JP2021172625A - ペプチド及びペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】抗ＣＤ６３抗体と結合する新規なペプチド及びペプチド誘導体を提供する。【解決手段】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のペプチド又はペプチド誘導体；（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチド、（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体、（ｄ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が多量化したペプチド又はペプチド誘導体。【選択図】なし

Description

本開示は、抗ＣＤ６３抗体と結合する新規なペプチド及びペプチド誘導体に関する。

エクソソームが各種のがん細胞、免疫細胞などから分泌されることが報告されており、エクソソーム内の核酸又はタンパク質を分析することによって病気の早期発見又は予後予測をすることが期待されている。エクソソームを生体試料から分離する方法の一つに、エクソソームの表面抗原であるＣＤ６３に対する抗ＣＤ６３抗体を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１）。

特開２０１８−１８６７３９号公報

抗体は、その抗原を発現している生体物質の単離又は分析の手段として重要である。また、抗体の性能を適切に評価するために、抗体の精製、抗体の力価の測定などに用いることのできるペプチドも、医学、薬学、生化学及び分子細胞学の研究手段として重要である。

本開示の実施形態は、上記状況のもとになされた。
本開示は、抗ＣＤ６３抗体と結合する新規なペプチド及びペプチド誘導体を提供することを課題とする。

課題を解決するための具体的手段は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のペプチド又はペプチド誘導体である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
（ｄ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が多量化したペプチド又はペプチド誘導体。

本開示によれば、抗ＣＤ６３抗体と結合する新規なペプチド及びペプチド誘導体が提供される。

以下に、本開示の実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、実施形態の範囲を制限するものではない。

本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

本開示は、抗ＣＤ６３抗体と結合する新規なペプチド又はペプチド誘導体として、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のペプチド又はペプチド誘導体を開示する。

（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
（ｄ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が多量化したペプチド又はペプチド誘導体。

本開示のペプチド及びペプチド誘導体は、抗ＣＤ６３抗体の精製又は定量に使用する物質、抗ＣＤ６３抗体の力価の測定に使用する物質などとして有用である。

本開示のペプチド又はペプチド誘導体が結合する抗ＣＤ６３抗体の形態例として、抗ヒトＣＤ６３抗体が挙げられる。抗ヒトＣＤ６３抗体は、ヒトＣＤ６３を抗原にし、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ）を免疫動物にして作製された抗体である。抗ＣＤ６３抗体のある形態例はモノクローナル抗体であり、ある形態例はポリクローナル抗体である。抗ＣＤ６３抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでもよい。

本開示においてアミノ酸配列の改変は、置換、欠失、挿入及び付加から選択される少なくとも１種を意味する。すなわち、アミノ酸配列の改変は、置換、欠失、挿入、付加、又はこれらの任意の組合せである。配列番号１に対する１残基又は２残基の改変としては、１残基の置換、２残基の置換、１残基の欠失、２残基の欠失、１残基の挿入、２残基の挿入、１残基の付加、２残基の付加、１残基の置換かつ１残基の欠失、１残基の置換かつ１残基の挿入、１残基の置換かつ１残基の付加、１残基の欠失かつ１残基の挿入、１残基の欠失かつ１残基の付加、１残基の挿入かつ１残基の付加が挙げられる。

本開示においてペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の一方又は両方が保護又は安定のために修飾されたペプチドも含む。ペプチドの末端の保護又は安定のための修飾としては、Ｎ末端のアセチル化、Ｃ末端のアミド化が挙げられる。

（ａ）は、配列番号１のアミノ酸配列（すなわち、ＭＷＭＤＩＷＬＱＡＦＹＫＱＳＡＡ）からなるペプチドである。

（ｂ）は、配列番号１に対して置換、欠失、挿入及び付加から選択される少なくとも１種の改変がなされたアミノ酸配列からなるペプチドであり、改変されたアミノ酸残基の合計が１残基又は２残基である。

（ａ）のアミノ酸配列（配列番号１）と、（ｂ）のアミノ酸配列の具体例（配列番号２〜５０）とを、表１に示す。配列番号２〜５０は、（ｂ）のアミノ酸配列の例示であり、（ｂ）の実施形態を限定するものではない。

