JP2021121216A - Ｐｄ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片 - Google Patents

Abstract

【課題】抗腫瘍のためのＰＤ−１/ＰＤ−Ｌｓシグナル伝達経路を遮断できる抗体を提供する。【解決手段】ヒトＰＤ−１のタンパク質に特異的に結合する親抗ヒトＰＤ−１マウスモノクローナル抗体に基づき、クローニング、同定、および遺伝子構造の分析により、そのＣＤＲ領域の配列を確認し、構築したキメラ抗体及びヒト化抗体。抗体は、特定の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３からなる軽鎖ＣＤＲ、特定の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３からなる重鎖ＣＤＲを含む。【選択図】図４

Description

相互参照

本願は、２０１６年０９月１４日に中国特許庁へ提出された、出願番号がＣＮ２０１６１０８２７０９９．１、発明の名称が「ＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。

本発明は、医学・生物学的技術及びヒト化抗体修飾の研究分野に関し、具体的には、ＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片に関する。

プログラム細胞死−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１、ＰＤ−１）は、近年大きな注目を集めている免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）となり、Ｔ細胞活性化の調節に主に関与し、免疫応答の強さ及び持続期間を調節することができる。正常な状態には、ＰＤ−１は、生体組織の自己免疫寛容を仲介・維持し、炎症反応中の免疫系の過剰な活性化による自己組織の損傷を防止し、自己免疫疾患の発生を回避するのに積極的な役割を果たし、病理学的状態には、腫瘍免疫および種々の自己免疫疾患の発生・進行に関与する（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７−１３．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４Ｍａｒ；７（１）：１−１７．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４−３３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３Ｊｕｌ ２５；３９（１）：６１−７３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１９７４−８２．）。

ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーのメンバーに属するが、ＣＤ２８ファミリーの他のメンバー、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合二量体を形成できるＣＴＬＡ４と異なり、ＰＤ−１は、単量体として存在する。ＰＤ−１の構造は、主に細胞外免疫グロブリン可変領域様ドメイン、疎水性膜貫通領域、及び細胞内領域を含み、その細胞内領域は、独立した２つのリン酸化部位を含み、それぞれ免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）である。ＰＤ−１は、主に活性化Ｔ細胞の表面に誘導され、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＤＣ細胞にも発現している。ＰＤ−１のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ−Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ２）を含み、そのリガンドは、Ｂ７ファミリーに属し、中でも、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣ細胞、及び内皮細胞、表皮細胞などを含む複数種の免疫細胞の表面に誘導されているが、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージ、ＤＣ細胞、Ｂ細胞を含む幾つかの免疫細胞のみに誘導されている（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ，２０１３，１２（１１）：１０９１−１１００．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，４：４８１．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２（４）：２５２−２６４．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４−３３．）。

腫瘍研究では、ＰＤ−Ｌ１は、黒色腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱がん、食道癌、胃癌、膵臓癌、腸癌などを含む複数種の腫瘍表面に高発現し、ＰＤ−Ｌ２は、Ｂ細胞リンパ腫に高発現していることがわかった。腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の高発現を介してＴ細胞上のＰＤ−１に結合し、免疫抑制シグナルを伝達し、腫瘍細胞への生体の免疫寛容をもたらすことにより、腫瘍細胞の増殖および転移に寄与する。ＰＤ−１リガンドの高発現は、癌患者における予後不良および薬剤耐性と密接に関連して
いる（Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．２０１４Ｍａｒ；７（１）：１−１７．）。また、研究では、ＰＤ−１がＴ細胞の表面、特に、腫瘍細胞に浸潤しているＴ細胞の表面にアップレギュレートされることは、予後不良とも密接に関連している（Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４−３３．）。

抗腫瘍のためにＰＤ−１/ＰＤ−Ｌｓシグナル伝達経路を遮断できる抗体を開発するこ
とは、最近の注目点となる。臨床的には、抗ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌｓ抗体は、以下のような
２つの明らかな特徴がある。即ち、第一、薬効は、特定の腫瘍タイプに限定されず、広範囲の腫瘍に対する強力かつ長期にわたる抗腫瘍効果を持ち、ますます多くの種類の腫瘍が臨床評価に入るにつれて、この特徴はさらに検証されることになる。第二、これらの抗体は、安全性が非常に良く、化学療法薬及び分子標的薬の一般的な副作用、例えば、疲労、白血球減少症、禿頭症、下痢、発疹などを起こすことがなく、幾つかの免疫関連副作用のみがある。ＰＤ−１抗体ｎｉｖｏｌｕｍａｂは進行性黒色腫、非小細胞肺癌および腎細胞癌の治療薬として市販され、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕａｍｂは、進行性黒色腫、非小細胞肺癌の治療薬として市販されている。因みに、現在では、抗ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌｓ抗体の良
好な抗腫瘍効果は、少数の患者のみに有益であり、大部の患者は先天的な薬剤耐性を有し、または二次耐性が生じる（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ Ｐａｒｋ）．２０１４Ｎｏｖ；２８Ｓｕｐｐｌ ３：１５−２８．）。
これに鑑み、特に本発明を提案した。

本発明は、得られたヒトＰＤ−１のタンパク質に特異的に結合する親抗ヒトＰＤ−１マウスモノクローナル抗体に基づき、クローニング、同定、および遺伝子構造の分析により、そのＣＤＲ領域の配列を確認し、対応するキメラ抗体及びヒト化抗体を構築しつつ、対応する真核細胞発現系を樹立し、そのキメラ抗体及びヒト化抗体を生産して精製する。

本発明に係る上記の目的を達成するために、特に、以下の技術案を採用する。
ＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片において、前記の抗体又は抗体の機能的断片は、軽鎖及び重鎖を含み、
前記軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３からなる軽鎖ＣＤＲを持ち、前記重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３からなる重鎖ＣＤＲを持ち；
前記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６で表され、前記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９で表され、
好ましくは、前記の抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片、並びにＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片を含む（前記の抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片を含み、或いは、前記の抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片を含むことも理解すべきである）。
好ましくは、前記抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片、並びにＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片を含む（前記の抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片を含み、或いは、前記の抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片を含むことも理解すべきである）。

抗体の結合特異性および親和性はいずれも主にＣＤＲ配列によって決定されることは、
当技術分野において周知であり、非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を周知の成熟した既存技術により容易に変更して、類似の生物学的活性を有する変異体を取得する。本発明に係る上記ＣＤＲ配列と完全に同じなＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体の変異体は、それが本発明に係るヒト化抗体と完全に同じなＣＤＲ配列を有するために、類似する生物学的活性を持つ。
好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、前記抗体は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤからなる群より選ばれるいずれか１種の定常領域の配列を含む。

