JP2021063132A - 標的治療薬を作製する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法およびキットの提供。【解決手段】該標的治療薬を作製する方法では、疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から生体試料を得る工程；前記生体試料は、疾患細胞の集団を含み、該疾患細胞に結合するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、それらの同族ｍＲＮＡに連結されたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングし、１つまたは複数のタンパク質を、前記同定されたｍＲＮＡ−タンパク質対から分離する工程；前記分離したタンパク質（複数可）を治療薬に結合させる工程を具えている。【選択図】図４

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、個々の患者または患者の亜集団に合わせて調整した治療薬を作製する方法、
またこのような治療薬を用いて、悪性疾患、病原体感染および他の状態を治療する方法、
ならびに移植拒絶反応を減少させるかまたは阻止する方法に関する。

従来技術の説明
多くの悪性細胞は、悪性疾患のタイプに特異的であるばかりでなく、個々の患者にも特
異的であるエピトープを示す。ある態様では、本発明は悪性リンパ球上に示されるエピト
ープのような患者特異的なエピトープを標的にできる治療薬に関する。

リンパ球は、脊椎動物の免疫系に重要である。リンパ球は、胸腺、脾臓および骨髄（成
体）で産生され、ヒト（成体）の循環系に存在する全白血球の約３０％を占める。リンパ
球の２つの主要な亜集団、すなわちＴ細胞およびＢ細胞が存在する。Ｔ細胞は、細胞性免
疫を担い、一方Ｂ細胞は、抗体産生（液性免疫）を担っている。典型的な免疫応答では、
Ｔ細胞レセプターが、抗原提示細胞の表面で主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）糖タンパ
ク質に結合した抗原フラグメントに結合すると、Ｔ細胞が活性化される。このような活性
化が生物学的伝達物質（「インターロイキン」）の放出を生じ、そしてこの伝達物質が本
質的には、Ｂ細胞を刺激して分化させ、抗原に対する抗体（「免疫グロブリン」）を産生
させる。

リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫などの血液癌の病因は、異なるかまたは知られて
いない。疑われる原因は、ウイルスおよび化学物質への暴露から家系性傾向の範囲に及ぶ
。しかしこれらの癌の共通性は、これらの癌は全て分裂して、これらの癌がその表面に発
現する免疫グロブリンタンパク質上に同じＦａｂイディオタイプを発現する細胞のクロー
ンを生ずる悪性に形質転換したＢ細胞またはＴ細胞で始まることである。これらの癌を治
療する困難性の１つは、それぞれの癌が特有なイディオタイプ発現することである。した
がって、効果的かつ選択的に全てのありうるイディオタイプを治療する治療処置の開発に
ついてはよく分かっていない。

血液癌のための従来の治療は、骨髄中の悪性クローンを含む全ての血液産生細胞を破壊
した後、血液産生系を再構築するために、骨髄を患者または適合するドナーの骨髄から分
離した幹細胞で置換する方法を一般的に含む。これらの治療は侵襲性が高く、治効はわず
かである。１つの方法は、同定の「マーカー」として利用する細胞表面タンパク質を認識
するモノクロナール抗体ワクチンを用いる治療を含む。この方法を採用する治療薬には、
Ｃｏｍｐａｔｈ−Ｈ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ＨＬＬ２（Ｅｐａｒｔｕｚｕｍａｂ）
、ＨｕｌＤ１０およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ、（例えば、特許文献１：米国特許第６，４５
５，０４３号）が含まれる。しかし、これらのモノクロナール抗体に基づく治療薬につい
ての深刻な限界は、標的細胞表面抗原が正常および悪性腫瘍細胞両方上にしばしば見出さ
れることである。さらに、ヒトモノクロナール抗体の生成が困難であるため、モノクロナ
ール抗体ワクチンは、通常は「キメラ」抗体、すなわち２つ以上の異なる種（例えば、マ
ウスおよびヒト）由来の一部を含む抗体を利用する。このような外来抗体の注射を繰り返
すと、有害な過敏性反応を招く免疫反応の誘導を引き起こす。マウスに基づくモノクロナ
ール抗体に関して、この免疫反応は、ヒト抗マウス抗体応答（「ＨＡＭＡ」応答）としば
しば呼ばれる。患者が、ヒト抗キメラ抗体応答（「ＨＡＣＡ」応答）も発症することもあ
る。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、「外来の」抗体を攻撃することができ、その結果抗体の
標的部位（複数可）に到達前に、それらの抗体は実質的に中和される。さらに、モノクロ
ナール抗体ワクチンの他の欠点は、モノクロナール抗体を生成するため要する時間および
費用である。標的エピトープ、例えばＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５２ｗおよび抗クラスＩ
Ｉ ＨＬＡが容易に突然変異して、以前の治療薬に抵抗性の新たな腫瘍を生ずることがで
きることを考慮すると、これは特に問題である（例えば、非特許文献１：Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５：６１１〜６１５、１９９９を参照）。したが
って本技術分野において、良性の細胞に対して個々の癌細胞を選択的に標的にする悪性疾
患を治療する効果的で低コストの治療薬に対する必要性が存在する。

悪性細胞のように移植組織および移植臓器の細胞は、生来の細胞と比べて移植された細
胞で発現の異なる細胞表面エピトープを示す。ある態様では、本発明はこのような変異す
るエピトープを認識することにより、移植組織または臓器の細胞を標的にすることができ
る治療薬に関する。個々の患者（ドナーを含む）にとって特異的なタンパク質であり、し
たがってレシピエントにより異種であると認識される移植された細胞上の同種抗原に対す
る免疫応答により、移植拒絶反応が生じる。移植拒絶反応に含まれる最も一般的な同種抗
原は、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）分子であり、移植された細胞表面で発現し、個体間
で高度に多型性である。異種ＭＨＣ分子は、レシピエントの免疫系により認識され、移植
の拒絶反応を招く免疫応答を生じる。

免疫系が移植組織に拒絶反応を示す１つの経路は、補体媒介性免疫であり、これは移植
された細胞上のＭＨＣ抗原およびＭＨＣ抗原に対するレシピエントの自然抗体からなる、
免疫複合体へのＣ１（第１の補体成分）の結合により活性化することができる。経路の活
性化により、補体成分Ｃ３を分解してＣ３ａおよびＣ３ｂを生ずるＣ３転換酵素と呼ばれ
ている酵素の集合体が得られる。そして、Ｃ３ｂ分子の一部がＣ３転換酵素に結合して、
Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂに分解する。次いで補体系の生物活性が、Ｃ３とＣ５の分解産物か
ら誘導される。別の補体系の亜成分であるＣ１ｑが、補体活性化の最初のステップに含ま
れる。現在まで補体媒介性免疫を調節することにより移植拒絶反応を治療する方法は、例
えば異種分子から保護する免疫系の能力の重要な成分を排除する治療薬による、全ての補
体媒介性免疫応答の抑制に起因する非選択性と関連した副作用を被っていた。

米国特許第６，４５５，０４３号

Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５：６１１〜６１５、１９９９

したがって本技術分野において、外来の病原体からの防御を保持しながら、移植された
細胞に対する体の免疫応答を選択的に阻害することにより、および／またはより大きな免
疫応答を刺激する特定の細胞型を選択的に破壊することにより、移植拒絶反応を減少させ
るかまたは予防する効果的で低コストの治療薬に対する必要性が存在する。

発明の開示
様々な態様において、細胞表面マーカー（例えばエピトープ、イディオタイプなど）、
または悪性腫瘍細胞、病原体、移植された細胞、および／または治療の標的にされる他の
物により、あるいはその極めて近傍で発現の異なる他の分子を標的にすることにより、広
範な状態の治療に有効な、標的治療薬を開発するための方法が本明細書において提供され
る。また本明細書に記載する方法により生成される治療薬を投与することにより、疾患ま
たは状態を治療する方法も提供する。

標的エピトープ結合タンパク質および免疫エフェクター抗体を含む複合体は、細胞表面上に発現したＦａｂイディオタイプを介して悪性細胞と反応した。 小さなヒトタンパク質（Ｅｂｂｄ）に対する既知のヒト抗体（Ａｂ）を示す図である。 ライゲーションの目的のための免疫エフェクター結合タンパク質（Ｅｂｂｄ）をコードするｍＲＮＡの拡大生成を示す図である。 特定の癌細胞表面で発現したエピトープと選択的に結合するタンパク質改良用のＰｒｏｔｅｏＮｏｖａシステムの概略図である。 悪性細胞上のイディオタイプまたは標的エピトープと結合するｍＲＮＡをタンパク質から分離する過程を示す図である。 二官能性タンパク質が、ヒトタンパク質（免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ））をコードするｍＲＮＡのライゲーションにより作製されることを示す図である。 二官能性タンパク質を含む複合体形成により調製された、個別化した癌治療薬を示す図である。 治療薬により標識された悪性細胞の図を示す。 改良された第２のペプチド（免疫エフェクター結合領域）を含む治療薬を示す図である。 改良された第２のペプチド（免疫エフェクター）を含む治療薬を示す図である。 ｍＲＮＡおよびそのタンパク質生成物により形成される複合体の例を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の１例を示す模式図である。 本発明のｔＲＮＡ分子を構築する１方法を例示する図である。 本発明の方法において、ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように架橋結合分子であるソラレンを配置することができる２つの代替実施形態について記載した図である。 ウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す図である。 本発明のいくつかの実施形態を示す図である。

いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供される方法は、タンパク質をその対
応するｍＲＮＡに連結し、タンパク質ｍＲＮＡ複合体を１つまたは複数の病因決定因子と
関連した分子標的への結合についてスクリーニングする新規の技術を利用する。様々な好
ましい実施形態では、本明細書で提供される治療法は、治療を望む個々の患者、または特
定の株または疾患もしくは状態の亜型を有すると診断された患者のような患者の亜集団で
、発現の異なる分子標的を認識するように設計されている。対象の標的に対して高親和性
を有するタンパク質を好ましくは分離し、治療している疾患に対して有効な１つまたは複
数の治療薬（例えば、細胞毒性薬剤）に連結して、種々の標的治療薬を生成する。都合の
良いことに、対象の標的を認識できるタンパク質の迅速かつ効率的な同定、分離および生
成が、患者および／または疾患に特異的な治療薬の生成のための効果的かつ低コストの方
法を提供する。様々な実施形態で、本明細書において提供される方法は、従来の保健医療
予算および資源分配状況の範囲内で、広範な疾患および状態を調整治療薬を用いて治療で
きる利点がある。

様々な態様において、癌および他の状態を治療するための調整治療薬を生成する方法が
、本明細書で提供され、調整治療薬は治療のために選択される疾患または状態と関連した
分子標的に結合する「標的領域」、および前記疾患または状態を治療するかまたは予防で
きる「治療薬」を含む。いくつかの好ましい実施形態では、標的領域が、特定の患者また
は患者の亜集団で発現の異なる標的を認識するように調整されるが、これらおよび／また
は他の実施形態では、本治療薬は個々の患者または患者の亜集団に対して実質的な調整を
必要としない。標的領域を含む投与可能な治療薬の小部分だけの調整による、個別化した
治療薬の作製のために、この「モジュラー」構造は有利であり、次いでこの治療薬を種々
の既存のまたは容易に調製できる治療薬の有効性を増強するために用いることができる。

いくつかの好ましい実施形態では、治療を望む患者で、標的領域は選択的にエピトープ
と結合するように調整されるか、または非癌性細胞に比べ癌細胞で優先的に発現され、治
療薬は抗体または患者で免疫応答を促進できる他の分子（以下「免疫エフェクター」と呼
ぶ）である。いくつかの好ましい実施形態では、標的エピトープは非癌性細胞には実質上
存在せず、治療薬は別の方法で非癌性細胞に実質上結合しない。いくつかの好ましい実施
形態では、癌はイディオタイプでありうる患者特異的なエピトープを発現する癌性および
／または悪性細胞であるリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、白血病、または多発
性骨髄腫のような血液癌である。

様々な実施形態で、治療薬は標的領域に直接的にまたは間接的に連結、融合、または誘
導体化されて、モジュラー治療薬を形成する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ
ーは、標的結合領域に共有結合しているが、他の実施形態では、免疫エフェクターは非共
有結合している。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、免疫エフェクターと結合す
る第２の領域に融合した標的結合領域を含む二官能性タンパク質の一部である。免疫エフ
ェクター結合領域は、抗体の可変領域、またはＦｃ領域などの抗体の他の領域と結合する
分子によって認識されるエピトープを含むことができる。免疫エフェクター結合領域は、
免疫エフェクター（例えば図９を参照）と強固に結合するように設計されたペプチド配列
も含むことができる。二官能性タンパク質は、融合タンパク質を含むことができるか、ま
たは２つのドメインは、共有結合または非共有結合することができる。標的結合領域およ
び免疫エフェクター結合領域は、直接的に連結できるかまたは間接的に、例えば可動性の
リンカーペプチドを介して連結できる。

他の態様では、本発明は、ｍＲＮＡ発現ライブラリーから、発現したｍＲＮＡ分子およ
びそれらの新生ポリペプチドの複合体を分離すること、タンパク質ｍＲＮＡ複合体を、癌
細胞で示されるエピトープのような病因決定因子と関連した分子標的への結合についてス
クリーニングすること、標的エピトープと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡを分
離して発現させること、および標的エピトープ結合タンパク質（または誘導体、フラグメ
ント、もしくはこれらのサブユニット）を、治療薬、例えば標的に対して免疫応答を誘発
できる抗体に誘導体化することを含む癌治療の治療薬を調製するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本治療薬の調製は、以下にさらに詳細に説明するように、標的
結合領域をコードする分離したｍＲＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化、選択的な突然変異誘
発、および／または標的エピトープに対しより強いかまたはより効果的な結合を示すｍＲ
ＮＡを同定して分離する当該技術分野で周知の他の方法を受けさせることをさらに含む。

さらに他の態様では、本発明は治療を要する患者で、治療標的にした状態の病因決定因
子上で、あるいはその極めて近傍で特異的にもしくは優先的に発現する、標的エピトープ
または他の分子を同定すること、標的と結合するが、非標的には実質的に結合しないタン
パク質を分離すること、標的結合タンパク質（または誘導体、誘導体のフラグメントもし
くはサブユニット）を、治療薬、例えば所望の対象で免疫応答を誘発できる抗体に連結す
ること、ならびに患者に治療薬を、治療の標的にされた状態を治療するために十分な分量
および回数で投与することを含む癌のような疾患または状態を治療するための方法を提供
する。

なおさらなる態様では、本発明はｍＲＮＡ発現ライブラリーから、発現したｍＲＮＡ分
子およびそれらの新生ポリペプチドの複合体を分離すること、癌細胞により示される標的
エピトープに対する結合についてタンパク質ｍＲＮＡ複合体をスクリーニングすること、
標的エピトープと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡを分離して発現させること、
および標的エピトープ結合タンパク質（または誘導体、誘導体のフラグメントもしくはサ
ブユニット）を、免疫応答を誘発できる抗体に誘導体化することを含む、癌細胞の標的エ
ピトープまたは他の病因決定因子と結合するタンパク質を同定する方法を提供する。いく
つかの実施形態では、本方法は標的エピトープ結合タンパク質をコードする分離したｍＲ
ＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化、選択的な突然変異誘発、または標的エピトープに対しよ
り強いかもしくはより効果的な結合を示すｍＲＮＡを同定して分離する当該技術分野で周
知の他の方法を受けさせることをさらに含む。

さらに別の態様では、本発明は、個別化した治療薬を開発するための、疾患および／ま
たは患者特異的な病因決定因子の発現により特徴付けられる疾患または状態の治療用のキ
ットを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、治療薬は癌性および／または悪性細
胞表面で発現の異なる特有な細胞表面エピトープを標的にする固形腫瘍および血液癌を含
む癌治療のための、患者特異的な治療薬を開発するキットが提供される。

さらなる態様では、本発明は、移植拒絶反応を減少させるか、または予防するための治
療薬および方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的結合タンパク質は、移植され
た細胞により表示されるＭＨＣ抗原のような細胞表面抗原に結合し、治療薬（例えば、免
疫エフェクター）は、免疫応答についての１つまたは複数の分子決定因子に結合して阻害
するタンパク質または他の分子を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫エフェク
ターは、補体系のＣ１ｑまたはＣ３成分と結合し、それにより補体媒介免疫の活性化を阻
害する。他の実施形態においては、免疫エフェクターは、免疫応答を刺激して「外来の」
ＭＨＣまたは他の抗原を持つ移植された細胞を排除する。さらなる実施形態では、特異的
なエピトープ、例えばＭＨＣ抗原を認識するエピトープを発現するリンパ球亜集団のクロ
ーン増殖を、治療薬は除去するかまたは妨げる。

本発明は、さらに悪性疾患治療に関して前記したものと本質的には同様の、移植拒絶反
応を抑制する方法およびキットを提供する。

本発明のさらなる態様では、前記したものと本質的には同様の、標的結合領域が、病原
性病原体により発現される１つまたは複数の変異するエピトープ、または病原性病原体が
感染した１つまたは複数の細胞と結合するように選択され、かつ治療薬が、抗生物質また
は他の細胞毒性薬剤などの抗病原薬剤を含む治療薬、方法およびキットを提供する。いく
つかの実施形態では、病原体は、ＨＩＶのようなウイルスである。

