JP2021072841A - Tgf−rシグナリング阻害剤としてのアンチセンス−オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
ミング、局所曝露など)は、激しい研究や議論の問題になる。現在、TGF−βシグナリ
ングの腫瘍サプレッサー機能は、他の腫瘍サプレッサーにおける劣性の機能喪失変異と同様に初期段階では失われると仮定されている。したがって、ガルニサーチブ(Galunisertib)およびTEW−7197(共にTGFRIの小分子阻害剤であり、臨床的検討、およびLY3022859で用いられており、TGFRIIに対する抗体である)の調査のように、TGF−βシグナル伝達経路を阻害することによる種々の癌治療のためのいくつかの薬理学的アプローチがある)。
様々な生理学的および病態生理学的なプロセスに関与する多機能サイトカインである。TGF−βは、大人の脳において傷害または低酸素症後に、および神経変性の間に誘導され、炎症反応を調節し弱める。傷害後、TGF−βは一般に神経保護作用があるけれども、神経幹細胞の増殖を阻害し、瘢痕形成のために線維化/神経膠症を誘導することによって脳の自己修復を制限する。神経幹細胞に及ぼす当該影響と同様に、TGF‐βは、ほとんどの細胞型において抗増殖制御を明らかにするが、逆説的に、多くの腫瘍はTGF−β制御から逃れる。さらに、これらの腫瘍は、主に、マトリックス、移行および浸潤、血管新生、並びに最も重要なのは免疫回避機構に対する多数のTGF−β媒介効果を調製することによって、TGF−β抗増殖性効果を発癌の合図に変更するという機構を発達させる。したがって、TGF−βは、腫瘍の進行に関与する(図3参照)。
驚くべきことに、タンパク質ヌクレオチド複合体、siRNA、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、アプタマー、CpG−オリゴ、DNA−ザイム、ラフト、またはカベオリン修飾剤、ゴルジ体の修飾剤、抗体およびそれらの誘導体、特にキメラ、Fab−断片、およびFc−断片、LNA(LNA(登録商標)ロックド核酸)を含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドなどの数千もの候補物質の下で、本願において開示される使用のための最も有望な候補物質が発見された。
センス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチドからなり、10個〜28個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個はLNAであり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『TGGTCCATTC』(Seq.ID No.4)、または配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)、または配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『TGGTCCATTC』(Seq.ID No.4)、または配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)、または配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
CTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)それぞれと相補的な配列を含む。
No.4)と相補的な配列を含む。
少なくとも2個はLNAであり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)とハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.5)と相補的な配列を含む。
センス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチドからなり、10個〜28個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個はLNAであり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)とハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.6)と相補的な配列を含む。
ID No.7)とハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.7)と相補的な配列を含む。
IIをコードするmRNA領域は、配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)と相補的な配列を含む。
No.8)と相補的な配列を含む。
RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、配列『TTATTAATGC』(Seq.ID
No.9)と相補的な配列を含む。
『TTTATTAATGCC』(Seq.ID No.313)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『CTGGTCCATTC』(Seq.ID No.296)、『TGGTCCATTCA』(Seq.ID No.297)、『CTGGTCCATTCA』(Seq.ID No.298)、『TCCCTAAACAC』(Seq.ID No.299)、『CCCTAAACACT』(Seq.ID No.300)、『TCCCTAAACACT』(Seq.ID No.301)、『CACTACCAAAT』(Seq.ID No.302)、『ACTACCAAATA』(Seq.ID
No.303)、『CACTACCAAATA』(Seq.ID No.304)、『TGGACGCGTAT』(Seq.ID No.305)、『GGACGCGTATC』(Seq.ID No.306)、『TGGACGCGTATC』(Seq.ID No.307)、『GGTCTATGACG』(Seq.ID No.308)、『GTCTATGACGA』(Seq.ID No.309)、『GGTCTATGACGA』(Seq.ID No.310)、『TTTATTAATGC』(Seq.ID No.311)、『TTATTAATGCC』(Seq.ID No.312)、または『TTTATTAATGCC』(Seq.ID No.313)それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.299)、『CCCTAAACACT』(Seq.ID No.300)、『TCCCTAAACACT』(Seq.ID No.301)、『CACTACCAAAT』(Seq.ID No.302)、『ACTACCAAATA』(Seq.ID No.303)、『CACTACCAAATA』(Seq.ID No.304)、『TGGACGCGTAT』(Seq.ID No.305)、『GGACGCGTATC』(Seq.ID No.306)、『TGGACGCGTATC』(Seq.ID No.307)、『GGTCTATGACG』(Seq.ID No.308)、『GTCTATGACGA』(Seq.ID No.309)、『GGTCTATGACGA』(Seq.ID No.310)、『TTTATTAATGC』(Seq.ID No.311)、『TTATTAATGCC』(Seq.ID No.312)、または『TTTATT
AATGCC』(Seq.ID No.313)それぞれと相補的な配列を含む。
GF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『TCCCTAAACAC』(Seq.ID No.299)、『CCCTAAACACT』(Seq.ID No.300)、または『TCCCTAAACACT』(Seq.ID No.301)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、配列『TCCCTAAACAC』(Seq.ID No.299)、『CCCTAAACACT』(Seq.ID No.300)、または『TCCCTAAACACT』(Seq.ID No.301)、それぞれと相補的な配列を含む。
No.305)、『GGACGCGTATC』(Seq.ID No.306)、または『TGGACGCGTATC』(Seq.ID No.307)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『TGGACGCGTAT』(Seq.ID No.305)、『GGACGCGTATC』(Seq.ID No.306)、または『TGGACGCGTATC』(Seq.ID No.307)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.308)、『GTCTATGACGA』(Seq.ID No.309)、または『GGTCTATGACGA』(Seq.ID No.310)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『GGTCTATGACG』(Seq.ID No.308)、『GTCTATGACGA』(Seq.ID No.309)、または『GGTCTATGACGA』(Seq.ID No.310)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.311)、『TTATTAATGCC』(Seq.ID No.312)、また
は『TTTATTAATGCC』(Seq.ID No.313)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『TTTATTAATGC』(Seq.ID No.311)、『TTATTAATGCC』(Seq.ID No.312)、または『TTTATTAATGCC』(Seq.ID No.313)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
ハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『ACTGGTCCATTC』(Seq.ID No.314)、『TGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.315)、『CTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.316)、『ACTGGTCCATTCA』(Seq.ID No.317)、『ACTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.318)、『CTCCCTAAACAC』(Seq.ID No.319)、『CCCTAAACACTA』(Seq.ID No.320)、『TCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.321)、『CTCCCTAAACACT』(Seq.ID No.322)、『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、『ACACTACCAAAT』(Seq.ID No.324)、『ACTACCAAATAG』(Seq.ID No.325)、『CACTACCAAATAG』(Seq.ID No.326)、『ACACTACCAAATA』(Seq.ID No.327)、『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、『GTGGACGCGTAT』(Seq.ID No.329)、『GGACGCGTATCG』(Seq.ID No.330)、『TGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.331)、『GTGGACGCGTATC』(Seq.ID No.332)、『GTGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.333)、『CGGTCTATGACG』(Seq.ID No.334)、『GTCTATGACGAG』(Seq.ID No.335)、『GGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.336)、『CGGTCTATGACGA』(Seq.ID No.337)、『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、『CTTTATTAATGC』(Seq.ID No.339)、『TTATTAATGCCT』(Seq.ID No.340)、『TTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.341)、『CTTTATTAATGCC』(Seq.ID No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『ACTGGTCCATTC』(Seq.ID No.314)、『TGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.315)、『CTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.316)、『ACTGGTCCATTCA』(Seq.ID No.317)、『ACTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.318)、『CTCCCTAAACAC』(Seq.ID No.319)、『CCCTAAACACTA』(Seq.ID No.320)、『TCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.321)、『CTCCCTAAACACT』(Seq.ID No.322)、『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、『ACACTACCAAAT』(Seq.ID No.324)、『ACTACCAAATAG』(Seq.ID No.325)、『CACTACCAAATAG』(Seq.ID No.326)、『ACACTACCAAATA』(Seq.ID No.327)、『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、『GTGGACGCGTAT』(Seq.ID No.329)、『GGACGCGTATCG』(Seq.ID No.330)、『TGGACGCGTATCG』(Seq.ID
No.331)、『GTGGACGCGTATC』(Seq.ID No.332)、『GTGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.333)、『CGGTCTATGACG』(Seq.ID No.334)、『GTCTATGACGAG』(Seq.ID No.335)、『GGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.336)、『CGGTCTATGACGA』(Seq.ID No.337)、『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、『CTTTATTAATGC』(Seq.ID No.339)、『TTATTAATGCCT』(Seq.ID No.340)、『TTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.341)、『CTTTATTAATGCC』(Seq.ID No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.336)、『CGGTCTATGACGA』(Seq.ID No.337)、『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、『CTTTATTAATGC』(Seq.ID No.339)、『TTATTAATGCCT』(Seq.ID No.340)、『TTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.341)、『CTTTATTAATGCC』(Seq.ID No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、配列『ACTGGTCCATTC』(Seq.ID No.314)、『TGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.315)、『CTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.316)、『ACTGGTCCATTCA』(Seq.ID No.317)、『ACTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.318)、『CTCCCTAAACAC』(Seq.ID No.319)、『CCCTAAACACTA』(Seq.ID No.320)、『TCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.321)、『CTCCCTAAACACT』(Seq.ID No.322)、『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、『ACACTACCAAAT』(Seq.ID No.324)、『ACTACCAAATAG』(Seq.ID No.325)、『CACTACCAAATAG』(Seq.ID No.326)、『ACACTACCAAATA』(Seq.ID No.327)、『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、『GTGGACGCGTAT』(Seq.ID No.329)、『GGACGCGTATCG』(Seq.ID No.330)、『TGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.331)、『GTGGACGCGTATC』(Seq.ID No.332)、『GTGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.333)、『CGGTCTATGACG』(Seq.ID No.334)、『GTCTATGACGAG』(Seq.ID No.335)、『GGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.336)、『
CGGTCTATGACGA』(Seq.ID No.337)、『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、『CTTTATTAATGC』(Seq.ID No.339)、『TTATTAATGCCT』(Seq.ID No.340)、『TTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.341)、『CTTTATTAATGCC』(Seq.ID No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)、それぞれと相補的な配列を含む。
No.317)、または『ACTGGTCCATTCAT』(Seq.ID No.318)、それぞれと相補的な配列を含む。
はTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『CTCCCTAAACAC』(Seq.ID No.319)、『CCCTAAACACTA』(Seq.ID No.320)、『TCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.321)、『CTCCCTAAACACT』(Seq.ID No.322)、または『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『CTCCCTAAACAC』(Seq.ID No.319)、『CCCTAAACACTA』(Seq.ID No.320)、『TCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.321)、『CTCCCTAAACACT』(Seq.ID
No.322)、または『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.322)、または『CTCCCTAAACACTA』(Seq.ID No.323)、それぞれと相補的な配列を含む。
No.327)、または『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
チドからなり、14個〜20個のヌクレオチド、より好ましくは14個〜18個のヌクレオチドのうちの少なくとも4個はLNAであり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『ACACTACCAAAT』(Seq.ID No.324)『、ACTACCAAATAG』(Seq.ID No.325)、『CACTACCAAATAG』(Seq.ID No.326)、『ACACTACCAAATA』(Seq.ID No.327)、または『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、を含み、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、配列『ACACTACCAAAT』(Seq.ID No.324)、『ACTACCAAATAG』(Seq.ID No.325)、『CACTACCAAATAG』(Seq.ID No.326)、『ACACTACCAAATA』(Seq.ID
No.327)、または『ACACTACCAAATAG』(Seq.ID No.328)、それぞれと相補的な配列を含む。
No.332)、または『GTGGACGCGTATCG』(Seq.ID No.333)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.337)、または『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.337)、または『CGGTCTATGACGAG』(Seq.ID No.338)、それぞれと相補的な配列を含む。
ATTAATGCCT』(Seq.ID No.340)、『TTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.341)、『CTTTATTAATGCC』(Seq.ID
No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)、それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む。
No.342)、または『CTTTATTAATGCCT』(Seq.ID No.343)、それぞれと相補的な配列を含む。
くとも2個はLNAであり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’(Seq.ID No.12)、または5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)、または5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10)、または5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’(Seq.ID No.11)、または5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100)、または5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101)によって表され、
ここで、
N1は、CATGGCAGACCCCGCTGCTC−、ATGGCAGACCCCGCTGCTC−、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCGG、を表し、
N3は、GGTGGGATCGTGCTGGCGAT−、GTGGGATCGTGCTGGCGAT−、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCGGC、−ACAGGACGATGTGCAGCGG、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、
N5は、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、
−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTC、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、
N7は、TGAATCTTGAATATCTCATG−、GAATCTTGAATATCTCATG−、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCACCA、−AGTATTCTAGAAACTCACC、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表し、
N9は、ATTCATATTTATATACAGGC−、TTCATATTTATATACAGGC−、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGCTA、−AGTGCAAATGTTATTGGCT、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、
N11は、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CAGAAGAGCTATTTGGTAG−、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCT、−GAGCCGTCTTCA
GGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
N1は、CATGGCAGACCCCGCTGCTC−、ATGGCAGACCCCGCTGCTC−、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCGG、を表す。
、好ましくはDNAユニットである。LNAユニットは、好ましくは3’末端(terminal end)(3’末端(terminus)とも呼ばれる)、および5’末端(terminal end)(5’末端(terminus)とも呼ばれる)に位置される。好ましくは、少なくとも1個以上、好ましくは少なくとも2個のLNAユニットは、3’末端および/または5’末端に存在する。
5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’(Seq.ID No.12)
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N1は、CATGGCAGACCCCGCTGCTC−、ATGGCAGACCCCGCTGCTC−、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、および、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCGG、から選択される。
5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N1は、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、および、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、または−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、から選択される。
5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N1は、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、および、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、または−CCGAGCCCCCAGCから選択される。
5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N1は、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、および、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、または−CCGAGCCCから選択される。
N1Aは、CATGGCAGACCCCGCTGCT−、ATGGCAGACCCCGCTGCT−、TGGCAGACCCCGCTGCT−、GGCAGACCCCGCTGCT−、GCAGACCCCGCTGCT−、CAGACCCCGCTGCT−、AGACCCCGCTGCT−、GACCCCGCTGCT−、ACCCCGCTGCT−、CCCCGCTGCT−、CCCGCTGCT−、CCGCTGCT−、CGCTGCT−、GCTGCT−、CTGCT−、TGCT−、GCT−、CT−、またはT−、を表し、
N2Aは、−C、−CG、−CGA、−CGAG、−CGAGC、−CGAGCC、−CGAGCCC、−CGAGCCCC、−CGAGCCCCC、−CGAGCCCCCA、−CGAGCCCCCAG、−CGAGCCCCCAGC、−CGAGCCCCCAGCG、−CGAGCCCCCAGCGC、−CGAGCCCCCAGCGCA、−CGAGCCCCCAGCGCAG、−CGAGCCCCCAGCGCAGC、−CGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CGAGCCCCCAGCGCAGCGGを表す。
N2Aは、−C、−CG、−CGA、−CGAG、−CGAGC、−CGAGCC、−CGAGCCC、−CGAGCCCC、−CGAGCCCCC、−CGAGCCCCCA、−CGAGCCCCCAG、−CGAGCCCCCAGC、−CGAGCCCCCAGCG、−CGAGCCCCCAGCGC、−CGAGCCCCCAGCGCA、−CGAGCCCCCAGCGCAG、または−CGAGCCCCCAGCGCAGCを表す。
N2Aは、−C、−CG、−CGA、−CGAG、−CGAGC、−CGAGCC、−CGAGCCC、−CGAGCCCC、−CGAGCCCCC、−CGAGCCCCCA、−CGAGCCCCCAG、または−CGAGCCCCCAGCを表す。
N2Aは、−C、−CG、−CGA、−CGAG、−CGAGC、−CGAGCC、または−CGAGCCCを表す。
クレオチドは、12個〜24個のヌクレオチドを有し、3’末端では少なくとも1個はLNAヌクレオチドを有し、5’末端では少なくとも1個はLNAヌクレオチドを有する。LNAヌクレオチド(LNAユニット)として、章「ロックド核酸(LNA(登録商標)」において、好ましくは章「好ましいLNA」において開示されるものが特に適しており、ヌクレオチド間結合として、章「ヌクレオチド間結合(IL)」において開示されるものが特に適している。
N3は、GGTGGGATCGTGCTGGCGAT−、GTGGGATCGTGCTGGCGAT−、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCGGC、−ACAGGACGATGTGCAGCGG、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
、好ましくはDNAユニットである。LNAユニットは、好ましくは3’末端(terminal end)(3’末端(terminus)とも呼ばれる)、および5’末端(terminal end)(5’末端(terminus)とも呼ばれる)に位置される。好ましくは、少なくとも1個以上、好ましくは少なくとも2個のLNAユニットは、3’末端および/または5’末端に存在する。
、5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N3は、GGTGGGATCGTGCTGGCGAT−、GTGGGATCGTGCTGGCGAT−、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、および、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCGGC、−ACAGGACGATGTGCAGCGG、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N3は、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、および、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N3は、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、および、
N4は、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N3は、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、および、
N4は、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
5’−N3A−『TACGCGTCCA』−N4A−3’(Seq.ID No.70)によって表され、ここで、
N3Aは、GGTGGGATCGTGCTGGCGA−、GTGGGATCGTGCTGGCGA−、TGGGATCGTGCTGGCGA−、GGGATCGTGCTGGCGA−、GGATCGTGCTGGCGA−、GATCGTGCTGGCGA−、ATCGTGCTGGCGA−、TCGTGCTGGCGA−、CGTGCTGGCGA−、GTGCTGGCGA−、TGCTGGCGA−、GCTGGCGA−、CTGGCGA−、TGGCGA−、GGCGA−、GCGA−、CGA−、GA−、またはA−、を表し、
N4Aは、−CAGGACGATGTGCAGCGGC、−CAGGACGATGTGCAGCGG、−CAGGACGATGTGCAGCG、−CAGGACGATGTGCAGC、−CAGGACGATGTGCAG、−CAGGACGATGTGCA、−CAGGACGATGTGC、−CAGGACGATGTG、−CAGGACGATGT、−CAGGACGATG、−CAGGACGAT、−CAGGACGA、−CAGGACG、−CAGGAC、−CAGGA、−CAGG、−CAG、−CA、または−Cを表す。
N4Aは、−CAGGACGATGTGCAGCG、−CAGGACGATGTGCAGC、−CAGGACGATGTGCAG、−CAGGACGATGTGCA、−CAGGACGATGTGC、−CAGGACGATGTG、−CAGGACGATGT、−CAGGACGATG、−CAGGACGAT、−CAGGACGA、−CAGGACG、−CAGGAC、−CAGGA、−CAGG、−CAG、−CA、または−Cを表す。
N4Aは、−CAGGACGATGTG、−CAGGACGATGT、−CAGGACGATG、−CAGGACGAT、−CAGGACGA、−CAGGACG、−CAGGAC、−CAGGA、−CAGG、−CAG、−CA、または−Cを表す。
N4Aは、−CAGGACG、−CAGGAC、−CAGGA、−CAGG、−CAG、−CA、または−Cを表す。
NAヌクレオチドを有し、5’末端では少なくとも1個はLNAヌクレオチドを有する。LNAヌクレオチド(LNAユニット)として、章「ロックド核酸(LNA(登録商標)」において、好ましくは章「好ましいLNA」において開示されるものが特に適しており、ヌクレオチド間結合として、章「ヌクレオチド間結合(IL)」において開示されるものが特に適している。
N11は、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CAGAAGAGCTATTTGGTAG−、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10)
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N11は、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CAGAAGAGCTATTTGGTAG−、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、および、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GA
GCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N11は、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、および、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N11は、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−
、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、および、
N12は、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N11は、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、および、
N12は、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
5’−N11A−『GTGTTTAGGG』−N12−3’(Seq.ID No.71)によって表され、ここで、
N11Aは、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTA−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTA−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTA−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTA−、CCAGAAGAGCTATTTGGTA−、CAGAAGAGCTATTTGGTA−、AGAAGAGCTATTTGGTA−、GAAGAGCTATTTGGTA−、AAGAGCTATTTGGTA−、AGAGCTATTTGGTA−、GAGCTATTTGGTA−、AGCTATTTGGTA−、GCTATTTGGTA−、CTATTTGGTA−、TATTTGGTA−、ATTTGGTA−、TTTGGTA−、TTGGTA−、TGGTA−、GGTA−、GTA−、TA−、またはA−、を表し、
N12Aは、−AGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−AGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−AGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−AGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−AGCCGTCTTCAGGAATCTT、−AGCCGTCTTCAGGAATCT、−AGCCGTCTTCAGGAATC、−AGCCGTCTTCAGGAAT、−AGCCGTCTTCAGGAA、−AGCCGTCTTCAGGA、−AGCCGTCTTCAGG、−AGCCGTCTTCAG、−AGCCGTCTTCA、−AGCCGTCTTC、−AGCCGTCTT、−AGCCGTCT、−AGCCGTC、−AGCCGT、−AGCCG、−AGCC、−AGC、−AG、または−Aを表す。
N12Aは、−AGCCGTCTTCAGGAATC、−AGCCGTCTTCAGG
AAT、−AGCCGTCTTCAGGAA、−AGCCGTCTTCAGGA、−AGCCGTCTTCAGG、−AGCCGTCTTCAG、−AGCCGTCTTCA、−AGCCGTCTTC、−AGCCGTCTT、−AGCCGTCT、−AGCCGTC、−AGCCGT、−AGCCG、−AGCC、−AGC、−AG、または−Aを表す。
N12Aは、−AGCCGTCTTCAG、−AGCCGTCTTCA、−AGCCGTCTTC、−AGCCGTCTT、−AGCCGTCT、−AGCCGTC、−AGCCGT、−AGCCG、−AGCC、−AGC、−AG、または−Aを表す。
N12Aは、−AGCCGTC、−AGCCGT、−AGCCG、−AGCC、−AGC、−AG、または−Aを表す。
N5は、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、
CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTC、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表す。
5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’(Seq.ID No.11)
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N5は、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、および、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTC、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、から選択される。
5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N5は、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGC
TA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、および、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、から選択される。
5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N5は、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、および、
N6は、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、から選択される。
5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、
式中、
N5は、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、および、
N6は、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、から選択される。
5’−N5A−『ATTTGGTAGT』−N6A−3’(Seq.ID No.72)によって表され、ここで、
N5Aは、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCT−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCT−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCT−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCT−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCT−、GCCTGCCCCAGAAGAGCT−、CCTGCCCCAGAAGAGCT−、CTGCCCCAGAAGAGCT−、TGCCCCAGAAGAGCT−、GCCCCAGAAGAGCT−、CCCCAGAAGAGCT−、CCCAGAAGAGCT−、CCAGAAGAGCT−、CAGAAGAGCT−、AGAAGAGCT−、GAAGAGCT−、AAGAGCT−、AGAGCT−、GAGCT−、AGCT−、GCT−
、CT−、またはT−、を表し、および、
N6Aは、−GTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−GTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−GTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、−GTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−GTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−GTTTAGGGAGCCGTCTTC、−GTTTAGGGAGCCGTCTT、−GTTTAGGGAGCCGTCT、−GTTTAGGGAGCCGTC、−GTTTAGGGAGCCGT、−GTTTAGGGAGCCG、−GTTTAGGGAGCC、−GTTTAGGGAGC、−GTTTAGGGAG、−GTTTAGGGA、−GTTTAGGG、−GTTTAGG、−GTTTAG、−GTTTA、−GTTT、−GTT、−GT、または−G、を表す。
N6Aは、−GTTTAGGGAGCCGTCTT、−GTTTAGGGAGCCGTCT、−GTTTAGGGAGCCGTC、−GTTTAGGGAGCCGT、−GTTTAGGGAGCCG、−GTTTAGGGAGCC、−GTTTAGGGAGC、−GTTTAGGGAG、−GTTTAGGGA、−GTTTAGGG、−GTTTAGG、−GTTTAG、−GTTTA、−GTTT、−GTT、−GT、または−G、を表す。
N6Aは、−GTTTAGGGAGCC、−GTTTAGGGAGC、−GTTTAGGGAG、−GTTTAGGGA、−GTTTAGGG、−GTTTAGG、−GTTTAG、−GTTTA、−GTTT、−GTT、−GT、または−G、を表す。
N6Aは、−GTTTAGG、−GTTTAG、−GTTTA、−GTTT、−GTT、−GT、または−G、を表す。
個のヌクレオチドを有し、3’末端では2個〜5個、好ましくは、3個〜5個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニットを有し、5’末端では2個〜5個、好ましくは、3個〜5個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニットを有する。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、LNA断片A−DNA断片−LNA断片Bの型のギャップマーである。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、2つのLNA断片の間において、少なくとも6個、より好ましくは、少なくとも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。非LNAユニット、およびLNAユニットのための適切な核酸塩基は、章「核酸塩基」で開示される。
N7は、TGAATCTTGAATATCTCATG−、GAATCTTGAATATCTCATG−、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCACCA、−AGTATTCTAGAAACTCACC、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表す。
よび3’末端で3個〜4個のLNAユニットを含み、並びに両LNA断片の間では少なくとも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。
