球前駆細胞が、造血幹細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記赤血球前駆細胞が、CD34+造血幹細胞である、請求項6に記載の方法。
- HBB遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、
a)AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシドと、
b)(i)標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、(ii)前記標的遺伝子座の5’の第1のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の5’の5’相同アームヌクレオチド配列、および(iii)前記標的遺伝子座の3’の第2のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の3’の3’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、有効量の複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)を投与することを含み、
外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共投与することなく投与することを含む、方法。 - 前記疾患または障害が、サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒト対象である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が、前記HBB遺伝子である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記HBB遺伝子におけるヌクレオチド点変異、挿入、または欠失にある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HBB遺伝子における前記ヌクレオチド点変異または欠失が、位置−87のG、位置−31のG、位置−30のA、位置−29のG、位置−28のG、位置−10のT、位置1のC、位置1のA、位置2のG、位置17および18のCおよびTの欠失、位置19のA、位置20のAの欠失、位置20のT、位置25および26のAの欠失およびA、位置26の後のGの追加、位置47のA、位置48のA、位置51のCの欠失、位置52のA、位置58のG、位置59のG、位置79のA、位置82のT、位置84の後のCの追加、位置93のT、位置93のA、位置97のC、位置98のC、位置202のG、位置208のG、位置222のC、位置241または242のTの欠失、位置254〜257のTの欠失ならびにTおよびCおよびT、位置260のT、位置264または265のCの欠失、位置343の後のAの追加、位置399および400のGおよびTの欠失、位置401のT、位置417の後のAの追加、位置446のA、位置1099のT、位置1293のA、位置1344のTからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記編集要素が、前記変異に対応する前記野生型HBB遺伝子の一部分を含む、請求項14または15に記載の方法。
- 前記編集要素が、HBB遺伝子の1つ以上のエクソンのコード領域を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記編集要素が、エクソン1の前記コード領域、イントロン1全体、エクソン2全体、イントロン2全体、およびエクソン3の前記コード領域を含むHBB遺伝子の一部分を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コード領域が、前記野生型HBB遺伝子の前記対応するエクソンに100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%未満同一であるように沈黙(silently)改変されている、請求項17または18に記載の方法。
- 前記編集要素が、配列番号43〜46および105〜107からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、AAVS1である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記編集要素が、配列番号48またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1〜16および21に記載のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号27のヌクレオチド4〜444からなる、請求項22に記載の方法。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号27のヌクレオチド4〜444に70%、75%、80%、85%、または90%未満同一であるように沈黙改変されている、請求項22に記載の方法。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号47または100の配列からなる、請求項24に記載の方法。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記HBB遺伝子のスタッファー挿入コード配列からなる、請求項22に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のヌクレオチド3とヌクレオチド4との間のヌクレオチド間結合であり、それにより、前記標的遺伝子座の前記編集要素の組み込みが、前記標的遺伝子の開始コドンで始まるHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む前記標的遺伝子座をもたらす、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記編集要素が、5’から3’に開始コドンおよび配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列からなるHBBコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列、または前記HBBコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列の一部分を含む、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のイントロンにあり、前記編集要素が、5’から3’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記HBB遺伝子のイントロン1にある、請求項29に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して3’にあり、前記編集要素が、5’から3’にリボソームスキッピング要素、およびHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、野生型標的遺伝子の終止コドン、または変異標的遺伝子の対応するヌクレオチドである、請求項31に記載の方法。
- 前記編集要素が、配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列の3’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項22〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記編集要素が、前記標的遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記編集要素が、配列番号23〜28のいずれか1つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’相同アームヌクレオチド配列が、前記第1のゲノム領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3’相同アームヌクレオチド配列が、前記第2のゲノム領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のゲノム領域が第1の編集枠に位置し、前記第2のゲノム領域が第2の編集枠に位置する、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の編集枠が異なる、請求項38に記載の方法。
- 前記第1および第2の編集枠が同じである、請求項38に記載の方法。
- 前記第1の編集枠が、配列番号101、102、または103に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の編集枠が、配列番号101、102、または103に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のゲノム領域が、配列番号101に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項38〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のゲノム領域が、配列番号102に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項38〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’相同アームが、配列番号101に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3’相同アームが、配列番号102に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’および3’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約100〜約2000ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修正ゲノムが、前記5’相同アームヌクレオチド配列の5’の5’逆位末端反復(5’ITR)ヌクレオチド配列、および前記3’相同アームヌクレオチド配列の3’の3’逆位末端反復(3’ITR)ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’ITRヌクレオチド配列が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3’ITRヌクレオチド配列が、配列番号19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項48に記載の方法。
- 前記5’ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3’ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項48に記載の方法。
- 前記修正ゲノムが、配列番号29〜42および104のいずれか1つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- (a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項52に記載の方法。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸203〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がDであるか、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- (a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項55に記載の方法。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸138〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項55に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がTであるか、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がVであるか、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がLであるか、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がDであるか、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