様々な態様において、本明細書で提供される方法は、迅速でかつ費用効率が高い個別化
した治療薬の作製を可能にする。以下の詳細な記述は、態様の特定の用途に関連する本発
明の様々な態様を説明する。しかし、この説明は悪性疾患の治療、病原体の減少と除去、
移植拒絶反応の低減および／または予防、ならびに全体的に、非標的細胞または非標的分
子と比べて、差次的な結合特性を示す治療薬標的を含むあらゆる状態の治療を含むがこれ
らに限定されない治療薬の開発および使用ならびに様々な状態の治療方法に等しく適用さ
れる。

本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面と
共に読むとさらに充分に明らかとなる。

図面の簡単な説明
図１、標的エピトープ結合タンパク質および免疫エフェクター抗体を含む複合体は、細
胞表面上に発現したＦａｂイディオタイプを介して悪性細胞と反応した。

図２は、小さなヒトタンパク質（Ｅｂｂｄ）に対する既知のヒト抗体（Ａｂ）を示す。
このタンパク質は、抗体（Ａｂ）を治療薬に連結するエピトープとして機能できる。Ａｂ
の役割は、最終的に免疫応答を誘発する免疫エフェクターとして作用することである。

図３は、治療薬の二官能性タンパク質成分をコードするオリゴヌクレオチド配列の作製
における、ライゲーションの目的のための免疫エフェクター結合タンパク質（Ｅｂｂｄ）
をコードするｍＲＮＡの拡大生成を示す。

図４は、特定の癌細胞表面で発現したエピトープと選択的に結合するタンパク質改良用
のＰｒｏｔｅｏＮｏｖａシステム。このシステムは、それぞれのタンパク質が、その同族
のｍＲＮＡと連結したままであるタンパク質ライブラリーをもたらすｍＲＮＡライブラリ
ーのｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳を含む。選択は、癌エピトープと選択的に結合するが、正
常細胞で発現するエピトープには結合しないタンパク質を同定するステップを含む。用い
られる選択法は、用いられるエピトープ分離および表示方法に依存する。このシステムは
、迅速な指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、選択および標的特性
を有するタンパク質（複数可）の大量な生成も含む。

図５は、悪性細胞上のイディオタイプまたは標的エピトープと結合するｍＲＮＡをタン
パク質から分離する過程。図ではネガティブ選択を除外する。

図６は、オリゴヌクレオチド配列から翻訳される二官能性タンパク質が、標的エピトー
プ結合タンパク質およびヒト抗体が結合するヒトタンパク質（免疫エフェクター結合領域
（Ｅｂｂｄ））をコードするｍＲＮＡのライゲーションにより作製されることを示す。

図７は、免疫エフェクターＡｂ（抗Ｅｂｂｄ抗体）およびＦａｂイディオタイプまたは
標的エピトープに対するエピトープを有する、二官能性タンパク質を含む複合体形成によ
り調製された、個別化した癌治療薬を示す。

図８は、イディオタイプもしくは標的エピトープとイディオタイプもしくは標的エピト
ープと結合するタンパク質との結合を介して、治療薬により標識された悪性細胞の図を示
す。露出したヒト抗体は、治癒的免疫応答を誘発する。

図９は、標的エピトープに結合するように改良された第１のペプチド（標的エピトープ
結合領域）、および安定なＣ３転換酵素（免疫エフェクター）と結合するように改良され
た第２のペプチド（免疫エフェクター結合領域）を含む治療薬を示す。標的エピトープへ
の治療薬の結合が、結合部位で補体媒介免疫応答を誘発する。

図１０は、標的エピトープに結合するように改良された第１のペプチド（標的エピトー
プ結合領域）、および補体系のＣ１成分と結合するように改良された第２のペプチド（免
疫エフェクター）を含む治療薬を示す。標的エピトープへの治療薬の結合が、エフェクタ
ーへの内在のＣ１の結合を誘発し、結合部位で補体媒介免疫応答の開始を誘発する。

図１１は、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体により連結されたとき、ｍＲＮＡおよびそ
のタンパク質生成物により形成される複合体の１つの例を、図式的に説明する。図のよう
に、ｍＲＮＡのコドンは修飾されたｔＲＮＡのアンチコドン塩基対を形成し、ＵＶ照射に
よってソラレンモノ付加体、または非ソラレン架橋剤もしくはアリールアジドと共有結合
的に架橋結合する。翻訳されたポリペプチドは、リボソームのペプチジルトランスフェラ
ーゼを介して修飾されたｔＲＮＡに連結される。いずれの連結も、ｍＲＮＡおよび新生タ
ンパク質がリボソームによって適所に保持されている間に起こる。

図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の１例を示す模式図であり、開始
核酸およびそのタンパク質生成物は連結されており（例えば図１参照）、タンパク質によ
って示される特定の特徴によって選択される。特定の特徴を示さないタンパク質は廃棄さ
れ、特徴を有するタンパク質は変異を有して増幅する、好ましくは変異を有するｍＲＮＡ
の増幅を介して増幅して新しい集団を形成する。様々な実施形態では、結合していないタ
ンパク質が選択される。新しい集団は翻訳され、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体を介し
て連結され、選択過程が繰り返される。タンパク質生成物を最適化するために、所望する
だけの回数の選択および増幅／突然変異を行うことができる。

図１３は、本発明のｔＲＮＡ分子を構築する１方法を例示する図である。この実施形態
では、ｔＲＮＡの５’末端と、アンチコドンループをコードし、ｍＲＮＡに安定して連結
することができる分子（本例で用いるソラレンなど）を有する核酸と、末端ピューロマイ
シン分子で修飾されたｔＲＮＡの３’末端とをライゲーションして、本発明のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ進化の方法で用いる完全な修飾されたｔＲＮＡを形成する。他の実施形態にはピュ
ーロマイシンは含まれない。

図１４は、本発明の方法において、ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように
架橋結合分子であるソラレンを配置することができる２つの代替実施形態について記載し
た図である。第１の実施形態には架橋剤（例えばソラレンモノ付加体）をｍＲＮＡに連結
させることが含まれ、第２の実施形態には架橋剤をｔＲＮＡ分子のアンチコドンに連結さ
せることが含まれる。架橋剤は、知られているもしくは部分的に知られているメッセージ
の読み枠のアンチコドンまたは３’末端コドンのどちらかとのモノ付加体とすることがで
きる。これは翻訳とは別の手順、例えば翻訳が起こる前に行うことができる。

図１５は、ウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す図である。プソイドウリ
ジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重
結合を欠くｔＲＮＡ中に見つかる天然に生じる塩基である。

図１６は、本発明のいくつかの実施形態を示す図である。特定の実施形態におけるＳＡ
ＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサー類似体を示す。

好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書中で用いられる用語「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞前駆体から成
熟Ｔ細胞までの、Ｔリンパ球系列内のあらゆる細胞を包含する。

用語「Ｂリンパ球」および「Ｂ細胞」は、プレＢ細胞のようなＢ細胞前駆体から、成熟
Ｂ細胞および形質細胞にまでのＢ細胞系列内のあらゆる細胞を包含する。

免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、それらのアミノ末
端で高度に特異的な可変領域を含む。Ｈ（Ｖ_Ｈ）およびＬ（Ｖ_Ｌ）鎖の可変（Ｖ）領域が
組み合わさって、特有な抗原認識または免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質の抗原結合部
位を形成する。Ｉｇ分子の可変領域は、抗原またはイディオタイプとして認識されうる決
定基（すなわち分子形態）を含む。

用語「エピトープ」は、免疫グロブリンＶ領域の抗原決定基またはエピトープ決定基（
すなわちイディオトープ）のセット（すなわち相補性決定領域、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域の会
合により形成される抗原結合部位を表す。）を表す。

用語「イディオトープ」は、免疫グロブリン分子のＶ領域の一部に沿って位置する単一
のイディオタイプのエピトープを表す。

用語「免疫エフェクター」は、治療している対象で、免疫応答を促進できる分子、また
は分子の誘導体、フラグメント、もしくはサブユニットを表し、抗体、または抗体の誘導
体、フラグメント、もしくはサブユニット、または非抗体分子を含むことができる。

「アジュバント」は、１つまたは複数の抗原（複数可）と共に投与した場合、免疫応答
を増強するか、または刺激する化合物である。

「悪性細胞」は、未治療で放置した場合、癌を生じる細胞を表す。

本明細書中で定義する用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」と
は、任意の型のアミノ酸（例えばペプチド結合を介して重合することができるＤもしくは
Ｌアミノ酸、合成または修飾されたアミノ酸など）を含む２つ以上の単位の高分子を意味
し、これらの用語は本明細書中で互換性があるように使用してもよい。

本明細書で提供するのは、特定の疾患もしくは状態を病む、特定の患者または患者の亜
集団に合わせて調整した治療薬を生成する方法である。様々な実施形態で、治療薬は、１
つまたは複数の患者マーカーおよび／または疾患特定マーカーと結合するように、小タン
パク質領域の調整を可能にし、かつ治療標的にした状態に効果的である様々な既存のまた
は容易に生成される治療薬を指示する調整された領域の使用を可能にする「モジュラー」
構造で構成される。標的にされた疾患マーカーは、タンパク質、核酸、脂質、化学物質、
ポリマー、および金属、ならびに生物構造、例えば細胞膜、細胞骨格要素、レセプター、
およびさらに全細胞を含むがこれに限定されないあらゆるタイプの分子、またはこれら分
子の部分もしくは誘導体、または分子の複合体を含むことができる。好都合にも、治療標
的にした状態の病因決定因子上で、あるいはその極めて近傍でマーカーは発現し、治療薬
の活性を病原性細胞、病原体、タンパク質、および／または治療状態の他の決定因子に集
中する。

いくつかの実施形態では、モジュラー治療薬は血液癌治療用に調整され、悪性Ｂ細胞お
よび／またはＴ細胞の表面の特有なＦａｂイディオタイプに結合するように設計される。
例えばいくつかの好ましい実施形態では、全ての癌性細胞が単一の悪性Ｂ細胞に由来する
「クローン」Ｂ細胞疾患である非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のために、治療薬が
提供される。その結果、本明細書で提供されるモジュラー治療薬の標的結合部分により標
的にされうるそれぞれの患者に特有である共通のイディオタイプ（表面で発現されたＩｇ
Ｍ分子の可変領域を含む）を、全てのＮＨＬ細胞が発現する。当該技術分野で周知の方法
を用いて、Ｂ細胞はリンパ節または末梢血から分離できる。例えばいくつかの実施形態で
は、赤血球および／または顆粒球は、分離する細胞群間の中間密度を有する液体中で、遠
心分離によりＢ細胞から分離できる。Ｔリンパ球を得る方法、例えば患者末梢血からの分
離、および大きさおよび／または密度に基づく分離も、当該技術分野で周知の技術でもあ
る。Ｂ細胞および／またはＴ細胞からのタンパク質の抽出は、当該技術分野で周知の多く
の方法のいずれかにより実施できる。例えば、細胞は界面活性剤により、または機械的な
方法により溶解できる。必要に応じて、酵素消化により、またはストレプトマイシンのよ
うな薬剤を使った沈殿により、核酸を細胞標品から除去できる。このような方法は当該技
術分野で周知の技術である。

本明細書で記載される方法に従って作製した、血液癌を治療するためのモジュラー治療
薬の作用機序を図１に示す。投与された治療薬は、悪性Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表
面の特有なＦａｂイディオタイプに結合し、イディオタイプが関連する血液癌の病因決定
因子は、標的イディオタイプを発現する悪性および／または癌性細胞を含む。イディオタ
イプへの標的領域の結合は、悪性細胞を破壊する免疫応答を生じる。標的結合タンパク質
は、単独で免疫応答を誘発するにはあまりに小さく、したがって標的イディオタイプへの
結合がない場合は、結合した免疫エフェクターはＩＲを生じない。標的結合タンパク質が
、悪性細胞の表面のＦａｂイディオタイプに結合するとき、悪性細胞は標的エピトープ結
合タンパク質に免疫原性を与えるキャリアとして作用し、免疫エフェクターに悪性腫瘍細
胞を標的にするＩＲを生じさせる。さらなる実施形態では、本発明の治療薬および方法は
、非血液癌を特徴付けるエピトープを標的にするために用いることもできる。

様々な好ましい実施形態では、標的マーカーは、（ｉ）同様の診断を有する他の患者と
比べて個々の患者において、または限定された患者の亜群で、および／または（ｉｉ）状
態と関連せず、好ましくは治療薬の影響を受けない細胞／分子と比べて、細胞または状態
の病因と関連した他の分子標的に関連して発現が異なる。有利なことに、例えば健全な細
胞に対する無調整治療薬の非選択的活性、および／または標的マーカー（複数可）に関し
て、既存の標的治療薬の患者間での差異を説明できないため、既存の無調整治療薬と比べ
て、調整治療薬の選択性が治療の有効性を増強する。例えば血液癌の場合、標的イディオ
タイプは、患者および悪性細胞の両方に特有のもので、治療薬（免疫応答をもたらす）の
活性を非癌性細胞は免れて、標的細胞に選択的に向けるようにする。さらに、イディオタ
イプがそれぞれの患者に特有なので、無調整治療薬は非選択的またはより選択的でない治
療的応答をもたらすであろう。

悪性細胞により発現の異なる細胞表面マーカーの例には、リンパ管腫に関しては、ＣＤ
−２０およびＣＤ−２２などの安定な細胞表面抗原エピトープ、ならびに固形腫瘍に関し
ては、ｍＡｂと結合した際に内部に取り入れられるＣＤ−１９およびＣＤ−３３などの表
面エピトープが挙げられるが、それらに限定されない。他の発現の異なる細胞表面マーカ
ーは当該技術分野で周知であり、ＣＤ−５２ｗおよびクラスＩＩＨＬＡ抗原を含むがこれ
らに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、標的エピトープは、治療対象患者
で変異する（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５：６１１
〜６１５、１９９９を参照）癌細胞特異的なエピトープである。好都合にも、それぞれの
患者に特有な変異エピトープを標的にする個別化した治療薬の開発を可能にすることによ
り、本明細書で提供される方法が、癌のさらに効果的な治療を可能にする。

いくつかの好ましい実施形態では（例えば、図２に示すように）、モジュラー治療薬の
標的結合領域は、標的（例えば、標的エピトープ結合領域（Ｔｅｂｄ））と結合する第１
のサブドメイン、および治療薬（例えば、免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ））と結
合する第２のサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、治療の標的であ
る対象における免疫応答を促進できる薬剤、例えば抗体、または抗体の誘導体、フラグメ
ント、もしくサブユニットであり、治療薬と結合する領域は、治療薬により認識される小
タンパク質、例えば、治療薬抗体により認識されるエピトープである。当該技術分野で周
知である、はっきりと特徴付けられた抗体−抗原の組合せも利用でき、市販で入手可能で
ある。本発明で有用な抗体は、任意の哺乳動物から得られるか、または異なる哺乳動物の
組合せから得られるキメラ抗体でありうる。哺乳動物は、例えばウサギ、マウス、ラット
、ヤギまたはヒトであってもよい。抗体は、ヒト抗体であるのが好ましい。ウエスタンブ
ロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および適切なＦａｂイディオタイプフラグメント、ペプ
チド、イディオタイプ−発現細胞またはこれらの細胞抽出物を用いるＦＡＣＳ分析を含む
多数の周知の方法により、標的抗原に対する抗体の反応性を確立できる。本抗体は、任意
の抗体クラスおよび／またはサブクラスに属すことができる。抗体は、異なるクラスおよ
びサブクラスの抗体からのフラグメントも含み、それにより複合体を形成してもよい。

様々な実施形態で、所望の結合活性を有するヒトモノクロナール抗体は、当該技術分野
で周知の方法（総説に関しては、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５〜５３９を参照のこと）を用いて、例えば、Ｐａｒｍ
ｌｅｙとＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ ７３：３０５〜３１８（１９８８）、Ｂａｒｂａｓら、
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７９７８〜７９８２（
１９９１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：３２４５〜３２６０（１９９
４）、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓとＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫系の構築：
ファージディスプレイライブラリー由来ヒト抗体（Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ
ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、ヒトにおける予防的および治療
的適用のための抗体分子のタンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａ
ｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ）中、Ｃｌａ
ｒｋ，Ｍ．編、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、ページ４５〜６４（１９９３
）、およびＢｕｒｔｏｎとＢａｒｂａｓ、組合せライブラリー由来ヒト抗体（Ｈｕｍａｎ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
）、（前掲）、ページ６５〜８２に記載される、ファージディスプレイライブラリーのス
クリーニングにより生成され、これら全ては、参照として本明細書に組み込まれている。
典型的には、所望の大きさの結合親和性を生じる抗体に対応するクローンを同定し、標準
的な組換え発現方法を用いるＤＮＡを用いて、所望の抗体を生成する。

ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３、およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘ
ｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７〜６１４に記載され
ているような、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニックマ
ウスを用いて、完全ヒトモノクロナール抗体も生成でき、参照として本明細書に組み込ま
れている。この方法は、ファージディスプレイ技術で要求されるｉｎ ｖｉｔｒｏの操作
を回避し、高親和性真正ヒト抗体を効率的に生成する。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター結合領域のような、対象の抗原に対する抗
体が、モジュラー治療薬を用いる治療に選択された患者で生成される。例えば、いくつか
の実施形態では、Ｚｅｂｅｄｅｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：３１７５〜３１７９（１９９２）、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４〜１０１３７（１９９１）、お
よびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：
１０１６４〜２０１６８（１９９１）に記載されているように、患者は対象の抗原を用い
る「ワクチン接種」を受け、抗原に対する患者の抗体が、対象の抗原への結合により選択
される。

