JP2021127291A - Ｍｅｆ２ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤を提供する。【解決手段】 プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を含む治療剤をＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療剤とする。【選択図】なし
Description
本発明は、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤に関する。
急性リンパ性白血病（Acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）は、骨髄においてリンパ芽球が増殖する悪性腫瘍性疾患であり、リンパ芽球の浸潤によるリンパ節や肝臓・脾臓などの腫大が伴うことがある。日本国内の年間の新規の発症数は約１０００人である。白血病細胞が骨髄や血液中で異常に増え、正常な赤血球、白血球、血小板が作られなくなるため、１）赤血球が少なくなることによる貧血の症状（息切れや動悸）、２）白血球が少なくなることによる、抵抗力の低下（感染症にかかりやすくなる）、３）血小板が少なくなることによる出血しやすくなる（鼻血が出やすくなるなど）が初期症状として表れることがある。
ＡＬＬは主に染色体の転座、欠失などの染色体異常、その結果として生じる、他の遺伝子との融合遺伝子などの遺伝子変異によって起こることが報告されている（非特許文献１）。その染色体異常等によって、現在、以下の１４のサブグループに分類されている。
グループ１：ＭＥＦ２Ｄ（MADS box transcription enhancer factor 2 polypeptide D）融合型（ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８、ＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒなど）
グループ２：ＴＣＦ３-ＰＢＸ１融合型
グループ３：ＥＴＶ６-ＲＵＮＸ１融合様型
グループ４：ＤＵＸ４ 融合型
グループ５ ＺＮＦ３８４融合型（ＥＰ３００-ＺＮＦ３８４，ＴＣＦ３-ＺＮＦ３８４，ＴＡＦ１５-ＺＮＦ３８４、ＳＭＡＲＣＡ２-ＺＮＦ３６２など）
グループ６：ＢＣＲ-ＡＢＬ１融合型／フィラデルフィア染色体様（ＢＣＲ-ＡＢＬ１，ＩＧＨ-ＣＲＬＦ２など）
グループ７：染色体数異常
グループ８：ＫＭＴ２Ａ融合型（ＫＭＴ２Ａ-ＡＦＦ１，ＫＭＴ２Ａ-ＭＬＬＴ１，ＫＭＴ２Ａ-ＭＬＬＴ３など）
グループ９：ＰＡＸ５及びＣＲＬＦ２融合型（Ｐ２ＲＹ８-ＣＲＬＦ２，ＰＡＸ５-ＮＯＬ４Ｌ，ＰＡＸ５-ＡＵＴＳ２など）
グループ１０：ＰＡＸ５変異型
グループ１１：ＩＫＺＦ１変異型
グループ１２：ＺＥＢ２変異／ＩＧＨ-ＣＥＢＰＥ融合型
グループ１３：ＴＣＦ３／４-ＨＬＦ融合型
グループ１４：ＮＵＴＭ１融合型
グループ１：ＭＥＦ２Ｄ（MADS box transcription enhancer factor 2 polypeptide D）融合型（ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８、ＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒなど）
グループ２：ＴＣＦ３-ＰＢＸ１融合型
グループ３：ＥＴＶ６-ＲＵＮＸ１融合様型
グループ４：ＤＵＸ４ 融合型
グループ５ ＺＮＦ３８４融合型（ＥＰ３００-ＺＮＦ３８４，ＴＣＦ３-ＺＮＦ３８４，ＴＡＦ１５-ＺＮＦ３８４、ＳＭＡＲＣＡ２-ＺＮＦ３６２など）
グループ６：ＢＣＲ-ＡＢＬ１融合型／フィラデルフィア染色体様（ＢＣＲ-ＡＢＬ１，ＩＧＨ-ＣＲＬＦ２など）
グループ７：染色体数異常
グループ８：ＫＭＴ２Ａ融合型（ＫＭＴ２Ａ-ＡＦＦ１，ＫＭＴ２Ａ-ＭＬＬＴ１，ＫＭＴ２Ａ-ＭＬＬＴ３など）
グループ９：ＰＡＸ５及びＣＲＬＦ２融合型（Ｐ２ＲＹ８-ＣＲＬＦ２，ＰＡＸ５-ＮＯＬ４Ｌ，ＰＡＸ５-ＡＵＴＳ２など）
グループ１０：ＰＡＸ５変異型
グループ１１：ＩＫＺＦ１変異型
グループ１２：ＺＥＢ２変異／ＩＧＨ-ＣＥＢＰＥ融合型
グループ１３：ＴＣＦ３／４-ＨＬＦ融合型
グループ１４：ＮＵＴＭ１融合型
ＡＬＬは主にアドリアマイシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、メソトレキサート、シタラビン、ステロイド剤など多種類の抗がん剤を組み合わせて投与することにより、治療されるが、グループ１、６及び８のＡＬＬは予後不良であった。
グループ６の原因遺伝子であるＡＢＬ１（ABL Proto-Oncogene 1, Non-Receptor Tyrosine Kinase）とグループ８の原因遺伝子であるＫＭＴ２Ａ（Lysine Methyltransferase 2A）が酵素なのに対して、グループ１のＭＥＦ２Ｄ（Ｍyocyte Ｅnhancer Ｆactor 2）融合型は、ＭＥＦ２Ｄ（1q22）が転写因子であり、ＭＥＦ２Ｄが融合するＢＣＬ９Transcription Coactivator（1q21.2）やＨＮＲＮＰＵＬ１（Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein U Like 1）（19q13.2）も核内の局在する転写関連遺伝子であるため（非特許文献２）、分子標的薬を開発するのが難しかった。
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2018;115(50):E11711-E20
NATURE COMMUNICATIONS 2016 7:13331 | DOI: 10.1038/ncomms13331 |www.nature.com/naturecommunications
本発明は、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤を提供することを目的とする。
プレＢ細胞受容体（pre-B cell receptor）は、Ｂリンパ球の初期発生に不可欠な未成熟型Ｂ細胞受容体（B cell receptor; BCR）であり、膜結合型免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖、代替軽鎖、シグナル伝達サブユニットＩｇα/Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）で構成される。通常のＢ細胞の場合、細胞分化に伴い、膜結合型免疫グロブリン分子およびＩｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体（α／β）から構成される機能的Ｂ細胞受容体（B cell receptor; BCR）となる。本願発明者らは鋭意研究の結果、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の白血病細胞には、成熟したＢ細胞受容体でなく、プレＢ細胞受容体が発現していることを新たに発見し、プレＢ細胞受容体を介したシグナルを阻害することにより、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療できることを新たに見出した。
本発明は、以下の実施態様を含む。
［１Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を有効成分として含む、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療するための医薬組成物。
［２Ａ］ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ａ］に記載の医薬組成物。
［３Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［４Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［５Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［６Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［７Ａ］チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ａ］に記載の医薬組成物。
［８Ａ］カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ａ］に記載の医薬組成物。
［１Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を有効成分として含む、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療するための医薬組成物。
［２Ａ］ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ａ］に記載の医薬組成物。
［３Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［４Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［５Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［６Ａ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の医薬組成物。
［７Ａ］チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ａ］に記載の医薬組成物。
［８Ａ］カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ａ］に記載の医薬組成物。
［１Ｂ］ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病に罹患している患者において、前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療する方法であって、
１）前記患者において、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の染色体転座又は他の遺伝子との遺伝子融合を検出する工程と、
