JP2021061846A - 高アンモニア血症に関連する疾患を治療するために操作された細菌 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子操作細菌、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障害をモジュレートおよび治療する方法を提供する。【解決手段】アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結しており、前記細菌が、機能性アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）を欠くように遺伝子操作されており、消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、遺伝子操作細菌である。【選択図】図１−１

Description

本出願は、２０１５年１２月４日に出願した米国特許出願第１４／９６０，３３３号の
一部継続出願、２０１６年３月２に出願したＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０
５３０号の一部継続出願であり、開示の継続性を可能にするために参照によってそれらの
全体として本明細書に組み込まれる、２０１５年６月１０日に出願した米国特許仮出願第
６２／１７３，７１０号、２０１５年６月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／１７
３，７０６号、２０１５年６月２４日に出願した米国特許仮出願第６２／１８３，９３５
号、２０１５年６月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／１８４，８１１号、２０１
５年６月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／１８４，７７０号、２０１５年１０月
３０日に出願した米国特許仮出願第６２／２４８，８０５号、２０１５年１１月１６日に
出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４１号、２０１５年１１月１６日に出願した
米国特許仮出願第６２／２５６，０３９号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許
仮出願第６２／２５６，０４８号、２０１５年１２月４日に出願した米国特許仮出願第６
２／２６３，３２９号、２０１６年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２９１，
４６８号および２０１６年２月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／２９３，７４９
号の利益を主張するものである。

アンモニアは、非常に有毒であり、すべての臓器において代謝時に発生する（Ｗａｌｋ
ｅｒ、２０１２年）。哺乳動物では、健常な肝臓は、アンモニアを非毒性分子、例えば、
尿素またはグルタミンに変換し、過剰な量のアンモニアが全身循環に入ることを妨げるこ
とによって身体を保護する。高アンモニア血症は、アンモニアの解毒作用の低下および／
または産生の増加を特徴とする。哺乳動物では、尿素回路がアンモニアを尿素に酵素によ
って変換し、次いで尿素が尿中に除去されることによってアンモニアを解毒する。アンモ
ニアの解毒作用の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイル
リン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠
損症およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの、尿素回路酵素が欠損してい
る尿素回路異常症（ＵＣＤ）により引き起こされる可能性がある（Ｈａｂｅｒｌｅら、２
０１２年）。国立尿素回路異常症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｒｅａ Ｃｙｃｌｅ Ｄｉ
ｓｏｒｄｅｒｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、ＵＣＤの罹患率が出生８，５００人当たり
１人であると推定している。さらに、肝性脳症、門脈体静脈短絡および有機酸代謝異常症
などの、いくつかの非ＵＣＤ障害も高アンモニア血症を引き起こし得る。高アンモニア血
症は、神経症状、例えば、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力障害、急
性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、低体温症または死亡をもたらし得
る（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１２年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。

アンモニアは、様々な生合成経路により合成される、アミノ酸の窒素源でもある。例え
ば、アルギニン生合成は、１個の窒素原子を含むグルタミン酸を、４個の窒素原子を含む
アルギニンに変換する。シトルリンなどの、アルギニン生合成経路において形成される中
間代謝物も窒素を組み込む。したがって、高アンモニア血症に関連する状態をモジュレー
トまたは治療するためにアルギニン生合成の増強を用いて、体内の過剰な窒素を非毒性分
子に組み込むことができる。同様に、ヒスチジン生合成、メチオニン生合成、リシン生合
成、アスパラギン生合成、グルタミン生合成およびトリプトファン生合成も過剰の窒素を
組み込むことができ、それらの経路の増強を用いて、高アンモニア血症に関連する状態を
モジュレートまたは治療することができる。

高アンモニア血症およびＵＣＤの現行の療法は、アンモニアの過剰を低減することを目
的としているが、最適とはいえないと広く考えられている（Ｎａｇａｍａｎｉら、２０１
２年）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０１３年；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａら、２０１４年）。
大部分のＵＣＤ患者は、タンパク質制限からなる実質的に改善された食事を必要とする。
しかし、低タンパク食は、注意深くモニターしなければならず、タンパク質摂取が過度に
制限される場合、身体は筋肉を分解し、その結果としてアンモニアを産生する。さらに、
多くの患者は、フェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムおよびフェニル酪酸グリセ
ロールなどのアンモニア捕捉薬の補給を必要とし、これらの薬物のうちの１つまたは複数
を１日３〜４回投与しなければならない（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年；Ｄｉａｚら、２
０１３年）。これらの薬物の副作用は、悪心、嘔吐、被刺激性、食欲不振および女性にお
ける月経障害を含む（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年）。小児では、食物および薬物の送達
には、胃に外科的に植え込まれた医瘻管または鼻を経て胃に手作業により挿入された経鼻
胃管を必要とし得る。これらの治療選択肢が奏功しない場合、肝臓移植が必要となり得る
（国立尿素回路異常症財団）。したがって、尿素回路異常症を含む、高アンモニア血症に
関連する障害の有効で、信頼でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない
必要性がある。

肝臓は、アミノ酸代謝ならびにタンパク質合成および分解に、ならびにいくつかの解毒
過程、特に、アンモニアのような腸代謝の最終産物の解毒過程に中心的な役割を果たして
いる。高アンモニア血症をもたらす、肝機能障害は、肝機能障害を有する患者に認められ
る多種多様な潜在的に可逆性の精神神経異常（無関係の神経および／または代謝異常の除
外の後）を含む、肝性脳症（ＨＥ）を引き起こし得る。ＨＥにおいて、重度の肝不全（例
えば、肝硬変）および／または肝臓の周囲の血液の門脈体静脈短絡が、アンモニアの動脈
レベルの上昇をもたらして、血液脳関門を通過させ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００６年）、
脳機能の変化をもたらす。

脳内のアンモニアの蓄積は、認知および運動障害、脳潅流の減少、ならびにアンモニア
を代謝することができる脳細胞である、星状細胞の酸化ストレス媒介損傷をもたらす。脳
内の過剰なアンモニアが、主要な抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）
のレベルを変化させることによって神経伝達を乱すことを示唆する証拠が存在する（Ａｈ
ｂｏｕｃｈａおよびＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、２００４）。脳マンガン濃度の上昇および
マンガンの沈着も肝硬変患者の大脳基底核において報告され、ＨＥの臨床症状に寄与する
と推測されている（Ｃａｓｈら、２０１０年；Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２
年）。高アンモニア血症の一般的な神経症状は、発作、運動失調、脳卒中様病変、パーキ
ンソン病様症状（振戦など）、昏睡、精神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐
、呼吸性アルカローシス、低体温症または死亡を含む（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１２年；
Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。

アンモニア代謝異常だけでＨＥを有する患者に認められるすべての神経学的変化を説明
し得ない。敗血症は、ＨＥの周知の増悪因子である。全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）
は、炎症性サイトカインおよびメディエーターの放出および循環に起因する。肝硬変を有
する患者では、ＳＩＲＳは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン６（ＩＬ６
）によって媒介され得る過程における軽微および顕性ＨＥを有する患者の両方におけるＨ
Ｅの症状を悪化させる可能性がある。特に、活性窒素種（ＲＮＳ）および活性酸素種（Ｒ
ＯＳ）の産生の増大が、アンモニア、炎症サイトカイン、低ナトリウム血またはベンゾジ
アゼピンに曝露されている培養星状細胞において起こる。

高アンモニア血症は、脳内の核内／細胞質凝集体および細胞死を特徴とする常染色体優
性疾患である、ハンチントン病の顕著な特徴でもある（Ｃｈｅｎら、２０１５年；Ｃｈｉ
ａｎｇら、２００７年）。実際、高アンモニア血症は、本明細書に記載の通り、すべてが
アンモニアレベルを低下させることによって治療することができる、いくつかの他の障害
の特徴である。

肝性脳症、ハンチントン病ならびに過剰なアンモニアレベルに関連する他の疾患および
障害に対する現行の療法は、不十分である（Ｃａｓｈら、２０１０年；Ｃｏｒｄｏｂａお
よびＭｉｎｇｕｅｚ、２００８年；ＳｈａｎｎｏｎおよびＦｒａｉｎｔ、２０１５）。ハ
ンチントン病において、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール、リスペリドン、クエチア
ピン）および不随意運動を抑制するために投与される薬物（例えば、テトラベナジン、ア
マンタジン、レベチラセタム、クロナゼパム）の副作用は、患者における筋硬直および認
知低下を悪化させ得る（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）。ウレアーゼ産生細菌に対する抗体は
、とりわけ長期にわたり投与した場合、腎毒性などの、高度な二次的影響を及ぼすことが
示された（Ｂｌａｎｃら、１９９２年； ＢｅｒｋおよびＣｈａｌｍｅｒｓ、１９７０年
）。タンパク質制限は、タンパク質の分解および不良な栄養状態を促し得るものであり、
死亡率の増大に関連付けられた（ＫｏｎｄｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９７年；Ｖａ
ｑｅｒｏら、２００３年）ことから、これももはや中心的な療法でない。タンパク質制限
は、ＨＥを有する肝硬変患者の３分の１に対してのみ適切である（ＮｇｕｙｅｎおよびＭ
ｏｒｇａｎ、２０１４年）。したがって、肝性脳症およびハンチントン病の有効で、信頼
でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない必要性がある。

Ｗａｌｋｅｒ、Ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎａｅｍｉａ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｎｏｔ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０１２年５月；４９（Ｐｔ３）：２１４〜２８頁 Ｈａｂｅｒｌｅら、Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ、２０１２年５月２９日、７巻：３２頁 Ｈａｂｅｒｌｅ Ｊ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、２０１３年８月１５日；５３６巻（２号）：１０１〜８頁 Ｎａｇａｍａｎｉら、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ、２０１２年９月；１０７巻（１〜２号）：１０〜４頁 Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ、Ｈａｎｄｂ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２０１３年；１１３巻：１７５５〜７３頁 Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａら、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ： ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１４年１０月２３日；２２巻（１号）：５８〜６４頁 Ｌｅｏｎａｒｄ（２００６年）、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｉｎｂｏｒｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第４版（２６３〜２７２頁）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｉａｚら、Ａｍｍｏｎｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１３年６月；５７巻（６号）：２１７１〜９頁 Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００６年 ＡｈｂｏｕｃｈａおよびＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｍ、２００４年 Ｃａｓｈら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、ＱＪＭ、．２０１０年１月；１０３巻（１号）：９〜１６頁 Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年 Ｃｈｅｎ、２０１５年 Ｃｈｉａｎｇら、Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２００７年３月１日；１６巻（５号）：４８３〜４９８頁 ＣｏｒｄｏｂａおよびＭｉｎｇｕｅｚ、Ｈｅｐａｔｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．、２００８年；２８巻（１号）：７０〜８０頁 ＳｈａｎｎｏｎおよびＦｒａｉｎｔ、２０１５年 Ｂｌａｎｃら、Ｌａｃｔｉｔｏｌ ｏｒ ｌａｃｔｕｌｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９２年２月；１５巻（２号）：２２２〜２２８頁 ＢｅｒｋおよびＣｈａｌｍｅｒｓ、Ｄｅａｆｎｅｓｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９７０年９月；７３巻（３号）：３９３〜３９６頁 ＫｏｎｄｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９７年 Ｖａｑｅｒｏら、２００３年 ＮｇｕｙｅｎおよびＭｏｒｇａｎ、２０１４年

本開示は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物
に変換することができる遺伝子操作細菌を提供する。特定の実施形態では、遺伝子操作細
菌は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物に変換
する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、非病原性であり、有毒なアンモニアを減
少させるために消化管に導入することができる。高アンモニア血症患者において７０％も
の過剰なアンモニアが胃腸管に蓄積する。本発明の他の態様は、アンモニアおよび／また
は窒素の消費、あるいは非毒性副産物、例えば、アルギニンまたはシトルリンの産生のレ
ベルの増加に基づいて遺伝子操作細菌を選択または標的にする方法を提供する。本発明は
また、遺伝子操作細菌を含む医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障害、例
えば、尿素回路異常症および肝性脳症をモジュレートおよび治療する方法を提供する。

本開示はまた、過剰なアンモニアおよび他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡ、マンガン
を減少させることができる遺伝子操作細菌を提供する。特定の実施形態では、遺伝子操作
細菌は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物に変
換する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、非病原性であり、有毒なアンモニアを
減少させるために消化管に導入することができる。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌
は、過剰なアンモニアおよび他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡ、マンガンを減少させる
ことができ、１つまたは複数の消化管バリア増強分子、例えば、酪酸などの、１つまたは
複数の短鎖脂肪酸を産生することもできる。本開示の他の態様は、アンモニアおよび／ま
たは窒素の消費、あるいは非毒性副産物、例えば、アルギニンまたはシトルリンの産生の
レベルの増加に基づいて遺伝子操作細菌を選択または標的にする方法を提供する。本発明
はまた、遺伝子操作細菌を含む医薬組成物、ならびに例えば、肝性脳症およびハンチント
ン病を含む、過剰なアンモニアに関連する障害をモジュレートおよび治療する方法を提供
する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の作用機構を媒介する、
１つまたは複数の天然または非天然構成要素を含む、１つまたは複数の遺伝子または遺伝
子カセットまたは回路を含む。さらに、細菌染色体内の１つまたは複数の内因性遺伝子ま
たは調節領域は、突然変異または欠失させることができる。遺伝子操作細菌は、これらの
遺伝子または遺伝子カセットまたは回路をプラスミド上に収容するか、あるいは、遺伝子
／遺伝子カセットは、それらが本質的な遺伝子発現を妨げない、染色体の特定の領域に挿
入された。

これらの遺伝子（複数可）／遺伝子カセット（複数可）は、構成的または誘導性プロモ
ーターの制御下にあってもよい。本明細書に記載の例示的誘導性プロモーターは、酸素レ
ベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または
肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）に誘導されるプロモーター、炎症または炎症
反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）ならびに消化管内に
自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例え
ば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。

さらに、操作細菌は、（１）当技術分野で公知であり、本明細書で示す栄養要求性のい
ずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの、１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明
細書に記載の、あるいは当技術分野で公知のキルスイッチのいずれかなどの、１つまたは
複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に
記載の、あるいは当技術分野で公知の輸送体のいずれかのような、生体分子または物質を
移入する１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知
の分泌回路のいずかなどの、１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのようなさらな
る回路のうちの１つまたは複数の組合せうちの１つまたは複数をさらに含み得る。