表１に示すペプチドは、本発明者がｃＤＮＡディスプレイ法によって見出したペプチドである。本発明者が行ったｃＤＮＡディスプレイ法の詳細は［実施例］項に記載のとおりである。

（ｂ）のある形態例は、配列番号１〜５０のいずれかのＮ末端のメチオニン残基が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドである。

（ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号１に対する改変の位置及び改変後のアミノ酸残基の種類は特に制限されないが、（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が高いほど好ましい。
（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有することが好ましく、配列同一性は９５％以上であることがより好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ (Basic Local Alignment Search Tool)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を使用して算出する。

（ｃ）は、（ａ）のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基が結合した構造を有するペプチド誘導体である。（ｄ）は、（ｂ）のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基が結合した構造を有するペプチド誘導体である。

ペプチド誘導体が有する親水性基の種類及び個数は、特に制限されず、水性媒体（例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液）に対するペプチド誘導体の溶解性又は分散性を調節する目的で選択すればよい。親水性基としては、例えば、側鎖に親水性基を有するアミノ酸残基、側鎖に親水性基を有するアミノ酸残基２個以上からなるペプチド（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＦＬＡＧタグを含むペプチド）、糖鎖、核酸、ポリエチレングリコール、リン酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、ピリジル基、これらの組合せが挙げられる。

（ｅ）は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が多量化したペプチド又はペプチド誘導体である。多量化とは、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合）による連結；イオン結合、ファンデルワールス力、水素結合による会合；スペーサー（例えば、ポリエチレングリコール）を介した連結；これらの組合せである。

（ｅ）のある形態例は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種を、任意の組み合わせで、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個有する。

本開示のペプチド及びペプチド誘導体は、使用目的に応じて、ビオチン標識したり、磁性粒子に固定化したりして使用してもよい。

本開示のペプチド及びペプチド誘導体は、化学合成してもよく、生合成してもよい。ペプチドの化学合成法は、固相合成法、液相合成法、及び今後開発される化学合成法のいずれを適用してもよい。

本開示は、本開示のペプチドを生合成する目的で、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｆ）のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が繰り返すペプチド。

（ａ）のペプチドは先述のとおりである。（ｂ）のペプチドは先述のとおりである。

（ｆ）は、（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が繰り返すペプチドである。すなわち、（ｆ）は、（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上が繰返し単位であり、繰返し単位が２個以上連なったペプチドである。繰返し単位の間には、（ａ）及び（ｂ）と相違するアミノ酸残基又はペプチドが存在していてもよい。（ａ）及び（ｂ）と相違するアミノ酸残基又はペプチドとしては、例えば、側鎖に親水性基を有するアミノ酸残基、側鎖に親水性基を有するアミノ酸残基２個以上からなるペプチド（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＦＬＡＧタグを含むペプチド）が挙げられる。

本開示は、目的のペプチドをコードするポリヌクレオチド（具体的には、（ａ）、（ｂ）又は（ｆ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド）を有する発現ベクターを提供する。発現ベクターとは、宿主細胞中で目的のペプチドを発現する組み換えベクターを意味する。発現ベクターは、目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドと、挿入されたポリヌクレオチドを発現させる発現調節要素（例えば、開始コドン、終止コドン、プロモーター、オペレーター）とを有する。

本開示の発現ベクターは、目的のペプチドの検出を容易にするために、目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドに連続して、標識タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）をコードするポリヌクレオチドをさらに有していてもよい。

本開示の発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、動物ウイルスベクター、昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。

本開示は、発現ベクターを含む形質転換体、及び形質転換体を用いて目的のペプチドを作製する方法を提供する。形質転換体を用いたペプチドの作製は、形質転換体を培養し、培養物からペプチドを回収することで実現される。

本開示の形質転換体は、本開示の発現ベクターで宿主を形質転換して作製する。形質転換体の作製に用いられる宿主は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞のいずれでもよい。

以下、実施例を挙げて発明の実施形態をさらに説明するが、発明の実施形態は、これら実施例に何ら限定されるものではない。

下記において、物質濃度に関し、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。

［ディスプレイライブラリーに用いるＤＮＡライブラリーの調製］
合成オリゴＤＮＡ１（配列番号５１）と合成オリゴＤＮＡ２（配列番号５２）とを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）により伸長反応を行った。９４℃で３分間変性した後、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを５回繰り返した。次いで、この伸長反応産物を鋳型に、合成オリゴＤＮＡ２（配列番号５２）と合成オリゴＤＮＡ３（配列番号５３）とを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＰＣＲを行った。９４℃で２分間変性した後、９４℃で１分、５０℃で１分、６８℃で１分のサイクルを５回繰り返し、配列番号５４のＤＮＡライブラリーを構築した。

Ｎはそれぞれ独立にＡ、Ｇ、Ｃ又はＴであり、Ｋはそれぞれ独立にＧ又はＴである。
配列番号５１ ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号５２ ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣ
配列番号５３ ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ
配列番号５４ ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ

［ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体の調製］
配列番号５４のＤＮＡライブラリーを鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、配列番号５５のｍＲＮＡを調製し、エタノール沈殿により精製した。２．８μｍｏｌ／ＬのｍＲＮＡに、５μｍｏｌ／Ｌのピューロマイシンリンカー（つくばオリゴサービス社製、構造を下記に示す。）、ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline、２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９０℃で５分間反応させた後、反応系の温度を２５℃まで低下させた。次いで、３６５ｎｍのＵＶを２分間照射した後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を得た。

Ｎはそれぞれ独立にＡ、Ｇ、Ｃ又はＵであり、Ｋはそれぞれ独立にＧ又はＵである。
配列番号５５ ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＵＵＵＣＣＣＵＣＵＡＧＡＡＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＣＧＧＵＵＣＵＧＧＣＧＧＵＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＵＡＡＡＵＡＡＡＵＡＡＧＣＵＵＧＡＧＵＡＵ

［抗体固定化ビーズの作製］
５００μＬのダイナビーズ Ｍ−２８０ ストレプトアビジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＴＢＳ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄し、９４５μＬのＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５５μＬの抗体溶液（抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（３−１３）、ビオチン結合、富士フイルム和光純薬社製、抗原由来動物：ヒト、免疫動物：マウス、クローンＮｏ．３−１３、タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を加えて室温で３０分間回転混和し、抗体をビーズに結合させた。ビーズを回収してＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、抗体固定化ビーズを得た。

［抗体非固定化ビーズの作製］
５００μＬのダイナビーズ Ｍ−２８０ ストレプトアビジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＴＢＳ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１ｍＬのビオチン溶液（５０μｍｏｌ／Ｌ）を加えて室温で１０分間回転混和し、ビオチンをビーズに結合させた。ビーズを回収してＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、抗体非固定化ビーズを得た。

［パニングに使用する翻訳液］
ＰＵＲＥｆｒｅｘ ２．０（ジーンフロンティア社製、「ＰＵＲＥｆｒｅｘ」は登録商標）を使用し、１０μＬの反応液に対して終濃度０．６μｍｏｌ／ＬになるようにｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を添加した。

［ラウンド１のパニングを行うための翻訳、パニング、逆転写反応及びＰＣＲ］
翻訳液を調製し、３７℃で３０分間反応させた。この翻訳液１０μＬに対して、２．５μＬのＥＤＴＡ水溶液（Ethylenediaminetetraacetic acid、１００ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、室温で数分間放置し、次いで、ＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社製）を用いて脱塩を行った。得られた溶液に２０μＬの抗体固定化ビーズ及びＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を加え、４℃で４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄した。次いで、ビーズ溶液に、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、ｄＮＴＰｓ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、プライマー１（配列番号５６、１０μｍｏｌ／Ｌ）を加えた。調製した溶液を３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行い、ペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を含むビーズ溶液を得た。
得られたビーズ溶液３μＬにＰＣＲ反応用の２×ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）及び純水を加え、９５℃で５分間加熱した後、反応系の温度を２５℃まで低下させた。上清を回収し、得られた上清にプライマー２（配列番号５７、１００μｍｏｌ／Ｌ）、プライマー３（配列番号５８、１００μｍｏｌ／Ｌ）、及びＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（東洋紡社製）を加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。