- (a)配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がTであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQである、
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がYである、
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKである、
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がLであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSである、
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項58に記載の方法。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸1〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、CD34+ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込み効率が、少なくとも1%である、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、CD34+ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度が、少なくとも0.5%である、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
- a)AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシドと、
b)(i)標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、(ii)前記標的遺伝子座の5’の第1のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の5’の5’相同アームヌクレオチド配列、および(iii)前記標的遺伝子座の3’の第2のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の3’の3’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)。 - 前記標的遺伝子が、前記HBB遺伝子である、請求項63に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、前記HBB遺伝子におけるヌクレオチド点変異または欠失にある、請求項63または64に記載のAAV。
- 前記HBB遺伝子における前記ヌクレオチド点変異または欠失が、位置−87のG、位置−31のG、位置−30のA、位置−29のG、位置−28のG、位置−10のT、位置1のC、位置1のA、位置2のG、位置17および18のCおよびTの欠失、位置19のA、位置20のAの欠失、位置20のT、位置25および26のAの欠失およびA、位置26の後のGの追加、位置47のA、位置48のA、位置51のCの欠失、位置52のA、位置58のG、位置59のG、位置79のA、位置82のT、位置84の後のCの追加、位置93のT、位置93のA、位置97のC、位置98のC、位置202のG、位置208のG、位置222のC、位置241または242のTの欠失、位置254〜257のTの欠失ならびにTおよびCおよびT、位置260のT、位置264または265のCの欠失、位置343の後のAの追加、位置399および400のGおよびTの欠失、位置401のT、位置417の後のAの追加、位置446のA、位置1099のT、位置1293のA、位置1344のTからなる群から選択される、請求項65に記載のAAV。
- 前記編集要素が、前記変異に対応する前記野生型HBB遺伝子の一部分を含む、請求項65または66に記載のAAV。
- 前記編集要素が、HBB遺伝子の1つ以上のエクソンの前記コード領域を含む、請求項63〜67のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記編集要素が、エクソン1の前記コード領域、イントロン1全体、エクソン2全体、イントロン2全体、およびエクソン3の前記コード領域を含むHBB遺伝子の一部分を含む、請求項63〜68のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記コード領域が、前記野生型HBB遺伝子の前記対応するエクソンに100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、または50%未満同一であるように沈黙改変されている、請求項68または69に記載のAAV。
- 前記編集要素が、配列番号43〜46および105〜107からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項70に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、AAVS1である、請求項63に記載のAAV。
- 前記編集要素が、配列番号48またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項63〜66および72に記載のいずれか一項に記載のAAV。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号27のヌクレオチド4〜444からなる、請求項73に記載のAAV。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号27のヌクレオチド4〜444に70%、75%、80%、85%、または90%未満同一であるように沈黙改変されている、請求項73に記載のAAV。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号47または100の前記配列からなる、請求項75に記載のAAV。
- 配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記HBB遺伝子のスタッファー挿入コード配列からなる、請求項73に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のヌクレオチド3とヌクレオチド4との間の前記ヌクレオチド間結合であり、それにより、前記標的遺伝子座の前記編集要素の組み込みが、前記標的遺伝子の前記開始コドンで始まるHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む前記標的遺伝子座をもたらす、請求項73〜77のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記編集要素が、5’から3’に開始コドンおよび配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列からなるHBBコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列、または前記HBBコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列の一部分を含む、請求項73〜77のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のイントロンにあり、前記編集要素が、5’から3’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項79に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、前記HBB遺伝子のイントロン1にある、請求項80に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して3’にあり、前記編集要素が、5’から3’にリボソームスキッピング要素、およびHBBコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項79に記載のAAV。
- 前記標的遺伝子座が、野生型標的遺伝子の前記終止コドン、または変異標的遺伝子の前記対応するヌクレオチドである、請求項82に記載のAAV。
- 前記編集要素が、配列番号48をコードする前記ヌクレオチド配列の3’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項73〜83のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記編集要素が、前記標的遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項63〜84のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記編集要素が、配列番号23〜28のいずれか1つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項63〜85のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記5’相同アームヌクレオチド配列が、前記第1のゲノム領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である、請求項63〜86のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記3’相同アームヌクレオチド配列が、前記第2のゲノム領域に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である、請求項63〜87のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記第1のゲノム領域が第1の編集枠に位置し、前記第2のゲノム領域が第2の編集枠に位置する、請求項62〜88のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記第1および第2の編集枠が異なる、請求項89に記載のAAV。
- 前記第1および第2の編集枠が同じである、請求項89に記載のAAV。
- 前記第1の編集枠が、配列番号101、102、または103に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項89〜91のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記第2の編集枠が、配列番号101、102、または103に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項89〜92のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記第1のゲノム領域が、配列番号101に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項89〜93のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記第2のゲノム領域が、配列番号102に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項89〜94のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記5’相同アームが、配列番号101に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項63〜95のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記3’相同アームが、配列番号102に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項63〜96のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記5’および3’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約100〜約2000ヌクレオチドの長さを有する、請求項63〜97のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記修正ゲノムが、前記5’相同アームヌクレオチド配列の5’の5’逆位末端反復(5’ITR)ヌクレオチド配列、および前記3’相同アームヌクレオチド配列の3’の3’逆位末端反復(3’ITR)ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項63〜98のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記5’ITRヌクレオチド配列が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3’ITRヌクレオチド配列が、配列番号19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項99に記載のAAV。