図１Ａは、非誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）は、ＡｒｇＡ（くねった線ξ）と相互作用してＡｒｇＡ活性を阻害し（「Ｘ」印で示す）、一方、酸素（Ｏ_２）は、ＦＮＲ（点線の囲み線付きのＦＮＲ）が二量体化し、ＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）およびその制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）ため好気的条件下で比較的に低いアルギニンの産生を示す。図１Ｂは、誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。ＦＮＲが二量体化し（点線の囲み線付きの２つのＦＮＲ）、アルギニンによる阻害に抵抗性である、ＡｒｇＡ^ｆｂｒ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ上のくねった線ξ）のＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）媒介発現を誘導するため嫌気的条件下でのアルギニンの産生の上方制御を示す。これは、ＡｒｇＡ（ａｒｇＡを示す四角の上のくねった線ξ）と相互作用するアルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）により引き起こされる野生型ＡｒｇＡの阻害を克服する（曲がった矢印）。アルギニンレギュロンにおける各遺伝子を遺伝子の名称を含む長方形によって示す。長方形の１つまたは集合に隣接する各矢印は、そのような遺伝子（複数可）の矢印の方向の転写を駆動することに関与するプロモーターを示す。１つまたは一連の長方形に隣接するより太い直線は、この細菌においてＡｒｇＲが欠失しているので利用されないＡｒｇＲ結合部位を示す。各長方形の上の矢印は、各遺伝子の発現産物を示す。 図２Ａは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。好気的条件下での実施形態を示し、酸素の存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、単量体として留まり、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動するＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化することができない。野生型ＡｒｇＡタンパク質は、機能性であるが、アルギニンに結合することにより負のフィーバック抑制を受けやすく、それによりアルギニンレベルを正常以下に維持する。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線；黒色の「Ｘ」印）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させた。図２Ｂは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。嫌気的条件下での図２Ａと同様の実施形態を示し、酸素の非存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、二量体化し、ＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化する。これは、アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）によるフィーバック抑制に抵抗性である、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動する（黒色のくねった線（ξ）＝ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現産物）。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させ（黒色の「Ｘ」印）、ひいてはアルギニン−ＡｒｇＲ複合体による阻害を妨げた。これにより、アルギニンの高レベルの産生が可能となる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、遺伝子Ｘの発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲとＸとの間の黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、遺伝子Ｘの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、遺伝子Ｘの発現（黒色のくねった線（ξ））が可能になる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲ楕円に結合した黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、ＧＦＰの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、ＧＦＰの発現が可能になる。この構築物を含む宿主を突然変異させることによって、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）を用いてＧＦＰの発現に基づいて高アルギニン産生体を選択することができる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサーの発現（示さず）を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（ＡｒｇＲ−Ａｒｇ複合体により結合された黒色の線）を含む構築物は、宿主の生存に必要な栄養要求性タンパク質（「ＡＵＣ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。高アルギニン濃度下では、ＡｒｇＲ−アルギニン複合体がＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＡＵＸの発現が可能となり、宿主が生存することが可能になる。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲがｔｅｔＲ遺伝子から発現し、ＡＵＸの発現を阻害し、ひいては宿主を殺滅する。図５における構築物は、ＡＵＸ発現のその制御により宿主細胞の生存のためにそれを必要にすることによって高アルギニン（「Ａｒｇ」）産生を増強する。 強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。 強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の他の概略図である。他の調節エレメントも存在し得る。 弱いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。 図９Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示し、制限部位は太字で示す。図９Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢプロモーター）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。他の調節エレメントも存在し得る。 図１０Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。制限部位を太字で示したＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示す。図１０Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳプロモーター）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。 大腸菌ニッスル（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）における構成的に発現したａｒｇＧ構築物の例示的実施形態を示す図である。構成的プロモーターは、灰色の囲み線付きのＢＢａ＿Ｊ２３１００である。クローニングに用いる制限部位は太字である。 大腸菌ニッスルの野生型ａｒｇＧオペロンおよびその構成的に発現する突然変異体のマップを示す図である。四角囲みのＡＲＧは、野生型オペロンに存在するが、突然変異体には存在しない。ＡｒｇＧは、ＢＢａ＿Ｊ２３１００プロモーターの制御下で構成的に発現する。 例示的ＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ構築物の概略図である。この実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子がａｒａＣ遺伝子とａｒａＤ遺伝子との間に挿入されている。ＡｒｇＡ^ｆｂｒに、リボソーム結合部位、ＦＲＴ部位および１つまたは複数の転写終結配列が隣接している。 ａｒｇＲ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。 ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。 ＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。 ａｒｇＧを除くアルギニン生合成オペロンのすべてにおけるＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。 大腸菌１９１７ニッスル染色体内の例示的組込み部位のマップを示す図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨げることなく、回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を用いて、挿入が発散的または収束的に発現する遺伝子間に起こることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内の挿入は、栄養要求性を作るのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、個々の回路成分を複数の示された部位に挿入する。ｍａｌＥ／Ｋ部位を丸で囲む。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒをｍａｌＥＫ遺伝子座に挿入する。 赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現する３つの細菌菌株を示す図である。菌株１〜３において、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入され、蛍光灯下で様々な程度の輝度をもたらす。非改変大腸菌ニッスル（菌株４）は、非蛍光性である。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０２を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたΔＡｒｇＲ、ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡおよびクロラムフェニコール耐性を含む。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０６、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０９を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０８およびＳＹＮ−ＵＣＤ３１０を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。 誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１は、ΔＡｒｇＲを含み、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲおよび高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。 誘導条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０５により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンおよびシトルリンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧ、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、構成的に発現したａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーター）、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。 酸素の存在（＋Ｏ_２）または非存在（−Ｏ_２）下で、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照ニッスル構築物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。 ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ１０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１は、野生型ＡｒｇＲおよび野生型ＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡＦｂｒを含まず、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む。 ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がΔＡｒｇＲ、それぞれ高コピープラスミドまたは低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、Ａｍｐ耐性および野生型ＴｈｙＡを含む。 図２８Ａは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。非改変対照ニッスルまたはＡｒｇリプレッサー遺伝子が欠失し、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子が高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子操作菌株であるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与した高アンモニア血症マウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。合計９６匹のマウスを試験した。エラーバーは、標準誤差を表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与したマウスにおける血中アンモニア（ＢＡ）レベルは、４日目および５日目において非改変対照ニッスルを投与したマウスにおけるアンモニアレベルより低い（ニッスル、ＢＡ＝２２０ｍＭ；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＢＡ＝１０５ｍＭ；ＢＡ_{Ｎｉｓｓｌｅ}−ＢＡ_{ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２}＝１１５ｍＭ；平均血液容積＝１．５ｍＬ）。図２８Ｂは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）および媒体のみの対照と比較して、ＴＡＡマウスモデルにおけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０４のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（アンモニア消費）を示す棒グラフを示す。図２８Ｃは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ＴＡＡ処理後２４〜４８時間目の血中アンモニア濃度の変化の百分率の棒グラフを示す。 高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。５６匹のｓｐｆ^ａｓｈマウスを４群に分けた。群１に通常の飼料を与え、群２〜４に初期の採血の後に７０％タンパク質飼料を与えた。各群にストレプトマイシン耐性ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）またはＳＹＮ−ＵＣＤ２０４を水とともに１日２回強制経口投与し、最初の強制経口投与の４時間後に血液を採取した。ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、血中アンモニアを高アンモニア血症閾値を下回るレベルに有意に低下させた。 高タンパク食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。マウスにＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含む）または水を投与し、次いで、２日後に高タンパク食に切り替えた。図３０に見られるように、高タンパク食への切り替えの４８時間後にアンモニアレベルがＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の両方において同様の程度に低下し、ＴｈｙＡ栄養要求性が有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。 図３１Ａは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。０、３０、６０および１２０分目に測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。図３１Ｂは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（これらの３つすべてが組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ΔＡｒｇＲおよびｗｔＴｈｙＡを含み、ＳＹＮ３０３は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む）のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。結果から、ＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組込みが、同じ構築物を発現する低コピープラスミド菌株で認められたのと同様のレベルのアルギニン産生をもたらすことがわかる。 図３２Ａは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスのアンモニアレベルおよび生存曲線の棒グラフである。ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）はＴｈｙＡ欠失を有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１）は有さない２つの菌株を比較した。通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。高タンパク食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレベルは、Ｈ_２Ｏ高タンパク食対照群と比較してＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３群において低下した。アンモニアレベルの観測された低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方において同様であり、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。図３２Ｂは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスの生存曲線を示す図であり、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３が対照と比較して生存期間の延長を示したことを表す。 通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおける血中アンモニアレベルのグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９および１×１０^１０細胞の用量を１２日間にわたり毎日投与した。血中アンモニアレベルを５日目に測定した。１×１０^８および１×１０^９の両用量は、このモデルにおける血中アンモニアレベルの有意な低下をもたらすのに十分であった。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。 ニッスルのｉｎ ｖｉｖｏでの滞在を示すグラフである。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。 図３５Ａは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性ニッスル）の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｂは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡｆｂｒを含まないＳＹＮ−ＵＣＤ１０６の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｃは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含むＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。 図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、生存細菌細胞およびアルギニン産生の棒グラフである。細胞を７０％イソプロパノールまたは対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とともに振盪しながら１時間インキュベートした。処理後、細胞を、０．５％グルコースおよび３ｍＭチミジンを添加したＭ９培地中で特定の比率で混合し、振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。図３６Ａおよび３６Ｂに見られるように、培養中のイソプロパノール処理細胞と非処理細胞とのより大きい比率は、平板培養により決定されるより少ないＣＦＵｓおよびより低いレベルのアルギニンの産生をもたらす。存在する細菌の量に対するアルギニンの産生は、種々の培養にわたり一定のままであった（図３６Ｃ）。これらの結果から、生存細菌のみがアルギニンの産生に寄与していることがわかる。 非ヒト霊長類毒性試験において採取した糞便試料中の定量された細菌の数を示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７（カナマイシン耐性ニッスル）およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む）の投与により得られた薬物動態および薬力学を５０日にわたり比較した。結果から、これらの投与条件下では、糞便中に対照カナマイシン耐性ニッスルと同様の量の細菌が栄養要求体ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について回収されたことがわかる。同様の結果がマウスにおいて観測された。 肝性脳症および高アンモニア血症を特徴とする他の障害を治療するための例示的合成遺伝子回路を示す図である。アンモニア変換回路において、アンモニアが細菌（例えば、大腸菌ニッスル）によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための４つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。第３の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。第４の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、４つの回路すべてがそれぞれ同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、４つの回路が異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧＡＢＡのレベルを低下させるための追加の回路、例えば、ＧＡＢＡを代謝する（異化する）ための回路をさらに含み得る。 図４１Ａは、合成遺伝子回路を含む遺伝子操作細菌への取込みの後のＧＡＢＡの異化を示す図である。細胞への侵入により、ＧＡＢＡがＧＡＢＡ α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ（ＧＳＳＴ）によりスクシニルセミアルデヒドに変換される。次にコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）が、ＧＡＢＡ異化における第２および唯一の他の特定のステップである、スクシニルセミアルデヒドのコハク酸への酸化を触媒する。最終的に、コハク酸がクエン酸（ＴＣＡ）回路の基質になる。ＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）は、アルファ−ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換する。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＧＯＴのうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されないＧＡＢＡ消費回路を含む。図４１Ｂは、大腸菌ニッスルにおけるＧＡＢＡ利用経路の概略図である。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。本明細書に記載の酪酸カセットのうちの１つまたは複数は、アルギニン（および／またはシトルリン）産生回路を含む遺伝子操作細菌により発現させることができる。 複数の作用機構（ＭｏＡｓ）を含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。 複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が４つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４６Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が３つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４６Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が３つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４７Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路およびマンガン輸送回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４７Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が２つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４８Ａは、酪酸の産生のための代謝経路を示す。図４８Ｂおよび図４８Ｃは、両方がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、２種の酪酸産生回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３およびＳＹＮ−ＵＣＤ５０４に見いだされる）の概略図を示す。図４８Ｄは、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の第３の酪酸遺伝子カセット（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５に見いだされる）の概略図を示す。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセットを含む。「ｂｄｃ２カセット」または「ｂｄｃ２酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子がｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｒカセット」または「ｔｅｒ酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｓＢ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子が存在し、ｔｅｓＢ遺伝子がｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢカセット」または「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢ酪酸カセット」は、少なくともｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する。本開示の代替酪酸カセットは、少なくともｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｔｅｓまたはｔｅｓＢカセットは、テトラサイクリン以外の誘導性プロモーターの制御下にある。ｔｅｓＢカセットの発現を制御し得る例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ， ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。 本開示の例示的な操作細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図４９Ａおよび４９Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図４９Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図４９Ｃおよび４９Ｄに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および酸化窒素（ＮＯ）の存在下でのその抑制解除を示す。図４９Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節領域に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図４９ＥおよびＦに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ_２Ｏ_２の存在下でのその誘導を示す。図４９Ｅにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｆにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ_２Ｏ_２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。 本開示の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図５０Ａおよび５０Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図５０Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図５０Ｃおよび５０Ｄに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯの存在下でのその抑制解除を示す。図５０Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図５０Ｅおよび５０Ｆに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ_２Ｏ_２の存在下でのその誘導を示す。図５０Ｅにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｆにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ_２Ｏ_２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。 図４８に示した回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０５）を用いた酪酸産生のグラフである。細胞を０．２％グルコースを含むＭ９最少培地中で増殖させ、初期対数期にＡＴＣにより誘導した。図５１Ａに見られるように、好気性対嫌気的条件下で各構築物について同様の量の酪酸が産生された。ｔｅｒ菌株は、全般的により多くの酪酸を産生する。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、ｐＬｏｇｉｃ０３１（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセット）を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット）を含む。図５１ＢにＳＹＮ−ＵＣＤ５０４（ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット））ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ５０５（プラスミドｐＬＯＧＩＣ０４６−デルタｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋、ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子の欠失およびｔｅｓＢ遺伝子によるそれらの置換を含む酪酸構築物を含むＡＴＣ誘導性ｔｅｒを含むニッスル株）の酪酸の産生を示す。ｔｅｓＢ構築物は、より大きい酪酸の産生をもたらす。 ｎｕｏＢ遺伝子の欠失を含む異なる酪酸産生回路を用いた酪酸の産生のグラフである。示した菌株は、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０３と同じである）およびＳＹＮ−ＵＣＤ５１１（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１１は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０４と同じである）である。ＮｕｏＢ遺伝子の欠失は、酪酸産生菌株における野生型親対照と比較してより大きいレベルの酪酸産生をもたらす。ＮｕｏＢは、呼吸成長時のＮＡＤＨの酸化に関与する主要なタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨ酸化と電子伝達との共役を妨げることにより、酪酸の産生を維持するために用いられるＮＡＤＨの量が増加する。 図５３Ａは、ＦＮＲプロモーターの制御下の酪酸産生回路の概略図である。図５３Ｂは、酪酸産生の嫌気性誘導の棒グラフである。ＦＮＲ応答性プロモーターをｂｃｄまたはｔｅｒ回路を含む酪酸カセットに融合させた。形質転換細胞をＬＢにおいて初期対数期まで増殖させ、嫌気性チャンバー内に４時間入れて、酪酸遺伝子の発現を誘導した。細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含む最少培地に再懸濁し、微好気的にインキュベートして、酪酸の産生を経時的にモニターした。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、嫌気的条件下で有意な酪酸産生をもたらした。図５３Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコースおよび酸素の存在下および非存在下でのＳＹＮ−ＵＣＤ５０１についての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５００は、ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０６は、ｐＳＣ１０１ ｎｉｒＢ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含む。図５３Ｄは、ＨＥのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける糞便試料を用いてＥＬＩＳＡにより定量したマウスリポカリン２およびカルプロテクチンのレベルを示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、対照ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３と比較して炎症を低減し、かつ／または消化管バリア機能を保護する。 （１）酪酸産生菌株、（２）アルギニン産生菌株（アンモニア消費菌株）ならびに（３）酪酸を産生し、アンモニアも消費する菌株についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニン（図５４Ａ）および酪酸（図５４Ｂ）産生を示す棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まないアルギニン産生／アンモニア消費菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０１（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生およびアルギニン産生／アンモニア消費菌株）。データから、ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＹＮ−ＵＣＤ３０５と同様のレベルのアルギニンを、またＳＹＮ−ＵＣＤ５０１と同様のレベルの酪酸を産生することができることがわかる。 本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５５Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５５ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。 例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。 図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、例示的な操作された細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５７Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５７ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。図５７Ｃに例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す。 本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５８Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、ｔｅｓＢ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５８ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。 例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。 図６０Ａおよび６０Ｂは、正のフィードバック栄養要求体を作製し、高アルギニン産生のために選択するために用いることができる例示的構築物を示す図である。図６０ＡにｔｈｙＡの発現を駆動するａｓｔＣプロモーターのマップを示す。図６０ＢにａｓｔＣプロモーターの制御下のｔｈｙＡ遺伝子の概略図を示す。調節領域は、ＣＲＰ、ＡｒｇＲおよびＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の結合部位を含み、追加の調節エレメントも含み得る。 アンモニアをシトルリンまたはアルギニンなどの所望の産物への変換により、尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするための操作細菌菌株の他の例示的実施形態を示す図である。該菌株は、ａｒｇＲが欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするように操作された合成生物も図６５に記載するキルスイッチ実施形態を有する。この例では、ＩｎｔリコンビナーゼおよびＫｉｄ−Ｋｉｓ毒素抗毒素システムをＵＣＤを治療するための組換え細菌細胞に用いる。組換え細菌細胞は、過剰のアンモニアを消費して、患者予後を改善するための有益な副産物を産生するように操作されている。組換え細菌細胞は、安全性を保証するための高度に制御可能なキルスイッチも含む。低酸素環境（例えば、消化管内に見いだされるような）に反応して、ＦＮＲプロモーターは、Ｉｎｔリコンビナーゼの発現を誘導し、Ｋｉｓ抗毒素の発現も誘導する。Ｉｎｔリコンビナーゼは、Ｋｉｄ毒素遺伝子を活性化立体配座に転換させるが、蓄積されたＫｉｓ抗毒素の存在が発現Ｋｉｄ毒素の活性を抑制する。酸素の存在下（例えば、消化管外）では、抗毒素の発現は停止する。毒素は、構成的に発現するので、蓄積し続け、細菌細胞を殺滅する。高アンモニア血症は、他の病変にも寄与し得る。 図６２ 図６３ 図６４ 図６５ 図６６Ａは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーター（Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}）に結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。図６６Ａに組換え細菌に見いだされない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の必須遺伝子の転写を抑制する立体配座をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これが必須遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能力を維持する。図６６Ｂは、抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔＲの発現を誘導し、ひいては毒素の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場会、ＴｅｔＲは、発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素に打ち勝ち、細胞を殺滅する。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターより弱いプロモーターであるべきである。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターの制御下にある。図６６Ｃは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。 操作された安全構成要素としてのＧｅｎｅＧｕａｒｄｓの使用を示す図である。すべての操作されたＤＮＡは、条件付きで破壊することができるプラスミド上に存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ： Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４巻、３０７〜３１６頁を参照されたい。 短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定システムを含む、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。細胞がプラスミドを失った場合、抗毒素がもはや産生されず、毒素が細胞を殺滅する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、等量のＨｏｋ毒素および短寿命Ｓｏｋ抗毒素を産生する。上のパネルにおいて、細胞は、等量の毒素および抗毒素を産生し、安定である。中間のパネルにおいて、細胞は、プラスミドを失い、抗毒素が崩壊し始める。下のパネルにおいて、抗毒素が完全に崩壊し、細胞が死ぬ。 細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境に移動させることができるようにペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることによって、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチド（星）を分泌する鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌システムの概略図である。 治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌システムの概略図である。このシステムにおいて、Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体に動員され、そこでベータ−ドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。次いで治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。治療用ペプチドは、自触媒切断によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（ハサミ）の標的化によってリンカーシステムから解放される。 内および外膜の両方を通るチャンネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を用いてパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接転位させる、Ｉ型分泌システムの概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。 漏出性または不安定化外膜を作製し、それにより、細胞外腔への治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含む真核生物由来の治療用ポリペプチドの転位を促進するためのグラム陰性細菌の外および内膜、ならびにいくつかの欠失標的の概略図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ留めるタンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を発生させる。突然変異の組合せは、漏出性表現型を相乗的に増強させ得る。 細菌が消化管内腔に分泌治療用タンパク質を注入することを可能にする改変された３型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を示す図である。誘導性プロモーター（小矢印、上）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、タグ付きペプチドを細胞外に分泌する装置を作るＴ３分泌システム遺伝子カセット（３つの大矢印、上）の発現を誘導する。誘導性プロモーター（小矢印、下）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、次にタグ付き治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する、調節因子、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの発現を駆動する。 例示的なＬ−ホモセリンおよびＬ−メチオニン生合成経路を示す図である。円形は、ＭｅｔＪにより抑制される遺伝子を表し、ｍｅｔＪの欠失は、これらの遺伝子の構成的発現および経路の活性化をもたらす。 例示的なヒスチジン生合成経路を示す図である。 例示的なリシン生合成経路を示す図である。 例示的なアスパラギン生合成経路を示す図である。 例示的なグルタミン生合成経路を示す図である。 例示的なトリプトファン生合成経路を示す図である。 本開示の遺伝子操作細菌を設計し、作製する非限定的な方法の概略を示す図である。「定義する」ステップは、１．微生物生理学および疾患生物学に基づく多様な候補アプローチの特定、２．候補代謝経路を決定するためのバイオインフォマティクスの使用、最適化操作された合成生物の要求される性能目標を決定するための予測ツールの使用を含む。「設計する」ステップは、１．経路構成のコンビナトリアル試験を可能にするための最先端のＤＮＡアセンブリ、２．経路の効率を予測するための数学モデル、３．操作された回路の制御および調節を可能にする専用のスイッチおよび部品の内部安定の使用を含む。「構築する」ステップは、１．コア構造「シャーシー」を構築すること、２．操作された回路を、効率的発現のための最適な染色体位置に安定に組み込むこと、３．固有の機能アッセイを用いて、遺伝子回路の忠実性および活性を評価することを含む。「組み込む」ステップは、１．動物モデルにおける合成生物の局在および通過時間のモニタリングを可能にする、染色体マーカーの使用、２．特定の疾患状態がＧＩ微生物叢および当環境における合成生物の挙動にどのように影響を及ぼすかの理解を拡大するための専門のマイクロバイオームネットワークおよびバイオインフォマティクスを利用すること、３．開発候補の前臨床への速やかで、途切れのない移行を可能にする、発見段階における組織内での方法の開発研究および最適化を活発にすること、候補合成生物の用意周到で、高品質の試験を支援する、特殊疾患動物モデルの改良の広範な経験を利用することを含む。 図８１Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、本開示の遺伝子操作細菌の上流および下流生産のための非限定的な製造方法の略図である。図８１Ａは、種培養１（ＳＣ１）のパラメーター：白金耳量−グリセロール保存液、継続時間一夜、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｂは、種培養２（ＳＣ２）のパラメーター：ＳＣ１からの１／１００希釈、継続時間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｃは、生産バイオリアクターのパラメーター：接種物−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、継続時間２４時間を示す。図８１Ｄは、収集のパラメーター：４０００ｒｐｍの速度および３０分の継続時間での遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、再懸濁１０％グリセロール／ＰＢＳを示す。図８１Ｅは、バイアル充填／貯蔵のパラメーター：１〜２ｍＬの小分け、−８０℃を示す。 ＡＴＣ（図８２Ａ）または酸化窒素誘導性（図８２Ｂ）リポーター構築物を示す図である。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。対照、ＡＴＣ誘導性Ｐ_ｔｅｔ−ＧＦＰリポーター構築物または酸化窒素誘導性Ｐ_ｎｓｒＲ−ＧＦＰリポーター構築物を含むプラスミドを含むニッスル細胞は、一連の濃度にわたり誘導した。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。図８２Ｃは、構築物の概略図を示す図である。 構成的プロモーターの制御下のＮｓｒＲを発現するプラスミドおよびＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下のリポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を含む細菌のドットブロットを示す図である。ＤＳＳ投与マウスをＨＥの例示的モデルとする。ＨＥ対象と同様に、マウスの消化管は、飲料水に２〜３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加することによって損傷する。化学発光は、ＤＳＳ投与マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターで示されている。 野生型ニッスルと比較してより多くの酪酸を産生する、ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０７）またはｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０８）を含む遺伝子操作ニッスルによる酪酸の産生を示す図である。

本発明は、遺伝子操作細菌、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障
害、例えば、尿素回路異常症、肝性脳症および過剰のアンモニアもしくはアンモニアレベ
ルの上昇に関連する他の障害をモジュレートまたは治療する方法を含む。遺伝子操作細菌
は、とりわけ、哺乳動物消化管内におけるような、特定の環境条件下で、過剰のアンモニ
アを減少させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、体内の過剰
の窒素を非毒性分子、例えば、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシ
ン、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンに組み込むことによって過剰のアン
モニアを減少させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを
減少させ、１つもしくは複数の他の有毒物質、例えば、ＧＡＢＡおよび／またはマンガン
も減少させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少さ
せ、例えば、ＧＡＢＡを移入することによって、かつ／またはＧＡＢＡを代謝することに
よって、ＧＡＢＡレベルも低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過
剰のアンモニアを減少させ、例えば、マンガンを移入することによって、マンガンレベル
も減少させる。遺伝子操作細菌は、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの
上昇に関連する障害（例えば、ＵＣＤ、ＨＥ等）の症状を軽減する１つまたは複数の分子
をさらに産生し得る。したがって、述べた実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌
は、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽
減する１つまたは複数の分子も産生し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は
、短鎖脂肪酸、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸を産生する。いくつかの
実施形態では、操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、消化管のバリア機能を改善す
るあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つまたは複数の分子を産
生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する
。いくつかの実施形態では、操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、１つもしくは複
数の他の有毒物質、例えば、ＧＡＢＡおよび／またはマンガンを減少させ、消化管のバリ
ア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしく
は複数の分子を産生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖
脂肪酸を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減
少させ、例えば、ＧＡＢＡを移入することによって、かつ／またはＧＡＢＡを代謝するこ
とによって、ＧＡＢＡレベルを低下させ、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモ
ニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしくは複数の分子を産生する、例えば
、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。いくつかの実
施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、例えば、マンガンを移入
することによって、マンガンレベルを低下させ、消化管のバリア機能を改善するあるいは
アンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしくは複数の分子を産生する、
例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。

述べた実施形態のいずれかにおいて、操作細菌は、（１）当技術分野で公知であり、本
明細書で示す栄養要求性のいずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの、１つまたは複
数の栄養要求性、（２）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知のキルスイッチの
いずれかなどの、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質
耐性回路、（４）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の輸送体のいずれかのよ
うな、生体分子または物質を移入する１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載の
、あるいは当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの、１つまたは複数の分泌回路、
および（６）そのようなさらなる回路の１つまたは複数の組合せのうちの１つまたは複数
をさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、Ｇ
ＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数お
よび／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、
輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、構成的プロモータ
ーにより調節することができる。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路
（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうち
のいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイ
ッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複
数のものは、組織特異的プロモーターにより調節することができる。いくつかの実施形態
では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン
減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回
路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路
）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、誘導性プロモーターにより調節すること
ができる。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア
消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしく
は複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐
性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、環境条件
、因子もしくはキュー、例えば、哺乳動物消化管に見いだされる環境条件、因子もしくは
キューに反応する誘導性プロモーターにより調節することができる。例示的誘導性プロモ
ーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ
特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモー
ター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター
）、ならびに消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、
外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンによ
り誘導されるプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、Ｇ
ＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数お
よび／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、
輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、１つもしくは複数
の低コピーまたは高コピープラスミド上に存在し得る。いくつかの実施形態では、ペイロ
ードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂
肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、
栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのい
ずれか１つもしくは複数のものは、細菌の染色体に組み込むことができる。本開示をより
容易に理解することができるために、特定の用語を最初に定義する。これらの定義は、本
開示の残りの部分に照らして、また当業者により理解されているように読むべきである。
別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、当業者により一
般的に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、この詳細な説明を通して
示す。

「高アンモニア血症」、「高アンモニア血」または「過剰アンモニア」は、体内のアン
モニアの濃度の増加を指すために用いる。高アンモニア血症は、アンモニアの解毒の低下
および／または産生の増加によって引き起こされる。解毒の低下は、アルギニノコハク酸
尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、
Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症およびオルニチントランスカルバミラーゼ
欠損症などの、尿素回路異常症（ＵＣＤ）に、あるいは肝臓のバイパス、例えば、開放肝
管、および／またはグルタミンシンテターゼの欠損に起因し得る（Ｈｏｆｆｍａｎら、２
０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。解毒の低下は、肝性脳症、急性肝不全また
は慢性肝不全などの肝臓障害およびハンチントン病などの神経変性疾患にも起因し得る（
Ｃｈｅｎら、２０１５年；Ｃｈｉａｎｇら、２００７年）。アンモニアの産生の増加は、
感染、薬物、神経因性膀胱および消化管細菌過増殖に起因し得る（Ｈａｂｅｒｌｅら、２
０１３年）。高アンモニア血症に関連する他の障害および状態は、肝性脳症、急性肝不全
または慢性肝不全などの肝臓障害；有機酸障害；イソ吉草酸尿症；３−メチルクロトニル
グリシン尿症；メチルマロン酸尿症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損；カルニチン回
路欠損症；カルニチン欠損症；β−酸化欠損症；リシン尿性タンパク不耐症；ピロリン−
５−カルボン酸シンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンア
ミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン症−高アンモニア血
症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；完全腸管外栄
養；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体静脈短絡；尿路感染
症；尿管拡張；多発性骨髄腫；および化学療法を含むが、これらに限定されない（Ｈｏｆ
ｆｍａｎら、２０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年；Ｐｈａｍら、２０１３年；Ｌ
ａｚｉｅｒら、２０１４年）。健常者では、血漿アンモニア濃度は、一般的に約５０μｍ
ｏｌ／Ｌ未満である（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年）。いくつかの実施形態では、高アン
モニア血症の診断シグナルは、少なくとも約５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約８０μｍｏ
ｌ／Ｌ、少なくとも約１５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１８０μｍｏｌ／Ｌ、または少
なくとも約２００μｍｏｌ／Ｌの血漿アンモニア濃度である（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６
年；Ｈｏｆｆｍａｎら、２０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。