配列番号５６ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣ
配列番号５７ ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣ
配列番号５８ ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣ

［ラウンド２のパニングを行うための転写、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体の調製、翻訳、パニング、逆転写反応及びＰＣＲ］
ラウンド１で増幅したｃＤＮＡから、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてｍＲＮＡを合成し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製した。次いで、ｍＲＮＡに、ピューロマイシンリンカー（つくばオリゴサービス社製、構造は先述のとおり。）を加え、９０℃で５分間反応させた後、反応系の温度を２５℃まで低下させた。次いで、３６５ｎｍのＵＶを２分間照射した後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体とした。終濃度として０．６μｍｏｌ／ＬのｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を含む翻訳液１０μＬを調製し、３７℃で３０分間保温した。この溶液に対して、２．５μＬのＥＤＴＡ溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、室温で数分間放置した。この溶液に対して、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、ｄＮＴＰｓ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、プライマー１（配列番号５６、１０μｍｏｌ／Ｌ）を加え、３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行った。次いで、得られた溶液をＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア社製）により脱塩を行い、ペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を得た。
上記で得られたペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液に対して、２０μＬの抗体非固定化ビーズ及びＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を加え、室温で１０分間回転混和を行い、上清を回収した。回収した上清に対して２０μＬの抗体非固定化ビーズを加え、室温で１０分間回転混和を行い、上清を回収した。その後、上清に対して２０μＬの抗体固定化ビーズを加え、４℃で４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄し、ペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を含むビーズ溶液を得た。
得られたビーズ溶液３μＬにＰＣＲ反応用の２×ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）及び純水を加え、９５℃で５分間加熱した後、２５℃まで低下させた。上清を回収し、得られた上清にプライマー２（配列番号５７、１００μｍｏｌ／Ｌ）、プライマー３（配列番号５８、１００μｍｏｌ／Ｌ）、及びＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（東洋紡社製）を加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。

ラウンド３以降もラウンド２と同じ操作を繰り返し、合計６回同様の操作を行って抗体に特異的な結合を示すｃＤＮＡの濃縮を行った。濃縮されたＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、ＤＮＡプールに含まれるペプチドのアミノ酸配列を同定した。同定したアミノ酸配列のうち出現頻度の高い５０個を、出現頻度の高い順に、表１に示す。

［ペプチド及びペプチド誘導体の化学合成］
ペプチド自動合成装置（Ｂｉｏｔａｇｅ社製 ＳｙｒｏＩ）を用いて、常法に従い、ペプチド固相合成を行なった。合成装置にＨ−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）、Ｆｍｏｃアミノ酸（０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルエステル（１．０ｍｏｌ／Ｌ）及びジイロプロピルエチルアミン（０．１ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、ジイソプロピルカルボジイミド（１．０ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液、及び無水酢酸（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液をセットし、合成を行った。Ｆｍｏｃ脱保護（２０分間）、ＮＭＰによる洗浄、Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合（１時間）、ＮＭＰによる洗浄を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長させた。

合成したペプチドを、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）で精製し、質量分析法（ＭＳ，Mass Spectrometry）で同定した。

ＨＰＬＣは、１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙバイナリＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）又はＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製 Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ１３０ Ｃ１８（１０×２５０ｍｍ）又はＷａｔｅｒｓ社製 Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ１３０ Ｃ１８（１９×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、２０ｍＬ／ｍｉｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
検出波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ

ＭＳは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、イオン化法：ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化））、又は、ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ（島津製作所、イオン化法：ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）を同時に行う。）を用いて測定した。保持時間（ＲＴ）は、ＳＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定し、分（ｍｉｎ）で示した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ，２．１×３０ｍｍ
溶媒：Ａ液：０．１％ギ酸−水
Ｂ液：０．１％ギ酸−アセトニトリル
グラジエントサイクル：０．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝９５／５）、２．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、３．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ

（１）ペプチド１
配列番号１のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されているペプチドを、以下の手順で合成した。
Ｈ−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）１１１ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎ５−トリチル−Ｌ−グルタミン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎ−ε−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−チロシン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−トリプトファン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−イソロイシン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸 β−ｔ−ブチル エステル（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨの順に縮合を行った。ペプチド鎖を伸長後、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分間反応させることでＦｍｏｃ基の脱保護を行い、無水酢酸（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え１０分間反応させることでＮ末端のアミノ基をアセチル化した。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にメチル−ｔ−ブチルエーテル（１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、減圧下溶媒を留去することで、白色固体のペプチド１を９．１７ｍｇ得た。ペプチド１の構造式を下記に示す。

ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：１０１５．６（（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１９

（２）ペプチド２
ペプチド１の合成方法と同様の合成方法で、ただし、Ｃ末端側のモノマーとしてＣ末端側からＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ）の順で余分に使用してペプチド２を得た。
ペプチド２は、ペプチド１のＣ末端に、親水性基であるところの配列番号５９のアミノ酸配列（ＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫ）からなるペプチドが付加したペプチドである。
ペプチド２の構造式を下記に示す。下記の構造式において「＊」は連結部である。

ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：１０５６．７（（Ｍ＋３Ｈ）^３＋）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０１

（３）ペプチド３
ペプチド１の合成方法と同様の合成方法で、ただし、Ｃ末端側のモノマーとしてＣ末端側から９−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニルアミノ］−４，７−ジオキサノナン酸、９−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニルアミノ］−４，７−ジオキサノナン酸の順で余分に使用してペプチド３を得た。
ペプチド３の構造式を下記に示す。下記の構造式において「＊」は連結部である。

ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：１１７４．６（（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０

（４）ペプチド４
ペプチド１の合成方法と同様の合成方法で、ただし、Ｃ末端側のモノマーとして（Ｆｍｏｃ−アミノ）−ＰＥＧ６−カルボン酸を余分に使用してペプチド４を得た。ペプチド４の構造式を下記に示す。下記の構造式において「＊」は連結部である。

ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：１１８３．６（（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１１

（５）ペプチド５
ペプチド１の合成方法と同様の合成方法で、ただし、Ｃ末端側のモノマーとしてＣ末端側から（Ｆｍｏｃ−アミノ）−ＰＥＧ６−カルボン酸、（Ｆｍｏｃ−アミノ）−ＰＥＧ６−カルボン酸の順で余分に使用してペプチド５を得た。ペプチド５の構造式を下記に示す。下記の構造式において「＊」は連結部である。

ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：１３５０．８（（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１１

［ＳＰＲを利用した合成ペプチドの標的タンパク質への結合評価］
合成したペプチドと抗ＣＤ６３抗体との相互作用をＳＰＲ（Surface plasmon resonance）によって解析した。ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、２５℃にて実施した。固定化した抗ＣＤ６３抗体に合成したペプチドを添加し、相互作用を評価した。ランニングバッファーとしては以下の組成のものを使用した。

ランニングバッファーの組成
２５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）
０．０５ｖｏｌ％ Ｔｗｅｅｎ−２０
１．０ｖｏｌ％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）

ビアコア用センサーチップ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥヘルスケア社製）上に抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（３−１３）（ビオチン結合、富士フイルム和光純薬社製）を固定化させた。解離定数（ＫＤ）を測定するため、合成したペプチドを複数の濃度で添加し、固定化抗体に対する結合のセンサーグラムを得た。
得られたセンサーグラムの解析は、Ｔ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて行った。ＤＭＳＯに対する溶媒補正を行い、次に抗体が固定化されていないフローセルへのセンサーグラムを差し引いたセンサーグラムを用いて、平衡値解析によりＫＤを決定した。解析して得られた結果を表２に示す。

Claims (1)

1. 下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のペプチド又はペプチド誘導体。
   （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
   （ｂ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
   （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
   （ｄ）配列番号１に１残基又は２残基の改変を有するアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に親水性基を有するペプチド誘導体。
   （ｅ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種が多量化したペプチド又はペプチド誘導体。