２）ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の染色体転座又は他の遺伝子との遺伝子融合を検出した前記患者に、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を投与する工程を含む方法。
［２Ｂ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｂ］に記載の方法。
［３Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［４Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［５Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［６Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［７Ｂ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｂ］に記載の方法。
［８Ｂ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｂ］に記載の方法。
１）前記患者において、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の染色体転座又は他の遺伝子との遺伝子融合を検出する工程と、
２）ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の染色体転座又は他の遺伝子との遺伝子融合を検出した前記患者に、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を投与する工程を含む方法。
［２Ｂ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｂ］に記載の方法。
［３Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［４Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［５Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［６Ｂ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［７Ｂ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｂ］に記載の方法。
［８Ｂ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｂ］に記載の方法。
［１Ｃ］ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病に罹患した患者における、前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療における使用のための、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤。
［２Ｃ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［３Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［４Ｃ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１
Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［５Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［６Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［７Ｃ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［８Ｃ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［２Ｃ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［３Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［４Ｃ］プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１
Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［５Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［６Ｃ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［７Ｃ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［８Ｃ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｃ］に記載の使用のための阻害剤。
［１Ｄ］ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療剤の製造における、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤の使用。
［２Ｄ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｃ］に記載の使用。
［３Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［４Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［５Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［６Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［７Ｄ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｄ］に記載の使用。
［８Ｄ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｄ］に記載の使用。
［２Ｄ］前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、［１Ｃ］に記載の使用。
［３Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［４Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、ＣＲＥＢ阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［５Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［６Ｄ］前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、［１Ｄ］又は［２Ｄ］に記載の使用。
［７Ｄ］前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、［３Ｄ］に記載の使用。
［８Ｄ］前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、［５Ｄ］に記載の使用。
本発明により、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤を提供できるようになった。
以下、本発明の好ましい実施の形態につき、添付図面を用いて詳細に説明するが、必ずしもこれに限定するわけではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＜医薬組成物＞
本発明の一実施態様は、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を有効成分として含む、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療するための医薬組成物である。なお、本明細書で用いられる「ＭＥＦ２Ｄ融合型」という用語は、白血病発症の原因として、白血病細胞がＭＥＦ２Ｄ遺伝子の全部または一部とＢＣＬ９、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＤＡＺＡＰ１、ＳＳ１８、ＣＳＦ１などの遺伝子の全部または一部との融合遺伝子を有することを意味するものとする。そして、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の全部または一部とＢＣＬ９遺伝子の全部または一部との融合遺伝子を有することをＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型などと称するものとし、他の融合遺伝子についても同様に表記する。
プレＢ細胞受容体シグナルとは、プレＢ細胞受容体から細胞内に伝達される、細胞増殖や細胞分化に関わるシグナルであり、その伝達には、ＳＦＫ（ＳＲＫ family kinase；ＬＹＮ，ＦＹＮ，およびＢＬＫ）、ＳＹＫ、ＰＩ３Ｋ（Phosphoinositide 3-kinase；PIK3 p110delta, PIK3CDを含む）、ＢＴＫ（Bruton's tyrosine kinase）、ＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase；ＥＲＫ１／２を含む）、ＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）、カルシニューリン（calcineurin）等が関与する。