「アンモニア」は、気体アンモニア（ＮＨ_３）、イオン性アンモニア（ＮＨ_４ ^＋）また
はそれらの混合物を指すために用いられる。体液中では、気体アンモニアとイオン性アン
モニアが以下のように平衡状態にある。
ＮＨ_３ ＋ Ｈ^＋ ←→ ＮＨ_４ ^＋

いくつかの臨床検査で総アンモニア（ＮＨ_３＋ＮＨ_４ ^＋）を分析する（Ｗａｌｋｅｒ、
２０１２年）。本発明のいずれかの実施形態では、特に示さない限り、「アンモニア」は
、気体アンモニア、イオン性アンモニアおよび／または総アンモニアを意味し得る。

アンモニアの「解毒」は、有毒なアンモニアが除去され、かつ／またはアルギニン、シ
トルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、トリプトファ
ンまたは尿素を含むが、これらに限定されない１つもしくは複数の非毒性分子に変換され
る、天然または合成の１つまたは複数の過程を指すために用いられる。例えば、尿素回路
は、身体から尿中への除去のためにアンモニアを尿素に酵素的に変換する。アンモニアは
、多くの生化学的経路を経て合成される、多くのアミノ酸の窒素源であるので、それらの
アミノ酸生合成経路のうちの１つまたは複数の増強を用いて、過剰の窒素を非毒性分子に
組み込むことができる。例えば、アルギニン生合成は、１個の窒素原子を含むグルタミン
酸を４個の窒素原子を含むアルギニンに変換し、それにより、過剰の窒素を非毒性分子に
組み込む。ヒトでは、アルギニンは、大腸から再吸収されず、結果として、大腸における
過剰のアルギニンは、有害であるとみなされない。同様に、シトルリンは、大腸から再吸
収されず、結果として、大腸における過剰のシトルリンは、有害であるとみなされない。
アルギニン生合成は、シトルリンを最終産物として産生するように修正することもできる
。シトルリンは、３個の窒素原子を含み、したがって、修正経路も過剰の窒素を非毒性分
子に組み込むことができる。

「アルギニンレギュロン」、「アルギニン生合成レギュロン」および「アルグレギュロ
ン」は、同義で用いられ、アルギニン生合成経路において、グルタミン酸をアルギニンお
よび／または中間代謝物、例えば、シトルリンに変換することに関与する酵素をコードす
る遺伝子を含む所定の細菌種におけるオペロンの集合を意味する。アルギニンレギュロン
は、それらのオペロンに関連するオペレーター、プロモーター、ＡＲＧボックスおよび／
または調節領域も含む。アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素であるＮ−アセ
チルグルタミン酸シンテターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグル
タミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチ
ルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンターゼ、
アルギノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロン、その
オペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックスおよび／またはその調節領域を含
むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、Ｎ−
アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えて
あるいはその代わりにオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロンなら
びに関連するオペレーター、プロモーター、ＡＲＧボックスおよび／または調節領域も含
む。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンの１つもしくは複数のオペロンまた
は遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し得る。いくつかの実施形態では、細菌は
、アルギニンレギュロンにおける任意の遺伝子またはオペロンの複数のコピーを含んでい
てよく、１つもしくは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異させるか、あるい
は変更することができる。

１つの遺伝子は、１つの酵素、例えば、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒ
ｇＡ）をコードし得る。２つまたはそれ以上の遺伝子は、１つの酵素の異なるサブユニッ
ト、例えば、カルバモイルリン酸シンターゼのサブユニットＡおよびサブユニットＢ（ｃ
ａｒＡおよびｃａｒＢ）をコードし得る。いくつかの細菌では、２つまたはそれ以上の遺
伝子は、同じ酵素、例えば、オルニチントランスカルバミラーゼをそれぞれ独立にコード
し得る（ａｒｇＦおよびａｒｇＩ）。いくつかの細菌では、アルギニンレギュロンは、Ｎ
−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする、ａｒｇＡ；Ｎ−アセチルグルタミン
酸キナーゼをコードする、ａｒｇＢ；Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコー
ドする、ａｒｇＣ；アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードする、ａｒｇ
Ｄ；Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードする、ａｒｇＥ；アルギニノコハク酸シンター
ゼをコードする、ａｒｇＧ；アルギニノコハク酸リアーゼをコードする、ａｒｇＨ；それ
ぞれがオルニチントランスカルバミラーゼを独立にコードする、ａｒｇＦおよびａｒｇＩ
の１つまたは両方；カルバモイルリン酸シンターゼの小サブユニットをコードする、ｃａ
ｒＡ；カルバモイルリン酸シンターゼの大サブユニットをコードする、ｃａｒＢ；そのオ
ペロン；そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックスおよび／またはその
調節領域を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュ
ロンは、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
および／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えてあるいはその代わりに）をコードす
る、ａｒｇＪ、そのオペロン、そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボック
スおよび／またはその調節領域を含む。

「アルギニンオペロン」、「アルギニン生合成オペロン」および「ａｒｇオペロン」は
、同義で用いられ、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボック
スを含む共有された調節領域の制御下のアルギニン生合成酵素をコードする遺伝子のうち
の１つまたは複数のクラスターを意味する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の
遺伝子は、共転写され、かつ／または共翻訳される。アルギニンの生合成に関与する酵素
をコードする遺伝子の任意の組合せを自然にまたは合成によりオペロンに組織化すること
ができる。例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、Ｎ−アセチルグルタミル
リン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ
、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、
カルバモイルリン酸シンターゼおよびオルニチントランスカルバミラーゼをコードする遺
伝子をプロモーターおよびＡＲＧボックスを含む共有調節領域の制御下の単一オペロンａ
ｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦ（例えば、表２参照）に組織化する。大腸菌Ｋ１
２およびニッスルにおいて、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン
酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼ
をコードする遺伝子を２つの２極性オペロンａｒｇＥＣＢＨに組織化する。アルギニン生
合成に関与する酵素をコードするオペロンを染色体にわたる異なる遺伝子座に分配するこ
とができる。非改変細菌において、各オペロンは、ＡｒｇＲを介してアルギニンにより抑
制することができる。いくつかの実施形態では、アルギニンおよび／または中間副産物の
産生は、本発明の遺伝子操作細菌において、本明細書で示したアルギニン生合成オペロン
によりコードされる酵素の発現を変化させることによって変化させることができる。各ア
ルギニンオペロンは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。さらに、任意のアル
ギニンオペロン、またはアルギニンオペロン内の遺伝子もしくは調節領域の複数のコピー
は、細菌に存在し得るものであって、オペロンまたは遺伝子もしくは調節領域の１つもし
くは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異させるか、あるいは変更することが
できる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、コピー数を増加させるために同じ
産物（例えば、オペロンまたは遺伝子もしくは調節領域）の複数のコピーを含むようにま
たは複数の異なる機能を果たすオペロンの複数の異なる構成要素を含むように操作されて
いる。

「ＡＲＧボックス共通配列」は、ＡＲＧボックス核酸配列を意味し、その核酸は、ａｒ
ｇＲ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒ
ｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよび／またはｃａｒＢの調節領域のうちの１つま
たは複数に高頻度で存在することが公知である。上述のように、各ａｒｇオペロンは、プ
ロモーターと重複し、レプレッサータンパク質が結合しているＡＲＧボックスと呼ばれる
少なくとも１つの１８ヌクレオチド不完全回文構造配列を含む調節領域を含む（Ｔｉａｎ
ら、１９９２年）。ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列は、各オペロンごとに異なり得る
ものであり、共通ＡＲＧボックス配列は、^Ａ／_Ｔ ｎＴＧＡＡＴ ^Ａ／_Ｔ ^Ａ／_Ｔ ^Ｔ／
_Ａ ^Ｔ／_Ａ ＡＴＴＣＡｎ ^Ｔ／_Ａである（Ｍａａｓ、１９９４年）。アルギニンリプレ
ッサーは、１つまたは複数のＡＲＧボックスに結合して、当１つまたは複数のＡＲＧボッ
クスに作動可能に連結したアルギニン生合成酵素（複数可）の転写を能動的に阻害する。

「突然変異アルギニンレギュロン」または「突然変異型アルギニンレギュロン」は、突
然変異アルギニンレギュロンが、同じ条件下で同じ細菌亜型に由来する非改変レギュロン
より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生するように、アルギニン生合成経
路における、グルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトルリン
に変換することに関与する酵素をコードするオペロンのそれぞれのアルギニン媒介抑制を
低減または消失させる１つまたは複数の核酸の突然変異を含むアルギニンレギュロンを指
すために用いられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィード
バック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒ
ならびにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタ
ミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル
オルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、
アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロン
のうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核
酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、それにより、レギュロンを活性
化し、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増強する。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下もしくは不活性化し、または
遺伝子操作細菌がアルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺
伝子が欠失し）、レギュロンの抑制解除ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の
生合成の増強がもたらされるように、１つもしくは複数の核酸突然変異を含む突然変異ア
ルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン
フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇ
Ａ^ｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡ
ＲＧボックスにおける１つもしくは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギ
ュロンおよび／または突然変異もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタ
ミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒおよびアルギニン生合成酵素をコ
ードするオペロンのそれぞれに対する少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまた
は複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態
では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シ
ンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒおよびアルギニンリプレッサーの突然変異
または欠失を含む。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型
Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンおよび前記オペロンの少な
くとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。いくつかの
実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼをコードするオペロンおよび突然変異または欠失アルギニンリプレッサーを含む
。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトラ
ンスフェラーゼ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオ
ルニチナーゼに加えてあるいはその代わりに）をコードするオペロンならびに前記オペロ
ンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。

ＡＲＧボックスは、各アルギニン生合成オペロンの調節領域におけるプロモーターと重
複する。突然変異アルギニンレギュロンにおいては、１つまたは複数のアルギニン生合成
オペロンの調節領域は、回文構造ＡＲＧボックス配列を破壊し、ＡｒｇＲ結合を低減する
のに十分に突然変異しているが、天然オペロン特異的プロモーターとして認識されるのに
、非突然変異調節領域のプロモーターとの十分に高い相同性を依然として含む。オペロン
は、ＡＲＧボックスおよびオペロンの調節領域へのＡｒｇＲ結合が低減または消失するよ
うに少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける少なくとも１つの核酸突然変異を含む。い
くつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化から保護される塩基およびＡｒｇＲ結合時にヒド
ロキシルラジカル攻撃から保護される塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の
主要な標的である（例えば、表３参照）。突然変異調節領域のプロモーターは、ＲＮＡポ
リメラーゼが、作動可能に連結したアルギニン生合成酵素（複数可）の転写を促進するの
に十分な親和性でそれに結合するように非突然変異調節領域のプロモーターとの十分に高
い相同性を保持している。いくつかの実施形態では、突然変異体のプロモーターのＧ／Ｃ
：Ａ／Ｔ比は、野生型プロモーターのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比と１０％以下異なっている。

いくつかの実施形態では、複数のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これら
の実施形態の一態様では、オペロンにおけるＡＲＧボックスのうちの少なくとも１つは、
オペロンの調節領域へのＡｒｇＲ結合の必要な低減をもたらすように変更される。これら
の実施形態の別の態様では、オペロンにおけるＡＲＧボックスのそれぞれは、オペロンの
調節領域へのＡｒｇＲ結合の必要な低減をもたらすように変更される。

ＡｒｇＲ結合の「低減」は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボック
スおよび調節領域へのリプレッサー結合と比較して、オペロンにおけるＡＲＧボックスへ
のリプレッサー結合の低減または前記オペロンの調節領域への全リプレッサー結合の低減
を指すために用いる。いくつかの実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスおよ
び調節領域へのＡｒｇＲ結合は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボッ
クスおよび調節領域へのＡｒｇＲ結合より少なくとも約５０％低い、少なくとも約６０％
低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低い、ま
たは少なくとも約９５％低い。いくつかの実施形態では、突然変異ＡＲＧボックスおよび
調節領域へのＡｒｇＲ結合の低減は、オペロンにおける１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮ
Ａ発現の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約
１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約
１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少な
くとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００
倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍の
増加をもたらす。

「ＡｒｇＲ」または「アルギニンリプレッサー」は、アルギニンレギュロンにおけるア
ルギニン生合成遺伝子の転写を調節することによりアルギニン生合成を抑制することがで
きるタンパク質を指すために用いられる。アルギニンリプレッサータンパク質をコードす
る遺伝子（「ａｒｇＲ」）の発現が野生型細菌において増加する場合、アルギニン生合成
が減少する。ａｒｇＲの発現が野生型細菌において減少する場合、またはａｒｇＲが欠失
しているかもしくはアルギニンリプレッサー機能を不活性化するように突然変異している
場合、アルギニン生合成が増加する。

「機能し得るＡｒｇＲを欠く」細菌および「ＡｒｇＲ欠失細菌」は、各アルギニンリプ
レッサーが、同じ条件下の同じ亜型の細菌の非改変アルギニンリプレッサーと比較して活
性を著しく低下または消失した細菌を指すために用いられる。アルギニンリプレッサー活
性の低下または消失は、例えば、アルギニン生合成遺伝子の転写の増加ならびに／または
アルギニンおよび／もしくは中間副産物、例えば、シトルリンの濃度の増加をもたらし得
る。アルギニンリプレッサー活性が低下または消失している細菌は、細菌ａｒｇＲ遺伝子
を改変することによりまたはａｒｇＲ遺伝子の転写を改変することにより作製することが
できる。例えば、染色体ａｒｇＲ遺伝子を欠失させることができ、突然変異させることが
でき、またはａｒｇＲ遺伝子を野生型リプレッサー活性を示さないａｒｇＲ遺伝子で置換
することができる。

「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現が例えば、シスで作動することを可能にす
る形で調節領域配列に連結している核酸配列、例えば、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡを
コードする遺伝子に当てはまる。調節領域は、目的の遺伝子の転写を導くことができる核
酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位
、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３
’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含む
ことができる。「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結し
ている調節領域を意味し、遺伝子の発現が前記調節領域のインデューサーの存在下で増加
する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好気性または嫌
気的条件により誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もしくは代謝物ま
たは肝損傷を示す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む。いくつかの
実施形態では、代謝物は、腸特異的であり得る。いくつかの実施形態では、代謝物は、肝
性脳症に関連付けることができ、例えば、ビリルビンであり得る。分子もしくは代謝物の
非限定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリルビン、アスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩ
Ｉ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝
炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗
体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマ
ンガンを含む。これらの分子またはそれらの代謝物のうちの１つに応答するプロモーター
を本明細書で示した遺伝子操作細菌に用いることができる。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、例えば、ＲＮＳま
たはＲＯＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内
に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例
えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。

「外因性環境条件（複数可）」は、本明細書に記載のプロモーターが誘導される状況（
複数可）または環境（複数可）を意味する。「外因性環境条件」という語句は、操作され
た微生物にとっては外部であるが、宿主対象の環境にとっては内因性または天然の環境条
件を意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、同義で用いて、環境条件が
哺乳動物の身体に対して内因性であるが、完全な微生物細胞に対しては外部または外因性
である環境条件を意味することができる。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、
哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺
乳動物の上部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、
哺乳動物の下部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は
、哺乳動物の小腸に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、健
常または疾患状態（例えば、ＨＥ）の哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝物
の存在を意味する。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環
境のような、低酸素、微好気的または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因
性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝物、例えば、プロピオネ
ートである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織に固有または疾患に固有
の代謝物もしくは分子（複数可）である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、
低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、ｐＨ依存性
プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、酸素レベ
ル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は、酸素レベルを感知すること
ができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルにより誘
発され、異なる速度論で発生し得る。

「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまた
は複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応
する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子発現を活性化する。

酸素レベル依存性転写因子の例は、ＦＮＲ、ＡＮＲおよびＤＮＲを含むが、これらに限
定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮ
Ｒ応答性プロモーターは、当技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら
、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；
Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００
３年参照）、非限定的な例を表１に示す。

非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素の条件下
で高度に発現することが公知である大腸菌ニッスルフマル酸・硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ
（ｆｎｒＳ）に由来していた（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅ
ｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、ニッスルに天然で見いだされるグロー
バルな転写調節因子ＦＮＲにより嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮ
Ｒは、二量体を形成し、その制御下の特定の遺伝子のプロモーターにおける特定の配列に
結合し、それにより、それらの発現を活性化する。しかし、好気的条件下では、酸素がＦ
ＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形に変換する。このよ
うにして、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレ
ートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本願書においてＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ
、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびＰｆｎｒＳプロモーターを示すための他のそのような
関連する記号表示と同義で用いる。

「消化管バリア機能増強分子」は、短鎖脂肪酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ＧＬＰ−
２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジル
エタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３およびＳＫＡＬＰ
とも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸およびキヌレニ
ンを含むが、これらに限定されない。消化管バリア機能増強分子は、単一遺伝子によりコ
ードされ得る。例えば、エラフィンは、ＰＩ３遺伝子によりコードされる。あるいは、例
えば、酪酸などの、消化管バリア機能増強分子は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路
により合成することができる。これらの分子は、治療用分子と呼ぶこともできる。

本明細書で使用する場合、生合成経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロ
ン」は、消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸、プロピオン酸を産生するために必要
な２つまたはそれ以上の遺伝子を意味する。前記分子を産生することができる一組の遺伝
子をコードすることに加えて、遺伝子カセットまたはオペロンは、さらなる転写および翻
訳エレメント、例えば、リボソーム結合部位も含み得る。

「酪酸生成遺伝子カセット」、「酪酸生合成遺伝子カセット」および「酪酸オペロン」
は、同義で用いて、酪酸を生合成経路で生成することができる一組の遺伝子を意味する。
内因性酪酸生合成経路を介して酪酸を産生することができる非改変細菌は、クロストリジ
ウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトクロストリジウム属（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリビブリオ
属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およ
びトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）を含むが、これらに限定されず、これらの内因
性酪酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。本発明の遺伝
子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酪酸生合成遺伝子、あるい
は細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酪酸生合成遺伝子の組合せを含
み得る。酪酸生成遺伝子カセットは、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル（
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（クロストリジウム・ディフ
ィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）とも呼ばれる）に由来する酪酸
産生経路の８つの遺伝子：それぞれブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼサブユニット、電子
伝達フラビンタンパク質サブユニットベータ、電子伝達フラビンタンパク質サブユニット
アルファ、アセチルＣｏＡ Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼおよび酪酸
キナーゼをコードするｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ
２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含み得る（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３年）。酪酸生合成
遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換または改変することができる。ペプトクロ
ストリジウム・ディフィシル６３０菌株および１２９６菌株は、両方が酪酸を産生するこ
とができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋについ
て異なる核酸配列を含む。酪酸生成遺伝子カセットは、ペプトクロストリジウム・ディフ
ィシル６３０菌株に由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３およびｔｈｉＡ１ならび
にペプトクロストリジウム・ディフィシル１２９６菌株に由来するｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐ
ｂｔおよびｂｕｋを含み得る。あるいは、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に由来する単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイルＣ
ｏＡレダクターゼをコードする）は、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来する
ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子の３つすべてを機能的に置換することがで
きる。したがって、酪酸生成遺伝子カセットは、ペプトクロストリジウム・ディフィシル
に由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋならびにトレポネーマ・
デンティコラに由来するｔｅｒを含み得る。酪酸生成遺伝子カセットは、酪酸の好気的生
合成の遺伝子および／または酪酸の嫌気的もしくは微好気的生合成の遺伝子を含み得る。

同様に、「プロピオン酸遺伝子カセット」または「プロピオン酸オペロン」は、プロピ
オン酸を生合成経路で生成することができる一組の遺伝子を意味する。内因性プロピオン
酸生合成経路を介してプロピオン酸を産生することができる非改変細菌は、クロストリジ
ウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスフ
ェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）およびプレボテラ・
ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）を含むが、これらに限定さ
れず、これらの内因性プロピオン酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起
源であり得る。本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来す
るプロピオン酸生合成遺伝子、あるいは細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由
来するプロピオン酸生合成遺伝子の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、プロピ
オン酸遺伝子カセットは、アクリル酸経路プロピオン酸生合成遺伝子、例えば、それぞれ
プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼＡ、ラクトイ
ルＣｏＡデヒドラターゼＢ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼＣ、電子伝達フラビンタン
パク質サブユニットＡ、アクリロイルＣｏＡレダクターゼＢおよびアクリロイルＣｏＡレ
ダクターゼＣをコードするｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ
およびａｃｒＣを含む（Ｈｅｔｚｅｌら、２００３年、Ｓｅｌｍｅｒら、２００２年）。
代替実施形態では、プロピオン酸遺伝子カセットは、ピルビン酸経路プロピオン酸生合成
遺伝子（例えば、ＴｓｅｎｇおよびＰｒａｔｈｅｒ、２０１２年参照）、例えば、それぞ
れホモセリンデヒドロゲナーゼ１、ホモセリンキナーゼ、Ｌ−トレオニンシンターゼ、Ｌ
−トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドアセチ
ルトランスフェラーゼおよびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡ^ｆ
ｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ^ｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを含む。
いくつかの実施形態では、プロピオン酸遺伝子カセットは、アシルＣｏＡチオエステラー
ゼをコードするｔｅｓＢをさらに含む。プロピオン酸遺伝子カセットは、プロピオン酸の
好気的生合成の遺伝子および／またはプロピオン酸の嫌気的もしくは微好気的生合成の遺
伝子を含み得る。プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換また
は改変する、例えば、コドンを最適化することができる。