いくつかの実施形態では、スクリーニングを追加実施して、最初に分離した抗体の親和
性を増加させる。例えばいくつかの実施形態では、抗体の親和性は、超可変抗体領域が変
異して多数の組合せを生じ、対応する抗体変異体をファージディスプレイによりスクリー
ニングして、抗原に対し所望の親和性を有する抗体を選択する、親和力成熟により増強さ
れる。さらなる実施形態では、小さなタンパク質エピトープは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化を
行い、以下にさらに詳細に説明するように、抗体に対するそのエピトープの結合親和性を
増加できる。有利なことに、いくつかの実施形態では、例えば、患者に「予防接種をする
」ことにより抗体が産生される実施形態では、同様な方法が宿主免疫系により（例えば、
クローン選択を介して）行われて、対象の抗原に対して特異的な高親和性抗体を生成する
。

他の実施態様において、治療を受けている対象で免疫応答を促進できる免疫エフェクタ
ーには、非抗体分子を含む。例えば、ＦａｒｒｉｅｓとＨａｒｒｉｓｏｎに付与された米
国特許第６，２６８，４８５号に記載されている免疫エフェクターは、Ｃ３転換酵素を含
むことができ、これは参照として本明細書に組み込まれている。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３タ
ンパク質をＣ３ａとＣ３ｂにタンパク質分解性転換を触媒する酵素であり、転換は補体系
応答の誘発における重要なステップを含む。Ｃ３ｂは生成部位近傍の細胞表面に結合し、
そこでＣ３ｂは食作用および他の破壊性免疫応答を媒介する。いくつかの実施形態では、
Ｃ３転換酵素は修飾または誘導体化されて、阻害剤に対する感受性の低下、タンパク分解
性裂開に対する耐性、補助因子に対する親和性の増強、または補体媒介免疫応答の促進に
おける酵素の効果を増強する他の修飾を賦与する。いくつかの実施形態では、免疫エフェ
クターは、Ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）または補体媒介免疫を刺
激する別の分子を含む。

Ｃ３転換酵素を本発明の治療薬に連結することは、標的エピトープ結合タンパク質の、
標的にされた細胞表面上の変異するエピトープへの結合により、治療の標的にされた細胞
、病原体、病原体−感染細胞、および／または他の細胞に向けられている補体媒介免疫応
答を可能にする。免疫エフェクターとしてＣ３転換酵素を用いる治療薬を図９に示す。好
ましい実施形態では、Ｃ３転換酵素（免疫エフェクター結合タンパク質）、および標的エ
ピトープ（標的エピトープ結合タンパク質）と結合するタンパク質をコードするペプチド
配列を同定し、分離し、必要に応じてｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化または他の技術により改
良して、それらの標的リガンドに対するペプチド配列の親和性を増加させた。次いで、標
的エピトープ結合領域、および免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ）として転換酵素結
合ペプチドを含む二官能性融合タンパク質を作製する。治療薬が治療を要する患者に投与
され、標的エピトープ結合領域が、悪性細胞の表面または他の標的に結合し、Ｃ３転換酵
素が、対象細胞の破壊を媒介する細胞膜傷害複合体の生成を含む補体媒介免疫応答を生じ
る。

いくつかの実施形態では、治療薬は、標的エピトープ結合領域およびＣ３転換酵素結合
領域を含む。投与されると同時にこのような治療薬は標的エピトープと結合し、内在性の
Ｃ３転換酵素を集めて補体媒介免疫応答を誘導する。免疫エフェクターが、補体系のＣ１
成分と結合する治療薬を示すこのような方法を図１０に示す。治療を要する患者に投与さ
れると同時に治療薬は標的エピトープと結合し、内在性のＣ１を細胞表面に集めて、そこ
で補体媒介免疫応答を誘導する。

他の実施形態においては、治療薬の免疫エフェクター成分は、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ５、お
よび／または補体媒介免疫応答の誘発に含まれる他の分子、例えば米国特許第５，６５０
，３８９号で記載されるタンパク質に結合して阻害する。治療を必要とする患者に投与さ
れると同時に、このような治療薬は、標的エピトープに結合し、さもなければ結合部位ま
たはその近傍に向けられる免疫応答を阻害する。例えば、いくつかの好ましい実施形態で
は、患者は移植された細胞（例えば、幹細胞、または移植臓器を含む細胞）のレシピエン
トであり、標的治療薬は、移植された細胞を認識し、このような細胞に対する免疫応答を
阻害することができる。さらなる実施形態では、移植拒絶反応を阻害するための標的治療
薬は移植された細胞を認識する１つまたは複数の免疫細胞のエピトープ、例えば移植され
た細胞表面上のＭＨＣ抗原と結合するエピトープを標的にする標的結合領域を含み、治療
薬は患者において抗移植免疫細胞に対し免疫応答を促進できる免疫エフェクターである。

有利なことに、本明細書で提供される方法は、迅速かつ安価で個別化した治療薬の日常
的な作製が十分に可能である。本発明に従う治療薬は、生検材料の受け取りから治療薬の
完成まで、わずか数週間で、かつ数千ドルの経費で作製できるのが好ましい。

本発明に用いる二官能性融合タンパク質は、当業者には周知の標準的な組換えＤＮＡ技
術に従って生成できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８
９））。いくつかの実施形態では、精製した二官能性タンパク質は、免疫エフェクターと
反応でき、図７に示しているような、治療薬を含む結合したエフェクター−二官能性タン
パク質複合体を産生する。当該技術分野で周知の方法により、二官能性タンパク質を、免
疫エフェクターに化学的に結合させることもできる。

いくつかの実施形態では、タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル
−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ
）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチル脂肪イミダートＨＣＬ）、活性
エステル（例えば、ジスクシニミヂルスベリン酸塩）、アルデヒド（例えばグルタレルデ
ヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えばｂｉｓ（ｐ−アジ
ドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ｂｉｓ−（ｐ−
ジアゾニウムベンゾイル）−エチル−エンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリ
エン ２，６−ジイソシアネート）、またはビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジ
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が、治療薬を含む２種以上のタンパク質成分を連
結するために使用される。

いくつかの実施形態では、標的−エピトープ結合タンパク質をコードする第１のポリヌ
クレオチド配列、またはその誘導体、フラグメントもしくはサブユニットを、キメラコー
ド配列を作製するために免疫エフェクターと結合するエピトープまたは他のタンパク質を
コードする第２のポリヌクレオチド配列に連結すること、キメラコード配列を発現ベクタ
ーにサブクローニングすること、発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションする
こと、およびトランスフェクション細胞により発現される融合タンパク質を精製すること
により、組換え型の融合タンパク質を作製する。いくつかの実施形態では、キメラポリヌ
クレオチドは、原核生物および／または真核生物のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で適切な翻訳
開始配列、および／または選択可能なマーカーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、両方のタンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびいくつかの
実施形態では、主要組織適合複合体Ｉおよび／またはＩＩをコードするｍＲＮＡを含むｍ
ＲＮＡオリゴのｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳により、二官能性タンパク質複合体を作製する
。ｍＲＮＡ配列に対するｃＤＮＡは、合成または市販品として入手でき、図３に示すよう
にＰＣＲにより転写して充分なｍＲＮＡを得ることができる。様々な実施形態で、免疫エ
フェクター結合領域をコードしているｍＲＮＡと、標的エピトープ結合領域をコードして
いるｍＲＮＡをライゲーションすることにより、オリゴを形成する。ある場合にはこの融
合は、図６に示すように親水性アミノ酸をコードするｍＲＮＡブリッジを介して連結でき
る。次いで、ｍＲＮＡは原核生物または真核生物の翻訳系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻
訳でき、得られた二官能性タンパク質は、ゲル電気泳動または当該技術分野で周知の任意
の他の方法により精製できる。

本融合タンパク質は、キメラタンパク質の有用性を高める、１つまたは複数の多数から
成る他の成分を含むこともできる。例えば、タンパク質は融合タンパク質の精製を容易に
するのに役立つエピトープタグを含むように設計できる。例えばペプチドのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端で、２またはそれ以上の隣接したヒスチジン残基をコードするように
キメラコード配列を修飾できる。ヒスチジン残基挿入は、スプライスバイオーバーラップ
（ｓｐｌｉｃｅ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ）延長方法により、ヒスチジンをコードするＣＡ
ＴおよびＣＡＣ三塩基コドンをコード配列の適切な位置でＰＣＲプライマー中に取り込む
ことにより容易に達成できる。当該技術分野で周知のニッケル−セファロースクロマトグ
ラフィー法により、ヒスチジン−修飾タンパク質は、効率的かつ定量的に分離できる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療薬は、治療薬（例えば細胞毒性薬
剤）のような第２の分子に結合されてもよい。例えば、治療薬は抗腫瘍剤、トキシン、放
射性薬剤、サイトカイン、第２抗体または酵素を含むが、これらに限定されない。細胞毒
性薬剤の例には、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、
臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アク
チノマイシンＤ、ジフテリアトキシン、シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）Ａ、ＰＥ
４０、アブリン、アルブリン（ａｒｂｒｉｎ）Ａ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシ
ン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉ
ｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙ
ｃｉｎ）、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフ
ィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、マイタン
シノイドス（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、ならびにグルココルチコイドおよび他の化
学療法剤、ならびに放射性同位元素、例えば^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^９０Ｙ、および^１８
６Ｒｅを含むが、これらに限定されない。適切な検出可能なマーカーには、これらに限定
されるものではないが、放射性同位元素、蛍光性化合物、生物発光化合物、化学発光化合
物、金属キレート剤または酵素が含まれる。本発明の治療薬は、プロドラッグをその活性
型に変換できる抗癌プロドラッグ活性化酵素にも結合できる。例えば米国特許第４，９７
５，２８７号を参照のこと。

いくつかの好ましい実施形態では、第２の治療薬は、第１の治療薬と相補的作用様式を
有する。例えばいくつかの実施形態では、第１および第２の治療薬は、癌または他の疾患
の病因に含まれるシグナル伝達系の異なる態様に対して作用し、第１および／または第２
の治療薬のみを持つ調整治療薬と比べて、有効性の増強、副作用の減少、改善された治療
指数、および／または他の利点を生じる。いくつかの実施形態では、第１の治療薬は、第
２の治療薬を増強するかあるいはこの逆で増強するか、または１つまたは複数の治療の態
様で、第１および第２治療薬は相乗的な増強を示す。相乗作用、増強作用、および他の組
み合わせた薬理学的効果を評価する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｃｈｏ
ｕとＴａｌａｌａｙ、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ、２２：２７〜５５（１９８４
）に記載され、参照として本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、治療薬は、治療薬の抗体免疫エフェクター成分に結合される
。抗体に治療薬を結合するか、または接続する技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら
、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ−ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉ
ｓｆｅｌｄら編、ページ２４３〜５６（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８
５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ
ｅｒｙ”、ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏ
ｂｉｎｓｏｎら編、ページ６２３〜５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １
９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”、
ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａ
ｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、ページ４
７５〜５０６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏ
ｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．，６２：１１９〜５８（
１９８２）を参照のこと）。

本発明の治療薬は、タンパク質薬剤に適切な当該技術分野で周知の任意の方法、例えば
静脈内注射、筋肉内注射、局所投与、経口摂取、経直腸投与および吸入により投与できる
。あるいは本発明の治療薬は、悪性疾患部位に直接供給できる。治療薬は、薬剤学的に許
容し得る担体との混合物として投与してもよい。任意のそのような担体が、適合性の問題
が生じない限り本方法に従って使用できる。本組換え型融合タンパク質の有効量を、患者
に投与しなければならない。用語「有効量」とは、望ましい応答をもたらすために必要な
融合タンパク質の量を意味する。

いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供する方法に従って作製した治療薬は
、増殖を阻害し、かつ／またはエピトープ結合タンパク質がスクリーニングされて、エピ
トープを持つ細胞のアポトーシスを誘導する。例えば、いくつかの実施形態では、本治療
薬複合体のエピトープ結合部分が、悪性細胞表面で発現するエピトープまたは他の標的と
結合できる。一旦結合すると、複合体のＩＲを誘発する抗体成分が免疫系を刺激して、図
８に示すように正常な細胞を残しつつ標識された細胞を攻撃し排除する。

様々な実施形態で、タンパク質をその対応するｍＲＮＡに連結（「同族対」として）す
る新規の方法を使用して、患者および／または疾患特異的な標的に結合する本明細書で提
供される個別化した治療薬の調整が可能になる。いくつかの好ましい実施形態では、多数
の同族対を含むタンパク質ライブラリーを作製し、対象の標的、例えば本明細書に記載し
た個別化された標的に結合する同族対に関して、ライブラリーをスクリーニングする。

本発明の様々な態様では、修飾したｔＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ分子を用いて、翻
訳されたタンパク質生成物をｔＲＮＡリンカーを介してそれらの対応するｍＲＮＡに連結
して「同族対」を形成する。いくつかの実施形態で、未知の配列を有するｍＲＮＡ、例え
ばｍＲＮＡライブラリーからのｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現し、それらの対
応するタンパク質を、１つまたは複数の所望の特性、例えば標的エピトープ結合領域への
結合、または対象の別のリガンド、および／または１つまたは複数の新たなリガンド、例
えば健全な細胞により表示されるエピトープに対する選択性に関してスクリーニングする
。さらなる実施形態では、１回または複数回の選択で同定されたタンパク質およびタンパ
ク質と連結した核酸を、例えば核酸進化（図４）を通じて修飾して、標的リガンドに対し
て増強された親和性をもつタンパク質を生成する。次いで、標的リガンドに対する高親和
性のような所望の特性を有するタンパク質を、標準的なクローン技術を使用して、タンパ
ク質−ｍＲＮＡ同族対から、それらの対応するｍＲＮＡを分離することにより多量に生成
できる。

いくつかの好ましい実施形態では、同族対は、真核生物のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系、例
えばウサギ網状赤血球溶解物（ＲＬＬ）、コムギ胚芽、大腸菌、または酵母菌溶菌液系を
用いて形成される。しかしｉｎ ｓｉｔｕ系、ならびに異なる系の成分を組み合わせるハ
イブリッド系を含む任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いることは、当業者により理解さ
れる。例えばいくつかの実施形態では、１つまたは複数の原核生物の因子、例えば翻訳サ
プレッサータンパク質が真核生物の翻訳系で使用される（全て参照として本明細書に組み
込まれている、例えばＧｅｌｌｅｒとＲｉｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ２８３：４１（１９８０
）、Ｅｄｗａｒｄｓら、ＰＮＡＳ ８８：１１５３（１９９１）、ＨｏｕとＳｃｈｉｍｍ
ｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８：６８００（１９８９）を参照のこと）。いくつかの実施形
態では、１つまたは複数のｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を原核生物系中で荷担し、その
後、確立された方法に従って、真核生物系で使用するために精製する（参照として本明細
書に組み込まれているＬｕｃａｓ−ＬｅｎａｒｄとＨａｅｎｎｉ、ＰＮＡＳ ６３：９３
（１９６９）。

様々な実施形態で、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用により、同族対
を含むタンパク質を、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体に連結する。いくつかの実施形態で
は、タンパク質を安定なアミノアシルｔＲＮＡ類似体に連結させる（ＳＡＴＡ）。いくつ
かの実施形態では、ＳＡＴＡは天然の構造で対応する高エネルギーのエステル結合と比べ
て、安定な結合を介してｔＲＮＡの３’末端に結合したアミノ酸またはアミノ酸類似体を
有するｔＲＮＡである。ＳＡＴＡが特定のコドンを、例えば水素結合を介して認識し、リ
ボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用により新生ペプチド鎖を受容する場合、
安定なアミノアシル結合が、ペプチジルトランスフェラーゼによるポリペプチドからのｔ
ＲＮＡの脱離を防ぎ、その後のステップの間ｔＲＮＡ−ポリペプチド構造も保つ。

いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、参照として本明細書に組み込まれている、Ｆｒ
ａｓｅｒとＲｉｃｈ、ＰＮＡＳ、７０：２６７１（１９７３）において一般に説明された
方法により作製され、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を３’−アミノ−３’−デオキシｔ
ＲＮＡへと変換することを含む。これは、天然のアデノシンを取り除いた後に、ｔＲＮＡ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、天然ｔＲＮＡの末端に３’−アミノ−３’
−デオキシアデノシン付加することにより達成され、次いでそれぞれのアミノアシルｔＲ
ＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって、修飾されたｔＲＮＡにアミノ酸を荷担する。いくつ
かの実施形態では、ａａＲＳは、ｔＲＮＡの２’ヒドロキシルではなく３’ヒドロキシル
に荷担して、通常の不安定な高エネルギーのエステル結合ではなく、安定なアミド結合に
よってｔＲＮＡにアミノ酸を連結する。したがってＳＡＴＡがリボソームのペプチジルト
ランスフェラーゼからペプチド受容した際、ペプチドは安定して保持されて別のアクセプ
ターに供与することができなくなる。

特定の実施形態では、３’アミド結合を介してアミノアシル化されたｔＲＮＡは、Ａ部
位への結合を補助する伸長因子ＥＦ−ＴＵと結合しない（例えば、参照として本明細書に
組み込まれているＳｐｒｉｎｚｌとＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
．、２２：１（１９７９））。しかし、このような修飾されたｔＲＮＡはＡ部位に結合す
る。この３’修飾されたｔＲＮＡの結合は、Ｍｇ^＋＋濃度を変えることにより増加させる
ことができる（参照として本明細書に組み込まれているＣｈｉｎａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１３：３００１（１９７４））。ＳＡＴＡおよびＭｇ^２＋の適切な濃度ならびに／
またはモル比は経験的に決定することができる。例えば、ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結
合力が高すぎる場合は、ＳＡＴＡは非同族コドンに関して、天然ｔＲＮＡと競合する可能
性があり、翻訳を停止する可能性がある。あるいは、ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結合力
が低すぎる場合は、ＳＡＴＡは放出因子と有効に競合しない可能性があり、ＳＡＴＡが新
生ペプチドを安定に受容することを妨げる可能性がある。