したがって、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤は、これらのキナーゼやホスファターゼの阻害剤を含み、例えば、ＳＦＫ阻害剤、ＳＹＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＣＲＥＢ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、例えば、ダサチニブ（ＳＦＫ阻害剤）、ＰＲＴ０６２６０７（ＳＹＫ阻害剤）、イデラリシブ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、イブルチニブ（ＢＴＫ及びＢＬＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＡＰＫ阻害剤）、3-(3-Aminopropoxy)-N-(2-((3-((4-chloro-2-hydroxyphenyl)carbamoyl)naphthalen-2-yl)oxy)ethyl)-2-naphthamide（ＣＲＥＢ阻害剤）シクロスポリン（カルシニューリン阻害剤）、タクロリムス（カルシニューリン阻害剤）が挙げられる。
プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤は、プレＢ細胞受容体シグナル伝達に関与する因子の機能に直接影響する化合物またはその薬学的に許容可能な塩だけでなく、その因子の転写及び／又は翻訳を阻害するアンチセンスＮＡ、ｓｈＮＡ、ｓｉＮＡやｍｉＲＮＡであってもよい。その配列は、当業者であれば容易に設計できる。特に限定しないが、プレＢ細胞受容体の構成分子であるＩｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９ＢのアンチセンスＲＮＡが好ましい。あるいは、ＳＹＫ、ＢＴＫ、ＣＲＥＢなどの転写因子のアンチセンスＲＮＡやｍｉＲＮＡであってもよい。これらの核酸（ＮＡ）は、天然型ヌクレオチド（塩基としてアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンを有するＲＮＡ型リボヌクレオチド、あるいはアデニン、グアニン、チミン、シトシンを有するＤＮＡ型デオキシリボヌクレオチド）または非天然型ヌクレオチド（例えば、イノシンを有するヌクレオチド、天然型ヌクレオチドのα-エナンチオマー型など）から構成されてもよく、両方から構成されたキメラ分子であってもよいが、リボヌクレオチドからなるＲＮＡであることが好ましい。ヌクレオチドは、細胞に吸収しやすくしたり、ヌクレアーゼに分解されにくくしたりすることなどを目的とし、糖および/または塩基（プリンおよび/またはピリミジン）において修飾してもよい。糖の修飾としては、例えば1つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、アルキル、アミン、およびアジドによって置換されてもよく、エーテル化またはエステル化されてもよい。また、全体の糖が、アザ糖および炭素環糖アナログのような立体的および電子的に等価な構造に置換されてもよい。塩基の修飾としては、例えばアルキル化および/またはアシル化されてもよく、あるいは複素環式置換をうけていてもよい。
あるいはこれらの分子を認識して結合してその酵素活性などの活性を阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。
本発明の一実施態様は、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を有効成分として含む、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療するための医薬組成物である。なお、本明細書で用いられる「ＭＥＦ２Ｄ融合型」という用語は、白血病発症の原因として、白血病細胞がＭＥＦ２Ｄ遺伝子の全部または一部とＢＣＬ９、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＤＡＺＡＰ１、ＳＳ１８、ＣＳＦ１などの遺伝子の全部または一部との融合遺伝子を有することを意味するものとする。そして、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の全部または一部とＢＣＬ９遺伝子の全部または一部との融合遺伝子を有することをＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型などと称するものとし、他の融合遺伝子についても同様に表記する。
プレＢ細胞受容体シグナルとは、プレＢ細胞受容体から細胞内に伝達される、細胞増殖や細胞分化に関わるシグナルであり、その伝達には、ＳＦＫ（ＳＲＫ family kinase；ＬＹＮ，ＦＹＮ，およびＢＬＫ）、ＳＹＫ、ＰＩ３Ｋ（Phosphoinositide 3-kinase；PIK3 p110delta, PIK3CDを含む）、ＢＴＫ（Bruton's tyrosine kinase）、ＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase；ＥＲＫ１／２を含む）、ＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）、カルシニューリン（calcineurin）等が関与する。
したがって、プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤は、これらのキナーゼやホスファターゼの阻害剤を含み、例えば、ＳＦＫ阻害剤、ＳＹＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＣＲＥＢ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、例えば、ダサチニブ（ＳＦＫ阻害剤）、ＰＲＴ０６２６０７（ＳＹＫ阻害剤）、イデラリシブ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、イブルチニブ（ＢＴＫ及びＢＬＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＡＰＫ阻害剤）、3-(3-Aminopropoxy)-N-(2-((3-((4-chloro-2-hydroxyphenyl)carbamoyl)naphthalen-2-yl)oxy)ethyl)-2-naphthamide（ＣＲＥＢ阻害剤）シクロスポリン（カルシニューリン阻害剤）、タクロリムス（カルシニューリン阻害剤）が挙げられる。
プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤は、プレＢ細胞受容体シグナル伝達に関与する因子の機能に直接影響する化合物またはその薬学的に許容可能な塩だけでなく、その因子の転写及び／又は翻訳を阻害するアンチセンスＮＡ、ｓｈＮＡ、ｓｉＮＡやｍｉＲＮＡであってもよい。その配列は、当業者であれば容易に設計できる。特に限定しないが、プレＢ細胞受容体の構成分子であるＩｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９ＢのアンチセンスＲＮＡが好ましい。あるいは、ＳＹＫ、ＢＴＫ、ＣＲＥＢなどの転写因子のアンチセンスＲＮＡやｍｉＲＮＡであってもよい。これらの核酸（ＮＡ）は、天然型ヌクレオチド（塩基としてアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンを有するＲＮＡ型リボヌクレオチド、あるいはアデニン、グアニン、チミン、シトシンを有するＤＮＡ型デオキシリボヌクレオチド）または非天然型ヌクレオチド（例えば、イノシンを有するヌクレオチド、天然型ヌクレオチドのα-エナンチオマー型など）から構成されてもよく、両方から構成されたキメラ分子であってもよいが、リボヌクレオチドからなるＲＮＡであることが好ましい。ヌクレオチドは、細胞に吸収しやすくしたり、ヌクレアーゼに分解されにくくしたりすることなどを目的とし、糖および/または塩基（プリンおよび/またはピリミジン）において修飾してもよい。糖の修飾としては、例えば1つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、アルキル、アミン、およびアジドによって置換されてもよく、エーテル化またはエステル化されてもよい。また、全体の糖が、アザ糖および炭素環糖アナログのような立体的および電子的に等価な構造に置換されてもよい。塩基の修飾としては、例えばアルキル化および/またはアシル化されてもよく、あるいは複素環式置換をうけていてもよい。
あるいはこれらの分子を認識して結合してその酵素活性などの活性を阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。
＜医薬品＞
本医薬組成物を用いて製造する医薬品は、共溶媒系を含んでもよい。例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、水相、ＶＰＤ共溶媒系（３ｗ／ｖ％のベンジルアルコール、８ｗ／ｖ％の非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）、および６５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液）が挙げられるが、これらに限定されない。共溶媒系の割合は、それらの溶解度および毒性特性を著しく変化させることなく大幅に変化することができる。さらに、共溶媒成分の同一性は変更するこができる。例えば、他の界面活性剤をポリソルベート８０（商標）の代わりに使用してもよく、他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンに取って代わり、他の糖または多糖は、デキストロースと置き換わり得るが、これらに限定されない。
これらは、有効成分以外の様々な目的の各種成分を含有してもよい。例えば、１種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定化剤、コーティング剤、局所麻酔剤、等張化剤などが挙げられる。具体的には、賦形剤としては、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、アミラーゼ、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、カオリン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロース、滑石、珪酸、粘性パラフィン、ポリビニルピロリドンなどを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを、等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。