「酢酸遺伝子カセット」または「酢酸オペロン」は、酢酸を生合成経路で生成すること
ができる一組の遺伝子を意味する。細菌は、セルロース、リグニンおよび無機気体などの
様々な基質を含む、「多くの炭素およびエネルギー源から酢酸を合成し」、当技術分野で
公知である、種々の生合成機序および遺伝子を利用する（Ｒａｇｓｄａｌｅら、２００８
年）。内因性酢酸生合成経路を介して酢酸を産生することができる非改変細菌は、本発明
の遺伝子操作細菌の酢酸生合成遺伝子の起源であり得る。本発明の遺伝子操作細菌は、細
菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子、あるいは細菌の異なる種
、菌株および／または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子の組合せを含み得る。大腸菌は
、好気的増殖中にグルコースおよび酸素を消費して、酢酸および二酸化炭素を産生するこ
とができる（Ｋｌｅｍａｎら、１９９４年）。アセチトマクラム属（Ａｃｅｔｉｔｏｍａ
ｃｕｌｕｍ）、アセトアナエロビウム属（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）、アセトハ
ロビウム属（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ）、アセトネマ属（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）、バ
ルチア属（Ｂａｌｕｔｉａ）、ブチリバクテリウム属（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、クロストリジウム属、ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オキソバクター属（Ｏｘｏ
ｂａｃｔｅｒ）、スポロムサ属（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）およびサーモアセトゲニウム属（
Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ）などの、いくつかの細菌は、例えば、Ｗｏｏｄ−
Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を用いて、ＣＯまたはＣＯ_２＋Ｈ_２を酢酸に変換することができ
る酢酸生成嫌気性菌である（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、２０１２年）。
様々な細菌種のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における遺伝子は、当技術分野で公知
である。酢酸遺伝子カセットは、酢酸の好気的生合成の遺伝子および／または酢酸の嫌気
的もしくは微好気的生合成の遺伝子を含み得る。酢酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複
数を機能的に置換または改変することができる。

「ＧＡＢＡ」および「γ−アミノ酪酸」は、哺乳動物中枢神経系における主要な抑制性
神経伝達物質（Ｃ_４Ｈ_９ＮＯ_２）を指すために用いられる。ヒトにおいては、ＧＡＢＡは
、筋緊張の調節にも直接的に関与する。ＧＡＢＡは、リガンド開口型イオンチャンネル複
合体の一部である、ＧＡＢＡ_Ａ受容体、ならびにＧＡＢＡ_Ｂ代謝調節型Ｇタンパク質共役
受容体を活性化することができる。ＧＡＢＡを産生するニューロンは、「ＧＡＢＡ作動性
」ニューロンとして公知であり、ＧＡＢＡ受容体の活性化は、ＧＡＢＡ作動性トーンと表
現される（すなわち、ＧＡＢＡ受容体の活性化の増大は、ＧＡＢＡ作動性トーンの増大を
意味する）。

「ＧＡＢＡ輸送体」および「ＧａｂＰ」は、ＧＡＢＡを細菌細胞内に輸送することがで
きる膜輸送タンパク質を指すために用いられる（例えば、Ｌｉら、２００１年参照）。大
腸菌では、ｇａｂＰ遺伝子は、ＧＡＢＡの輸送に関与する高親和性ＧＡＢＡパーミアーゼ
をコードする（Ｌｉら、２００１年）。いくつかの実施形態では、ＧＡＢＡ輸送体は、枯
草菌および大腸菌を含むが、これらに限定されない、細菌種に由来するｇａｂＰ遺伝子に
よりコードされる。これらの内因性ＧＡＢＡ輸送体遺伝子は、本発明の遺伝子操作細菌の
遺伝子の起源であり得る。ＧＡＢＡ輸送体をコードする任意の適切な遺伝子（複数可）を
用いることができる。

「マンガン」は、記号「Ｍｎ」および原子番号２５を有する化学元素を意味する。生体
系においては、マンガンは、必須微量金属であり、酵素媒介性触媒作用に重要な役割を果
たすが、有害な作用も有し得る。細胞は、毒性を避けるためにマンガンを厳格な恒常性制
御下に維持する。高アンモニア血症に関連するいくつかの障害は、マンガンのレベルの上
昇を特徴とすることもあり得るものであり、マンガンは、疾患病因（例えば、肝性脳症）
に寄与し得るものである（Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。

「マンガン輸送体」および「ＭｎｔＨ」は、マンガンを細菌細胞内に輸送することがで
きる膜輸送タンパク質を指す（例えば、ＪｅｎｓｅｎおよびＪｅｎｓｅｎ、２０１４年参
照）。大腸菌では、ｍｎｔＨ遺伝子は、マンガンの輸送に関与するプロトン刺激性２価金
属陽イオン取込み系をコードする（Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎら、２０１３年）。いくつかの実
施形態では、マンガン輸送体は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）、フレキスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ペスト菌
（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）および大腸菌を含むが、これらに限定されない、細
菌種に由来するｍｎｔＨ遺伝子によりコードされる。これらの内因性マンガン輸送体遺伝
子は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。マンガン輸送体をコードする
任意の適切な遺伝子（複数可）を用いることができる。

本明細書で使用する場合、「非天然」核酸配列は、通常細菌に存在しない核酸配列、例
えば、内因性配列の余剰のコピー、あるいは細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来す
る配列などの異種配列、あるいは同じ亜型の細菌に由来する非改変配列と比較して改変さ
れ、かつ／または突然変異した配列を意味する。いくつかの実施形態では、非天然核酸配
列は、合成非天然型配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年参照）。非天然
核酸配列は、遺伝子カセットにおける調節領域、プロモーター、遺伝子および／または１
つもしくは複数の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」は、天然で互
いに同じ関係性が見いだされない２つまたはそれ以上の核酸配列を意味する。非天然核酸
配列、例えば、遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し
得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、天然において前記遺伝子カ
セットと関連していない誘導性プロモーター、例えば、酪酸生成遺伝子カセットまたはア
ルギニン産生カセットに作動可能に連結したＦＮＲ応答性プロモーターに直接的または間
接的に作動可能に連結している遺伝子カセットを含む。さらに、遺伝子、遺伝子カセット
または調節領域の複数のコピーが細菌に存在し、１つもしくは複数のコピーは、本明細書
に記載の通り突然変異させるか、あるいは変更することができる。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、コピー数を増大させるまたは複数の異なる機能を果たす遺伝子カ
セットの複数の異なる構成要素を構成するために、同じ非天然核酸配列、例えば、遺伝子
、遺伝子カセットまたは調節領域の複数のコピーを含むように操作されている。

「構成的プロモーター」は、その制御下の、かつ／またはそれが作動可能に連結したコ
ード配列もしくは遺伝子の連続的転写を駆動することができるプロモーターを意味する。
構成的プロモーターおよび変異体は、当技術分野で周知であり、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、
構成的大腸菌σ^Ｓプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）
Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ Ｎ
ａｍｅ ＢＢａ＿Ｊ４５９９２； ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ^３２プロ
モーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成
的大腸菌σ^７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；
ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモーター（Ｂ
Ｂａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺ
プロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝
子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（Ｂ
Ｂａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３
）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝
子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（Ｂ
Ｂａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０
８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０）、構成的枯草菌σ^Ａプロモーター（例えば
、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４
３０１３）、Ｐ_ｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、Ｐ_ｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０
０２）、Ｐ_ｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３）、構成的枯草菌σ^Ｂプロモーター（例えば
、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ
１４３０１１））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サル
モネラ属に由来するＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ属に由来するＰ
ｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、
Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４
８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；Ｂ
Ｂａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１
；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２
；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プ
ロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））およびそれらの機能的断片を含むが、これらに限
定されない。

本明細書で使用する場合、アルギニンまたは中間副産物、例えば、シトルリンを「過剰
産生する」遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含む細菌を指す。例えば
、操作細菌は、ＡｒｇＡのフィードバック抵抗形を含み得るものであり、アルギニンフィ
ードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現する場合、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌より多く
のアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。遺伝子操作細菌は、ア
ルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックス
における１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを代わるべ
きものとしてまたはさらに含み得る。遺伝子操作細菌は、突然変異もしくは欠失アルギニ
ンリプレッサーを代わるべきものとしてまたはさらに含み得る。いくつかの実施形態では
、遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌の少なくとも約１．５倍、少な
くとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なく
とも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少
なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６０
０倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくと
も約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のアルギニンを産生する。いくつかの実
施形態では、遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌の少なくとも約１．
５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０
倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２
００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なく
とも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍
、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のシトルリンまたは他の中間
副産物を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌におけるアルギニン生合成
遺伝子のうちの１つまたは複数のｍＲＮＡ転写物レベルは、同じ条件下で同じ亜型の非改
変細菌におけるｍＲＮＡ転写物レベルの少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少な
くとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少な
くとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍
、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約
７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、ま
たは少なくとも約１５００倍である。特定の実施形態では、非改変細菌は、検出可能なレ
ベルのアルギニン、中間副産物、および／またはそのようなオペロンにおける遺伝子（複
数可）の転写を有さない。しかし、タンパク質ならびに／またはアルギニンおよび／もし
くは中間副産物の転写レベルは、突然変異アルギニンレギュロンを有する対応する遺伝子
操作細菌において検出可能である。転写レベルは、遺伝子のｍＲＮＡレベルを直接測定す
ることによって検出することができる。アルギニンおよび／または中間副産物レベル、な
らびにアルギニン生合成遺伝子から発現する転写物のレベルを測定する方法は、当技術分
野で公知である。アルギニンおよびシトルリンは、例えば、質量分析により測定すること
ができる。

「消化管」は、食物の輸送および消化、栄養素の吸収、ならびに廃物の排泄に関与する
器官、腺、路および系を意味する。ヒトにおいては、消化管は、口から始まり、肛門で終
わり、食道、胃、小腸および大腸をさらに含む、胃腸管を含む。消化管は、脾臓、肝臓、
胆嚢および膵臓などの、付属器官および腺も含む。上部胃腸管は、食道、胃および小腸の
十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、ならび
に大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸および肛門管を含む。細菌は、消化管を通
して、例えば、胃腸管、とりわけ腸に見いだすことができる。

本明細書で使用する場合、「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば、核酸配
列を意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的遺伝子配列を含むことを
意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉ
ｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むこと
を意味し、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列、例えば、調節配列
、リーダー配列、シグナル配列または他の非タンパク質コード配列を含むことも意味する
。

「微生物」は、一般的に単細胞からなる顕微鏡的、超顕微鏡的または極超微鏡的サイズ
の生物または微小生物を意味する。微生物の例は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定
の藻類および原虫を含む。いくつかの態様では、微生物は、１つまたは複数の治療用分子
を生産するように操作される（「操作微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境
、例えば、消化管からの特定の有毒な代謝物、基質または他の化合物を移入し、かつ／ま
たは異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、有益な代謝物、分子または
他の化合物（合成もしくは天然）を合成し、それらをその環境中に放出するように操作さ
れる。特定の実施形態では、操作微生物は、操作細菌である。特定の実施形態では、操作
微生物は、操作ウイルスである。

「非病原性細菌」は、宿主における疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌
を意味する。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌
の例は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム
属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）、大腸菌、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィ
ロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バシラス・コアグランス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ズブチリス（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダ
ム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・イン
ファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテ
リウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバク
テリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジ
ウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス
・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバシラス・アシド
フィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・
ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス
・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタルム（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）およびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定
されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；
米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５
８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然で病原性の細菌を遺伝子操作
して、病原性の低下または消失をもたらすことができる。

本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、細菌またはウイルスなどの、遺伝子操作
微生物により産生される目的の１つもしくは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、遺伝子もしくは複数の遺
伝子またはオペロンによりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードを含む１
つもしくは複数の遺伝子および／またはオペロンは、微生物に対して内因性である。いく
つかの実施形態では、ペイロードの１つもしくは複数のエレメントは、異なる微生物およ
び／または生物に由来する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロード
である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の生合成のための遺伝子によりコ
ードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の代謝、異化または分解のた
めの遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の移入の
ための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の輸出
のための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子
（複数可）、例えば、ＦＮＲのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペ
イロードは、プロモーターまたはリプレッサーのような、調節エレメントを含む。いくつ
かの実施形態では、ペイロードは、ペイロードは、ＦＮＲＳのような、誘導性プロモータ
ーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、キルスイッチのような、リプレッサ
ーエレメントを含む。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路によ
り生成されるものであって、生合成または生化学的経路は、任意選択で微生物に対して内
因性であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作微生物は、２つまたはそれ以
上のペイロードを含む。ペイロード（複数可）の非限定的な例は、（１）ＡｒｇＡｆｂｒ
、（２）突然変異Ａｒｇボックス、（３）突然変異ＡｒｇＲ、（４）突然変異ＡｒｇＧ、
（５）酪酸生合成カセット、（６）プロピオン酸生合成カセット、（７）酢酸生合成カセ
ット、（８）ＧＡＢＡ代謝カセット、（９）ＧＡＢＡ輸送体、（１０）Ｍｎ輸送体のうち
の１つまたは複数を含む。他の例示的ペイロードは、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２
７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３またはＳＫＡＬＰ
としても公知）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ_２、キヌレン酸およびキヌレニ
ンを含む。他の例示的ペイロードは、栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性をもたら
す突然変異配列（複数可）、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、生体分子または基質
を移入するための輸送体配列、分泌回路を含む。

「プロバイオティク」は、適切な量の微生物を含む宿主生物に健康上の恩恵をもたらし
得る、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために用いられる。いくつかの
実施形態では、宿主生物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、ヒ
トである。非病原性細菌のいくつかの種、菌株および／または亜型は、現在プロバイオテ
ィク細菌と認識されている。プロバイオティク細菌の例は、ビフィドバクテリウム属、大
腸菌、乳酸桿菌属およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム
、エンテロコッカス・ファシウム、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、
ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プラン
タルムおよびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅ
ｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７
９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクは、細菌の変異または突
然変異菌株であり得る（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２
０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原
性細菌を遺伝子操作して、所望の生物学的特性、例えば、生存性を増強または改善するこ
とができる。非病原性細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を与えることができ
る。プロバイオティク細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を増強または改善す
ることができる。

本明細書で使用する場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、
非天然遺伝物質が保持され、発現し、伝播するように、宿主ゲノムに組み込まれるまたは
自己複製染色体外プラミド上に伝播する非天然遺伝物質、例えば、フィードバック抵抗性
ａｒｇＡ遺伝子、突然変異アルギニンリプレッサーおよび／または他の突然変異アルギニ
ンレギュロンを有する細菌宿主細胞を指すために用いられる。安定な細菌は、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの、例えば、培地中での、かつ／またはｉｎ ｖｉｖｏでの、例えば、消化管中
での生存および／または増殖の能力がある。例えば、安定な細菌は、ａｒｇＡ^ｆｂｒを細
菌において発現させることができ、細菌がｉｎ ｖｉｔｒｏで、かつ／またはｉｎ ｖｉ
ｖｏで生存し、かつ／または増殖することができるように、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を有す
るプラスミドまたは染色体が細菌において安定に維持されている、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子
を含む遺伝子操作細菌であり得る。

本明細書で使用する場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならび
にそれらの同語源語は、疾患、障害および／または状態、あるいはその少なくとも１つの
認識できる症状の改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治
療する」は、患者によって必ずしも認識できない、少なくとも１つの測定可能な物理的パ
ラメーターの改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療す
る」は、疾患、障害および／または状態の進行を、物理的に（例えば、認識できる症状の
安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、抑制
することを意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、
疾患、障害および／または状態の進行を遅くすることまたは進行を逆転することを意味す
る。本明細書で使用する場合、「妨げる」およびその同語源語は、所定の疾患、障害およ
び／または状態あるいはそのような疾患、障害および／または状態に関連する症状の発生
を遅延させることまたはかかるリスクを低下させることを意味する。

治療を必要とする人は、特定の医学的障害を既に有する人、障害を有するリスクがある
、または最終的に障害にかかる可能性がある人を含み得る。治療の必要性は、例えば、障
害の発生に関連する１つもしくは複数のリスクファクターの存在、障害の進行もしくは存
在、または障害を有する対象の治療に対する生じ得る受容によって評価される。原発性高
アンモニア血症は、公知の治療法が存在しない常染色体劣性またはＸ連鎖先天性代謝異常
である、ＵＣＤによって引き起こされる。高アンモニア血症は、尿素回路の他の破壊、例
えば、有毒代謝物、感染および／または基質欠損に二次的でもあり得る。高アンモニア血
症は、他の病的状態にも寄与し得る。例えば、ハンチントン病は、公知の治療法が存在し
ない常染色体優性障害である。高アンモニア血症、高血中シトルリンおよび尿素回路酵素
の抑制を特徴とする尿素回路異常は、公知の治療法が存在しない常染色体優性障害である
、ハンチントン病の病状に寄与し得る。高アンモニア血症の治療は、過剰のアンモニアお
よび／または随伴症状を低減または除去することを含み得るものであり、潜在する高アン
モニア血症に関連する障害の除去を必ずしも含まない。

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、本発明の遺伝子操作細菌と生理学的に適
切な担体および／または賦形剤のような他の成分との製剤を意味する。

同義で用いることができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される
担体」という語句は、生物に対する著しい刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の
生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を意味する。アジュバントは、
これらの語句のもとに含まれる。

「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加さ
れる不活性物質を意味する。例は、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およ
び種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコールなら
びに例えば、ポリソルベート２０を含む、界面活性剤を含むが、これらに限定されない。

「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発生の予防、遅延、また
は状態、例えば、高アンモニア血症の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために用い
られる。治療有効量は、例えば、アンモニア濃度の上昇に関連する障害の１つもしくは複
数の症状を治療する、防止する、重症度を低下させる、発症を遅延させる、かつ／または
発生のリスクを低下させるのに十分であり得る。治療有効量、ならびに治療有効投与頻度
は、当技術分野で公知であり、下文で述べる方法により決定することができる。

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」ならびに
「（複数の）ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直線
状に連結したアミノ酸単量体から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用
語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を意味し、特定の長さの生成
物を意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オ
リゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つもしくはそれ以上のアミノ
酸の１つもしくは複数の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」
の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、ま
たはそれらと同義で用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化
、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断または非天然アミ
ノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物も
指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得ることができ、または組
換え技術により生成することができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺
伝子操作細菌またはウイルスにより産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくは
それ以上、５もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５も
しくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以
上、２００もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、１０００もしくはそれ以上、ま
たは２０００もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずし
もそのような構造を有さないが、定義された３次元構造を有し得る。定義された３次元構
造を有するポリペプチドは、折りたたみと呼ばれ、定義された３次元構造を有さずに、多
数の異なる立体配座をとり得るポリペプチドは、変性と呼ばれる。「ペプチド」または「
ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸
配列を意味し、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド
配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列および他のペプチド配列から選択さ
れる配列と一致するアミノ酸配列を意味し得る。

「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その天然環境中に存
在しないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は、要求されない。細菌または哺
乳動物細胞を含むが、これらに限定されない宿主細胞において発現した組換えにより産生
されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、
または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発
明の目的のために単離されたと見なされる。
組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された
、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換し
た、細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質を意味する。大部分の細菌培養において発現するタンパク質またはペプチドは、一般的
にグリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変異体、およ
びそれらのいずれかの組合せもポリペプチドとして含まれる。「断片」、「変異体」、「
誘導体」および「類似体」という用語は、最初のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似の
アミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する最初のポリペプチドの少なくとも１
つまたは複数の特性を保持している、任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド
の断片は、タンパク質分解性断片ならびに欠失断片を含む。断片は、本明細書に記載の任
意のポリペプチドに由来する特異抗体または生物活性断片もしくは免疫学的に活性な断片
も含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当技術分野で
公知の突然変異誘発法を用いて生成することができる。変異型ポリペプチドは、同類もし
くは非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。

ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用する場合、「変異体」という
用語は、最初のペプチドのまたは最初のペプチドと十分に類似した配列を含む、融合タン
パク質を含む。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、２つまたは
それ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。一般的
に、融合タンパク質は、周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術により得られる。融合タンパ
ク質は、融合タンパク質の成分である個別の最初のタンパク質と類似の構造的機能（ただ
し必ずしも同じ程度でない）および／または類似の調節機能（ただし必ずしも同じ程度で
ない）および／または類似の生化学的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／ま
たは免疫学的活性（ただし必ずしも同じ程度でない）を有し得る。「誘導体」は、２０種
の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含む、ペプチドを含むが、これ
に限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第
２のペプチドの配列と比較することによって決定される。それが同一または同類アミノ酸
置換である場合、１つのペプチドのアミノ酸は、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類
似している。同類置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９７８年）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．８（１９８９年）、７
７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸
は、保守的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ
、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａ
ｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および
−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

本明細書で使用する場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のア
ミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように第２のア
ミノ酸配列と比べて十分なまたは最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１
のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なく
とも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なく
とも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なく
とも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なく
とも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なく
とも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ
酸配列は、本明細書で十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明
のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。そのような変異体は、一般的に本発明
のペプチドの機能活性を保持している。変異体は、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、付
加および／または置換により、それぞれ天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列が異な
るペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体ならびに人工的に設計されたもので
あり得る。

本明細書で使用する場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリン
カー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を結合または連結する
、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは非天然型ア
ミノ酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、「合成」という用語は、天然に存在し
ないアミノ酸配列を意味する。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる
例示的リンカーは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国
特許出願公開第２０１４００７９７０１号に記載されている。

本明細書で使用する場合、「コドン最適化配列」という用語は、例えば、コード配列か
ら転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するため
に、またはコード配列の転写を改善するために、既存のコード配列から改変された、また
は設計された配列を意味する。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選択に適合するコ
ード配列のコドンを選択することを含む過程を含むが、これに限定されない。

多くの生物は、成長しつつあるポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコード
する特定のコドンの使用についてバイアスまたは選択を示す。コドン選択またはコドンバ
イアスは、生物間のコドン使用の差であり、遺伝コードの縮重によって可能になるもので
あり、多くの生物で十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）の翻訳の効率としばしば相関しており、これがひいては、とりわけ、翻訳され
るコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考え
られている。細胞における選択されるｔＲＮＡｓが優位であることは、一般的にペプチド
合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映するものである。したがって、コドン
最適化に基づいて所定の生物における最適の遺伝子発現を得るために遺伝子を調整するこ
とができる。