好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、前記機能的断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位(ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ，ＭＲＵ)からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。
本発明に係る「機能的断片」とは、特に、ＰＤ−１に対して親抗体と同じな特異性を持つ抗体断片を意味する。上記機能的断片に加えて、半減期が延長した任意の断片も含まれる。
ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）。

それらの機能的断片は、通常、それらが由来する抗体と同じな結合特異性を有する。当業者は、本発明に係る抗体の断片は、例えば、酵素消化の方法（ペプシンまたはパパインを含む）、及び/又はジスルフィド結合を化学的に還元して開裂させる方法により上記機
能的断片を取得することができることを本発明の説明に記載の内容から推測する。
抗体の断片は、当業者に周知の遺伝子組換え技術、又は自動ペプチド合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどにより販売される自動ペプチド合成装置により、ペプチド合成により取得されることもできる。

好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、前記ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表される。
さらに好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、前記ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域配列及び重鎖定常領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される。

好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４を含み、重鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含む。
前記ＦＲ−Ｌ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１番目のアミノ酸Ｄは、Ｅに置き換えられ、
２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
１３番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
１９番目のアミノ酸Ａは、Ｖに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
６番目のアミノ酸Ｐは、Ｓに置き換えられ、
７番目のアミノ酸Ｇは、Ｈに置き換えられ、
９番目のアミノ酸Ａは、Ｓに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
２２番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
２４番目のアミノ酸Ｐは、Ｔに置き換えられ、
２８番目のアミノ酸Ａは、Ｇに置き換えられ、
３１番目のアミノ酸Ｆは、Ｙに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換により得られたアミノ酸配列から選ばれ、
７番目のアミノ酸Ｖは、Ｌに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
前記ＦＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
５番目のアミノ酸Ａは、Ｔに置き換えられ、
１４番目のアミノ酸Ａは、Ｓに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１２番目のアミノ酸Ｎは、Ｔに置き換えられ、
１４番目のアミノ酸Ｙは、Ｈに置き換えられ、
１８番目のアミノ酸Ｎは、Ｓに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
一般的に、ウス抗体のＣＤＲをヒト抗体フレームワークに移植し、配列相同性が高いヒト抗体フレームワークを選択することはある程度の成功率を有する。しかしながら、多くのＣＤＲ移植は、一定の抗体活性を回復させるために復帰突然変異を必要とすることが研究により示されている。如何に適切なヒト抗体フレームワークを選択するのは、主なボトルネックである。

ＣＤＲは、抗原結合に主な関連部位であるが、多数の場合には、ＦＲ（フレームワーク，Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）は結合部位コンフォメーションに大きな影響を及ぼす。高親和性ヒト化抗体を得るために、本発明は、適切なＦＲ領域を選択しながら、関連するＦＲ残基をマウス由来アミノ酸又は同じな作用があるヒトに見出されるアミノ酸に復帰させる必要がある。
好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５−３６のいずれか１つで表され、
好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７−４２のいずれか１つで表され、
さらに好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１で表され、
或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２で表され、
さらに好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域配列及び重鎖定常領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される。

因みに、本願で上記に開示されているアミノ酸配列の以外は、キメラ抗体及びヒト化抗体の産生は、当業者が任意の公知の方法、例えば、免疫されたマウスまたは骨髄腫細胞と融合した他の種の脾臓細胞の骨髄腫細胞によって分泌されるマウス抗体の配列決定されたＣＤＲにより設計された組換えヒト化抗体により達成することができる。上記免疫された動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有してヒト抗体を直接産生するトランスジェニックマウスを含んでもよい。他の可能な実施形態は、ファージディスプレイ技術を使用して
ライブラリーをスクリーニングすることを含んでもよい。

単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、以下の核酸から選ばれる。
Ａ）上記のような抗体及びその機能的断片をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、
Ｂ）Ａ）で定義された核酸に相補的な核酸、から選ばれる単離された核酸分子。
上記のような核酸を含むベクター。
本発明は、さらに、上記のような核酸分子をコードする少なくとも１つの核酸構築物を含み、その核酸構築物は、好ましくはベクターであり、さらに好ましくは発現ベクターであり、例えば、プラスミドであり、そのベクターの構築方法は本願に係る１つの実施例において説明する。
上記のようなベクターで形質転換された宿主細胞。
上記宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である。
ＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片を生産する方法において、
培地において適切な培養条件下で上記のような宿主細胞を培養するステップと、
培地又は培養された宿主細胞からこのようにして産生された抗体及びその機能的断片を回収するステップと、
を含む方法。

上記のような抗体和/或その機能的断片、又は前記抗体と他の成分とからなる化合物、
又は前記抗体の機能的断片と他の成分とからなる化合物を有効成分とする組成物。
好ましくは、上記のような組成物、前記抗体及びその機能的断片は少なくとも１種の診断薬及び/又は治療薬とカップリングして免疫複合体を形成する。
好ましくは、上記のような組成物において、前記診断薬は、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識物、超音波造影剤、光増感剤からなる群より選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記放射性核種は、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ及び^８３Ｓｒからなる群より選ばれる１種又は複数種である。

好ましくは、前記常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム （ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム （ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム （ＩＩＩ）からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。
好ましくは、前記蛍光標識は、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ
４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０/６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０/６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６−ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、トリス（ビピリジル)ジアミン‐ユウロピウム、ユウロピウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ビシアニン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ Ｄｙｅ、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、Ｒ-フィコエリトリン、Ｃ-フィコシアニン、フィコエリスリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群より選ばれる１種又は複数種である。

好ましくは、上記のような組成物において、前記治療薬は、裸抗体、細胞毒性薬、薬物、放射性核種、ホウ素原子、免疫調節剤、抗アポトーシス剤、光増感性治療薬、免疫複合体及びオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記薬物は、メトトレキサート、フルオロウラシル、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、シタラビン、メクロレタミン、シクロホスファミド、チオテパ、シスプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、カンプトテシン、ポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、セファロタキシン及びＬ−アスパラギナーゼからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる１種又は複数種である。

好ましくは、前記免疫調節剤は、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び幹細胞増殖因子からなる群より選ばれる１種又は複数種である。
ここで、前記サイトカインは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニールヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びＬＴからなる群より選ばれる１種又は複数種であることが好ましい。