5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100)
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N7は、TGAATCTTGAATATCTCATG−、GAATCTTGAATATCTCATG−、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCACCA、−AGTATTCTAGAAACTCACC、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
NAユニットのための適切な核酸塩基は、章「核酸塩基」で開示される。
5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N7は、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N7は、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N7は、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N7A−『GAATGGACCA』−N8A−3’(Seq.ID No.73)によって表され、ここで、
N7Aは、TGAATCTTGAATATCTCAT−、GAATCTTGAATATCTCAT−、AATCTTGAATATCTCAT−、ATCTTGAATATCTCAT−、TCTTGAATATCTCAT−、CTTGAATATCTCAT−、TTGAATATCTCAT−、TGAATATCTCAT−、GAATATCTCAT−、A
ATATCTCAT−、ATATCTCAT−、TATCTCAT−、ATCTCAT−、TCTCAT−、CTCAT−、TCAT−、CAT−、AT−、またはT−、を表し、
N8Aは、−GTATTCTAGAAACTCACCA、−GTATTCTAGAAACTCACC、−GTATTCTAGAAACTCAC、−GTATTCTAGAAACTCA、−GTATTCTAGAAACTC、−GTATTCTAGAAACT、−GTATTCTAGAAAC、−GTATTCTAGAAA、−GTATTCTAGAA、−GTATTCTAGA、−GTATTCTAG、−GTATTCTA、−GTATTCT、−GTATTC、−GTATT、−GTAT、−GTA、−GT、または−Gを表す。
N8Aは、−GTATTCTAGAAACTCAC、−GTATTCTAGAAACTCA、−GTATTCTAGAAACTC、−GTATTCTAGAAACT、−GTATTCTAGAAAC、−GTATTCTAGAAA、−GTATTCTAGAA、−GTATTCTAGA、−GTATTCTAG、−GTATTCTA、−GTATTCT、−GTATTC、−GTATT、−GTAT、−GTA、−GT、または−Gを表す。
N8Aは、−GTATTCTAGAAA、−GTATTCTAGAA、−GTATTCTAGA、−GTATTCTAG、−GTATTCTA、−GTATTCT、−GTATTC、−GTATT、−GTAT、−GTA、−GT、または−Gを表す。
N8Aは、−GTATTCT、−GTATTC、−GTATT、−GTAT、−GTA、−GT、または−Gを表す。
しくは、3個〜4個のLNAユニットを有し、5’末端では2個〜5個、好ましくは、3個〜5個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニットを有する。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、LNA断片A−DNA断片−LNA断片Bの型のギャップマーである。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、2つのLNA断片の間において、少なくとも6個、より好ましくは、少なくとも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。非LNAユニット、およびLNAユニットのための適切な核酸塩基は、章「核酸塩基」で開示される。
N9は、ATTCATATTTATATACAGGC−、TTCATATTTATATACAGGC−、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGCTA、−AGTGCAAATGTTATTGGCT、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表す。
とも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。
5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101)
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N9は、ATTCATATTTATATACAGGC−、TTCATATTTATATACAGGC−、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGCTA、−AGTGCAAATGTTATTGGCT、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N9は、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N9は、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N9は、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−Aから選択される。
N9Aは、ATTCATATTTATATACAGG−、TTCATATTTATATACAGG−、TCATATTTATATACAGG−、CATATTTATATACAGG−、ATATTTATATACAGG−、TATTTATATACAGG−、ATTTATATACAGG−、TTTATATACAGG−、TTATATACAGG−、TATATACAGG−、ATATACAGG−、TATACAGG−、ATACAGG−
、TACAGG−、ACAGG−、CAGG−、AGG−、GG−、またはG−、を表し、
N10Aは、−GTGCAAATGTTATTGGCTA、−GTGCAAATGTTATTGGCT、−GTGCAAATGTTATTGGC、−GTGCAAATGTTATTGG、−GTGCAAATGTTATTG、−GTGCAAATGTTATT、−GTGCAAATGTTAT、−GTGCAAATGTTA、−GTGCAAATGTT、−GTGCAAATGT、−GTGCAAATG、−GTGCAAAT、−GTGCAAA、−GTGCAA、−GTGCA、−GTGC、−GTG、−GT、または−Gを表す。
N10Aは、−GTGCAAATGTTATTGGC、−GTGCAAATGTTATTGG、−GTGCAAATGTTATTG、−GTGCAAATGTTATT、−GTGCAAATGTTAT、−GTGCAAATGTTA、−GTGCAAATGTT、−GTGCAAATGT、−GTGCAAATG、−GTGCAAAT、−GTGCAAA、−GTGCAA、−GTGCA、−GTGC、−GTG、−GT、または−Gを表す。
N10Aは、−GTGCAAATGTTA、−GTGCAAATGTT、−GTGCAAATGT、−GTGCAAATG、−GTGCAAAT、−GTGCAAA、−GTGCAA、−GTGCA、−GTGC、−GTG、−GT、または−Gを表す。
N10Aは、−GTGCAAA、−GTGCAA、−GTGCA、−GTGC、−GTG、−GT、または−Gを表す。
しくは、3個〜4個のLNAユニットを有し、5’末端では2個〜5個、好ましくは、3個〜5個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニットを有する。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、LNA断片A−DNA断片−LNA断片Bの型のギャップマーである。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、2つのLNA断片の間において、少なくとも6個、より好ましくは、少なくとも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。非LNAユニット、およびLNAユニットのための適切な核酸塩基は、章「核酸塩基」で開示される。
N13は、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、TGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCCAGAAGAGCTATTTG−、CCAGAAGAGCTATTTG−、CAGAAGAGCTATTTG−、AGAAGAGCTATTTG−、GAAGAGCTATTTG−、AAGAGCTATTTG−、AGAGCTATTTG−、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−
TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCT、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATC、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAAT、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TAGGGAGCCGTCTTCAG、−TAGGGAGCCGTCTTCA、−TAGGGAGCCGTCTTC、−TAGGGAGCCGTCTT、−TAGGGAGCCGTCT、−TAGGGAGCCGTC、−TAGGGAGCCGT、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、
mは、0または1を表し、
nは、0または1を表し、
および、n+m=1または2である。
end)(3’末端(terminus)とも呼ばれる)、および5’末端(terminal end)(5’末端(terminus)とも呼ばれる)に好ましくは位置される。好ましくは、少なくとも1個、より好ましくは少なくとも2個のLNAユニットは、3’末端および/または5’末端に存在する。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、GCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CTGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、TGCCCCAGAAGAGCTATTTG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCCAGAAGAGCTATTTG−、CCAGAAGAGCTATTTG−、CAGAAGAGCTATTTG−、AGAAGAGCTATTTG−、GAAGAGCTATTTG−、AAGAGCTATTTG−、AGAGCTATTTG−、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCGTCTTC、−TAGGGAGCCGTCTT、−TAGGGAGCCGTCT、−TAGGGAGCCGTC、−TAGGGAGCCGT、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、CCCCAGAAGAGCTATTTG−、CCCAGAAGAGCTATTTG−、CCAGAAGAGCTATTTG−、CAGAAGAGCTATTTG−、AGAAGAGCTATTTG−、GAAGAGCTATTTG−、AAGAGCTATTTG−、AGAGCTATTTG−、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、GAAGAGCTATTTG−、AAGAGCTATTTG−、AGAGCTATTTG−、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、CAGAAGAGCTATTTG−、AGAAGAGCTATTTG−、GAAGAGCTATTTG−、AAGAGCTATTTG−、AGAGCTATTTG−、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATCT、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAATC、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGAAT、−T
AGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TAGGGAGCCGTCTTCAG、−TAGGGAGCCGTCTTCA、−TAGGGAGCCGTCTTC、−TAGGGAGCCGTCTT、−TAGGGAGCCGTCT、−TAGGGAGCCGTC、−TAGGGAGCCGT、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、GAGCTATTTG−、AGCTATTTG−、GCTATTTG−、CTATTTG−、TATTTG−、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TAGGGAGCCGTCTTCAG、−TAGGGAGCCGTCTTCA、−TAGGGAGCCGTCTTC、−TAGGGAGCCGTCTT、−TAGGGAGCCGTCT、−TAGGGAGCCGTC、−TAGGGAGCCGT、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
5’−(N13)m−『GTAGTGTT』−(N14)n−3’
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドであり、ここで、
N13は、ATTTG−、TTTG−、TTG−、TG−、またはG−、を表し、
N14は、−TAGGGAGCCGTCT、−TAGGGAGCCGTC、−TAGGGAGCCGT、−TAGGGAGCCG、−TAGGGAGCC、−TAGGGAGC、−TAGGGAG、−TAGGGA、−TAGGG、−TAGG、−TAG、−TA、または−Tから選択され、mは、0または1を表し、nは、0または1を表し、および、n+m=1または2である。
ンス−オリゴヌクレオチドは、LNA断片A−DNA断片−LNA断片Bの型のギャップマーである。好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、2つのLNA断片の間において、少なくとも6個、より好ましくは、少なくとも7個、最も好ましくは少なくとも8個のDNAユニットのような非LNAユニットを含む。非LNAユニット、およびLNAユニットのための適切な核酸塩基は、章「核酸塩基」で開示される。
GAATCTTGAATATCTCATGAATGGACCAGTATTCTAGAAAC
(Seq.ID No.75:Seq.ID No.1の383〜423)
TTCATATTTATATACAGGCATTAATAAAGTGCAAATGTTAT
(Seq.ID No.77:Seq.ID No.1の2245〜2285)
TGAGGAAGTGCTAACACAGCTTATCCTATGACAATGTCAAAG
(Seq.ID No.78:Seq.ID No.1の2315〜2356)
GCCTGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAGTGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG
(Seq.ID No.79:Seq.ID No.1の2528〜2576)
CGCAGGTCCTCCCAGCTGATGACATGCCGCGTCAGGTACTCCTGTAGGT
(Seq.ID No.81:Seq.ID No.1の3205〜3253)
ATGTCGTTATTAACCGACTTCTGAACGTGCGGTGGGATCGTGCTGGCGATACGCGTCCACAGGACGATGTGCAGCGGC
(Seq.ID No.83:Seq.ID No.1の4141〜4218)
GGCCACAGGCCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCCAGCGCAG
(Seq.ID No.84:Seq.ID No.1の4216〜4289)
ATGTCGTTATTAACCGACTTCTGAACGTGCGGTGGGATCGTGCTGGCGATACGCGTCCACAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCCAGCGCAG
(Seq.ID No.86:Seq.ID No.1の4141〜4289)
TTGAATATCTCATGAATGGACCAGTATTCTA
(Seq.ID No.87:Seq.ID No.1の388〜418)
CAAGTGGAATTTCTAGGCGCCTCTATGCTACTG
(Seq.ID No.88:Seq.ID No.1の483〜515)
ATTTATATACAGGCATTAATAAAGTGCAAAT
(Seq.ID No.89:Seq.ID No.1の2250〜2280)
AAGTGCTAACACAGCTTATCCTATGACAATGT
(Seq.ID No.90:Seq.ID No.1の2320〜2351)
CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAGTGTTTAGGGAGCCGTCT
(Seq.ID No.91:Seq.ID No.1の2533〜2571)
CTGGTCGCCCTCGATCTCTCAACACGTTGTCCTTCATGCTTTCGACACAGGGGTGCTCCCGCACCTTGGAACCAAATG
(Seq.ID No.92:Seq.ID No.1の2753〜2830)
GTCCTCCCAGCTGATGACATGCCGCGTCAGGTACTCCTG
(Seq.ID No.93:Seq.ID No.1の3210〜3248)
CTCAGCTTCTGCTGCCGGTTAACGCGGTAGCAGTAGAAGA(Seq.ID No.94:Seq.ID No.1の3655〜3694)
GTTATTAACCGACTTCTGAACGTGCGGTGGGATCGTGCTGGCGATACGCGTCCACAGGACGATGTGCA
(Seq.ID No.95:Seq.ID No.1の4146〜4213)
CAGGCCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCCAG
(Seq.ID No.96:Seq.ID No.1の4221〜4284)
CACGCGCGGGGGTGTCGTCGCTCCGTGCGCGCGAGTGACTCACTCAACTTCA
(Seq.ID No.97:Seq.ID No.1の4495〜4546)から選択される配列中に含まれる。
ドで書かれており、すなわち、G、C、A、Tコードで表されており、RNAコードではない。
核酸塩基
用語「核酸塩基」は、本願において「B」と略され、5個の標準的なヌクレオチド塩基アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U
)、並びにそれらの修飾体、もしくは類似体、または相補鎖における塩基とワトソン−クリック塩基対を形成するための能力を有する類似体に関する。修飾核酸塩基は、5−メチルシトシン(C*)、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−メチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、7−デアザキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、6−エチルアデニン、6−エチルグアニン、2−プロピルアデニン、2−プロピルグアニン、6−カルボキシウラシル、5−ハロウラシル、5,6−ジヒドロウラシル、5−ハロシトシン、5−プロピニルウラシル、5−プロピニルシトシン、6−アザウラシル、6−アザシトシン、6−アザチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)4−チオウラシル、8−フルオロアデニン、8−クロロアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アミノアデニン、8−チオールアデニン、8−チオアルキルアデニン、8−ヒドロキシルアデニン、8−フルオログアニン、8−クロログアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アミノグアニン、8−チオールグアニン、8−チオアルキルグアニン、8−ヒドロキシルグアニン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、5−トリフルオロメチルウラシル、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、5−クロロシトシン、5−ヨードシトシン、5−トリフルオロメチルシトシン、7−メチルグアニン、7−メチルアデニン、8−アザグアニン、8−アザアデニン、7−デアザグアニン、7−デアザアデニン、7−デアザ−8−アザアデニン、3−デアザグアニン、3−デアザアデニン、2−チオウラシル、2−チオチミン、および2−チオシトシン、などのような、他の合成および天然核酸塩基を含み、好ましいのは、5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニン置換基であり、これらの修飾は、核酸二重鎖の安定性の増加を明らかに示している。
酸間の正確な対のための能力に関する。塩基対におけるヌクレオチドは、それらの形が水素結合によって共に結合することができる場合に、相補性である。したがって、アデニンおよびチミジン(またはウラシル)は2つの水素結合の対を形成し、シトシン−グアニンの対は、3つの水素結合を形成する。本願に使用される「相補的な配列」は、DNAまたはRNA配列を意味し、それらが互いに逆平衡に並べられる場合に、配列中の各位置でヌクレオチド塩基は、多くは鏡で見ているように、物質の逆を見ているように、相補的になるようなものである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Pre−mRNAおよび/またはmRNAと、結合またはハイブリダイズすることができる。このことは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、Pre−mRNAのイントロン領域で、またはイントロン領域内で、結合またはハイブリダイズすることができ、またはPre−mRNAの、オーバーラッピングするイントロン−エキソン領域で、結合またはハイブリダイズすることができ、または
Pre−mRNAのエキソン領域で、またはエキソン領域内で、およびmRNAのエキソン領域で結合、またはハイブリダイズすることができる、ことを意味する(図1参照)。好ましくは、Pre−mRNAおよびmRNAと結合、またはハイブリダイズすることができるアンチセンス−オリゴヌクレオチドである。Pre−mRNAに対するアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の結合、またはハイブリダイゼーションは、5’キャップ形成を阻害し、mRNAを得るためのPre−mRNAのスプライシングを阻害し、Pre−mRNAを切断するRNase Hを活性化する。mRNAに対するアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の結合、またはハイブリダイゼーションは、mRNAを切断するRNaseHを活性化し、リボソームサブユニットの結合を阻害する。
Bは核酸塩基を表し、
IL’は、−X’’−P(=X’)(X−)−を表し、
Rは、−H、−F、−OH、−NH2、−OCH3、−OCH2CH2OCH3を表し、およびR#は−Hを表し、または、RおよびR#は、共に、結合−R#−R−を形成し、−R#−R−は、−CH2−O−、−CH2−S−、−CH2−NH−、−CH2−N(CH3)−、−CH2−N(C2H5)−、−CH2−CH2−O−、−CH2−CH2−S−、−CH2−CH2−NH−、−CH2−CH2−N(CH3)−、または−CH2−CH2−N(C2H5)−から選択され、
X’は、=O、または=Sを表し、
X−は、−O−、−OH、−ORH、−NHRH、−N(RH)2、−OCH2CH2ORH、−OCH2CH2SRH、−BH3 −、−RH、−SH、−SRH、または−S−を表し、
X’’は、−O−、−NH−、−NRH−、−CH2−、または−S−を表し、
Yは、−O−、−NH−、−NRH−、−CH2−、または−S−であり、
RHは、水素、およびC1〜4−アルキルから選択され、好ましくは、−CH3、または−C2H5であり、最も好ましくは、−CH3である。
または−O−P(O)(C2H5)−O−であり、最も好ましくは、−O−P(O)(CH3)−O−である。
好ましくは、Bは、A、T、G、C、Uから選択される標準的な核酸塩基を表し、
好ましくは、ILは、−O−P(=O)(S−)−、または−O−P(=S)(S−)−を表す。
したがって、次の一般式(B3)〜(B6)が好ましい:
Bは、核酸塩基を表し、好ましくは、A、T、G、C、Uを表す。
Rは、−H、−F、−OH、−NH2、−N(CH3)2、−OCH3、−OCH2CH2OCH3、−OCH2CH2CH2OH、−OCH2CH2CH2NH2を表し、好ましくは、−Hを表す。
本願に記述されるアンチセンス−オリゴヌクレオチドのモノマーは、ヌクレオチド間結合を介して共に結合される。適切に、各モノマーは、3’隣接モノマーに、ヌクレオチド間結合を介して連結される。本発明との関連で、オリゴマーの末端における5’モノマーは、5’末端基を含んでも、または含まなくてもよいが、5’ヌクレオチド間結合を含まないことを当業者は理解するだろう。用語「ヌクレオチド間結合」は、2個のヌクレオチド、2個のLNAのような2個のヌクレオチド類似体、並び1個のヌクレオチドおよび1個のLNAのような1個のヌクレオチド類似体を共に共有結合することができる基を意味するように意図される。特定の好ましい例は、リン酸基およびホスホロチオエート基を含む。
結されて極性反転を有するもの、を含む。それらの様々な塩、混合塩、および遊離酸も含まれ、更なる詳細において本願に開示される。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−S−P(S)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(RH)−O−、−O−P(O)(ORH)−O−、−O−P(O)(NHRH)−O−、−O−P(O)[N(RH)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2ORH)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SRH)−O−、−O−P(O)(O−)−NRH−、−N(RH)−P(O)(O−)−O−、を表し、ここでRHは、水素およびC1〜4−アルキルから選択される。
−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−O−P(O)(NHRH)−O−、および−O−P(O)[N(RH)2]−O−から好ましくは選択され、より好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、および−O−P(S)(S−)−O−から選択される。
好ましくは、少なくとも50%のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート基である骨格におけるホスホロチオエート部分である。さらに好ましくは、LNAユニットが存在する場合、LNAユニットは、ヌクレオチド間結合としてホスホロチオエートを介して結合される。最も好ましくは、完全なホスホロチオエート骨格であり、すなわち、最も好ましくは、全てのヌクレオチドユニットおよび(存在する場合)LNAユニットが、次に定義されるホスホロチオエート基:−O−P(O,S)−O−、または−O−P(O−)(S)−O−と同義である−O−P(O)(S−)−O−、を介して互いに連結される。
ロックド核酸(LNA(登録商標))
アンチセンス−オリゴヌクレオチドにおいて、一般式(B1)または(B2)のいくつかのヌクレオチドは、いわゆるLNA(ロックド核酸)によって置き換えられると特に好ましい。略語LNAは登録商標であるが、本願において用語「LNA」は、もっぱら用語説明で使用される。
式中、Xは、−O−、−S−、−N(RN)−、−C(R6R7)−、から選択され、好ましくは、Xは、−O−、であり、
Bは、水素、任意に置換されたC1−4−アルコキシ、任意に置換されたC1−4−アルキル、任意に置換されたC1−4−アシルオキシ、核酸塩基、および核酸塩基類似体から選択され、好ましくは、Bは、核酸塩基、または核酸塩基類似体であり、最も好ましくは、標準核酸塩基である。
アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ(C1−6−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ(C1−6−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−C1−6−アルキレニル−アミノカルボニル、モノ−およびジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキレニル−アミノカルボニル、C1−6−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、C1−6−アルカノイルオキシ、スルホノ、C1−6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1−6−アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されてもよく、ここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは共に、任意に置換されたメチレン(=CH2)を表してもよく、この場合において、全てのキラル中心のために、非対称基は、R配置またはS配置のどちらかで発見されてもよく、および
置換基R1、R2、R3、R4、R5、R6、およびR7のそれぞれは、独立して、水素、任意に置換されたC1−12−アルキル、任意に置換されたC2−6−アルケニル、任意に置換されたC2−6−アルキニル、ヒドロキシ、C1−12−アルコキシ、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル、C2−6−アルケニルオキシ、カルボキシ、C1−12−アルコキシカルボニル、C1−12−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ(C1−6−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ(C1−6−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ−(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、C1−6−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、C1−6−アルカノイルオキシ、スルホノ、C1−6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1−6−アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されてもよく、ここで2つのジェミナルな置換基は共に、オキソ、チオキソ、イミノ、または任意に置換されたメチレンを示してもよい。
らかで発見されてもよい。
いくつかの実施形態において、R1、R2、およびR3は、独立して、水素、ハロゲン、C1−6−アルキル、置換されたC1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、置換されたC2−6−アルケニル、C2−6−アルキニルまたは置換されたC2−6−アルキニル、C1−6−アルコキシ、置換されたC1−6−アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1−6−アミノアルキル、または置換されたC1−6−アミノアルキル、から選択される。全てのキラル中心のために、非対称基は、R配置またはS配置のどちらかで発見されてもよい。好ましい実施形態において、R1、R2、およびR3は水素である。
C(RdRe)−O−を表し、ここでRa、Rb、Rd、およびReは、独立して、水素、ハロゲン、C1−6−アルキル、置換されたC1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、置換されたC2−6−アルケニル、C2−6−アルキニル、または置換されたC2−6−アルキニル、C1−6−アルコキシ、置換されたC1−6−アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1−6−アミノアルキル、または置換されたC1−6−アミノアルキル、からなる群から選択され、好ましくは水素である。
R3、R4、およびR5は水素である。好ましい実施形態において、R1、R2、およびR3は水素であり、R4、R5の一つ、または両方は、上記およびWO2007/134181に参照されるような水素以外であってもよい。
−、−C[=C(q1)(q2)]−C(q3)(q4)−、または−C(q1)(q2)−C[=(q3)(q4)]−であり、
q1、q2、q3、q4は、互いに独立して、それぞれ、−H、ハロゲン、C1−12−アルキル、置換されたC1−12−アルキル、C2−6−アルケニル、置換された1−12−アルコキシ、−OJ1、−SJ1、−S(O)J1、−SO2−J1−、−NJ1J2、−N3、−CN、−C(=O)OJ1、−C(=O)NJ1J2、−C(=O)J1、−OC(=O)NJ1J2、−NH−C(=NH)NJ1J2、−NH−C(=O)NJ1J2、または−NH−C(=S)NJ1J2、であり、各J1およびJ2は、互いに独立して、−H、C1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、C2−6−アルキニル、C1−6−アミノアルキル、または保護基であり、任意に、Qが−C(q1)(q2)C(q3)(q4)−であり、q3またはq4の一つが−CH3である場合、他のq3またはq4の少なくとも一つ、または、q1およびq2の一つは、−H以外である。好ましい実施形態において、R1、R2、R3、R4、およびR5は、水素である。全てのキラル中心のために、非対称基は、R配置またはS配置のどちらかで発見されてもよい。当該二環性ヌクレオチドは、WO2008/154401に開示されており、当該全体の参照によって本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態において、R1、R2、R3、R4、およびR5は、互いに独立して、水素、ハロゲン、C1−6−アルキル、置換されたC1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、置換されたC2−6−アルケニル、C2−6−アルキニル、または置換されたC2−6−アルキニル、C1−6−アルコキシ、置換されたC1−6−アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1−6−アミノアルキル、または置換されたC1−6−アミノアルキルからなる群から選択される。好ましい実施形態において、R1、R2、R3、R4、およびR5は水素である。好ましい実施形態におい
て、R1、R2、およびR3は水素であり、R4、R5の一つ、または両方は、上記およびWO2007/134181、またはWO2009/067647(アルファ−L−二環性核酸類似体)に参照されるような水素以外であってもよい。
C2H4−に関する。
−C(CH3)=CH2、−C(CH3)=CH−C(CH3)=CH2、−C(CH3)=C(CH3)−CH=CH2、および−CH=CH−CH=CH−CH=CH2に関する。
用語「C1−12−アルコキシル」は、「C1−C12−アルキル−O−」に関する。
用語「C1−6−アミノアルキル」は、「H2N−C1−C6−アルキル−」に関する。
用語「C1−6−アルキルカルボニル」は、「C1−C6−アルキル−CO−」に関する。「アシル」とも呼ばれる。
用語「C1−6−アルコキシカルボニル」は、「C1−C6−アルキル−O−CO−」に関する。
用語「C1−C6−アルカノイルオキシ」は、「C1−C6−アルキル−CO−O−」に関する。
用語「C1−6−アルキルスルホニルオキシ」は、「C1−C6−アルキル−SO2−O−」に関する。
用語「C1−6−アルキルアミノ」は、「C1−C6−アルキル−NH−」に関する。
用語「C1−6−アルキルアミノカルボニル」は、「C1−C6−アルキル−NH−CO−」に関する。
用語「C1−6−アルキル−アミノ−C1−6−アルキルアミノカルボニル」は、「C1−6−アルキル−HN−[C1−C6−アルキレニル]−NH−CO−」に関する。
用語「アリールオキシ」は、「アリール−O−」に関する。
用語「アリールオキシカルボニル」は、「アリール−O−CO−」に関する。
用語「ヘテロアリール」は、置換されたヘテロ芳香族基、または置換されていない4個〜9個の原子を有するヘテロ芳香族基に関し、4個〜9個の原子うちの1個〜4個は、O、N、および/またはSから選択される。好ましい「ヘテロアリール」基は、5−、または6−員芳香族環に1個、または2個のヘテロ原子を有する。単環システムおよび二環性環システムを含む。典型的に「ヘテロアリール」基は、ピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾイル、チアゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジニル、1,3,5−トリアジニル、1,2,3−トリアゾリル、1,3,4−チアジアゾリル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾ[b]フリル、ベンゾ[b]チエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、1,8−ナフチリジニル、テトラヒドロキノリル、ベンゾオキサゾリル、クロム−2−オニル、インダゾリル、および同類のものである。
用語「ヘテロアリールカルボニル」は、「ヘテロアリール−CO−」に関する。
用語「ヘテロアリールオキシカルボニル」は、「ヘテロアリール−O−CO−」に関する。
LNAモノマー、またはLNA構成要素
本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの合成において出発物質として使用されるLNAモノマー、またはLNA構成要素は、好ましくは、次の一般式のLNAヌクレオチドである。
常提供される。LNAユニットを含む本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホロアミダイト化学によって合成される。LNA構成要素において、核酸塩基は保護される。プリン塩基のアミノ基のための好ましい保護基は、ベンゾイル基(Bz)であり、ABzとして示される。5−メチルピリミジノン塩基のアミノ基のための好ましい保護基は、ベンゾイル基(Bz)であり、CBzとして示される。プリノン塩基のアミノ基のための好ましい保護基は、ジメチルホルムアミド(DMF)基、ジエチルホルムアミド(DEF)基、ジプロピルホルムアミド(DPF)基、ジブチルホルムアミド(DBF)基、またはイソ−ブチリル(−CO−CH(CH3)2)基、であり、GDMF、GDEF、GDPF、GDBF、またはGiBu、として示される。したがって、−NDMF基は、−N=CH−N(CH3)2に関する。DMTは4,4’−ジメトキシトリチルに関する。
末端基
Yは、本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’−末端基を表す場合、残基Yは、Y5’とも呼ばれ、−OH、−O−C1−6−アルキル、−S−C1−6−アルキル、−O−C6−9−フェニル、−O−C7−10−ベンジル、−NH−C1−6−アルキル、−N(C1−6−アルキル)2、−O−C2−6−アルケニル、−S−C2−6−アルケニル、−NH−C2−6−アルケニル、−N(C2−6−アルケニル)2、−O−C2−6−アルキニル、−S−C2−6−アルキニル、−NH−C2−6−アルキニル、−N(C2−6−アルキニル)2、−O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル、−O−[C1−6−アルキレニル−O]m−C1−6−アルキル、−O−CO−C1−6−アルキル、−O−CO−C2−6−アルケニル、−O−CO−C2−6−アルキニル、−O−S(O)−C1−6−アルキル、−O−SO2−C1−6−アルキル、−O−SO2−O−C1−6−アルキル、−O−P(O)(O−)2、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(S−)2、−O−P(O)(S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(S−)(O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−)(NH−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)(NH−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−)[N(C1−6−アルキル)2]、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)[N(C1−6−アルキル)2]、−O−P(O)(O−)(BH3 −)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)(BH3 −)、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキレニル−S−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキレニル−S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(OCH2CH2O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(OCH2CH2O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(OCH2CH2S−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(OCH2CH2S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)OC3H6OH、−O−P
(O)(S−)OC3H6OH、−O−P(S)(S−)OC3H6OH、を表し、
ここで、C1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、C2−6−アルキニル、−O−C6−9−フェニル、または−O−C7−10−ベンジルは、−F、−OH、C1−4−アルキル、C2−4−アルケニル、および/またはC2−4−アルキニルによってさらに置換されてもよく、ここでmは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10から選択される。
ここで、nは、1、2、3、4、5、または6から選択され、
ここで、mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10から選択される。
−OH、−O−C1−6−アルキル、−S−C1−6−アルキル、−O−C6−9−フェニル、−O−C7−10−ベンジル、−NH−C1−6−アルキル、−N(C1−6−アルキル)2、−O−C2−6−アルケニル、−S−C2−6−アルケニル、−NH−C2−6−アルケニル、−N(C2−6−アルケニル)2、−O−C2−6−アルキニル、−S−C2−6−アルキニル、−NH−C2−6−アルキニル、−N(C2−6−アルキニル)2、−O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル、−O−[C1−6−アルキレニル−O]m−C1−6−アルキル、−O−CO−C1−6−アルキル、−O−CO−C2−6−アルケニル、−O−CO−C2−6−アルキニル、−O−S(O)−C1−6−アルキル、−O−SO2−C1−6−アルキル、−O−SO2−O−C1−6−アルキル、−O−P(O)(O−)2、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(S−)2、−O−P(O)(S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(S−)(O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−)(NH−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)(NH−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−)[N(C1−6−アルキル)2]、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)[N(C1−6−アルキル)2]、−O−P(O)(O−)(BH3 −)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキル)(BH3 −)、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキレニル−O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(O−C1−6−アルキレニル−S−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(O−C1−6−アルキレニル−S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(OCH2CH2O−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(OCH2CH2O−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)(OCH
2CH2S−C1−6−アルキル)、−O−P(O)(OCH2CH2S−C1−6−アルキル)2、−O−P(O)(O−)OC3H6OH、−O−P(O)(S−)OC3H6OH、−を表し、
ここで、C1−6−アルキル、C2−6−アルケニル、C2−6−アルキニル、−O−C6−9−フェニル、または−O−C7−10−ベンジルは、−F、−OH、C1−4−アルキル、C2−4−アルケニル、および/またはC2−4−アルキニルによってさらに置換されてもよく、
ここでmは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10から選択される。
ここで、nは、1、2、3、4、5、または6から選択され、
ここで、mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10から選択される。
好ましいLNA
好ましい実施形態において、本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドに使用されるLNAユニットは、一般式(II)