本明細書で使用する場合、「分泌システム」または「分泌タンパク質」という用語は、
微生物、例えば、細菌細胞質から目的のタンパク質または治療用タンパク質を分泌または
輸出することができる天然または非天然分泌機構を意味する。分泌システムは、単一タン
パク質を含み、または複合体、例えば、ＨｌｙＢＤに集合する２つまたはそれ以上のタン
パク質を含み得る。グラム陰性細菌の分泌システムの非限定的な例は、改変ＩＩＩ型鞭毛
、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩ
Ｉ型分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ｒｅｓｉｓｔａｎ
ｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単
一膜分泌システムを含む。グラム陽性細菌の分泌システムの非限定的な例は、Ｓｅｃおよ
びＴＡＴ分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質（複数可）ま
たは治療用タンパク質（複数可）は、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク
質（複数可）を特定の分泌システムに導くためのＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ
」を含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、操作細菌から目的のタンパク質（
複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌する前にこのタグを除去することがで
きる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシ
ステムにより「パッセンジャー」ペプチドの細胞質からペリプラズムコンパートメント内
への転位時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を越えて転位したならば、Ｃ末端分
泌タグを自己触媒またはプロテアーゼ触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断によって除去し、それ
により、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を細胞外環境中
に放出することができる。

本明細書で使用する場合、「輸送体」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、
代謝物、基質等を細胞外環境から微生物に移入するための機構、例えば、１つまたは複数
のタンパク質を意味する。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、それに反することが明確に示
されない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解すべきである。

「および／または」という語句は、リストにおける要素の間に用いられる場合、（１）
１つの列挙された要素のみが存在すること、または（２）リストの複数の要素が存在する
ことを意味するものとする。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、選択がＡのみ；Ｂ
のみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、ＢおよびＣであり得る
ことを示している。「および／または」という語句は、リストにおける要素「のうちの少
なくとも１つ」または「のうちの１つもしくは複数」と同義で用いることができる。

細菌
本明細書で開示する遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、アンモニアおよ
び／または窒素を代替副産物に変換することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子
操作細菌は、天然で非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロバイオティク細菌で
ある。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、病原性を低下または消失させるよう
に改変または突然変異させた天然で病原性の細菌である。例示的細菌は、バシラス属、バ
クテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、クロストリジウム属
、腸球菌属、大腸菌、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、サッカロミセス属およびスタフィロコッ
カス属、例えば、バシラス・コアグランス、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス、バク
テロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリ
ウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・
ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテ
ロコッカス・ファシウム、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリ
クス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラ
カゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・
ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティスおよびサッカロミセス・ブラウディを含むが、
これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、バクテロイデス・フラ
ジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ズブチリス、ビフ
ィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバ
クテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌ニッスル、ラクトバシ
ラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリおよ
びラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、最も十分に特徴付けられたプロビオティ
クの１つに進化した腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ
）のグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）、大腸菌ニッスル１９１７株で
ある。該菌株は、その完全な無害（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ
（一般的に安全と認識された（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａ
ｆｅ））状態（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、強調は著者による）を有する。ゲノム配
列決定により、大腸菌ニッスルが顕著な毒性因子（例えば、大腸菌α−ヘモリシン、Ｐ線
毛アドヘシン）を欠いていることが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ， ２００８）。さらに
、大腸菌ニッスルが病原性接着因子を有さず、腸毒素または細胞毒素を産生せず、侵襲性
でなく、尿路病原性でないことが示された（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。１
９１７年という早期に、大腸菌ニッスルが治療用のＭｕｔａｆｌｏｒと呼ばれた医薬カプ
セルに包装された。大腸菌ニッスルは、それ以来、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトにおける潰瘍性
大腸炎を治療するために（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎら、１９９９年）、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト
における炎症性腸疾患、クローン病および回腸嚢炎を治療するために（Ｓｃｈｕｌｔｚ、
２００８年）、またｉｎ ｖｉｔｒｏで腸管侵襲性サルモネラ属、レジオネラ属（Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ）を抑制するために（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒら、２００４年）用いられている。大腸
菌ニッスルの治療有効性および安全性が説得力をもって立証された（Ｕｋｅｎａら、２０
０７年）ことは、一般的に受け入れられている。

当業者は、本明細書で開示した遺伝子改変は、修正し、細菌の他の種、菌株および亜型
に適応することができることを十分に理解するであろう。例えば、アルギニン媒介調節は
、非常に多様な細菌、すなわち、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎ
ｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サーモトガ門（Ｔｈｅｒｍ
ｏｔｏｇａ）およびモンテラ・プロファンダ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｐｒｏｆｕｎｄａ）
などのグラム陰性菌ならびに枯草菌、ゲオバシラス・ステアサーモフィルス（Ｇｅｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびストレプトミセズ・クラ
ブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）などのグラム陽性
菌ならびに他の細菌において著しく十分に保存されていることが公知である（Ｎｉｃｏｌ
ｏｆｆ、２００４年）。さらに、アルギニンリプレッサーは、細菌ゲノムにおいて普遍的
に保存されており、弱い回文構造である、その認識シグナル（ＡＲＧボックス）もゲノム
間に保存されている（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００１年）。

非改変大腸菌ニッスルおよび本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、消化管または血清中
の防御因子により破壊することができる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。ｉｎ
ｖｉｖｏでの細菌の滞留時間は、本明細書に記載の方法を用いて決定することができる
。いくつかの実施形態では、滞留時間をヒト対象について計算する。野生型ＡｒｇＲおよ
び野生型アルギニン調節を含むストレプトマイシン耐性大腸菌ニッスルを用いる非限定的
な例を本明細書で示す。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの滞留時間を本発明
の遺伝子操作細菌について計算する。

過剰なアンモニアの低減
アルギニン生合成経路
大腸菌などの細菌において、アルギニン生合成経路は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸リン酸レダク
ターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、
カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク
酸シンターゼ、およびアルギニノコハク酸リアーゼを含む８ステップ酵素過程においてグ
ルタミンをアルギニンに変換することができる（Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）。最初の５
ステップは、オルニチン前駆体を得るためのＮ−アセチル化を含む。第６のステップにお
いて、オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ
としても公知である）がシトルリンの形成を触媒する。最後の２ステップは、シトルリン
からアルギニンを得るためのカルバモイルリン酸の利用を含む。

いくつかの細菌、例えば、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒ
ｈｏｅａｅ）において、アルギニン生合成における第１および第５ステップは、二機能性
酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼにより触媒され得る。オルニチンアセチルト
ランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）が大腸菌におけるＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
（ａｒｇＡ）およびＮ−アセチルオルニチナーゼ（ａｒｇＥ）栄養要求性遺伝子突然変異
の両方を補完することが示された場合、この二機能性が最初に特定された（Ｍｏｕｎｔａ
ｉｎら、１９８４年；Ｃｒａｂｅｅｌら、１９９７年）。

ａｒｇＡは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードし、ａｒｇＢは、Ｎ−ア
セチルグルタミン酸キナーゼをコードし、ａｒｇＣは、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レ
ダクターゼをコードし、ａｒｇＤは、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコ
ードし、ａｒｇＥは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードし、ａｒｇＦは、オルニチン
トランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＩもオルニチントランスカルバミラーゼをコ
ードし、ａｒｇＧは、アルギノコハク酸シンターゼをコードし、ａｒｇＨは、アルギノコ
ハク酸リアーゼをコードし、ａｒｇＪは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコー
ドする。ｃａｒＡは、グルタミナーゼ活性を有するカルバモイルリン酸シンターゼの小Ａ
サブユニットをコードし、ｃａｒＢは、アンモニアからのカルバモイルリン酸の合成を触
媒するカルバモイルリン酸シンターゼの大Ｂサブユニットをコードする。これらのアルギ
ニン生合成遺伝子（すなわち、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａ
ｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のうちの
１つまたは複数の異なる組合せを天然でまたは合成により、１つまたは複数のオペロンに
組織化することができ、そのような組織化は、細菌の種、菌株および亜型間で異なり得る
（例えば、表２参照）。各オペロンの調節領域は、少なくとも１つのＡＲＧボックスを含
み、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数は、オペロンおよび細菌間で異なり得る。

これらの酵素をコードする遺伝子のすべてをＡｒｇＲとのその相互作用を介してアルギ
ニンによる抑制にかけて、各遺伝子の調節領域に結合し、転写を抑制する複合体を形成す
る。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼもアルギニンのみによるタンパク質レベルで
のアロステリックフィードバック阻害にかける（Ｔｕｃｈｍａｎら、１９９７年；Ｃａｌ
ｄａｒａら、２００６年； Ｃａｌｄａｒａら、２００８年；Ｃａｌｄｏｖｉｃら、２０
１０年）。

細菌におけるアルギニン生合成を調節する遺伝子は、染色体にわたって散在しており、
単一リプレッサーにより制御される複数のオペロンに組織化され、これは、Ｍａａｓおよ
びＣｌａｒｋ（１９６４年）により「レギュロン」と名付けられた。各オペロンは、プロ
モーターと重複し、リプレッサータンパク質が結合しているＡＲＧボックスと呼ばれる、
少なくとも１つの１８ヌクレオチドの不完全回文構造配列を含む調節領域により調節され
る（Ｔｉａｎら、１９９２年；Ｔｉａｎら、１９９４年）。ａｒｇＲ遺伝子は、１つまた
は複数のＡＲＧボックスに結合している、リプレッサータンパク質をコードする（Ｌｉｍ
ら、１９８７年）。アルギニンは、アルギニンリプレッサーを活性化する共リプレッサー
として機能する。各オペロンを調節するＡＲＧボックスは、同一でないことがあり、共通
ＡＲＧボックス配列は、^Ａ／_ＴｎＴＧＡＡＴ^Ａ／_Ｔ ^Ａ／_Ｔ ^Ｔ／_Ａ ^Ｔ／_ＡＡＴＴＣＡｎ^Ｔ／
_Ａである（Ｍａａｓ、１９９４年）。さらに、ａｒｇＲの調節領域は、２つのプロモータ
ーを含み、そのうちの１つは、２つのＡＲＧボックスと重複し、自己制御性である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含み、
同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物、例
えば、シトロリンを産生する。突然変異アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成経路
におけるグルタミン酸をアルギニンに変換することに関与する酵素をコードするオペロン
のうちの１つまたは複数の、ＡＲＧボックスへのＡｒｇＲの結合および／またはＮ−アセ
チルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニンの結合を介した、アルギニン媒介抑制を低
減または妨げ、それによりアルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増大させる１
つまたは複数の核酸突然変異を含む。

代替実施形態では、細菌を、他の代謝経路、例えば、ヒスチジン生合成経路、メチオニ
ン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路およ
びトリプトファン生合成経路を介して過剰のアンモニアを消費するように遺伝子操作を施
す。本明細書で使用する場合、「アンモニア変換回路」は、過剰のアンモニアを消費し、
かつ／または減少させることができる代謝経路を意味する。

ヒスチジン生合成経路
ヒスチジン生合成は、例えば、大腸菌における単一オペロン内にある８つの遺伝子によ
り行われる。該オペロンの８つの遺伝子のうちの３つ（ｈｉｓＤ、ｈｉｓＢおよびｈｉｓ
Ｉ）は、二機能性酵素をコードし、２つ（ｈｉｓＨおよびｈｉｓＦ）は、一緒に１つの酵
素を形成して、合計１０酵素反応の１つのステップを触媒するポリペプチド鎖をコードす
る（Ａｌｉｆａｎｏら、１９９６年）。ｈｉｓＧ遺伝子の産物であるＡＴＰホスホリボシ
ルトランスフェラーゼは、ヒスチジンによりタンパク質レベルで阻害される。いくつかの
実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗性ｈｉｓＧを含む。細菌
は、当技術分野で公知の技術を用いて突然変異を起こさせ、かつ／またはフィードバック
抵抗性ｈｉｓＧ突然変異体についてスクリーニングすることができる。フィードバック抵
抗性ｈｉｓＧを含むように操作された細菌は、ヒスチジンの産生のレベルの上昇を示し、
ひいてはアンモニアの消費を増加させ、高アンモニア血を低下させることとなる。あるい
は、ヒスチジン生合成に必要な１つまたは複数の遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなど
の、誘導性プロモーターの制御下におき、律速酵素の産生の増大を可能にし得る。ヒスチ
ジン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加さ
せることができる。

メチオニン生合成経路
細菌のメチオニンレギュロンは、ホモセリンからのメチオニンの３ステップ合成（すな
わち、アシル化、スルフリル化およびメチル化）を制御する。ｍｅｔＪ遺伝子は、メチオ
ニンまたはその誘導体と結合した場合、メチオニンレギュロン内の遺伝子の転写レベルで
の抑制をもたらす調節タンパク質をコードする（Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓら、１９８４
年；Ｓｈｏｅｍａｎら、１９８５年）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細
菌は、ｍｅｔＪ遺伝子の欠失、破壊または突然変異を含む。ｍｅｔＪ遺伝子を欠失する、
破壊または突然変異させるように操作された細菌は、メチオニンの産生のレベルの上昇を
有し、ひいてはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させる。メチオニン生合
成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させること
ができる。

リシン生合成経路
微生物は、２つの経路の１つによりリシンを合成する。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）
経路を用いて、アスパラギン酸およびピルビン酸からリシンを合成し（Ｄｏｇｏｖｓｋｉ
ら、２０１２年）、アミノアジピン酸経路を用いて、アルファ−ケトグルタル酸およびア
セチル補酵素Ａからリシンを合成する。ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）
は、ＤＡＰ経路の第１のステップを触媒し、リシンによるフィードバック阻害を受ける（
Ｌｉｕら、２０１０年；Ｒｅｂｏｕｌら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、本発
明の遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗性ＤＨＤＰＳを含む。フィードバック抵抗性
ＤＨＤＰＳを含むように操作された細菌は、ヒスチジン産生のレベルの上昇を示し、ひい
てはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させる。あるいは、リシン生合成に
必要な１つまたは複数の遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーター
の制御下におくことによって、リシンの産生を最適化することができる可能性がある。リ
シン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加さ
せることができる。

アスパラギン生合成経路
アスパラギンは、それぞれオキサロ酢酸トランスアミナーゼおよびアスパラギンシンテ
ターゼ酵素によりオキサロ酢酸およびアスパラギン酸から直接合成する。この経路の第２
のステップにおいて、Ｌ−グルタミンまたはアンモニアがアミノ基ドナーとしての役割を
果たす。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の
非改変細菌と比較してアスパラギンを過剰産生し、それにより過剰のアンモニアを消費し
、高アンモニア血を低下させる。あるいは、これらの遺伝子の１つまたは両方をＦＮＲ誘
導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下におくことによって、アスパラギ
ン合成を最適化することができる。アスパラギン生合成経路の任意の他の適切な改変（複
数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。

グルタミン生合成経路
アンモニアおよびオキソグルタル酸からのグルタミンおよびグルタミン酸の合成は、３
つの酵素により強固に調節される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、オキソグルタル酸
の還元的アミノ化を触媒して、単一ステップでグルタミン酸を生成させる。グルタミンシ
ンテターゼは、グルタミン酸およびアンモニアのＡＴＰ依存性縮合を触媒して、グルタミ
ンを形成させる（Ｌｏｄｅｉｒｏら、２００８年）。グルタミンシンテターゼはまた、サ
イクル反応においてグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミ
ン酸シンターゼとしても公知）とともに作用して、グルタミンおよびオキソグルタル酸か
らグルタミン酸を生成させる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、同
じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較してグルタミンシンテターゼを高いレベルで発現
する。グルタミンシンテターゼの発現の増大を示すように操作された細菌は、高いレベル
のグルタミン産生を有し、ひいてはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させ
る。あるいは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはグルタミン−オキソグルタ
ル酸アミノトランスフェラーゼの発現を改変して、アンモニア消費を促進することができ
る。グルタミンシンテターゼの産生が窒素により転写レベルで調節される（Ｆｅｎｇら、
１９９２年；ｖａｎ Ｈｅｅｓｗｉｊｋら、２０１３年）ので、グルタミンシンテターゼ
遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、異なる誘導性プロモーターの制御下において
用いて、グルタミンの産生を改善することもできる。グルタミンおよびグルタミン酸生合
成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させること
ができる。

トリプトファン生合成経路
大部分の細菌において、コリスミ酸前駆体からのトリプトファンの合成に必要な遺伝子
は、単一転写単位、ｔｒｐオペロンとして組織化されている。ｔｒｐオペロンは、高レベ
ルのトリプトファンが存在する場合に、トリプトファンリプレッサー（ＴｒｐＲ）により
阻害される単一プロモーターの制御下にある。ｔｒｐオペロンの転写は、高レベルの荷電
トリプトファンｔＲＮＡの存在下でも終結され得る。いくつかの実施形態では、本発明の
遺伝子操作細菌は、ｔｒｐＲ遺伝子の欠失、破壊または突然変異を含む。ｔｒｐＲ遺伝子
の欠失、破壊または突然変異、および結果として生じるＴｒｐＲ機能の不活性化は、トリ
プトファンの産生およびアンモニアの消費の両方のレベルの上昇をもたらし得る。あるい
は、トリプトファン生合成に必要な１つまたは複数の酵素をＦＮＲ誘導性プロモーターな
どの、誘導性プロモーターの制御下におくことができる可能性がある。トリプトファン生
合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させるこ
とができる。

突然変異アルギニンレギュロンを含む操作細菌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路を含み、過剰のア
ンモニアを減少させることができる。より具体的な態様では、遺伝子操作細菌は、アルギ
ニン生合成酵素（複数可）をコードする１つまたは複数のオペロンが活性化されて、同じ
条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンまたは中間副産物、例えば、シトル
リンを産生する突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子
操作細菌は、アルギニンを過剰産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
シトルリンを過剰産生し、これは、さらに有益であり得る。その理由は、シトルリンが現
在、特定の尿素回路異常症の治療薬として使用されているからである（国立尿素回路異常
症財団）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書に記載の中間体のいず
れかのような、アルギニン生合成経路における別の中間副産物を過剰産生する。いくつか
の実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より多くの
アルギニン、シトルリンおよび／または他の中間副産物を産生することによって過剰のア
ンモニアを消費する。尿素回路異常症および肝性脳症を含む、高アンモニア血症に関連す
る状態を治療するために、アルギニンおよび／または中間副産物生合成の増強を用いて、
体内の過剰の窒素を非毒性分子に組み込むことができる。

当業者は、オペロン内のアルギニン生合成遺伝子の構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）
が、細菌の種、菌株および亜型、例えば、大腸菌Ｋ１２株における二極ａｒｇＥＣＢＨ、
枯草菌におけるａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦおよびＬ．プランタルム（Ｌ．
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における二極ｃａｒＡＢ−ａｒｇＣＪＢＤＦにわたって異なるこ
とを理解するであろう。種々の細菌のオペロン構成の非限定的な例を表２に示す（いくつ
かの例では、遺伝子は、推測であり、かつ／または大腸菌における公知の配列との配列相
同性により同定されている；いくつかの例では、アルギニンレギュロンにおける遺伝子の
すべてが公知かつ／または下に示されているとは限らない）。特定の例において、アルギ
ニン生合成酵素は、細菌の種、菌株および亜型にわたって異なる。

各オペロンは、前記オペロンにおけるアルギニン生合成遺伝子の抑制および発現を制御
する、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む調節
領域により調節される。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路における
グルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物に変換することに関与する酵素をコ
ードするオペロンのうちの１つまたは複数のアルギニン媒介抑制を低減または消失させる
１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。アルギニン媒介抑制
を低減または消失させることは、ＡｒｇＲリプレッサー結合（例えば、アルギニンリプレ
ッサーを突然変異させるもしくは欠失させることにより、またはアルギニン生合成酵素を
コードするオペロンのそれぞれに対する少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させ
ることにより）、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニン
の結合（例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ
突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを産生するためにＮ−アセチルグルタミン酸シンテ
ターゼを突然変異させることにより）を低減または消失させることによって達成すること
ができる。

ＡＲＧボックス
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグル
タミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンア
ミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラ
ーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイル
リン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲ
Ｇボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロン
を含み、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物の生
合成を増強する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサー
機能が低下もしくは不活性化し、または遺伝子操作細菌がアルギニンリプレッサーを有さ
ず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失し）、レギュロンの抑制解除ならびに
アルギニンおよび／または中間副産物の生合成の増強がもたらされるように、１つもしく
は複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。これらの実施形態
のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチル
グルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒをさらに含み得る。したが
って、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素をコードする
オペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは
複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンおよびアルギニンフィードバッ
ク抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含
む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレ
ッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然
変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例え
ば、ａｒｇＡ^ｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくと
も１つのＡＲＧボックスにおける１つもしくは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アル
ギニンレギュロンおよび／または突然変異もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、そ
れにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物生合成を増強す
るように、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコー
ドし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ
、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニ
チントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リア
ーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテター
ゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の各ＡＲＧボックスにおける１つまたは
複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオ
ペロンのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲに結合する能力を維持し、それにより、シトルリン
生合成を駆動する。例えば、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオ
ペロンの調節領域は、構成的であり、それにより、アルギニン生合成を駆動し得る。代替
実施形態では、１つまたは複数の代替オペロンの調節領域は、構成的であり得る。しかし
、特定の細菌において、複数の酵素をコードする遺伝子は、二極オペロンにまたは共有調
節領域の制御のもとに組織化することができ、これらの場合、活性調節領域を構成的に操
作するために調節領域をデコンボリュートする（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）必要があり得
る。例えば、大腸菌Ｋ１２およびニッスルにおいて、ａｒｇＥおよび／またはａｒｇＣＢ
Ｈの構成的な型を得るために、ａｒｇＥおよびａｒｇＣＢＨを２つの二極オペロンに組織
化し、ａｒｇＥＣＢＨおよびそれらの調節領域をデコンボリュートすることができる。