前記ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β及びＩＰ−１０からなる群より選ばれる１種又は複数種であることが好ましい。
好ましくは、前記放射性核種は、 ^１１１Ｉｎ、^１１１Ａｔ、^１７７Ｌｕ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^１１１Ａｇ、^６７Ｇａ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１５２Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６１Ｈｏ、^１６６Ｈｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、
^９９Ｍｏ、^１０５Ｒｈ、^１４９Ｐｍ、^１６９Ｅｒ、^１９４Ｉｒ、^５８Ｃｏ、^８０ｍＢｒ、^９９ｍＴｃ、^１０３ｍＲｈ、^１０９Ｐｔ、^１１９Ｓｂ、^１８９ｍＯｓ、^１９２Ｉｒ、^２１９Ｒｎ、^２１５Ｐｏ、^２２１Ｆｒ、^２５５Ｆｍ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^７５Ｂｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２２４Ａｃ、^７７Ｂｒ、^１１３ｍＩｎ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^２０３Ｈｇ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１６５Ｔｍ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１９７Ｐｔ、^１０９Ｐｄ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１６１Ｔｂ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^２０１Ｔｌ、^７６Ｂｒ及び^１６９Ｙｂからなる群より選ばれる１種又は複数種である。

上記のような組成物の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、並びに腫瘍を予防及び／又は治療するための薬物の調製における応用。
好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎
、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれか１種である。
好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれか１種である。

好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれか１種である。
上記のような抗体及びその機能的断片の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬物の調製における応用。

自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療する薬物であって、上記のようなＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片、並びに薬学的に許容されるベクターを含有し、
又は、上記のような組成物、及び薬学的に許容されるベクターを含有する薬物。

ここで、「薬学的に許容される」という用語とは、化合物がヒトに投与された場合に生理学的に許容され、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応、またはそれらのアレルギー反応と類似する全身性アレルギー反応を引き起こさないことを意味する。
本発明では、「薬学的に許容されるベクター」は、バインダー（例えば、微結晶セルロース、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、デンプン、ショ糖、グルコース及び無水乳酸）、崩壊剤（例えば、架橋ＰＶＰ、架橋カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム、及び低置換度ヒドロキシプロピルセルロース）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウ）、湿潤剤（例えば、グリセリン）、界面活性剤（例えば、セチルアルコール）、及び吸収促進剤、矯味剤、甘味剤、希釈剤、コーティング剤などを含むが、これらに限定されない。

上記のような抗体及びその機能的断片の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍の予防及び／又は治療における応用。
好ましくは、上記のような自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様
疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎 、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性
甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれか１種である。

好ましくは、上記のような神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれか１種である。
好ましくは、上記のような腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれか１種である。

自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療する方法において、上記のような薬物を個体に投与することを含む方法。
好ましくは、上記個体は、ヒトである。

本発明の具体的な実施形態又は従来技術に係る技術案をより明らかに説明するために、以下、具体的な実施形態又は従来技術の説明で使用する必要がある図面を簡単に述べ、下記の説明における図面は、本発明の幾つかの実施形態であり、当業者は、いかなる創造的な作業もなしにそれらの図面に従って他の図面を得ることが明らかになる。

図１は、本発明に係る実施例１における番号２のクローンによって分泌されたモノクローナル抗体のとヒトＰＤ−１に対する結合活性を示す図である。 図２は、本発明に係る実施例１における番号２のクローンによって分泌されたモノクローナル抗体の、ヒトＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１結合に対するブロッキング活性を示す図である。 図３は、本発明に係る実施例３における抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体のヒトＰＤ−１に対する結合活性を示す図である。 図４は、本発明に係る実施例４における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の種特異性を示す図である。 図５は、本発明に係る実施例４における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の結合特異性を示す図である。 図６は、本発明に係る実施例５における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の、ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ２結合に対するブロッキング活性を示す図である。 図７は、本発明に係る実施例６における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体のＴ細胞機能調節活性を示す図である。 図８は、本発明に係る実施例７における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体のラット単回静脈内注射後の薬物血中濃度−時間曲線を示す図である。 図９は、本発明に係る実施例８における抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す図である。

以下、実施例を参照しながら本発明の実施態様をさらに詳細に説明し、しかしながら、当業者は、下記の実施例が、本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解すべきである。実施例において具体的な条件を明記されないものは、通常の条件又は製造業者によって推奨される条件に従って行われる。使用する試薬又は機器が製造元を明記していないものは、いずれも市販で入手可能な通常の製品で
ある。

実施例１ マウス由来抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の調製
１．１、動物免疫
実験動物は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスを選択した。マウスを環境に１週間慣れさせた後、免疫し始めた。初回免
疫は、組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃ タンパク質１００μｇと完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｆ５８８１）を使用し、十分に混合してエマルジョンを形成し、マウスに腹腔内注射した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃ タンパク質５０μｇと不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｆ５８０６）を使用し、十分に混合してエマルジョンを形成し、マウスに腹腔内注射した。２週間おきに同様の方法で追加免疫し、追加免疫を合計で３回行った。最終免疫後７日目に、マウスの後眼窩静脈叢から採血して血清を遠心分離し、抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。高い力価のマウスを選択して融合させてハイブリドーマを作製した。融合の３日前に、組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃタンパク質 ５０μｇをアジュバントなしで腹腔内注射した。融合当日に、脾臓を無菌的に取り出し、単一脾臓細胞懸濁液を作製し、融合のために用意した。