上記医薬の投与経路は、有効成分の剤形によって、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。いずれの場合も、経口経路、非経口経路のどちらであってもよい。非経口経路としては、静脈内投与、動脈内投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができる。局所投与の場合、くも膜下注入、脳室内注入、脳せき髄液内注入（例えば髄腔内注入）などが例示できる。脳関門の通過を考慮に入れて、全身投与と局所投与（特に、脳内投与）を併用してもよい。
剤形は、特に限定されず、上記投与経路に適した剤形であればよい。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができる。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
上記医薬に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定できる。用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択できる。
薬学的に許容可能な塩は、有機塩、無機塩、酸性塩、塩基性塩、金属塩、非金属塩、酸付加塩、塩基付加塩など様々な分類の塩や様々な態様の塩が考えられる。例としては、酢酸塩、酸性リン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、ゲンチシン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、二塩化水素化物、ヨウ化水素酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、糖酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、ジエタノールアミン塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
本医薬組成物を用いて製造する医薬品は、共溶媒系を含んでもよい。例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、水相、ＶＰＤ共溶媒系（３ｗ／ｖ％のベンジルアルコール、８ｗ／ｖ％の非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）、および６５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液）が挙げられるが、これらに限定されない。共溶媒系の割合は、それらの溶解度および毒性特性を著しく変化させることなく大幅に変化することができる。さらに、共溶媒成分の同一性は変更するこができる。例えば、他の界面活性剤をポリソルベート８０（商標）の代わりに使用してもよく、他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンに取って代わり、他の糖または多糖は、デキストロースと置き換わり得るが、これらに限定されない。
これらは、有効成分以外の様々な目的の各種成分を含有してもよい。例えば、１種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定化剤、コーティング剤、局所麻酔剤、等張化剤などが挙げられる。具体的には、賦形剤としては、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、アミラーゼ、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、カオリン、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロース、滑石、珪酸、粘性パラフィン、ポリビニルピロリドンなどを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを、局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを、等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。
上記医薬の投与経路は、有効成分の剤形によって、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。いずれの場合も、経口経路、非経口経路のどちらであってもよい。非経口経路としては、静脈内投与、動脈内投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができる。局所投与の場合、くも膜下注入、脳室内注入、脳せき髄液内注入（例えば髄腔内注入）などが例示できる。脳関門の通過を考慮に入れて、全身投与と局所投与（特に、脳内投与）を併用してもよい。
剤形は、特に限定されず、上記投与経路に適した剤形であればよい。例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができる。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
上記医薬に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定できる。用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択できる。
薬学的に許容可能な塩は、有機塩、無機塩、酸性塩、塩基性塩、金属塩、非金属塩、酸付加塩、塩基付加塩など様々な分類の塩や様々な態様の塩が考えられる。例としては、酢酸塩、酸性リン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、ゲンチシン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、二塩化水素化物、ヨウ化水素酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、糖酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、ジエタノールアミン塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
本実施例で用いた細胞株
Ｋａｓｕｍｉ−７（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ芽球性白血病細胞株）、Ｋａｓｕｍｉ−９（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ芽球性白血病細胞株）、Ｋａｓｕｍｉ−２（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）、ＮＡＬＬ−１（ｐｒｅＢＣＲ―型白血病細胞株）、およびＮＡＧＬ−１細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）は、ＪＣＲＢ細胞バンクから購入した。ＮＡＬＭ−１（ｐｒｅＢＣＲ＋フィラデルフィア染色体型白血病細胞株）およびＲｅｈ細胞（ｐｒｅＢＣＲ―白血病細胞株）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＮＡＬＭ６細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）はＤＳＭＺ（https://www.dsmz.de/）から入手した。ＡＴ２細胞（ｐｒｅＢＣＲ―細胞株）は、シカゴ大学より提供された。ＴＳ−２細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１型急性リンパ芽球性白血病細胞株）は、東京医科歯科大学医学研究所より提供された。
Ｋａｓｕｍｉ−７（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ芽球性白血病細胞株）、Ｋａｓｕｍｉ−９（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ芽球性白血病細胞株）、Ｋａｓｕｍｉ−２（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）、ＮＡＬＬ−１（ｐｒｅＢＣＲ―型白血病細胞株）、およびＮＡＧＬ−１細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）は、ＪＣＲＢ細胞バンクから購入した。ＮＡＬＭ−１（ｐｒｅＢＣＲ＋フィラデルフィア染色体型白血病細胞株）およびＲｅｈ細胞（ｐｒｅＢＣＲ―白血病細胞株）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＮＡＬＭ６細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型白血病細胞株）はＤＳＭＺ（https://www.dsmz.de/）から入手した。ＡＴ２細胞（ｐｒｅＢＣＲ―細胞株）は、シカゴ大学より提供された。ＴＳ−２細胞（ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１型急性リンパ芽球性白血病細胞株）は、東京医科歯科大学医学研究所より提供された。
本実施例で用いた臨床検体
名古屋大学病院または日本赤十字社名古屋第一病院で治療された、原発性Ｂ−ＡＬＬを有する４７歳の男性（症例１；ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型）、および１６歳の男性（症例２；ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９融合型）の白血病細胞試料を用いた。ＭＥＦ２Ｄ融合遺伝子はＲＴ−ＰＣＲによって検出され、配列を決定した。
名古屋大学病院または日本赤十字社名古屋第一病院で治療された、原発性Ｂ−ＡＬＬを有する４７歳の男性（症例１；ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型）、および１６歳の男性（症例２；ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９融合型）の白血病細胞試料を用いた。ＭＥＦ２Ｄ融合遺伝子はＲＴ−ＰＣＲによって検出され、配列を決定した。