部分−C(RaRb)−X−は、好ましくは、−C(RaRb)−O−、−C(RaRb)−NRc−、−C(RaRb)−S−、および−C(RaRb)−C(RaRb)−O−を表し、ここで、置換基Ra、Rb、およびRcは、本願に定義される意味を有し、
好ましくはC1−6−アルキルであり、より好ましくはC1−4−アルキルである。より好ましい−C(RaRb)−X−は、−CH2−O−、−CH2−S−、−CH2−NH−、−CH2−N(CH3)−、−CH2−CH2−O−、または−CH2−CH2−S−から選択され、より好ましくは−CH2−O−、−CH2−S−、−CH2−CH2−O−、または−CH2−CH2−S−から選択され、さらにより好ましくは、−CH2−O−、−CH2−S−、または−CH2−CH2−O−、から選択され、さらにより好ましくは、−CH2−O−、または−CH2−S−、から選択され、最も好ましくは−CH2−O−である。
用語「チオ−LNA」は、ロックドヌクレオチドを含み、ロックドヌクレオチドにおいて、一般式(II)のXは、−S−、または−CH2−S−から選択される。チオ−LNAは、ベータ−D−配置、およびアルファ−L−配置の両方であることができる。
o.14)、またはGTAG『TGTTTAGG』GAGC(Seq.ID No.15)、またはGCTA『TTTGGTAG』TGTT(Seq.ID No.16)、または
CATG『AATGGACC』AGTA(Seq.ID No.17)、またはAGGC
『ATTAATAA』AGTG(Seq.ID No.18)は、本願に開示される5’
末端で少なくとも1個のLNAユニット、および3’末端で少なくとも1個のLNAユニット、任意の核酸塩基、任意の3’末端基、任意の5’末端基、任意のギャップマー構造、および任意のヌクレオチド間結合を含み、そのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体も含む。
は、ギャップマーと呼ばれ、下記により詳細に開示される。3’末端および5’末端でのLNAユニットの間において、好ましくは4個〜10個、より好ましくは5個〜9個、さらにより好ましくは6個〜8個の非LNAユニットを有するアンチセンス−オリゴヌクレオチドにおいて、より好ましくは、3’末端で2個〜5個のLNAヌクレオチドおよび5’末端で2個〜5個のLNAヌクレオチドであり、または3’末端で1個〜4個のLNAヌクレオチドおよび5’末端で1個〜4個のLNAヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、3’末端で2個〜4個のLNAヌクレオチドおよび5’末端で2個〜4個のLNAヌクレオチドである。
本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、両DNAヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなってもよく、両DNAヌクレオチドは、非LNAヌクレオチドおよびLNAヌクレオチドであり、本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、ギャップマーの型で配列されてもよい。
LNA配列1−非LNA配列−LNA配列2、または領域A−領域B−領域C
を有する。
A、およびアルファ−L−オキシ−LNAである。
−10−2、3−10−3、2−10−4、4−10−2、3−10−4、4−10−3、4−10−4、1−11−1、1−11−2、2−11−1、2−11−2、1−11−3、3−11−1、2−11−2、2−11−3、3−11−2、3−11−3、2−11−4、4−11−2、3−11−4、4−11−3、4−11−4、を含み、さらに領域Dを含んでもよく、領域Dは、1個または2個のDNAヌクレオチドユニットを有し、DNAヌクレオチドユニットは非LNAユニットである。
参照によって本明細書に組み込まれ、「ショートマー」ギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドに関し、本発明にも適切である。
からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、A−B−Cにおけるヌク
レオチド数は、3−8−3、4−8−2、2−8−4、3−8−4、4−8−3、4−8−4、3−9−3、4−9−2、2−9−4、4−9−3、3−9−4、4−9−4、3−10−3、2−10−4,4−10−2、3−10−4、4−10−3、4−10−4、2−11−4,4−11−2、3−11−4、および4−11−3からなる群から選択され、さらにより好ましくは、3−8−3、3−8−4、4−8−3、4−8−4、3−9−3、4−9−3、3−9−4、4−9−4、3−10−3、3−10−4、4−10−3、4−10−4、3−11−4、および4−11−3、である。
説明
本願に使用される略語b、d、s、ssは、次の意味を有する:
b LNAユニット、またはLNAヌクレオチド(b1〜b7から選択されるいずれか)b1 β−D−オキシ−LNA
b2 β−D−チオ−LNA
b3 β−D−アミノ−LNA
b4 α−L−オキシ−LNA
b5 β−D−ENA
b6 β−D−(NH)−LNA
b7 β−D−(NCH3)−LNA
d 2−デオキシ、2−デオキシリボースユニットを意味する(例えば、R=−Hを有する式B3またはB5)
C* メチル−C(5−メチルシトシン);[したがって、dC*は、5−メチル−2’−デオキシシチジンである。]
A* 2−アミノアデニン;[したがって、dA*は、2−アミノ−2’−デオキシアデノシンである。]
s ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート基(−O−P(O)(S−)−O−)
ss ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート基(−O−P(S)(S−)−O−)
/5SpC3/ アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端基で−O−P(O)(O−)OC3H6OH
/3SpC3/ アンチセンス−オリゴヌクレオチドの3’末端基で−O−P(O)(O−)OC3H6OH
/5SpC3s/ アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端基で−O−P(O)(S−)OC3H6OH
/3SpC3s/ アンチセンス−オリゴヌクレオチドの3’末端基で−O−P(O)(S−)OC3H6OH
太字のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドである。なお、表を除く明細書本文及び、特許請求の範囲本文においては、太字列を、『と、』とで挟んで太字列であることを表している。
ギャップマー配列
表2〜表9、より好ましくは表4〜表9に列挙されるギャップマーの形の次のアンチセンス−オリゴヌクレオチドが特に好ましい。
次に本発明の好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドを開示する。
したがって、本発明は、好ましくは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜29個、または14個〜18個のヌクレオチドからなるギャップマーの形のアンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端で1〜5個のヌクレオチド、および3’末端で1〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端および3’末端でのLNAヌクレオチドの間では、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチドが存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’(Seq.ID No.12)、または5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)、または5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10)、または5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’(Seq.ID No.11)、または5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100)、または5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101)によって表され、
ここで、
N1は、CATGGCAGACCCCGCTGCTC−、ATGGCAGACCCCGCTGCTC−、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGA
GCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCGG、を表し、
N3は、GGTGGGATCGTGCTGGCGAT−、GTGGGATCGTGCTGGCGAT−、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCGGC、−ACAGGACGATGTGCAGCGG、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、
N5は、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTC、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、
N7は、TGAATCTTGAATATCTCATG−、GAATCTTGAATATCTCATG−、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCACCA、−AGTATTCTAGAAACTCACC、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表し、
N9は、ATTCATATTTATATACAGGC−、TTCATATTTATATACAGGC−、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGCTA、−AGTGCAAATGTTATTGGCT、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、
N11は、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CAGAAGAGCTATTTGGTAG−、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表し、または、ここで、N1〜N12は、本願に開示されるような残基の制限されたリストのいずれかを表す。
N1は、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC
−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、または−CCGAGCCCCCAGCGCAG、を表す。
特に好ましい、一般式
S1:5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’(Seq.ID No.12)
S1
に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の:
CCGCTGCT『CGTCATAGAC』(Seq.ID No.19)
CGCTGCT『CGTCATAGACC』(Seq.ID No.20)
GCTGCT『CGTCATAGAC』CG(Seq.ID No.21)
CTGCT『CGTCATAGAC』CGA(Seq.ID No.22)
TGCT『CGTCATAGAC』CGAG(Seq.ID No.23)
GCT『CGTCATAGAC』CGAGC(Seq.ID No.24)
CT『CGTCATAGAC』CGAGCC(Seq.ID No.25)
T『CGTCATAGAC』CGAGCCC(Seq.ID No.26)
『CGTCATAGAC』CGAGCCCC(Seq.ID No.27)
CGCTGCT『CGTCATAGAC』(Seq.ID No.28)
GCTGCT『CGTCATAGACC』(Seq.ID No.29)
CTGCT『CGTCATAGAC』CG(Seq.ID No.30)
TGCT『CGTCATAGAC』CGA(Seq.ID No.31)
GCT『CGTCATAGAC』CGAG(Seq.ID No.32)
CT『CGTCATAGAC』CGAGC(Seq.ID No.33)
T『CGTCATAGAC』CGAGCC(Seq.ID No.34)
『CGTCATAGAC』CGAGCCC(Seq.ID No.35)
GCTGCT『CGTCATAGAC』(Seq.ID No.36)
CTGCT『CGTCATAGACC』(Seq.ID No.37)
TGCT『CGTCATAGAC』CG(Seq.ID No.38)
GCT『CGTCATAGAC』CGA(Seq.ID No.39)
CT『CGTCATAGAC』CGAG(Seq.ID No.40)
T『CGTCATAGAC』CGAGC(Seq.ID No.41)
『CGTCATAGAC』CGAGCC(Seq.ID No.42)
CTGCT『CGTCATAGAC』(Seq.ID No.43)
TGCT『CGTCATAGACC』(Seq.ID No.44)
GCT『CGTCATAGAC』CG(Seq.ID No.45)
CT『CGTCATAGAC』CGA(Seq.ID No.46)
T『CGTCATAGAC』CGAG(Seq.ID No.47)
『CGTCATAGAC』CGAGC(Seq.ID No.48)
TGCT『CGTCATAGAC』(Seq.ID No.49)
GCT『CGTCATAGACC』(Seq.ID No.50)
CT『CGTCATAGAC』CG(Seq.ID No.51)
T『CGTCATAGAC』CGA(Seq.ID No.52)
『CGTCATAGAC』CGAG(Seq.ID No.53)
である。
の通りであり、さらにより好ましくは、3−8−3、3−8−4、4−8−3、4−8−4、3−9−3、4−9−3、3−9−4、4−9−4、3−10−3、3−10−4、4−10−3、4−10−4、3−11−4、および4−11−3である。
)である。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
N1は、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、C
TGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、または−CCGAGCCCCCAGCGCAG、を表し、および
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、より好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、または−CCGAGCCCCCAGCGC、を表す。
センス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N1−『GTCATAGA』−N2−3’(Seq.ID No.12)、によって表され、ここで、
N1は、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、好ましくは、N1は、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、および、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、または−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、または−CCGAGCCCCCAG、を表し、好ましくは、N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、または−CCGAGCCCCC、を表し、
および、LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
No.53のギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、3’末端で2個〜5個、好ましくは、2個〜4個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニット断片を含み、5’末端で2個〜5個、好ましくは、2個〜4個、より好ましくは、3個〜4個のLNAユニット断片を含み、およびLNAユニットの2個の断片の間には少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAユニット断片を含み、ここで、LNAユニットは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、ヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基としてLNAユニット、好ましくは全てのLNAユニットにおいて、5−メチルシトシンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて2−アミノアデニンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて5−メチルシトシンを含む。
さらに、本発明は、好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレ
オチドは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)によって表され、ここで、
N3は、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表す。
特に好ましくは、一般式S2:
5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98) S2
に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、
次の:
GCTGGCGA『TACGCGTCCA』(Seq.ID No.54)
CTGGCGA『TACGCGTCCA』C(Seq.ID No.55)
TGGCGA『TACGCGTCCA』CA(Seq.ID No.56)
GGCGA『TACGCGTCCA』CAG(Seq.ID No.57)
GCGA『TACGCGTCCA』CAGG(Seq.ID No.58)
CGA『TACGCGTCCA』CAGGA(Seq.ID No.59)
GA『TACGCGTCCA』CAGGAC(Seq.ID No.60)
A『TACGCGTCCA』CAGGACG(Seq.ID No.61)
『TACGCGTCCA』CAGGACGA(Seq.ID No.62)
CTGGCGA『TACGCGTCCA』(Seq.ID No.63)
TGGCGA『TACGCGTCCA』C(Seq.ID No.64)
GGCGA『TACGCGTCCA』CA(Seq.ID No.65)
GCGA『TACGCGTCCA』CAG(Seq.ID No.66)
CGA『TACGCGTCCA』CAGG(Seq.ID No.67)
GA『TACGCGTCCA』CAGGA(Seq.ID No.68)
A『TACGCGTCCA』CAGGAC(Seq.ID No.349)
『TACGCGTCCA』CAGGACG(Seq.ID No.350)
TGGCGA『TACGCGTCCA』(Seq.ID No.351)
GGCGA『TACGCGTCCA』C(Seq.ID No.352)
GCGA『TACGCGTCCA』CA(Seq.ID No.353)
CGA『TACGCGTCCA』CAG(Seq.ID No.354)
GA『TACGCGTCCA』CAGG(Seq.ID No.355)
A『TACGCGTCCA』CAGGA(Seq.ID No.356)
『TACGCGTCCA』CAGGAC(Seq.ID No.357)
GGCGA『TACGCGTCCA』(Seq.ID No.358)
GCGA『TACGCGTCCA』C(Seq.ID No.359)
CGA『TACGCGTCCA』CA(Seq.ID No.360)
GA『TACGCGTCCA』CAG(Seq.ID No.361)
A『TACGCGTCCA』CAGG(Seq.ID No.362)
『TACGCGTCCA』CAGGA(Seq.ID No.363)
GCGA『TACGCGTCCA』(Seq.ID No.364)
CGA『TACGCGTCCA』C(Seq.ID No.365)
GA『TACGCGTCCA』CA(Seq.ID No.366)
A『TACGCGTCCA』CAG(Seq.ID No.367)
『TACGCGTCCA』CAGG(Seq.ID No.368)
である。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
ンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)によって表され、ここで、
N3は、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、および
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N4は、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、
−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、
さらに、更なる好ましくは、本発明は、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での2個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での2個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも7個、好ましくは少なくとも8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N3−『ACGCGTCC』−N4−3’(Seq.ID No.98)によって表され、ここで、
N3は、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、好ましくは、N3は、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、および、
N4は、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、好ましくは、N4は、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、ヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基としてLNAユニット、好ましくは全てのLNAユニットにおいて、5−メチルシトシンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて2−アミノアデニンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて5−メチルシトシンを含む。
さらに、本発明は、好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10)によって表され、ここで、
N11は、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す。
特に好ましくは、一般式S3:
5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10) S3
に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、
次の:
ATTTGGTA『GTGTTTAGGG』(Seq.ID No.369)
TTTGGTA『GTGTTTAGGG』A(Seq.ID No.370)
TTGGTA『GTGTTTAGGG』AG(Seq.ID No.371)
TGGTA『GTGTTTAGGG』AGC(Seq.ID No.372)
GGTA『GTGTTTAGGG』AGCC(Seq.ID No.373)
GTA『GTGTTTAGGG』AGCCG(Seq.ID No.374)
TA『GTGTTTAGGG』AGCCGT(Seq.ID No.375)
A『GTGTTTAGGG』AGCCGTC(Seq.ID No.376)
『GTGTTTAGGG』AGCCGTCT(Seq.ID No.377)
TTTGGTA『GTGTTTAGGG』(Seq.ID No.378)
TTGGTA『GTGTTTAGGG』A(Seq.ID No.379)
TGGTA『GTGTTTAGGG』AG(Seq.ID No.380)
GGTA『GTGTTTAGGG』AGC(Seq.ID No.381)
GTA『GTGTTTAGGG』AGCC(Seq.ID No.382)
TA『GTGTTTAGGG』AGCCG(Seq.ID No.383)
A『GTGTTTAGGG』AGCCGT(Seq.ID No.384)
『GTGTTTAGGG』AGCCGTC(Seq.ID No.385)
TTGGTA『GTGTTTAGGG』(Seq.ID No.386)
TGGTA『GTGTTTAGGG』A(Seq.ID No.387)
GGTA『GTGTTTAGGG』AG(Seq.ID No.388)
GTA『GTGTTTAGGG』AGC(Seq.ID No.389)
TA『GTGTTTAGGG』AGCC(Seq.ID No.390)
A『GTGTTTAGGG』AGCCG(Seq.ID No.391)
『GTGTTTAGGG』AGCCGT(Seq.ID No.392)
TGGTA『GTGTTTAGGG』(Seq.ID No.393)
GGTA『GTGTTTAGGG』A(Seq.ID No.394)
GTA『GTGTTTAGGG』AG(Seq.ID No.395)
TA『GTGTTTAGGG』AGC(Seq.ID No.396)
A『GTGTTTAGGG』AGCC(Seq.ID No.397)
『GTGTTTAGGG』AGCCG(Seq.ID No.398)
GGTA『GTGTTTAGGG』(Seq.ID No.399)
GTA『GTGTTTAGGG』A(Seq.ID No.400)
TA『GTGTTTAGGG』AG(Seq.ID No.401)
A『GTGTTTAGGG』AGC(Seq.ID No.402)
『GTGTTTAGGG』AGCC(Seq.ID No.403)
である。
している。修飾核酸塩基5−メチルシトシン、または2−アミノアデニンは、特に、5−メチルシトシンがLNAヌクレオチドのみにおいて、またはLNAヌクレオチドおよびDNAヌクレオチドにおいて使用される場合、および/または2−アミノアデニンがDNAヌクレオチドにおいて使用されLNAヌクレオチドにおいて使用されない場合に、式S3のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの活性をさらに増加させることを証明している。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−から選択され、より好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、さらにより好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−から選択され、最も好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、および−O−P(O)(S−)−O−、から選択される、ヌクレオチド間結合ILである。
N11は、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表し、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−
、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表し、
さらに、更なる好ましくは、本発明は、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での2個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での2個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも7個、好ましくは少なくとも8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N11−『TGTTTAGG』−N12−3’(Seq.ID No.10)によって表され、ここで、
N11は、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、好ましくは、N11は、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表し、好ましくは、N12は、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5
’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
さらに、本発明は、好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、次の配列5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’(Seq.ID No.11)によって表され、ここで、
N5は、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表す。
特に好ましい一般式S4:
5’−N5−『TTTGGTAG』−N6−3’(Seq.ID No.11) S4
に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、
次の:
GAAGAGCT『ATTTGGTAGT』(Seq.ID No.404)
AAGAGCT『ATTTGGTAGT』G(Seq.ID No.405)
AGAGCT『ATTTGGTAGT』GT(Seq.ID No.406)
GAGCT『ATTTGGTAGT』GTT(Seq.ID No.407)
AGCT『ATTTGGTAGT』GTTT(Seq.ID No.408)
GCT『ATTTGGTAGT』GTTTA(Seq.ID No.409)
CT『ATTTGGTAGT』GTTTAG(Seq.ID No.410)
T『ATTTGGTAGT』GTTTAGG(Seq.ID No.411)
『ATTTGGTAGT』GTTTAGGG(Seq.ID No.412)
AAGAGCT『ATTTGGTAGT』(Seq.ID No.413)
AGAGCT『ATTTGGTAGT』G(Seq.ID No.414)
GAGCT『ATTTGGTAGT』GT(Seq.ID No.415)
AGCT『ATTTGGTAGT』GTT(Seq.ID No.416)
GCT『ATTTGGTAGT』GTTT(Seq.ID No.417)
CT『ATTTGGTAGT』GTTTA(Seq.ID No.418)
T『ATTTGGTAGT』GTTTAG(Seq.ID No.419)
『ATTTGGTAGT』GTTTAGG(Seq.ID No.420)
AGAGCT『ATTTGGTAGT』(Seq.ID No.421)
GAGCT『ATTTGGTAGT』G(Seq.ID No.422)
AGCT『ATTTGGTAGT』GT(Seq.ID No.423)
GCT『ATTTGGTAGT』GTT(Seq.ID No.424)
CT『ATTTGGTAGT』GTTT(Seq.ID No.425)
T『ATTTGGTAGT』GTTTA(Seq.ID No.426)
『ATTTGGTAGT』GTTTAG(Seq.ID No.427)
GAGCT『ATTTGGTAGT』(Seq.ID No.428)
AGCT『ATTTGGTAGT』G(Seq.ID No.429)
GCT『ATTTGGTAGT』GT(Seq.ID No.430)
CT『ATTTGGTAGT』GTT(Seq.ID No.431)
T『ATTTGGTAGT』GTTT(Seq.ID No.432)
『ATTTGGTAGT』GTTTA(Seq.ID No.433)
AGCT『ATTTGGTAGT』(Seq.ID No.434)
GCT『ATTTGGTAGT』G(Seq.ID No.435)
CT『ATTTGGTAGT』GT(Seq.ID No.436)
T『ATTTGGTAGT』GTT(Seq.ID No.437)
『ATTTGGTAGT』GTTT(Seq.ID No.438)
である。
。LNAユニットおよびDNAユニットは、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)のような標準的な核酸塩基を含んでもよいが、章「核酸塩基」に開示されるような修飾核酸塩基も含んでもよい。式S4のアンチセンス−オリゴヌクレオチド、またはアンチセンス−オリゴヌクレオチドのLNA断片およびDNA断片は、本願に開示されるような任意のヌクレオチド間結合、特に、章「ヌクレオチド間結合(IL)」に開示されるもの、を含んでもよい。式S4のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、3’末端における、および/または5’末端における末端基、特に、章「末端基」に開示されるもの、を任意に含んでもよい。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−
、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
N5は、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表す。
N5は、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、好ましくは、N5は、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、および、
N6は、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、好ましくは、N6は、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−T
GTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の修飾3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
さらに、本発明は、好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100)によって表され、ここで、
N7は、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAAT
ATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表す。
特に好ましい一般式S6:
5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100) S6に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、
次の:
TATCTCAT『GAATGGACCA』(Seq.ID No.439)
ATCTCAT『GAATGGACCA』G(Seq.ID No.440)
TCTCAT『GAATGGACCA』GT(Seq.ID No.441)
CTCAT『GAATGGACCA』GTA(Seq.ID No.442)
TCAT『GAATGGACCA』GTAT(Seq.ID No.443)
CAT『GAATGGACCA』GTATT(Seq.ID No.444)
AT『GAATGGACCA』GTATTC(Seq.ID No.445)
T『GAATGGACCA』GTATTCT(Seq.ID No.446)
『GAATGGACCA』GTATTCTA(Seq.ID No.447)
ATCTCAT『GAATGGACCA』(Seq.ID No.448)
TCTCAT『GAATGGACCA』G(Seq.ID No.449)
CTCAT『GAATGGACCA』GT(Seq.ID No.450)
TCAT『GAATGGACCA』GTA(Seq.ID No.451)
CAT『GAATGGACCA』GTAT(Seq.ID No.452)
AT『GAATGGACCA』GTATT(Seq.ID No.453)
T『GAATGGACCA』GTATTC(Seq.ID No.454)
『GAATGGACCA』GTATTCT(Seq.ID No.455)
TCTCAT『GAATGGACCA』(Seq.ID No.456)
CTCAT『GAATGGACCA』G(Seq.ID No.457)
TCAT『GAATGGACCA』GT(Seq.ID No.458)
CAT『GAATGGACCA』GTA(Seq.ID No.459)
AT『GAATGGACCA』GTAT(Seq.ID No.460)
T『GAATGGACCA』GTATT(Seq.ID No.461)
『GAATGGACCA』GTATTC(Seq.ID No.462)
CTCAT『GAATGGACCA』(Seq.ID No.463)
TCAT『GAATGGACCA』G(Seq.ID No.464)
CAT『GAATGGACCA』GT(Seq.ID No.465)
AT『GAATGGACCA』GTA(Seq.ID No.466)
T『GAATGGACCA』GTAT(Seq.ID No.467)
『GAATGGACCA』GTATT(Seq.ID No.468)
TCAT『GAATGGACCA』(Seq.ID No.469)
CAT『GAATGGACCA』G(Seq.ID No.470)
AT『GAATGGACCA』GT(Seq.ID No.471)
T『GAATGGACCA』GTA(Seq.ID No.472)
『GAATGGACCA』GTAT(Seq.ID No.473)
である。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
N7は、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N8は、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表す。
−オリゴヌクレオチドは、次の配列、、5’−N7−『AATGGACC』−N8−3’(Seq.ID No.100)によって表され、ここで、
N7は、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、好ましくは、N7は、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、および、
N8は、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表し、好ましくは、N8は、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aを表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
さらに、本発明は、好ましくは、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びにアンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体に関し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチド、好ましくは、11個〜24個のヌクレオチド
、より好ましくは、12個〜20個のヌクレオチド、さらにより好ましくは、13個〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101)によって表され、ここで、
N9は、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表す。
特に好ましい一般式S7:
5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101) S7
に該当するギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、
次の:
TATACAGG『CATTAATAAA』(Seq.ID No.474)
ATACAGG『CATTAATAAA』G(Seq.ID No.475)
TACAGG『CATTAATAAA』GT(Seq.ID No.476)
ACAGG『CATTAATAAA』GTG(Seq.ID No.477)
CAGG『CATTAATAAA』GTGC(Seq.ID No.478)
AGG『CATTAATAAA』GTGCA(Seq.ID No.479)
GG『CATTAATAAA』GTGCAA(Seq.ID No.480)
G『CATTAATAAA』GTGCAAA(Seq.ID No.481)
『CATTAATAAA』GTGCAAAT(Seq.ID No.482)
ATACAGG『CATTAATAAA』(Seq.ID No.483)
TACAGG『CATTAATAAA』G(Seq.ID No.484)
ACAGG『CATTAATAAA』GT(Seq.ID No.485)
CAGG『CATTAATAAA』GTG(Seq.ID No.486)
AGG『CATTAATAAA』GTGC(Seq.ID No.487)
GG『CATTAATAAA』GTGCA(Seq.ID No.488)
G『CATTAATAAA』GTGCAA(Seq.ID No.489)
『CATTAATAAA』GTGCAAA(Seq.ID No.490)
TACAGG『CATTAATAAA』(Seq.ID No.491)
ACAGG『CATTAATAAA』G(Seq.ID No.492)
CAGG『CATTAATAAA』GT(Seq.ID No.493)
AGG『CATTAATAAA』GTG(Seq.ID No.494)
GG『CATTAATAAA』GTGC(Seq.ID No.495)
G『CATTAATAAA』GTGCA(Seq.ID No.496)
『CATTAATAAA』GTGCAA(Seq.ID No.497)
ACAGG『CATTAATAAA』(Seq.ID No.498)
CAGG『CATTAATAAA』G(Seq.ID No.499)
AGG『CATTAATAAA』GT(Seq.ID No.500)
GG『CATTAATAAA』GTG(Seq.ID No.501)
G『CATTAATAAA』GTGC(Seq.ID No.502)
『CATTAATAAA』GTGCA(Seq.ID No.503)
CAGG『CATTAATAAA』(Seq.ID No.504)
AGG『CATTAATAAA』G(Seq.ID No.505)
GG『CATTAATAAA』GT(Seq.ID No.506)
G『CATTAATAAA』GTG(Seq.ID No.507)
『CATTAATAAA』GTGC(Seq.ID No.508)
である。
4、および4−11−3である。
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、
からなる群から選択される。
〜19個、または14個〜18個のヌクレオチド、からなるギャップマーの形であり、アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’末端での1個〜5個のヌクレオチド、および3’末端での1個〜5個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、5’末端、および3’末端でのLNAヌクレオチドの間は、少なくとも6個、好ましくは7個、より好ましくは8個のDNAヌクレオチド配列が存在し、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列、5’−N9−『ATTAATAA』−N10−3’(Seq.ID No.101)によって表され、ここで、
N9は、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−ENA(b5)、β−D−(NH)−LNA(b6)、β−D−(NCH3)−LNA(b7)、β−D−(ONH)−LNA(b8)、およびβ−D−(ONCH3)−LNA(b9)、から選択され、好ましくは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(CH3)−O−、−O−P(O)(OCH3)−O−、−O−P(O)(NH(CH3))−O−、−O−P(O)[N(CH3)2]−O−、−O−P(O)(BH3 −)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2OCH3)−O−、−O−P(O)(OCH2CH2SCH3)−O−、−O−P(O)(O−)−N(CH3)−、−N(CH3)−P(O)(O−)−O−、から選択され、好ましくは、−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
N10は、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT
、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表す。
N9は、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、好ましくは、N9は、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、および
N10は、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、好ましくは、N10は、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、および、
LNAヌクレオチドは、β−D−オキシ−LNA(b1)、β−D−チオ−LNA(b2)、α−L−オキシ−LNA(b4)、β−D−(NH)−LNA(b6)、およびβ−D−(NCH3)−LNA(b7)、から選択され、および、
ヌクレオチド間結合は、
−O−P(O)(O−)−O−、−O−P(O)(S−)−O−、−O−P(S)(S−)−O−、−S−P(O)(O−)−O−、−S−P(O)(S−)−O−、−O−P(O)(O−)−S−、−O−P(O)(S−)−S−、−S−P(O)(O−)−S−、から選択され、および好ましくは、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基として5−メチルシトシンおよび/または2−アミノアデニンを含んでもよい。
CH3)−LNA(b7)、から選択され、ヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。当該好ましいアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、任意の修飾3’末端および5’末端を含まなくてもよく、または任意の3’末端基および5’末端基を含まなくてもよく、修飾核酸塩基としてLNAユニット、好ましくは全てのLNAユニットにおいて、5−メチルシトシンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて2−アミノアデニンを、および/または、いくつかの、もしくは全てのDNAユニットにおいて5−メチルシトシンを含んでもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、実質的に無毒な薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、溶媒、または希釈剤を任意に使用してそれらの薬学的に活性な塩の形態で投与される。本発明の医薬品は、従来の固体もしくは液体担体、または希釈剤で、および公知の方法で適切な用量レベルで従来の薬学的に作られるアジュバントで調製される。好ましい調製物および製剤は、輸液または注射(髄腔内、脳室内、