１．２、ハイブリドーマ細胞の調製
対数増殖期の骨髄腫細胞ＳＰ２/０を採用し、１０００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清
を捨て、細胞を不完全ＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ Ｎｏ．１１９６５）で懸濁した後、計数し、必要な細胞数を取り出し、不完全培養液で２回洗浄した。同時に免疫脾臓細胞の懸濁液を調製し、不完全培養液で２回洗浄した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを割合で１：１０又は１：５の比率で混合させ、５０ｍｌのプラスチック製遠心分離管中で不完全培養液で、１２００ｒｐｍで、８分間で１回洗浄した。上清を捨て、スポイトで残存液を吸い出した。沈殿した細胞をほぐして均一化させるために、手掌上に遠心管の底を軽くタップし、４０℃水浴に置いて予熱した。１ｍｌのスポイトで１分間程度（最適時間が４５秒間）をかけて４０℃に予熱された４５％のＰＥＧ−４０００（ＰＨ ８．０、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ７１８１）１ｍｌを添加しながら軽く撹拌し（スポイトで撹拌し）、目視観察で目に見える粒子が見えるはずである。１０ｍｌのスポイトを用いて９０ｓ内で３７℃に予熱された不完全培地 ２０〜３０ｍｌを添加してＰＥＧの作用を停止させ、２０〜３７℃で１０分間静置した。１０００ｒ/ｍｉｎで５分間遠心し、上清を捨てた。５ｍｌのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ+ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ Ｎｏ．１Ｈ０２６２−１０ＶＬ）を加え、沈殿した細胞を軽く吹かし・吸い（融合した細胞が広がらないように強く吹かないことを注意）、懸濁させ、均一に混合し、その後、脾臓細胞の濃度が１〜２×１０^６/ｍｌとなるように、８０〜１００ｍｌとなるまでにＨＡＴ培地を追加した。９６ウェル細胞培養プレートを１ウェル当たり０．１ｍｌずつ分注し、２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．０〜１．５ｍｌずつ分注し、その後、培養プレートを３７℃で置き、６％ ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。一般的に、９６ウェルプレートを６枚敷いた。５日後、１/２の培地をＨＡＴ培地と交換した。さらに、７〜１０日後でＨＡＴ培地をＨＴ培地（ＤＭＥＭ+ＨＴ、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ０１３７−１０ＶＬ）と交換した。ハイブリドーマ細胞の増殖状況をしばしば観察し、ウェルの底部の面積の１/１０以上までに増殖する時に上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。

１．３、クローンのグスクリーニング及び同定
ＥＬＩＳＡは、ハイブリドーマ培養上清における抗ヒトＰＤ−１抗体をグスクリーニングするために用いられる。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社、品番１０３７７−Ｈ０８Ｈ）を被覆し、被覆濃度は１μｇ/ｍＬであり、被
覆量は、１ウェル当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間
インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性対照血清を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、品番Ａｂ７０６８）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μＬ/ウェルで比色基質ＴＭＢを加え、室温で１０分間発色させた。１００μＬ/ウェルで１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加え、発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強さに基づいて抗ヒトＰＤ−１結合抗体を分泌することができる陽性クローンを選択した。

ＥＬＩＳＡは陽性クローンによって分泌された抗ヒトＰＤ−１抗体がＰＤ−１/ＰＤ−
Ｌ１の結合を阻害できるか否かを測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃを被覆し、被覆濃度は１μｇ/
ｍＬであり、被覆量は、１ウェル当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、
２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。抗ヒトＰＤ−１抗体サンプル及び陽性対照を１ウェル当たり５０μＬ加え、ビオチン標識ＰＤ−Ｌ１を加え、濃度が２０ｎＭ（最終濃度が１０ｎＭ）で、１ウェル当たり５０μＬ加え、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００で希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、品番５５４０６６）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μＬ/ウェルで比色基質ＴＭＢを加え、室温で１０分間発色させた。１００μＬ/ウェルで１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加え、発色を停止させた。
４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ヒトＰＤ−１−Ｆｃ/ビオチン標識ＰＤ−Ｌ１の結合を阻害できる抗ヒトＰＤ−１抗体は、中和活性を持つ
。ブロッキング能の強さに基づいて抗ヒトＰＤ−１中和抗体を分泌することができる陽性クローンを選択した。
結果は、図１に示すように、番号２のクローンは、強いヒトＰＤ−１結合活性を持ち、図２に示すように、番号２のクローンは、同時に強いヒトＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１結合ブロ
ッキング活性も持つ。

１．４、モノクローナル抗体配列の決定
グスクリーニングされた抗原結合活性と抗原中和活性とを併せ持つクローンについて抗体ＤＮＡ配列の決定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４３０）を用いて細胞ｍＲＮＡを抽出した。手順は以下の通りであり、即ち、懸濁細胞１×１０^７を収集して３００×ｇで５ｍｉｎ遠心させ、細胞を遠沈管に収集し、全ての培地上清を慎重に吸い出した。すぐに溶解ステップを行った。遠沈管の底部を軽く弾いて細胞ペレットをはぐし、適量のライセートＲＬ ６００ｕＬを加え、旋回・振動させた。全ての溶液をろ過カラムＣＳ上（ろ過カラムＣＳが収集チューブにセットされている）に移し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で２ｍｉｎ遠心し、濾液を収集した。濾液に７０％ エタノールを１倍体積（一般的に、３５０μｌ又は６００μｌ）で加え、均一に混合して得られた溶液を沈殿とともに吸着カラムＣＲ３に移し（吸着カラムＣＲ３が収集チューブにセットされている）、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブに戻した。吸着カラムＣＲ３に除蛋白液ＲＷ１を３５０μｌ加え、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。吸着カラムＣＲ３の中央に８０μｌのＤＮａｓｅ Ｉ溶液を加え、室温で１５ｍｉｎ放置した。吸着カラムＣＲ３に３５０μｌの除蛋白液ＲＷ１を加え、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。吸着カラムＣＲ３に５００μｌの洗浄液ＲＷ（使用前にエタノールを加えたか否かを検査）を加え、室温で２ｍｉｎ静置し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。１２，０００ｒｐｍ（〜１３、４００×ｇ）で２ｍｉｎ遠心させ、廃液を排出し。吸着カラムＣＲ３を室温で数分間放置し、吸着材に残った洗浄液を徹底的に乾かした。吸着カラムＣＲ３を新たなＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ遠沈管に移し、３０〜１００μｌのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ｄｄＨ_２Ｏを加えて室温で２ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）２ｍｉｎ遠心し、ＲＮＡ溶液を得た。

ＱｕａｎｔＳｃｒｉｐｔ ＲＴキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＫＲ１０３）を用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成した。手順は以下の通りであり、即ち、氷上でテンプレートＲＮＡを解凍し、プライマー、１０×ＲＴ ｍｉｘ（ここで、ＲＮａｓｉｎ及びＤＴＴを含み）、Ｓｕｐｅｒ ｐｕｒｅ ｄＮＴＰ混合液、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ｄｄＨ_２Ｏを室温（１５〜２５℃）で解凍した後、すばやく氷上にセットした。使用前に、各種の溶液を旋回・振動させて均一に混合し、短時間遠心して管壁に残った液体を収集した。表１の逆転写システムに従って混合液（天根生物Ｑｕａｎｔ ｃＤＮＡの第一鎖合成キット、品番ＫＲ１０３−０４、１０倍濃度の逆転写バッファー ２μＬ、超純ｄＮＴＰ ２μＬ、ランダムプライマー ２μＬ、逆転写酵素 １μＬ）を調製し、よく均一に混合し、旋回・振動時間が５ｍｉｎ以下である。短時間遠心し、氷上に置き、最後にテンプレートＲＮＡ（５０ｎｇ〜２μｇ）を混合液に加え、よく均一に混合し、旋回・振動時間が５ｓｅｃ以下であり、短時間遠心して管壁に残った液体を収集した。３７℃で６０ｍｉｎインキュベートした。逆転写により産生されたｃＤＮＡの第一鎖を次のＰＣＲ反応に使用した。
ＰＣＲ反応で用いられるプライマーは、表１に示した。

