JP2021119146A - 膵管腺ガンを有する被験体のリスクを評価するための早期かつ非侵襲的な方法及びこのような疾患の処置方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膵管腺ガン(PDAC)を予防又は治療するための方法に関する。本発明はまた、膵管腺ガン(PDAC)の診断方法に関する。より具体的には、本発明は、膵臓ガンを有する被験体のリスクを評価するための方法であって、前記被験体から得られた血液サンプル中のβig−h3タンパク質レベルを測定する工程を含み、該βig−h3レベルが、膵管腺ガンを有する前記被験体のリスクと正に相関する方法に関する。
膵管腺ガン(PDAC)は最も致命的なヒト悪性腫瘍であり、主な健康問題である。PDACは、フランスでは年間約10,000件及び全世界では230,000件の死亡を引き起こす(Jemal et al, 2003)。発生率/死亡率の比はほぼ1であるが、これは、PDACを示す事実上全ての患者が疾患によって死亡することを示している。これは、処置が比較的非効率的であり、疾患が進行状態で診断されたために、約6カ月間という短い平均生存期間(全ての腫瘍で最も短い)に起因する。過去数十年間にわたる相当な研究努力にもかかわらず、手術、放射線、化学療法又はこれらの組み合わせを含む従来の処置アプローチは、影響が非常に限定的であった。予後は悲惨であり、診断後1年間生存する患者はわずか20%である(Jemal et al, 2003)。この状況を考慮して、PDAC進行を遅らせて患者の平均余命及び生活の質を増加させる新たな処置の探索が最優先されている。
本明細書では、本発明者らは、血清βig−h3レベルとPDAC患者からの生物学的所見との間の相関関係を調査した。驚くべきことに、本発明者らは、1)マウス及びヒトの両方の膵臓新生物における腫瘍間質では、ガン関連線維芽細胞(CAF)によってβig−h3タンパク質が高度に産生されること;2)PDAC体質のマウスモデル及びPDAC患者における膵臓新生物病変の腫瘍形成では、βig−h3が非常に早期(PanIN1、PanIN2及びPanIN3ステージ)に発現されること、3)膵臓新生物病変を発症したマウスの血清では、βig−h3が分泌され、検出され得ること、4)活性化特性及び細胞傷害特性を減少させることによって、βig−h3がCD8+T細胞に対して直接作用すること、5)CD8+T細胞の表面において、βig−h3がCD61と相互作用すること、6)PDACマウスモデルにおける中和βig−h3抗体の使用が、CD8+T細胞抗腫瘍応答を増強することによって、腫瘍成長を減少させたこと、並びに7)in vivoにおけるβig−h3中和効果のために、CD8+T細胞が必須であることを見出した。これらの結果は、βig−h3が抗腫瘍CD8+T細胞応答遮断に寄与することを示している。したがって、PDACにおける新規免疫学的チェックポイントターゲットとして作用するβig−h3の中和は、膵臓ガンにおける有益な抗腫瘍免疫の回復を可能にする。
本発明の第1の態様は、膵管腺ガン(PDAC)を有し又は発症する被験体のリスクを評価するための方法であって、前記被験体から得られた血液サンプル中のβig−h3タンパク質レベルを測定する工程を含み、該βig−h3レベルが、膵管腺ガンを有する前記被験体のリスクと正に相関する方法からなる。
1つ以上の本発明の組織特異的生物学的マーカーの発現レベルに対する薬剤(例えば、薬物化合物)の影響のモニタリングは、患者の処置膵管腺ガンの悪性効力を経時的にモニタリングするために適用され得る。例えば、βig−h3発現に影響を及ぼす薬剤の有効性は、抗ガン処置、特に化学療法処置を受けている被験体の処置中にモニタリングされ得る。
−t1において前記被験体から得られた第1の血液サンプル中のβig−h3レベルを測定する工程、及び
−t2において前記被験体から得られた第2の血液サンプル中のβig−h3レベルを測定する工程
を含み、
−t1が治療前である場合、t2は治療中又は治療後であり、及び
−t1が治療中である場合、t2はより後の治療中又は治療後であり、
第1のサンプル中のβig−h3レベルと比較した第2のサンプル中のβig−h3レベルの減少が、処置被験体における膵管腺ガンに対する治療のポジティブな効果を示す方法に関する。
本発明は、膵管腺ガンを予防又は治療するための方法及び組成物(例えば、医薬組成物)を提供する。本発明はまた、膵管腺ガンを阻害又は予防するための方法及び組成物を提供する。
別の実施態様では、βig−h3アンタゴニストは、βig−h3とαVβ3インテグリンとの相互作用を遮断し得る抗体(この用語は、抗体フラグメント又は部分を含む)である。