頭蓋内、静脈内、実質内、腫瘍内、眼内または眼外、腹腔内、筋肉内、皮下)、脳への局
所投与、吸入、固体腫瘍への局所投与、または経口投与に適切な投与可能形態である。しかしながら、上皮ライニング、または粘膜皮膚ライニング(口腔粘膜、直腸ライニングおよび腟上皮ライニング、鼻咽頭粘膜、腸粘膜)を介する吸収、直腸的に、経皮的に、局所的に、皮内に(intradermally)、胃内に、皮内に(intracutaneously)、膣内に、管内に(intravasally)、鼻腔内に、口腔内に(intrabuccally)、経皮的に(percutaneously)、舌下に適用、または医薬分野内で利用できる任意の他の手段、のような、他の適用形態が可能である。
ビトール、グリシン)および/または凍結保護物質(例えば、トレハロース、マンニトール)を含む。再構成のための溶媒は、pH6〜8に制御する緩衝塩の有無にかかわらず注入
可能な化合物のために水であることもできる。
特に好ましい医薬組成物は、吸入または静脈内投与による投与に適した凍結乾燥(フリ
ーズドライ)製剤(凍結乾燥物)である。好ましい凍結乾燥製剤を調製するために、本発明
の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを4〜5%(w/v)マンニトール溶液に可溶化し、その後、溶液を凍結乾燥させる。マンニトール溶液は、上述の適切な緩衝液で調製することもできる。
リプロピレングリコール)、トレハロース、グルコース、スクロース、ソルビトール、デ
キストラン、マルトース、ラフィノース、スタキオースおよび他の糖類(例えば、WO9
7/29782参照)を含み、マンニトールが好ましくは使用される。これらは従来の凍
結技術で従来の量で使用することができる。凍結の方法は、医薬製剤を調製する当該分野においてよく知られている。
に滅菌蒸留水または任意の他の適切な液体に再水和されることができる。代替的に、静脈内投与のために凍結乾燥製品を、滅菌蒸留水または任意の他の適切な液体に再水和するとができる。
錠剤やカプセルの形での経口投与のために、少なくとも1つのアンチセンス−オリゴヌクレオチドを、ラクトース、デンプン、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール(液体の形態)などのような任意の経口無毒な薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせてもよい。さらに、所望される、または、必要とされる場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤を混合物に包含されてもよい。
適切な結合剤は、デンプン、ゼラチン、天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシアのような天然および合成ガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチル−セルロース、ポリエチレングリコールおよびワックスを含む。潤滑剤の中で、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が、これらの剤形で使用するために挙げられてもよい。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、グアーガム等を含む。
の無機物、を含む。組成物中の結合剤の量は、組成物の約1〜30重量%、好ましくは、組成物の約2〜約20重量%、より好ましくは、約3〜約10重量%、さらにより好ましくは、約3〜約6重量%の範囲であることができる。
指示(Indications)
本発明は、中枢神経系(CNS)の感染後および炎症性疾患を含む、神経変性疾患、神経外傷、神経血管性および神経炎症性疾患の予防および治療のために本願に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RII発現を阻害し、その結果、上方調節された、または向上したTGF−RIIおよび/またはTGF−RIIレベルに関連する疾患の治療に用いられる。
、クロイツフェルト−ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨大細胞封入体病(CIBD)、サイトメガロウイルス感染、ダンシングアイ−ダンシング脚症候群、ダンディ−ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジェリン−クルンプケ麻痺、多発梗塞性認知症、皮質性痴呆、レビー小体型認知症、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、デビック症候群、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下困難、統合運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん脳症、エンプティセラ症候群、脳炎嗜眠性脳炎、脳炎および髄膜炎、脳瘤、脳症、脳3叉神経領域血管腫症、てんかん、エルブ麻痺、エルブ−デュシェンヌおよびデジェリン−クルンプケ麻痺、ファブリ病、ファール症候群、失神、家族性自律神経障害、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化、家族性痙攣麻痺、熱性発作(例えば、GEFSおよびGEFSプラス)、フィッシャー症候群、フロッピー乳児症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ
病、ゲルストマン症候群、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、球様細胞白質萎縮症、舌咽神経痛、ギラン−バレー症候群、HTLV−1関連脊髄症、ハレルフォルデン−スパッツ病、頭部外傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性神経障害、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳帯状疱疹、帯状疱疹、平山症候群、全前脳欠損症、ハンチントン病、水頭無脳症、正常圧水頭症正常圧、水頭症(特に、TGF−β誘発水頭症)、水脊髄症、副腎皮質機能亢進、過眠症、高血圧症、低血圧症、低酸素症、免疫介在脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児低血圧症、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児けいれん、炎症性筋疾患、腸性リポジストロフィー、頭蓋内嚢胞、頭蓋内高血圧、アイザック症候群、ジュベール症候群、カーンズセイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン(Kinsbourne)症候群、クライン−レビン症候群、クリッペル−フェイル症候群、クリッペル−トレノニー症候群(KTS)、クリューヴァー−ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルバーグ−ヴェランダー病、クールー病、ランバート−イートン筋無力症候群、ランドー−クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レヴァイン−クリッチュリー症候群、レビー小体型認知症、間脳腫瘍、ロックイン症候群、ルーゲーリッグ病、神経学的後遺症、ライム病の神経学的合併症、マチャド−ジョセフ病、巨大脳髄症、巨脳症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、髄膜炎、メンケス病、知覚異常性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリア筋症、メビウス症候群、単肢筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピド症、ムコ多糖症、多発梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症(MS)、多系統萎縮症(MSA−CおよびMSA−P)、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、ミエリン破壊性びまん性硬化症(myelinoclastic diffuse sclerosis)、乳児のミオクロニー脳症、ミオクローヌス、先天性ミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、ミオパシー、先天性筋緊張症、筋緊張症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳鉄蓄積を有する神経変性症、神経線維腫症、神経遮断薬悪性症候群、エイズの神経学的合併症、ポンペ病の神経症状、視神経オプティカ、神経性筋緊張病、神経セロイドリポフスチン症、神経遊走障害、遺伝性ニューロパシー、神経サルコイドーシス、神経毒性、海綿静脈母斑、ニーマン−ピック病、オサリバン−マクラウド症候群、後頭神経痛、オカルト脊椎管癒合異常配列、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌスミオクローヌス、起立性低血圧、濫用症候群、慢性疼痛、腫瘍随伴症候群、感覚異常、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、発作性舞踏病、発作性片側頭痛、ペイリー−ロンベルグ病、ペリツェウス−メルツバッハー病、ペナ ショッカー症候群II型、神経周囲嚢胞、周期性麻痺、末梢神経障害、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸貯留病、ピック病、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポストポリオ症候群、帯状疱疹後神経痛、後感染性脳脊髄炎、体位性低血圧、体位性起立性頻拍症候群、体位頻拍症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面半側萎縮症、進行性脊髄ろう、進行性多病巣性白質脳症、進行性硬化
性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、偽性脳腫瘍、ピリドキシン依存性およびピリドキシン応答性発作性疾患、ラムジーハント症候群I型、ラムジーハント症候群タイプII型、ラスムッセン脳炎および他の自己免疫てんかん、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、乳児レフスム病、レフスム病、反復運動障害、反復的ストレス傷害、むずむず脚症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、ライリー−デイ症候群、SUNCT頭痛、仙骨神経根嚢胞、聖ヴァイタス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、発作性疾患、中隔視神経異形成症、乳児重症ミオクロニーてんかん(SMEI)、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙縮、脊椎披裂、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮、スティール−リチャードソン−オルシェウスキー症候群、スティッフパーソン症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ−ウェーバー症候群、亜急性硬化性汎脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒脊髄硬化症、水脊髄空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄癆、遅発性ジスキネジア、ターロブ嚢胞、テイ−サックス病、側頭動脈炎、繋留脊髄症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパシー、三叉神経痛、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性虚血発作、伝染性海綿脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、震え、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、結節性硬化症、血管勃起性腫瘍、側頭動脈炎を含む血管炎、フォンエコーノモ病、フォンヒッペル−リンダウ病(VHL)、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルク症状群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウェスト症候群、ウィップル病、ウィリアムス症候群、ウイルソン病、X連鎖球脊髄性筋萎縮症、ゼルウィガー症候群を含む。
アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病(CJD)、クロイツフェルトヤコブ病の新しい変異体(nvCJD)、ハレルフォルデン スパッツ病、ハンチントン病、多系統萎縮症、認知症、前頭側頭型認知症、複数の自発的または遺伝的背景の運動ニューロン障害、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄筋萎縮症、小脳萎縮症(SCAs)、統合失調症、情動障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性髄膜脳炎、CNS自己免疫疾患、多発性硬化症(MS)、急性虚血性/低酸素性病変脳卒中、CNSおよび脊髄外傷、頭および脊椎の外傷、脳外傷性傷害、動脈硬化、アテローム性動脈硬化症、微小血管症性認知症痴呆、ビンスワンガー病(白質希薄化)、網膜変性症、蝸牛変性症、黄斑変性症、蝸牛難聴、エイズ関連認知症、網膜色素変性症、脆弱X関連震え/失調症候群(FXTAS)、進行性核上性麻痺(PSP)、線条体黒質変性症(SND)、オリーブ橋小脳変性症(OPCD)、シャイドレーガー症候群(SDS)、年齢依存性記憶欠損、認知症関連神経発達障害、ダウン症候群、シヌクレイノパチー、スーパーオキシドジスムターゼ変異、ハンチントン病気のようなトリヌクレオチド反復障害、外傷、低酸素症、血管疾患、血管炎症、CNS老化、
を含む、またはからなる群から選択される。また幹細胞更新の年齢依存的減少であってもよい。
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、水頭症(特に、TGFβ−誘導水頭症)、脊髄損傷などの、CNSの、および脊髄の、外傷、頭部の、および脊椎の外傷、脳外傷性傷害、網膜変性症、黄斑変性症、蝸牛難聴、エイズ関連認知症、ハンチントン病のようなトリヌクレオチド反復障害、およびCNS老化、
を含む、または、からなる群から選択される。
な繊維状結合組織の形成である。これは、反応性、良性、または病理学的状態であることができる。損傷に応答して、これは瘢痕と呼ばれ、線維化が単一細胞系列から発生する場合、線維腫と呼ばれる。生理学的に、これは、細胞外マトリックスを堆積させるために作用し、基になる器官または組織の構造および機能を消し去ることができる。線維化は、繊維組織の過剰堆積の病理学的状態、および治療における結合組織堆積の過程を説明するために使用することができる。線維化は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む結合組織を形作るために刺激された細胞を含む過程である。続いて間質の間のマクロファージおよび損傷を受けた組織は、TGF−βを放出する。TGF−βは、結合組織を堆積させる線維芽細胞の増殖および活性化を刺激する。TGF−βレベルを減らすことは、結合組織の形成を減少させるので、線維化を防ぎ、治療する。
肺:・肺線維症
・特発性肺線維症(特発性は原因が不明であることを意味する)
・嚢胞性線維症
肝臓:・多発性起源肝硬変
心臓:・心筋線維症
・古い心筋梗塞
・心房線維症
その他:・縦隔線維症(縦隔の軟組織)
・緑内障(眼、眼の)
・骨髄線維症(骨髄)
・後腹膜線維症(後腹膜腔の軟組織)
・進行性塊状線維症(肺);石炭労働者じん肺症の合併症
・腎性全身性線維症(皮膚)
・クローン病(腸管)
・ケロイド(皮膚)
・強皮症/全身性硬化症(皮膚、肺)
・関節線維化(膝、肩、他の関節)
・ペイロニー病(陰茎)
・デュプイトラン拘縮(手、指)
・癒着性関節包炎のいくつかの形態(肩)
・ループスエリテマトーデス後のレジデュー(residuums)
である。
細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、バーキットリンパ腫、コーパス癌、CUP−症候群(原発不明の癌腫)、大腸癌、小腸癌、小腸腫瘍、卵巣癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌型、
ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胃癌、胆嚢癌、胆嚢癌腫、子宮癌、子宮頸癌、子宮頸部、神経膠芽細胞腫、婦人科腫瘍、耳、鼻および喉の腫瘍、血液学的新生組織形成、有毛細胞白血病、尿道癌、皮膚癌、皮膚精巣癌、脳腫瘍(星状細胞腫、乏突起膠細胞、髄芽細胞腫
、PNET、混合膠腫、などのグリオーマ)、脳転移、睾丸癌、脳下垂腫瘍、カルチノイ
ド、カポジ肉腫、喉頭癌、生殖細胞腫、骨癌、結腸直腸癌、頭頸部腫瘍(耳、鼻、喉領域の腫瘍)、大腸癌、頭蓋咽頭腫、口腔癌(口領域および唇上の癌)、中枢神経系の癌、肝臓癌、肝転移、白血病、眼瞼腫瘍、肺癌、リンパ節癌(ホジキン/非ホジキン)、リンパ腫、胃癌、悪性黒色腫、悪性新生物、悪性消化管腫瘍、乳癌、直腸癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻癌、神経鞘腫、神経芽細胞腫、腎癌、腎細胞癌、非ホジキン病リンパ腫、乏突起膠腫、食道癌、溶骨性癌、および骨形成性癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、形質細胞腫、頭頸部扁平上皮癌(SCCHN),前立腺癌、咽頭癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腟癌、甲状腺癌、シュネーベルガー病、食道癌、スピナリオムズ(spinalioms)、T−細胞リンパ腫(菌状息肉症)、胸腺腫、管癌、眼(eye)/眼(ocular)腫瘍、尿道癌、泌尿器腫瘍、尿路上皮癌、外陰部癌、疣贅出現(wart appearance)、軟部組織腫瘍、軟組織肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、および舌癌、を含む、または、からなる群から選択される。
肺癌腫のような肺癌;肝細胞癌などの肝臓癌;黒色腫、または悪性黒色腫;膵上皮癌または膵腺癌などの膵癌;結腸直腸腺癌などの大腸癌;胃癌または胃癌腫;乳癌;悪性星細胞腫;前立腺癌;胃癌腫のような;急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、単球性白血病、前骨髄球性白血病、リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、リンパ性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病;組織球性リンパ腫などのリンパ腫、
からなる、または含む群から選択される癌に関する。
ための投与計画は、一週間投与であり、3回、4回、または5回と繰り返される。この投与計画は、その後、例えば、約4週間のような約3〜5週間などの休止期間後に、繰り返される。いくつかの実施形態において、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、初期投与計画の間に、2〜10投与が4日〜13日の定期的な投与間隔(DI)で投与される。
No 配列,5’−3'
4217 16 218b『C*b1sAb1sTb1』sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdCsdCs『Ab1sGb1sTb1sAb1』
No 配列,5'−3'
2064 16 209y 『Gb1sTb1s』dAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGs『Ab1sGb1sC*b1』
No 配列,5'−3'
2072 16 210q 『Gb1sC*b1sTb1sAb1s』dTsdTsdTsdGsdGsdTsdAsdGsdTs
『Gb1sTb1sTb1』
No 配列,5'−3'
2064 16 209x /5SpC3s/『Gb1sTb1s』dAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGs
『Ab1sGb1sC*b1』/3SpC3s/
No 配列, 5'−3'
429 15 152h 『C*b1sGb1sAb1sTb1s』dAsdCsdGsdCsdGsdTsdCsdCs『Ab1sC*b1sAb1』
No 配列,5'−3'
355 14 143h 『C*b1sTb1s』dCsdGsdTsdCsdAsdTsdAsdGsdAs『C*b1sC*b1sGb1』
No 配列,5'−3'
2355 17 213k 『C*b1sAb1sGb1s』dGsdCsdAsdTsdTsdAsdAsdTsdAsdAsdAs
『Gb1sTb1sGb1』
材料および方法
本願に使用されるほとんどのアンチセンス−オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドのコントロールまたは参照は、発明者/出願人の必要性に従って、カスタムオリゴヌクレオチドとしてEXIQONによって合成された。次の配列を有するオリゴヌクレオチドは、参照として使用された:
Ref.0=dCsdAsdGsdCsdCsdCsdCsdCsdGsdAsdCsdCsdCsdAsdTsdG(Seq.ID No.147c);
Ref.1=Ab1sAb1sC*b1sdAsdCsdGsdTsdCsdTsdAsdTsdAsC*b1sGb1sC*b1(Seq.ID No.76);
Ref.2=C*b1sAb1sGb1sdCsdCsdCsdCsdCsdGsdAsdCsdCsdCsAb1sTb1sGb1(Seq.ID No.147m);
Ref.3=TTGAATATCTCATGAATGGA;2’−MOE−ウィングス(5ユニット5’および3’)およびホスホロチオエート連結を有する(Seq.ID No.80);
Ref.4=;CAGAAGAGCTATTTGGTAGT、2’−MOE−ウィングス(5ユニット5’および3’)およびホスホロチオエート連結を有する(Seq.ID No.82);
Ref.5=TGGTAGTGTTTAGGGAGCCG(Seq.ID No.85),
Ref.6=GTGCAGGGGAAAGATGAAAA(Seq.ID No.344),
Ref.7=GAGCTCTTGAGGTCCCTGTG(Seq.ID No.345),
Ref.8=AGCCTCTTTCCTCATGCAAA(Seq.ID No.346),
Ref.9=CCTTCTCTGCTTGGTTCTGG(Seq.ID No.347),および
Ref.10=GCCATGGAGTAGACATCGGT(Seq.ID No.348)。
標準手順プロトコール
細胞培養:
FCS(ATCC#30−2020)
ピルビン酸ナトリウム(シグマ(Sigma)#8636)
重炭酸ナトリウム(シグマ(Sigma)#S8761−100ML)
トランスフェリン(シグマ(Sigma)#T8158−100MG)
亜セレン酸ナトリウム(シグマ(Sigma)#S5261−10G)
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Al
drich)#P4458)
非必須アミノ酸(AS)100×(シグマ(Sigma)#M7145)
抗生物質/抗真菌薬(シグマ(Sigma)#A5955)
MEMビタミン溶液(シグマ(Sigma)#M6895)
PBS(シグマ(Sigma)#D8537)
FGF塩基性 ヒト(ミリポア(Millipore)#GF003)
EGF ヒト(ミリポア(Millipore)#GF144)
N−2サプリメント(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)#
17502048)
ReNcell神経幹細胞維持培地(ミリポア(Millipore)#SCM005)培養および播種細胞:
培地を除去後、細胞をPBSで洗浄し、アクターゼ(accutase)(シグマ−ア
ルドリッチ#P4458)と共にインキュベートした(5分、RT)。培養後、細胞をピー
ニングし、全培地(3ml、会社:各細胞株については表10参照)を加えた。その後、
細胞を、5mlのエッペンドルフカップに移し、遠心分離した(5分、1000rpm、RT)。1 T75−ボトル(ザルスタッド(Sarstedt)#833.910.3
02)からのペレットを、2.5mlの新鮮な培地に再懸濁した。細胞懸濁液の細胞数を、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムアッセイ生存率キット(バイオジム(Biozym)#872045)を用いて染色することにより、ルナ(Luna)−FL(商標)自動細胞カウンター(バイオジム(Biozym)#872040)を用いて決定した。2μg/cm2の濃度での実験用の細胞を播種する前に、ディッシュのラミニンコーティング(ミリポア#CC095)がReNcellCX(登録商標)細胞の接着には必要であった。ラミニン−PBS溶液のそれぞれの量を、ウェルおよびフラスコに直接与え、1.5時間37℃でインキュベートした。実験のために細胞を、それぞれの実験章の方法の部分で述べられるように播種し、収穫した。37℃、5%CO2で細胞を一晩インキュベーションした後、細胞を、それぞれの実験的記述に説明されているように処理した。500μlの残りの細胞懸濁液を、細胞を培養するために、10mlの新鮮な完全な培地で満たされた新しいT75−ボトルに与えた。
RNA−解析
cDNA合成のための全RNAを、製造業者の指示に従って、innuPREP(登録商標)RNAミニキット(Analytik Jena(アナリティク イエナ) #845−KS−2040250)を用いて、単離した。cDNAを合成するために、全RNA含量を、フォトメーター(エッペンドルフ、バイオフォトメーター(BioPhotometer) D30#6133000907)を用いて決定し、ヌクレアーゼフリーの水を用いて希釈した。その後、最初cDNA鎖を、製造業者の推薦に従って、iScript(商標)cDNA合成キット合成キット(バイオラッド(BioRad)#170−8891)を用いて調製した。mRNA解析のために、リアル−タイムRT−PCRを、
CFX96 Touch(商標)リアルタイムPCR検出システム(バイオラッド(BioRad#185−5196)を用いて行った。
ウェスタンブロット:
タンパク質分析のために、細胞/組織を、製造業者の指示に従って、それぞれ、M−PER(登録商標)哺乳類タンパク質抽出試薬/T−PER(登録商標)組織タンパク質抽出試薬(サーモ サイエンティフィック、#78501/#78510)を使用して溶解した。SDS−アクリルアミド−ゲル(10%)を、製造業者の指示に従って、TGX
染色(Stain) フリー(Free)(商標) ファースト(Fast) キャスト(Cast)(商標)アクリルアミドキット(バイオラッド(BioRad)#161−0183)を使用して生産した。タンパク質サンプル(20μl)を、ラムリ(Lammli)−緩衝液(6.5μl、ロティ(登録商標)−ロード(Load)1、ロス(Roth)#K929.1)を用いて1:5に希釈し、60℃で30分間インキュベートし、
タンパク質溶液の全容量をゲル上にロードした。タンパク質の分離を、パワーパック(PowerPac)(商標)ベーシック(Baseic) パワー(Power) サプライ(Supply)(バイオラッド(BioRad)#164−5050−SP)およびミニ−プロテアン(Mini−PROTEAN)(登録商標)テトラセル(Tetra cell)電気泳動チャンバー(バイオラッド(BioRad)#165−8001−SP)(200V、45分)を使用して電気泳動によって行った。電気泳動後、タンパク質
を、トランス−ブロット(Trans−Blot)(登録商標)ターボ(Turbo)転送(Transfer)システム(バイオラッド(BioRad)#170−4155SP)を使用してブロットした。ウェスタンブロッティングのための全ての材料を、トランス−ブロット(Trans−Blot)(登録商標)ターボ(Turbo)RTA PVDF−ミディ(Midi)キット(バイオラッド(BioRad#170−4273)に含めた。
4000、GE ヘルスケア)を用いて検出した。その後、ブロットをTBS−Tで洗
浄し(3×10分、RT)、TBS−Tで希釈された5%BSAを有する溶液ブロックした(1時間、RT)。
使用して染色し、RTで乾燥した。
免疫細胞化学
細胞を前記したように処理し、採取した。8ウェルのロティ(登録商標)−ヒストフィックス4%(Histofi)(ロス(Roth)#P087.4)を用いて細胞の固定
化後、、細胞培養スライドディッシュ(6分、RT)をPBSを用いて3回洗浄した。ブロッキング液(Zytomed #ZUC007−100)を用いて1時間RTで細胞を
ブロッキング後、細胞を表14に記載の各一次抗体と共にインキュベートし、4℃で一晩インキュベートした。
H−1500)に定着させた。スライドを、蛍光顕微鏡(ツァイス(Zeiss)、アク
シオ(Axio)(登録商標)オブザーバー.Z1)の前に4℃で一晩乾燥した。画像を
、イメージ(image) J ソフトウェアおよびコーレルドロー(CorelDRAW)(登録商標)X7ソフトフェアを用いて解析した。
インビボ(in vivo)実験
末梢血単核細胞(PBMC)アッセイ
PBMCを、500mlの完全な輸血ユニットに対応するバフィーコートから単離した。各ユニットを、健康的なボランティアから得て、クエン酸グルコースを、抗凝着剤として使用した。バフィーコート血液は、輸血医学研究所の血液銀行ズール(Blood Bank Suhl of the Institute for Transfusion Medicine)、ドイツ、によって調製され送達された。各献血は、HIV抗体
、HCV抗体、HBs抗原、TPHA、HIV RNA、およびSPGT(ALAT)のために監視された。感染症因子に対して陰性であり、通常のSPGT値を有する唯一の試験された血液サンプルを、低速遠心分離によって白血球および赤血球の分離のために使用された。PBMCの分離を、献血に続いて、フィコール−ヒストパック(Ficoll−Histopague)(登録商標)1077(ヘレウス(Heraeus)(商標)マルチフュージ(Multifuge)(商標)3SR)を用いてグラジエント遠心分離により約40時間行った。IFNαアッセイのために、PBMCを100μl完全培地プラス添加剤(RPMI1640、+L−Glu、+10%FCS、+PHA−P(5μg/ml)、+IL−3(10μg/ml)に100,000細胞/96ウェルで播種し、試験テスト化合物(5μl)を直接インキュベーションのために加えた(24時間、37℃、5%CO2)。TFNαアッセイのために、PBMCを100μl完全培地w/o添加剤(RPMI1640、+L−Glu、+10%FCS)に100,000細胞/96ウェルで播種し、試験テスト化合物(5μl)を直接インキュベーションのために加えた(24時間、37℃、5%CO2)。huIFNα(イーバイオサイエンス(eBioscience)、♯BMS216INSTCE)のためにELISA(プールされた上清を除く二重反復測定、20μl)を製造業者のプロトコルに従って行った。huTNFα(
イーバイオサイエンス(eBioscience)、♯BMS223INSTCE)のためにELISA(プールされた上清を除く二重反復測定、20μl)を製造業者のプロト
コルに従って行った。
bDNAアッセイ
TGF−RII mRNAレベルを、製造業者の指示に従って、bDNAアッセイによって肝臓、腎臓、および肺の溶解物で決定した(クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)キット、パノミクス(Panomics)/アフィメトリクス(Affimetrix))。
免疫蛍光
パラフィン埋め込み脊髄および頭脳の組織を、5μm断片(物質プレートごとに3〜4
スライド)に切った。パラフィン断片は、電子レンジでクエン酸バッファー中で加熱する
ことにより(10mM、40分)、脱パラフィンおよび脱マスクした。その後、脱パラフィン化断片を、0.3%H2O2を用いてインキュベートし(30分、RT)、PBSを用いて洗浄し(10分、RT)、ブロッキング溶液(Zytomed #ZUC007−100)を用いて30分間ブロッキングした。ブロッキング溶液(Zytomed)を用
いて1時間RTでブロッキング後、断片を、150μlの各一次抗体を用いてインキュベートし、4℃で一晩インキュベートした。PBSを用いて洗浄後(3回、5分RT)、断片を、2次抗体を用いて1時間RTでインキュベートした。全ての抗体希釈液を、抗体希釈液(Zytomed#ZUC025−100)を用いて調製した。その後、断片を、PBSを用いて再び洗浄し(3回、5分、RT)、DAPIを有するVECTASHIELD(登録商標)マウンティング(Mounting)培地(ベクター(Vector))を用いて定着させた。免疫蛍光のための抗体は、細胞培養実験に相当し、各種に適合した。
電気化学発光
免疫学的および血液学的変化のために、電気化学発光の技術(メソスケール ディスカ
バリー(MesoScale Discovery)(登録商標)、メリーランド州、米国)を使用した。各アッセイのために、25μlのタンパク質、血液、およびアルコール試料を使用し、手順を製造業者の指示に従って行った。
BrdUアッセイ
分裂細胞の標識化を、チミジン類似体BrdU(シグマ(Sigma)、シュタインハイム、ドイツ)の50mg/体重kgでの腹腔内注射によって、0.9%(w/v)NaCl溶液中に10mg/mlのBrdUを溶解した滅菌溶液を用いて行った。BrdU注射は、最後の実験週内に毎日行われた。
外科処置
慢性の中心静脈注入のために、動物は、アルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ミニポンプ(マウス、ラット、注入率:0.25μl/h、アルゼット(Alzet)(登録商標)、モデル2004年、クパチーノ(Cupertino)、米国)、またはガ
ス圧ポンプ(カニクイザル、注入率0.25ml/24時間、Tricumed(登録商標)、モデルIP2000V、ドイツ)に取り付けられたicvカニューレのために外科
処置を受けた。カニューレおよびポンプを、ケタミン/キシラチン(xylacin)麻酔(バクスター(Baxter)、GmbH、ドイツ)および半滅菌条件の下で定位的に
埋め込んだ。各浸透圧ミニポンプ/ガス圧ポンプを、動物の首に皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植され、シリコーンチューブによって、icvカニューレと接続された。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレを、右側脳室へと降ろした。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)−Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのスチール製のネジで固定した。首
の皮を縫合で閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、動物を局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)
を用いて処置し、抗生物質(sc,バイトリル(Baytril)(登録商標)2.5%
バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。チューブを、各溶液で満たした。血液、アルコール、
および組織を分析のために収集した。icv移植部位の組織学的検証を、40μm冠状面のクレシルバイオレット染色脳断片で行った。
結果パラメーターおよび機能解析
症候性疾患の発症、初期麻痺の発症および生存を、インビボ(in vivo)エンドポイントとして使用した。症候性疾患の発症を、尾懸垂に反応する脚のストレッチの欠如として定義した。歩行障害が最初に検出された時点(例えば、よろよろ歩き(hobbl
ing)またはよたよた歩く(waddling)を、初期麻痺の発症として分類された。これらのパラメーターを、年齢40日に開始して毎日決定した。
まるランニングホイールへのアクセスと別にケージに入れた。運動活性は、ランニングホイールにおいて各動物によって生成される1分あたりの回転と直接相関した。ホイールの各フルターンは、2つの電磁信号を誘因するホイールの各フルターンは、最大120ホイールに接続されたコンピュータに直接供給された。ランニングホイールデータを、「マウス バイタル(Maus Vital)」ソフトウェア(Laser− und Medizin−Technoligie、ベルリン、ドイツ)で分析した。評価時間は午後6
時〜午前6時の12時間持続した。
空間学習試験(モリス−水−迷路)
行動試験を、8:00と13:00との間で行った。
温水で満たされた)で訓練され、同じ想像上の象限(近位の手がかり)の中心に全研究が
置かれる。各動物は、12のトライアル/セッション、1日あたり1つのセッションおよび10〜20秒の試行間間隔(inter−trial−interval)を有する3つの連続したセッションにおいてプラットフォームに移動するように訓練された。
微生物学的分析
アンチセンス−オリゴヌクレオチド試料は、Phに応じて微生物学的に分析された。Eur.2.6.12、USP30<61> 全好気性微生物数(TAMC)、および酵母とカビの全合計数(TYMC)に関する。
アニオン交換高速液体クロマトグラフィー(AEX−HPLC)
アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)試料の完全性および安定性を、AKTAexplore(商標)システム(GE ヘルスケア(healthcare)、フライブルク(Freiburg)、ドイツ)を用いてAEX−HPLCによって決定した。精
製されたASO試料をエタノール沈殿により脱塩した。ASOの同一性を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI−MS)によって確認され、純度を、Dionex DNAPac(商標)200(4×250mm)カラムを用いてAEX−HPLCによって決定した。
実施例1:mRNAレベルにおける本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの阻害活性の決定
1.1アンチセンス−オリゴヌクレオチドのトランスフェクション
TGF−RIIに向けられるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を、ヒト上皮肺癌細胞(A549)で試験した。TGF−RIImRNAを、TGF−RII特異的オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした細胞から分離された全mRNAにおける分岐DNAアッセイにより定量した。
方法の説明:
細胞を上述のように得て、培養した。アンチセンス−オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、96ウェルプレート上で10,000A549細胞/ウェルを播種した後に直接行い、製造業者によって記述されるように、リポフェクトアミン(登録商標)2000(インビトロジェン GmbH、カールスルーエ(Karlsruhe)、ドイツ、cat.No.11668−019)を用いて行った。4反復で行われた2つの独立した
単回投与実験において、オリゴヌクレオチドは、20nMの濃度でトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞を加湿器(ヘレウス(Heraeus)GmbH、ハ
ーナウ(Hanau)、ドイツ)で24時間、37℃で、5%CO2でインキュベートし
た。TGF−RIImRNAの測定のために、細胞を、分岐DNA(bDNA)の単離のために、QuantiGene(登録商標)Exploreキット(パノミクス(Panomics)、フリーモント(Fremont)、カリフォルニア州、米国、cat.No.QG0004)の製造業者によって推奨される手順にしたがって、収穫し、53℃で溶解した。ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAの定量のために、クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)Exploreキットを使用し、一方、TGF−RIImRNAの定量を、クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)2.0(Axolabs GmbH、ク
ルムバッハ(Kulmbach)、ドイツのカスタム製造)を用いて行った。インキュベ
ートおよび溶解後、10μl溶解物を、ヒトTGF−RIIおよびヒトGAPDHに特異的なプローブセットと共にインキュベートした。両方の反応型を、それぞれのクアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)キットのための製造業者のプロトコルに従って処理した。化学発光を、ベクター(Vector)2(商標)マルチラベル(multilabel)カウンター(counter)(パーキン エルマー(Perkin Elmer)、ヴィースバーデン(Wiesbaden)、ドイツ)で、RLU(相対光単
位)として測定し、TGF−RIIプローブセットを用いて得られた値を、ウェル毎にそれぞれのGAPDHに正規化し、その後、モック処理細胞から対応するmRNAの読み出し(readout)に正規化した。
結果
結果は、A549細胞のトランスフェクション後に様々なASOによりTGF−RIIの効率的な下方調節を示す。参照オリゴヌクレオチドRef.6〜Ref.10のトランスフェクション後の下方調節は、効率的ではないとして60%を超える下方調節に結果的にならなかった。
TGF−RIImRNAは、本発明のASOによって効果的に標的にされた。言及されたASOは、A549細胞のトランスフェクション後の効率的な標的mRNA下方調節を
達成した。
1.2 アンチセンス−オリゴヌクレオチドの裸の(Gymnotic)取り込み
1.2.1a A549およびPanc−1−細胞における裸の(gymnotic)送達による本発明のASOおよび先行技術配列の両方の標的ノックダウンの比較
TGF−RIIに向けられる様々なアンチセンス−オリゴヌクレオチドの下方調節活性を、ヒト上皮肺腫瘍細胞においてトランスフェクション試薬なしの直接的な取り込み(「裸の(gymnotic)取り込み」)によって試験した。TGF−RIImRNAを、TGF−RII特異的オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞から単離された全mRNAにおいて、分岐DNAアッセイにより定量化した。
方法の説明
細胞を一般的な方法に記載されるように得て、培養した。アンチセンス−オリゴヌクレオチドの裸の(Gymnotic)送達を、各アンチセンス−オリゴヌクレオチドと共に96ウェルプレートを調製し、続いて10,000細胞(Panc−1)または8,000細胞(A549)/ウェルを播種することによって、行った。実験を4反復で行い、オリゴヌクレオチドを、最終濃度5μM(Panc−1)および7.5μM(A549)で使用した。細胞を加湿インキュベーター(ヘレウス(Heraeus)GmbH、ハーナ
ウ(Hanau)、ドイツ)で72時間、37℃で、および5%CO2でインキュベート
した。TGF−RIImRNAの測定のために、細胞を、分岐DNA(bDNA)のために、クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)Exploreキット(パノミクス(Panomics)、フリーモント(Fremont)、カリフォルニア州、米国、cat.No.QG0004)の製造業者によって推奨される手順に従って、収穫し、53℃で溶解した。ハウスキーピング遺伝子GAPDHmRNAの定量のために、クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)Exploreキットを使用し、一方、TGF−RIImRNAの定量を、クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)2.0(Axolabs GmbH、クルムバッハ(Kulmbach)、ドイツの
カスタム製造)を用いて行った。インキュベートおよび溶解後、10μl溶解物を、ヒト
TGF−RIIおよびヒトGAPDHに特異的なプローブセットと共にインキュベートした。両方の反応型を、それぞれのクアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)キットのための製造業者のプロトコルに従って処理した。化学発光を、ベクター(Vector)2(商標)マルチラベル(multilabel)カウンター(counter)(パーキン エルマー(Perkin Elmer)、ヴィースバーデン(Wiesbaden)、ドイツ)で、RLU(相対光単位)として測定し、TGF−RIIプローブ
セットを用いて得られた値を、ウェル毎にそれぞれのGAPDHに正規化し、その後、PBS処理細胞から対応するmRNAの読み出し(readout)に正規化した。
No.209ax、およびSeq.ID No.209yの更なる修飾体、すなわち、明細書の表6において列挙されるASOは、これら3個のアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同程度の値を示した。さらに、Seq.ID No.152hの修飾体、すなわち、明細書の表5において列挙されるASOは、このアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同程度の値を示した。Seq.ID No.218bの修飾体、すなわち、明細書の表8において列挙されるASOは、このアンチセンス−オリゴヌクレオチドSeq.ID No.218bと同程度の値を示した。Seq.ID No.213kの修飾体、すなわち、明細書の表9において列挙されるASOは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドSeq.ID No.213kと同程度の値を示した。さらに、Seq.ID No.210qの修飾体、すなわち、明細書の表7において列挙されるASOは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドSeq.ID No.210qと同程度の値を示した。最後に、Seq.ID No.143hの修飾体、すなわち、明細書の表4において列挙されるASOは、アンチセンス−オリゴヌクレオチドSeq.ID No.143hと同程度の値を示した。表4〜表9に列挙されるアンチセンス−オリゴヌクレオチドの送達は、試験された参照配
列の送達と比較した標的TGF−RIImRNAのより強力な下方調節になるという結果になった(A549:下方調節<0.5;Panc1細胞:下方調節<0.4)。