伸長因子がコドン−アンチコドンの認識のプルーフリーディングを補助すると考えられ
ているが、プルーフリーディングのこの供与源を欠くことが、本明細書で提供される方法
を妨害することは予想されない。特定の作用機序に束縛されることなく、伸長因子および
関連するＧＴＰ加水分解が存在しない場合における誤り率は、ヌクレオチド１つ離れたコ
ドンの認識についてほぼ１００回に１回であると考えられる（参照として本明細書に組み
込まれているＶｏｅｔとＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ１０００
〜１００２（１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）。いくつかの好ま
しい実施形態では、ＵＡＡが連結コドンとして用いられる。ＵＡＡは、アミノ酸１個が異
なる７つの非ストップコドンを有し、非ストップコドンの７／６１または約１１．５％を
含む。したがって、所定のコドンのミスコードの確率は、コドン１個あたり（０．０１）
（０．１１５）＝１．１５×１０^−３個のミスコード、または８７０コドンごとに約１個
のミスコードで、本明細書に記載されている様々な方法のパフォーマンスを実質的には損
なわない頻度であると推定できる。いくつかの新たな実施形態では、伸長因子媒介プルー
フリーディングを欠くことによる実質的な障害なしに、ＵＡＧを連結コドンとして用いる
ことができる。

いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、アクセプター基部（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｔｅ
ｍ）または分子の別の領域に、１つまたは複数の修飾された塩基を有するｔＲＮＡまたは
ｔＲＮＡ類似体である。アクセプター基部修飾を有するｔＲＮＡを生成する様々な方法が
当該技術分野で周知であり、例えば、参照として本明細書に組み込まれているＳｐｒｉｎ
ｚｌとＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２２：１（１９７９
）に記載されている。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡがアミノアシル−
Ｔｙｒ ｔＲＮＡを模倣するように、ピューロマイシンで修飾され、新生ポリペプチドに
取り込まれて翻訳を停止する。いくつかの実施形態では、アクセプター基部が修飾された
ｔＲＮＡは、「転写ｔＲＮＡ」から形成され、転写後プロセシングではなく、ｔＲＮＡ自
体の配列が非定型かつ修飾された塩基をもたらす。転写ｔＲＮＡはｔＲＮＡとして機能す
ることができる（例えば、どちらも参照として本明細書に組み込まれているＤａｂｒｏｗ
ｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． １４：４８７２、１９９５、およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：７６１７、１９９３を参照のこと）。転写ｔＲＮＡは、転写
のような当該技術分野で周知の方法により生成することができ、または市販されているＲ
ＮＡ配列（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ
、Ｃｏｌｏ．から）を図Ｘに記載のように１片ずつ連結して一緒にするか、もしくは確立
された方法をいくつか併用することにより生成することができる。例えば図Ｘを参照して
、５’リン酸と３’ピューロマイシンは、オリゴリボヌクレオチドと結合したものが市販
されていて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（例えば、参照として本明細書に組み込まれているＭ
ｏｏｒｅとＳｈａｒｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：９９２、（１９９２）、またはＴ４
ＲＮＡリガーゼ（参照として本明細書に組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋとＵｈｌｅｎ
ｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １００：５２（１９８３））
を用いて結合することができる。

修飾されたｔＲＮＡを生成する他の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｃｈ
ｉｎａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３００１（１９７４）およびＫｒａｙｅｖｓｋｙ
とＫｕｋｈａｎｏｖａ、Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２３：１（１９７９
）に記載され、どちらも参照として本明細書に組み込まれている。

いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡは、新生タンパク質がペプチジルトランスフェラー
ゼによりｔＲＮＡに結合する時に翻訳が停止するように、好ましくはコドン−アンチコド
ンの水素結合により、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを認識する修飾されたｔ
ＲＮＡもしくは修飾されていないｔＲＮＡ、またはｔＲＮＡ類似体を含むナンセンスサプ
レッサーｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡは
Ｙａｒｕｓの延長アンチコドン則に従う３’修飾および／または配列を有する（参照とし
て本明細書に組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６４６〜６５２、
１９８２）。本明細書で定義されるように「疑似ストップコドン」とは、天然にはナンセ
ンスコドンではないが、メッセージがさらに翻訳されることを防ぐコドンを意味する。疑
似ストップコドンは、本明細書に記載されるような、「安定なアミノアシルｔＲＮＡ類似
体」もしくはＳＡＴＡにより認識されるコドン、または存在しないｔＲＮＡが要求された
とき、すなわち疑似ストップコドンで翻訳が停止するように、相補的アンチコドンを有す
るｔＲＮＡが実質的に枯渇するかあるいは存在しないコドンを含むことができる。当業者
は、本明細書で定義されるように、疑似ストップコドンの作製方法が多数存在することを
理解するであろう。

いくつかの好ましい実施形態では、ｔＲＮＡは、天然ペプチド結合を介して新生ポリペ
プチドに連結された天然ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、アンチ
コドンループおよび／または分子の他の領域に１つまたは複数の修飾を有するが、３’末
端で修飾されていないｔＲＮＡである。様々な実施形態で、３’末端で修飾されていない
天然ｔＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡの使用は、本明細書に記載されている様々な選択法
の改善に結びつき、より速い、誤りの少ない、効率的な、費用効率のより高い、および／
または高い収率の方法が得られる。特定の理論に束縛されるものではないが、特定の条件
下においては、ピューロマイシン（および類似のリンカー）は、伸長因子（複数可）とｔ
ＲＮＡとの相互作用を干渉することで低収率をもたらしうると考えられる。

本発明の１つの実施形態において、架橋剤は、２つの分子を化学的または力学的に一緒
に連結する作用物質である。１つの実施形態では、架橋剤は活性化されることにより、ｔ
ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用
物質である。１つの実施形態では、架橋剤は硫黄で置換したヌクレオチドである。別の実
施形態においては、架橋剤はハロゲンで置換したヌクレオチドである。架橋剤の例には、
これらに限定されるものではないが、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウ
リジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロ
ロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体が含まれる。１つ
の実施形態では、架橋剤はソラレンまたはソラレン類似体である。

いくつかの好ましい実施形態では、例えば、ソラレンで連結されたオリゴヌクレオチド
（図３）を連結することにより、または天然もしくは修飾されたｔＲＮＡもしくはｔＲＮ
Ａ類似体、好ましくアンチコドンもしくはポリペプチドとの連結とは異なる別の部位への
モノ付加（ｍｏｎｏａｄｄｕｃｔｉｏｎ）により（図４）、ソラレンをｔＲＮＡまたはｔ
ＲＮＡ類似体（例えば、３’修飾されたＳＡＴＡ）とのモノ付加体とする。所望の波長の
ＵＶ光で照射を受けたとき、以下にさらに詳細に説明するように、共有結合のソラレン架
橋結合が、ＳＡＴＡとｍＲＮＡの間に形成される。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡの
アンチコドンまたは他の部分を、ｍＲＮＡと架橋結合を形成することができる非ソラレン
部分、例えば２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシト
シン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、２−クロロアデノシン、アリールアジ
ド、およびそれらの修飾体または類似体で誘導体化する。これらおよび他の架橋剤は、当
分野で周知であり、例えばＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄｈａｒｍ
ａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、および他の周知の科学材料の製造者
から購入可能である。

様々な実施形態で、ＳＡＴＡ−ポリペプチド複合体またはｔＲＮＡ−ポリペプチド複合
体が、ｍＲＮＡ上および／またはｔＲＮＡ上に位置することができるリンカー部分を介し
て、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに連結される。いくつかの好ましい実施形態では
、ｍＲＮＡは、好ましくは転写物の３’末端のストップコドンまたはその近隣で架橋剤を
含み、ｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ連結は、ｍＲＮＡに基づく架橋剤により完全に媒介される。さ
らなる実施形態では、ｔＲＮＡは、その３’末端で修飾されていない（例えば、ナンセン
スサプレッサーｔＲＮＡ）。いくつかの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、翻訳可能な
読み枠の最後に位置する疑似ストップコドンを含む。疑似ストップコドンがｍＲＮＡの３
’末端に位置する、翻訳系が疑似ストップコドンの３’側のコドン対応するｔＲＮＡを枯
渇する、および／または疑似ストップコドンに対応する３’修飾されたｔＲＮＡが使用さ
れ、転写物を翻訳不可能にして放出因子の活性化ができないようにする読み枠の最後に、
疑似ストップコドンを効果的に配置することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
ＡはｔＲＮＡストップアンチコドンに対応するストップコドンを含む。有利なことに、ス
トップコドン／アンチコドンの対は、完全長の転写物を選択する。当業者は、ストップコ
ドンを有さないｍＲＮＡを用いてもよく、任意のコドンまたは核酸トリプレットを用いて
もよいことを理解するであろう。

いくつかの方法では、ＳＡＴＡは、コドンとアンチコドンとの間でソラレン架橋結合に
よって翻訳されたメッセージに結合している。ソラレン架橋結合は、相補的５’ピリミジ
ン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列を含む配列間で優先的に生じる（参照とし
て本明細書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５
４：１１５１（１９８５））。ＳＡＴＡをコードするコドン、または連結コドンは、連結
コドンにいくつかのコドンが用いられてもよいために、ＰＹＲ−ＰＵＲ−ＸまたはＸ−Ｐ
ＹＲ−ＰＵＲであることができる。便利なことに、ストップコドンまたはナンセンスコド
ンがこの立体配置を有する。アミノ酸をコードするコドンを用いることは遺伝暗号の微調
整を必要とすることがあり、これは一部の用途を複雑にする可能性がある。したがって好
ましい実施形態では、ストップコドンを連結コドンとして用い、ＳＡＴＡは連結コドンを
認識するという意味でナンセンスサプレッサーとして機能する。しかし当業者は、系に適
切な調整を加えることによって任意のコドンを用いることができることを理解するであろ
う。

いくつかの好ましい実施形態では、ＳＡＴＡまたはペプチジルｔＲＮＡは、例えばコド
ンとアンチコドン間でソラレン架橋結合によって、または２−チオシトシン、２−チオウ
リジン、４チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジ
ン、２−クロロアデノシン、およびアリールアジドから成る群から形成された架橋結合に
よって、翻訳されたｍＲＮＡに架橋結合する。いくつかの実施形態では、ソラレン架橋結
合は、相補的５’ピリミジン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列を含む配列間で
優先的に生じる（参照として本明細書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。いくつかの実施形態では、非ソ
ラレン架橋剤またはアリールアジドが用いられ、特定の実施形態では、その要件において
ストリンジェンシーがより低く、そのため可能なコドン−アンチコドン対が増加するので
特に有利である。

様々な実施形態で、ペプチジルトランスフェラーゼにより、新生タンパク質がＳＡＴＡ
に結合された際に、および／または読み枠の最後に到達した際に翻訳が停止する。多数の
リボソームがこの位置にあるとき、ＳＡＴＡおよびｍＲＮＡはＵＶ光の処理によって架橋
結合される。好ましい方法では、ＵＶ光を、好ましく３２０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で照
射した後に、ソラレン架橋結合を形成することにより、架橋結合がなされる。ソラレンは
フラン側鎖およびピロン側鎖を含み、これらは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドの相補的塩基対の間に容易にインターカレートする（参照として本明細
書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１
５１（１９８５））。いくつかの好ましい実施形態では、ソラレン架橋結合は、以下によ
り詳細に記述するピロン側鎖またはフラン側鎖のモノ付加体であるモノ付加体を形成する
。さらに照射すると、フラン側鎖のモノ付加体を相補的塩基対に共有結合的に架橋結合す
ることができるが、ピロン側鎖のモノ付加体はさらに架橋結合することができない。フラ
ン側鎖のソラレンモノ付加体（ＭＡｆ）の形成は、確立された方法に従って達成される。
さらに他の実施態様においては、ソラレンは、メッセージの読み枠の最後に結合すること
もできる。

精製したオリゴヌクレオチドのＭＡｆの大量生成方法は文献に記載されており（例えば
、参照として本明細書に組み込まれているＳｐｅｉｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ ８９：４５
１４、１９９２）、また、より少ない資源しか必要としないが架橋結合不可能なピロン側
鎖のソラレンモノ付加体の混入を一部含む方法も記載されている（例えば、いずれも参照
として本明細書に組み込まれている米国特許第４，５９９，３０３号、Ｇａｍｐｅｒら、
Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９７：３４９（１９８７）、Ｇａｍｐｅｒら、Ｐｈｏｔｏ
ｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ４０：２９（１９８４））。本発明のいくつかの実
施形態では、どちらかの方法を用いてソラレンの標識化を行う。好ましい実施形態では、
どちらも参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，４６２，７３３号および
Ｇａｓｐａｒｒｏら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１
９９３）に記載の方法に従って、可視光、好ましくは約４００ｎｍ〜４２０ｎｍの範囲の
可視光を用いてフラン側鎖のモノ付加体を作製する。本発明の１態様では、ｍＲＮＡの３
’末端に配置するための、フラン側鎖モノ付加体を有するＳＡＴＡ、またはモノ付加体化
したオリゴヌクレオチド、および付加していないＳＡＴＡをキットの主成分として提供す
る。

１つの実施形態では、参照として本明細書に組み込まれているＢａｃｈｅｌｌｅｒｉｅ
ら、（Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、９：２２０７（１９８１））の方法に従って、モノ
付加体および架橋結合の形成および逆転を行う。好ましい実施形態では、どちらも参照と
して本明細書に組み込まれているＫｏｂｅｒｔｚとＥｓｓｉｇｍａｎｎ、Ｊ．Ａ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、５９６０〜５９６１およびＫｏｂｅｒｔｚとＥｓｓｉ
ｇｍａｎｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、６２、２６３０〜２６３２の方法を用
いることにより、高収率の最終生成物をもたらすモノ付加体の効率的な生成が達成される
。

ｍＲＮＡをそのタンパク質に連結する他の方法、またファージディスプレイ方法が使用
できる。

いくつかの実施形態では、適切な濃度のＳＡＴＡおよびＭｇ^＋＋が、ｍＲＮＡ分子の存
在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で用いられ、リボソームが上記のようにＳＡＴＡにペプ
チド鎖を受容させるストップコドンまたは疑似ストップコドンに達した際に翻訳が停止さ
れる。短時間の後、かなりの割合のおよび／または多くのストップコドンまたは疑似スト
ップコドンが、リボソーム内のＳＡＴＡによって占有され、いくつかの実施形態では、そ
の後、系にＵＶ光を照射して、ｔＲＮＡ−ポリペプチドとそれらの対応するｍＲＮＡ間に
架橋結合を生成する。いくつかの実施形態で、ｍＲＮＡに架橋結合の後、好ましくは透析
、希釈、またはキレート化によるＭｇ^＋＋の除去によって、リボソームを放出または変性
させる。当業者は、それだけに限定されないが、イオン強度、ｐＨ、または溶媒系を変え
ることによる変性を含めた他の方法も、結合したリボソームおよび／または他の翻訳因子
から同族対を放出するために使用できることを理解するであろう。

様々な実施形態で、１つまたは複数の所望の特性に基づき同族対が選択される。いくつ
かの実施形態では、同族対の選択は、これらに限定されるものではないが、アレイ、アフ
ィニティーカラム、免疫沈降などを含む、様々な確立された方法のうちの任意のものによ
り測定されるように、標的細胞、タンパク質、および／または他の生体分子の結合に基づ
く。いくつかの好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニング手法を用いて、
選択基準が測定される。様々な実施形態において、治療薬の所望の特性に従って、選択は
陽性または陰性であることができる。いくつかの好ましい実施形態では、配列が未知のｍ
ＲＮＡ（例えば、患者、組織、または所望の他の供与源からのｍＲＮＡライブラリーの形
態で）を発現させ、本明細書に記載する方法を用いてそれらのコードされたポリペプチド
に連結し、同族対を所望の特性に関し選択するためにスクリーニングする。例えば、いく
つかの好ましい実施形態では、同族対を、所望のリガンド、例えば悪性細胞により表示さ
れるＦａｂイディオタイプ、または標的細胞の他の表面的特徴への結合に関して分析する
。所望の結合特性を示すタンパク質に対するｍＲＮＡが分離でき、当該技術分野で周知の
標準的な分子クローン技術を用いて大量のタンパク質が生成できる。本明細書でさらに詳
細に記載されるように、次に所望のタンパク質をモジュラー治療薬に組み込み、例えば作
用物質を患者および／または疾患特異的標的に向けることができる。

様々な実施形態で、選択された同族対は、リガンドによく結合する同族対またはよく結
合しない同族対であってもよい。例えば、タンパク質が熱力学的に有利な反応を加速する
ためには、例えばその反応の酵素として作用するためには、基質および遷移状態の類似体
のどちらにも結合するべきである。しかし、遷移状態の類似体は基質よりもはるかに密に
結合しているべきである。

これは、以下の式によって説明される。

［式中、酵素を用いた場合の反応速度（ｋ_{ｅｎｚｙｍｅ}）の、酵素を用いない場合の速度
（ｋ_{φｅｎｚｙｍｅ}）に対する比は、酵素と遷移状態との結合（Ｋ_{ｔｒａｎｓ}）の、基質
の酵素との結合（Ｋ_{ｓｕｂｓｔ}）に対する比に等しい（ＶｏｅｔとＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ３８０、（１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）。