別の実施態様では、βig−h3アンタゴニストは、βig−h3に対するアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物となる分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質的に任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているようにランダム配列ライブラリーの試験管内進化法を介して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、DNAのコンビナトリアル化学合成によって得られ得る。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニークな配列の最終的には化学的に改変される線状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な改変、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法(Colas et al., 1996)によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質(例えば、E. coliチオレドキシンA)によって提示されるコンフォメーション的に制限された抗体可変領域からなる。
さらに別の実施態様では、βig−h3アンタゴニストは、βig−h3遺伝子発現の阻害剤である。「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。したがって、「βig−h3遺伝子発現の阻害剤」は、βig−h3遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を示す。
本発明はさらに、被験体における膵管腺ガンを予防又は治療する方法であって、治療有効量のβig−h3アンタゴニストを該被験体に投与することを含む方法を企図する。
治療用組成物を形成するために、上記βig−h3アンタゴニストは、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わされ得る。
材料及び方法
マウスモデル
p48−Cre;KrasG12Dを交配し、特定病原体除去条件で飼育し、PANINの発症のモデルとして使用した。これらのマウスは、1.5カ月からPANIN病変を発症する。特異的免疫応答のレギュレーションにおけるβig−h3分子の役割を決定するためにユニークなOT1 T細胞レセプター(CD8+T細胞)を発現するOT1/Rag2 KOトランスジェニックマウスを使用した。さらに、PANIN発症の早期におけるこの分子の影響を評価するために、βigh3に対する中和抗体を使用した。
Bucarest, Romanian National Institute for Diabetes、Marseille Hopital La Timone及びLyon, Hopital Edouard Herriotから、PANIN、IPMN又はPDACを有する患者由来の膵臓スライドを収集した。免疫組織化学及び免疫蛍光では、パラフィン包埋膵臓由来の6μm切片を染色した。全ての実験手順は、Romanian National Ethics Committee及びFrench National Ethics Committeeによって承認された。CRB (Centre de Ressources Biologiques Centre Leon Berard, Lyon France) BB-0033-00050から、血清を回収した。
96−U型ウェルプレート(細胞 300000個/ウェル)中、6μg/mlの最終濃度の中和抗βigh3 Ab又はコントロールAb(BioXCell, USA)の存在下で、流入領域リンパ節、膵臓(Agbunag et al., 2006に以前に記載されているコラゲナーゼ破壊による)、脾臓から抽出した細胞を24時間培養した。
細胞外染色では、CD8 V450ラット抗体(BD Bioscience)、マウスCD4 V500ラット抗体(BD Bioscience)、マウスCD44 A700ラット抗体(BD Bioscience)、CD69 FITC(ImmunoTools)で流入領域リンパ節細胞又は灌流膵臓を染色した。細胞内染色では、Golgi plug (BD Pharmingen)の存在下、10%FCS(Biowest)、10mM HEPES、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミン(Invitrogen)を補充したRPMI1640培地(Invitrogen)中、PMA及びイオノマイシン(1μg/ml)で流入領域リンパ節細胞を37℃、5%CO2で4時間活性化した。活性化後、CD8 V450ラット抗体(BD Bioscience)、マウスCD4 V500ラット抗体(BD Bioscience)で細胞を染色し、Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen)を使用して透過処理し、抗IFNγ(clone XMG1.2, BD Pharmingen)、抗グランザイムB(clone GB12, Invitrogen)でさらに染色し、BD Fortessa Flow Cytometer (BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリー分析を行い、BD FACS Divaソフトウェアv5.0.1 (BD)又はFlowJo (Tree Star, Inc.)のいずれかを用いて分析した。