プライマーを使用する場合に、ＶＨ ｐｒｉｍｅｒ中のいずれかの上流プライマーは、いずれかの下流プライマーと配合されて使用することができ、同様にＶＬ ｐｒｉｍｅｒ中のいずれかの上流プライマーは、いずれかの下流プライマーと配合されて使用することもできる。ＰＣＲ増幅で得られた目的のバンドをｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。単一クローンを選別してＤＮＡシークエンシングを行った。

実施例２ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の調製
ＰＣＲ増幅により得られた抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表される。マウス可変領域配列からフレームワーク領域配列を除外した後、その相補性決定領域配列を取得し、そのうち、軽鎖の３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５及び６で表され、重鎖の３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９で表される。上記の可変領域配列を真核細胞発現ベクターＸ０ＧＣにクローンニングし、抗体の軽鎖定常領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表され、抗体の重鎖定常領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される。抗体の軽鎖（軽鎖の全長配列は、抗体の軽鎖可変領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と連結することによって得られる）及び重鎖（重鎖の全長配列は、抗体の重鎖可変領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と連結することによって得られる）の発現ベクターを２９３Ｆ細胞株（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ^ＴＭ ２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ、品番Ｒ７９００７，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に細胞を接種し、トランスフェクション当日に細胞を遠心して收集し、細胞を新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３発現培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、品番１２３３８００１、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、細胞密度が２００×１０^５ｃｅｌｌｓ/ｍＬであった。トランスフェクション容量に従って最終濃度が３６．６７ｕｇ/ｍＬとなるように、プラスミドを加え、軽く混合して均一化した後、最終濃度が５５ｕｇ/ｍＬとなるように、線状ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線状、Ｍ．Ｗ．２５０００、品番４３８９６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を加え、軽く混合して均一化した。その後、細胞培養インキュベーター内に入れ、１２０ｒｐｍのシェーカーで３７℃で１時間インキュベートした。そして、１９倍のトランスフェクション容量の新鮮な培地を加えた。１２０ｒｐｍのシェーカーで３７℃でインキュベートし続けた。５〜６日にトランスフェクトした細胞培養上清を遠心して収集した。

実施例３ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体とヒトＰＤ−１との結合活性及び結合動力学定数
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＰＤ−１との結合活性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社から購入され）を被覆し、被覆濃度は１μｇ/ｍＬであり、被覆量は、１ウェル
当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートし
た。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで配列が希釈した抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体サンプル、及びモノクローナル抗体対照であるペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を、１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１: ２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室
温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止し
た。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図３に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、良好なヒトＰＤ−１結合親和力、及びペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）と類似している結合活性を持つ。

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００により抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＰＤ−１とが結合する結合動力学定数を検出する。その装置は、光学的な表面プラズモン共鳴技術によりバイオチップに架橋・被覆された分子と被験分子の間の結合及び解離を検出した。用いられた主な試薬は、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１０００−１２）である。実験過程は、簡単に説明すると、抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体をランニングバッファー（１×ＨＢＳ−ＥＰ+１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０，ｐＨ７．４）で２μｇ/ｍＬに希釈した後、１０μＬ/ｍｉｎの速度で抗ヒトＩｇＧが固定されたＣＭ５チップに注入し、６０秒間持続した。結合階段では、抗原ＰＤ−１用ランニングバッファーを複数の濃度に希釈し、それぞれ３０μＬ/ｍｉｎの速度で１８０秒間注入し、解離階段では、解離時間は、１２００秒間である。再生条件は、グリシン塩溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００３−５４）、１０μＬ/ｍｉｎの速度で３０秒間再生させた。対照抗体を分析する実験方法は、解離時間を６００秒に調整した以外、同様にした。結合動力学定数及び解離動力学定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析して算出した。抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の結合動力学定数、解離動力学定数、及び解離平衡定数は、表２に示した。データにより、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）と比較して、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体がＰＤ−１抗原と結合した後、結合状態を長時間にわたって維持でき、解離しにくく、これは、その生物学的機能に対して非常に有利である。

実施例４ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１、サルＰＤ−１、ラットＰＤ−１及びマウスＰＤ−１（いずれもＢｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社から購入）を被覆し、被覆濃度が１μｇ/ｍｌであり、被覆量が１００μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃
で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで配列が希釈した抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体サンプル、及び対照を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴに１:２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ
標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２（いずれもＢｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社から購入）を被覆し、被覆濃度が１μｇ/ｍｌであり、被覆量が１０
０μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含
むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした
。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで配列が希釈した抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体サンプル、及び対照を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴに１:２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈ
ｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加
え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を
停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図４に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、ヒトＰＤ−１及びサルＰＤ−１に結合でき、且つ親和力が類似しているが、ラット、マウスＰＤ−１に結合せず、種特異性がある。同時に、図５に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、さらに、強い結合特異性も持ち、ＰＤ−１にのみ結合し、ＣＤ２８ファミリーでの他のメンバーに結合しなく、さらに、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合しない。

実施例５ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のＰＤ−１ブロッキング及びリガンド結合の活性
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１−Ｆｃを被覆し、被覆濃度が１μｇ/ｍｌであり、被覆量が１００μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。抗ヒトＰＤ−１抗体サンプル及び陽性対照を１ウェル当たり５０μＬ加え、濃度が２０ｎＭ（最終濃度１０ｎＭ）となるようにビオチン標識ＰＤ−Ｌ１を加え、又は濃度が３２０ｎＭ（最終濃度１６０ｎＭ）となるようにビオチン標識ＰＤ−Ｌ２を１ウェル当たり５０μＬ加え、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００で希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、品番５５４０６６）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図６に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）と類似しているＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−
１/ＰＤ−Ｌ２ブロッキング活性を有する。