本発明のASOの裸の(Gymotic)送達は、試験された参照配列の送達よりも標的TGF−RIImRNAの連続的な強い下方調節をもたらす。クレームされたアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、選択されたヒト細胞株とは独立して、先行技術から公知の全ての試験された配列より優れていた。それにもかかわらず、一般的に12個〜20個のヌクレオチドの長さを有するアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、より短い、またはより長いアンチセンス−オリゴヌクレオチドよりも標的TGF−RIImRNAのより効果的な下方調節をもたらす。この効果は、一般的に最も強力な効果を示す14個〜18個のヌクレオチドの長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドではさらにより顕著であった。
1.2.1b 分岐DNAアッセイによるA549細胞における裸の(gymnotic)送達の分析
トランスフェクションスクリーンからTGF−RIIに対する最も効果的なアンチセン
ス−オリゴヌクレオチドを、A549細胞における裸の(gymnotic)取り込みによってさらに特徴付けた。TGF−RIImRNAを、TGF−RII特異的オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞から単離された全mRNAにおいて、分岐DNAにより定量化した。
方法の説明
A549細胞を、標準的な条件下、前に記述されるように培養した。単回投与、および投与−応答実験のために、80,000細胞 A549細胞/ウェルを、6ウェル培養ディッシュに播種し、7.5μMの濃度でオリゴヌクレオチドと直接的にインキュベートした。TGF−RIImRNAの測定のために、細胞を、上記(1.1参照)に記述されるようにクアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)Exploreキット(パノミクス(Panomics)、フリーモント(Fremont)、カリフォルニア州、米国、cat.No.QG0004)の製造業者によって推奨される手順に従って、収穫し、53℃で溶解し、分岐DNAアッセイによって分析した。
結果
表16bにおいて列挙されたASOは、A549細胞におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較してTGF−RIIの標的mRNAレベルの低下を示した。10個の最も効率的なASOは、阻害濃度50(IC50)も試験された。Seq.ID No.209t、Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218cおよびSeq.ID No.209yは全体的に、低濃度レベルでのTGF−RIIの最も適切なノックダウンにつながった。
最も効率的な本発明のASOの標的下方調節は、トランスフェクション試薬なしで再び優れていた。したがって、裸の(gymnotic)送達が可能であり、さらなる薬剤開発に好適な方法である。
1.2.2 A549およびReNcell CX(登録商標)細胞における裸の(gymnotic)取り込みの分析
アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)による標的mRNAに対する阻害活性を、皮質脳領域からのヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標)細胞、ミリポア(Millipore)#SCM007)において決定した。治療対象として成人の神経新生に関する問題を、最も効果的なASOを用いる裸の(gymnotic)送達試験によって評価した。A549細胞を、参照細胞線株として用いた。
方法の説明
A549およびReNcell CX(登録商標)細胞を上述のように培養した。治療試験のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。A549およびReNcell CX(登録商標)細胞治療のために、培地を除去し、新しい全培地(24ウェルに0.5ml)に交換した。その後、Ref.1、Seq.ID No.218bを有するASO、およびSeq.ID No.218cを有するASOを、異なる時点(A549細胞:18時間、72時間、6日、ReNcell CX(登録商標)細胞:18時間、96時間、8日)での標的下方調節の分析のために、37℃および5%CO2で、2.5μMおよび10μMの濃度で培地に添加した。収穫のために、細胞を、PBSを用いて二回洗浄し、−20℃で凍結した。リアル−タイムRT−PCRによるmRNAの分析のために、細胞を上述のように処理した。リアル−タイムRT−PCRのために使用準備済の、および標準的なプライマーペア(表11参照)を使用し、製造業者の指示(バイオラッド(BioRad)プライム(Prime) PCR クイック(Quick) ガイド(Guide))に従って、それぞれ使用準備済みのマスターミックス液(SsoAdvanced(商標)Universial SYBR(登録商標)Green Supermix(バイオラッド(BioRad)#172−5271)と混合した。プローブを3反復として分析し、データを、バイオラッド(BioRad) CFX マネージャー(Manager)(商標) 3.1を用いてGNB2L1mRNAと比較して定量化し、その後、未処理コントロールに正規化した。統計は、Ordinary−one−way−ANOVA、続いてダネット(Dunnett’s)」ポストホック比較(post hoc comparison)を用いて算出された。
結果:
結果は、Seq.ID No.218bおよび218cを用いての裸の(gymnotic)送達は、A549細胞およびReNcell CX(登録商標)において、用量および時間依存的方法で適切な下方調節をもたらすことを示した(表17)。A549細胞
における標的mRNAは、18時間後に重大に減少し、72時間および6日後にさらにより効率的に減少した。18時間後、ReNcell CX(登録商標)において、10μMの裸の(gymnotic)取り込み後のTGF−RIImRNAの低下のみが観察され得るが、標的下方調節は、両方の試験濃度で72時間後に有意であり、8日目まで安定していた。
ASOの裸の(gymnotic)取り込みによる標的mRNAの効率的および安定した下方調節は、長期間の適用においても達成される。したがって、ReNcell CX(登録商標)細胞は、患者の治療オプションとして例えば成人の神経新生の回復に対処する実験のために使用することも可能である。同じことが、A549実験によって示される
ような他の指示に適用する。
実施例2:タンパク質レベルにおけるTGF−RIIに対するアンチセンス-オリゴヌク
レオチドの阻害活性の決定
ウェスタンブロット分析および免疫細胞化学は、TGF−RIImRNAレベルを減少させるかどうかを決定するために行われ、ヒト肺癌細胞(A549)およびヒト神経前駆体細胞(ReNcell CX(登録商標))における本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)による媒介は、標的タンパク質の減少をもたらす。
方法の説明
細胞を上述のように培養した。治療のために、細胞を6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300,80,000細胞/ウェル)
および、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802、10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。A549およびReNcell CX(登録商標)細胞の裸の(gymnotic)送達のために、培地を除去し、新しい全培地(6ウェルに1ml、8ウェルに0.5ml)に交換した。その後、Ref.1(スクランブルコントロール)、各本発明のASOを、A549細胞においては72時間後、ReNcell CX(登録商標)細胞においては96時間後の標的下方調節の分析のために、2.5μMおよび10μMのタンパク質濃度で培地に添加した。細胞を溶解し、一般的な方法部分に記述されるようにウェスタンブロットによって試験した。一次抗体抗TGF−RIIをTBS−T中に0.5%BSAを有する溶液で希釈し、4℃で2日間インキュベートした。その後、膜を、TBS−T中に0.5%BSAを有する溶液で希釈された2次抗体抗−ウサギIgG HRP−連結を用いてインキュベートした(1時間、RT)。インキュベーション後、 ブロットを、TBS−Tを用いて洗浄し、Luminata(商標)Forte
ウェスタンHRP基質(ミリポア(Millipore)#WBLUF0500)を用いて出現させ、バンドを蛍光画像アナライザ(イメージクアント(ImageQuant)(商標)LAS 4000、GE ヘルスケア)を用いて検出した。ハウスキーパー比
較のために、膜をHRP−共役抗−GAPDHを用いてインキュベートした(0.5%Blottoで1:1000、4℃、一晩)。デンシトメトリー(Densitometric)定量を、GAPDHと比較して算出し、その後イメージ(image)スタジオ(Studio)(商標)ライフ(Life)ソフトウェア(Software)を用いて未処理コントロールに正規化した。免疫細胞化学のための手順を、標準的なプロトコルに記述されるように行った。標的−下方調節の検証のために、抗−TGF−RIIを希釈し、4℃で一晩インキュベートした。Cy3ヤギ−抗−ウサギを二次抗体として使用した。全ての抗体希釈液を、抗体希釈液(Zytomed(登録商標)#ZUC025−100)を用いて調製した。細胞の試験を、蛍光顕微鏡(ツァイス(Zeiss)、アクシオ(Axio)(登録商標)オブザーバー.Z1)によって行った。画像を、イメージ(image) J ソフトウェアおよびコーレルドロー(CorelDRAW)(登録商標)X7ソフトフェアを用いて分析した。
結果および裸の(gymnotic)送達
ウェスタンブロット分析および免疫細胞化学は、TGF−RIIタンパク質レベルの減少を確認するのに使用された。裸の(gymnotic)送達後の72時間で、TGF−RIIタンパク質は、A549細胞における未処理コントロールと比較して、本発明に係る高濃度の異なるASOを用いて重大に減少した(表18)。減少したTGF−RIIレベルは、ReNcell CX(登録商標)細胞においても観察された(表18)。両方の細胞株について、TGF−RIIタンパク質レベルの減少は、ウェスタンブロット分析
によって示された。免疫細胞化学は、未処理細胞およびスクランブルコントロール処理細胞に比べて両方の細胞株におけるTGF−RIIタンパク質の強力な用量依存的減少を明らかにした。
標的mRNA下方調節に加えて、Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c、Seq.ID No.210q、Seq.ID No.213k、Seq.ID No.143h、Seq.ID No.152h、Seq.ID No.209az、およびSeq.ID No.209yの裸の(gymnotic)送達は、A549細胞および ReNcell(登録商標)細胞におけるタンパク質レベルの優れた減少をもたらした。TGF−RIIの染色は、両細胞株において、これらのASOを用いての治療後に用量依存的低減を明らかにした。
更なるASOを用いての裸の(gymnotic)送達後の結果
タンパク質分析は、試験されたASOのA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞の裸の(gymnotic)送達におけるTGF−RIIの量の減少を示した(10μM、表19)。このことは、免疫細胞化学によっても確認された。両細胞株ののために、試験されたASOの裸の(gymnotic)送達によるTGF−RIIタンパク質レベルの減少は、未処理細胞およびスクランブルコントロール処理細胞と比較して検出され得る。
まとめると、A549細胞および ReNcell CX(登録商標)細胞における裸の(gymnotic)送達によるTGF−RIImRNAの用量−依存的下方調節は、タンパク質レベルの用量−依存的減少をもたらした。本発明のASOは、A549細胞および ReNcell CX(登録商標)細胞において示されるようにタンパク質標的下方調節に影響を及ぼす。
実施例3:TGF−RIIの下流のシグナル伝達経路に対するアンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果の分析
機能分析をヒト肺癌細胞(A549)およびヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標))において行った。TGF−RIImRNAの効果的な下方調節および本発
明のASOにおける裸の(gymnotic)送達によるタンパク質レベルの減少に続いて、TGF−β下流シグナル伝達経路を分析した。したがって、TGF−βの下流−メディエーターとしても知られる結合組織成長因子(CTGF)のmRNAおよびタンパク質レベルを評価した。さらに、Smad2(マザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ2(mothers against decapentaphlegic homolog2))のリン酸化を試験した。Smad2のリン酸化は、TGF−β経路の活性化、続く、下流標的遺伝子CTGFの上方調節のためのマーカーである。
方法の説明
細胞を上述のように培養した。処理のために、細胞を6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(80,000細胞/ウェル)および、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。裸の(gymnotic)送達のために、A549およびReNcell CX(登録商標)細胞の培地を除去し、新しい全培地(6ウェルに1ml、および8ウェルに0.5ml)に交換した。その後、Ref.1(スクランブルコントロール)、配列識別番号218b(Seq.ID No.218b)、No.218c(Seq.ID No.218c)を有するASOを、2.5μMおよび10μMの濃度で培地に添加し、各分析を、A549細胞においては72時間後、ReNcell CX(登録商標)細胞においては96時間後に行った。CTGFmRNAレベルにおける効果を評価するために、リアル−タイムPCRを、以前に記述されるように行った。CTGF分析のためのプライマーペアは、使用準備済みであり、標準化された。CTGFおよびpSmad2タンパク質レベルをチェックするために、ウェスタンブロットおよび免疫細胞化学を、以前に記述されるように行った。各方法のための型および使用される希釈液を表13および表14に列挙した。
3.1.Seq.ID No.218bの結果
3.1.1CTGFmRNAおよびタンパク質レベルにおける効果
CTGFmRNAは、A549細胞(72時間)、およびReNcell CX(登録商標)細胞(96時間)においてASO Seq.ID No.218bを用いた裸の(gymnotic)送達後に、大幅に、および用量−依存的に減少した。TGF−βの下流−メディエーターは、10μMのSeq.ID No.218bを用いた裸の(gymnotic)送達後に、ReNcell CX(登録商標)細胞においては52%±0.02に、A549細胞においては39%±0.03に減少した(表20)。これらの下方調節されたCTGFmRNAレベルにしたがって、CTGFタンパク質発現の強い減少を、A549細胞において観察した(表21)。
TGF−βシグナリングの機能的阻害は、A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞において標的CTGFmRNAの下方調節およびCTGFタンパク質レベルの減少によって示されるように、Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達を用いて達成された。
3.1.2 pSmad2タンパク質レベルにおける効果
ASO媒介TGF−βシグナリング阻害の特異的結果としてのCTGF下方調節を証明するために、pSmad2タンパク質レベルを分析した。
A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるSeq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、TGF−βシグナリングの下流メディエーターの用量−依存的阻害をもたらした。CTGFおよびSmad2のリン酸化は、ASO Seq.ID No.218bによって減少し、共に、阻害されたTGF−β経路を示した。
3.2.Seq.ID No.218cの結果
3.2.1CTGFmRNAおよびpSmad2タンパク質レベルにおける効果
A549細胞、およびReNcell CX(登録商標)細胞においてASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達は、CTGFmRNAを下流調節する(表23)。pSmad2に対する免疫細胞化学は、TGF−βシグナリングの阻害を確認した(図6)。したがって、CTGFmRNAの下流調節は、TGF−βシグナリングの直接的な減少効果である。
ASO Seq.ID No.218cは、標的TGF−RIImRNAの下流調節後のTGF−βシグナリング阻害に効果的であった。このことは、CTGFmRNAの決定によって試験され、TGF−βシグナリングのためのマーカーとしてpSmad2タンパク質レベルを減少させた。
実施例4:TGF−β1処理細胞において、標的mRNAレベルにおける本発明のASOの阻害活性
4.1 TGF−β1前処理後のA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるASOの裸の(gymnotic)取り込み
病理学的条件下、皮質脳領域からのヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標)におけるアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の阻害活性を分析するために、細胞をトランスフォーミング成長因子−β1(TGF−β1)を用いて前処理した。以前の研究から、TGF−β1は、例えばALSなどの全ての神経疾患の脳脊髄液(CSF)において高濃度で見られると知られている。したがって、TGFβ−シグナリングにおけるASOの阻害活性を、前処理後、TGF−β1の存在で試験した。A549細胞は参照細胞株として使用された。
方法の説明
A549およびReNcell CX(登録商標)を上述のように培養した。処理研究のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。A549およびReNcell CX(登録商標)細胞処理のために、培地を除去し、新しい全培地(24ウェルに0.5ml)に交換した。48時間TGF−β1(10ng/ml、プロモセル(PromoCell)#C−63499)に続いて、培地を交換した。TGF−β1再処理を、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、ASO Seq.ID No.218b(10μM)、またはA
SO Seq.ID No.218c(10μM)を有する培地と組み合わせて行った。A549細胞をさらに72時間インキュベートし、一方、ReNcell CX(登録商標)細胞を96時間後に収穫した。収穫のために、細胞を、PBSを用いて二回洗浄し、続いて、以前に記述されるようなRNA単離(24ウェルディッシュ)を使用した。リアル−タイムRT−PCRのために使用されたプライマーペアを表11に列挙する。
4.1.1 Seq.ID No.218bの結果
ASO Seq.ID No.218bによるTGF−RIIのmRNA下方調節における効果は、A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞においてTGF−β1プレインキュベーションによって影響されなかった(表24、図7)。A549細胞における標的mRNAは、ASOを用いての単回処理後(残存mRNA:15%±0.05)に重大に下方調節したが、前処理に続くTGF−β1の存在下での処理後(残存mRNA:7%±0.01)も重大に下方調節した。ReNcell CX(登録商標)細胞において、ASO Seq.ID No.218bは、TGF−β1の非存在下で(25%±0.01)、またはTGF−β1前処理に続く、TGF−β1の存在下で(17%±0.02)TGF−RII mRNA阻害の同様の効力を示した。
標的mRNAは、両試験された細胞株におけるプレ−インキュベーションに続いて、TGF−β1の存在下で、本発明のASOの裸の(gymnotic)取り込みによって約20%に効果的に下方調節した。
4.1.2 Seq.ID No.218cの結果
ASO Seq.ID No.218cによるTGF−RIImRNAの下方調節は、A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞においてTGF−β1存在下で効果的であった(表25、図8)。両試験された細胞における標的mRNAは、ASO
Seq.ID No.218cを用いての単回処理にもかかわらず、またはTGF−β1の存在下で、重大に下方調節した。
まとめると。本発明のASOは、TGF−β1の存在下で、TGF−RIImRNAを下方調節するのに効果的であり、ASOが病理学的条件下で機能的であることを示す。
実施例5:TGF−β1処理細胞において、標的タンパク質レベルにおける本発明のASOの阻害活性
病理学的条件下、皮質脳領域からのヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標)におけるアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の阻害活性を分析するために、細胞をトランスフォーミング成長因子−β1(TGF−β1)を用いて前処理した。以前の研究から、TGF−β1は、例えばALSなどの全ての神経疾患の脳脊髄液(CSF)において高濃度で見られると知られている。したがって、TGFβ−シグナリングにおけるASOの阻害活性を、前処理後、TGF−β1の存在で試験した。A549細胞は参照細胞株として使用された。
方法の説明
細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されたように培養した。処理のために、細胞を6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(80,000細胞/ウェル)および、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。裸の(gymnotic)送達効果の調査のために(A549およびReNcell CX)、TGF−β1(プロモセル(Promocell)#C−63499)を用いたプレインキュベーション後、培地を除去し、新しい全培地(6ウェルディッシュ、および8ウェル細胞培養スラ
イドディッシュに1ml)に交換した。TGF−β1(10ng/ml、48時間)の曝露後、培地を交換し、TGF−β1(10ng/ml)、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、および本発明のASO(10μM)を細胞に組み合わせ、単回処理で加えた。A549細胞を、さらに72時間インキュベートし、一方、ReNcell
CX(登録商標)細胞を96時間後収穫した。続いて、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、その後、ウェスタンブロット分析に続くタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)のために、または細胞の免疫細胞化学試験(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中で)のために使用した。使用された技術のための手順は、以前に記述されるように行った。各方法のために使用された抗体および希釈液を、表13および14に列挙する
裸の(gymnotic)送達後の結果
A549細胞のウェスタンブロットおよび免疫細胞化学分析は、Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c、Seq.ID No.210q、Seq.ID No.213k、Seq.ID No.143h、Seq.ID No.152h、Seq.ID No.209az、Seq.ID No.209yが、TGF−β1の存在下で強力な標的下方調節を生じることを示した(表26)。固定化ReNcell CX(登録商標)細胞でのTGFRIIの染色は、A549細胞において観察された結果を確認した。試験されたASOは、単回処理後、TGF−β1の存在下でも、強力な標的下方調節を明らかにした。
TGF−β1プレインキュベーションに続いてSeq.ID No.218b、Seq.ID No.218c、Seq.ID No.210q、Seq.ID No.213k、Seq.ID No.143h、Seq.ID No.152h、Seq.ID No.209az、およびSeq.ID No.209yの裸の(gymnotic)送達後は、標的mRNA下方調節に加えて、A549細胞およびReNcell CX(登録
商標)細胞におけるタンパク質レベルの減少をもたらした。
更なるASOを用いての裸の(gymnotic)送達後の結果
ウェスタンブロット分析は、未処理細胞およびスクランブルコントロールを用いて処理された細胞と比較して、72時間の裸の(gymnotic)送達後のA549細胞におけるTGF−RIIタンパク質量の減少を示した(表27)。TGF−β1のプレインキュベーションに続く、試験されたASOの裸の(gymnotic)送達は、TGF−β1を用いて前処理に続く、スクランブルコントロールを用いた裸の(gymnotic)送達が行われた細胞と比較して、減少を誘発した。TGF−RIIに対する染色後のA549および ReNcell CX(登録商標)の免疫細胞化学試験は、試験されたASOが、TGF−β1の前処理で、またはTGF−β1の前処理をしないで裸の(gymnotic)送達後に、標的タンパク質の強力な減少を媒介したことを示した。
TGF−β1プレインキュベーション後でさへも、本発明のASOの裸の(gymnotic)送達は、A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるTGF−RIIタンパク質の減少をもたらす。
実施例6:TGF−β1プレインキュベーション後のTGF−RIIの下流のシグナル伝達経路に対する本発明のASOの効果の分析
機能分析をヒト肺癌細胞(A549)およびヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標))において行った。TGF−β1の存在下でのTGF−RIImRNAの効果的な下方調節および本発明のASOにおける裸の(gymnotic)送達によるタンパク質レベルの減少に続いて、TGF−β下流シグナル伝達経路を分析した。したがって、TGF−β1の下流−メディエーターとして知られる結合組織成長因子(CTGF)の
mRNAおよびタンパク質レベルを評価した。さらに、Smad2(マザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ2(mothers against decapentaphlegic homolog2))のリン酸化を試験した。Smad2のリン酸化は、TGF−β経路の活性化、続く、下流標的遺伝子CTGFの上方調節のためのマーカーである。
方法の説明
細胞を標準的なプロトコルで上述のように培養した。処理のために、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(80,000細胞/ウェル)および、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。裸の(gymnotic)送達効果の調査のために、TGF−β1を用いてプレインキュベーション後、培地を除去し、新しい全培地(6ウェルディッシュ、および8ウェル細胞培養スライドディッシュに1ml)に交換した。TGF−β1の曝露(10ng/ml)に続いて、培地を交換し、TGF−β1(10ng/ml)、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、Seq.ID No.218bを有するASO(10μM)、Seq.ID No.218cを有するASO(10μM)を、組み合わせて、および単回処理で細胞に加えた。A549細胞をさらに72時間インキュベートし、一方、ReNcell CX(登録商標)細胞を、96時間後に収穫した。その後、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA(24−ウェルディッシュ)、およびタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)、または細胞の免疫細胞化学試験(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中で)のために使用した。CTGFmRNAレベルにおける効果を評価するために、リアル−タイムPCRを、以前に記述されるように行った。CTGF分析のためのプライマーペアは、使用準備済みであり、標準化された。CTGFおよびpSmad2タンパク質レベルをチェックするために、ウェスタンブロットおよび免疫細胞化学を、以前に記述されるように行った。各方法のための型および使用される希釈液を表13および表14に列挙する。
6.1.Seq.ID No.218bの結果
6.1.1 CTGFmRNAおよびタンパク質レベルにおける効果
A549細胞(72時間、0.52±0.05)、およびReNcell CX(登録商標)細胞(96時間、0.70±0.25)においてASO Seq.ID No.218bを用いた裸の(gymnotic)送達後に、CTGFmRNAは、下方調節され、一方、5日間(A549:48時間+72時間、6.92±2.32)、または6日間(ReNcell CX:48時間+96時間、1.60±015)のTGF−β1インキュベーションは、それぞれ、CTGFmRNAの重大な上方調節を引き起こした。ASO Seq.ID No.218bは、TGF−β1の存在下でTGF−β1の効果を阻害することによるCTGFmRNA下方調節を誘発するのに十分効力があった(表28、図11)。mRNAレベルの観察によると、CTGFに対して染色する免疫細胞化学も、タンパク質レベルにおけるこのような観察を確認した(図12)。
TGF−β1の存在で、続くASO Seq.ID No.218bの処理は、最初にTGF−RIImRNAの下方調節をもたらし、二番目にCTGFmRNA並びにA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるタンパク質レベルの減少をもたらした。このことは、ASO Seq.ID No.218bは、高TGF−β1病理学的条件下で十分強力に活性であり、TGF−β1媒介効果から救うことができることを示す。
6.1.2 pSmad2タンパク質レベルにおける効果
CTGF下方調節が、TGF−β1存在下でASO Seq.ID No.218bにより媒介される特異的なTGF−βシグナリング阻害の結果であるかどうかを証明するために、pSmad2タンパク質レベルを分析した。
ASO Seq.ID No.218bは、TGF−β1の存在でA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるTGF−βシグナリングの機能的阻害をもたらし、pSmad2のリン酸化の減少が確認された。
6.2.Seq.ID No.218cの結果
6.2.1 CTGFmRNAおよびタンパク質レベルにおける効果
データは、スクランブルコントロールおよびTGF−β1の組み合わせ処理(A549:5.89、ReNcell CX(登録商標):1.25)と比較して、ASO Seq.ID No.218cおよびTGF−β1の組み合わせ処理(A549:0.86、ReNcell CX(登録商標):0.23)後のCTGFmRNA下流調節を示す(表30および図14)。これらの観察に加えて、CTGFにおける免疫細胞化学的染色は、ASO Seq.ID No.218cによるタンパク質レベルにおけるTGF−β1媒介効果の防止を確認した(図15)。
データは、ASO Seq.ID No.218cによるCTGFmRNAおよびタンパク質レベルにおけるTGF−β1誘導効果の効果的な防止を確認した。
6.2.2 pSmad2タンパク質レベルにおける効果
CTGF下方調節が、TGF−β1プレインキュベーションの存在でさへも、ASO Seq.ID No.218cによって媒介されるTGF−β1シグナリング阻害の結果であるかどうかを証明するために、pSmad2タンパク質レベルを分析した。
TGF−β1プレインキュベーションに続く組み合わせ処理は、Smad2のリン酸化におけるTGF−β1効果の抑制をもたらす(ウェスタンブロット分析、表31)。免疫細胞化学は、ウェスタンブロット分析によって観察されるデータを支持した(図16)。
ASO Seq.ID No.218cは、TGF−β1プレインキュベーションに続くASOの裸の(gymnotic)送達後のTGF−βシグナリングを効果的に阻害している。このことは、下流のpSmad2タンパク質レベルの試験によって示された。
実施例7:mRNAレベルにおけるアンチセンス−オリゴヌクレオチドの予防活性の決定(TGF−β1処理後)
皮質脳領域からのヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標)におけるアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の予防活性を分析するために、ASOを、トランスフォーミング成長因子−β1(TGF−β1)処理に続く裸の取り込みによって細胞に移した。
方法の説明
A549およびReNcell CX(登録商標)細胞を以前に記述されたように培養した。予防処理研究のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。その後、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、またはSeq.ID No.218bを有するASO(10μM)を、72時間(A549)、または96時間(ReNcell CX(登録商標))
培地に加えた。裸の(gymnotic)送達後のインキュベーション時間に続いて、TGF−β1(10ng/ml プロモセル(Promocell) #C−63499))を、培地置換なしで、細胞にさらに48時間で加えた。収穫するために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、リアル−タイムRT−PCRによるmRNA分析後のRNA単離(24−ウェルディッシュ)のために使用した。リアル−タイムRT−PCRのための使用準備済みのおよび標準化されたプライマーペアを使用し、製造業者の指示(バイオラッド(BioRad)プライム(Prime) PCR クイック(Quick)
ガイド(Guide))に従って、それぞれ使用準備済みのマスターミックス液(SsoAdvanced(商標)Universial SYBR(登録商標)Green Supermix(バイオラッド(BioRad)#172−5271)と混合した。方法は、以前に記述されたように行った。
7.1.Seq.ID No.218bの結果
ASO Seq.ID No.218bによるTGF−RIImRNAにおける効果は、A549およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるTGF−β1のポストインキュベーションによって影響されなかった(表32)。ReNcell CX(登録商標)細胞における標的mRNAの重大な減少は、ASO Seq.ID No.218bを用いて単回処理後に示された(0.33*±0.11)。TGF−β1の後処理を伴うASOの裸の(gymnotic)送達は、標的TGF−RIImRNAを強く減少させた。A549細胞において、Seq.ID No.218bは、単回処理(0.25±0.07)またはTGF−β1のポストインキュベーションを伴う組み合わせ処理(0.24±0.06)においてTGF−RIImRNAを阻害するのに同様の有効性を示した。
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)取り込みに続くT
GF−β1のポストインキュベーションは、標的TGF−RIImRNA下方調節において有効であり、ASO Seq.ID No.218bは、医学的適応における予防処理に適している。
実施例8:TGF−β1処理に続くタンパク質レベルにおける本発明のASOの阻害活性の決定
皮質脳領域からのヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標))における本発明のASOの予防活性を分析するために、ASOを、TGF−β1処理に続く裸の取り込みによって細胞に移した。
方法の説明
細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されるように培養した。処理のために、細胞を8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。その後、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、またはASO配列特定ナンバー218b(Seq.ID No.218b、10μM)を、72時間(A549細胞)、または96時間(ReNcell CX(登録商標))培地に加えた。裸の(gymnotic)送達に続いて、TGF−β1(10ng/ml、プロモセル(Promocell)#C−63499))を、培地置換なしで、さらに48時間で細胞に加えた。収穫するために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いて、免疫細胞化学分析に使用した。手順を、以前に記述されたように行った。各方法に使用される抗体および希釈液を表13および表14に列挙する。
8.1 TGF−β1処理に続くSeq.ID No.218b、を用いた裸の(gymnotic)送達後のTGF−RIIタンパク質減少の結果
A549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞に対する免疫細胞化学分析は、ASO Seq.ID No.218bが、続くTGF−β1処理後に強力なTGF−RIImRNA標的下方調節を生成することを示した(図17)。
結論
TGF−β1処理に続くASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、標的mRNA下方調節、並びにA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞における強いTGF−RIIタンパク質レベルの減少をもたらす。
実施例9:TGF−β1処理に続くTGF−RIIの下流のシグナル伝達経路におけるASO処理効果
TGF−βシグナリングの阻害を媒介することにおける本発明のASOの効果は、ヒト肺癌細胞(A549)およびヒト神経前駆細胞(ReNcell CX(登録商標))におけるTGF−β1処理に続く裸の(gymnotic)送達を評価した。したがって、TGF−βシグナリングの下流分子、Smad2(マザーズアゲンストデカペンタプレジックホモログ3(mothers against decapentaphlegic
homolog 3)および結合組織成長因子(CTGF)を分析した。
方法の説明
細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されるように行った。処理のために、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)および、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。その後、Ref.1(スクランブルコントロール、10μM)、またはASO Seq.ID No.218b(10μM)を、培地に72時間(A549)、または96時間(ReNcell CX(登録商標))で加えた。裸の(gymnotic)送達に続いて、TGF−β1(
10ng/ml、プロモセル(Promocell)#C−63499)を、培地の交換なしに、さらに48時間で加えた。収穫するために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA単離(24−ウェルディッシュ)、または細胞の免疫細胞化学試験(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中で)のために使用した。CTGFmRNAレベルにおける効果を評価するために、リアル−タイムRT−PCRを、以前に記述されるように行った。CTGF分析のためのプライマーペアは、使用準備済みであり、標準化された。pSmad3タンパク質レベルを決定するために、免疫細胞化学を、以前に記述されるように使用した。各方法のための型および使用される希釈液を表13および表14に列挙する。
9.1.Seq.ID No.218bの結果
9.1.1 CTGFmRNAおよびpSmad3タンパク質レベルにおける効果
CTGFmRNAは、A549細胞(5日:0.67±0.02)、およびReNcell CX(登録商標)細胞(6日:0.70±0.02)においてASO Seq.ID No.218bを用いた裸の(gymnotic)送達後に減少した。それぞれ、72時間、または96時間後にTGF−β1を添加し、細胞は、CTGFmRNAの増加に反応するが、TGF−β1処理に続くスクランブルコントロールの裸の(gymnotic)送達と比較して、CTGFmRNAの誘導は強く減少した(表33)。CTGFmRNA下流調節は、TGF−βシグナリング阻害の結果であり、続くTGF−β1処理後でも、ASO Seq.ID No.218bによって媒介されるかどうかを検証するために、pSmad3タンパク質レベルを試験した。図18は、TGF−βシグナリングが、A549細胞(図18A)およびReNcell CX(登録商標)細胞(図18B)において、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達によって、事実上阻害されたことを示す。この効果は、TGF−β1処理に続く試験されたASOの裸の(gymnotic)送達後も存在した。
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、TGF−β1処理に独立して、TGF−RIImRNAの下方調節、並びにA549細胞およびReNcell CX(登録商標)細胞におけるCTGFmRNAおよびpSmad3タンパク質レベルの減少をもたらした。
実施例10:アンチセンス−オリゴヌクレオチドの潜在的な炎症性および毒性効果の分析
10.1 末梢血単核細胞(PBMC)アッセイ
免疫賦活特性のためアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の免疫賦活特性を分析するために、末梢血単核細胞(PBMC)を、コントロールASOおよび試験化合物とインキュベートし、続いてIFNαおよびTGFαのためにELISAを行った。
方法の説明
PBMCを500mlの全輸血ユニットに対応するバフィーコートから単離した。各ユニットを、健康なボランティアから得て、クエン酸グルコースを、抗接着剤として使用した。バフィーコートは、輸血医学研究所の血液銀行ズール(Blood Bank Suhl of the Institute for Transfusion Medicine)、ドイツ、によって調製され送達された。各献血は、HIV抗体、HCV抗体
、HBs抗原、TPHA、HIVRNA、およびSPGT(ALAT)のために監視された。感染症因子に対して陰性であり、通常のSPGT値を有する唯一の試験された血液サンプルを、低速遠心分離によって白血球および赤血球の分離のために使用した。PBMCの分離を、献血に続いて、フィコール−ヒストパック(Ficoll−Histopague)(登録商標)1077(ヘレウス(Heraeus)(商標)マルチフュージ(Multifuge)(商標)3SR)を用いてグラジエント遠心分離により約40時間行った。IFNαアッセイのために、PBMCを100μl完全培地プラス添加剤(RPMI1640、+L−Glu、+10%FCS、+PHA−P(5μg/ml)、+IL−3(10μg/ml)に100,000細胞/96ウェルで播種し、試験テスト化合物(5μl)を直接インキュベーションのために加えた(24時間、37℃、5%CO2)。TFNαアッセイのために、PBMCを100μl完全培地w/o添加剤(RPMI1640、+L−Glu、+10%FCS)に100,000細胞/96ウェルで播種し、試験化合物(5μl)を直接インキュベーションのために加えた(24時間、37℃、5%CO2)。huIFNα(イーバイオサイエンス(eBioscience)、♯BMS216INSTCE)のためにELISA(プールされた上清を除く二重反復測定、20μl)を製造業者のプロトコルに従って行った。huTNFα(イーバイオサイエンス(
eBioscience)、♯BMS223INSTCE)のためにELISA(プールされた上清を除く二重反復測定、20μl)を製造業者のプロトコルに従って行った。
結果
ASOインキュベーションに対して検出できるIFNα(表34)およびTNFα(表35)分泌がないことによって、PBMCにおけるASO処理の免疫賦活効果はないことが示された。分析機能は、免疫賦活化、コレステロール共役siRNA(XD−01024;IFNα)、および(二本鎖RNAの合成類似体であり、TLR3に結合し、免疫システムを刺激する)ポリイノシン:ポリシチジン酸(polyI:C;インビボジェン(InvivoGen)#tlrl−pic)における免疫賦活効果によって証明される。
アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)の毒性特性を分析するために、C57/Bl6Nマウスは、ASO静脈注射を3回受け、続いて殺処分され、血清、肝臓、および腎臓内のトランスアミナーゼレベルを調べた。
方法の説明
年齢6週の雌のC57/Bl6Nマウスを、試験化合物(Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c)を用いて7日間処理した。ASO(200μl、1
5mg/kg/BW)を、治療期間の1日目、2日目、および3日目に静脈内に注射した
。体重の進展(Seq.ID No.218c)を連続して毎日監視し、1日につき4回の血清を、静脈ファシキュラリス(Vena fascicularis)から採集めた。8日目に動物を殺処分し(CO2)、大静脈、肝臓(〜50mgの破片)、腎臓、および肺からの血清を、mRNAおよびトランスアミナーゼの定量のために採集した。TGF−RII mRNAレベルを、bDNAアッセイによって肝臓、腎臓、および肺の溶解物で決定した(クアンチジーン(QuantiGene)(登録商標)キット、パノミクス(Panomics)/アフィメトリクス(Affimetrix))。アスパラギン酸トランスアミナーゼ(ASP)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)を、コバス(Cobas) インテグラ(Integra)(登録商標)400で1:10希釈血清から測定した。
実施例11:インビボ(in vivo)においてTGF−β誘導神経幹阻害および神経前駆細胞増殖における本発明のASOの脳室内注入の決定
本研究の目標は、インビボ(in vivo)において神経幹および神経前駆細胞増殖におけるTGF−β1誘導効果をi)防ぐために、およびii)処理するためにTGF−RIIに対する本発明のASOの可能性を評価することであった。
方法の説明
11.1 神経発生のTGF−β1関連下流調節の防止
2ヶ月歳の雌のフィッシャー(Fischer)−344ラット(n=32)は、ステンレススチール製カニューレに接続された浸透圧ミニポンプ(2002年モデル、アルゼ
ット(Alzet))を介して脳室内注入を受けた。ミニポンプの外科的移植を、筋肉内
注射を使用して深麻酔下行った。動物は、本発明に係る本発明のASO(ポンプ内に1.