製造業者にしたがってQiagenキットによって、ペレット化膵島からRNAを抽出した。NanodropでRNA濃度を測定した。等量の抽出RNA(300ng超)に対して、逆転写(RT)を行った。cDNAから、以下のプライマーTBPフォワード5’−TGGTGTGCACAGGAGCCAAG−3’(配列番号:3)、TBPリバース5’−TTCACATCACAGCTCCCCAC−3’(配列番号:4)及びβig−h3オールインワンTM qPCR(cat no MQP028379)プライマー(GeneCopoeia製)と共に、Power SYBR(登録商標)Master Mix (Life technologies)を用いて、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を行った。
パラフィンに含まれるマウス膵臓の5μm切片を有するスライドを脱パラフィン処理した。アンマスキング溶液(Vector H 3300)によって切片をアンマスキングし、次いで、抗体希釈剤(Dako)で30分間飽和させ抗体希釈剤で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベーションした(βig−h3ウサギ抗体(Sigma製)、αSMA(Genetex)、CK19 CK19 Troma III(DSHB製))。培養細胞では、スライド上で細胞をサイトスピンし、0.4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、次いで、0.1%TritonX−100で10分間透過処理した。PBS 0.05%Tweenで細胞を洗浄し、抗体希釈剤(Dako)で15分間ブロッキングした後、βig−h3ウサギ抗体(Sigma製)、CD61(Ebioscience製)、pErk(Cell Signalling製)によって4℃で一晩染色した。スライドを種特異的抗Fab’2−Alexa 647及びAlexa 555(Molecular Probes)と共にインキュベーションし、DAPIを含むVectashield封入剤にマウントした。各分子の局在性の代表的な画像が示されている。全ての共焦点分析を複数回反復し、各分子について少なくとも20個の画像を分析した。共局在性の定量に使用するための方法は、以前に記載されている(10)。Zenソフトウェア(Zeiss)を使用して、データをレンダリング及び分析した。
図の凡例に詳述されているように、スチューデントt検定(GraphPad Prism)を用いて、P値を計算した。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.****P<0.0001
βig−h3は、膵臓新生物の腫瘍形成の早期に発現される。
本発明者らは、C57Bl6のWT膵臓では、ランゲルハンス島において、βig−h3タンパク質が低レベルで発現されることを以前に示した(Patry et al., 2015)。外分泌区画では、前記タンパク質の発現は検出されなかった。対照的に、1.5カ月から新生物を発症するp48Cre;KrasG12D(KC)マウス(Hingorani et al., 2003)では、本発明者らは、新生物病変周辺において前記タンパク質の有意な発現を見出した。新生物発生の後期(すなわち、4.5及び7カ月)では、この発現は維持されていたが不均一であった。さらに、本発明者らは、免疫蛍光染色によって、βig−h3発現が、導管マーカーサイトケラチン19(CK19)を発現する腫瘍性導管細胞(PANIN)周辺に局在しており、PANIN発生の1.5カ月後直ぐに間質マーカーαSMAと主に共局在していたことを特定した。膵臓ガンを有する患者における発現タンパク質パターンの関連性をチェックするために、本発明者らは、膵臓腺ガン(PDAC)に対して免疫組織化学染色を実施した。PDACを有する患者 15人を分析したところ、患者は全て、前記タンパク質が、腫瘍性導管周辺の間質の細胞外区画において発現されるが、びまん性ガンにおいても発現されることを示した。要するに、これらの結果は、マウスでは、βig−h3(TGF−β/アクチビンスーパーファミリーターゲット)が新生物の早期に発現され、ヒトPDACでは、この発現が同じ染色パターンで見られたことを初めて実証している。
βig−h3発現のパターンはαSMAとの共局在性を示したので、本発明者らは次に、どの細胞型が前記タンパク質を産生するかを調査した。したがって、本発明者らは、磁気ビーズ分類によって、2.5カ月の膵臓から導管細胞及びガン関連線維芽細胞(CAF)を単離した(図1A)(材料及び方法に記載)。mRNA抽出後、本発明者らは、βig−h3転写産物の定量RT−PCRを実施した。本発明者らは、βig−h3タンパク質の発現がCAF区画に限定されていたことを見出した(図1B)。(KCマウスから単離した)3つの異なるCAF細胞株を完全培地中で24時間in vitro培養し、又はTGF−β1(20ng/ml)で刺激したので、本発明者らは、タンパク質のレベルでこれらのデータを確認した。本発明者らは、CAFがex vivoでβig−h3タンパク質を産生し、TGF−β処置によってこの産生がさらに増強されたことを見出した(図1C)。