実施例６ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のＴ細胞機能調節活性
実験で用いられたＰＢＭＣは、Ｌｏｎｚａから購入され、品番がＣＣ−２７０２である。
まず、ＰＢＭＣによるＤＣ細胞の誘導は、ＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ １６４０+
１０％ＦＢＳ）で回復させ、次いで無血清培地で１回洗浄し、無血清培地に再懸濁し、細胞培養フラスコに接種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした。９０分間後、非接着細胞及び培地を除去し、接着単球を完全培地と交換して培養し、１００ｎｇ/ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ及び１００ｎｇ/ｍＬ ＩＬ−４を加えて培養し、３日後に培養液を１回交換し、さらに３日培養し、次いで培地を完全培地に交換し、１００ｎｇ/ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ/ｍＬ ＩＬ−４及び２０ｎｇ/ｍＬ ＴＮＦ−ａｌｐｈａを加えて１日培養し、ＤＣ細胞の誘導を完成させた。さらに、他の個体由来ＰＢＭＣからのＴ細胞の単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（品番５１５０４１４８２０）を使用してＴ細胞を単離し、具体的な実験過程は、説明書を参照した。誘導された成熟ＤＣ細胞を１ウェルあたり１０，０００細胞で９６ウェルプレートに播種し、単離されたＴ細胞を１ウェルあたり１００，０００細胞で加え、最後に、被験すべきサンプルを加え、共に１２０時間インキュベートした。インキュベート終了時に、上清を採取し、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈから購入されたＥＬＩＳＡキットによりＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇａｍｍａ（ＩＦＮ−γ）のレベルを検出した。
結果は、図７に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、ＭＬＲ系でＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇａｍｍａ（ＩＦＮ−γ）の分泌を亢進させることができ、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）と類似しているＴ細胞機能調節活性を持つ。

実施例７ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のラット体内での薬物動態研究
実験材料は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＳＤラットを選択した。ラットを環境に１週間慣れさせた後、無作為に群分けし、１群当たり３匹である。各群は、それぞれ抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を投与し、投与量がいずれも２０ｎｍｏｌ/ｋｇであり、静脈内注射で単回投与した。０時に投与後５分間、３０分間、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３１２時間で眼窩から採血し、抗凝固処理を行わず、血液サンプルを室温で３０分間〜１時間放置し、血液凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた血清サンプルを−８０℃で凍結保存し、測定のために用意した。

ＥＬＩＳＡにより血清中の抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の濃度を測定した。簡単に説明すると、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて４℃でヒト組換えＰＤ−１タンパク質を高吸着型ＥＬＩＳＡプレートに一晩被覆した。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的結合を防止するために、５％ 脱脂粉乳含有ＰＢＳＴでそのプレートをブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。そして、１０％ 混合ラット血清、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した被検血清サンプルを加えて２５℃で１時間インキュベートし、そのプレートをＰＢＳＴで洗浄した。５％ 脱脂粉乳含有ＰＢＳＴに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を加えて２５℃で１時間インキュベートし、そのプレートをＰＢＳＴで洗浄した。最後に、比色基質ＴＭＢを用いて室温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図８に示すように、用量が２０ｎｍｏｌ/ｋｇである抗ヒトＰＤ−１キメラモ
ノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の単回静脈内投与は、ラット体内において類似する薬物血中濃度−時間曲線及び薬物動態学的特性を示した。抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体の薬物動態学的パラメータは、半減期ｔ _１/２が２１２時間であり、薬物血中濃度−時間曲線下面積ＡＵＣ
_{０−３１２ｈｒ}が３３９６７ｎＭ．ｈｒであり、推定ゼロ濃度Ｃ _０が４６４ｎＭであり、見かけの分布容積Ｖ _ｄが１１８ｍＬ/Ｋｇであり、クリアランスＣＬが０．３９ｍ
Ｌ/ｈｒ/ｋｇであり、平均滞留時間ＭＲＴ _ｌａｓｔが１１９時間である。

実施例８ キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果研究
本実施例は、ＰＢＭＣヒト化マウスに接種されたＨＣＣ８２７異種移植片に対するキメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の増殖阻害作用を検出した。
実験材料は、６〜８週齡の雌性ＮＣＧ免疫不全マウスを選択し、南京銀河生物医薬有限公司から購入された。マウスを環境に１週間慣れさせた後、１匹マウス当たり１×１０^７個のＨＣＣ８２７ヒト非小細胞肺癌細胞（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センターから購入）を接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３となる場合には、腫瘍体積に従って群分けし、１群当たり６匹のマウスであり、それぞれ溶媒対照群、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体投与群、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）投与群とした。各マウスに５×１０^６個のヒトＰＢＭＣ細胞を静脈内注射し、免疫系ヒト化マウスを作成し、その後、群分けで溶媒又は抗体を投与し、用量７０ ｎｍｏｌ/ｋｇで腹腔内投与（ｉ．ｐ．）し、１週２回投与を３週連続した。投与日から腫瘍体積を週３回測定し、長径ａ、短径ｂを計測し、腫瘍体積の計算式：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２）/
２。
結果は、図９に示すように、抗ヒトＰＤ−１キメラモノクローナル抗体は、抗腫瘍活性を有し、ＰＢＭＣヒト化マウス体内でのＨＣＣ８２７非小細胞肺癌移植片の増殖を阻害し、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）に匹敵するかそれよりやや強い抗腫瘍効果を示した強い抗腫瘍効果を示す。

実施例９ ヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の調製
ヒト化型の抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇ者ら（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３−２７）の方法により得られたものである。
在Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースからマウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチするヒト化テンプレートを選別し、中でも、軽鎖可変領域のテンプレートは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３で表されるＩＧＫＶ３−１１*０１であり、重鎖可変領域的テンプレー
トは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で表されるＩＧＨＶ３−２３*０４である。マウ
ス由来抗体ＣＤＲ領域を選別されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト由来テンプレートのＣＤＲ領域を置き換え、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で表される移植されたヒト化抗体軽鎖可変領域、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で表される移植されたヒト化抗体重鎖可変領域を得た。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６において部位を選択して復帰突然変異を行い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のＣＤＲ１領域においてＮＱＳ部位を選択して突然変異を行い、可能性があるグリコシル化部位を除去し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表される新たなＣＤＲ−Ｌ１配列を得、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５−３６で表される軽鎖可変領域配列を得、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７−４２で表される重鎖可変領域配列を得た。軽鎖可変領域を軽鎖定常領域（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と連結し、それぞれ対応する軽鎖全長配列を得、重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）と連結し、それぞれ対応する重鎖全長配列を得た。親和力及び安定性スクリーニングにより利用可能なヒト化配列を得た。親和力及び安定性スクリーニングにより得られた利用する可能なヒト化配列、得られたヒト化配列の軽鎖及び重鎖の可変領域配列情報は、表３に示した。