64mM濃度存在)、スクランブルASO(ポンプ内に1.64mM濃度存在)、またはC
SF(人工髄液)を7日間注入された。8日目にポンプが変更され、動物は、i)CSF、ii)TGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)、iii)TGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)+スクランブルASO(ポンプ内に1.64mM濃度存在)、またはiv)TGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)+本発明のASO(ポンプ内に1.64mM濃度存在)を14日間注入された。注入期間の終わりに、全ての動物を、4%パラホルムアルデヒドを用いて経心腔的灌流した。脳を、カニューレ管局在のために分析し、不適切なカニューレ配置を有する動物を、分析から除外した。ポンプ期間の最後の24時間の間に、動物は、200mg/kgブロモ−デオキシウリジン(BrdU)の腹腔内注入を受けた。
平面)またはカウンティングフレームの側面除外境界を交差した陽性プロファイルは数え
られなかった。海馬の分析のため、海馬の用量を決定し、境界内のおよび境界に隣接するすべての陽性細胞が数えられた。各構造体のBrdU陽性細胞数の予測値を得るために、陽性プロファイルの総数を、試料容量に対する参照容量の比率によって乗算した。すべての推定を、1つの大脳半球のために算出し、総脳値を表すために倍増するべきである。データを平均値±標準偏差(SD)として表す。統計分析を、TGF−β1処理群およびコントロール群間で、不対の、両側t検定比較−スチューデント(Student’s)t検定を用いて行った(グラフパッド(GraphPad)プリズム(Prism)4ソフトウェア、米国)。有意レベルをP<0.05に仮定した。
11.2 神経発生のTGF−β1関連下流調節の治療
動物は、CSFまたは組換え体ヒトTGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)のどちらかを、毎時0.5μlの流速で14日間受けた。14日後、ポンプを変更し、動物は、i)CSF、ii)組換え体ヒトTGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)、またはiii)本発明のASO(ポンプ内に1.64mM濃度存在)+組換え体ヒトTGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)を有する共注入体、またはiv)スクランブルASO(ポンプ内に1.64mM濃度存在)+組換え体ヒトTGF−β1(ポンプ内に500ng/ml存在)を有する共注入体のどれかを用いて注入された。注入期間の終わりに、全ての動物を、4%パラホルムアルデヒドを用いて経心腔的灌流した。脳を、カニューレ管局在のために分析し、不適切なカニューレ配置を有する動物を、分析から除外した。ポンプ期間の最後の24時間の間に、動物は、200mg/kgブロモ−デオキシウリジン(BrdU)の腹腔内注入を受けた。組織学的分析は、上述のように行った(11.1)。
結果:
ASO Seq.ID No.143aj、Seq.ID No.143h、およびSeq.ID No.210qを用いた処理は、明確に、および部分的に、海馬における、および室壁における細胞増殖のTGF−β1効果を減少させた。本発明のASOを用いる処置は、神経新生におけるTGF−β1の阻害効果から明確におよび部分的に救助する。結論:齧歯動物との交差反応性を示す本発明のASOは、このインビボ実験における神経新生を誘導する。交差反応性を示さない本発明のASOは、インビボ実験において、大抵は、より多くの潜在的な効果を及ぼす。結果として、これらの本発明のASOは、インビボセットアップにおいて、非ヒト霊長類およびヒトにとってより有効でもあり、したがって、TGF−β1誘導の神経幹阻害および前駆細胞増殖を予防する、または治療するための非常に強力な薬として機能する。
実施例12:増殖に対する本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果、およびヒト神経前駆細胞の特異的マーカーの分析
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、今までのところ効果的な治療のない神経変性致死疾患である。現在の分子遺伝的キャンペーンは、この致命的な病気の分子病態をますます解明しており、以前の研究から、TGF−βはALS患者の脳脊髄液(CSF)において高濃度に発見されることが知られている。TGF−βの高レベルの循環は、幹細胞の静止を促進するので、脳の脳室下帯(SVZ)内の成体の神経新生の阻害を引き起こすことが知られている。したがって、変性神経の再生は、高められたTGF−βシグナリングによって予防されるようである。 本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドによって媒介されるTGF−βシグナリングの選択的阻害が、成体の神経新生の再活性化を許可する可能性があるかどうかを見つけ出すだめに、TGF−β媒介細胞周期の停止の証拠を、証明しなければならない。
方法の説明
細胞周期停止研究 細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されるように培養した。実験
のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。増殖条件下(+EGF/FGF)(Millipore(ミリポア):EGF#GF144、bFGF♯GF003)、または分化条件下(−EG
F/FGF)で細胞周期におけるTGF−β1媒介効果の決定のために、細胞を、各培地の除去および交換後に、TGF−β1(プロモセル(Promocell)#C−63499、10ng/ml、または50ng/ml)を用いて4日間処理した。4日目に培地をリフレッシュし、TGF−β1処理を7日目まで繰り返した。7日目に、残存細胞を、PBSを用いて2回洗浄することによって収穫し、続いて上述されるようにRNA(24−ウェルディッシュ)単離のために使用した。リアル−タイムRT−PCRによって細胞周期におけるTGF−β1媒介効果を評価するために、増殖マーカーKi67の、腫瘍抑制遺伝子p53の、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1(p21)の、および神経新生マーカーダブルコルチン(Doublecortin)(DCX)のmRNAを分析した。各プライマーペアを、表11に列挙する。
ヒト神経前駆細胞におけるASO Seq.ID No.218bの効果のためのmRNA分析 細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されるように培養した。実験のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。本実験のために細胞培地を変更し、Ref.1(スクランブルコントロール、2.5μMおよび10μM)、Seq.ID No.218bのASO(2.5μMおよび10μM)、またはTGF−β1(10ng/ml、プロモセル(Promocell)#C−63499)を、96時間細胞に加えた。インキュベーション時間後、培地をもう一度交換し、更なる処理を、更に96時間行った。処理の8日後に細胞を収穫した。細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA(24−ウェルディッシュ)単離のために使用した。前駆細胞に及ぼす効果を評価するために、ネスチン(Nestin)(初期神経細胞マーカー)、ソックス2(Sox2)(初期神経細胞マーカー)、DCX(神経新生のインジケーター)、およびKi67(増殖マーカー)mRNAレベルを、以前に記述されるようにリアル−タイムRT−PCRによって決定した。各プライマーペアを、表11に列挙する。
ReNcell CX(登録商標)細胞における裸の(gymnotic)送達によるTGFRII特異的ASOの増殖性効果および分化効果:次の目的は、TGF−RII特異的ASOが、ReNcell CX(登録商標)細胞の増殖に影響を与えるかどうかを調査することであった。したがって、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)または、8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。増殖曲線を得るために、細胞を、培地交換後、72時間、Ref.1(スクランブルコントロール、2.5μMおよび10μM)、およびASO Seq.ID No.218b(2.5μMおよび10μM)を用いて処理した。インキュベーション時間後、培地を交換し、処理を2回繰り返した。上澄みを採集後、残存細胞を、細胞数の決定のために24ウェルディッシュから収穫した。この目的のために、残存細胞を、PBSを用いて洗浄し(2×)、アクターゼ(500μl/ウェル)を用いて処理し、5分間37℃でインキュベートした。その後、500μl培地を加え、細胞数を、製造業者の指示に従って、ルナ(Luna)−FL(商標)自動細胞カウンター蛍光および明視野(Bright Field)(バイオジム(Biozym)872040)を用いて決定した。簡単に、18μlの細胞懸濁液を、2μlのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムアッセイ生存率キット(バイオジム(Biozym)#872045)に加えた。セッティングの1分後、10μlを、細胞カウントスライド(Cell Counting Slide)(バイオジム(Biozym)#872011)に加え、細胞をカウントし、全細胞/mlおよび死細胞と比較して生存細胞の割合を算出した。Ref.1
(10μM)、Seq.ID No.218b(10μM)の送達、および8日間のTGF−β1(10ng/ml)の対応する処理の後に、8−ウェル細胞培養スライドディッシュの細胞を固定し、Ki67キットに対する抗体を用いて染色した。裸の(gymnotic)送達後のReNcell CX(登録商標)細胞の分化能力を調査するために、他の8−ウェル細胞培養スライドディッシュを、Ref.1(10μM)、Seq.ID
No.218b(10μM)を用いて処理し、増殖条件下(+EGF/FGF)、96時間、TGF−β1(10ng/ml)の対応する処理をした。その後、細胞の一部をさらに96時間増殖条件下で処理し、一方、細胞の他の部分を、処理し、分化条件下(−EGF/FGF)に保持した。細胞の染色に続いて、ニューロフィラメント N (NeuN)およびβIII−チューブリン発現レベルを蛍光顕微鏡によって決定した。細胞を収穫し、固定し、染色するプロトコルは、以前に記述され、各抗体希釈液を表14に列挙する。
TGF−β1プレ−インキュベーションに続く裸の(gymnotic)送達後の増殖および神経新生のためのマーカーのmRNA分析:細胞を標準的なプロトコルで以前に記述されるように培養した。実験のために、細胞を24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。細胞周期停止を誘導するために、ReNcell CX(登録商標)細胞を、TGF−β1を用いて4日間処理した。その後、培地を変更し、TGF−β1(10ng/ml)を新たに加えた。1日に8個の培地をもう一度交換し、裸の(gymnotic)送達を、Ref.1(10μM)、Seq.ID No.218b(10μM)をTGF−β1(10ng/ml)と組み合わせて加えることによって96時間行った。細胞を、インキュベーション後にPBSを用いて2回洗浄することによって収穫した。続くRNA単離およびリアル−タイムRT−PCRによるmRNA分析を、記述されるように行った。
12.1.1 ヒト神経前駆細胞におけるTGF−β1による細胞周期停止の媒介
幹細胞静止マーカーの検出は、TGF−β1が細胞の曝露後7日で細胞周期停止を媒介することを示した。増殖マーカーKi67mRNA発現は用量依存的に減少した。さらに、腫瘍抑制遺伝子p53のmRNA発現は、TGF−β1濃度と相関して下方調節された。対照的に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1(p21)は、TGF−β1によって重大に上方調節された。要約すると、これらの結果は、TGF−β1によって誘導される幹細胞静止を示す。興味深いことに、神経新生のためのマーカー、DCXは、TGF−β1によって強く減少した(表41)。
ReNcell CX(登録商標)細胞の増殖はTGF−β1によって阻害された。
12.1.2 ヒト神経幹細胞のマーカーに及ぼすアンチセンス−オリゴヌクレオチド効果の結果
幹細胞マーカーに及ぼすASO Seq.ID No.218bの効果を見つけ出すために、ReNcell CX(登録商標)細胞において繰り返しの裸の(gymnotic)送達後8日で初期神経前駆細胞の異なるマーカーを試験した(表42)。ネスチンおよびSox2遺伝子発現レベルは、ASO Seq.ID No.218bによって影響されなかった。GFAPmRNAは、10μMのASO Seq.ID No.218bを用いた裸の(gymnotic)送達後にわずかに上方調節し、対照的に、DCXは、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)取り込み後に明らかに誘導された。全ての試験されたマーカーの発現は、TGF−β1処理後(8日)に強く減少した(表42、図19)。
mRNA分析の結果、ASO Seq.ID No.218bは、さらに多くの幹細胞様状態の方向にReNcell CX(登録商標)細胞を導く(GFAP上方調節)、さらに、DCXの誘導は、神経新生の上昇を示す。TGF−β1処理は、反対の方向になるという結果をもたらす。
12.1.3 ヒト神経幹細胞の増殖に及ぼすアンチセンス−オリゴヌクレオチド効果の結果
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、繰り返しの裸の(gymnotic)送達(3×72時間)後9日の細胞をカウントすることによる増殖速度、および裸の(gymnotic)取り込み(2×96時間)後8日のKi67タンパク質レベルの決定、に真に効果を有するかどうか調査するために行った。
結果
細胞数は、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)取り込み後、細胞の免疫化学染色において観察された増殖マーカーKi67のタンパク質発現の上昇にしたがって、上昇した(表43、図20)。免疫細胞化学染色の蛍光分析も、TGF−β1によって媒介される増殖ステップを明らかにした。
ReNcell CX(登録商標)細胞においてASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、Ki67タンパク質発現の向上と並行して、細胞数の増加をもたらし、全体的に神経前駆体の増殖の増加を示す。
12.1.3 ヒト神経幹細胞における分化能力に及ぼすアンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果の結果
分化するための細胞能力に及ぼすASO Seq.ID No.218bの影響を除外するために、ASO Seq.ID No.218bを、増殖条件下(+EGF/FGF)、96時間、裸の(gymnotic)取り込みによって細胞に移した。インキュベーション時間後、培地を交換し、細胞増殖培地の一部に加え、一方、細胞分化培地の他の部分(−EGF/FGF)に加えた。その後、 TGF−β1(10ng/ml)の対応する処理をした。その後、96時間の他の裸の(gymnotic)送達を行った。細胞を、神経細胞マーカーのニューロフィラメント N (NeuN)およびβIII−チューブリンの発現レベルもよって分析した。
結果
NeuN(図23A)およびβIII−チューブリン(図23B)に対する免疫化学染色は、増殖条件下の裸の(gymnotic)ASO送達に続く、分化条件下の裸の(gymnotic)送達後に分化する能力に影響を及ぼさないことを示す。ヒト神経特異的タンパク質であるβIII−チューブリンのシグナルは、分化条件下でASO Seq.ID No.218bによって影響されず、未処理コントロールに匹敵した。NeuN発現も、分化条件下の裸の(gymnotic)送達後に影響されなかった。したがって、細胞は、未だに神経細胞に分化することができる。驚くべきことに、ReNcell CX(登録商標)細胞は、増殖条件下(2×96時間)、両期間で、ASOの裸の(gymnotic)送達後の神経マーカーNeuNおよびβIII−チューブリンを発現し、ASOの裸の(gymnotic)送達は、増殖条件下でさへ神経の分化へ特異的シフトを促進し得ることを示す。さらに、神経前駆細胞の増殖率の上昇を観察した(表43、図20)。さらに、NeuNに対する染色は、ASO Seq.ID No.218bを用いて処理された細胞が、全ての他の処理と比較して、より生存できるように見えることを明らかにした(図21A)。明らかに、TGF−β1を用いて処理された細胞は、増殖性が重大に低かった。
結論
分化能力は、本発明のASO Seq.ID No.218bによって影響されなかった。興味深いことに、ReNcell CX(登録商標)細胞は、増殖および分化条件下
で裸の(gymnotic)送達後に神経に分化することを示した。このことは、本文中で増加した増殖速度の観察において示しており、本発明のASO Seq.ID No.218bは、神経分化の上昇傾向を伴う神経新生を促進することを示す。
12.1.4 TGF−β1プレインキュベーション後のヒト神経幹細胞の増殖における本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの結果
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達が、ReNcell CX(登録商標)細胞における逆のTGF−β1媒介効果に効果的であるかどうか分析するために、更なる研究を、7日間のTGF−β1プレインキュベーション、続く8日間の裸の(gymnotic)送達(2×96時間)と共に行った。
結果
初期神経マーカーとしてGFAP(表44、図22A)、増殖マーカーとしてKi67(表44、図22B)、および神経新生マーカーとしてDCX(表44、図22C)の遺伝子発現は、単回のASO処理後に上昇し、一方、TGF−β1は反対の結果をもたらした。さらに、TGF−β1プレインキュベーション後7日に、本発明のASO処理は、TGF−β1誘導効果を逆転させた。したがって、分析は、ASO Seq.ID No.218bが幹細胞および増殖マーカーに対してTGF−β1媒介効果を回復させること影響を及ぼすことを示す。
結果は、成体の神経新生が、本発明のTGF−RII特異的ASO−媒介TGF−βシグナリング阻害によって再活性化され得ることを示す。
実施例13:SOD1マウスにおいて本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドにおけるALSの疾患進行の治療活性の決定
筋萎縮性側索硬化症(ALS)のための薬としてASOの治療可能性を分析するために、雄および雌のトランスジェニックのSOD1 G93Aマウスを、浸透圧アルゼット(ALZET)(登録商標)ミニポンプを介して側脳室にicvカニューレによって本発明のASOの異なる投与量を用いて処理した。さらに、リルゾール(riluzole)を参照として使用した。リルゾールは筋萎縮性側索硬化症を治療するために使用される薬であり、サノフィ(Sanofi) ファーマシューティカルズ(Pharmaceuticals)社によって販売される。選択された患者において、人工呼吸器依存性または気管切開の発現を遅延し、約2〜3ヶ月生存率を高め得る。
方法の説明:
長期の中心静脈注入のために、アルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ミニポンプ(注入率:0.25μl/h、アルゼット(Alzet)(登録商標)、モデル2004年、クパチーノ(Cupertino)、米国)に取り付けられたicvカニューレを
、イソフルラン麻酔(バクスター(Baxter)、GmbH、ドイツ)および半滅菌条
件の下で定位的に埋め込んだ。各浸透圧ミニポンプを、マウスの首に1cmの長さの皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植し、シリコーンチューブによって、icvカニューレと接続した。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレ(23G、3mm長さ)を、右側脳室へと降ろした(ブレグマ(bregma)に対して相対的に後部0.3mm、側部1mm、深さ3mm)。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて
2つのステンレススチール製のネジで固定した。首の皮を縫合で閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、マウスを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)を用いて処置し、0.1mlの抗生
物質(sc,バイトリル(Baytril)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。チューブを、各溶液で満たした。ASO効果をALSの発展および進行、症
状の発症、不全麻痺、並びに生存率をインビボ(invivo)エンドポイントとして使用した。9週の年齢のマウスを殺処分し、脳を神経病理学分析のために除去した。icv移植部位の組織学的検証を、40μm冠状面、クレシルバイオレット染色脳断片で行った。
実施例14:R6/2マウスにおいてハンチントン病の疾患発展および進行におけるTGF−RIIに関するアンチセンス−本発明のASOの治療活性の決定
ハンチントン症(HD)のための薬としてASOの治療可能性を分析するために、雄および雌のトランスジェニックR6/2マウスを、浸透圧ミニポンプを介して側脳室にicv用法によって本発明のTGF−RII特異的ASOの異なる投与量を用いて処理した。方法の説明:
慢性の中心静脈注入のために、マウスは、5週の年齢で、アルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ミニポンプ(注入率:0.25μl/h、アルゼット(Alzet)(登録商標)、モデル2004年、クパチーノ(Cupertino)、米国)に取り付け
られたicvカニューレのために外科処置を受けた。カニューレおよびポンプを、ケタミン/キシラシン(xylacin)麻酔(バクスター(Baxter)、GmbH、ドイツ)および半滅菌条件の下で定位的に埋め込んだ。各浸透圧ミニポンプを、マウスの首に
1cmの長さの皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植し、シリコーンチューブによって、icvカニューレと接続した。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレ(23G、3mm長さ)を、右側脳室へと降ろした(ブレグマ(bregma)に対して相対的に後部0.3mm、側部1mm、深さ3mm)。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのステンレススチール製のネジで固定した。首の皮を縫合で閉じ
た。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、マウスを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)を用いて処置し
、0.1mlの抗生物質(sc,バイトリル(Baytril)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。チューブを、各溶液で満たした。HDの発展および進行
、症状の発症、握力、一般的な運動性、並びに生存率をインビボ(invivo)エンドポイントとして使用した。9週の年齢のマウスを殺処分し、脳を組織学的分析のために除去した。icv移植部位の組織学的検証を、40μm冠状面、クレシルバイオレット染色脳断片で行った。
実施例15:フィッシャー−344ラットにおけるTGF−β1誘導の水頭症およびこれに伴う認知障害の疾患進行における本発明のASOの治療活性の決定
本研究の目標は、本発明のASOの脳室内注入によって、容量依存的手法でi)神経幹細胞増殖および神経新生、ii)水頭症の形成、およびiii)空間学習障害、におけるTGF−β1誘導効果に苦しむ動物を治療することである。
方法の説明:脳室内注入のための浸透圧ミニポンプを、180g〜200g体重の雌のフィッシャー(Fischer)−344ラット(n全体=70、nグループ=10)に移植した。注入は、コントロールとしてa)人工脳脊髄液(aCSF:148.0mM NaCl、3.0mM KCl、1.4mM CaCl2 0.8mM MgCl2、1.5mM Na2HPO4、0.2mM NaH2PO4、100μg/mlラット血清アルブミン、50μg/ml ゲンタマイシン、pH7.4)、またはb)aCSF中に1μg/mlのTGF−β1を有する溶液をアルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ポンプ2004を用いて0.25μl/hの流速で14日間行った。14日後にポンプは
変更され、アルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ポンプ2004(流速0.25μl/h)は、次の注入:aCSF、または様々な濃度のTGF−RIIASO(1.1mmol/L、3.28mmol/L、9.84mmol/L、)と組み合わせたTGF−β1(1μg/ml)、のために使用され、またはスクランブルASO(3.28mmol/l)を注入した(2×4週)。注入期間の最後の4日の間に、動物は、増殖細胞を標識するために、毎日、BrdU(50mg/kg体重)の腹腔内注入を受けた。ポンプを除去し、二週間後の動物を、14日間空間学習試験(モリス−水−迷路)で機能分析し
た。1日後、動物を、0.9%NaClを用いてかん流し、脳を除去し、PCNA、BrdU、DCX、BrdU/NeuN、およびBrdU/GFAPの定量的組織学的分析のために、および水頭症の測定として側脳室の容量の立体解析のために、4%パラホルムアルデヒド中に後で添加した。対側半球をさらに解剖し、異なる領域(心室壁、海馬、皮質)を、TGF−RII発現レベルを分析する定量的RT−PCRのために処理する。MR画像を、ポンプ移植4日前、ポンプ移植後1週、最初のポンプ変更日、および、その後から、注入期間の終わりまで2週間毎に、グループ1、グループ3、およびグループ6のうちの4匹の動物から撮った。icv移植部位の組織学的検証を、40μm冠状面、クレシルバイオレット染色脳断片で行った。
実施例16:フィッシャー344ラットにおいて脊髄損傷のリハビリテーションにおけるTGF−RIIに関するアンチセンス−オリゴヌクレオチドの治療活性の決定
脊髄損傷(SCI)のための薬としてASOの治療可能性を分析するために、雄および雌のフィッシャー−344ラットを、浸透圧ミニポンプを介して側脳室にicv投与によ
って本発明のASOの異なる投与量を用いて処理した。
方法の説明:
SCIを、C3レベルで頸部タングステンワイヤーナイフの脊柱離脱によって刺激した。次のステップにおいて、慢性の中心静脈注入のために、ラット(180g〜200g体重)は、アルゼット(Alzet)(登録商標)浸透圧ミニポンプ(注入率:0.25μl/h、アルゼット(Alzet)(登録商標)、モデル2004年、クパチーノ(Cupertino)、米国)に取り付けられたicvカニューレのために外科処置を受けた
。カニューレおよびポンプを、ケタミン/キシラシン(xylacin)麻酔(バクスター(Baxter)、GmbH、ドイツ)および半滅菌条件の下で定位的に埋め込んだ。
各浸透圧ミニポンプを、ラットの首に1cmの長さの皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植し、シリコーンチューブによって、icvカニューレと接続した。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレ(23G、3mm長さ)を、右側脳室へと降ろした(ブレグマ(bregma)に対して相対的に後部1.0mm、側部1.0mm、深さ1.8mm)。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)−Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのステンレスス
チール製のネジで固定した。首の皮を縫合で閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、ラットを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)を用いて局所的に処理し、0.5ml抗生物質(sc,
バイトリル(Baytril)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。
チューブを、各溶液で満たした。SCIに続くリハビリテーションにおけるASOの効果を決定するために、外科処理後4週で、インビボMRI構造分析を行った(3T MRI、アレグラ(Allegra) シーメンス(Siemens)、フェーズトアレイ(phased array)−小動物コイル)。手術後6週で、動物を殺処分し、脊髄を組織学的、および免疫組織学的分析のために除去した。icv移植部位の組織学的検証を、40μm冠状面、クレシルバイオレット染色脳断片で行った。
実施例17:ヒト肺癌細胞株A549の増殖におけるASO−媒介効果
Ki67、p53、カスパーゼ8(Caspase 8)およびDNA−結合タンパク質阻害剤2(ID2)のmRNAを、いくつかの腫瘍細胞の増殖における代表するマーカーとして分析した。以前の研究から、腫瘍抑制遺伝子p53およびID2の発現は、腫瘍組織においてしばしば劇的に上昇した。Ki67は増殖マーカーであり、Casp8は、アポトーシスの指標となる。さらに、細胞数を裸の(gymnotic)送達後に決定した。
方法の説明
A549細胞を上述のように培養した。処理細胞のために、培地は除去され、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarste
dt)#83.3920.300)(50,000細胞/ウェル)、または8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(20,000細胞/ウェル)(24−ウェルおよび8−ウェル細胞培養スライドディッシュには0.5ml、6−ウェルディッシュには1ml)に新しい全培地によって置換され、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。mRNA発現および増殖における影響を分析するために、細胞を、Ref.1(スクランブルコントロール)、およびASO Seq.ID No.218bを用いて、2.5μMおよび10μMの濃度で処理し、72時間、37℃および5%CO2でインキュベートした。培地交換を含む処理は、72時間毎に3回(全体で12日)繰り返された。増殖(Ki67)の免疫細胞化学的分析のために、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、72時間に制限された。その後、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)、免疫細胞化学(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中に)、増殖曲線およびRNA単離(24−ウェルディッシュ)、のために使用した。RNA、タンパク質、および免疫細胞化学のためのプロトコルは、上述のように行った。増殖曲線のために、残存細胞を細胞数の決定のために24−ウェルディッシュから収穫した。この目的のために、残存細胞を、PBSを用いて洗浄し(2×)、アクターゼ(500μl/ウェル)を用いて処理し、7分間37℃でインキュベートした。その後、500μl培地を加え、細胞数を、製造業者の指示に従って、ルナ(Luna)−FL(商標)自動細胞カウンター蛍光および明視野(バイオジム(Biozym)、#872040)を用いて決定した。簡単に、18μlの細胞懸濁液を、2μlのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムアッセイ生存キット(バイオジム(Biozym)#872045)に加えた。セッティングの1分後、10μlを、細胞カウンティングスライド(バイオジム(Biozym)#872011)に加えた。細胞をカウントし、生存細胞および死細胞を区別して算出した。
17.1 ASO Seq.ID No.218bの結果
mRNA分析は、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後12日のKi67、p53およびID2発現レベルの減少を示した。対照的に、Casp8は、低レベルのASO Seq.ID No.218bで上昇した(表46)。これらの結果は、減少した腫瘍成長が、アポトーシス細胞のわずかな増加と関連しているということを示す。さらに、ウェスタンブロット分析は、本発明のASOの裸の(gymnotic)送達後12日のKi67、およびpAkt12のタンパク質レベルの減少を示した(表47)。ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後のA549細胞の免疫化学試験は、適用された両濃度では、スクランブルコントロールと比較してKi67シグナルの減少したレベルを示した(図23)。最後に、A549細胞数は、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後の12日に約50%近く減少した(表48)。
これらの結果は、減少した腫瘍成長がアポトーシス細胞の増加と関連していることを示す。特に、腫瘍において可能な治療標的遺伝子ID2はTGF−RII特異的ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後に減少した。
実施例18:いくつかの腫瘍細胞株の増殖におけるASO裸の(gymnotic)送達の効果
TGF−βシグナリングは、癌発展において重要な経路である。一方、TGF−βは、腫瘍抑制に機能する因子を促進するが、他方、この成長因子は、細胞遊走、細胞浸潤、細胞増殖、免疫調節の刺激につながり、腫瘍細胞の進行および遊走に利点である環境再編成を促進する。したがって、TGF−βは、癌治療において鍵となる標的である。増殖マーカー(Ki67)のmRNAおよびタンパク質レベル、並びに細胞数を、腫瘍細胞の増殖速度のマーカーとして本発明のASOにおける裸の(gymnotic)取り込み後に決定した。さらに、腫瘍抑制遺伝子p53の、およびDNA結合タンパク質阻害剤2(ID2)の腫瘍抑制遺伝子を試験した。
方法の説明
いくつかの腫瘍細胞株を上述されるように培養した(表10)。細胞を治療するために、培地を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(50,000細胞/ウェル)(24−ウェルには0.5ml、6−ウェルディッシュには1ml)の新しい全培地によって置換し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。mRNA発現および増殖における影響を分析するために、細胞を、Ref.1(スクランブルコントロール)、およびASO Seq.ID No.218bを用いて、2.5μMおよび10μMの濃度で処理し、72時間、37℃および5%CO2でインキュベートした。培地交換を含む処理は、72時間毎に3回(全体で12日)繰り返された。収穫のために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA単離(24−ウェルディッシュ)、タンパク質単離(6−ウェルディッシュ)、または増殖曲線のために使用した。RNAおよびタンパク質単離のためのプロトコルは、上述されるように行われた。増殖曲線のために細胞をカウント
する前に、細胞を、光学顕微鏡(ニコン(Nikon、TS−100 F LED #MFA33500)を用いることによって分析した。残存細胞を、その後、細胞数の決定のために24−ウェルディッシュから収穫した。この目的のために、残存細胞を、PBSを用いて洗浄し(2×)、アクターゼ(500μl/ウェル)を用いて処理し、5〜7分間37℃でインキュベートした。その後、500μl培地を加え、細胞数を、製造業者の指示に従って、ルナ(Luna)FL(商標)自動細胞カウンター蛍光および明視野(バイオジム(Biozym)、#872040)を用いて決定した。簡単に、18μlの細胞懸濁液を、2μlのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムアッセイ生存キット(バイオジム(Biozym)#872045)に加えた。セッティングの1分後、10μlを、細胞カウンティングスライド(バイオジム(Biozym)#872011)に加えた。細胞をカウントし、生存細胞および死細胞を区別して算出した。
18.1 Seq.ID No.218bの結果
Ki67mRNAレベルは、使用されたASO濃度に独立して(A549、L3.6pI、Panc−1)、または依存して(HT−29、Panc−1、CaCo2)、裸の(gymnotic)送達後12日に効果的に減少した(表40)。p53の遺伝子発現レベルは、試験されたASOによって、A549、HT−29、K562、KG−1、CaCo2およびTMK−1においても影響を及ぼした(表50)。減少したKi67タンパク質発現の検証は、A549、L3.6pI、TMK−1、HT−29、およびK562で示された(表51)。特に、ID2 mRNA発現は、ASO Seq.ID No.218bによって媒介されるA549、HT−29、K562およびTMK−1細胞において首尾一貫して効率的および用量依存的な下方調節を示した(表51)。さらに、ASO Seq.ID No.218bは、いくつかの腫瘍細胞株の増殖速度の減少をもたらした(表53)。細胞数の用量依存的減少は、HPAFII、MCF−7、KG1、K562、U937、およびHTZ−19細胞で認められた。肺癌細胞(A549)は、ASO Seq.ID No.218bによって誘発された約50%の細胞数の減少を示した。減少した細胞数は、ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後12日にHPAFII、K562、MCF−7、Panc−1およびHTZ−1で光学顕微鏡によってさらに確認した(図24)。
ゴヌクレオチドの多くは、Seq.ID No.218bおよび218cを負かすことは可能ではないだろうが、当該技術分野のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの場合よりまだかなりより有利である。したがって、本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、癌および腫瘍のような高増殖性疾患の治療に非常に有用である。
ASO Seq.ID No.218bによるKi67、p53、およびID2のmRNAの調節は、いくつかの組織において、および異なる組織と共に腫瘍拡大を弱めるのに有利な効果を示す。Ki67、ID2およびp53は、異なる癌タイプにおいて上方調節され細胞増殖を促進するることが知られている。増殖マーカーKi67、p53、およびID2は、効果的に下方調節された。裸の(gymnotic)送達後12日のいくつかの腫瘍細胞における細胞カウントおよび光学顕微鏡は、細胞増殖を減少させるために強力な物質としてASO Seq.ID No.218bを明らかにした。
実施例19:いくつかの腫瘍細胞株における血管新生に対するアンチセンス−オリゴヌクレオチドの効果の分析
血管新生の調節は、組織成長および修復に必須である。血管成長の不均衡は、例えば腫瘍成長、虚血、炎症、および免疫疾患などのような、種々の病気に貢献している。TGF−βは、血管新生促進の因子であると知られている。TGF−βは、過大応答(overshooting)血管新生が疾患進行に責任がある場合に、炎症性および腫瘍性のプロセスにおいて最も関連があり得る。これらの効果は、TGF−β1誘導線維化を伴ってもよい。したがって、TGF−RII特異的ASOによるTGF−βシグナリングの阻害は、適切な治療アプローチを表してもよい。この仮定を試験するために、これらのASOは、裸の(gymnotic)取り込みによっていくつかの腫瘍細胞株に移された。繰り返しの裸の(gymnotic)送達後12日に、細胞上清を、多重分析によって、血管新生促進因子におけるタンパク質レベルのために分析した。この技術は、電気化学発光による複数の血管新生促進タンパク質(VEGF、Tie−2、FLt−1、PIGF、およびbFGF)の調査を可能にした。血管内皮増殖因子(VEGF)は、血管新生を促進し、それと共に例えば腫瘍増殖などに貢献する強力な腫瘍分泌サイトカインである。Tie−2は、活発に成長する血管から発現されるタンパク質である。Fms様チロシンキナーゼ1(Flt−1)は、血管内皮細胞増殖因子受容体1(VEGFR1)としても知られており、血管内皮細胞において高く発現される膜貫通型チロシン受容体キナーゼであり、胎盤成長因子(PlGF)は、VEGFとともに作用し、例えば腫瘍形成などの病理学的条件下で上方調節される。さらに、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)は、血管新生も誘導する成長因子である。PAI−1は、TGF−βの標的遺伝子であり、TGF−βの瘢痕形成および血管新生効果を仲介する。したがって、PAI−1は、腫瘍浸潤および転移にも重要な因子を示す。PAI−1が高濃度を示す患者は、例えば乳癌、肺癌、大腸癌、および胃癌などにおいて不良予後因子と見なされます。PAI−1の高濃度は、血栓症の役割を果たしている疾患(例えば、心筋梗塞、脳卒中など)の危険因子でもある。したがって、TGF−β特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドによるPAI−1mRNA調節も試験された。
方法の説明
腫瘍細胞株を上述されるように培養した(表10)。細胞を処理するために、培地を除去し、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)の新しい全培地によって置換し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。次の日、Ref.1(スクランブルコントロール)、およびASO Seq.ID No.218bを、2.5μMおよび10μMの濃度でリフレッシュした培地に加え、72時間、37℃および5%CO2でインキュベートした。培地交換を含む処理は、72時間毎に3回(全体で12日)繰り返された。その後、細胞上清を集め、メソスケール(MesoScale) ディスカバリー(Disco
very)(登録商標)アッセイ(MSD ディスカバリー(Discovery))によって分析した。この技術は、電気化学発光によって複数の血管新生促進タンパク質(VEGF、Tie−2、FLt−1、PIGF、およびbFGF)の調査を可能にした。個々の成長因子に関する実験パフォーマンスおよび情報を、製造業者の指示(MSD メソスケール(MesoScale) ディスカバリー(Discovery)(登録商標)、♯K15198G)によって抽出した。結果を、グラフパッド(GraphPad)プリズム(Prism)(登録商標)ソフトウェアによって評価した。
19.1 Seq.ID No.218bの結果
表54は、PAI−1mRNAが、ASO Seq.ID No.218bの繰り返しの裸の(gymnotic)送達後に、いくつかの試験された癌細胞(A549:肺癌、HPAFII:膵腺癌、HT−29:大腸腺癌、HTZ−19:メラノーマ、TMK−1:胃癌、THP−1:単球性白血病)において用量依存的に下方調節されたことを示す。
さらに、刺激された細胞上清におけるVEGFも、A549、HTZ−19、HPAFII、およびPC3M(前立腺癌)において用量依存的減少を示した。HPAFIIおよびPC3M細胞の下方調節は重要であった(表55)。bFGFに対するASO Seq.ID No.218bの影響は、VEGFでの観察で確認され、ASO Seq.ID No.218bが血管新生を抑制する能力があることを意味する(表56)。A549およびPC3Mにおける結果は、bFGFの重大な減少も示した。細胞上清におけるPIGFのタンパク質量は、わずかだが、A549およびHTZ−19細胞において用量依存的に減少した。PC3M細胞において基本的な内因性PIGFレベルは、全ての他の試験された細胞より高く、ASO効果もより強かった(表57)。最後に、HT−29細胞におけるFlt−1タンパク質の下方調節(表58)、並びにHTZ−19(ASO Seq.ID No.218b 2.5μM)およびMCF−7(乳癌、10μM)におけるTie−2減少を検出することが可能である(表59)。
89q、290c、290f、290i、291c、292c、293b、および294aのアンチセンス−オリゴヌクレオチドで得ることができる。前述のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの多くは、Seq.ID No.218bおよび218cを負かすことは可能ではないだろうが、当該技術分野のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの場合よりまだかなりより有利である。したがって、本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、癌および腫瘍のような高増殖性疾患の治療に非常に有用である。
全ての分析された血管新生促進因子(VEGF、bFGF、PIGF、Flt−1、およびTie−2)は、腫瘍進行および向上した血管新生に依存する他の病理学的メカニズムの抑制に有利な影響を有する方法において、ASO Seq.ID No.218bによって調節される可能性がある。さらに、PAI−1mRNAは、ASO Seq.ID
No.218bによって、用量依存的に減少した。この因子、TGF−β標的遺伝子、および例えば乳癌における承認された予後マーカーなどは、用量依存的に下方調節もされた。
実施例20:線維症に対する本発明のASOの効果の分析。
ECMの2つの主な要素であるフィブロネクチン(FN)、およびコラーゲンIV(ColIV)を評価した。さらに、CTGF、FN、およびアクチン−細胞骨格におけるASOの効果を、神経前駆体細胞(ReNcell CX)およびヒト肺癌細胞(A549)において試験した。
20.1 神経変性における線維症
方法の説明
細胞を標準的なプロトコルにおいて上述されるように培養した。処理するために、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(80,000細胞/ウェル)、及び8−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。TGF−β1に対するReNcell CX(登録商標)細胞の応答を調査するために、細胞を、TGF−β1(2ng/mlおよび10ng/ml、プロモセル(PromoCell)#63499)を用いた培地のリフレッシュ後、48時間処理し、続いてCTGFのためのmRNA分析を行った。ReNcell CX(登録商標)細胞において、ASOがCTGF、およびFNに影響を及ぼすことを理解するために、培地を除去し、新しい全培地(6−ウェルに1ml、8ウェルに0.5ml)に置き換えた。Ref.1(スクランブルコントロール)、ASO Seq.ID No.218b、およびSeq.ID No.218bを、その後、2.5μMおよび10μMの濃度で培地に加え、各分析(リアル−タイムRT−PCR、ウェスタンブロット分析、および免疫細胞化学)を96時間後に行った。TGF−β1を用いてのプレインキュベーション試験後のASOの効果を試験するために、培地は除去され、新しい全培地置き換えられた(6−ウェルディッシュおよび8−ウェル細胞培養スライドディッシュに1ml)。TGF−β1(10ng/ml、48時間)の曝露に続いて培地を交換し、TGF−β1(10ng/ml)、Ref.1(10μM)、Seq.ID No.218bのASO(10μM)、およびSeq.ID No.218cのASO(10μM)を組み合わせ処理で、および単回処理で細胞に加えた。ReNcell CX(登録商標)細胞を、その後、裸の(gymnotic)送達後、96時間で収穫した。そのために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA単離(24−ウェルディッシュ)、およびタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)、または細胞の免疫細胞化学試験(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中に)のために使用した。プロトコル、抗体、希釈液、およびプライマーは、以前に記述されるように使用した。
20.1.1 神経前駆体細胞(ReNcell CX)におけるTGF−β1効果の結果
TGF−β1曝露に対するReNcell CX(登録商標)の反応については全く知られていなかった。したがって、ReNcell CX(登録商標)細胞を、2つの異なる濃度のTGF−β1と48時間処理した(表60)。リアル−タイムRT−PCRの評価は、CTGF−およびTGF−β1遺伝子発現の用量依存的誘導を明らかにした。
ReNcell CX(登録商標)細胞は、TGF−β1の自己誘導を示すTGF−β1曝露に対する応答、およびTGF−β1標的遺伝子CTGFの上昇を示した。まとめると、ReNcell CX(登録商標)細胞は、TGF−β1効果に対処する問題を試験するために理想的である。
20.1.2 Seq.ID No.218bの結果
20.1.2.1 裸の(gymnotic)送達の効果
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、CTGFおよびFNの用量依存的および重大な減少をもたらす(表61)。ASO Seq.ID
No.218bのこの効果は、FNタンパク質レベルで確かめられた。FNタンパク質レベルは、試験されたASOの裸の(gymnotic)送達96時間後に約70%までに減少し、一方、ReNcell CX(登録商標)細胞のTGF−β1処理は、FNの3.4倍の誘導をもたらした(表62)。
ASO Seq.ID No.218bは、ヒト神経前駆体細胞においてCTGFおよびFNのmRNAレベルを下方調節するのに効果がある。ASO Seq.ID No.218b処理は、裸の(gymnotic)送達96時間後にFNタンパク質を減少させ
た。したがって、TGF−RII特異的ASOは、ReNcell CX(登録商標)細胞において、TGF−β誘導線維性効果の阻害を媒介する。
20.1.2.2 TGF−βプレ−インキュベーション後の裸の(gymnotic)送達の効果
ASO Seq.ID No.218bは、病理学的条件下、TGF−βによって媒介される線維性効果を阻害する効果もあるかどうかを分析するために、ReNcell CX(登録商標)細胞を、TGF−βプレ−インキュベーションでインキュベーションし、続いて96時間裸の(gymnotic)送達をした。その後、CTGFおよびFNの決定されたmRNAレベルは、CTGFおよびFN遺伝子発現のTGF−β誘導後も、ASO Seq.ID No.218bにおける強力な抗線維性効果を示す(表63)。CTGF(図25A)およびFN(図25B)の免疫細胞化学染色は、mRNA分析からのデータを確認した。さらに、アクチン−細胞骨格の分析のためのファロイジン染色は、TGF−β処理後のストレス−ファイバーの誘導を示し、一方、ASO Seq.ID No.218bは、TGF−β媒介ストレスファイバー誘導を阻害するのに効果的であった(図25C)。
ASO Seq.ID No.218bは、模擬の病理学的条件下(TGF−β1プレ−インキュベーション)、強力な抗−線維性効果を示した。ECMの一つの主要な構成要素としてFNの下方調節は別として、アクチン−細胞骨格は、線維性疾患においてより良い結果になるのに有益になり得る方法において本発明のASOによっても影響を及ぼされた。
20.1.3 Seq.ID No.218cの結果
20.1.3.1 裸の(gymnotic)送達の効果
ASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達は、10μMのASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達後に、CTGFmRNAの強力および重大な減少をもたらす(表64)。
ASO Seq.ID No.218cは、CTGFmRNAの用量依存的減少に効果的であった。
20.1.3.2 TGF−βプレ−インキュベーション後の裸の(gymnotic)送達の効果
TGF−β1プレ−インキュベーションに続くASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達の結果は、CTGFmRNAレベルにおけるTGF−β1誘導効果の効果的な阻害を確かめた(表65)。ASOは、CTGFにおけるTGF−β1効果を阻害することにおいて、このように有力であり、組み合わせ処理は、ASO Seq.ID No.218c単回処理に匹敵している。
ASO Seq.ID No.218cは、人工的な病理学的条件下(TGF−β1プレ−インキュベーション)でさえCTGFmRNAおよびタンパク質の強い下方調節を示した。
20.2.肺線維症
方法の説明
肺におけるECMおよびアクチン−細胞骨格に対するASO効果を調査するために、ヒト肺癌(A549)細胞を試験し、以前に記述されるように培養した。処理のために、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(50,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(80,000細胞/ウェル)、および8−ウェル細胞培養スライドディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#94.