いくつかの好ましい実施形態では、基質との結合に関して競合が不十分であるが遷移状
態の類似体との結合に関して良好に競合するタンパク質を選択する。操作上では、これは
マトリックスに基質または基質類似体が結合した状態でマトリックスから容易に溶出され
、マトリックスに遷移状態の類似体が結合した状態のマトリックスから除去が最も困難で
あるタンパク質を選ぶことによって達成してもよい。この選択を連続して繰り返し、同族
対の核酸の複製および翻訳によりタンパク質を再生産することにより、改良された酵素が
進化するはずである。本発明のいくつかの実施形態では、同一選択過程において、１つの
部分に対する親和性、および別の部分に対する親和性の欠如を用いる。いくつかのさらな
る実施形態では、ｍＲＮＡ部分の１つまたは複数の特性に従って同族対が選択できる。

正常細胞および悪性細胞により発現されるエピトープを同定する、当該技術分野で周知
の多くの方法がある。例えば、いくつかの実施形態では、例えばＡｉｎａらによる“Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ ６６：１８４〜１９９（２００２）の記載のように、組合せライブラ
リーからの細胞特異的なマーカーペプチドの分離に、ペプチドマイクロアレイが使用でき
る。いくつかの好ましい実施形態では、タンパク質ｍＲＮＡ複合体ライブラリーを悪性細
胞の分離した集団と反応させ、正常細胞の集団に対して観察される結合と比較して、悪性
腫瘍細胞エピトープに結合する程度を測定する。いくつかの実施形態では、悪性細胞に対
してかなりの親和性を有し、正常細胞に対しては、かなり低いかまたは親和性を有さない
タンパク質が選択される。例えば、いくつかの実施形態では、約１０μＭ未満、好ましく
は約１μＭ未満、より好ましくは約０．１μＭ未満、そしてさらにより好ましくは約１０
ｎＭ未満の親和性で、エピトープまたは所望の他の標的と結合するポリペプチドが同定さ
れる。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、エピトープまたは約１ｎＭ未
満の他の標的に対する親和性を有する。スクリーニング法は、潜在的なリガンド（例えば
、その同族ｍＲＮＡに連結されたタンパク質）およびいろいろな配向の標的（例えば、治
療対象の細胞）を用いて実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、悪性
細胞はガラススライドのような平坦な表面上にあり、ｍＲＮＡ−タンパク質同族対を含む
溶液に曝露される。結合したタンパク質（同族対）は、当該技術分野で周知のいろいろな
方法で検出できる。例えば、いくつかの実施形態では、好ましくはｍＲＮＡおよび／また
はｔＲＮＡリンカー上で、その後第２のリポータープローブを用いて、例えばアビジンで
コーティングした磁気ビーズ用いて検出できるビオチン部分のような検出可能なプローブ
を用いて、同族対は誘導体化される。得られたイディオタイプ−（タンパク質：ｍＲＮＡ
）−ビオチン−アビジン−磁気ビーズ複合体は、Ｖｅｎｔａｎａ ３２０自動免疫組織化
学システム（Ｖｅｎｔａｎａ ３２０ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ
、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）、または例えばＤａｖｉｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：６１１〜６１５、（１９９９）に記載されているような類似の
システムを用いて同定できる。

この方法は、複数の相異なる核酸−ポリペプチド複合体を提供すること、所望の結合特
徴を有するリガンドを提供すること、複合体をリガンドと接触させること、結合していな
い複合体を取り除くこと、およびリガンドに結合した複合体を回収することをさらに含む
ことができる。

本発明のいくつかの方法は、核酸分子および／またはタンパク質の進化を含む。いくつ
かの実施形態では、例えば参照として本明細書に組み込まれているＣａｄｗｅｌｌら、Ｐ
ＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、２：２８（１９９２）に記載のように、試験管内組
換え、例えば米国特許第５，６０５，７９３号に記載のように、突然変異誘発、例えば米
国特許第５，８３０，７２１号に記載のように、「ＤＮＡシャッフリング」、例えばＣｏ
ｃｏら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９（４）：３５４〜９（２００１）に記載の
ように、および／または当該技術分野で周知の方法に記載のように、このような方法は回
収された複合体の核酸成分（ＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡとして）を増幅すること、お
よび例えばエラープローンＰＣＲにより、変異を核酸の配列に導入することを含む。いく
つかの好ましい実施形態では、タンパク質中のそれぞれの位置において少なくとも１つの
アミノ酸置換が導入される。さらなる実施形態では、この方法は、増幅して変化した核酸
からポリペプチドを翻訳すること、ｔＲＮＡを用いてそれらを一緒に連結すること、およ
び、結合した複合体の別の新しい集団を選択するためにそれらをリガンドと接触させるこ
とをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化の過程で、特
に選択されたｍＲＮＡが変異を持って複製され、翻訳され、選択のために再度同族タンパ
ク質に結合される反復過程において、選択されたタンパク質ｍＲＮＡ複合体を用いる。

複製の閾値
効率的な進化のための複製の公称最小回数は、以下の式を用いて推定してもよい。
長さｎの配列において、選択的改善を伴う、ｒの突然変異が、突然変異率ｐで出現する場
合、複製において、前記選択的改善が生じる確率は以下のように決定してもよい：
ｒ＝１では、適当な部位における突然変異の確率、ｐ、×該突然変異が、出発点とは異な
る３個のヌクレオチドのうち、目的の一つ変異である確率、１／３、×他のｎ−１部位が
、変異しないままである確率、（１−ｐ）^{（ｎ−１）}、または

式中、Ｐは、所定の変化を示す、ｒの突然変異を達成する確率である。より一般的には
、全てのｒの値に対して：

利点のある１つの突然変異を見出す確率と、３つの突然変異が出現する確率とを比較す
ることは有用である。これはトリプレットの遺伝暗号を考慮すると、任意の１種のコドン
は１つの突然変異において９種の他のコドンにしか変化できないからである。実際に、１
つの突然変異で９種の他のアミノ酸コードに実際に変化できるコドンは存在しないことが
判る。１つの突然変異でアクセスすることができるアミノ酸の最大数は７種のアミノ酸で
あり、これを行うことができるのは６４個のコドンのうち８個のみである。ほとんどのコ
ドンでは、１つの突然変異で１９種の他のアミノ酸のうち５または６種となる。開始アミ
ノ酸とは異なる１９種のアミノ酸全てに達するためには、一般に３つの突然変異が必要で
ある。間に入る２つの変異は一般に選択的に有利とならないので、これら３つの突然変異
は逐次的であることはできない。したがって、２０種のアミノ酸全てを用いるためには、
大きさが少なくとも３つの突然変異（ｒ＝３）であるステップを用いる必要がある。

「エラープローンＰＣＲ」に関して報告されている突然変異率である０．００６７では
、１００個のアミノ酸の短いタンパク質を与える、３００個のヌクレオチドのメッセージ
を用いると：
Ｐ_３＝１．５１×１０^−９
したがって、その突然変異率において、利点がある、次のアミノ酸に到達することが合
理的に予測されるためには：

回の複製の閾値が必要であると予測される。二項展開により、１／３回を超える試験（実
際には約１／ｅ）でも選択的利点を有する所定の配列が含まれないことが示されるので、
これは用いるべき複製ではない。

所定のμについて大きなｎおよび小さなｐに対するポアソン近似を計算することができ
、したがって、ｎが、例えば、１０^９の桁数であり、ｐが、１０^−９の桁数の場合の一般
項を算出することができる。近似の一般項は以下のとおりである：

約６／Ｐを超える増幅係数により、全てのアミノ酸の使用を伴って進化が進行すること
が保証される。これは、新規タンパク質の生成が既存のタンパク質の「シャッフリング」
の使用を妨げる場合に有用である。

精製に対する制限
ＢおよびＣがＡに対して競合する可逆的結合において：

全濃度は以下のように表すことができる：
［Ｂ］_Ｔ＝［Ｂ］＋［ＡＢ］（３）
［Ｃ］_Ｔ＝［Ｃ］＋［ＡＣ］（４）
（３）を（４）で割り算し：

（１）および（２）を［Ｂ］および［Ｃ］に代入し：

方程式を再度整理し、以下の結果が得られる：

分子および分母の［Ａ］を約分し：

最後に方程式を再度整理し、以下の方程式が得られる：

上記係数は「濃縮係数」と呼ばれる。結合した成分の比、またはＣに対するＢの濃縮を
計算するために、全成分の比にこの係数を掛け算する。最大濃縮係数は、［Ａ］がｋ_ｃま
たはｋ_Ｂよりも有意に小さい場合にｋ_ｃ／ｋ_Ｂである。［Ａ］がｋ_ｃまたはｋ_Ｂよりも有
意に大きな場合は、濃縮は１であり、すなわち、他方に対して一方の濃縮は存在しない。

濃縮は結合定数の比によって制限される。その競合相手よりも１００倍強力に結合して
いる乏しいタンパク質を濃縮するためには、３回の濃縮でその競合相手に対するこのタン
パク質の比が百万上昇する。その競合相手よりも２倍強力にしか結合していないタンパク
質を濃縮するためには、１０回の濃縮サイクルでも約１０００の濃縮しか得られない。

まったく同様の方法によって、結合が最小のタンパク質を選択する濃縮係数を示すこと
ができる：
以下の方程式において：

ここでの濃縮は、［Ａ］＞ｋ_Ｃまたはｋ_Ｂで最大である。

以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示し、いかなる様式でも本発明を限定する
ことを意図しない。

実施例１：ＳＡＴＡの生成
当業者は、いくつかの異なる方法でＳＡＴＡを生成することができることを理解するで
あろう。以下の実施例中に記載したプロトコルは、ｔＲＮＡ上にピューロマイシンおよび
架橋剤の両方を有するＳＡＴＡ、またはｔＲＮＡ上にピューロマイシンを有しｍＲＮＡ上
に架橋剤を有するＳＡＴＡに用いることができる。架橋剤がｍＲＮＡ上にあるものは、以
下の実施例４に指針が提供されている。好ましい実施形態において、連結ｔＲＮＡ類似体
もｔＲＮＡ上に架橋剤を有するという意味で、以下のプロトコルは連結ｔＲＮＡ類似体に
ついても有用である。

例えば、好ましい実施形態では、３つのフラグメント（図１）を商業的な供与源（例え
ばＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入
した。修飾された塩基、ならびにその３’末端上に事前付着されたピューロマイシンおよ
びその３’末端上にＰＯ_４を有するフラグメント３が含まれ、これらの全てが市販されて
いた。３つのフラグメントは、モノ付加体の形成においてフラグメント２の操作を容易に
するために用いた。

酵母ｔＲＮＡ^Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅを用いた。しかし、配列は広く知られて
いるｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を形成する配列を選択することによって選択
することができる。フラグメント２に対応する部分中に限定数のＵしか有さない配列を用
いるのが好ましい。ソラレンは優先的に５’ＵＡ３’配列に結合するので、僅かなＵのみ
を有する配列の使用は必須ではない（参照として本明細書に組み込まれているＴｈｏｍｐ
ｓｏｎＪ．Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：１３６３）。しかし、そのような
配列を用いれば、精製により除去される、二重に付加がなされた生成物は減少することで
あろう。

フラグメント２は、ソラレンのインタカレートを誘導するためにヘリカルコンホメーシ
ョンで用いるのが好ましかった。したがって、相補鎖が必要であった。ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを用い、１つの配列、例えば一方または両方の末端にポリＣを添加して、モノ付加体形
成の完了後の分離と除去を容易にした。

フラグメント２およびｃＲＮＡを、緩衝５０ｍＭＮａＣｌ溶液中で結合した。Ｔｍは、
ハイパークロミシティー変化により測定した。２つの分子を再アニールして、選択された
ソラレンと共に、Ｔｍよりも約１０℃低い温度で１時間インキュベートした。ソラレンは
用いた配列に基づいて選択した。より高い配列ストリンジェンシーを有するが補充する必
要があるかもしれない、８ＭＯＰなどの比較的不溶性のソラレンを選択することが可能で
あった。ＡＭＴのような可溶性の高いソラレンは、ストリンジェンシーが低いが、ほとん
どの部位を埋める。ＨＭＴを用いるのが好ましい。非標的のＵをより多く含むフラグメン
ト２を選択した場合は、さらに高いストリンジェンシーが要求される。温度の低下、また
はＭｇ^＋＋を加えることによるイオン強度の上昇も、ストリンジェンシーを高めるために
用いた。好ましい実施形態では、Ｍｇ^＋＋を省略し、約４００ｍＭのＮａＣｌ溶液を用い
た。

インキュベーション後、ソラレンを約４００ｎｍよりも高い波長で照射した。照射は選
択した波長および用いたソラレンに依存する。例えば、ＨＭＴには約４１９ｎｍ、２０〜
１５０Ｊ／ｃｍ^２を用いるのが好ましかった。この処理は、ほぼ全部がフラン側鎖のモノ
付加体をもたらす。

モノ付加体の精製
次いで、参照として本明細書に組み込まれているＳａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈ
ｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９に記載のＨＰＬＣによっ
てモノ付加体を精製した。一般に２５量体以上のモノ付加体の精製は困難なので、フラグ
メント２がフラグメント３から分離されたことで、精製ステップが容易になった（参照と
して本明細書に組み込まれているＳｐｉｅｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ、８９：４５１４〜４
５１８）。

フラグメント２および３のライゲーション
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、フラグメント２を、フラグメント３にライゲーション
した。３’末端のピューロマイシンは保護基として役割を果たした。これは参照として本
明細書に組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋとＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００：５２〜５９（１９８３）により実施する。フラグメ
ント２＋３とフラグメント１の３’末端との結合は、参照として本明細書に組み込まれて
いるＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：２７０５〜２７１２（１９
８５）に記載の方法に従って実施した。フラグメント２＋３をポリヌクレオチドキナーゼ
によって５’リン酸化し、２つの半分子をアニールした。

代替方法では、フラン側鎖のモノ付加体としたＵの相当量を、ポリＵＡをそれ自体にハ
イブリダイズさせて、上記のように照射することにより形成した。次いでポリＵＡを酵素
消化して保護されているフラン側鎖のＵを得て、ヌクレオシドホスホラミダイト法により
ｔＲＮＡ類似体内に組み込んだ。ソラレンモノ付加体を形成する他の方法には、全て参照
として本明細書に組み込まれているＧａｍｐｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７：
３４９（１９８７）、Ｇａｍｐｅｒら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４
０：２９、１９８４、Ｓａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．
Ｂ Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ、８９：４５１４
〜４５１８、米国特許第４，５９９，３０３号に記載の方法が含まれる。

上記の方法によって生成したＳＡＴＡはＵＡＧ（アンチコドンＣＵＡ）を読み取った。
さらに、ＵＡＡまたはＵＧＡも用いた。様々な実施形態では、「連結コドン」として選択
されたストップコドンを有する任意のメッセージを用いた。

実施例２：ソラレン化したフラン側鎖のモノ付加体の生成
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＵＶ光露光
いずれも５０ｍＭのＮａＣｌを含む、等容積の３ｎｇ／ｍｌのＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブ
リッドセグメントおよび１０μｇ／ｍｌのＨＭＴを、新しい１．５ｍｌのキャップ付ポリ
プロピレンマイクロ遠心チューブに移し、３７℃で３０分間、暗所でインキュベートした
。次いで、これを新しい清浄な培養皿に移した。これを、照射量が約６．５ｍＷ／ｃｍ^２
であるように約１２．５ｃｍの距離で光化学反応器（４１９ｎｍのピーク、Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｏ．）内に配置し、６０〜
１２０分間照射した。

低分子量の原産物（Ｐｒｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔ）の除去
１００μｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）をピペットで注ぎ、ボ
ルテックスによって混合した。混合物をマイクロ遠心チューブ中で、５分間、１５０００
×ｇで遠心分離した。クロロホルム−イソアミルアルコール層をマイクロピペットで除去
した。クロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出を再度繰り返した。透明なＲＮＡ
が溶液から沈殿した。

アルコール沈殿
２倍量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを混合物に加えた。チューブを１５分
間、１５，０００×ｇで、マイクロ遠心機で遠心分離した。上清をデカンテーションして
廃棄し、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解し、その後、再度ＲＮＡ
＋８−ＭＯＰに曝した。

ＨＰＬＣを用いたソラレン化したＲＮＡフラグメントの分離
全ての成分、ガラス器具および試薬は、ＲＮａｓｅフリーのように調製した。ＨＰＬＣ
はＤｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰＡ−１００パッケージカラムを用いてセットアップした。ソラ
レン化したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを４℃まで暖めた。ソラレン化したＲＮＡをＨＰ
ＬＣにかけ、次いで「ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析」という表題の以下のセク
ションに記載のように、オリゴヌクレオチド解析を行った。採取された分画は以下を表し
た：
・５’ＣＵＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’、ここで、Ψはプソイドウリジンである（配列
番号１）
・フラン側鎖の５’ＣＵＰsoralenＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号
２）

分画を新しい、ＲＮａｓｅフリーのスナップ付マイクロ遠心チューブ中に４℃で保存し
、４週間を超える保存が必要な場合は−２０℃で保存した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いた、ＨＰＬＣによって採取された
各ピーク分画に示されたＲＮＡフラグメントの同定
電気泳動ユニットを４℃の冷蔵庫内にセットアップした。２ｍｍのスペーサーを有する
ゲルを選択した。各ＨＰＬＣ分画の５μｌをローディング緩衝液で１０μｌまで希釈した
。１０μｌの各希釈した分画を適切に標識した試料ウェルに入れた。追跡用色素を別のレ
ーンに載せ、「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動を行った。電気泳動
の実行が完了したあと、追跡用色素がゲルの端に達した時に電気泳動を停止した。装置を
解体した。ゲル−ガラスパネルユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。ＵＶ光を点けた。
ＲＮＡのバンドを同定した。バンドはＵＶ光の条件下でより濃い影として現れた。