試薬
本実施例で用いた、実験試薬、抗体、ｓｈＲＮＡ、プライマーなどは以下の表１〜表５に示す。
本実施例で用いた、実験試薬、抗体、ｓｈＲＮＡ、プライマーなどは以下の表１〜表５に示す。
Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞の作製
Ｋａｓｕｍｉ−７細胞に、１）ヒトＨＮＲＮＰＵＬ１遺伝子のストップコドンの下流を標的とするｇＲＮＡ（5'- GUGUGACCCAGAGGCUCCCGG -3'（配列番号１７））を発現するlentiCRISPR V2（＃52961、addgene、ウォータータウン、MA、USA）と、２）ヒトＨＮＲＮＰＵＬ１遺伝子のストップコドンの上流および下流のそれぞれ約1kbpを含むフラグメント、２Ａ配列(5'- gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggacc -3'（配列番号１８）)、及びＧＦＰのｃＤＮＡを含むpBluescript SKII（Agilent、カリフォルニア州サンタクララ）をトランスフェクトし、CRISPR-Cas９システムを使用して、カルボキシ末端に血球凝集素（ＨＡ）がタグとして結合した内因性ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合タンパク質を、２Ａ配列によりＧＦＰと共発現するようにゲノム編集したＫａｓｕｍｉ−７ＧＦＰ陽性細胞株を作製した（以降、Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞と呼ぶ）。
Ｋａｓｕｍｉ−７細胞に、１）ヒトＨＮＲＮＰＵＬ１遺伝子のストップコドンの下流を標的とするｇＲＮＡ（5'- GUGUGACCCAGAGGCUCCCGG -3'（配列番号１７））を発現するlentiCRISPR V2（＃52961、addgene、ウォータータウン、MA、USA）と、２）ヒトＨＮＲＮＰＵＬ１遺伝子のストップコドンの上流および下流のそれぞれ約1kbpを含むフラグメント、２Ａ配列(5'- gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggacc -3'（配列番号１８）)、及びＧＦＰのｃＤＮＡを含むpBluescript SKII（Agilent、カリフォルニア州サンタクララ）をトランスフェクトし、CRISPR-Cas９システムを使用して、カルボキシ末端に血球凝集素（ＨＡ）がタグとして結合した内因性ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１融合タンパク質を、２Ａ配列によりＧＦＰと共発現するようにゲノム編集したＫａｓｕｍｉ−７ＧＦＰ陽性細胞株を作製した（以降、Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞と呼ぶ）。
１．ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９とｐｒｅＢＣＲ＋Ｂ細胞の関係
ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９とＧＦＰを同時に発現させるため、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ（配列番号１９）をｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターにクローニングした。
胎児肝細胞（交尾後１４日、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を、１５％ＦＢＳ、幹細胞因子、Ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン−７、および２−メルカプトエタノールを添加したIscove’s Modified Dulbecco培地中で、ＯＰ９ストロマ細胞上で培養することにより、Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋ｐｒｏ−Ｂ細胞に分化させた。
Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋ｐｒｏ−Ｂ細胞に、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（±ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ）を含む組換えレトロウイルスを感染させ、ＧＦＰの発現をマーカーとして、感染した細胞を選別した。得られたｐｒｏ−Ｂ細胞（＋ＧＦＰ±ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ）を、致死量以下（２Ｇｙ）の放射線照射された免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウス（８〜１０週齢、雌）に静脈内移植（１ｘ１０７細胞）した（ＧＦＰｏｎｌｙ（Ｃｔｒ）：ｎ ＝１０；ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９：ｎ＝１１）。３週間後、骨髄細胞を回収し、分化したｐｒｅＢ細胞を検出するため、抗ｐｒｅＢＣＲ（プレＢ細胞受容体）抗体を用いてフローサイトメトリーを行った（図１Ａ）。
その結果、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現させたｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した場合（ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９）、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現させないｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した場合（ＧＦＰ−ｏｎｌｙ）に比べて有意にｐｒｅＢＣＲ陽性の細胞の割合が増えていた。これは、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９の発現が、ｐｒｅＢＣＲ＋細胞の増加させることを示している。
ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９とＧＦＰを同時に発現させるため、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ（配列番号１９）をｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターにクローニングした。
胎児肝細胞（交尾後１４日、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を、１５％ＦＢＳ、幹細胞因子、Ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン−７、および２−メルカプトエタノールを添加したIscove’s Modified Dulbecco培地中で、ＯＰ９ストロマ細胞上で培養することにより、Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋ｐｒｏ−Ｂ細胞に分化させた。
Ｂ２２０＋ｃ−Ｋｉｔ＋ｐｒｏ−Ｂ細胞に、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（±ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ）を含む組換えレトロウイルスを感染させ、ＧＦＰの発現をマーカーとして、感染した細胞を選別した。得られたｐｒｏ−Ｂ細胞（＋ＧＦＰ±ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９ｃＤＮＡ）を、致死量以下（２Ｇｙ）の放射線照射された免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウス（８〜１０週齢、雌）に静脈内移植（１ｘ１０７細胞）した（ＧＦＰｏｎｌｙ（Ｃｔｒ）：ｎ ＝１０；ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９：ｎ＝１１）。３週間後、骨髄細胞を回収し、分化したｐｒｅＢ細胞を検出するため、抗ｐｒｅＢＣＲ（プレＢ細胞受容体）抗体を用いてフローサイトメトリーを行った（図１Ａ）。
その結果、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現させたｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した場合（ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９）、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現させないｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した場合（ＧＦＰ−ｏｎｌｙ）に比べて有意にｐｒｅＢＣＲ陽性の細胞の割合が増えていた。これは、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９の発現が、ｐｒｅＢＣＲ＋細胞の増加させることを示している。
同じように調製したｐｒｏ−Ｂ細胞１ｘ１０７個を、致死量以下の放射線を照射（２Ｇｙ）した免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウス（８〜１０週齢、雌、各々ｎ＝５）に静脈注射によって移植した。生存率のカプラン・マイヤー分析は、R packages survival（バージョン2.44-1.1）を使用して行った（図１Ｂ）。
移植から１２０日後に、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現していない対照のｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した個体は健常なのに対して（点線）、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現しているｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した個体は、すでに死亡したか、又はひん死の状態であった（実線）。
ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現するｐｒｏ−Ｂ細胞を投与された２匹のマウス（マウスＡ及びマウスＢ）を死亡前に検査したところ、脾臓が肥大していることと骨髄中に多数のリンパ芽球が存在することが観察された(図１Ｃ)。そして、骨髄中の細胞を抗体を用いたフローサイトメトリーで分類分けしたところ、９０％以上がＧＦＰ＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞であり、ｐｒｅＢＣＲを発現していた（図１Ｄ）。
これは、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現したｐｒｏ−Ｂ細胞の投与がＡＬＬの病態（リンパ芽球の浸潤、脾臓などの腫大）を引き起こすことを示す。
移植から１２０日後に、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現していない対照のｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した個体は健常なのに対して（点線）、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現しているｐｒｏ−Ｂ細胞を移植した個体は、すでに死亡したか、又はひん死の状態であった（実線）。
ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現するｐｒｏ−Ｂ細胞を投与された２匹のマウス（マウスＡ及びマウスＢ）を死亡前に検査したところ、脾臓が肥大していることと骨髄中に多数のリンパ芽球が存在することが観察された(図１Ｃ)。そして、骨髄中の細胞を抗体を用いたフローサイトメトリーで分類分けしたところ、９０％以上がＧＦＰ＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞であり、ｐｒｅＢＣＲを発現していた（図１Ｄ）。
これは、ＭＥＦ２Ｄ−ＢＣＬ９を発現したｐｒｏ−Ｂ細胞の投与がＡＬＬの病態（リンパ芽球の浸潤、脾臓などの腫大）を引き起こすことを示す。
２．ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ細胞における、ｐｒｅＢＣＲの発現とＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の必要性
ｐｒｅＢＣＲの構成分子であるＩg膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９ＢのｓｈＲＮＡ（shIgm/Fw、shCD79A/Fw、shCD79B/Fw）をコードする二本鎖ＤＮＡをそれぞれ、ヒトＣＤ８の細胞外ドメインを共発現させるＣＳＩＩｈＵ６ＰＧＫｈＣＤ８ベクターのｈＵ６プロモーターの下流のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ部位に挿入することにより、各ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。それぞれのレンチウイルスベクターをウィルスエンベロープにパッケージングし、Centriprep-10K（Merk-Millipore、Darmstadt、Germany）を使用してレンチウイルスを濃縮した。得られたレンチウイルスをＫａｓｕｍｉ−７細胞に各々感染させ、ＭＡＣＳ磁気細胞分離システム（Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）と抗ヒトＣＤ８抗体（HIT8a; Biolegend、San Diego、CA、USA）を用いてｓｈＲＮＡが導入された細胞を分離した。
その結果、ｈＣＤ８陽性細胞の増殖は、Ｉg膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂの発現を各々抑制することにより、抑えられた（図２Ａ）。
ｐｒｅＢＣＲの構成分子であるＩg膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９ＢのｓｈＲＮＡ（shIgm/Fw、shCD79A/Fw、shCD79B/Fw）をコードする二本鎖ＤＮＡをそれぞれ、ヒトＣＤ８の細胞外ドメインを共発現させるＣＳＩＩｈＵ６ＰＧＫｈＣＤ８ベクターのｈＵ６プロモーターの下流のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ部位に挿入することにより、各ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。それぞれのレンチウイルスベクターをウィルスエンベロープにパッケージングし、Centriprep-10K（Merk-Millipore、Darmstadt、Germany）を使用してレンチウイルスを濃縮した。得られたレンチウイルスをＫａｓｕｍｉ−７細胞に各々感染させ、ＭＡＣＳ磁気細胞分離システム（Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）と抗ヒトＣＤ８抗体（HIT8a; Biolegend、San Diego、CA、USA）を用いてｓｈＲＮＡが導入された細胞を分離した。
その結果、ｈＣＤ８陽性細胞の増殖は、Ｉg膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂの発現を各々抑制することにより、抑えられた（図２Ａ）。
ＧＦＰに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＧＦＰ−１及びｓｈＲＮＡ−ＧＦＰ−２；表４）をコードする二本鎖ＤＮＡを、ＣＳＩＩｈＵ６ＰＧＫｈＣＤ８ベクターに挿入した。ＧＦＰｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターをウィルスエンベロープにパッケージングし、Centriprep-10K（Merk-Millipore、Darmstadt、Germany）を使用してレンチウイルスを濃縮した。レンチウイルスをＫ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞に感染させ、MACS磁気細胞分離システム（Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）と抗ヒトＣＤ８抗体（HIT8a; Biolegend、San Diego、CA、USA）を用いてＧＦＰｓｈＲＮＡを発現する細胞を分離した。コントロールとして（Ｃｔｒ）、ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡを代わりに用いて実験を行った（ｓｈＲＮＡ−Ｌｕｃｉ）。Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞では、ＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１とＧＦＰが一本のｍＲＮＡとして発現するので、ＧＦＰのｓｈＲＮＡによってＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１の発現を抑制することができる。
このようにしてＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１の発現を抑制した結果、Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞のＣＤ８陽性画分でのみＧＦＰが減少した（図２Ｂ）。なお、ＣＤ８陽性画分の細胞では、ｐｒｅＢＣＲの発現が減少し（図２Ｃ上段）、細胞増殖の抑制が生じており（図２Ｃ下段）、さらに細胞死（図２Ｄ）が生じていた。
これはＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の存在がｐｒｅＢＣＲの発現増強を介して、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬの症状（すなわち白血病細胞の増加）を引き起こし、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現を抑制することにより、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬの症状が抑えられることを示している。
このようにしてＭＥＦ２Ｄ−ＨＮＲＮＰＵＬ１の発現を抑制した結果、Ｋ７−ＨＡ−ＧＦＰ細胞のＣＤ８陽性画分でのみＧＦＰが減少した（図２Ｂ）。なお、ＣＤ８陽性画分の細胞では、ｐｒｅＢＣＲの発現が減少し（図２Ｃ上段）、細胞増殖の抑制が生じており（図２Ｃ下段）、さらに細胞死（図２Ｄ）が生じていた。
これはＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の存在がｐｒｅＢＣＲの発現増強を介して、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬの症状（すなわち白血病細胞の増加）を引き起こし、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現を抑制することにより、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬの症状が抑えられることを示している。
３．Ｅｘ ｖｉｖｏ薬物感受性アッセイ
本実施例では、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖が、チロシンキナーゼ阻害剤またはカルシニューリン阻害剤によって抑制されることを示す。