6140.802)(10,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。TGF−β1に対するA549細胞の応答を調査するために、細胞を、TGF−β1(2ng/mlおよび10ng/ml、プロモセル(PromoCell)#C63499)を用いて培地のリフレッシュ後、48時間処理し、続いてCTGFのためのmRNA分析を行った。A549細胞において、CTGF、およびFNに対するASOの影響を調査するために、培地を除去し、新しい全培地(6−ウェルに1ml、8−×−ウェルに0.5ml)に置き換えた。Ref.1(スクランブルコントロール)、ASO Seq.ID No.218b、およびSeq.ID No.218bを、その後、2.5μMおよび10μMの濃度で培地に加え、各分析(リアル−タイムRT−PCR、ウェスタンブロット分析、および免疫細胞化学)をReNcell CX(登録商標)細胞において72時間後に行った。TGF−β1を用いてのプレインキュベーション後の可能なASOの効果を示すために、培地は除去され、新しい全培地置き換えられた(6−ウェルディッシュおよび8−ウェル細胞培養スライドディッシュに1ml)。TGF−β1(10ng/ml、48時間)の曝露に続いて培地を交換し、TGF−β1(10ng/ml)、Ref.1(10μM)、Seq.ID No.218bのASO(10μM)、およびSeq.ID No.218cのASO(10μM)を組み合わせ処理で、および単回処理で細胞に加えた。A549細胞を、その後、裸の(gymnotic)送達後、72時間で収穫した。そのために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA単離(24−ウェルディッシュ)、およびタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)、または細胞の免疫細胞化学試験(8−ウェル細胞培養スライドディッシュ中に)のために使用した。使用されたプロトコル、抗体、希釈液、およびプライマーは、以前に記述される通りであった。
20.2.1 肺癌細胞(A549)におけるTGF−β1効果の結果
TGF−β1曝露に反応するためのA549細胞の能力を調査するために、細胞を、2つの異なる濃度のTGF−β1と48時間処理した(表66)。リアル−タイムRT−PCRの評価は、CTGF−およびTGF−β1自身の遺伝子発現の用量依存的誘導を明らかにした。
A549細胞は、TGF−β1曝露に対する用量依存的およびCTGFの重大なmRNA上方調節を示した。さらに、TGF−β1の自己誘導を観察した。まとめると、A549細胞は、肺および肺癌においてTGF−β効果に対処する問題を試験するためによいモデルである。
20.2.2 Seq.ID No.218bの結果
20.2.2.1 裸の(gymnotic)送達の効果の効果
ASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、CTGF遺伝子発現の用量依存的および高く重大な減少をもたらす(表67)。FNmRNAレベルも試験されたASOによって影響を受けたが、用量依存的ではなかった。対照的に、FNに対する染色は、スクランブルコントロールと比較してFNの用量依存的減少を明らかにした(図260A)。さらに、アクチン−細胞骨格に対するASOおよびTGF−β1効果を試験した。図26Bは、用量依存的方法においてA549細胞のTGF−β1処理後のストレス−ファイバー形成を含むアクチン−ファイバーの誘導を示し、一方、A549細胞におけるASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達後のシグナルは、TGF−β1媒介効果の認識される逆戻り(reversion)と並行して重大に下方調節した。タンパク質分析のために、CTGFが当該繊維性効果を媒介することによりpErk1/2の阻害と並行したCTGFの適切な下方調節を示した(表68)。
Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達は、ヒト肺癌細胞において、ECM沈着およびアクチン−細胞骨格再構築に関与している調節因子に効果的であった。
20.2.2.2 TGF−β1プレ−インキュベーション後の裸の(gymnotic)送達の効果の結果
TGF−β1プレ−インキュベーションに続くASO Seq.ID No.218bの裸の(gymnotic)送達の結果は、CTGFおよびFNmRNAレベルにおける強いTGF−β1誘導効果の効果的な阻害を確認した(表69)。CTGF(図27A)およびFN(図27B)に対して染色する免疫細胞化学は、タンパク質レベルにおけるmRNA検出を確認した。
ASO Seq.ID No.218bは、TGF−β1の過剰濃度が模倣される人工的な病理学的条件下、A549細胞において抗−線維性効果を媒介するのに効果的であった。
20.2.3 Seq.ID No.218cの結果
20.2.3.1 裸の(gymnotic)送達の効果の結果
ASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達は、A549細胞において裸の(gymnotic)送達後72時間に、CTGFmRNAの強い用量依存的および重大な減少を媒介する(表70)。
ASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達は、TGF−β下流メディエーターCTGFのmRNAの減少に効果的であった。
20.2.2.2 TGF−βプレ−インキュベーション後の裸の(gymnotic)送達の効果
TGF−β1プレ−インキュベーションに続くASO Seq.ID No.218cの裸の(gymnotic)送達の結果は、CTGFmRNAレベルにおける強いTGF−β1誘導効果の阻害を確かめた(表71)。CTGFに対して染色する免疫細胞化学は、タンパク質レベルにおけるこれらの結果を確認した(図28)。
ASO Seq.ID No.218cは、過剰なTGF−β1濃度によって模倣される人工的な病理学的条件下、A549細胞において抗−線維性効果を媒介するのに効果的であった。
20.3.いくつかの癌細胞の効果
方法の説明
ECM(CTGF、FN、ColIV)に対処するASO効果の調査のために、細胞を、標準的なプロトコルに以前に記述されるように使用し、培養した(表10)。処理のために、細胞を、24−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.1836.300)(30,000細胞/ウェル)、6−ウェル培養ディッシュ(ザルスタット(Sarstedt)#83.3920.300)(50,000細胞/ウェル)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートした。mRNA発現、並びに、CTGFの、FNの、ColIVのmRNAおよびタンパク質レベルに対する影響を分析するために、細胞を、Ref.1(スクランブルコントロール)、またはASO Seq.ID No.218bを用いて、2.5μMおよび10μMの濃度で処理し、72時間、37℃で、および5%CO2でインキュベートした。培地置換を含む処理を、72時
間毎に3回(全体で12日)繰り返した。収穫のために、細胞を、PBSを用いて2回洗浄し、続いてRNA単離(24−ウェルディッシュ)、またはタンパク質単離(6−ウェルディッシュ)のために使用した。RNAの、およびタンパク質単離のためのプロトコル、並びに使用される抗体、および希釈液は、以前に記述されるように行った。
20.3.1 Seq.ID No.218bの結果
抗−線維性効果を、CTGFmRNA、FNmRNA、ColIVmRNAおよびタンパク質レベルの分析によって検出した。CTGFmRNA(表72)は、HT−29、HTZ−19、MCF−7、およびTHP−1細胞においてSeq.ID No.218bによって用量依存的に減少した。KG−1細胞では、TGF−β下流メディエーターの下方調節が2.5μMのASO Seq.ID No.218bで確認された。A549、Panc−1、およびCaCo2細胞では、FNの減少が、THP−1、HTZ−19、およびL3.6pl細胞(表65)においてColIVmRNA(表74)の用量依存的減少にしたがって、証明された(表73)。ウェスタンブロット分析は、HT−29、MCF−7、TMK−1、およびL3.6pl細胞においてCTGFタンパク質の強い減少を明らかにした。MCF−7の結果は重大であった(表75)。さらに、A549、およびTMK−1細胞におけるErk1/2のリン酸化は、ASO Seq.ID No.218bによって阻害された。pErk1/2は、TGF−β媒介線維性効果を減少させるためにCTGFによって通常、活性化される(表76)。FN(A549、MCF−7、HT−29、HTZ−19、HPAFII)およびColIV(A549、HTZ−19、HPAFII、PC3M)(表77および78)では、ECMの二つの主な構成要素のタンパク質レベルは、約50%まで最小化した。
TGF−β1によって媒介されるECMの増加した沈着は、当該下流−メディエーターCTGFを介して、異なる腫瘍細胞株において、TGF−RII特異的本発明のASOによって効果的に逆転させることが可能である。ECM構成要素の減少レベルは、腫瘍進行における攻撃性をより少なくすることに貢献することが可能である。まとめると、試験されたASOは、異なる線維症−関連疾患において新しい治療戦略を示してもよい。
実施例21:カニクイザルにおいて用量−漸増パラダイムを使用して慢性の脳室内投与に
よる本発明のASOの毒性の閾値。
方法の説明:
雄および雌のカニクイザルにおける慢性中心ASO注入のために、ガス圧ポンプ(0.25ml/24時間、Tricumed−IP 2000V(登録商標)は、シリコーンカテーテルに連結され、右側脳室を標的に、ケタミン/キシラチン(xylacin)麻酔、および半滅菌条件の下で定位的に埋め込んだ。一匹の雄および一匹の雌サルを、各処理条件(Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c、表79に与えられた濃度)に使用した。各ポンプを、サルの首に10cmの長さの皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植し、シリコーンカテーテルによって、icvカニューレと接続した。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレを、右側脳室へと降ろした。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)−Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのステンレススチール製のネジで
固定した。首の皮を縫合で閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、サルを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)を用いて局所的に処理し、1ml抗生物質(sc,バイトリル(Baytr
il)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。チューブおよび各ポンプ
を、各処理溶液で満たした。ASO注入間隔(各投与1週間)を、0.9%NaClのみを用いて投与するだけの1週間の洗い流し期間によって中断した。全投与パラダイム中の体重発展および摂食量を監視した。さらに、血液およびCSF試料を、全身のASO濃度だけでなく、血液学的変更および免疫学的変更を決定するために、一週間に一度採取した。最後の日に、動物を殺処分し、組織(肝臓、腎臓、脳)を除去し、増殖、アポトーシス、mRNAノックダウン、および腫瘍形成を分析した。
全ての試験された、本発明のASOは、1〜6週では少なくとも非毒性であり、したがって、更なる研究および毒物学的試験に使用された。しかしながら、Ref.0およびRef.5だけでなくアンチセンス−オリゴヌクレオチドSeq.ID No.214、Seq.ID No.138b、Seq.ID No.172bも、上記スキームにおいて初期に毒性効果をもたらした。したがって、これらのアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、治療薬として適切ではなく、更なる研究に使用されなかった。
実施例22:中心アンチセンス−オリゴヌクレオチド投与に続く行動学的および生理学的異常の決定
この研究の目標は、ラットにおいて、神経学的、および結果的に生じる行動学的パラメ
ーターにおける単一の脳室内(icv)アンチセンスーオリゴヌクレオチド投与の効果を調査することであった。
方法の説明:
定位手順は、ケタミン/キシラチン(xylacin)麻酔、および半滅菌条件の下で行われた。続く戦略で、ラットは、回復のため2日有した。
icvガイドカニューレの移植
動物を、定位フレームに配置し、ガイドカニューレ(12mm)を、左側脳室の上2mmに移植し(ブレグマ(bregma)に対する相対座標:1.0mm後部、正中線の側方−1.6mm、頭蓋骨の表面の下1.8mm。ガイドカニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのステンレススチール製のネジで固定し、ダミーカニュー
レを用いて閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、マウスを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)
を用いて処置し、0.1mlの抗生物質(sc,バイトリル(Baytril)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。
ICV注入
わずかに拘束されたラットは、27−ゲージのカニューレを用いてASO(2μM/5μl、10μM/5μl、50μM/5μl、250μM/5μl)またはビヒクル(5μl、0.9%NaCl、pH7.4、ブラウン)のどちらかのicv注入を受けた。27−ゲージのカニューレは、ガイドカニューレを2mm超えて拡張し、拡散させるために30秒間所定の位置に残した。ラットは、行動学的反応、運動活性、CNS興奮、姿勢、運動調整、筋肉の緊張、反射、および体温のためにicv投与後15分、30分、60分、および120分監視された。
カニューレおよびマイクロダイアリシスプローブ配置の検証
殺処分後、脳を除去し、急速凍結し、分析まで−80℃で保存した。icv移植の組織学的検証を、40μm冠状面のクレシルバイオレット染色脳断片で行った。
実施例23:カニクイザルGLP−毒性研究(ラットにおけるプレ毒性実験)のための理想的な用量範囲の決定。
方法の説明
繰り返しの静脈内ASO注入のために、20匹の雄および20匹の雌のラットを、4つの処理グループであるビヒクル(vehicle)グループ、ASO低い、ASO中間、ASO高いグループに分けた。このパラダイムは、Seq.ID No.218b、およびSeq.ID No.218cで行われた。ラットは、連続する15日間に毎日ivボーラスASO注射を受けた。ラットは、死亡(1日2回)、臨床徴候(1日1回、体重発展(1週1回)、摂食量(1週1回)を監視された。実験パラダイムの15日目に、動物を殺処分し、組織(肝臓、腎臓、脳)を除去し、動脈血を集めた。その後、組織および血液は、免疫学的および血液学的な変化を分析された。
No.218cが、低い、および中間の用量で投与された場合、毒性効果を有さずに種々の異なる疾患に安全な薬剤になることを示す。
実施例24:繰り返しの静脈内アンチセンス−オリゴヌクレオチド注入による任意の一般的な毒物学的効果の決定
この研究の目標は、ラットにおいて、毎日の静脈内(iv)アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)投与が、任意の一般的な毒物学的効果を及ぼすかを調査することであった。
方法の説明
繰り返しの静脈内ASO注入のために、80匹の雄および80匹の雌のラットを、4つの処理グループであるビヒクル(vehicle)グループ、ASO低い、ASO中間、ASO高いグループに分けた。ラットは、連続する29日間に毎日ivボーラスASO注射を受けた。ラットは、死亡(1日2回)、臨床徴候(1日1回、体重発展(1週1回)、摂食量(1週1回)を監視された。実験パラダイムの29日目に、動物を殺処分し、組織(肝臓、腎臓、脳)を除去し、動脈血を集めた。さらに、骨髄の塗抹標本を集めた。その後、組織および血液は、免疫学的および血液学的、並びに病理組織学的な変化を分析された。
実施例25:カニクイザルにおける慢性中心アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)投与投与の毒物学的特性の決定
毒性用量の効果を決定するために、および確認するために、雄および雌のカニクイザルは、慢性の脳室内投与によって異なる用量の本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)を受けた。投与パラダイムの間、動物は、免疫学的、血液学的、および生理学的な変化を監視された。
方法の説明:
雄および雌のカニクイザルにおける慢性中心ASO注入のために、ガス圧ポンプ(0.25ml/24時間、Tricumed−IP 2000V(登録商標)は、シリコーンカテーテルに連結され、右側脳室を標的に、ケタミン/キシラチン(xylacin)麻酔、および半滅菌条件の下で定位的に埋め込まれた。三匹の雄および三匹の雌サルを、各処理条件(表79に与えられたビヒクル(vehicle)、ASO低い、ASO高い濃度)に使用した。さらに、回復のための時間フレームを調査するために、二匹の雄および二匹の雌のサル(ビヒクル(vehicle)、およびASO高い)を、ASO投与が終了した4週間後に殺処分した。各ポンプを、サルの首に10cmの長さの皮膚切開を介して腹部領域に皮下移植し、シリコーンカテーテルによって、icvカニューレと接続した。動物を、定位フレームに配置し、icvカニューレを、右側脳室へと降ろした。カニューレを、歯科用セメント(Kallocryl、Speiko(登録商標)−Dr.Speier GmbH、ミュンスター、ドイツ)を用いて2つのステンレススチール製のネ
ジで固定した。首の皮を縫合で閉じた。外科処置中、体温を加温パッドによって維持した。外科処置後の感染を避けるために、サルを局所的にbetaisodona(登録商標)(ムンディファーマ(Mundipharma) GmbH、リンブルグ(Limburg)、ドイツ)を用いて局所的に処理し、1ml抗生物質(sc,バイトリル(Bay
tril)(登録商標)2.5% バイエルバイタル(Bayer Vital)GmbH、レバークーゼン(Leverkusen)、ドイツ)を受けた。チューブを、各処理
溶液で満たした。全投与パラダイム中の体重発展および摂食量を監視した。さらに、血液およびCSF試料を、全身のASO濃度だけでなく、血液学的変更および免疫学的変更を決定するために、一週間に一度採取した。最後の日に、主な研究の動物を殺処分し、組織(肝臓、腎臓、脳)を除去し、増殖、アポトーシス、mRNAノックダウン、および腫瘍形成を分析した。57週後、回復期間を調査するために使用された更なる動物も殺処分さ
れ、同じリードアウトパラメーターを決定した。
実施例26:異なるビヒクル(vehicle)溶液におけるアンチセンス−オリゴヌクレオチドの安定性および生物学的活性の決定
アンチセンス−オリゴヌクレオチド(Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c)と注入溶液との任意の相互作用効果があるかどうかを調査するために、29日の予備実験を行った。そのため、2つのASOは、異なるエンドトキシンフリーのビヒクル溶液(PBS、注入用の水[WFI]、0.9%NaCl)に再構成され、それぞれ異なる条件で保存された。試料を単一週ごとに集め、AEX−HPLCによって、pH値、ASO安定性、含有物、および完全性を分析した。効果条件の任意の変化を、各試料を用いて、それぞれ、細胞培養アッセイにおいてTGF−RII mRNAのノックダウンの効果を証明することによって試験した。
方法の説明
凍結乾燥されたASOを、滅菌条件(ラミナーフロー(laminar flow)、BIOWIZARD ゴールデン(Golden) GL−170 エルゴサイエンス(Ergoscience)(登録商標)、S1条件)下、各ビヒクル(vehicle)溶液(注入用水、0.9%NaCl、PBS)を用いて希釈した。1.5mlのエッペンドルフカップを標識し、100μl(AEX−HPLC)、または250μl(標的ノックダウン)の各ASO溶液で満たした(全てのステップは、ラミナーフロー(laminar flow)、BIOWIZARD ゴールデン(Golden) GL−170 エルゴサイエンス(Ergoscience)(登録商標)、S1条件であり、表81のピペッティング/標識付け スキーム参照)、次のステップにおいて、全ての試料を、各保存条件で保存し、試料を単一週ごとに集め(表82試料採取 スキーム参照)、分析まで−80℃で保存した。
アンチセンス−オリゴヌクレオチド(ASO)(Seq.ID No.218b、Seq.ID No.218c)と、ガス圧ポンプまたはカテーテルとの任意の相互作用効果があるかどうかを調査するために、29日の予備実験を行った。そのため、2つのASOは、0.9%NaCl溶液中に再構成され、ポンプおよびカテーテルは、製造業者の説明にしたがって満たされた。試料を単一週ごとに集め、AEX−HPLCによって、pH値、微生物学、オリゴ安定性、含有物、および完全性を分析した。効果条件の任意の変化を、各試料を用いて、それぞれ、細胞培養アッセイにおいてTGF−RII mRNAのノックダウンの効果を証明することによっても試験した。
方法の説明
凍結乾燥されたASOを、滅菌条件(ラミナーフロー(laminar flow)、BIOWIZARD ゴールデン(Golden) GL−170 エルゴサイエンス(Ergoscience)(登録商標)、S1条件)下、0.9%NaClを用いて希釈した。5mlのエッペンドルフカップを、滅菌条件(ラミナーフロー(laminar flow)、BIOWIZARD ゴールデン(Golden) GL−170 エルゴサイエンス(Ergoscience)、S1条件)下、標識付けスキーム(表83参照)にしたがって標識した。2つのガス圧ポンプ(Tricumed Model IP−2000 V(登録商標))およびカテーテル(脊髄カテーテルセット4000)を、各ASO溶液を用いて製造業者の説明にしたがって満たした(全てのステップは、ラミナーフロー(laminar flow)、BIOWIZARD ゴールデン(Golden) GL−170 エルゴサイエンス(Ergoscience)(登録商標)、S1条件であり、表83のピペッティング/標識付け スキーム参照)。次のステップにおいて、ポンプを、5mlのエッペンドルフカップのふたに接続されたカテーテルに接続し、残りのポンプを、任意の汚染を避けるために、全ての開口をパラフィルム(Parafilm)(登録商標)を用いて閉じて保存ボックスに保存した。単一週ごとに試料を集め、分析まで−80℃に保存し、5mlのエッペンドルフカップのふたに接続されたカテーテルを、試料採取手順に続けるために、次のカップに移した。さらに、一つの試料を、ボーラ
スポート(bolus port)を介してポンプから直接取り、−80℃に保存した。最後の日に、微生物学的分析のための更なる試料を集めた。
化学合成
略語
Pybop:(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ)トリピロリジノホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMAP:4−ジメチルアミノピリジン
DMT:4,4’−ジメトキシトリチル
LCAA:長鎖−アルキルアミノ
TRIS:トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン
TRIS−HCl:トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン塩酸塩
DEPC:二炭酸ジエチル
ギャップマーアンチセンス−オリゴヌクレオチドの合成および精製
ギャップマーの形でのアンチセンス−オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトオリゴマー化化学にしたがって、ABI3900もしくはABI394合成機、またはエクスペダイト(Expedite(商標))(アプライドバイオシステムズ(Applied
Biosystems))で組み立てられた。ABI3900において、固体支持体は
、UnySupport(グレンリサーチ(Glen Research)、スターリング、バージニア州、米国から購入)を用いてロードされるポリスチレンであり、0.2μmolの合成スケールを与えた。ABI394において、固体支持体は、ケムジェーンズ(Chemgenes)((ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国)から購入され
るUnylinker(商標)を用いてロードされる500Aの制御孔ガラス(CPG)であり、3μmolの合成スケールを与えた。
一般的な方法
LNA−固体支持体の調製
1)LNA−スクシニルヘミエステルの調製(WO2007/112754)
5’−O−DMT−3’−ヒドロキシ−ヌクレオシドモノマー、無水コハク酸(1.2eq)、およびDMAP(1.2e.q)を35mlのジクロロメタン(DCM)に溶解した。反応を室温で一晩撹拌した。NaH2PO4 0.1M pH5.5(2×)および塩水(1×)を用いて抽出後、有機相を、さらに無水NaSO4を用いて乾燥し、濾過し、蒸発させた。ヘミエステル誘導体を、95%の収率で得て、更なる精製なしで使用し
た。
2)LNA−支持体の調製(WO2007/112754)
上記で調製されたヘミエステル誘導体(90μmol)を、最小量のDMF中に溶解し、DIEAおよびpyBOP(90μmol)を加え、1分間共に撹拌した。このプレ活性化された混合物を、マニュアル合成機においてLCAA−CPG(500Å、80〜120メッシュサイズ、300mg)と結合させ、撹拌した。室温で1.5時間後、支持体をろ過して取り除き、DMF、DCM、およびMeOHを用いて洗浄した。乾燥後、ロードを、57μmol/gになるように決定した(参照、Tom Brown,Dorcas J.S.Brown.Modern machine−aided methods
of oligodeoxyribonucleotide synthesis.In:F.Eckstein,editor.Oligonucleotides and
35 Analogues A Practical Approach.Oxford:IRL Press,1991:13−14)。
オリゴヌクレオチドの伸長(カップリング)
活性剤として5−エチルチオ−1H−テトラゾール(ETT)(アセトニトリル中に0.5M有する)を、ホスホロアミダイトのカップリングに使用した。ETTの代わりに、WO2007/112754に開示されるような4,5−ジシアノイミダゾール(DCI)、5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール、またはサッカリン−1−メチルイミダゾールなどの他の試薬を活性化剤として使用することができる。アセトニトリル中に0.25MのDClを有する溶液をLNAとのカップリングのために使用した。
キャッピング
THF(HPLC等級)中に10%の無水酢酸(Ac2O)を有する溶液、およびTHF/ピリジン(8:1)中に10%のN−メチルイミダゾール(NMI)を有する溶液を加え、反応させた。
酸化
グレンリサーチ(Glen Research)社から購入されたTHF/ピリジン/H2O中に0.02Mのヨウ素を有するヨウ素/THF/ピリジン/H2O溶液、またはグレンリサーチ(Glen Research)社からの無水アセトニトリル中に0.5Mの1S)−(+)−(10−カンファースルホニル)−オキサジリジン(CSO)を有する溶液で、リン(III)をリン(V)へと通常は行われる。
を有する溶液を添加することによって、ホスホロチオトリエステルに酸化した。
固体支持体からの切断および脱保護
固相合成の終わりに、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、「DMT−オン」または「DMT−オフ」のどちらかで切断することができる。「DMT−オフ」は、最後の5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)基が「デブロック(Deblock)」試薬をもちいて合成機上で除去されたことを意味し、DMT−オンは、DMT基は、オリゴヌクレオチドが固体支持体から切断される間は存在していることを意味する。DMT基は、トリクロロ酢酸を用いて除去された。
「DMT−オフ」
固相合成の終了時に、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格におけるシアノエチル保護基を除去するために、アセトニトリル中に20%ジエチルアミンを有する溶液(Biosolve BV、ファルケンスワールト、オランダ)を用いて処理された。続いて、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、固体支持体から切断し、1mL〜5mLの濃アンモニア水(シグマアルドリッチ社から得られる)を用いて、16時間55℃で脱保護した。固体支持体を、濾過、または遠心分離によってアンチセンス−オリゴヌクレオチドから分離した。
「DMT−オン」
オリゴヌクレオチドを、アンモニア水を用いて1〜2時間室温で、固体支持体から切断し、4時間、65℃でさらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを、逆相HPLC(RP−HPLC)によって生成し、その後、DMT−基を、トリクロロ酢酸を用いて除去する。
末端基
アンチセンス−オリゴヌクレオチドの5’−末端の末端基
固体支持されたオリゴヌクレオチドを、ジクロロメタン(w/v)中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液を用いて処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。さらに、化合物を、シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト部分を有する適切な末端基で変換した。リン(III)をリン(V)へと酸化した後、固体支持体からの分離、および脱保護の連鎖を、上述されるように行った。
精製
次に、粗アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、AKTA エクスプローラー(Explorer) システム(System)(GE ヘルスケア(Healthcare)社、フライブルク、ドイツ)におけるアニオン−交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびソース(Source) Q15を用いてパックされたカラム(GE ヘルスケア(Healthcare)社)によって精製した。バッファーAは、10mM過塩素酸ナトリウム、20mMトリス、1mMEDTA、pH7.4であり、20%アセトニトリルを含み、バッファーBは、500mM過塩素酸ナトリウムを除外してバッファーAと同じであった。32カラム容量(CV)内に15%B〜55%Bのグラジエントを使用した。280nmでのUVトレース(traces)を記録した。適切なフラクションをプールし、3MのNaOAc、pH=5.2、および70%エタノールを用いて沈殿させた。最後に、ペレットを、70%エタノールを用いて洗浄した。アンチセンス−オリゴヌクレオチドの分析学的同一性を、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー
(ESI−MS)によって確認し、分析的オリゴプロ(OligoPro)キャピラリー(Capilary)エレクトロフォレーシス(Electrophoresis)(CE)によって精製した。
実施例28
Gb1sTb1sdAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGsAb1sGb1sC*b1(Seq.ID No.209y)
LCAA CPGに連結される5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾキシルシチジン−3’−O−スクシノイル(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸1400μlと60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
lのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
を用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
テムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
Aと同じであった。32カラム容量(CV)内に15%B〜55%Bのグラジエントを使用した。280nmでのUVトレース(traces)を記録した。適切なフラクションをプールし、3MのNaOAc、pH=5.2、および70%エタノールを用いて沈殿させた。最後に、ペレットを、70%エタノールを用いて洗浄した。アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、93.7%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5387.3
Da;計算値:5387.80 Da。
実施例29
Gb1Tb1dAdGdTdGdTdTdTdAdGdGdGAb1Gb1C*b1(Seq.ID No.209u)
LNAを一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも、実施例28に記述されるように行った。キャッピングステップ後、システムを、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素0.02Mを有する溶液400μlを、45秒間カラムに挿入した。システムを、酸化ステップ後に24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、95.3%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5146.80 Da;計算値:5146.4 Da。
実施例30
/5SpC3s/Gb1sTb1sdAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGsAb1sGb1sC*b1(Seq.ID No.209v)
化合物を一般的な方法にしたがって、実施例28において例示されるような適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて合成した。最後のヌクレオチドが
オリゴヌクレオチドにカップリングされた後を除くが、続く、酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液236μlを加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを実施例28に記述されるように行った。精製後、アンチセンス オリゴヌクレオチドは、97.4%の純度が認められた。HRMS(ESI):実験値:5540.70 Da;計算値:5541.4 Da。
実施例31
Gb1sTb1sdAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGsAb1sGb1sC*b1/3SpC3s/(Seq.ID No.209w)
3’−スペーサーC3CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾイルシチジン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例28に記述されるように行った。精製後、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、92.7%の純度が認められた。ESI−sMS:実験値:5541.70 Da;計算値:5541.4 Da。
実施例32
Gb1ssTb1ssAb1ssdGssdTssdGssdTssdTssdTssdA*ssdGssdGssdGssAb1ssGb1ssC*b1(Seq.ID No.209an)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾキシルシチジン−3’−O−スクシノイル連結されるLCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/V)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、固体支持体からのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの切断、およびチオール基を脱保護するために、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、濃エタノール中にアンモニア(アンモニア/エタノール 3:1v/v)を有する溶液850μlを55℃で15〜16時間処理した。
実施例33
Gb1sTb1sAb1sdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsG
bsAb1sGb1sC*b1(Seq.ID No.218az)
化合物を、表28に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、90.5%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5442.9Da;計算値:5443.3Da。
実施例34
Gb1sTb1sAb1sGb1sdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsGb1sAb1sGb1sC*b1(Seq.ID No.209ba)
化合物を、表28に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、89.4%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5469.9Da;計算値:5471.3Da。
実施例35
Gb1sTb1sAb1sdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGsdAsGb1sC*b1(Seq.ID No.209bb)
化合物を、表28に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、88.4%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5386.5Da;計算値:5387.3Da。
実施例36
Gb1Tb1dAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAsdGsdGsdGsAb1Gb1C*b1(Seq.ID No.209s)
化合物を、適切なDNA、DNA−誘導体、およびLNA結合ユニットを用いて実施例28および実施例29に記述されるような方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、96.8%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5323.30Da;計算値:5323.0Da。
実施例37
Gb1sTb1sdA*sdGsdTsdGsdTsdTsdTsdA*sdGsdGsdGsAb1sGb1sC*b1(Seq.ID No.209t)
化合物を、適切なDNA、およびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法、および実施例28に記述されるような方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、91.4%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5416.30Da;計算値:5417.3Da。
実施例38
/5SpC3s/Gb1sTb1sdAsdGsdTsdGsdTsdTsdTsdAs
dGsdGsdGsAb1sGb1sC*b1/3SpC3s/(Seq.ID No.209x)
化合物を、実施例28、実施30、および実施例31に例示されるような適切なDNA、およびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、95.1%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5696.30Da;計算値:5695.5Da。
実施例39〜132
表6における他のオリゴヌクレオチドを、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で行った。
実施例133
Gb1sC*b1sTb1sAb1sdTsdTsdTsdGsdGsdTsdAsdGsdTsGb1sTb1sTb1(Seq.ID No.210q)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−O−スクシノイルが連結されたLCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
を320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
THF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
実施例134
『Gb1C*b1Tb1Ab1』dTdTdTdGdGdTdA*dGdT『Gb1Tb1Tb1』(Seq.ID No.210r)
LNAを、一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも、実施例133に記述されるように行った。キャッピングステップ後、システムを、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素(0.02M)を有する溶液400μlを、45秒間カラムに挿入した。システムを、酸化ステップ後、24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、95.3%の純度が認められた。
実施例135
/5SpC3s/『Gb1sC*b1sTb1sAb1s』dTsdTsdTsdGsdGsdTsdAsdGsdTs『Gb1sTb1sTb1』(Seq.ID No.210v)
化合物を、実施例133に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。最後のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに結合された後を除くが、続く酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを、実施例133に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、93.9%の純度が認められた。
実施例136
『Gb1sC*b1sTb1sAb1s』dTsdTsdTsdGsdGsdTsdAsdGsdTs『Gb1sTb1sTb1』/3SpC3s/(Seq.ID No.210w)
3’−スペーサー C3 CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例133に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、89.7%の純度が認められた。
実施例137
Gb1C*b1Tb1Ab1dTsdTsdTsdGsdGsdTsdAsdGsdTsGb1Tb1Tb1(Seq.ID No.210o)
化合物を、実施例133および実施例134に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、83.8%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5288.10Da;計算値:5287.9Da。
実施例138
Gb1sC*b1sTb1sAb1sdTsdTsdTdGsdGsdTsdA*sdGsdTsGb1sTb1sTb1(Seq.ID No.210p)
化合物を、実施例133に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、80.7%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5398.40Da;計算値:5399.3Da。
実施例139
『Gb1ssC*b1ssTb1ss』dAssdTssdTssdTssdGssdGssdTssdA*ssdGssdTss『Gb1ssTb1ssTb1』(Seq.ID No.210af)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/v)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリ
ルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、固体支持体から切断し、チオール基を脱保護するために、濃エタノール中にアンモニアを有する溶液(アンモニア/エタノール 3:1 v/v)850μlを用いて55℃15時間〜16時間処理した。
実施例140〜233
表7の他のオリゴヌクレオチドは、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で調製した。
実施例234