ゲルからのＲＮＡの抽出
各バンドを、無菌、ＲＮａｓｅフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、新しい１．
５ｍｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、
各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌ
の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出させた
。マイクロピペットを用いて溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピ
レンマイクロ遠心チューブに移した。各チューブに新しいＲＮａｓｅフリーのピペットチ
ップを用い、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。

エタノール沈殿
２倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、マイクロ遠心機で、１５，０００×ｇで
１５分間遠心分離した。上清を排出し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣ処理
脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは必要時まで４℃でマイクロ遠心チューブに保存した。保
存が２週間を超える場合、チューブを−２０℃で保存した。以下が、各フラグメントの移
動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：

・フラン側鎖の５’ＣＵＰsoralenＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号
２）

各分画の残りを含むチューブを標識し、−２０℃で保存した。

エタノール沈殿
ＲＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントを沈殿させ、ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除く
ために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅｓの不活化
」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。全ての溶液はＲＮａｓｅフリ
ーのガラス器具中で保存し、ヌクレアーゼの導入を防いだ。無水エタノールは使用時まで
０℃で保存した。マイクロピペットを用いて、２倍容量の氷冷エタノールをマイクロ遠心
チューブ内で沈殿させる核酸に加えた。キャップ付マイクロ遠心チューブをマイクロ遠心
器内に入れ、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したＲＮＡを
再度ＤＥＰＣ処理脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは使用の準備ができるまで、マイクロ遠
心チューブ中に４℃で保存した。

ＲＮＡフラグメント２および３のライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、お
よび溶液中のＲＮａｓｅの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄し
た。１００〜１０００μｌのピペットを用いて以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレン
スナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加え、各溶液に新しい無菌ピペットチップを
用いた：
フラグメント２（３．０ｎＭ） １２５．０μｌ
フラグメント３（３．０ｎＭ） １２５．０μ１
反応緩衝液 ２５０．０μ１
ＲＮＡ Ｔ４リガーゼ（９〜１２Ｕ／ｍｌ） ４２μｌ
反応緩衝液
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水 ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ） ０．７９ｇ
ＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ） ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ） ０．０７８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ） ０．５５ｇ
ＨＣｌを用いてｐＨは７．８
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水で１００．００ｍｌに調整
混合物を穏やかに混合し、混合物を温度制御した冷蔵庫内で、１６℃で１時間インキュ
ベートしてＲＮＡを溶解した。インキュベーション完了後直ちに、ＲＮＡを溶液から沈殿
させた。

アルコール沈殿
２倍容量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠
心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントし
て捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解した。混合物を「ソラレ
ン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表
題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度
の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ） フラグメント２

ｂ） フラグメント３

ｃ） フラグメント２＋３

各分画をＵＶシャドーイングにより分離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出
させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。残留の
ライゲーションしていないフラグメント２および３の分画全てを用いてライゲーション手
順を繰り返した。ライゲーションした画分２および３をプールし、ＲＮａｓｅを含まない
脱イオン水少量中に４℃で保存した。

ＲＮＡフラグメント１とフラグメント２＋３とのライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、お
よび溶液中のＲＮａｓｅの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄し
た。以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブ
に加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
フラグメント２＋３（３．０ｎＭ） １２５．０μｌ
反応緩衝液 ２５０．０μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５〜１０Ｕ／ｍｌ） １．７μｌ
反応緩衝液
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水 ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（４０ｍＭ） ０．６３ｇ
ＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ） ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ） ０．０８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ） ０．００６ｇ
ＨＣｌを用いてｐＨは７．８ ＲＮａｓｅ含まない脱イオン水で１００．００ｍｌに
調整
ＲＮＡを穏やかに混合し、その後、加熱ブロック内で、混合物を７０℃まで５分間加熱
し、融解した。混合物を２時間かけて室温まで冷却し、ＲＮＡをｔＲＮＡの立体配置でア
ニールさせた。ＲＮＡを溶液から沈殿させた。

アルコール沈殿
２倍容量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠
心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントし
て捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解した。混合物を「ソラレ
ン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表
題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度
の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ） フラグメント１

ｂ）フラグメント２＋３

ｂ）フラグメント１＋２＋３

各画分をＵＶシャドーイングにより分離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出
させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。ライゲ
ーションしていないフラグメント１および２＋３分画を用いて、ライゲーション手順を繰
り返した。ライゲーションした分画２＋３をプールし、少量のＲＮａｓｅを含まない脱イ
オン水中に４℃で保存した。

最終ＲＮＡライゲーション
以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに
加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
フラグメント１＋２＋３（３．０ｎＭ） ２５０μｌ 反応緩衝液
２５０μｌ
ＲＮＡ Ｔ４リガーゼ（４４μｇ／ｍｌ） ２２μｇ
混合物を温度制御した冷蔵庫内で、１７℃で４．７時間インキュベートした。インキュ
ベーションの直後、上記ステップ６．２に記載のようにｔＲＮＡを沈殿させ、「ソラレン
化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題
の以下のセクションに記載したように電気泳動によりｔＲＮＡを分離した。ｔＲＮＡを少
量のＲＮａｓｅを含まない水にプールし、２週間までは４℃で、または２週間を超える長
い期間は−２０℃で保存した。

ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
アクリルアミドゲルの調製
全ての試薬およびガラス器具は、「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅの不
活化」という表題の以下のセクションに記載のようにＲＮａｓｅフリーのようにした。ゲ
ル装置を組み立てて厚さが４ｍｍで２０ｃｍ×４２ｃｍの四角いゲルを作製した。ＲＮａ
ｓｅフリーの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で、適量のアクリルアミド溶液を用いて、
２９部のアクリルアミドと１部のアンモニウム架橋剤を室温で混合した。

アクリルアミド溶液
尿素（７Ｍ） ４２０．４２ｇ
ＴＢＥ（１×） １Ｌに調整
５×ＴＢＥ
０．４５５Ｍ トリスＨＣｌ ５３．９ｇ
１０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５Ｍを２０ｍｌ
ＲＮａｓｅフリーの脱イオン水 ９００ｍｌ
ホウ酸を用いて ｐＨ９
ＲＮａｓｅフリーの脱イオン水を用いて １Ｌに調整
混合物を１分間真空圧で脱気した。適量のＴＥＭＥＤを加え、穏やかに混合し、その後
、ゲル混合物をガラスプレートの間に上部から０．５ｃｍ以内まで注いだ。すぐにガラス
シートの間のゲル混合物内に櫛を挿入した。ＲＮａｓｅフリーのゲル用櫛を用いた。櫛で
５ｍｍ幅の色素レーンおよび１３５ｍｍの試料レーン用のウェルを作製した。ゲルを約３
０〜４０分間重合させ、その後、注意しながら櫛を取り外した。新しいピペットチップを
備えたマイクロピペットを用いて試料ウェルを泳動緩衝液ですすいだ。その後、ウェルに
泳動緩衝液を満たした。

試料の調製
試料のアリコートをスナップキャップ付マイクロ遠心チューブ中のローディング緩衝液
に懸濁させ、ボルテックスした。指示色素は試料に加えなかった。

ローディング緩衝液
尿素（７Ｍ） ４２０．４２ｇ
トリスＨＣｌ（５０ｍＭ） ７．８５ｇ
ＲＮａｓｅフリーの蒸留水を用いて １Ｌに調整
電気泳動の実行
最大量のＲＮＡ／ローディング緩衝液溶液を１３５ｍｍの試料ウェルにセットし、適量
の追跡用色素を５ｍｍの追跡用レーンに載せた。試料を５℃の冷蔵庫で電気泳動した。追
跡用色素がゲルの端に達したら電気泳動を停止した。装置を解体した。ガラスパネルはゲ
ルから取り外さなかった。ゲル−ガラスパネルユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。Ｕ
Ｖフィルタリングゴーグルを装着してＵＶ光を点けた。ＲＮＡのバンドを同定した。バン
ドはＵＶ光条件下でより濃い影として現れた。ＲＮＡをゲルから抽出した。各バンドを、
無菌、ＲＮａｓｅフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、各バンドを新しい１．５ｍ
ｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲ
ルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌの０
．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出した。各チ
ューブにＲＮａｓｅフリーの新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて、
溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに
移した。２倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、次いでマイクロ遠心機で、１５，
０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰ
Ｃ処理脱イオン水に再溶解した。ＲＮＡは必要時まで４℃でマイクロ遠心チューブに保存
した。

ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析
ＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて
最も良好に達成される。２’−保護または２’−脱保護の型のいずれもククロマトグラフ
ィーによって分離できる。２’−保護の型は、二次構造効果を最小限に抑える利点を提供
し、ヌクレアーゼに対して耐性を与える。ＲＮＡが完全に脱保護されている場合は、精製
中は無菌条件が必要である。

２’−オルソエステル保護ＲＮＡの脱保護
チューブを１５，０００×ｇで、３０秒間またはＲＮＡペレットが底部に存在するまで
遠心分離する。４００μｌのｐＨ３．８脱保護緩衝液を、ＲＮＡの各チューブに添加する
。

脱保護緩衝液
酢酸（１００ｍＭ）を、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を用いてｐＨ３
．８に調整する。ピペットで吸入と排出とを行って、ペレットを緩衝液中に完全に溶解す
る。チューブを１０秒間ボルテックスし、１５，０００×ｇで遠心分離する。チューブを
、６０℃の水浴で３０分間インキュベートする。試料は、使用前に凍結乾燥する。

ＨＰＬＣカラムの条件
２６０ｎｍで４０吸光度単位（ＯＤＵ）のキャパシティを有するＤｉｏｎｅｘ（８００
）−ＤＩＯＮＥＸ−０（３４６−６３９０）で充填された４×２５０ ｍｍカラム（ＤＮ
ＡＰＡＣ ＰＡ、Ｎｏ．０４３０１０）を設置する。カラム温度は、５４℃にセットする
。注入量を、５μｌが約０．２０ＯＤＵをもたらすように調整する。

溶出緩衝液

ＨＰＬＣの勾配
オリゴ１７〜３２塩基対長に対して、緩衝液Ｂの３０％〜６０％の勾配が用意される：

勾配の選択
勾配は、以下のとおり塩基数に基づき選択される：

ＨＰＬＣの後、目標の試料を採取し、分光光度計を用いて２６０ｎｍでＲＮＡ濃度を決
定する。試料は−７０℃で保存する。

装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅｓの不活化
ガラス器具は、１８０℃で少なくとも８時間ベーキングすることにより処理した。プラ
スチック器具は、クロロホルムですすぐことにより処理した。あるいは、全てのものを０
．１％のＤＥＰＣに浸した。

０．１％のＤＥＰＣを用いた処理
０．１％のＤＥＰＣを調製した。脱イオン水を０．２μＭの膜フィルターで濾過した。
水を１５ｐｓｉで１５分間、液体サイクルでオートクレーブした。１．０ｇ（ｗｔ／ｖ）
のＤＥＰＣ／リットルの無菌濾過水を加えた。

ガラスおよびプラスチック器具
全てのガラスとプラスチック器具を、０．１％ＤＥＰＣに３７℃で２時間浸した。
ガラス器具を少なくとも５回、殺菌した脱イオン水ですすいだ。ガラス器具は、１５分間
１００℃までに加熱するか、または１５ｐｓｉで１５分間、液体サイクルでオートクレー
ブした。

ＲＮＡの電気泳動に用いる電気泳動槽
泳動槽を洗剤で洗浄し、水、次いでエタノールですすぎ、空気乾燥した。泳動槽に３％
（ｖ／ｖ）の過酸化水素（３０ｍｌ／Ｌ）を満たし、１０分間室温で放置した。泳動槽を
ＤＥＰＣ処理水で少なくとも５回すすいだ。

溶液
全ての溶液は、Ｒｎａｓｅを含まないガラス器具、プラスチック器具、オートクレーブ
した水、ＲＮＡを用いる作業のための化学薬品、およびＲＮａｓｅを含まないスパーテル
を用いて作製した。使い捨ての手袋を用いた。可能な場合は、溶液を０．１％のＤＥＰＣ
で少なくとも１２時間、３７℃で処理し、その後、１００℃までに１５分間加熱するか、
または１５分間１５ｐｓｉで、液体サイクルでオートクレーブした。

ＲＮＡの翻訳
２０μｌ／ｍｌの濃度の腸阻害ペプチド（ＧＩＰ）ｍＲＮＡ、２μｌを、２５０μｌの
スナップキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れた。３５μｌのウサギ網状
赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を加えた。メチオニンを含まないアミノ酸
混合物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を１μｌ加えた。^３５Ｓ メチオニンまたは非標
識のメチオニンを１μｌ加えた。^３２Ｐ ＧＩＰｍＲＮＡまたは非標識のＧＩＰｍＲＮＡ
を２μｌ加えた。任意選択で、対照として役割を果たすために２μｌのルシフェラーゼを
一部のチューブに加えてもよい。好ましい実施形態では、ＧＩＰｍＲＮＡの代わりにルシ
フェラーゼを用いた。当業者は、実際に適切な配列を含む任意のｍＲＮＡフラグメントを
用い得ることを理解するであろう。

ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用い
たＳＡＴＡの量は、約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであっ
た。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて
全容量を５０μｌとした。

約１５０アミノ酸を超えるタンパク質では、ｔＲＮＡの量を補充する必要があり得る。
例えば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般にＳＡＴＡの量は、ストッ
プコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分に多量であるべきである。
天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で動的なプルーフリーディングを受けないＳＡＴ
Ａとの競合に勝つために十分多くなければならない。

各チューブは、すぐにキャップを締め、パラフィルム処理し、翻訳反応のために３０℃
で９０分間インキュベートした。各反応チューブの内容物を毛管作用によって５０μｌの
石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ
．、５７：１００７（１９９３）、参照として本明細書に組み込まれている）の記載に従
って、各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ^２、約３５０ｎｍの波長の光を照射して、
ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合した。光架橋結合の後、各チューブの内容物を新しいスナ
ップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを各チューブ
に加えてカルシウム陽イオンをキレートして、リボソームを解離させた。各ステップの間
で、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌して各チューブを穏やかに混合した。

最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけ
るためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。

上記のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を行った。参照として本明細書に組
み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを実施した。

上記実施例は、ＳＡＴＡ（例えばｔＲＮＡ上のピューロマイシン＋ｔＲＮＡ上の架橋剤
）の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（例えばピューロマイシンを有さない
がｔＲＮＡ上に架橋剤を有する）の生成および使用を教示している。

別の実施例では、ウリジンをプソイドウリジンで置き換えた以外は上記方法と同様の方
法によってＳＡＴＡを生成した。プソイドウリジンによる置換は、架橋剤モノ付加体形成
（例えばソラレンモノ付加体の形成）の形成を容易にするので、連結ｔＲＮＡ類似体にも
用いることができる。この技術は以下の実施例２で説明する。

実施例３：プソイドウリジンを用いたＳＡＴＡの生成
上記のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサ
ーｔＲＮＡを、多くの異なる方法により生成することができることを理解するであろう。
図５はウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す。プソイドウリジンは、ウリジ
ンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重結合を欠くｔＲ
ＮＡにおいて見出される天然の塩基である。本明細書中で用いるプソイドウリジンには、
天然に存在する塩基および任意の合成類似体または修飾体が含まれる。好ましい実施形態
では、プソイドウリジンを用いてＳＡＴＡを生成した。連結ｔＲＮＡ類似体もプソイドウ
リジンを用いて生成することができる。具体的には、好ましい実施形態では、３つのフラ
グメント（図１）を商業的な供与源（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．
、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入した。それぞれの３’末端にピューロマイシンおよび
ＰＯ_４を事前に結合させた、修飾された塩基およびフラグメント３（「フラグメント３」
）が含まれ、これらは全て市販されている。３つのフラグメントは、モノ付加体の形成に
おいてフラグメント２（「フラグメント２」）の操作を容易にするために用いた。いくつ
かの実施形態によれば、３つのフラグメントの配列は以下のとおりである（各フラグメン
トにつき２つの配列例を提供する）：
フラグメント１

フラグメント２

フラグメント３

フラグメント３に挙げた上記配列はＳＡＴＡに適用可能である。連結ｔＲＮＡ類似体で
は、ピューロマイシンがアデノシンで置き換えられる以外は配列は類似している。

修飾された酵母ｔＲＮＡ^Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅを本発明の１つの実施形態に
従って用いた。しかし当業者は、配列は既知のｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を
形成する配列を選択することにより、広く選択することができることを理解するであろう
。いくつかの実施形態においてプソイドウリジンを用いる利点の１つは、フラグメント２
中にプソイドウリジンがあることで、対象外のＵのソラレン標識化が回避されることであ
る。ウリジンの代わりにプソイドウリジンを用いることにより、ｔＲＮＡ類似体に対する
リボソームのＡ部位の結合力が減少するが、末端ウリジンとソラレンとの相互作用が排除
される。Ｙａｒｕｓの「延長アンチコドン」の指針を用いることによりＡ部位の結合が増
加する（参照として本明細書に組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：
６４６〜６５２、１９８２）。