まず、ｐｒｅＢＣＲ−細胞株（ＡＴ２、ＮＡＬＬ−１、ＮＡＬＭ−１及びＲｅｈ）、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−２，ＮＡＧＬ−２及びＮＡＬＭ−６）、及びｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−７、Ｋａｓｕｍｉ９及びＴＳ−２）を、１×１０５個／ｍｌの密度で培養皿に播種し、各チロシンキナーゼ阻害剤（ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、及びイブルチニブ）、カルシニューリン阻害剤（タクロリムス）または溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下で３日間培養した。生細胞数を顕微鏡下でカウントし、生存細胞の割合を、対照を１として計算した。グラフはRパッケージggplot2（バージョン3.2.0）を使用して作成した（図３Ａ）。その結果、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、およびイブルチニブはいずれも、ｐｒｅ−ＢＣＲ陽性細胞の増殖を阻害したのに対し、ｐｒｅＢＣＲ陰性細胞の増殖は阻害しなかった。このことは、これらの化合物が、ｐｒｅ−ＢＣＲの下流のシグナル伝達経路をターゲットにして効果を発揮していることを示す。一方、タクロリムス（ＦＫ５０６）は、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株の増殖は阻害せず、他のシグナル伝達因子の阻害剤とは細胞増殖阻害のメカニズムが違うものと考えられた。
臨床検体由来の細胞（ｃａｓｅ−１、ｃａｓｅ−２）を用いた同様の実験でも、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、イブルチニブ及びタクロリムスによって、これらの細胞の細胞増殖が阻害された（図３Ｂ）。
一方、対照実験においては、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）などに投与されるヒストン脱アセチル化酵素阻害薬であるボリノスタットやパノビノスタットはすべての細胞株の増殖を阻害した（図３Ｃ）。
このように、これらのチロシンキナーゼ阻害剤またはカルシニューリン阻害剤は、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖を阻害する。このことは、これらの薬剤が、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
本実施例では、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖が、チロシンキナーゼ阻害剤またはカルシニューリン阻害剤によって抑制されることを示す。
まず、ｐｒｅＢＣＲ−細胞株（ＡＴ２、ＮＡＬＬ−１、ＮＡＬＭ−１及びＲｅｈ）、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−２，ＮＡＧＬ−２及びＮＡＬＭ−６）、及びｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−７、Ｋａｓｕｍｉ９及びＴＳ−２）を、１×１０５個／ｍｌの密度で培養皿に播種し、各チロシンキナーゼ阻害剤（ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、及びイブルチニブ）、カルシニューリン阻害剤（タクロリムス）または溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下で３日間培養した。生細胞数を顕微鏡下でカウントし、生存細胞の割合を、対照を１として計算した。グラフはRパッケージggplot2（バージョン3.2.0）を使用して作成した（図３Ａ）。その結果、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、およびイブルチニブはいずれも、ｐｒｅ−ＢＣＲ陽性細胞の増殖を阻害したのに対し、ｐｒｅＢＣＲ陰性細胞の増殖は阻害しなかった。このことは、これらの化合物が、ｐｒｅ−ＢＣＲの下流のシグナル伝達経路をターゲットにして効果を発揮していることを示す。一方、タクロリムス（ＦＫ５０６）は、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞株の増殖は阻害せず、他のシグナル伝達因子の阻害剤とは細胞増殖阻害のメカニズムが違うものと考えられた。
臨床検体由来の細胞（ｃａｓｅ−１、ｃａｓｅ−２）を用いた同様の実験でも、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ、イブルチニブ及びタクロリムスによって、これらの細胞の細胞増殖が阻害された（図３Ｂ）。
一方、対照実験においては、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）などに投与されるヒストン脱アセチル化酵素阻害薬であるボリノスタットやパノビノスタットはすべての細胞株の増殖を阻害した（図３Ｃ）。
このように、これらのチロシンキナーゼ阻害剤またはカルシニューリン阻害剤は、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖を阻害する。このことは、これらの薬剤が、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
４．生体内薬物感受性アッセイ
ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞であるＫａｓｕｍｉ−７細胞に、ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するレトロウイルス（MIG-Luciferase-IRES-GFP：Addgene＃75021）を感染させ、ＧＦＰ発現細胞を選別した。一方、ＮＳＧマウスに、２４時間間隔で２０ｍｇ／体重ｋｇのブスルファン（B2635、Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、USA）を２回、腹腔内注射することにより造血幹細胞を死滅させる前処理を行なった。このＮＳＧマウスに、５×１０６個のＧＦＰ発現細胞を静脈注射することによって移植した。このＧＦＰ発現細胞を移植したマウスに、３０ｍｇ／体重ｋｇ／日のダサチニブ（Dasatinib；Ｄａｓａ）、２５ｍｇ／体重ｋｇ／日のイブルチニブ（Ibrutinib；Ｉｂｒ）又はこれらの対照（Ｃｔｒ；溶媒のみ）を、経口胃管栄養法により移植後３５日間毎日与えた。ルシフェラーゼ活性をバイオルミネセンスイメージングにより観察した（図４Ａ）。
生存率のカプラン・マイヤー分析は、R packages survival（バージョン2.44-1.1）を使用して行った（図４Ｂ）。
その結果、ダサチニブ及びイブルチニブを投与した個体は、ルシフェラーゼ発現細胞数が減少し、生存率も上昇した。このように、チロシンキナーゼ阻害薬は、in vivoにおいても、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖を阻害する。このことは、これらのチロシンキナーゼ阻害薬が、in vivoでも、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞であるＫａｓｕｍｉ−７細胞に、ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するレトロウイルス（MIG-Luciferase-IRES-GFP：Addgene＃75021）を感染させ、ＧＦＰ発現細胞を選別した。一方、ＮＳＧマウスに、２４時間間隔で２０ｍｇ／体重ｋｇのブスルファン（B2635、Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、USA）を２回、腹腔内注射することにより造血幹細胞を死滅させる前処理を行なった。このＮＳＧマウスに、５×１０６個のＧＦＰ発現細胞を静脈注射することによって移植した。このＧＦＰ発現細胞を移植したマウスに、３０ｍｇ／体重ｋｇ／日のダサチニブ（Dasatinib；Ｄａｓａ）、２５ｍｇ／体重ｋｇ／日のイブルチニブ（Ibrutinib；Ｉｂｒ）又はこれらの対照（Ｃｔｒ；溶媒のみ）を、経口胃管栄養法により移植後３５日間毎日与えた。ルシフェラーゼ活性をバイオルミネセンスイメージングにより観察した（図４Ａ）。
生存率のカプラン・マイヤー分析は、R packages survival（バージョン2.44-1.1）を使用して行った（図４Ｂ）。
その結果、ダサチニブ及びイブルチニブを投与した個体は、ルシフェラーゼ発現細胞数が減少し、生存率も上昇した。このように、チロシンキナーゼ阻害薬は、in vivoにおいても、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖を阻害する。このことは、これらのチロシンキナーゼ阻害薬が、in vivoでも、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
５．ｐＢＣＲシグナルのＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現への影響
プレＢ細胞受容体の各構成分子（ＣＤ７９Ａ，Ｉｇ膜型μ鎖及びＣＤ７９Ｂ）；プレＢ細胞受容体シグナルの下流因子であるＳＹＫ（Spleen tyrosine kinase；非受容体型タンパク質チロシンキナーゼ）及び ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）；さらに下流の因子であるＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）の発現を阻害するｓｈＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ（表４）を、ヒトＣＤ８の細胞外ドメインを共発現したＣＳＩＩｈＵ６ＰＧＫｈＣＤ８ベクターのｈＵ６プロモーターの下流のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ部位に挿入することにより、各ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。ベクターをウィルスエンベロープにパッケージングし、Centriprep-10K（Merk-Millipore、Darmstadt、Germany）を使用してレンチウイルスを濃縮した。Ｋａｓｕｍｉ−７細胞にレンチウイルスを感染後、所定時間培養し、培養後の細胞に存在する各タンパク質をウェスタンブロッティングで検出した。