本発明者らは、βig−h3が、不活性コンフォメーションのLckキナーゼを直接遮断することによって、糖尿病誘発性T細胞を阻害して膵島β細胞を殺傷することができたことを以前に示した(Patry et al., 2015)。βig−h3がCD8+T細胞Ag特異的応答をモデュレーションすることができたかを決定するために、本発明者らは、リコンビナントβig−h3でOT1 CD8+T細胞を処置し、(2つの異なる濃度の)特定のOVA SIINFEKL同族ペプチドで細胞をさらに処置した。本発明者らは、活性化マーカーCD69(図2D)及びCD44(図2C)を発現する総細胞数(図2B)及び分裂OT1細胞数(図2A)によって測定した場合、βig−h3前処置がAg特異的応答を有意に減少させることができたことを実証する。本発明者らはさらに、CD8+T細胞とCAFとの共培養実験において、βig−h3に対する中和Abを使用した。図2Eに示されているように、中和Abの追加は、CAFの免疫抑制を無効化することができなかったが、CAF上清中の分泌タンパク質を遮断することができた(図2F)。さらに、本発明者らは、放射線照射膵臓KC細胞株で刺激したKCマウスの流入領域リンパ由来のT細胞を使用することによって、これらの結果を確認した(図2G)。要するに、これらの結果は、βig−h3が、in vitroで特異的抗腫瘍CD8+T細胞応答をモデュレーションすることができたことを初めて示している。
in vivoにおける影響を試験するために、本発明者らは、21日齢(離乳直後)から、中和βig−h3Ab又はアイソタイプコントロール抗体でKCマウスを処置した。本発明者らは、マウスを4週間にわたって週1回処置し、次いで、FACS染色、免疫組織化学及び免疫蛍光によって、膵臓における新生物を評価した。処置マウスは、同腹仔コントロールAb処置マウスと比較して、CK19染色の減少を示した。さらに、この応答は、免疫蛍光及びFACS分析によって検出した場合、腫瘍性膵臓におけるCD8+T細胞数の増加に関連していた(図3A)。本発明者らは、FACSによって、EPCAMを発現する導管腫瘍性区画が減少したことを確認した(図3B)。αSMA染色によって検出した場合のCAFの数は減少しなかったが、これは、βig−h3中和が、(機能を改変することのみによって)CAFの数を減少させずに腫瘍性細胞を殺傷するCD8+抗腫瘍応答を増強することを示唆している。
βig−h3発現は、膵臓新生物の早期に起こるので、本発明者らは、βig−h3を血清中で検出することができ、「予測マーカー」として使用することができると仮定した。本発明者らはELISAを使用して、WT又はKCマウス(WT of KC mice)の血清中のβig−h3の量を検出した。本発明者らは、検出がELISA試験の閾値未満であったWTマウスと比較して、KCマウスの血清中のbigh3の量の有意な増加を検出した(69.32±35.70 N=6)(図4A)。
βig−h3は、T細胞表面上でCD61と相互作用する
βig−h3は、αvβ3インテグリンに対する結合を介してシグナル伝達することが報告されている(Tumbarello DA, et al. Mol Cancer 2012;11:36)。したがって、本発明者らは、CD8+T細胞の表面におけるβ3(CD61)の発現を調べた。本発明者らは、リンパ節及び腫瘍中に存在する両CD8+T細胞がCD61を発現することを見出し、CD61の発現が、腫瘍CD8+T細胞では、末梢CD8+T細胞と比較して有意に高かったことをさらに認めた(図5A)。本発明者らは次に、リコンビナントβig−h3タンパク質(rβig−h3)によるCD8+T細胞の処置がCD61インターナリゼーションをもたらしたので、βig−h3が、CD61を介してシグナル伝達することができたことを確認した(図5B)。糖尿において以前に報告されているように(Patry M, Diabetes 2015;64:4212-9)、rβig−h3によるCD8+T細胞の処置は、Y505におけるLckのリン酸化及びCD61とのその共局在化をもたらした(図5C)。これらの結果は、βig−h3がCD8+T細胞の表面でCD61と相互作用して、Y505におけるLckのリン酸化(Davis SJ,. Trends Immunol 2011;32:1-5)及びそれに続くTCRシグナル伝達経路のこの初期キナーゼの遮断をもたらすことを示している。