実施例１０ ヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏの生物学的活性
ヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体は、ヒトＰＤ−１と結合する活性、及びＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１結合に対するブロッキング活性を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの生物学的活性
を測定した。測定されたヒト化配列は、ＡＨ００２９０、ＡＨ００２９１、ＡＨ００２９３、ＡＨ００２９４、ＡＨ００２９５、ＡＨ００２９６、ＡＨ００２９８、ＢＭIII、ＢＭIV、ＡＨ００２９０−Ｎ２６Ｑ、ＡＨ００２９１−Ｎ２６Ｓ、ＡＨ００２９１−Ｓ２８Ａ、ＡＨ００２９４−Ｎ２６Ｑ、ＡＨ００２９４−Ｎ２６Ｓ、ＡＨ００２９４−Ｓ２８Ａ、ＡＨ００２９６−Ｎ２６Ｑ、ＡＨ００２９６−Ｎ２６Ｓ、ＡＨ００２９６−Ｓ２８Ａを含み、測定方法は、ＥＬＩＳＡであり、具体的な実験過程がキメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の測定方法と同様である。
実験結果は、表４に示した。キメラ抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体よりも、測定されたヒト化配列は、いずれも活性をよく維持し、強いＰＤ−１結合活性及びＰＤ−１/Ｐ
Ｄ−Ｌ１ブロッキング活性を示した。

実施例１１．モレキュラーシーブ高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によるヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の純度及びその熱安定性の検出
ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００クロマトグラフ用カラム（品番：００１８６７５）を使用し、移動相は、０．１ｍｏｌ/Ｌ リン酸塩緩衝液（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、０．１ｍｏｌ/Ｌ 硫酸ナトリウム緩衝液であり、ｐＨが６．７となり、流速は、０．３５ｍＬ/ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は４℃であり、検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液でサンプルを１ｍｇ/ｍＬに希釈し、サンプルロード量は、５μＬである。実験結果に対してＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ１２６０システムワークステーションによりデータ処理を行い、面積正規化法によりメインピークの割合を純度として算出した。上記調製されたヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体にはＳＥ−ＨＰＬＣ純度検出を行った。それらのモノクローナル抗体の熱安定性を確認するために、上記サンプルを４０℃の高温条件下で置き、２週目及び４週目にそれぞれ試料を採取し、ＳＥ−ＨＰＬＣ検出を行って熱安定性を観察した結果は以下の表５に示した。ヒト化抗ヒトＰＤ−１抗体は、ＡＨ００２９６−Ｓ２８Ａを除い
て、いずれも良く且つ相当な安定性を示した。

実施例１２．ヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のＴｍ値の測定
示差走査型蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ，ＤＳＦ）を採用してヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の変性温度（Ｔｍ）を測定した。ＤＳＦは、蛍光指示薬の蛍光強度変化によりサンプルにおけるタンパク質の熱変性過程を検出する方法であり、タンパク質変性温度の測定を実現した。用いられた試薬は、米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入さえたＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅタンパク質蛍光色素（品番：Ｓ５６９２、５０００倍濃度、溶媒ＤＭＳＯ）である。装置は、米国のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入されたＡＢ ７５００Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムである。タンパク質蛍光色素をサンプル緩衝液で１：５０に希釈し、１μｌの希釈後の色素をそれぞれ１９μｌのタンパク質溶液と混合し、蛍光色素の最終希釈倍率が１：１０００であり、９６ウェルプレートに加え、各サンプルについて３つの平行なウェルを設けた。光学封止フィルムでプレートを封止し、１０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し、気泡を除去した。ＲＴ−ＰＣＲ装置の設定は以下の通りであり、即ち、融解曲線は、連続取り込みモードを採用し、走査温度範囲が２５〜９９℃であり、昇温速率が１％（約１℃/ｍｉｎ）であり、２５℃で２ｍｉｎ平衡化させ、昇温中にデータを収集し、レポーターとしてＲＯＸを選択し、クエンチャーとしてＮｏｎｅを選択し、反応容量が２０μｌである。サンプルの測定濃度は、１ｍｇ/ｍｌであり、参照溶液は、サンプルの緩衝液である。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ ^ＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３ソフトウエアを用いて蛍光曲線及びその一次微分曲線をプロットした。ＤＳＦによる試験では、通常、タンパク質の第一転移中点温度をタンパク質製剤の熱安定性の変性温度とする。下記の表６に示すように、上記調製されたヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体はＴｍ値を測定した。結果は下表に示した。ヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体は、いずれも良いＴｍ値を持つ。

実施例１３．イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によるヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の電荷変異体の検出
陽イオン交換クロマトグラフ用カラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ−１０，４ｍｍ×２５０ｍｍ（品番：７８６５５）を用いて、２０ｍｍｏｌ/Ｌ モルホリノエタンスルホン酸（２
−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ/Ｌ 塩化ナトリウムを移動相Ａとし、２０ｍｍｏｌ/Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ/Ｌ 塩化ナトリウムを移動相Ｂとして、流速が０．５ｍＬ/ｍｉｎであり、カラム温度が２５℃であり、サンプルセル温度：４℃、検出波長が２８０ｎｍであり、サンプルロード量が５０μｌ（１ｍｇ/ｍＬ）であり、５〜５０％の直線的濃度勾配で６０分間溶出させた。実験結果はＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ１２６０システムワークステーションによりデータ処理を行い、面積正規化法でピーク面積百分率を算出した。上記調製されたヒト化抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体にはＣＥＸ検出を行った。それらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確認するために、上記サンプルを４０℃高温条件下で置き、２週目及び４週目にそれぞれ試料を採取してＣＥＸ検出を行い、電荷変異体の割合の変化を観察した結果は、表７に示された。ヒト化抗ヒトＰＤ−１抗体は、ＡＨ００２９６−Ｓ２８Ａを除いて、電荷変異体の割合変化がいずれも低い。

最後に、以上の各実施例は、本発明に係る技術案のみを説明するためのみであり、制限的ではなく、上記各実施例を参照して本発明を詳しく説明したものの、当業者にとっては、上記各実施例に記載の技術案を修正したり、そのうちの一部又は全部の技術特徴を同等に置き換えることができ、それらの修正又は置き換えは、対応する技術案の主旨が本発明に係る各実施例の技術案の範囲から逸脱することなくなされることを理解すべきである。

本発明で提供された抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１に特異的に結合し、自己免疫疾患（例えば、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎など）、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病など）、並びに腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫等）などの予防及び/又は治療に適用することができる。

Claims (15)

1. ＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片であって、
   前記抗体及びその機能的断片は、軽鎖及び重鎖を含み、
   前記軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３からなる軽鎖ＣＤＲを持ち、前記重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３からなる重鎖ＣＤＲを持ち、
   前記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：１、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５及び６で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６で表され、前記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９で表され、
   好ましくは、前記抗体及びその機能的断片は、ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片、並びにＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片を含む、
   ことを特徴とするＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片。
2. 前記抗体は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれか１種の定常領域配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体及びその抗体機能的断片。
3. 前記機能的断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、及び抗体の最小認識単位の１種又は複数種を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体及びその機能的断片。
4. 前記ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、または、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表され、
   好ましくは、前記ＰＤ−１キメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域の配列及び重鎖定常領域の配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗体及びその機能的断片。
5. 前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４を含み、重鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含み、
   前記ＦＲ−Ｌ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
   １番目のアミノ酸Ｄは、Ｅに置き換えられ、
   ２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
   １３番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
   １９番目のアミノ酸Ａは、Ｖに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｌ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
   ６番目のアミノ酸Ｐは、Ｓに置き換えられ、
   ７番目のアミノ酸Ｇは、Ｈに置き換えられ、
   ９番目のアミノ酸Ａは、Ｓに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｌ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表されるアミノ酸配列、又は以下の置
   換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
   ２２番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
   ２４番目のアミノ酸Ｐは、Ｔに置き換えられ、
   ２８番目のアミノ酸Ａは、Ｇに置き換えられ、
   ３１番目のアミノ酸Ｆは、Ｙに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｌ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換により得られたアミノ酸配列から選ばれ、
   ７番目のアミノ酸Ｖは、Ｌに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
   前記ＦＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
   ５番目のアミノ酸Ａは、Ｔに置き換えられ、
   １４番目のアミノ酸Ａは、Ｓに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ
   １２番目のアミノ酸Ｎは、Ｔに置き換えられ、
   １４番目のアミノ酸Ｙは、Ｈに置き換えられ、
   １８番目のアミノ酸Ｎは、Ｓに置き換えられ、
   前記ＦＲ−Ｈ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
   好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５−３６のいずれか１つで表され、
   好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７−４２のいずれか１つで表され、
   更に好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：３７で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：２９で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１で表され、
   或いは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で表され、それの対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２で表され、
   更に好ましくは、前記ＰＤ−１ヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域配列及び重鎖定常領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗体及びその機能的断片。
6. 単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、以下の核酸から選ばれることを特徴とする核酸分子。
   Ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の抗体及びその機能的断片をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、
   Ｂ）Ａ）で定義された核酸に相補的な核酸。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体及び/又はその機能的断片、又は前記抗体と他の
   成分とからなる化合物、又は前記抗体の機能的断片と他の成分とからなる化合物を有効成分とする、ことを特徴とする組成物。
8. 前記抗体及びその機能的断片は、少なくとも１種の診断薬及び/又は治療薬とカップリ
   ングして免疫複合体を形成する、ことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
9. 前記診断薬は、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識物、超音波造影剤、光増感剤からなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
   好ましくは、前記放射性核種は、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^{１３
   １}Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ及び^８３Ｓｒからなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
   好ましくは、前記常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム （ＩＩＩ）、バナ
   ジウム（ＩＩ）、テルビウム （ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（Ｉ
   ＩＩ）及びエルビウム （ＩＩＩ）からなる群より選ばれる１種又は複数種を含み、
   好ましくは、前記蛍光標識は、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ
   ４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０/６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０/６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６−ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、トリス（ビピリジル)ジアミン‐ユウロピウム、ユウロピ
   ウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ビシアニン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ Ｄｙｅ、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、Ｒ-フィコエリトリン、Ｃ-フィコシアニン、フィコエリスリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群より選ばれる１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
10. 前記治療薬は、裸抗体、細胞毒性薬、薬物、放射性核種、ホウ素原子、免疫調節剤、抗アポトーシス剤、光増感性治療薬、免疫複合体、オリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記薬物は、メトトレキサート、フルオロウラシル、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、シタラビン、メクロレタミン、シクロホスファミド、チオテパ、シスプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、カンプトテシン、ポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、セファロタキシン、及びＬ−アスパラギナーゼからなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記免疫調節剤は、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び幹細胞増殖因子からなる群より選ばれる１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記放射性核種は、^１１１Ｉｎ、^１１１Ａｔ、^１７７Ｌｕ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^１１１Ａｇ、^６７Ｇａ、^１５３Ｓｍ、^１６１
    Ｔｂ、^１５２Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６１Ｈｏ、^１６６Ｈｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｒｈ、^１４９Ｐｍ、^１６９Ｅｒ、^１９４Ｉｒ、^５８Ｃｏ、^８０ｍＢｒ、^９９ｍＴｃ、^１０３ｍＲｈ、^１０９Ｐｔ、^１１９Ｓｂ、^１８９ｍＯｓ、^１９２Ｉｒ、^２１９Ｒｎ、^２１５Ｐｏ、^２２１Ｆｒ、^２５５Ｆｍ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^７５Ｂｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２２４Ａｃ、^７７Ｂｒ、^１１３ｍＩｎ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^２０３Ｈｇ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１６５Ｔｍ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１９７Ｐｔ、^１０９Ｐｄ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１６１Ｔｂ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^２０１Ｔｌ、^７６Ｂｒ及び^１６９Ｙｂからなる群より選ばれる１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項８又は９に記載の組成物。
11. 請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬物の調製における応用であって、
    好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎
    、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれかの１種である応用。
12. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体及びその機能的断片の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬物の調製における応用であって、
    好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎
    、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれかの１種である応用。
13. 自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬物であって、
    前記薬物は、請求項１〜５のいずれかに記載のＰＤ−１に特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片、並びに薬学的に許容されるベクターを含み、
    又は、前記薬物は、請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物、及び薬学的に許容されるベクターを含み、
    好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎
    、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれかの１種である、ことを特徴とする薬物。
14. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体及びその機能的断片の、自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍の予防及び／又は治療における応用であって、
    好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症様疾患、シェーグレン症候群、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性多発動脈炎
    、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット症候群、及び慢性甲状腺炎からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群より選ばれるいずれかの１種であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞癌、及び黒色腫からなる群より選ばれるいずれかの１種である応用。
15. 請求項１４に記載の薬物を個体に投与することを特徴とする自己免疫疾患、移植片に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患、及び腫瘍を予防及び／又は治療する方法。

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