１つの実施形態では、ソラレンのインタカレートを誘導するために、フラグメント２を
ヘリカルコンホメーションで用いる。当業者は、本発明のいくつかの実施形態に従って他
のコンホメーションも用いることができることを理解するであろう。相補鎖も用いた。Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを用い、Ｃがソラレンの一方または両方の末端に対して相互作用する場
合には、ポリＧまたはポリＣなどの配列を付加して、モノ付加体形成の完成後の分離と除
去を容易にした。相補体中でウリジンの代わりにプソイドウリジンを用いることにより、
生成物の架橋結合を気にせずに約３６５ｎｍのような高効率の波長を用いることが可能と
なった。照射は約３００〜４５０ｎｍの範囲が好ましく、約３２０〜４００ｎｍの範囲が
より好ましく、約３６５ｎｍが最も好ましい。さらに、Ｍａｆが架橋結合形成の主な第１
のステップであるので、プソイドウリジンを使用することによりフラン側鎖のモノ付加体
がフラグメント２上の適所に配置された。

プソイドウリジンを有する以下のｃＲＮＡ配列を本発明の好ましい実施形態に従って用
いた。当業者は、これらの配列および本明細書中に記載の他の配列の置換体ならびに修飾
体も、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解するであろう
。例えば以下に記載の配列番号１９では、配列は以下のものであることもできる。

ステップ１：フラグメント２へのソラレンのフラン側鎖のモノ付加体
フラグメント２の標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成を以下
のように行った。

反応緩衝液を以下のように調製した：
トリスＨＣＬ ２５ｍＭ
ＮａＣｌ １００ｍＭ
ＥＤＴＡ ０．３２ｍＭ
ｐＨ ７．０
次いで、４’ −ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）
を最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量のフラグメント２およびｃＲＮＡをフラグメ
ント２：ｃＲＮＡ：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加えた。１００μｌの
全容量を一度に照射した。

相補的オリゴ、ＨＭＴ、ソラレンの混合物を以下のように処理した：
１） ＰＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで
１５分間かけて冷却した。

２） エッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で、上部をパラフィルム
で覆い、ＵＶランプ（１ｍＷ／ｃｍ^２多波長ＵＶランプ（λ＞３００ｎｍ）（ＵＶ Ｌ２
１モデル λ ３６５ｎｍ）の上に置いて４℃で２０分間照射した。

ＨＭＴを再度インタカレートし、照射するために、上記ステップ１および２を４回繰り
返した。２回目の照射後、さらに１０μｌの１．６ｍＭ ＨＭＴを、合計１００μｌの反
応容積に加えた。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、全てのオ
リゴ（標識したものおよび未標識のもの）をエタノールで一夜沈殿させた（沈殿ステップ
を参照）。少量のアリコートをゲルの同定用に保存した。

ステップ２：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートしたフラグメント２（２ＭＡ）オ
リゴの精製
１） 反応混合物を急速真空乾燥機（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ）で１０分間乾燥させ
、その後、２μｌの０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶解した。

０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液
酢酸 ５．６ｍｌ
トリエチルアミン １３．８６ｍｌ
Ｈ_２Ｏ（ＲＮａｓｅフリーの） ９５０ｍｌ
酢酸を用いてｐＨを７．０に調整し、水を加えて１Ｌにする
２） 試料を、緩衝液Ａ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中５％ｗｔ／ｗｔのアセト
ニトリル）で事前に平衡化したＷａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８、２．５μｍ
、４．５×５０ｍｍの逆相カラムに載せた。試料を、緩衝液Ａに対して０〜５５％の緩衝
液Ｂ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中１５％ｗｔ／ｗｔのアセトニトリル）の勾配で
、３５分間の時間フレームをかけて、１ｍｌ／分の流速で溶出した。カラム温度は６０℃
であり、狭帯域フィルターによって設定した検出波長は３４０ｎｍであった。フラン側鎖
のソラレンモノ付加体は３４０ｎｍで吸収するが、ＲＮＡおよび任意のピロン側鎖のモノ
付加体は吸収しない。緩衝溶液は使用前に濾過し脱気した。

２ＭＡは約２５〜２８分で、緩衝液Ｂの濃度４０％により溶出された。採取した分画の
その後のゲル電気泳動分析に基づくと、ソラレン化していないフラグメント２は８分間よ
り前に溶出された。

カラムを１００％アセトニトリルで５分間洗浄し、緩衝液Ａで１５分間、再度平衡化し
た。全ての分画をspeed vacuum（急速真空乾燥機）で一夜乾燥させた。

２ＭＡを含む分画は、２６０ｎｍ（ＲＮＡ）および３３０ｎｍ（フラン側鎖のソラレン
モノ付加体としたＲＮＡ）での吸光レベルによって同定した。これは、乾燥した分画を再
度１２０μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かし、分光光度計を用いて２６０ｎｍお
よび３３０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。両方の波長で吸光度の高い分画
をプールし、次いでspeed vacuum（急速真空乾燥機）で乾燥させた。各分画からの少量の
アリコートをゲル分析用に保存した。

架橋結合した生成物を変性２０％ＴＢＥ−尿素ゲルで分析し、ゲルの銀染色によって可
視化した。

ステップ３：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートした、ｃＲＮＡからのフラグメン
ト２オリゴの精製
乾燥した試料をプールし、その後、０．５×ＴＥ緩衝液に溶かした。吸光度約０．４の
試料を、緩衝液Ｃ（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で事前に平衡化したＤｉｏ
ｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）カラムに載せた。カラム温度は
８５℃であった（陰イオン交換ＨＰＬＣ）。

オリゴを１ｍｌ／分の流速で、４％〜５５％の緩衝液Ｄの凹型（ｃｏｎｃａｖｅ）勾配
で１５分間、次いで次の１５分間は５５％〜８０％の緩衝液Ｄの凸型（ｃｏｎｖｅｘ）勾
配で溶出させた。オリゴを１００％の緩衝液Ｄで５分間および１００％の緩衝液Ｃでさら
に５分間、１．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。２６０ｎｍの光を吸収する分画を採取した
。２ＭＡの保持時間（ＲＴ）は１６．２分であり、５７％の緩衝液Ｄによって溶出され、
遊離フラグメント２のＲＴは１６．６分未満であり、５５％の緩衝液Ｄによって溶出され
、遊離ｃＲＮＡのＲＴは１９．２分を超えていた。２５４ｎｍまたは２６０ｎｍで光吸収
を示す分画を採取した。採取した分画をspeed vacuum（急速真空乾燥機）で一夜乾燥させ
た。全ての溶液は使用前に濾過し脱気した。

用いた溶液は以下を含んでいた：
Ｃ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、
Ｄ：２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０の緩衝液中２５０ｍＭのＮａＣｌＯ_４、
ＴＥ：１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
ステップ４：精製した２ＭＡオリゴの脱塩、沈殿および採取
乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解した。０．５Ｍの（
ＮＨ_４）_２ＣＯ_３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物を短時間ボル
テックスした。その後、混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０
℃で一夜保存した。

その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレ
ットの位置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを
乱さないように注意した。ペレットがまだ塩を含んでいた場合は、このステップを繰り返
した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。
湿ったペレットをspeed vacuum（急速真空乾燥機）で１５分間乾燥させた。尿素ＰＡＧＥ
ゲルにより、次のステップ用の適切な分画を同定した。

ステップ５：２ＭＡオリゴのフラグメント３オリゴへのライゲーション
以下のステップを実施した。

Ａ．以下の試薬および器具を用いた：
ヌクレアーゼを含まない水（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）４０％（水中のｗｔ／ｗｔ）
ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）
フェノール：クロロホルム
無菌１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ
１００％エタノール
７０％エタノール
ドライアイスまたは−２０℃の冷凍庫
室温および＋４℃のマイクロ遠心機
ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴
Ｂ．以下の反応条件を用いた：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、
１０ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＡＴＰ
１８〜２０％のＰＥＧ
Ｃ．以下の反応混合物を無菌マイクロ遠心チューブ内で構築した：
フラグメント３（ドナー）１μｌ（６μｇ）（必要な場合は、ドナーとして用いる前に
精製した）
２ＭＡ（アクセプター）１μｌ（１．５μｇ）。

８μｌのＲｎａｓｅを含まないｄＨ_２Ｏを８μｌ加えたあと、オリゴ二次構造を緩める
ために反応物を８５℃で１分間インキュベートし、その後、ＰＣＲ装置のサーモサイクラ
ーを用いて４℃までゆっくりと冷やした。事前に加熱したチューブを氷上に置いて冷たい
状態に保ち、短時間遠心分離し、その後、以下のものを加えた：
１０×リガーゼ緩衝液 ４μｌ
１０ｍＭのＡＴＰ ４μｌ
Ｒｎａｓｅ ＯｕｔまたはＲｎａｓｉｎ(４０単位/μl)Ｐｒｏｍｅｇａ ０．５μｌ
ＰＥＧ、４０％（Ｓｉｇｍａ） ２０μｌ
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（１０単位／μｌ）（ＮＥＢ） １μｌ
ヌクレアーゼを含まない水を加えて全容積を４０μｌとした。混合物を１６℃で一夜（
１６時間）インキュベートした。混合物を短時間遠心分離し、次いで氷上に置いた。

Ｄ．オリゴヌクレオチドの沈殿：
６０μｌのＤＥＰＣ ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を混合物に加え、次いで１５０μｌ
のフェノール／クロロホルムを加えた。混合物を３０秒間激しくボルテックスした。その
後、マイクロ遠心分離機で、室温で５分間、最大速度で遠心分離して沈殿物を除去した。
水相を新しいマイクロ遠心チューブに移した（＞９５μｌ）。

これに、３μｌの５ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン、および５００μｌの事前に冷やした０
．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３を含む１００％エタノールを加え、混合物を短時間ボルテッ
クスし、次いで６０分間ドライアイス上で凍結した。この時点で、これを一夜−２０℃で
保存してもよい。乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解し、
０．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物
を短時間ボルテックスした。その後、これを６０分間ドライアイス上で凍結させるか、ま
たは−２０℃で一夜保存した。その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で
１５分間遠心分離し、上清をピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した
。ペレットがまだ塩を含んでいた場合は、このステップを１回繰り返した。その後、ペレ
ットを７０％の事前に冷やしたエタノールで数回洗浄した。次いで、これをマイクロ遠心
機で、４℃で５分間、最大速度で遠心分離した。ピペットを用いてエタノールを慎重に取
り除いた。遠心分離を再度繰り返して、残留するタノールを集め、これを慎重に取り除い
た。湿ったペレットをspeed vacuum（急速真空乾燥機）で１０分間乾燥した。少量のアリ
コートをゲル分析用に採取した。長期間の保存には、ＲＮＡをエタノール中に−２０℃で
保存した。ＲＮＡをＤＥＰＣ水中で保存しないように注意した。

ステップ６：ライゲーションしたフラグメント３オリゴ複合体の精製
乾燥した試料を０．５×ＴＥ緩衝液に再溶解し、緩衝液Ｃで平衡化したＤＮＡＰａｃ
ＰＡ−１００カラムに載せた。カラム温度は８５℃であり、検出器をＲＮＡを有する分画
の同定には２５４ｎｍで作動させ、２ＭａＦを有する分画の同定には３４０ｎｍで作動さ
せた。オリゴは、最初の２０分間は３０％〜７０％の緩衝液Ｄの凸型勾配で、０．８ｍｌ
／分の流速で溶出させ、次いでさらに２０分間、７０％の〜９８％のＤの直線勾配で、同
じ流速で溶出させた。溶出は、１００％のＤで７分間および１００％のＣでさらに１０分
間、１．０ｍｌ／分の流速で洗浄することによって完了した。分画は２５４または２６０
ｎｍの波長の光を用いて検出した。ライゲーションしたオリゴ（２ＭＡ−フラグメント３
）は３４分より後に、９０％を超える緩衝液Ｂで溶出された。２５４ｎｍでの吸光度（Ａ
２５４ｎｍ＞０．０１）を有する分画を採取し、speed vacuum（急速真空乾燥機）で一夜
乾燥させた。

ステップ７：精製した２ＭＡ−フラグメント３の脱塩および沈殿
乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解し、５００μｌの０
．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３を含む１００％冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテ
ックスした。次いで混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０℃で
一夜保存した。

試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位
置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さない
ように注意した。まだ塩を含んでいる場合は、このステップを繰り返した。その後、ペレ
ットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。湿ったペレットをsp
eed vacuum（急速真空乾燥機）で１５分間乾燥させた。

フラグメント１を２ＭＡ−フラグメント−３オリゴにライゲーションさせてＳＡＴＡリ
ンカーを完成させる次のステップで用いる、ライゲーションした２ＭＡ−フラグメント−
３を同定するために、尿素ＰＡＧＥを実施した。

ステップ８：ＳＡＴＡ（または他のｔＲＮＡ分子）の調製
Ａ．ＲＮＡオリゴの５’リン酸化
１．試薬および器具：
・ヌクレアーゼを含まない水（カタログ番号Ｐ１１９３、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（カタログ番号Ｎ２５１１、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）
・フェノール：クロロホルム
・無菌マイクロ遠心チューブ
・１００％のエタノール
・７０％のエタノール
・室温および４℃のマイクロ遠心機
・ＰＣＲサーマルサイクラーまたは水浴
２．以下の反応混合物を無菌マイクロ遠心チューブ内で構築する：
成分 ： 容積
・アクセプターＲＮＡ ＜２００ｎｇ
・Ｔ４リガーゼ１０×反応緩衝液^＊ ４μｌ
・ＲＮａｓｉｎ(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位/μｌ） ２０単位
・Ｔ４キナーゼ（９〜１２単位／μｌ） ２μｌ
・１０ｍＭ ＡＴＰ ４μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水で最終容量に ４０μｌ
ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴中で、３７℃で３０分間インキュベートする。非放
射性のリン酸化には、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液、１ｍＭのＡＴＰお
よび１０〜２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む、３０〜４０μｌの反応液中
、３００ｐｍｏｌまでの５’末端を用いる。３７℃で３０分間インキュベートする。１×
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液は１ｍＭのＡＴＰを含み、非放射性のリン酸化において置
き換えることができる。（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは、この緩衝液中で１００％の
活性を示す）。最適な活性には新しい緩衝液が必要である（古い緩衝液では、酸化による
ＤＴＴの減少が活性を低下させる）。

Ｂ．フラグメント１および２ＭＡ−フラグメント３オリゴ複合体のアニーリング：
１．試薬および器具：
・ＰＣＲサーモサイクラー装置または水浴
・１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含まないアルブミン
・１００ｍＭのＭｇＣｌ２
２．以下の反応混合物を無菌マイクロ遠心チューブ内で構築する：
・アクセプターＲＮＡオリゴ（１Ｅ） ＜２００ｎｇ
・ドナーＲＮＡオリゴ（３Ｇ−２Ｇのライゲーションしたオリゴ） ＜２００ｎｇ
・（ステップＡからの５’リン酸化されたオリゴ）
適切な比は以下のとおりで、フラグメント１の自己ライゲーションを回避するために、
アクセプターオリゴ：ドナーオリゴ（フラグメント１：２ＭＡ−フラグメント３）のモル
比が１：１．１であるべきである。ＭｇＣｌ_２を、Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＡＴ
Ｐ）に、最終濃度２０ｍＭまで添加した。Ｒｎａｓｅを含まないアルブミンを最終的に５
μｇ／ｍｌになるように添加する。最終容量は、１００μｌ以下とすべきである。溶液を
５分間７０℃まで加熱し、次いで２時間にわたって７０℃から２６℃まで冷やし、４０分
にわたって２６から０℃まで冷却した。ＰＣＲ器具を用いて、１６℃で１６〜１７時間イ
ンキュベートする。

Ｃ．アニールしたオリゴのライゲーション
・アニールしたオリゴ ＜１５μｌ
・１０ｍＭ ＡＴＰ ２μｌ
・４０％ＰＥＧ １８μｌ
・Ｔ４リガーゼ １０×緩衝液 ２μｌ
・ＲＮａｓｉｎ(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤(４０単位/μｌ) ０．５μｌ
・Ｔ４リガーゼ（９〜１２単位／μｌ）（ＮＥＢ） １μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水で 最終容量４０μｌ
Ｄ．ｔＲＮＡフラグメントの沈殿
ライゲーションの後、５０μｌのＤＥＰＣ水および１５０μｌのフェノール：クロロホ
ルムを加え、３０秒間激しくボルテックスした。その後、これをマイクロ遠心機で、室温
で最大速度で５分間遠心分離した。水相を新しいマイクロ遠心チューブ（約１００μｌ）
に移した。これに、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのイガイグリコーゲン、１０μｌの３Ｍの酢
酸ナトリウム、ｐＨ５．２を加えた。これをよく混合した。次いで２２０μｌの９５％の
エタノールを加え、短時間ボルテックスした。その後、混合物を３０分間ドライアイス上
で凍結させた。この時点で、混合物を一夜−２０℃で保存してもよいし、または先に進ん
でもよい。１つの実施形態では、ＲＮＡは好ましくはＤＥＰＣ水中に保存すべきでなく、
エタノール中に−２０℃で保存すべきである。

その後試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレッ
トの位置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱
さないように注意した。次いでペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２
回で洗浄した。エタノールを除去した後、湿ったペレットをspeed vacuum（急速真空乾燥
機）で１５分間乾燥させた。乾燥したペレットは、次のステップまで−２０℃で保存した
。

ＲＮＡの翻訳
ＳＡＴＡのアンチコドンによって認識されるコドンに対応するストップコドン（この場
合はＵＡＧ）を有するように修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡを、１μｌの濃度１μｇ
／μｌを推奨する標準のＰｒｏｍｅｇａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳キットで用いた。当業者
は、実際、適切な配列を含む任意のｍＲＮＡフラグメントを用い得ることを理解するであ
ろう。

ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用い
たＳＡＴＡの量は、約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであっ
た。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて
全容量を５０μｌとした。

約１５０アミノ酸を超えるタンパク質では、ｔＲＮＡの量を補充する必要があり得る。
例えば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般に、ＳＡＴＡの量は、スト
ップコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分に多量であるべきである
。天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で活発なプルーフリーディングを受けないＳＡ
ＴＡとの競合に勝つために十分に多量でなければならない。

各チューブは、直ちにキャップを締め、パラフィルムで覆い、翻訳反応のために３０℃
で９０分間インキュベートした。各反応チューブの内容物を毛管作用によって５０μｌの
石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ
．、５７：１００７（１９９３）、参照として本明細書に組み込まれている）に従って、
各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ^２、約３５０ｎｍの波長の光を照射することによ
り、ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合させた。光架橋結合の後、各チューブの内容物を新し
いスナップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを各チ
ューブに加えることによってカルシウム陽イオンをキレートして、リボソームを解離させ
た。各ステップの間に、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌することによって各チ
ューブを穏やかに混合した。

最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけ
るためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。

上記のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を実施した。参照として本明細書に
組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒ
ｅｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを実施した。

上記実施例は、ＳＡＴＡ（ｔＲＮＡ上のピューロマイシンおよびｔＲＮＡ上の架橋剤）
の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（ピューロマイシンを有さず、ｔＲＮＡ
上に架橋剤を有する）の生成および使用のために有用である。

実施例４：架橋剤を形成するよう修飾したリボヌクレオチドを用いたｔＲＮＡ類似体の
生成：ソラレンおよび非ソラレン架橋剤の使用
上記のように、いくつかの実施形態では、所望しないモノ付加体および架橋結合の形成
を最小限にするために、プソイドウリジンを用いることができる。１つの実施形態では、
架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドを形成して用いる。架橋剤で修飾されたモノヌクレ
オチドの１つの利点は、これが望ましくないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限に
することである。

上記のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサ
ー類似体を多くの異なる方法によって生成することができることを理解するであろう。好
ましい実施形態では、ソラレン化したウリジン５’モノヌクレオチド、２−チオシトシン
、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５
−ブロモウリジンもしくは２−クロロアデノシンを生成または購入し、オリゴヌクレオチ
ドに酵素的にライゲーションして、ｔＲＮＡ類似体内に組み込むことができる。アリール
アジドおよびアリールアジドの類似体、ならびにその任意の修飾体も、いくつかの実施形
態において連結部分または作用物質として用いることができる。以下のプロトコルをｔＲ
ＮＡ上に位置する架橋剤に用いることができる。当業者は、このプロトコルはｍＲＮＡ上
に位置する架橋剤にも用いることができることを理解するであろう。したがって、以下の
実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体、およびナンセンスサプレッサー類似体の生成
ならびに使用に関して有用である。

修飾されたヌクレオチドの生成
長さが８０塩基対までのカスタムヌクレオチドにすでに組み込まれている、ピューロマ
イシンを有するかまたは有さない４−チオＵ、５−ヨードおよび５−ブロモＵを購入でき
る（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）。したがって、ＳＡＴＡ、およびこれらの架橋剤が既
に適所に存在する連結ｔＲＮＡ類似体、ならびに類似の架橋剤を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，
Ｉｎｃから直接購入できる。ナンセンスサプレッサー類似体もＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎ
ｃから購入できる。

２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−
ヨードウリジン、５−ブロモウリジンまたは２−クロロアデノシンは、ＲＮＡ内に組み込
むためのＡｍｂｉｏｎＭＯＤＩｓｃｒｉｐｔキットで使用するために、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉ
ｎｃ．から架橋用に全て購入できる。したがって、これらの架橋剤および類似の架橋剤を
有するＳＡＴＡおよび連結ｔＲＮＡ類似体を、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃから直接購入できる
。

ＰＯ_４Ｕ_ソラレンは以下のように生成することができる：

（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）

（南カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）のサービスから入手可能）。

標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成は、以下のように実施す
る：
反応緩衝液を調製する。ｐＨ７．０を有する反応緩衝液は、２５ｍＭ トリスＨＣＬ、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．３２ｍＭ ＥＤＴＡを含む。

その後、４’−ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）を
最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量の配列Ａ１および配列Ａ２を配列Ａ１：配列Ａ
２：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加える。１００μｌの全容量を一度に
照射した。

相補的オリゴ、ＨＭＴ、トリメチルソラレンの混合物を以下のように処理する：１）Ｐ
ＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで１５分間か
けて冷却する、ならびに２）冷却ファンおよび４１９ｎｍの波長を備えたＲＰＲ−２００
Ｒａｙｏｎｅｔ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒｅａｃｔｏｒ内で、上部をパラフィルムで覆った
エッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で２０〜６０分間４℃で照射する
。これを、氷水浴上または−２０℃の冷凍庫内のどちらかに置く。

ＨＭＴを再インタカレートおよび照射するために上記ステップ１および２を４回繰り返
す。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、全てのオリゴ（標識し
たものおよび未標識のもの）をエタノールで一夜沈殿する（沈殿ステップを参照）。少量
のアリコートをゲルの同定用に保存する。

非ソラレン架橋剤のＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃのキットを用いて同等の配列を生成すること
ができる。

ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ消化
以下のステップを実施する：（１）speed vacuum（急速真空乾燥機）内でオリゴを乾燥
する、（２）ペレットを１０μＬの１×ハイブリッド混合物に再懸濁する、（３）６８℃
で１０分間加熱する、（４）ゆっくりと３０℃まで冷却する。パルススピンダウン（Ｐｕ
ｌｓｅ ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ）する、（５）１０μＬの２×ＲＮａｓｅ Ｈ緩衝液を加え
る。混合する。（６）３０℃で６０分間インキュベートする、（７）１３０μＬの停止混
合液を加える。

フェノール／クロロホルム抽出には、（１）１倍容量のフェノール／クロロホルムを加
える、（２）よくボルテックスする、（３）室温のマイクロ遠心機で２分間遠心沈殿する
、（４）上層を新しいチューブに取り出す。

クロロホルム抽出には：（１）１倍容量のクロロホルムを加える、（２）よくボルテッ
クスする、（３）室温のマイクロ遠心機で２分間遠心沈殿する、（４）上層を新しいチュ
ーブに取り出す。

次いで、（１）３７５μＬの１００％エタノールを加える、（２）−８０℃で凍結する
、（３）室温のマイクロ遠心機で１０分間遠心沈殿する、（４）ペレットを７０％エタノ
ールで洗浄する、（５）１０μＬのローディング色素に再懸濁する、（６）載せる直前に
１００℃で３分間加熱する。

より長いｃＤＮＡおよびより長いＲＮＡフラグメントからのモノリボヌクレオチドヌク
レオチドの精製は、陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて行う。次いでソラレンモノ付加体とし
たモノヌクレオチド（ＰＯ_４Ｕ_{ｐｓｏｒａｌｅｎ}）を、逆相ＨＰＬＣによってモノ付加体
化されなかったモノヌクレオチド（ＰＯ_４ＵおよびＰＯ_４Ａ）から分離する。

以下に記載する類似の消化技法およびヌクレオチドの組み込みも、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎ
ｃのキットを用いた非ソラレン架橋剤に用いることができる。

ｔＲＮＡ成分オリゴリボヌクレオチド内への光感受性ヌクレオチドの組み込み
ｐＵ_crosslinkerをＣＵＡストップアンチコドン内に組み込むために以下のプロトコル
を用いることができる。しかし当業者は、本明細書中に記載の方法に従って、他のストッ
プアンチコドンおよび疑似ストップアンチコドンを生成するために他のヌクレオチドも用
いることができることを理解するであろう。

一般に、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ用のプロトコルからから適用させた方法を用いるが、修
飾されたヌクレオチドの３’ＯＨの保護が欠けているためにいくつかの変更を伴っている
。

５’ＯＨ ＣＵＣ ＯＨ３’オリゴリボヌクレオチド（配列Ｂ１）はＤｈａｒｍａｃｏ
ｎ，Ｉｎｃ．から購入することができ、ライゲーションにおいてアクセプターとすること
ができる。Ｂ１対ソラレン化したモノヌクレオチドのモル比は、修飾されたＵの数が大き
く下回るように１０：１〜５０：１を保つのが好ましく、それによりＣＵＣ（Ｕ_crosslin
ker）_Ｎの形成を妨げる。これにより、好ましい反応の１つが行われる：

１つの実施形態では、ソラレン化したＵおよびより長いソラレン化した７量体を確実に
分離するために、連続した陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣによって生成物を精製する。
その後、ｐＡｐとライゲーションすることによって７量体を３’保護してＣＵＣＵ_crossl
inkerＡｐ（フラグメント２Ｂ）を得る。

陰イオン交換ＨＰＬＣＦまたは次のライゲーションを用いて、これを再び精製する。

フラグメント２Ｂと１Ｂもしくは１Ｂ _１ との第１のライゲーション
この２Ｂフラグメントは、安定したアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体または、天然
のエステル化されたアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体において用いることができる。
１つの実施形態では、天然のＡＡ−ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然の３’末端をアミノ
アシル化できることを保証するために、その類似体のバージョンにおいてアクセプター基
部を修飾する。ＳＡＴＡのバージョンでは、１つの実施形態では、３’フラグメントは市
販の調製されたピューロマイシンをアクセプターとして保守する。したがって、１つの実
施形態では、異なる２つの５’末端において以下を用いる：

（安定したピューロマイシンアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体と共に用いる）および

（天然のエステル化されたアクセプターと共に用いる）。

Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて再度ライゲーションを行い、長さによって精製する。配
列１Ｂの場合の反応式は以下のとおりである：

配列１Ｂ_１の場合：

ｔＲＮＡ類似体の２つの半分子のライゲーション
３’リン酸を除去して５’リン酸を付加するために、上記生成物を、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて２つの個別のステップで処理する。

その後、新しく調製した５’および３’の半分子末端を、一般に以前のプロトコルに従
ってライゲーションする。それぞれの５’配列に対応する３’配列は以下のとおりである
：
配列１Ｂ：（Ψ＝プソイドウリジン）

３’の半分に対応：

３Ｂおよび配列１Ｂ１、

３’の半分に対応：

後者は、大腸菌のアラニンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識可能で
ある。

上記の実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ、およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを
作製および使用するために用いることができる。

実施例５：ＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡに対するｍＲＮＡ上への架
橋剤の配置
いくつかの実施形態では、架橋剤（ソラレンまたは非ソラレン架橋剤など）はｔＲＮＡ
上に配置されず、ｍＲＮＡ上に位置する。例えば、１つの実施形態では、ＳＡＴＡはｔＲ
ＮＡ上に位置するピューロマイシンを含むが、架橋剤はｍＲＮＡ上にある。さらに別の実
施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを用い、これはピューロマイシンを有さな
いｔＲＮＡを含み、架橋剤はｍＲＮＡ上にある。架橋剤のメッセージ（ｍＲＮＡ）上への
配置は、以下に示すように達成することができる。関連する配列は以下のとおりである：

利便性だけを考えると、１つの実施形態では、多数の^３５Ｓ標識のためのメチオニンコ
ドンを有する、コザック配列およびシャインダルガノ配列をどちらも有するメッセージを
用いる。

４−チオウリジン、５−ブロモウリジンおよび５−ヨードウリジンに関しては、完全に
作製されたメッセージをＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから購入できる。アリールアジドに
関しては、参照として本明細書に組み込まれているＤｅｍｅｓｈｋｉｎａ，Ｎら、ＲＮＡ
、６：１７２７〜１７３６、２０００に記載の方法を用いることができる。

２−チオシトシン、２−チオウリジン、５−ヨードシトシン、または２−クロロアデノ
シンに関しては、修飾された塩基を５’モノリン酸ヌクレオチドとしてＡｍｂｉｏｎ，Ｉ
ｎｃ．から購入できる。ソラレンを架橋剤として用いる場合は、修飾された５’モノリン
酸ヌクレオチドは上記のように作製する。

精製を容易にするために、修飾された５’モノリン酸ヌクレオチドをまず六量体内に組
み込む。架橋剤を含むウリジンの構築を示すが、いくつかの実施形態では、類似の技法を
用いて他の塩基をストップコドンおよび疑似ストップコドンのどちらにも組み込むことが
できる：

は、ｐＮ_{ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ}の３’保護が存在しないことによるＡＵＧの優位点を用
いたこと以外は上記のプロトコルと同様のプロトコルを用いて達成した。陰イオン交換Ｈ
ＰＬＣにより、生成物を過剰のＡＵＧから精製した。次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用い
て５’ｐＡＧビオチン３’を付加した。３’ビオチンは、単にＤｈａｒｍａｃｏｎから入
手可能な便利な３’ブロッキング基であった。得られたＡＵＧＵ_{ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ}
ＡＧ_{ｂｉｏｔｉｎ}を再度精製し、次いで５’リン酸化し：

にライゲーションして、

を得た。

収率は精製が不要となるほどに十分に高い。したがって、上記のプロトコルを用いて、
本発明のいくつかの実施形態に従ってＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを
作製および使用することができる。

実施例６：ピューロマイシンを必要としないｔＲＮＡ系の使用
本発明のいくつかの実施形態は、ピューロマイシン、ピューロマイシン類似体、または
他のアミドリンカーを必要としない系および方法を提供する。１つの実施形態では、連結
ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはピューロマイシンを必要とせず
、以下の例に従って作製および使用することができる。

ピューロマイシンを用いない系では、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための翻訳系を用
いることができる。他の実施形態では、化学的にアミノアシル化を達成できる。当業者は
、どのようにｔＲＮＡを化学的にアミノアシル化するかを理解するであろう。翻訳系を用
いる場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｓｉｔｕなどのアミノアシ
ル化する任意の種類の翻訳系を用いることができる。１つの実施形態では、大腸菌翻訳系
を用いる。大腸菌翻訳系は、ａａＲＳ^Ａｌａによって認識されるように修飾したｔＲＮＡ
を用いる系で使用する。１つの実施形態では、これは安定したアクセプター（例えばピュ
ーロマイシン）を含まない系に好ましい。

以下のｍＲＮＡの各３μｇを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｓ３０ 大腸菌翻訳混合物の各４０マ
イクロリットル中で翻訳する：

上記のように製作したアンバーサプレッサーｔＲＮＡの３μｇを、第１配列に加える。
アンチコドン上に架橋剤を有するサプレッサーの３μｇを、第２配列に加える。３５Ｓ−
メチオニンを両方に加えた後、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。その後、
反応液を氷浴に入れることにより迅速に冷却し、平らなペトリ皿に移し、混合物が約３５
０ｎｍ光源から１．５ｃｍだけ下方にあるように氷浴中に浮かべる。これらを約２０Ｊ／
ｃｍで１５分間露光させる。

照射後、混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿する。このようにして、連結ｔＲ
ＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡなどの系をアミノアシル化し、本発明
のいくつかの実施形態に従ってメッセージ（ｍＲＮＡ）をそのコードされたペプチドに結
合させるために用いる。

実施例７：代替配列
好ましい実施形態では、上記の実施例１に記載したフラグメント１、２および３は、以
下の代替配列を有する：
フラグメント１（配列番号１３）：

フラグメント２（配列番号１４）：

フラグメント３−先に記載した配列（配列番号６）から変化なし：

上記の方法を用いると、代替フラグメント１＋２＋３の配列は（配列番号１５）であっ
た：

ｔＲＮＡ類似体とナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの連結に関して、アデノシンがピュ
ーロマイシンの置換に用いられていることを除いて、上記の配列は類似している。

本発明の多くの好ましい実施形態およびその変形を詳述したが、当業者には他の改変お
よび使用方法が容易に明らかであろう。上記の全ての実施形態において、方法のステップ
を逐次的に行う必要はない。したがって、本発明の精神または特許請求の範囲から逸脱せ
ずに様々な応用、改変および置換を行い得ることを理解するであろう。

Claims (8)

1. 二官能性タンパク質を含有する組成物であって、
   前記二官能性タンパク質は、
   病変細胞の表面において発現されている、マーカーと選択的または優先的に結合する、
   第一の非抗体タンパク質部分、
   その際、該第一の非抗体タンパク質部分は、ｍＲＮＡ−タンパク質の同族対(cognate p
   air)のライブラリーを、前記病変細胞の表面において発現されている、マーカーに対して
   、スクリーニングすることで、特定された、第一のｍＲＮＡによりコードされており、各
   ｍＲＮＡ−タンパク質の同族対は、タンパク質を該タンパク質をコードするｍＲＮＡに連
   結させる安定なアミノアシルｔＲＮＡ類似体（ＳＡＴＡ）を含み；
   抗体の定常領域の部分と結合する、補体以外の非抗体の第二の部分；ならびに
   前記第一の非抗体タンパク質部分と、前記非抗体の第二の部分とを連結するリンカーと
   を含む
   ことを特徴とする、組成物。
2. 前記第二の部分は、抗体の定常領域の部分と結合し、
   前記マーカーを発現している、前記病変細胞に対する免疫応答を誘起する
   ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記病変細胞は、癌性細胞である
   ことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
4. 前記癌性細胞は、固形腫瘍の細胞を含む
   ことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 前記表面マーカーは、前記対象において変異している、癌性Ｂ細胞に特異的なエピトー
   プである
   ことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
6. 前記病変細胞は、血液癌に由来する
   ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
7. 前記第一の非抗体タンパク質部分、前記リンカー、および、前記非抗体の第二の部分が
   、一体となり、融合タンパク質を形成する
   ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
8. 前記リンカーが可動性ペプチドである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物
   。

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