その結果、ＣＤ７９Ａ，Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ及びＢＴＫの発現をｓｈＲＮＡを用いて抑制することにより、それぞれの下流分子のリン酸化（ＣＲＥＢのリン酸化を含む）が減少し、さらにＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質量及びその転写量も減少し（図５Ａ、図５Ｂ）、細胞の増殖そのものも抑制された（図５Ｃ）。また、ＣＲＥＢの発現をｓｈＲＮＡを用いて抑制しても、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現が減少した（図５Ｄ）。チロシンキナーゼ阻害剤をＫａｓｕｍｉ−７細胞に投与すると、リン酸化ＣＲＥＢの量も減少した（図５Ｅ）。
このように、ｐｒｅＢＣＲの構成分子やｐｒｅＢＣＲシグナルの構成因子の発現を抑制することによって、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖が抑制される。このことは、ｐｒｅＢＣＲの構成分子やｐｒｅＢＣＲシグナルの構成因子の発現を抑制する分子が、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
プレＢ細胞受容体の各構成分子（ＣＤ７９Ａ，Ｉｇ膜型μ鎖及びＣＤ７９Ｂ）；プレＢ細胞受容体シグナルの下流因子であるＳＹＫ（Spleen tyrosine kinase；非受容体型タンパク質チロシンキナーゼ）及び ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）；さらに下流の因子であるＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）の発現を阻害するｓｈＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ（表４）を、ヒトＣＤ８の細胞外ドメインを共発現したＣＳＩＩｈＵ６ＰＧＫｈＣＤ８ベクターのｈＵ６プロモーターの下流のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ部位に挿入することにより、各ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。ベクターをウィルスエンベロープにパッケージングし、Centriprep-10K（Merk-Millipore、Darmstadt、Germany）を使用してレンチウイルスを濃縮した。Ｋａｓｕｍｉ−７細胞にレンチウイルスを感染後、所定時間培養し、培養後の細胞に存在する各タンパク質をウェスタンブロッティングで検出した。
その結果、ＣＤ７９Ａ，Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ及びＢＴＫの発現をｓｈＲＮＡを用いて抑制することにより、それぞれの下流分子のリン酸化（ＣＲＥＢのリン酸化を含む）が減少し、さらにＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質量及びその転写量も減少し（図５Ａ、図５Ｂ）、細胞の増殖そのものも抑制された（図５Ｃ）。また、ＣＲＥＢの発現をｓｈＲＮＡを用いて抑制しても、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現が減少した（図５Ｄ）。チロシンキナーゼ阻害剤をＫａｓｕｍｉ−７細胞に投与すると、リン酸化ＣＲＥＢの量も減少した（図５Ｅ）。
このように、ｐｒｅＢＣＲの構成分子やｐｒｅＢＣＲシグナルの構成因子の発現を抑制することによって、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ融合型細胞の増殖が抑制される。このことは、ｐｒｅＢＣＲの構成分子やｐｒｅＢＣＲシグナルの構成因子の発現を抑制する分子が、ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型の白血病の治療に有効であることを示す。
６．チロシンキナーゼ阻害剤のＭＥＦ２Ｄ融合型細胞への影響
ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株である、Ｋａｓｕｍｉ−７、Ｋａｓｕｍｉ−９及びＴＳ−２、ならびに臨床検体細胞に、チロシンキナーゼ阻害剤を投与した。７２時間培養後の細胞に存在するＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現をウェスタンブロッティングで調べた。
図６Ａに示すように、ダサチニブ（Ｄａｓａ）、ＰＲＴ０６２６０７（ＰＲＴ）及びイブルチニブ（Ｉｂｒ）は、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現を抑制した。また、図６Ｂに示すように、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７及びイブルチニブは、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株において、ｐｒｅＢＣＲの発現を抑制したものの、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株においては、ｐｒｅＢＣＲの発現を抑制しなかった。
このように、チロシンキナーゼ阻害剤は、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株において、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現を抑制する。これは、チロシンキナーゼ阻害剤がＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現を抑制することを介して、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株の細胞の増殖を阻害し得ることを示す。
ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株である、Ｋａｓｕｍｉ−７、Ｋａｓｕｍｉ−９及びＴＳ−２、ならびに臨床検体細胞に、チロシンキナーゼ阻害剤を投与した。７２時間培養後の細胞に存在するＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現をウェスタンブロッティングで調べた。
図６Ａに示すように、ダサチニブ（Ｄａｓａ）、ＰＲＴ０６２６０７（ＰＲＴ）及びイブルチニブ（Ｉｂｒ）は、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質の発現を抑制した。また、図６Ｂに示すように、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７及びイブルチニブは、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株において、ｐｒｅＢＣＲの発現を抑制したものの、ｐｒｅＢＣＲ＋非ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株においては、ｐｒｅＢＣＲの発現を抑制しなかった。
このように、チロシンキナーゼ阻害剤は、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株において、ＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現を抑制する。これは、チロシンキナーゼ阻害剤がＭＥＦ２Ｄ融合タンパク質およびｐｒｅＢＣＲの発現を抑制することを介して、ｐｒｅＢＣＲ＋ＭＥＦ２Ｄ−ＡＬＬ型細胞株の細胞の増殖を阻害し得ることを示す。
本発明により、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療方法及び治療剤を提供することができる。
Claims (9)
- プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤を有効成分として含む、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病を治療するための医薬組成物。
- 前記ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病が、ＭＥＦ２Ｄ-ＢＣＬ９融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＨＮＲＮＰＵＬ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ-ＤＡＺＡＰ１融合型急性リンパ性白血病、ＭＥＦ２Ｄ−ＳＳ１８融合型急性リンパ性白血病、またはＭＥＦ２Ｄ-ＣＳＦ１Ｒ融合型急性リンパ性白血病である、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
- 前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）阻害剤である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
- 前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、カルシニューリン阻害剤である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
- 前記プレＢ細胞受容体シグナル阻害剤が、Ｉｇ膜型μ鎖、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＳＹＫ、ＢＴＫ又はＣＲＥＢのアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、ＰＲＴ０６２６０７、イデラリシブ又はイブルチニブである、請求項３に記載の医薬組成物。
- 前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスである、請求項５に記載の医薬組成物。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含有する、ＭＥＦ２Ｄ融合型急性リンパ性白血病の治療剤。
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