- 前記5’ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3’ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項99に記載のAAV。
- 前記修正ゲノムが、配列番号29〜42および104のいずれか1つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項63〜101のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項63〜102のいずれか一項に記載のAAV。
- (a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項103に記載のAAV。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸203〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項103に記載のAAV。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がDであるか、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項63〜105のいずれか一項に記載のAAV。
- (a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項106に記載のAAV。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸138〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項106に記載のAAV。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がTであるか、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がVであるか、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がLであるか、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がDであるか、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであるか、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQであるか、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであるか、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであるか、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSであるか、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであるか、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、GまたはYであるか、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMであるか、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであるか、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKであるか、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCであるか、または配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、請求項63〜108のいずれか一項に記載のAAV。
- (a)配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がTであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がQである、
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がYである、
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がKである、
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がLであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がSである、
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がGである、
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がMである、
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRである、または
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がCである、請求項109に記載のAAV。 - 前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、または17のアミノ酸1〜736の前記アミノ酸配列を含む、請求項109に記載のAAV。
- 前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、CD34+ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込み効率が、少なくとも1%である、請求項63〜111のいずれか一項に記載のAAV。
- 前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、CD34+ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度が、少なくとも0.5%である、請求項63〜112のいずれか一項に記載のAAV。
- 請求項62〜111のいずれか一項に記載のAAVを含む、医薬組成物。
- AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムであって、
a)1つ以上のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列と、
b)請求項103〜111のいずれか一項に記載の1つ以上のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列と、
c)請求項63〜102のいずれか一項に記載の修正ゲノムと、を含み、前記パッケージングシステムが、前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するために細胞内で作動可能である、パッケージングシステム。 - 前記パッケージングシステムが、前記Repヌクレオチド配列および前記Capヌクレオチド配列を含む第1のベクターと、前記修正ゲノムを含む第2のベクターと、を含む、請求項115に記載のパッケージングシステム。
- 前記Repヌクレオチド配列が、AAV2 Repタンパク質をコードする、請求項115または116に記載のパッケージングシステム。
- 前記AAV2 Repタンパク質が、78/68またはRep68/52である、請求項117に記載のパッケージングシステム。
- 前記AAV2 Repタンパク質が、配列番号22の前記AAV2 Repアミノ酸配列に対して最小パーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記最小パーセント配列同一性が、前記AAV2 Repタンパク質をコードする前記アミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%である、請求項117または118のパッケージングシステム。
- 第3のベクターをさらに含み、前記第3のベクターが、ヘルパーウイルスベクターである、請求項115〜119のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスベクターが、独立した第3のベクターである、請求項120に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第1のベクターと統合される、請求項120に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第2のベクターと統合される、請求項120に記載のパッケージングシステム。
- 前記第3のベクターが、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項120〜123のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびサイトメガロウイルス(CMV)からなる群から選択される、請求項120〜124のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項125に記載のパッケージングシステム。
- 前記アデノウイルスゲノムが、E1、E2、E4、およびVAからなる群から選択される1つ以上のアデノウイルスRNA遺伝子を含む、請求項126に記載のパッケージングシステム。
- 前記ヘルパーウイルスが、単純ヘルペスウイルス(HSV)である、請求項125に記載のパッケージングシステム。
- 前記HSVゲノムが、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22、およびUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうちの1つ以上を含む、請求項128に記載のパッケージングシステム。
- 前記第1のベクターおよび前記第3のベクターが、第1のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項120〜129のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記第2のベクターおよび前記第3のベクターの前記ヌクレオチドが、第2のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項120〜129のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記第1のベクターおよび前記第3のベクターの前記ヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項120〜129のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- 前記第2のベクターおよび前記第3のベクターの前記ヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項120〜129のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
- AAVの組換え調製のための方法であって、前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するように作動可能である条件下で、請求項115〜133のいずれか一項に記載のパッケージングシステムを細胞内に導入することを含む、方法。
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