βig−h3中和はCD8+T細胞の局所的な蓄積をもたらすので、本発明者らは、前記プロセスへのCD8+T細胞の直接的な寄与を調査しようと考えた。この仮説を検証するために、本発明者らは、βig−h3中和又はコントロールAbで処置したKC細胞株をRag2KOマウスに注射した。KCマウスの膵臓流入領域リンパ節から単離したCD8+T細胞をマウスにさらに静脈内注射した(図6A)。本発明者らは、βig−h3中和Abで処置したKC細胞株を注射したマウスが同様のCD45+細胞リクルートを示したが、それらは、コントロール条件処置動物と比較して増加したCD8+T細胞蓄積を示したことを見出した(図6B及び6C)。また、CD8 T細胞数の増加に付随して、本発明者らは、腫瘍性導管CD45−/EPCAM+細胞の割合の減少を検出した(図6D)。これらの結果は、βig−h3の非存在下では、CD8+T細胞の蓄積がEPCAM+細胞の割合の低下の原因であり得ることを示唆している。腫瘍におけるEPCAM+集団の観察された減少は、CD8+T細胞枯渇によってレスキューされると予測されよう。この仮説を検証するために、本発明者らは、βig−h3中和又はコントロールAbで処置したKC由来細胞株の皮下埋め込みを実施し、続いて、腫瘍細胞注射後7日目及び8日目における2回連続の静脈内注射によって、CD8+T細胞を枯渇させた(図6E)。これらの処置は、CD4+T細胞又はF4/80集団を変化させずに、CD8+T細胞集団の90%超の枯渇をもたらした。対照的に、CD8細胞の中和は、βig−h3中和又はコントロール条件の両方において、同じ数のEPCAM+細胞を確立させるために十分であった(図6F)。要するに、これらの結果は、CD8+T細胞が、in vivoにおける腫瘍成長に対するβig−h3中和効果のために必須であることを示している。
ヒトPDACにおける概念の証明として、本発明者らは、診断マーカー候補としての可溶性βig−h3の存在について、血液バンクの健常志願者 49人及びPDAC患者 104人の血清のさらなるコホートを試験した。図7に示されているように、健常志願者とPDAC患者との間の有意差により、この分子は、バイオマーカーとしての潜在的関心を有することが示された。
本出願を通して、本発明が関係する技術水準が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
Claims (15)
- 膵管腺ガン(PDAC)を有し又は発症する被験体のリスクを評価するための方法であって、前記被験体から得られた血液サンプル中のβig−h3タンパク質レベルを測定する工程を含み、該βig−h3レベルが、膵管腺ガンを有する前記被験体のリスクと正に相関する、方法。
- 前記βig−h3レベルをコントロール基準値と比較する工程を含み、
−前記コントロール基準値と比較して高いβig−h3レベルが、膵管腺ガンを有し又は発症する高いリスクを予測し、
−前記コントロール基準値と比較して低いβig−h3レベルが、膵管腺ガンを有し又は発症する高いリスクを予測する、請求項1に記載の方法。 - 被験体における膵管腺ガンを処置するための治療の効果をモニタリングするための方法であって、
−t1において前記被験体から得られた第1の血液サンプル中のβig−h3レベルを測定する工程、及び
−t2において前記被験体から得られた第2の血液サンプル中のβig−h3レベルを測定する工程
を含み、
−t1が治療前である場合、t2は治療中又は治療後であり、及び
−t1が治療中である場合、t2はより後の治療中又は治療後であり、
第1のサンプル中のβig−h3レベルと比較した第2のサンプル中のβig−h3レベルの減少が、処置被験体における膵管腺ガンに対する治療のポジティブな効果を示す、方法。 - 膵管腺ガンを処置するための治療が、化学療法処置及び/又はβig−h3アンタゴニストからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 膵管腺ガン(PDAC)の血液バイオマーカーとして使用するための、βig−h3タンパク質。
- PDACが早期のものである、請求項5に記載の使用のためのβig−h3タンパク質。
- 膵管腺ガンに罹患している患者の予防又は治療において使用するための、βig−h3アンタゴニスト。
- βig−h3に直接結合してCD8+T細胞活性化の阻害を阻害する、請求項7に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
- 抗βig−h3中和抗体又はアプタマーである、請求項7又は8のいずれか一項に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載のβig−h3アンタゴニストと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
- ガンに罹患している患者の抗腫瘍CD8+T細胞応答を活性化する方法において使用するための、βig−h3アンタゴニスト。
- 抗βig−h3中和抗体又はアプタマーである、請求項11に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
- ガンが、膵臓ガン、食道扁平上皮ガン、胃ガン及び肝臓ガン、結腸ガン、メラノーマからなる群より選択される固形腫瘍である、請求項11又は12のいずれか一項に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
- 固形腫瘍が膵臓ガンである、請求項13に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
- 膵臓ガンが膵管腺ガンである、請求項13に記載の使用のためのβig−h3アンタゴニスト。
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