C*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdCsdCsAb1sGb1sTb1sAb1(Seq.ID No.218b)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N 6 −ベンゾイルアデノシン−3’−O−スクシネート
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン(500mg、0.73mmol)、95mgの無水コハク酸(0.95mmol、1.2eq.)、および116mgのDMAP(0.95mmol、1.2eq.)を、35mlのジクロロメタンに溶解した。反応を、室温で一晩撹拌した。反応溶液を、10mlのNaH2PO4(0.1M、pH5.5)を用いて2回洗浄し、10ml塩水を用いて1回洗浄した。有機相を無水NaSO4下で乾燥させ、濾過し、乾燥させるために真空内で濃
縮した。ヘミエステル誘導体を、95%収率で得て、次のステップで更なる精製なしで使用した。
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N 6 −ベンゾイルアデノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG
70mgのヘミエステル誘導体(90μmol)を、0.3mlのDMF中に溶解し、11.6μlのDIEA(90μmol)およびpyBOP(90μmol)を加えて、1分間、共に混合した。この混合物を、手動合成機でLCAA−CPG(500Å、80〜120メッシュサイズ、300mg)と結合させ、室温で1.5時間撹拌した。支持体を濾別し、DMF、DCM、およびMeOHを用いて洗浄した。乾燥後、ローディングを57μmol/gになるように決定した。
伸長
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
のビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
実施例235
C*b1Ab1Tb1dGdAdAdTdGdGdAdCdCAb1Gb1Tb1Ab1(Seq.ID No.218r)
LNAを一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも実施例234に記述されるように行った。キャッピングステップの後、システムを、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素を有する溶液0.02Mの400μlを45秒間カラムに挿入した。システムを、酸化ステップ後、24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、97.8%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5125.10Da;計算値:5124.4Da。
実施例236
/5SpC3s/『C*b1sAb1sTb1s』dGsdAsdAsdTsdGsdG
sdAsdCsdCs『Ab1sGb1sTb1sAb1』(Seq.ID No.218t)
化合物を、実施例234に例示されるように、適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。最後のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに結合された後を除くが、続く酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを、実施例234に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.2%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5519.60Da;計算値:5519.4Da。
実施例237
C*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdCsdCsAb1sGb1sTb1sAb1s/3SpC3/
(Seq.ID No.218u)
3’−スペーサー C3 CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3’−[(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例234に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.3%の純度が認められた。ESI−MS:実験値:5519.10Da;計算値:5519.4Da。
実施例238
『C*b1ssAb1ssTb1ss』dGssdAssdAssdTssdGssdGssdAssdCssdCss『Ab1ssGb1ssTb1ssAb1』(Seq.ID No.218aa)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/V)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流しだし、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メ
チルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、固体支持体からのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの切断、およびチオール基を脱保護するために、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、濃エタノール中にアンモニア(アンモニア/エタノール 3:1v/v)を有する溶液850μlを55℃で15〜16時間処理した。
実施例239
C*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdC*sdC*sAb1sGb1sTb1sAb1
(Seq.ID No.218m)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、93.8%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5394.00Da;計算値:5393.3Da。
実施例240
C*b1Ab1Tb1dGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdC*sdC*sAb1Gb1Tb1Ab1(Seq.ID No.218n)
化合物を、実施例234および実施例235に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.7%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5297.30Da;計算値:5297.0Da。
実施例241
C*b1sAb1sTb1sdGsdA*sdA*sdTsdGsdGsdA*sdCsdCsAb1sGb1sTb1sAb1(Seq.ID No.218o)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを
用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、92.8%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5410.40Da;計算値:5410.3Da。
実施例242
C*b1sAb1sTb1sdGsdA*sdA*sdTsdGsdGsdA*sdC*sdC*sAb1sGb1sTb1sAb1
(Seq.ID No.218p)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、95.3%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5437.40Da;計算値:5438.4Da。
実施例243
C*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdC*sdCsAbsGb1sTb1sAb1(Seq.ID No.218q)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、93.9%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5378.80Da;計算値:5379.3Da。
実施例244
C*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdCsdC*sAb1sGb1sTb1sAb1(Seq.ID No.218c)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、92.9%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5379.10Da;計算値:5379.3Da。
実施例245
C*b1sAb1sTb1sdGdAdAdTdGdGdAdC*sdC*sAb1sGb1sTb1sAb1(Seq.ID No.218s)
化合物を、実施例234に例示されるように適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.5%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5152.70Da;計算値:5152.4Da。
実施例246
/5SpC3/SC*b1sAb1sTb1sdGsdAsdAsdTsdGsdGsdAsdCsdCsAb1sGb1sTb1sAb1s/3SpC3/(Seq.ID No.218v)
化合物を、実施例234、実施例236、および実施例237に例示されるように適切なDNA結合ユニットおよびLNA結合ユニットを用いて一般的方法にしたがって合成した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.4%の純度が確認された。ESI−MS:実験値:5673.50Da;計算値:5673.5Da
実施例247〜実施例335
表8における他のオリゴヌクレオチドを、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で行った。
実施例336
C*b1sGb1sAb1sTb1sdAsdCsdGsdCsdGsdTsdCsdCsAb1sC*b1sAb1(Seq.ID No.152h)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3
’−O−スクシノイル連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾイルシチジン−3’−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
テムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
実施例337
『C*b1Gb1Ab1Tb1』dAdCdGdC*dGdTdCdC*『Ab1C*b1Ab1』(Seq.ID No.152q)
LNAを、一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも実施例336に記述されるように行った。カップリングステップ後、システムを、800μlのアセトニトリルを用いて洗い流し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素(0.02M)を有する溶液の400μlを、45秒間カラムに挿入した。酸化ステップ後、システムを、24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、93.1%の純度が確認された。
実施例338
『/5SpC3s/C*b1sGb1sAb1sTb1s』dAsdC*sdGsdC*sdGsdTsdCsdCs『Ab1sC*b1sAb1』(Seq.ID No.152s)
化合物を、実施例336に例示されるように、適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。最後のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに結合された後を除くが、続く酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを、実施例336に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、96.5%の純度が認められた。
実施例339
『C*b1sGb1sAb1sTb1s』dAsdC*sdGsdCsdGsdTsdCsdC*s『Ab1sC*b1sAb1/3SpC3s/』(Seq.ID No.152t)
3’−スペーサー C3 CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3’−[(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μl
のアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例336に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、92.1%の純度が認められた。
実施例340
『C*b1ssGb1ssAb1ss』dTssdAssdC*ssdGssdCssdGssdTssdCssdC*ss『Ab1ssC*b1ssAb1』(Seq.ID No.152aa)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N6−ベンゾイルアデノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/V)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾイルシチジン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、固体支持体からのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの切断、およびチオール基を脱保護するために、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、濃エタノール中にアンモニア(アンモニア/エタノール 3:1v/v)を有する溶液850μlを55℃で15〜16時間処理した。
DEPC処理水を用いて調製し、それらの成分は、次の通りであった:バッファーA:25mM トリス−HCl、1mM EDTA、pH8.0;バッファーB:25mM トリス−HCl、1mM EDTA、1M NACl、pH8.0。
実施例341〜実施例433
表5における他のオリゴヌクレオチドを、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で行った。
実施例434
C*b1sTb1sdCsdGsdTsdCsdAsdTsdAsdGsdAsC*b1sC*b1sGb1(Seq.ID No.143h)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−O−スクシノイル連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾイルシチジン−3’−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
テムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
ようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
イト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
社、フライブルク、ドイツ)におけるアニオン−交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびソース(Source) Q15を用いてパックされたカラム(GE ヘルスケア(Healthcare)社)によって精製した。バッファーAは、10mM過塩素酸ナトリウム、20mMトリス、1mMEDTA、pH7.4であり、20%アセトニトリルを含み、バッファーBは、500mM過塩素酸ナトリウムを除外してバッファーAと同じであった。32カラム容量(CV)内に15%B〜55%Bのグラジエントを使用した。280nmでのUVトレース(traces)を記録した。適切なフラクションをプールし、3MのNaOAc、pH=5.2、および70%エタノールを用いて沈殿させた。最後に、ペレットを、70%エタノールを用いて洗浄した。
実施例435
『C*b1Tb1』dC*dGdTdCdAdTdAdGdA『C*b1C*b1Gb1』(Seq.ID No.143ad)
LNAを、一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも実施例434に記述されるように行った。カップリングステップ後、システムを、800μlのアセトニトリルを用いて洗い流し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素(0.02M)を有する溶液の400μlを、45秒間カラムに挿入した。酸化ステップ後、システムを、24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、88.7%の純度が確認された。
実施例436
『/5SpC3s/C*b1sTb1s』dC*dGdTdC*dA*dTdAdGdA*s『C*b1sC*b1sGb1』(Seq.ID No.143af)
化合物を、実施例434及び実施例435に例示されるように、適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。最後のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに結合された後を除くが、続く酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを、実施例434および実施例435に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、94.4%の純度が認められた。実施例437
『C*b1sTb1s』dC*dGdTdC*dA*dTdAdGdA*s『C*b1sC*b1sGb1/3SpC3s/』(Seq.ID No.143ag)
3’−スペーサー C3 CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジエメチルホルムアミジングアノシン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例434、および実施例435に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、91.6%の純度が認められた。
実施例438
『C*b1ssTb1ssC*b1ss』dGssdTssdC*ssdAssdTssdAssdGssdAss『C*b1ssC*b1ssGb1』(Seq.ID No.143t)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/V)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−5−メチル−N4−ベンゾイルシチジン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、固体支持体からのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの切断、およびチオール基を脱保護するために、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、濃エタノール中にアンモニア(アンモニア/エタノール 3:1v/v)を有する溶液850μlを55℃で15〜16時間処理した。
実施例439〜実施例534
表4における他のオリゴヌクレオチドを、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で行った。
実施例535
C*b1sAb1sGb1sdGsdCsdAsdTsdTsdAsdAsdTsdAsdAsdAsGb1sTb1sGb1(Seq.ID No.213k)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−O−スクシノイル連結CAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレンチミジン3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
セトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
ステムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
実施例536
『C*b1Ab1Gb1』dGdC*dAdTdTdAdAdTdAdAdA『Gb1Tb1Gb1』(Seq.ID No.213n)
LNAを、一般的な方法にしたがってCPGに結合した。カップリング反応およびキャッピングステップも実施例535に記述されるように行った。カップリングステップ後、
システムを、800μlのアセトニトリルを用いて洗い流し、THF/ピリジン/H2O中にヨウ素(0.02M)を有する溶液の400μlを、45秒間カラムに挿入した。酸化ステップ後、システムを、24μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、91.4%の純度が確認された。
実施例537
『/5SpC3s/C*b1sAb1sGb1s』dGsdC*sdAsdTsdTsd
AsdAsdTsdAsdAsdAs『Gb1sTb1sGb1』(Seq.ID No.213o)
化合物を、実施例535に例示されるように、適切なDNAおよびLNA結合ユニットを用いて一般的な方法にしたがって合成した。最後のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに結合された後を除くが、続く酸化およびキャッピングステップを行い、アセトニトリル中にホスホロアミダイト−C3(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl加えた。カップリングを250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出した。続くステップを、実施例535に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、87.1%の純度が認められた。
実施例538
『C*b1sAb1sGb1s』dGsdC*sdAsdTsdTsdAsdAsdTsdAsdAsdAs『Gb1sTb1sGb1/3SpC3s/』(Seq.ID No.213p)
3’−スペーサー C3 CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジエメチルホルムアミジングアノシン−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト(0.07M)を有する溶液を80μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、640μlのビューケイジ(Beaucage)(0.2M)を、180秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。続く反応を、実施例535に記述されるように行った。精製後、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、95.7%の純度が認められた。
実施例539
『C*b1ssAb1ssGb1ss』dGssdC*ssdAssdTssdTssdAssdAssdTssdAssdAss『Ab1ssGb1ssTb1ssGb1』(Seq.ID No.213ae)
5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−N2−ジメチルホルムアミジングアノシン−3’−O−スクシノイル−連結LCAA CPG(0.2μmol)を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。全量800μlのアセトニトリルを用いて数回洗浄後、カップリング反応を、アセトニトリル中に10%ジクロロメタン(v/V)を有する溶液に5’−O−DMT−2’−O,4’−C−メチレン−チミジン−3’−[(β−ベンゾイルメルカプト)エチル]ピロリジノールチオホスホロアミダイト(0.15M)を有する溶液を38μl、およびアセトニトリル中にDCl(0.25M)を有する溶液を236μl用いて行った。カップリング反応を、250秒間行うようにし、過剰な試薬
を、800μlのアセトニトリルを用いて流し出し、900μlのDDTT(ピリジン/アセトニトリル 4:1v/v中に0.05M)を、240秒間カラムに挿入した。システムを320μlのアセトニトリルを用いて洗い流した。キャッピングステップのために、THF中に無水酢酸を有する溶液(無水酢酸inTHF 1:9v/v)を448μl、およびN−メチルイミダゾール(NMI)/THF/ピリジン(1:8:1)を448μl加えて、45秒間反応させた。このサイクルの終わりに、システムを480μlのアセトニトリルを用いて洗浄した。化合物を、ジクロロメタン中に3%トリクロロ酢酸を有する溶液1400μlを用いて60秒間処理し、5’−DMT保護基を完全に除去した。
固相合成の完了において、固体支持体からのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの切断、およびチオール基を脱保護するために、アンチセンス−オリゴヌクレオチドを、濃エタノール中にアンモニア(アンモニア/エタノール 3:1v/v)を有する溶液850μlを55℃で15〜16時間処理した。
実施例540〜実施例640
表9における他のオリゴヌクレオチドを、一般的な方法にしたがって、および実施例に示されるように合成した。β−D−チオ−LNA、α−L−オキシ−LNA、β−D−(NH)−LNA、またはβ−D−(NCH3)−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドの調製を、β−D−オキシ−LNAユニットを含むアンチセンス−オリゴヌクレオチドと同じ方法で行った。
Claims (13)
- アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びに前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体であって、
前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、10個〜28個のヌクレオチドからなり、前記10個〜28個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個はLNA(LNAの塩基配列は『』で囲まれるか、又は太字で示した。)であり、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、TGF−RIIをコードする遺伝子領域、またはTGF−RIIをコードするmRNA領域とハイブリダイズすることができ、ここで、前記TGF−RIIをコードする遺伝子領域、または前記TGF−RIIをコードするmRNA領域は、配列『TGGTCCATTC』(Seq.ID No.4)、または配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)、または配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)を含み、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記配列『TGGTCCATTC』(Seq.ID No.4)、または配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)、または配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(Seq.ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)それぞれとハイブリダイズすることができる配列を含む、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、並びに前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドの塩、および光学異性体。 - 前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、前記TGF−RIIをコードする遺伝子領域、または前記TGF−RIIをコードするmRNA領域の配列『TGGTCCATTC』(Seq.ID No.4)、または配列『CCCTAAACAC』(Seq.ID No.5)、または配列『ACTACCAAAT』(Seq.ID No.6)、または配列『GGACGCGTAT』(Seq.ID No.7)、または配列『GTCTATGACG』(配列ID No.8)、または配列『TTATTAATGC』(Seq.ID No.9)とのみ選択的にハイブリダイズする、請求項1に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、12個〜20個のヌクレオチドの長さを有し、ここで、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、3’末端で1個〜5個のLNAユニット、5’末端で1個〜5個のLNAユニットを有するギャップマー(GAPmer)構造を有し、および/または、ここで、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合としてホスフェート、ホスホロチオエート、および/またはホスホロジチオエートを有する、請求項1または請求項2に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、次の配列:
ここで、
N1は、CATGGCAGACCCCGCTGCTC−、ATGGCAGACCCCGCTGCTC−、TGGCAGACCCCGCTGCTC−、GGCAGACCCCGCTGCTC−、GCAGACCCCGCTGCTC−、CAGACCCCGCTGCTC−、AGACCCCGCTGCTC−、GACCCCGCTGCTC−、ACCCCGCTGCTC−、CCCCGCTGCTC−、CCCGCTGCTC−、CCGCTGCTC−、CGCTGCTC−、GCTGCTC−、CTGCTC−、TGCTC−、GCTC−、CTC−、TC−、またはC−、を表し、
N2は、−C、−CC、−CCG、−CCGA、−CCGAG、−CCGAGC、−CCGAGCC、−CCGAGCCC、−CCGAGCCCC、−CCGAGCCCCC、−CCGAGCCCCCA、−CCGAGCCCCCAG、−CCGAGCCCCCAGC、−CCGAGCCCCCAGCG、−CCGAGCCCCCAGCGC、−CCGAGCCCCCAGCGCA、−CCGAGCCCCCAGCGCAG、−CCGAGCCCCCAGCGCAGC、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCG、または、−CCGAGCCCCCAGCGCAGCGG、を表し、
N3は、GGTGGGATCGTGCTGGCGAT−、GTGGGATCGTGCTGGCGAT−、TGGGATCGTGCTGGCGAT−、GGGATCGTGCTGGCGAT−、GGATCGTGCTGGCGAT−、GATCGTGCTGGCGAT−、ATCGTGCTGGCGAT−、TCGTGCTGGCGAT−、CGTGCTGGCGAT−、GTGCTGGCGAT−、TGCTGGCGAT−、GCTGGCGAT−、CTGGCGAT−、TGGCGAT−、GGCGAT−、GCGAT−、CGAT−、GAT−、AT−、またはT−、を表し、
N4は、−ACAGGACGATGTGCAGCGGC、−ACAGGACGATGTGCAGCGG、−ACAGGACGATGTGCAGCG、−ACAGGACGATGTGCAGC、−ACAGGACGATGTGCAG、−ACAGGACGATGTGCA、−ACAGGACGATGTGC、−ACAGGACGATGTG、−ACAGGACGATGT、−ACAGGACGATG、−ACAGGACGAT、−ACAGGACGA、−ACAGGACG、−ACAGGAC、−ACAGGA、−ACAGG、−ACAG、−ACA、−AC、または、−A、を表し、
N5は、GCCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CAGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、AGCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CCTGCCCCAGAAGAGCTA−、CTGCCCCAGAAGAGCTA−、TGCCCCAGAAGAGCTA−、GCCCCAGAAGAGCTA−、CCCCAGAAGAGCTA−、CCCAGAAGAGCTA−、CCAGAAGAGCTA−、CAGAAGAGCTA−、AGAAGAGCTA−、GAAGAGCTA−、AAGAGCTA−、AGAGCTA−、
GAGCTA−、AGCTA−、GCTA−、CTA−、TA−、またはA−、を表し、
N6は、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGAA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGGA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAGG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCAG、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTCA、−TGTTTAGGGAGCCGTCTTC、−TGTTTAGGGAGCCGTCTT、−TGTTTAGGGAGCCGTCT、−TGTTTAGGGAGCCGTC、−TGTTTAGGGAGCCGT、−TGTTTAGGGAGCCG、−TGTTTAGGGAGCC、−TGTTTAGGGAGC、−TGTTTAGGGAG、−TGTTTAGGGA、−TGTTTAGGG、−TGTTTAGG、−TGTTTAG、−TGTTTA、−TGTTT、−TGTT、−TGT、−TG、または、−T、を表し、
N7は、TGAATCTTGAATATCTCATG−、GAATCTTGAATATCTCATG−、AATCTTGAATATCTCATG−、ATCTTGAATATCTCATG−、TCTTGAATATCTCATG−、CTTGAATATCTCATG−、TTGAATATCTCATG−、TGAATATCTCATG−、GAATATCTCATG−、AATATCTCATG−、ATATCTCATG−、TATCTCATG−、ATCTCATG−、TCTCATG−、CTCATG−、TCATG−、CATG−、ATG−、TG−、またはG−、を表し、
および
N8は、−AGTATTCTAGAAACTCACCA、−AGTATTCTAGAAACTCACC、−AGTATTCTAGAAACTCAC、−AGTATTCTAGAAACTCA、−AGTATTCTAGAAACTC、−AGTATTCTAGAAACT、−AGTATTCTAGAAAC、−AGTATTCTAGAAA、−AGTATTCTAGAA、−AGTATTCTAGA、−AGTATTCTAG、−AGTATTCTA、−AGTATTCT、−AGTATTC、−AGTATT、−AGTAT、−AGTA、−AGT、−AG、または、−Aから選択され、
N9は、ATTCATATTTATATACAGGC−、TTCATATTTATATACAGGC−、TCATATTTATATACAGGC−、CATATTTATATACAGGC−、ATATTTATATACAGGC−、TATTTATATACAGGC−、ATTTATATACAGGC−、TTTATATACAGGC−、TTATATACAGGC−、TATATACAGGC−、ATATACAGGC−、TATACAGGC−、ATACAGGC−、TACAGGC−、ACAGGC−、CAGGC−、AGGC−、GGC−、GC−、またはC−、を表し、
N10は、−AGTGCAAATGTTATTGGCTA、−AGTGCAAATGTTATTGGCT、−AGTGCAAATGTTATTGGC、−AGTGCAAATGTTATTGG、−AGTGCAAATGTTATTG、−AGTGCAAATGTTATT、−AGTGCAAATGTTAT、−AGTGCAAATGTTA、−AGTGCAAATGTT、−AGTGCAAATGT、−AGTGCAAATG、−AGTGCAAAT、−AGTGCAAA、−AGTGCAA、−AGTGCA、−AGTGC、−AGTG、−AGT、−AG、または、−A、を表し、
N11は、TGCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、GCCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CCAGAAGAGCTATTTGGTAG−、CAGAAGAGCTATTTGGTAG−、AGAAGAGCTATTTGGTAG−、GAAGAGCTATTTGGTAG−、AAGAGCTATTTGGTAG−、AGAGCTATTTGGTAG−、GAGCTATTTGGTAG−、AGCTATTTGGTAG−、GCTATTTGGTAG−、CTATTTGGTAG−、TATTTGGTAG−、ATTTGGTAG−、TTTGGTAG−、TTGGTAG−、TGGTAG−、GGTAG−、GTAG−、TAG−、AG−、またはG−、を表し、
N12は、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTCC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTTC、−GAGCCGTCTTCAGGAATCTT、−GAGCCGTCTTCAGGAATCT、−GAGCCGTCTTCAGGAATC、−GAGCCGTCTTCAGGAAT、−GAGCCGTCTTCAGGAA、−GAGCCGTCTTCAGGA、−GAGCCGTCTTCAGG、−GAGCCGTCTTCAG、−GAGCCGTCTTCA、−GAGCCGTCTTC、−GAGCCGTCTT、−GAGCCGTCT、−GAGCCGTC、−GAGCCGT、−GAGCCG、−GAGCC、−GAGC、−GAG、−GA、または、−Gを表す、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。 - 前記5’末端の最後から2〜4個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、前記3’末端の最後から2〜4個のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドであり、前記5’末端の前記LNAヌクレオチドと前記3’末端の前記LNAヌクレオチドとの間は、少なくとも6個の連続するヌクレオチドが存在しており、前記少なくとも6個の連続するヌクレオチドは、非LNAヌクレオチド、またはDNAヌクレオチドである、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 前記LNAヌクレオチドは、ホスホロチオエート基、またはホスホロジチオエート基を介して互いに連結される、または全てのヌクレオチドは、ホスフェート基、ホスホロチオエート基、またはホスホロジチオエート基を介して互いに連結される、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 前記LNAヌクレオチドは、次の基:
式中、
IL’は、−X’’−P(=X’)(X−)−を表し、
X’は、=O、または=Sを表し、
X−は、−O−、−OH、−ORH、−NHRH、−N(RH)2、−OCH2CH2ORH、−OCH2CH2SRH、−BH3 −、−RH、−SH、−SRH、または−S−を表し、
X’’は、−O−、−NH−、−NRH−、−CH2−、または−S−を表し、
RcおよびRHは、互いに独立して、水素およびC1〜4−アルキルから選択され、
Bは、次の基:
アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−メチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、7−デアザキ
サンチン、2−アミノアデニン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、6−エチルアデニン、6−エチルグアニン、2−プロピルアデニン、2−プロピルグアニン、6−カルボキシウラシル、5,6−ジヒドロウラシル、5−プロピニルウラシル、5−プロピニルシトシン、6−アザウラシル、6−アザシトシン、6−アザチミン、5−ウラシル、4−チオウラシル、8−フルオロアデニン、8−クロロアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アミノアデニン、8−チオールアデニン、8−チオアルキルアデニン、8−ヒドロキシルアデニン、8−フルオログアニン、8−クロログアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アミノグアニン、8−チオールグアニン、8−チオアルキルグアニン、8−ヒドロキシルグアニン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、5−トリフルオロメチルウラシル、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、5−クロロシトシン、5−ヨードシトシン、5−トリフルオロメチルシトシン、7−メチルグアニン、7−メチルアデニン、8−アザグアニン、8−アザアデニン、7−デアザグアニン、7−デアザアデニン、7−デアザ−8−アザアデニン、3−デアザグアニン、3−デアザアデニン、2−チオウラシル、2−チオチミン、および2−チオシトシン、
から選択される核酸塩基を表す、
請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。 - 次のギャップマー構造:3−8−3、4−8−2、2−8−4、3−8−4、4−8−3、4−8−4、3−9−3、4−9−2、2−9−4、4−9−3、3−9−4、4−9−4、3−10−3、2−10−4、4−10−2、3−10−4、4−10−3、4−10−4、2−11−4、4−11−2、3−11−4、4−11−3、
の一つを有する、請求項1〜請求項7のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。 - 損傷した神経経路の再生および機能的再接続を促進するための、並びに/または神経幹細胞再生における年齢誘導性減少の治療および補償のための、請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 神経変性疾患、神経炎症性疾患、外傷性または外傷後疾患、神経血管性疾患、低酸素性疾患、感染後中枢神経系疾患、線維性疾患、過剰増殖性疾患、癌、腫瘍、老人性難聴、および老眼の予防および治療に使用するための請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。
- 前記神経変性疾患、および前記神経炎症性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、クロイツフェルトヤコブ病の新しい変異体、ハレルフォルデン(Hallervorden)スパッツ病、ハンチントン病、多系統萎縮症、認知症、前頭側頭型認知症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、統合失調症、情動障害、大うつ病、髄膜脳炎、細菌性髄膜脳炎、ウイルス性
髄膜脳炎、CNS自己免疫疾患、多発性硬化症、急性虚血性/低酸素性病変、脳卒中、CNSおよび脊髄の外傷、頭部および脊髄外傷、脳外傷性損傷、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、細小血管性認知症、ビンスワンガー(Binswanger)病、網膜変性症、蝸牛変性症、黄斑変性症、蝸牛性難聴、エイズ関連認知症、網膜色素変性症、脆弱X関連震え/失調症候群、進行性核上麻痺、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳変性症、シャイ(Shy)ドレーガー(Drager)症候群、年齢依存性記憶障害、認知症と関連する神経発達障害、ダウン症候群、シヌクレイン症、スーパーオキシドディスムターゼ変異、トリヌクレオチド反復障害、外傷、低酸素症、血管疾患、血管炎症、およびCNS老化から成る群から選択され、前記線維性疾患、肺線維症、嚢胞性線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、心房線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮、および全身性エリテマトーデス後残留物(residuum)から成る群から選択される、請求項12に記載の使用のためのアンチセンス−オリゴヌクレオチド。 - 少なくとも一つの薬学的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント、溶媒、または希釈剤と共に請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含む医薬組成物。
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