いくつかの実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンに
おけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる
。いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロ
ンにおけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失さ
せる。いくつかの実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む各オペロンにおけるすべ
てのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。いくつか
の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする各オペロンにおけるすべてのＡＲＧ
ボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、そ
れにより、レギュロンを活性化し、シトルリン生合成を増強するように、アルギニンフィ
ードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、ＡｒｇＲ抑制性調節領域により
駆動されるアルギニノコハク酸シンターゼをコードし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナー
ゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフ
ェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニ
ノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼお
よび任意選択で、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンの
それぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アル
ギニンレギュロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、シトルリンを産生することが
できる遺伝子操作細菌は、とりわけ好都合である。その理由は、シトルリンは、特定の尿
素回路異常症の治療用の治療上有効な栄養補助食品としてさらに役割を果たすからである
（国立尿素回路異常症財団）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、そ
れにより、レギュロンを活性化し、アルギニン生合成を増強するように、アルギニンフィ
ードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、構成的プロモーターにより駆動
されるアルギニノコハク酸シンターゼをコードし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、
Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラ
ーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコ
ハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび任意選択で、野生型Ｎ−アセチル
グルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける
１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンおよびフ
ィードバック抵抗性ＡｒｇＡを含み、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現す
る場合、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副
産物を産生することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、突然変異アルギニ
ンレギュロンおよび／またはフィードバック抵抗性ＡｒｇＡは、細菌染色体の１つもしく
は複数の組込み部位に組み込むことができるかまたは１つもしくは複数のプラスミド上に
存在していてもよい。

アルギニンリプレッサー結合部位（ＡＲＧボックス）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンレギュロンが活性化され、ア
ルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトルリンの生合成が増強されるように、
アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン
酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチ
ナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニ
ノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの
１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変
異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトラ
ンスフェラーゼをコードするオペロンおよび前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボッ
クスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。１つまたは複数の核酸突然変異は、
同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲ
の結合と比較して、当ＡＲＧボックスへのおよびオペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合
が低減または消失するように、回文構造ＡＲＧボックス配列の破壊をもたらす。いくつか
の実施形態では、ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化およびヒドロキシルラジカル攻撃から
保護される核酸は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。いくつ
かの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、上述のアルギニン生合成酵素をコ
ードするオペロンのそれぞれの１つまたは複数のＡＲＧボックスにおける少なくとも３つ
の核酸突然変異を含む。ＡＲＧボックスは、プロモーターと重複し、突然変異アルギニン
レギュロンにおいて、突然変異プロモーター領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比は、野性型プロモー
ター領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比と１０％以下異なる（表３）。プロモーターは、ＲＮＡポリ
メラーゼが転写を駆動するのに十分な親和性で結合するように非突然変異プロモーターと
の十分に高い相同性を保持している。

大腸菌ニッスルにおける各アルギニン生合成オペロンのＡＲＧボックスを含む野生型ゲ
ノム配列およびその突然変異体を表３に示す。例示的野生型配列については、ＡＲＧボッ
クスを斜体で示し、各遺伝子の開始コドンは囲み線付きである。ＲＮＡポリメラーゼ結合
部位は、下線付きである（Ｃｕｎｉｎ、１９８３年；Ｍａａｓ、１９９４年）。いくつか
の実施形態では、下線付きの配列は、変化していない。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化
から保護される塩基は網掛け付きであり、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカル攻撃か
ら保護される塩基は太字である（Ｃｈａｒｌｉｅｒら、１９９２年）。網掛け付きの塩基
および太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。

いくつかの実施形態では、複数のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これら
の実施形態の一態様では、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合の必要な低減をもたら
すためにオペロンにおけるＡＲＧボックスのうちの少なくとも１つを突然変異させる。こ
れらの実施形態の代替態様では、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合の必要な低減を
もたらすためにオペロンにおけるＡＲＧボックスのそれぞれを突然変異させる。当業者は
、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数が各細菌で異なり、ＡＲＧボックスのヌクレオチ
ド配列が各オペロンごとに異なり得ることを理解するであろう。例えば、大腸菌ニッスル
におけるｃａｒＡＢオペロンは、２つのＡＲＧボックスを含み、１つまたは両方のＡＲＧ
ボックス配列を突然変異させることができる。大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＧオペロン
は、３つのＡＲＧボックスを含み、１つ、２つまたは３つのＡＲＧボックス配列を突然変
異させる、破壊する、または欠失させることができる。いくつかの実施形態では、３つす
べてのＡＲＧボックス配列を突然変異させ、破壊し、または欠失させ、構成的プロモータ
ー、例えば、ＢＢａ＿Ｊ２３１００をａｒｇＧオペロンの調節領域に挿入する。当業者は
、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数が各細菌で異なり、ＡＲＧボックスのヌクレオチ
ド配列が各オペロンごとに異なり得ることを理解するであろう。

大腸菌ニッスルにおける構成的に発現するａｒｇＧ構築物の例示的実施形態を表４に示
す。表４に大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＧ遺伝子の調節領域および５’部分の野生型ゲ
ノム配列ならびにその構成的突然変異体を示す。各配列のプロモーター領域は下線付きで
あり、ａｒｇＧ遺伝子の５’部分は囲み線付きである。野生型配列では、ＡｒｇＲ結合部
位は大文字の下線付きである。突然変異配列では、５’非翻訳領域は大文字の下線付きで
ある。構成的プロモーターの制御下でａｒｇＧを発現する細菌は、アルギニンを産生する
ことができる。野生型ＡｒｇＲ抑制性プロモーターの制御下でａｒｇＧを発現する細菌は
、シトルリンを産生することができる。大腸菌ニッスルの野生型ａｒｇＧオペロンおよび
その構成的に発現する突然変異体のマップを図１２に示す。

いくつかの実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスまたは調節領域に対する
ＡｒｇＲの結合親和性は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスお
よび調節領域に対するＡｒｇＲの結合親和性より少なくとも約５０％低い、少なくとも約
６０％低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低
い、または少なくとも約９５％低い。いくつかの実施形態では、突然変異ＡＲＧボックス
および調節領域へのＡｒｇＲの結合の低減は、関連オペロンにおける遺伝子（複数可）の
ｍＲＮＡ発現を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１
５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、
少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、
少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、
少なくとも１０００倍、または少なくとも１５００倍増加させる。

いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝
子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。アルギニン生合成遺
伝子、例えば、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇ
Ｇ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢに特異的プライマーを当技
術分野で公知の方法（Ｆｒａｇａら、２００８年）に従って設計し、試料中のｍＲＮＡを
検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇ ｍＲＮＡを含む
可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応
混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物
を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および
冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００
℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。
特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所
定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつある
アンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数
は、閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）である。各試料について少なくとも１つのＣ_Ｔ結果を発生させ
、Ｃ_Ｔ結果（複数可）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定す
ることができる。

いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、
Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラ
ーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコ
ハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼを
コードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける
１つまたは複数の核酸突然変異を含む遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗
性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒをさらに含
む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、なら
びにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミル
リン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオル
ニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アル
ギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリ
ン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の各ＡＲＧボックスにおけ
る１つまたは複数の核酸突然変異を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、Ａｒ
ｇＲ抑制性調節領域により駆動されるアルギノコハク酸シンターゼ、ならびにアルギニン
生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクタ
ーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オ
ルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルト
ランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのそれぞれ
の各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態で
は、細菌は、シトルリンを産生することができる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、構成
的プロモーターから発現するアルギノコハク酸シンターゼ、ならびにアルギニン生合成酵
素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、ア
セチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチン
トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ
、オルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコード
するオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含
む。これらの実施形態では、細菌は、アルギニンを産生することができる。

表３に１つまたは複数の核酸突然変異がアルギニンオペロンのそれぞれのアルギニン媒
介性抑制を低減または消失させる突然変異構築物の例を示す。突然変異構築物は、酸素レ
ベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターにより駆動されるフィードバック
抵抗型のＡｒｇＡを含む。各突然変異アルギニンレギュロンは、ＡｒｇＲ結合が低減また
は消失し、それにより、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成が増強されるよう
に、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、
アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチ
ントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアー
ゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおけ
る１つまたは複数の核酸突然変異を含む。突然変異アルギニンレギュロン構築物の非限定
的な例を表５に示す。

突然変異は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、アル
ギニンレギュロンは、単一リプレッサータンパク質により調節される。細菌の特定の種、
菌株および／または亜型において、アルギニンレギュロンが２つの推定上のリプレッサー
により調節され得ることが提案された（Ｎｉｃｏｌｏｆｆら、２００４年）。したがって
、特定の実施形態では、本発明のアルギニンレギュロンは、複数のリプレッサータンパク
質により調節される。

特定の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、遺伝子操作細菌の１つの種、
菌株または亜型において発現する。代替実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは
、遺伝子操作細菌の２つまたはそれ以上の種、菌株または亜型において発現する。

アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）
本発明の遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路におけるグルタミン酸をアルギニン
および／または中間副産物に変換することに関与する酵素をコードするオペロンのうちの
１つまたは複数のアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然
変異を含むアルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、アルギニン媒介抑制
を低減または消失は、ＡｒｇＲレプレッサー結合を低減もしくは消失させることにより、
例えば、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくと
も１つのＡＲＧボックスを突然変異させることにより（上で述べたように）またはアルギ
ニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより（ここで述べるように）かつ
／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニンの結合を低減もしくは消
失させることにより（例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン
酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを生じるようにＮ−アセチルグルタミ
ン酸シンテターゼを突然変異させることにより）達成することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、機能し得るＡｒｇＲリプレ
ッサーを欠いており、したがって、アルギニン生合成オペロンのそれぞれのＡｒｇＲリプ
レッサー媒介転写抑制が低減または消失している。いくつかの実施形態では、操作細菌は
、アルギニンリプレッサー機能が低下するまたは不活性であるように１つまたは複数の核
酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺
伝子が欠失した）、レギュロンの活性化ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の
生合成の増強がもたらされる。いくつかの実施形態では、対応する野生型細菌に通常存在
する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーは、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入ま
たは置換によって独立に欠失するかまたは不活性にされる。いくつかの実施形態では、対
応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが欠失している。

いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一リプレッサータンパク質によ
り調節される。細菌の特定の種、菌株および／または亜型において、アルギニンレギュロ
ンが２つの異なる推定上のリプレッサーにより調節され得ることが提案された（Ｎｉｃｏ
ｌｏｆｆら、２００４年）。したがって、特定の実施形態では、それぞれが異なるアミノ
酸配列を含む２つの異なるＡｒｇＲタンパク質は、遺伝子操作細菌において突然変異また
は欠失している。

いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーを含む遺伝子改
変細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変
異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌
は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡを含み、機能性アルギニンリプレッサーを欠き、ア
ルギニンを産生することができる。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、機能性Ａｒ
ｇＧをさらに欠き、シトルリンを産生することができる。いくつかの実施形態では、ａｒ
ｇＲ遺伝子を遺伝子操作細菌において欠失させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＲ遺
伝子を突然変異させて、ＡｒｇＲ機能を不活性化する。いくつかの実施形態では、ａｒｇ
Ｇ遺伝子を遺伝子操作細菌において欠失させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＧ遺伝
子を突然変異させて、ＡｒｇＲ機能を不活性化する。いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲを欠失した。いくつかの実施形態では、遺伝
子操作細菌は、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲを欠失し、ａｒｇＧを欠失した。いくつ
かの実施形態では、いくつかの実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧ
が細菌ゲノムから欠失し、ａｒｇＡ^ｆｂｒがプラスミドに存在する。いくつかの実施形態
では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧが細菌ゲノムから欠失し、ａｒｇＡ^ｆｂ
ｒが染色体に組み込まれる。１つの特定の実施形態では、遺伝子改変細菌は、染色体に組
み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ゲノムＡｒｇＲを欠失し、ゲノムａｒｇＧを欠失した
。他の特定の実施形態では、遺伝子改変細菌は、プラスミド上に存在するａｒｇＡ^ｆｂｒ
を含み、ゲノムＡｒｇＲを欠失し、ゲノムａｒｇＧを欠失した。ａｒｇＧが欠失している
実施形態のいずれかにおいて、アルギニンではなく、シトルリンが産生される。

いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡが発現する条件下で、本発
明の遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して少なくとも約１．
５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０
倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２
００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なく
とも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍
、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のアルギニン、シトルリン、
他の中間副産物および／またはオペロンにおける遺伝子（複数可）の転写物を産生する。

いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝
子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。アルギニン生合成遺
伝子、例えば、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇ
Ｇ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢに特異的プライマーを当技
術分野で公知の方法（Ｆｒａｇａら、２００８年）に従って設計し、試料中のｍＲＮＡを
検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇ ｍＲＮＡを含む
可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応
混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物
を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および
冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００
℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。
特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所
定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつある
アンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数
は、閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）である。各試料について少なくとも１つのＣ_Ｔ結果を発生させ
、Ｃ_Ｔ結果（複数可）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定す
ることができる。

ＡｒｇＲが突然変異しているこれらの実施形態のいずれかにおいて、突然変異ＡｒｇＲ
および／またはフィードバック抵抗性ＡｒｇＡは、１つもしくは複数の組込み部位におい
て細菌染色体に組み込まれるかまたは１つもしくは複数のプラスミド上に存在し得る。

フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−ア
セチルグルタミン酸シンターゼ変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡを含む突然変異
アルギニンレギュロンを含み、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現する場合
、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を
産生することができる。アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼタンパク質（ａｒｇＡ^ｆｂｒ）は、フィードバック感受性親系統の酵素よりＬ−
アルギニンに対して著しく感受性が低い（例えば、Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９７５年；Ｒ
ａｊａｇｏｐａｌら、１９９８年参照）。フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラ
スミドまたは染色体に存在し得る。いくつかの実施形態では、プラスミドからの発現は、
ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現を増大させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、染色体
からの発現は、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現の安定性を向上させるのに有用であり得る。

いくつかの実施形態では、アルギニン生合成経路に関与する述べた突然変異配列（例え
ば、ＡｒｇＲ、ａｒｇＡ^ｆｂｒ、Ａｒｇボックス配列）のいずれかを細菌染色体の１つま
たは複数の組込み部位に組み込む。例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチ
ルグルタミン酸シンターゼをコードする配列の１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組
み込むことができる。染色体に組み込まれたアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチ
ルグルタミン酸シンターゼの複数のコピーを有することは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シ
ンターゼのより多くの産生が可能になり、発現のレベルの微調整も可能になる。或いは、
アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼに加えて、輸送体
またはキルスイッチ回路のいずれかのような、本明細書に記載の異なる回路を、複数の異
なる機能を果たす１つまたは複数の異なる組込み部位において細菌染色体に組み込むこと
ができよう。複数の異なるフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
タンパク質は、当技術分野で公知であり、遺伝子操作細菌において組み合わせることがで
きる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下
に発現させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、外因性環境条件によ
り誘導されるプロモーターの制御下に発現させる。いくつかの実施形態では、外因性環境
条件は、哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条
件は、健常または疾患状態の哺乳動物の消化管に固有である分子または代謝物、例えば、
プロピオン酸である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物消化管の環
境のような、低酸素または嫌気的条件である。

細菌は、酸素レベルを検知することができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝
達経路は、異なる酸素レベルにより誘発され、異なる速度論で発生し得る。酸素レベル依
存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル検知転写因子が結合することができる
核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活
性化する。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、酸素レベル依存性プロモーターの
制御下にある。より具体的な態様では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、哺乳動物消化管の環境
のような、低酸素または嫌気的環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制
御下にある。

特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮ
Ｒ）プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好
気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅ
ｎら、１９９７年）。嫌気的状態では、ＦＮＲは、嫌気性増殖への適応に関与する数百も
の遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気的状態では、ＦＮ
Ｒは、酸素によって二量体化を妨げられ、不活性である。代替実施形態では、遺伝子操作
細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーターの制御下、例えば、アルギニンデイミニアー
ゼおよび硝酸還元ＡＮＲプロモーター（Ｒａｙら、１９９７年）、異化型硝酸呼吸調節因
子ＤＮＲプロモーター（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）の嫌気的調節下で発現するａｒｇＡ
^ｆｂｒを含む。これらの実施形態では、アルギニン生合成経路は、消化管内のような、低
酸素または嫌気的環境下で特に活性化される。

緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）では、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元
（ＡＮＲ）転写調節因子の嫌気的制御は、「酸素制限または嫌気的条件下で誘導性である
生理学的機能の発現のために必要である」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅ
ｒｓ、１９９１年）。緑膿菌ＡＮＲは、大腸菌ＦＮＲと相同であり、「共通ＦＮＲ部位（
ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）は、ＡＮＲおよびＦＮＲにより効率的に認識された」（
Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気的状態では、ＡＮＲは、嫌気
性増殖への適応に関与する多くの遺伝子を活性化する。好気的状態では、ＡＮＲは、不活
性である。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シ
ュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびシュード
モナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）はすべて、ＡＮＲ
の機能性類似体を有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲにより制御さ
れるプロモーターは、当技術分野で公知であり、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロ
モーターなどがある（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年参照）。

ＦＮＲファミリーは、「緑膿菌の嫌気性硝酸呼吸」のためにＡＮＲとの結合に必要であ
る転写調節因子である（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）、異化型硝酸呼吸調節因子（
ＤＮＲ）も含む（Ａｒａｉら、１９９５年）。特定の遺伝子について、ＦＮＲ結合モチー
フは、「おそらくＤＮＲのみによって認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）
。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子
を用いることができる。非限定的な例は、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／
ＣおよびＡｉｒＳＲならびに当技術分野で公知のその他を含む。

ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野で公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモータ
ー配列（複数可）を本発明の遺伝子操作細菌に用いることができる。任意の適切なＦＮＲ
プロモーター（複数可）を任意の適切なａｒｇＡ^ｆｂｒと組み合わせることができる（例
えば、例示的ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列を表７に示す）。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を
表６に示す。表６にＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的調節領域配列の核酸配列
を示す。下線付きの配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クロ
ーニングに用いられる制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細
菌は、配列番号１８、配列番号１９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号２０）、ｎｉｒ
Ｂ２プロモーター（配列番号２１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号２２）、ｙｄｆ
Ｚプロモーター（配列番号２３）、強リボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモータ
ー（配列番号２４）、強リボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号
２５）、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配
列番号２６またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２７）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎ
ｉｒＢプロモーター（配列番号２８）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番
号２９）のうちの１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のＤＮＡ配列またはそれらの機能性
断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。

他の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒは、転写活性化因子、例えば、ＣＲＰの結合部位に
融合した酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現する。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体
タンパク質または異化代謝産物活性化タンパク質もしくはＣＡＰ）は、グルコースのよう
な迅速代謝性炭水化物が存在する場合にさほど有益でない炭素源の取込み、代謝および同
化に関与する遺伝子を抑制することによって細菌における調節における主要な役割を果た
す（Ｗｕら、２０１５年）。このグルコースに対する選択は、グルコース抑制ならびに炭
素異化代謝産物抑制と呼ばれた（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳ
ｔｕｌｋｅ、２００８年）。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現は、ＣＲＰ
結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形
態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモーターにより
制御される。これらの実施形態では、グルコースが環境中に存在しない場合、環状ＡＭＰ
がＣＲＰに結合する。この結合が、ＣＲＰにおける立体配座の変化を引き起こし、ＣＲＰ
がその結合部位に強固に結合することを可能にする。ＣＲＰの結合が次に、直接的なタン
パク質間相互作用によるＲＮＡポリメラーゼのＦＮＲプロモーターへの動員をもたらすこ
とによってａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の転写を活性化する。グルコースの存在下では、環状Ａ
ＭＰは、ＣＲＰに結合せず、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の転写が抑制される。いくつかの実施
形態では、転写活性化因子の結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター（例えば
、ＦＮＲプロモーター）を用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地にグルコースを
加えることにより、十分な量のグルコースが存在する場合にａｒｇＡ^ｆｂｒが嫌気的条件
下で発現しないことを保証する。

いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒは、環境中、例えば、哺乳動物消化管内の特
定の分子または代謝物に応答性である誘導性プロモーターの制御下で発現する。例えば、
短鎖脂肪酸プロピオネートは、消化管に局在する主要な微生物発酵代謝物である（Ｈｏｓ
ｓｅｉｎｉら、２０１１年）。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現は、プロピオ
ン酸誘導性プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺
伝子発現は、哺乳動物消化管内のプロピオン酸の存在によって活性化されるプロピオン酸
誘導性プロモーターの制御下にある。健常および／または疾患状態の、哺乳動物消化管内
に見いだされる任意の分子または代謝物を用いて、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現を誘導することが
できる。非限定的な例は、プロピオネート、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよ
びＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および
抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、ト
ランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンを含
む。代替実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現は、アラビノース糖の存在下で活性化
される、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの制御下にある（例えば、図１３参照）。

肝性脳症（ＨＥ）および他の肝臓疾患または障害を有する対象は、それらの血液および
腸における高いアンモニアレベルをもたらす慢性肝損傷を有する。アンモニアに加えて、
これらの患者は、それらの血液および腸におけるビリルビン、アスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ
およびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原お
よび抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄
、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガン
のレベルの上昇も有する。これらのＨＥに関連する分子またはそれらの代謝物のうちの１
つに応答するプロモーターは、消化管内のａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を誘導するために遺伝子
操作細菌に用いることができる。これらのプロモーターは、非ＨＥ患者において誘導され
るとは予期されないものであろう。

いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、テトラサイクリンへの曝露により
誘導されるプロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ
遺伝子は、炎症または炎症反応への曝露により誘導されるプロモーター（例えば、ＲＮＳ
またはＲＯＳプロモーター）の制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆ
ｂｒ遺伝子は、アラビノースのような代謝物への曝露により誘導されるプロモーター（例
えば、ＡｒａＢＡＤプロモーター）の制御下で発現する。

いくつかの実施形態では、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操
作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を向上させることによって、当技術分野で公知の方
法により遺伝子発現をさらに最適化する。例示的ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列の核酸配列を表７に
示す。例示的ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列のポリペプチド配列を表８に示す。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３０の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３０のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３０と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３１のポリペプチド配列または
その機能性断片をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３
１またはその機能性断片に対する１つもしくは複数の同類アミノ酸置換を含む、ポリペプ
チドをコードするポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、配列番号３１またはその機能性断片のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なく
とも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相
同であるポリペプチド配列をコードする。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼの
アルギニンフィードバック阻害は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタ
ミン酸シンテターゼが活性である場合、同じ条件下の同じ亜型の細菌の野生型Ｎ−アセチ
ルグルタミン酸シンテターゼと比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少な
くとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％
減少する。

いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒを宿主細胞中で発現させることができ、宿主
細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例え
ば、消化管内で、生存し、かつ／または増殖することができるように、遺伝子操作細菌は
、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いく
つかの実施形態では、細菌は、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子の複数のコピーを含
み得る。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を低コピープラ
スミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性
を向上させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非
誘導性条件下での漏出性発現を低下させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では
、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を高コピープラスミド上で発現させる。いくつか
の実施形態では、高コピープラスミドは、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現を増加させるのに有用であ
り得る。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を染色体上で発
現させる。

いくつかの実施形態では、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコ
ピーを産生する回路または複数の異なる機能を果たす回路を含むように細菌に遺伝子操作
を施す。挿入部位の例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、
ｄａｐＡ、ｃｅａおよび図１８に示すその他を含むが、これらに限定されない。例えば、
遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒ
ａＣ／ＢＡＤおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの４つのコピーを含み得る。あ
るいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／
ＩおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの３つのコピーならびに３つの異なる挿入
部位ｄａｐＡ、ｃｅａおよびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された、３つの突然変異アルギニン
レギュロン、例えば、シトルリンを産生する２つおよびアルギニンを産生する１つを含み
得る。

いくつかの実施形態では、プラスミドまたは染色体は、野生型ＡｒｇＲ結合部位、例え
ば、ＡＲＧボックスも含む。いくつかの例では、機能性ＡｒｇＲの存在および／または集
積は、遺伝子発現のオフターゲット変化をもたらし得る、ＡＲＧボックス以外の部位にお
けるオフターゲット結合をもたらし得る。機能性ＡＲＧボックスをさらに含むプラスミド
または染色体を用いて、すなわち、ＡｒｇＲシンクとして作用することによって、オフタ
ーゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させることができる。いくつかの実施形態では、
プラスミドまたは染色体は、機能性ＡｒｇＲ結合部位を含まず、例えば、プラスミドまた
は染色体は、改変ＡＲＧボックスを含むかまたはＡＲＧボックスを含まない。

いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に存
在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いく
つかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染色体に存在し、低酸素
または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形
態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に存在し、哺乳動物消化
管に特異的である分子または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する
。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染色体上に存在し
、哺乳動物消化管に特異的である分子または代謝物により誘導されるプロモーターに作動
可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染
色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に
連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミ
ド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連
結する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、対応する酸素レベル依存性プロモーター
に加えて、変異もしくは突然変異酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮ
ＲまたはＤＮＲを含む。変異もしくは突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、低酸素
または嫌気性環境中の作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形
態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を保持している。代替実施形態では
、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、野生型活性を低減または消
失させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化お
よびＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏ
ｒｅら、２００６年参照）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、低酸素または嫌気性環境中でアンモニア
を減少させ、かつ／または消費する異なる細菌種に由来する酸素レベル依存性転写調節因
子を含む。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌に由来
するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）。いくつ
かの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型活性を保
持する。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、
野生型活性を低減または消失させる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、例えば
、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒ、ならびに上で述べた１つまた
は複数のＡＲＧボックス突然変異を含む突然変異調節領域の制御下で発現する野生型ａｒ
ｇＡを含む。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、
例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、野生型ａｒｇＡ
を含まない。他の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、酸素レベル依存性プ
ロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、Ａ
ＲＧボックス突然変異を含まない野生型ａｒｇＡをさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プラスミドおよび／または染色体からａ
ｒｇＡ^ｆｂｒを発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、構成的プ
ロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、誘
導性プロモーターの制御下で発現する。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、低酸
素または嫌気性環境中で活性化される酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプ
ロモーターの制御下で発現する。例示的ＦＮＲプロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列の核
酸配列を表９に示す。ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲み
線付きである。ＦＮＲプロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒプラスミドの核酸配列を表１０に
示し、ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲み線付きである。
表１１に例示的ｐＳＣ１０１プラスミドの核酸配列を示す。任意の適切なＦＮＲプロモー
ター（複数可）を任意の適切なフィードバック抵抗性ＡｒｇＡと組み合わせることができ
る。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を表６に示す。いくつかの実施形態では、本発明
の遺伝子操作細菌は、配列番号１６、配列番号１７、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号
１８）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１９）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号
２０）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号２１）、強リポソーム結合部位に融合したｎｉ
ｒＢプロモーター（配列番号２２）、強リポソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモー
ター（配列番号２３）、嫌気的に誘導された小ＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモ
ーター配列番号２４またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２５）、ｃｒｐ結合部位に融
合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２６）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ
（配列番号２７）のうちの１つまたは複数を含む。表１２に例示的ｆｎｒＳプロモーター
駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列の核酸配列を示す。ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、リボ
ソーム結合部位は網掛け付きであり、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲み線付きである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３２の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３２と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３２のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を
別とすれば、配列番号３２と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも
約９９％相同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３３の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３３と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３３のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を
別とすれば、配列番号３３と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも
約９９％相同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３５の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３５と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３５のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を
別とすれば、配列番号３５と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも
約９９％相同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、染色体に組み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを
含む。いくつかの実施形態では、組み込まれたｆｂｒＡｒｇＡは、ｆｎｒＳプロモーター
の制御下にある。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットも同じ部位に存在する
。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットは、存在しない。いくつかの実施形態
では、抗生物質耐性は、クロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物
質耐性は、カナマイシンである。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれたａｒｇ
Ａ^ｆｂｒを含む遺伝子操作細菌は、ｔｈｙＡ栄養要求体である。いくつかの実施形態では
、遺伝子操作細菌は、染色体に組み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異も
含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、
ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体に組み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、Ａ
ｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有し、ｔｈｙＡ栄養要求性を含む。他の
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体
に組み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失
を有し、ｔｈｙＡ栄養要求性を含み、抗生物質耐性カセットを含む。他の特定の実施形態
では、遺伝子操作細菌は、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体に組み込まれた
ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有し、ｔｈｙ
Ａ栄養要求性を含み、カナマイシン耐性カセットを含む。１つの特定の実施形態では、遺
伝子操作細菌は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５である。他の特定の実施形態では、遺伝子操作細
菌は、ＳＹＮ＿ＵＣＤ３０３である。

表１３に染色体に組み込まれているＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡ構築物の非限定的な例を
示す。

配列番号３６は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２に含まれてい
るような、ＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡおよびクロラムフェニコール耐性を含む。配列番号
３７は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０６、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０７
およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０９に含まれているような、ＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡおよびカ
ナマイシン耐性を含む。配列番号３８は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣ
Ｄ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０８、ＳＹＮＵＣＤ３１０に含まれているような、ＦＮＲＳ
−ｆｂｒＡｒｇＡを含み、抗生物質耐性を含まない。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３６の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３６のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３７と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３７の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３７と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３７のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３７と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３８の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号３８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３８のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３８と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

アルギニン異化
本発明を実施するうえでの重要な考慮すべき事柄は、アンモニアがアルギニンおよび／
またはシトルリン異化の副産物として過剰産生されないことを保証することである。尿素
回路の最終酵素ステップにおいて、アルギナーゼは、アルギニンのオルニチンおよび尿素
への加水分解開裂を触媒する（Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）。腸内細菌により産生され得
る、ウレアーゼは、尿素の二酸化炭素およびアンモニアへの開裂を触媒する（Ｓｕｍｍｅ
ｒｓｋｉｌｌ、１９６６年；Ａｏｙａｇｉら、１９６６年；Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）
。したがって、ウレアーゼ活性は、ヒト組織に対して有毒であり得るアンモニアを発生し
得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎａら、２０１２年）。大腸菌ニッスルを含む、いくつかの細菌に
おいて、ａｒｃＤ遺伝子は、アンモニアも放出し得る、アルギニン／オルニチン対向輸送
体をコードする（Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｕｖｅｎら、１９８４年；Ｇａｍｐｅｒら、１９９
１年；Ｍｅｎｇら、１９９２年）。

ＡｓｔＡは、アンモニアを放出する、コハク酸へのアルギニンの変換に関与する酵素で
ある。ＳｐｅＡは、さらに異化されてアンモニアを生成し得る、アグマチンへのアルギニ
ンの変換に関与する酵素である。したがって、いくつかの例において、アルギニンの分解
を防ぐことは、有益であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロ
ンを含む遺伝子操作細菌は、アルギニン異化を低減または消失させ、それにより、さらな
るアンモニアの産生を低減または消失させる突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態
では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｃＤ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の
実施形態では、ＡｒｃＤが欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
ＡｓｔＡ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ＡｓｔＡが
欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＳｐｅＡ活性を低減または
消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ＳｐｅＡが欠失している。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギナーゼ活性を低減または消失させる突然変異も
含む。特定の実施形態では、アルギナーゼが欠失している。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、ウレアーゼ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形
態では、ウレアーゼが欠失している。いくつかの実施形態では、アルギニン異化に関与す
る１つまたは複数の他の遺伝子が突然変異または欠失している。

他の高アンモニア血障害
肝性脳症（ＨＥ）は、患者における神経認知変化を特徴とし、生化学的撹乱が病因に関
連付けられた。具体的には、アンモニアレベルの上昇が疾患の病態生理に部分的に寄与し
ていると推測されている。高アンモニア血症に加えて、脳ＧＡＢＡのレベルおよびマンガ
ンレベルの上昇が認められ、臨床症状に寄与すると推測された。

いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作微生物、例えば、細菌およびウイルス
、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する疾患もしくは障害、例えば、肝
性脳症およびハンチントン病をモジュレートまたは治療する方法を提供する。遺伝子操作
細菌は、哺乳動物における過剰のアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、体内の過剰の窒素を非毒性分子、例えば、アルギニン、シ
トルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミンまたはトリプト
ファンに組み込むことによって過剰のアンモニアを減少させる。いくつかの実施形態では
、遺伝子操作細菌は、他の有毒または有害分子（複数可）、例えば、ＧＡＢＡ、マンガン
のレベルを低下させるための１つまたは複数の回路（遺伝子配列）をさらに含む。いくつ
かの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管バリア増強分子、例えば、酪酸、プロピオ
ン酸および酢酸のような短鎖脂肪酸を産生する１つまたは複数の回路をさらに含む。本開
示はまた、過剰のアンモニアならびに他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡおよびマンガン
を減少させるための組成物および治療方法を提供する。特定の態様では、本開示は、過剰
のアンモニアおよび他の有害な分子を減少させることができる遺伝子操作細菌を提供する
。特定の実施形態では、本開示は、過剰のアンモニアおよび他の有害な分子を減少させ、
消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸などの、１つまたは複数の治療用分子をさらに
産生することができる遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、
回路が誘導性プロモーター制御下にある過剰のアンモニアを減少させるための１つまたは
複数の回路を含む遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、回路
のうちの１つまたは複数が誘導性プロモーター制御下にある過剰のアンモニアを減少させ
るための１つまたは複数の回路および他の有害な分子を減少させるための１つまたは複数
の回路を含む遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、回路のう
ちの１つまたは複数および／または治療用分子が誘導性プロモーター制御下にある過剰の
アンモニアを減少させるための１つまたは複数の回路および他の有害な分子を減少させる
ための１つまたは複数の回路を含み、消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸などの、
１つまたは複数の治療用分子をさらに産生する遺伝子操作細菌を提供する。特定の態様で
は、本明細書で開示する組成物および方法は、過剰のアンモニアに関連する疾患もしくは
障害、例えば、肝性脳症もしくはハンチントン病、および／または肝性脳症もしくはハン
チントン病などの、過剰のアンモニアに関連する疾患もしくは障害に随伴する１つもしく
は複数の症状を治療するために用いることができる。

ＧＡＢＡの輸送および代謝
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、哺乳動物中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物
質である。ヒトにおいて、ＧＡＢＡは、リガンド開口型塩化物特異的イオンチャンネル複
合体の一部である、シナプス後ＧＡＢＡ_Ａ受容体を活性化する。シナプス後ニューロン上
のこの複合体の活性化により、塩化物イオンがニューロンに入り、抑制作用を及ぼすこと
が可能となる。そのようなＧＡＢＡ作動性神経伝達の変化は、てんかん（Ｊｏｎｅｓ−Ｄ
ａｖｉｓおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、２００３年）、ハンチントン病（Ｋｒｏｇｓｇａａ
ｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ、１９９２年）および肝性脳症（ＪｏｎｅｓおよびＢａｓｉｌｅ、１
９９７年）を含む、いくつかの神経障害の病態生理に関連付けられた。

ＧＡＢＡによりモジュレートされる脳内のニューロンは、抑制性ＧＡＢＡ作動性トーン
のもとにあると言われる。この抑制性トーンは、十分に強力な興奮性刺激が受容されるま
で、または抑制性トーンが別の方法で開放されるまで、ニューロン発火を妨げる。肝性脳
症におけるＧＡＢＡ作動性トーンの増大は、ガラクトサミン誘発性肝不全を有するウサギ
およびＧＡＢＡ_Ａ受容体のアロステリックモジュレーター（例えば、ペントバルビタール
、ジアゼパム）を投与したウサギにおける同様な視覚的応答パターン基づいて、１９８０
年代初頭に最初に記載された（ＪｏｎｅｓおよびＢａｓｉｌｅ、１９９７年）。ＧＡＢＡ
_Ａ受容体における高度に選択的なベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルに
より治療したＨＥ患者における臨床的改善は、これらの所見をさらに確認するものであっ
た（Ｂａｎｋｓｙら、１９８５年；Ｓｃｏｌｌｏ−ＬａｖｉｚｚａｒｉおよびＳｔｅｉｎ
ｍａｎｎ、１９８５年）。ＨＥにおけるＧＡＢＡ作動性トーンの増大は、それ以来、（１
）脳内のＧＡＢＡ濃度の上昇、（２）ＧＡＢＡ_Ａ受容体の完全性の変化、および／または
（３）ＧＡＢＡ_Ａ受容体の内因性モジュレーターの濃度の上昇（Ａｈｂｏｕｃｈａおよび
Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、２００４年）のうちの１つまたは複数の結果であると提案され
た。

大腸菌におけるＧＡＢＡの取込みは、膜電位により駆動され、膜輸送タンパク質Ｇａｂ
Ｐにより促進される（Ｌｉら、２００１年）。ＧａｂＰは、二次性能動輸送体の２つの最
大のファミリーの１つである、アミノ酸／ポリアミン／有機陽イオン（ＡＰＣ）輸送体ス
ーパーファミリーのメンバーである（Ｊａｃｋら、２０００年）。ｇａｂＰ遺伝子により
コードされる、ＧａｂＰタンパク質は、４６６アミノ酸および１２膜貫通アルファらせん
からなり、ＮおよびＣ末端の両方が細胞質ゾルに面している（ＨｕおよびＫｉｎｇ、１９
９８ａ）。ＧａｂＰ残基配列は、細菌から哺乳動物までのＡＰＣファミリーのメンバー間
で保存されている、共通両親媒性領域（ＣＡＲ）も含む（ＨｕおよびＫｉｎｇ、１９９８
ｂ）。細胞への侵入により、ＧＡＢＡがＧＡＢＡ α−ケトグルタル酸トランスアミナー
ゼ（ＧＳＳＴ）によりスクシニルセミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換される。コハク酸セミ
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）がＧＡＢＡ異化における第２の唯一の他の特異
的ステップである、スクシニルセミアルデヒドのコハク酸への酸化を触媒する（Ｄｏｖｅ
ｒおよびＨａｌｐｅｒｎ、１９７２年）。最終的に、コハク酸がクエン酸（ＴＣＡ）回路
の基質になる。

いくつかの実施形態では、細菌は、本明細書に記載の代謝経路、例えば、アルギニン生
合成経路、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラ
ギン生合成経路、グルタミン生合成経路またはトリプトファン生合成経路（「アンモニア
変換回路」）により過剰のアンモニアを消費するように遺伝子操作されている。いくつか
の実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路を含み、過剰のアンモニアを
減少させることができる。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路は、誘導性プロ
モーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路は、酸素レベル
依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実
施形態では、アンモニア変換回路は、肝性脳症に関連する分子または代謝物、例えば、ビ
リルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラー
ゼ、トランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコ
ンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラ
スミン、アンモニアまたマンガンにより誘導されるプロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複
数のＧＡＢＡ膜輸送タンパク質、例えば、ＧａｂＰを産生するための１つまたは複数の回
路をさらに含み、ＧＡＢＡを細胞内に輸送することができる（「ＧＡＢＡ輸送回路」）（
図４１）。

いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複
数のＧＡＢＡ異化酵素、例えば、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよび／またはＣＯＴを産生するた
めの１つまたは複数の回路（「ＧＡＢＡ代謝回路」）をさらに含む（図４９）。いくつか
の実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＧＡＢ
Ａ膜輸送タンパク質、例えば、ＧａｂＰを産生するための１つまたは複数の回路および１
つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素、例えば、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよび／またはＣＯＴを
産生するための１つまたは複数の回路（「ＧＡＢＡ代謝回路」）をさらに含む（図４１）
。

より具体的な態様では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路お
よびＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ
輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路は、同じプロモーターの制御下にある。代替実施形態で
は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路は、異なるプロモー
ターの制御下にある。例示的プロモーターは、本明細書で開示するプロモーターのいずれ
かを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好
気性または嫌気的条件により誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつか
の実施形態では、遺伝子操作細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もし
くは代謝物または肝損傷を示す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む
。分子もしくは代謝物の非限定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリル
ビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、
血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミル
トランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリ
ア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン
、アンモニアならびにマンガンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、炎
症または炎症反応により誘導されるプロモーター、例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモー
ターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内に自然に存在し得る
またはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノース
およびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。

例示的ＧａｂＰ輸送体のアミノ酸配列を表４２に示す。いくつかの実施形態では、遺伝
子操作細菌は、配列番号１０５のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０５と
同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形
態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０５のアミノ酸配列またはその機能性断片と少な
くとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もし
くは少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、または遺伝コードの重複性を別とすれ
ば、配列番号１０５と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含
む。

ポリヌクレオチド配列の非限定的な例を表４３（配列番号１０６）に示す。

マンガンの輸送
マンガンは、生物学的に重要な微量金属であり、大部分の生存生物の生存に必要である
。哺乳動物において、マンガンは、胆汁中に排泄されるが、その除去は、肝不全を伴う肝
臓から十二指腸への胆汁の流れの障害（すなわち、胆汁うっ滞）の影響を受ける。アンモ
ニアと同様に、マンガンの濃度の上昇は、肝性脳症の発現に一定の役割を果たす（Ｒｉｖ
ｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。グルタミンシンテターゼによって触媒される反
応におけるアンモニアを解毒する脳内の星状細胞は、マンガンを補助因子として必要とし
、したがって、この金属を蓄積する傾向を有する（Ａｓｃｈｎｅｒら、１９９９年）。ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ試験で、マンガンがグルタミン酸の輸送の抑制（ＨａｚｅｌｌおよびＮｏ
ｒｅｎｂｅｒｇ、１９９６年）、星状細胞の形態の異常（Ｈａｚｅｌｌら、２００６年）
および細胞容積の増加（Ｒａｍａ Ｒａｏら、２００７年）をもたらし得るが示された。
マンガンおよびアンモニアは、肝脳症の病因において相乗的に作用することも示された（
Ｊａｙａｋｕｍａｒら、２００４年）。

内部区画を欠く原核細胞における金属イオンの恒常性は、細胞膜を横切る金属イオンフ
ラックスの厳格な調節により維持されている（ＪｅｎｓｅｎおよびＪｅｎｓｅｎ、２０１
４年）。細菌におけるマンガンの取込みは、プロトン依存性Ｎｒａｍｐ関連輸送体および
／またはＡＴＰ依存性ＡＢＣ輸送体の２つの主要な種類の輸送体が主として関与している
。Ｎｒａｍｐ（天然抵抗性関連マクロファージタンパク質（Ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ））輸送体
ファミリーは、植物、動物および酵母において最初に記載された（Ｃｅｌｌｉｅｒら、１
９９６年）が、ＭｎｔＨは、それ以来、いくつかの細菌種において特徴付けがなされた（
Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎら、２０１３年）。マンガンに対するＮｒａｍｐ１輸送体の選択性が
金属蓄積試験において示され、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）ｍｎｔＨの過剰発現が細胞結合マンガンのレベルの増加をもたらしたが、カルシ
ウム、銅、鉄、マグネシウムまたは亜鉛の蓄積をもたらさなかった（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ
ら、２００２年）。さらに、ｍｎｔＨ遺伝子の突然変異を含む枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、マンガンの添加により救出された金属不含有培地中の増殖
の障害を示した（ＱｕｅおよびＨｅｌｍａｎｎ、２０００年）。例示的ＭｎｔＨ輸送体の
アミノ酸配列を表４４に示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１
０７のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３６と同じポリペプチドまたはその
機能性断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
配列番号１０７のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも
約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同
であるアミノ酸配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０７と同じポ
リペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。ポリヌクレオチド配列の
非限定的な例を表４５（配列番号１０８）に示す。

マンガンの高親和性取込みは、ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｃａｓｓｅｔｔｅ））輸送体によっても媒介され得る。この輸送体スーパーファミリー
のメンバーは、ＡＴＰの加水分解を利用して、イオンから巨大分子までの多様な基質の移
入または輸出を増大させ、原核および真核細胞の両方の多剤耐性におけるそれらの役割に
ついて十分に特徴付けられている。マンガンの移入に関与する細菌ＡＢＣ輸送体の非限定
的な例は、ＭｎｔＡＢＣＤ（枯草菌、黄色ブドウ球菌）、ＳｉｔＡＢＣＤ（ネズミチフス
菌、フレキスナー赤痢菌）、ＰｓａＡＢＣＤ（肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））およびＹｆｅＡＢＣＤ（ペスト菌）を含む（Ｂｅａｒｄｅ
ｎおよびＰｅｒｒｙ、１９９９年；Ｋｅｈｒｅｓら、２００２年；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ
ら、２００４年；Ｚｈｏｕら、１９９９年）。ＭｎｔＡＢＣＤ輸送体複合体は、３つのサ
ブユニットからなり、ＭｎｔＣおよびＭｎｔＤは、パーミアーゼサブユニットを含む内在
性膜タンパク質であり、陽イオン輸送を媒介し、ＭｎｔＢは、ＡＴＰアーゼであり、Ｍｎ
ｔＡは、マンガンに結合し、パーミアーゼサブユニットに送達する。ｓｉｔＡＢＣＤ、ｐ
ｓａＡＢＣＤおよびｙｆｅＡＢＣＤなどの、他のＡＢＣ輸送体オペロンは、同様のサブユ
ニット構成および機能を示す（Ｈｉｇｇｉｎｓ、１９９２年；Ｒｅｅｓら、２００９年）
。

いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、マンガン膜輸
送タンパク質、例えば、ＭｎｔＨを産生するための１つまたは複数の回路をさらに含み、
マンガンイオンを細胞内に輸送することができる（「マンガン輸送回路」）（図４２）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路
およびＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニ
ア変換回路、マンガン輸送回路およびＧＡＢＡ輸送回路を含む。いくつかの実施形態では
、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回路および
ＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、各回路は、同じプロモーターの制御
下にある。代替実施形態では、各回路は、異なるプロモーターの制御下にある。いくつか
の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好気性または嫌気的条件により
誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もしくは代謝物または肝損傷を示
す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む。分子もしくは代謝物の非限
定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、
ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗
原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、
鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガ
ンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、炎症または炎症反応により誘導
されるプロモーター、例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーターを含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体
外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンによ
り誘導されるプロモーターを含む。

酪酸および他の消化管バリア機能増強分子の産生
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、消化管バリア機能増強分子をコ
ードする遺伝子、または消化管バリア機能増強分子を産生することができる生合成経路を
コードする遺伝子カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、該分子は、短鎖脂肪
酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、
ＴＧＦ−β２、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、ト
レフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ_２、キヌレン酸およびキヌレニンからなる群から選
択される。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、単一遺伝子によりコードされる
消化管バリア機能増強分子を発現するものであり、例えば、該分子は、エラフィンであり
、ＰＩ３遺伝子によりコードされる。代替実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、複
数の遺伝子を必要とする生合成経路により合成される消化管バリア機能増強分子、例えば
、酪酸またはプロピオン酸をコードする。

遺伝子または遺伝子カセットは、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色
体上で発現させることができる。いくつかの実施形態では、プラスミドからの発現は、消
化管バリア機能増強分子の発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態で
は、染色体からの発現は、消化管バリア機能増強分子の発現の安定性を向上させるのに有
用であり得る。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強分子を産生するための遺
伝子または遺伝子カセットを遺伝子操作細菌における１つまたは複数の組込み部位におい
て細菌染色体に組み込む。例えば、酪酸生合成遺伝子カセットの１つまたは複数のコピー
を細菌染色体に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強
分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを遺伝子操作細菌におけるプラスミド
から発現させる。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強分子を産生するための
遺伝子または遺伝子カセットを大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、
ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において
細菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる（例えば、図１８参
照）。挿入部位は、ゲノムにおけるどこでもよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を創製
するための）のような、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近
くのような、ゲノムの活性領域；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒ
ａＣとの間のような、意図しない転写のリスクを低下させるために多様なプロモーターの
間であってよい。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、酪酸生成遺伝子カセットを含み
、酪酸を産生することができる。遺伝子操作細菌は、適切な組の酪酸生成遺伝子を含み得
る（例えば、表１４参照）。酪酸生合成遺伝子を含む非改変細菌は、公知であり、ペプト
クロストリジウム属、クロストリジウム属、フゾバクテリウム属、ブチリビブリオ属、ユ
ウバクテリウム属およびトレポネーマ属を含むが、これらに限定されず、これらの内因性
酪酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。いくつかの実施
形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酪
酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペプトクロストリ
ジウム・ディフィシル、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０株に由来
する酪酸生合成経路の８つの遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、
ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含み（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３年）、
ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子
もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのようなある種の他の代謝物に存在下で、
低酸素条件で酪酸を産生することができる。ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３
０菌株および１２９６菌株は、両方が酪酸を産生することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈ
ｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。いくつ
かの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由
来する酪酸生成遺伝子の組合せを含み、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝
物の存在下で酪酸を産生することができる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０菌株に由来するｂｃｄ２、ｅｔ
ｆＢ３、ｅｔｆＡ３およびｔｈｉＡ１ならびにペプトクロストリジウム・ディフィシル１
２９６菌株に由来するｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含む。いくつかの実施形
態では、遺伝子操作細菌は、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下
で酪酸生合成カセットを発現し、酪酸を産生することができる。遺伝子をコドン最適化す
ることができ、翻訳および転写エレメントを加えることができる。表１４に酪酸生合成遺
伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子
操作細菌は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは
４８のＤＮＡ配列、その機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なく
とも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含
む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３９、４０、４１、４２、４
３、４４、４５、４６、４７もしくは４８の核酸配列、またはその機能性断片を含む。

クロストリジウム・ディフィシルにおけるｂｃｄ２、ｅｔｆＡ３およびｅｔｆＢ３遺伝
子の遺伝子産物は、酸素依存性共酸化剤として機能し得る、クロトニルＣｏＡをブチリル
ＣｏＡに変換する複合体を形成する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌
は、微好気的または酸素制限環境、例えば、哺乳動物消化管内で酪酸を産生するように設
計されているので、酸素依存性は、消化管内での酪酸の産生に負の影響を及ぼす可能性が
ある。トレポネーマ・デンティコラに由来する単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノ
イルＣｏＡレダクターゼをコードする）が、この３遺伝子複合体を酸素非依存的に機能的
に置換し得ることが示された。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペ
プトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３
遺伝子の３つすべてを機能的に置換することができる、例えば、トレポネーマ・デンティ
コラに由来するｔｅｒ遺伝子を含む。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペ
プトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ
およびｂｕｋ、ならびに例えば、トレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒを含み、
ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子
もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得る、もしく
は存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で酪酸を産生することができ
る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、好気的酪酸生合成の遺伝子および／ま
たは嫌気的もしくは微好気的酪酸生合成の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発
明の遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈ
ｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、例えば、トレポネーマ・デンティコラ
に由来するｔｅｒ、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２
、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３のうちの１つまたは複数を含み、低酸素条件で、またはＨ
Ｅ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酪酸を産生する。いくつかの実施形態では、低酸
素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物、または肝損傷に関連する分子もしくは代
謝物の存在下、または炎症もしくは炎症反応のような他の条件（複数可）で、またはアラ
ビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存
在下で安定性を増大させ、かつ／または酪酸の産生を増加させるために、酪酸生合成遺伝
子のうちの１つまたは複数を機能的に置換し、改変し、かつ／または突然変異させる。い
くつかの実施形態では、酪酸の局所産生は、消化管内の調節Ｔ細胞の分化を誘導し、かつ
／または結腸上皮細胞のバリア機能を増進させる。

ｐｂｔおよびｂｕｋの遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡを酪酸に変換する。いくつかの実
施形態では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子は、ｔｅｓＢ遺伝子により置換することができる
。ｔｅｓＢは、ブチリルＣｏＡからＣｏＡを切り離すために用いることができる。一実施
形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来す
るｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄおよびｃｒｔ２、ならびに大
腸菌に由来するｔｅｓＢを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎
症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのよう
な、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素
条件で酪酸を産生する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、トレポネーマ・デ
ンティコラに由来するｔｅｒ遺伝子（トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコ
ードする）、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈ
ｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、ならびに大腸菌に由来するｔｅｓＢを含み、ＨＥ
特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子も
しくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存
在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で酪酸を産生する。いくつかの実
施形態では、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物、または肝損傷に関連す
る分子もしくは代謝物の存在下、または炎症もしくは炎症反応のような他の条件（複数可
）で、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種
の他の代謝物の存在下で安定性を増大させ、かつ／または酪酸の産生を増加させるために
、酪酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換し、改変し、かつ／または突
然変異させる。いくつかの実施形態では、酪酸の局所産生は、消化管内の調節Ｔ細胞の分
化を誘導し、かつ／または結腸上皮細胞のバリア機能を増進させる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、プロピオン酸遺伝子カセットを
含み、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下でプロピオン酸を産生
することができる。遺伝子操作細菌は、任意の適切な組のプロピオン酸生合成遺伝子を発
現し得る（例えば、表１５参照）。内因性プロピオン酸生合成経路を介してプロピオン酸
を産生することができる非改変細菌は、クロストリジウム・プロピオニクム、メガスフェ
ラ・エルスデニイおよびプレボテラ・ルミニコラを含むが、これらに限定されず、これら
の内因性プロピオン酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る
。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜
菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、クロストリジウム・プロピオニクムに由来する遺伝子ｐｃｔ、ｌｃｄおよびａｃ
ｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのア
クリル酸経路遺伝子、例えば、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃ
ｒＢおよびａｃｒＣを含む。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオン酸生合成
のためのピルビン酸経路遺伝子、例えば、ｔｈｒＡ^ｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖ
Ａ^ｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを含み、ｔｅｓＢを任意選択でさらに含む。
遺伝子は、コドンを最適化することができ、翻訳および転写エレメントを加えることがで
きる。表１５にプロピオン酸生合成遺伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示
す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８、４９、５０、５１、５
２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１もしくは６２のＤＮＡ配列
、その機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少
なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくつかの実
施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、
５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１もしくは６２の核酸配列、またはその機能性
断片を含む。

いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、合成
プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子
のうちの１つまたは複数は、大腸菌プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形
態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、プ
ロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、Ｃ．プロピオニクムプロピオン酸生
合成遺伝子である。プロピオン酸遺伝子カセットは、プロピオン酸の好気的生合成のため
の遺伝子および／またはプロピオン酸の嫌気的もしくは微好気的生合成のための遺伝子を
含み得る。プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、機能的に置換または改
変、例えば、コドンを最適化することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細
菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子
の組合せを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症
反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に
存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件でプロピオ
ン酸を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物
の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、ま
たはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代
謝物の存在下で、低酸素条件で安定性を向上させ、かつ／またはプロピオン酸の産生を増
加させるために、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換、改
変、および／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥ
特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子も
しくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存
在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件でプロピオン酸生合成カセットを
発現し、プロピオン酸を産生することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、酢酸遺伝子カセットを含み、酢
酸を産生する。遺伝子操作細菌は、適切な組の酢酸生合成遺伝子を含み得る。内因性酢酸
生合成遺伝子を含む非改変細菌は、当技術分野で公知であり、好気的および／または嫌気
的条件下で様々な基質を消費して、酢酸を産生することができる（例えば、Ｒａｇｓｄａ
ｌｅら、２００８年参照）。これらの内因性酢酸生合成遺伝子は、本発明の遺伝子操作細
菌の遺伝子の起源であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細
菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形
態では、遺伝子操作細菌における天然酢酸生合成遺伝子は、増強されている。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、大腸菌に由来する好気性酢酸生合成遺伝子を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、アセチトマクラム属、アセ
トアナエロビウム属、アセトハロビウム属、アセトネマ属、バルチア属、ブチリバクテリ
ウム属、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、スポロムサ属および／ま
たはサーモアセトゲニウム属に由来する嫌気性酢酸生合成遺伝子を含む。遺伝子操作細菌
は、好気的酢酸生合成の遺伝子または嫌気的もしくは微好気的酢酸生合成の遺伝子を含み
得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、好気性および嫌気性または微好気性
酢酸生合成遺伝子の両方を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異
なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子の組合せを含み、酢酸を
産生することができる。いくつかの実施形態では、安定性および／または酢酸の産生を増
大させるために、酢酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換、改変、およ
び／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、低酸素条件で
またはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酢酸生合成カセットを発現し、酢酸を産
生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替短鎖脂肪酸を産
生することができる。

当業者は、消化管バリア機能増強分子を産生することができるさらなる遺伝子および遺
伝子カセットが当技術分野で公知であり、本発明の遺伝子操作細菌により発現させること
ができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療用分子を産生するため
の遺伝子または遺伝子カセットは、さらなる転写および翻訳エレメント、例えば、治療用
分子の発現を増大させるための、リボソーム結合部位も含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２種またはそれ以上の消化管バリア機能
増強分子を産生する。特定の実施形態では、２種またはそれ以上の消化管バリア機能増強
分子は、相乗的に挙動して、消化管バリア機能を増強する。特定の実施形態では、遺伝子
操作細菌は、酪酸およびプロピオン酸を発現する。

いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、消化管バリア
増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路をさらに含む（図４３）
。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ代謝回路
および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含
む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回
路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送
回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１
つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変
換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪
酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回路および消化管バリア
増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施
形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回
路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つ
または複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、各回路は、同じプロモーターの制御
下にある。代替実施形態では、各回路は、異なるプロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下
で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラ
ビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存
在下で、低酸素条件で、記載した回路のうちの１つまたは複数を発現することができる。
いくつかの実施形態では、記載した回路のうちの１つまたは複数が１つもしくは複数のプ
ラスミド（例えば、高コピーもしくは低コピー）上に存在するかまたは細菌染色体におけ
る１つもしくは複数の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、記載した回路のうちの１つまたは複数をさらに発現することができ、（１）当技
術分野で公知であり、本明細書で示す栄養要求性のいずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求
性などの、１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明細書に記載の、あるいは当技術分野
で公知のキルスイッチのいずれかなどの、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１
つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知
の輸送体のいずれかのような、生体分子または物質を移入する１つまたは複数の輸送体、
（５）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの、１つ
または複数の分泌回路、および（６）そのようなさらなる回路のうちの１つまたは複数の
組合せのうちの１つまたは複数をさらに含む。

本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌は、リファキシミンに
対する耐性をさらに含み得る。リファキシミンに対する耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子における
突然変異によって主としてもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
例えば、ｒｐｏＢ遺伝子における公知のリファキシミン耐性を含む。他の実施形態では、
リファキシミン耐性をもたらす有用な突然変異を同定するために、遺伝子操作細菌を漸増
量のリファキシミンに曝露する、スクリーニングを用いることができる。

誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）を宿主細胞において発現させることが
でき、宿主細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ ｖｉｖ
ｏで、例えば、消化管内で、生存し、かつ／または増殖することができるように、細菌細
胞は、ペイロード（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を有する安定に維持されたプ
ラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２種またはそれ以
上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、２種またはそれ以上のペイロード遺伝子
を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、３種またはそれ以上の異なる輸送体また
はオペロン、例えば、３種またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形
態では、細菌細胞は、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるペイロー
ドまたはオペロン、例えば、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上のペイロー
ド遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じペイロード遺伝子（複数可）の複数
のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミ
ド上に存在し、誘導性プロモーターに直接的または間接的に作動可能に連結する。いくつ
かの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素ま
たは嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態
では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、誘導性プロモーターに直接
的または間接的に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードす
る遺伝子は、染色体上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに
作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラ
スミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロ
モーターに作動可能に連結する。

いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝に作動可能に連結されたプロモ
ーターは、外因性環境条件により直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ペイロ
ードをコードする遺伝に作動可能に連結されたプロモーターは、外因性環境条件により間
接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に固有
の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プ
ロモーターは、哺乳動物の小腸に固有の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導
される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境のような低
酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では
、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特有である分子または代謝物により直接的または
間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与さ
れる分子により直接的または間接的に誘導される。

特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応
答性プロモーターの制御下に発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。大腸菌にお
いて、ＦＮＲは、好気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因
子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気的状態では、ＦＮＲは、嫌気的増殖への適
応に関与する数百種の遺伝子を活性化する活性なＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。
好気的状態では、ＦＮＲは、酸素により二量体化することが妨げられ、不活性である。Ｆ
ＮＲ応答性プロモーターは、下文の図表に示すＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、これ
らに限定されない。下線付き配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列
は、クローニングに用いられる制限部位である。

ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野で公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモータ
ー配列（複数可）を本発明の遺伝子操作細菌に用いることができる。任意の適切なＦＮＲ
プロモーター（複数可）を適切なペイロードと組み合わせることができる（例えば、例示
的ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列を表７に示す）。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を表６に示す
。表６にＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的調節領域配列の核酸配列を示す。下
線付きの配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに
用いられる制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、配列
番号１８、配列番号１９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号２０）、ｎｉｒＢ２プロモ
ーター（配列番号２１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号２２）、ｙｄｆＺプロモー
ター（配列番号２３）、強リボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番
号２４）、強リボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号２５）、嫌
気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号２６
またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２７）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロ
モーター（配列番号２８）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号２９）の
うちの１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のＤＮＡ配列またはそれらの機能性
断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。

一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１を含む。他の実施形態では
、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プ
ロモーターは、配列番号３を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配
列番号４を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５を含む。

いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝子操作細菌に挿入されて
いる。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例え
ば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御
下に発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロード
遺伝子の発現は、消化管内のような、低酸素または嫌気的環境において特に活性化される
。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野で公知の方法により、例えば、リ
ボソーム結合部位を最適化し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を向上させることにより、
さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物消化管は、ヒト哺乳動物消化管である。

いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮ
Ｒ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および異なる細菌種に由来する対応するプロモーターを含む。
異種酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、同じ条件下の細菌における天
然遺伝子（複数可）およびプロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境における、
前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、ペイロードをコードする遺伝子
の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、淋
菌に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）
。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型
活性を保持している。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を
低減または消失するように欠失または突然変異させる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、
例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および同じ亜型の細菌に由来する野生型プロモー
ターと比べて突然変異している対応するプロモーターを含む。突然変異プロモーターは、
同じ条件下の野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境における、野生型
転写調節因子への結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例え
ば、ペイロードをコードする遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝
子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤ
ＮＲプロモーター、および同じ亜型の細菌に由来する野生型転写調節因子と比べて突然変
異している対応する転写調節因子を含む。突然変異転写調節因子は、同じ条件下の野生型
転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気的環境における、野生型プロモーターへの結
合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、ペイロードをコ
ードする遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転
写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増加させるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパ
ク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年参照）。

いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子、例えば、ＦＮＲ
遺伝子をコードする内因性遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素
レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実
施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコード
する遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感
知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、同じプラス
ミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする
遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子
をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する
。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイ
ロードをコードする遺伝子は、同じ異染色体上に存在する。いくつかの例では、発現安定
性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現
させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイ
ロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制
御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードの発現を制御す
る同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペ
イロードは、プロモーター領域から分岐して転写される。

ＲＮＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、誘導性プロモ
ーターの制御下で発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、炎症状態により活性化されるプロモー
ターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺
伝子は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、活性窒素種
またはＲＮＳプロモーターの制御下に発現する。

本明細書で使用する場合、「活性窒素種」および「ＲＮＳ」は、同義で用い、分子状窒
素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＮＳは、
ニトロソ化ストレスのような有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＮＳは、酸化窒素（ＮＯ
・）、ペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（
・ＮＯ_２）、三酸化二窒素（Ｎ_２Ｏ_３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロ
ペルオキシカーボネート（ＯＮＯＯＣＯ_２−）を含むが、これらに限定されない（不対電
子を・により示す）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を発達させ
た。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルにより誘発され、異なる速度
論で発生する。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知
転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の
遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域
に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節
領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知
し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化す
る。代替実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域に結合し
、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子
発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、ペイロ
ード遺伝子配列（複数可）、例えば、本明細書に記載のペイロードのいずれかに作動可能
に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対
応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列の
発現を駆動する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感
知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制す
る、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制し
ない。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。
ＲＮＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、ペイロード遺伝子配列（
複数可）に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は
、ＲＮＳを感知し、調節領域にもはや結合し、かつ／または抑制することをせず、それに
より、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、
ＲＮＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を活性化する。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知
転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する
、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつか
の実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節
領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモ
ーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制性調節
領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結することができる。例えば、
ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制性調節領域に結
合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。
このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」は、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮ
Ｓ抑制性調節領域および／またはＲＮＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形
態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも
１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳを感知する転写因子
ならびにそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の
例は、表Ａに示すものを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性窒素種を
感知することができる転写因子により直接的または間接的に制御される調整可能な調節領
域を含む。調節可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接的または間接的に駆動するこ
とができる１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結し、ひいてはＲＮＳレベルに対して
ペイロードの発現を制御する。例えば、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域で
あり、ペイロードは、本明細書で示すペイロードのいずれかのような、ペイロードであり
、例えば、炎症組織においてＲＮＳが存在する場会、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域に
結合し、かつ／または活性化し、１つまたは複数のペイロード遺伝子の発現を駆動する。
その後、炎症が改善し、ＲＮＡレベルが低下した場合、ペイロードの産生は、減少または
消失する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮ
Ｓの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それに
より、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形
態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それに
より、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＮＳの非存在下
でＲＮＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＮＳを感知するとき、それは、立体配
座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮ
Ｓを感知する転写因子は、ＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ＮＯを亜酸化窒素に還元する
、フラボルブレドキシンおよび関連フラビタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発
現を調節するＮＯ応答性転写活性化因子である」（Ｓｐｉｒｏ、２００６年）。本発明の
遺伝子操作細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子の任意の適切なＲＮＡ応答性調
節領域を含み得る。ＮｏｒＲによって活性化することができる遺伝子は、当技術分野で公
知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓ
ｅｙら、２０１２年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまた
は複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列に作動可能に連結した
ｎｏｒＶＷに由来するＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＲの存在下で、ＮｏｒＲ転写因
子は、ＲＮＲを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結し
た遺伝子（複数可）の発現を駆動し、ペイロードを産生する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮ
Ｓを感知する転写因子は、ＤＮＲである。ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）は、酸化窒
素の存在下で「ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する」（Ｃａｓｔｉｇｌ
ｉｏｎｅら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺
伝子の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによって活性化することが
できる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００
９年；Ｇｉａｒｄｉｎａら、２００８年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操
作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、酪酸生成遺伝子カセットに作動可能に
連結したｎｏｒＣＢのＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＲの存在下で、ＤＮＲ転写因子
は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作
動可能に連結した遺伝子の発現を駆動し、１つまたは複数のペイロードを産生する。いく
つかの実施形態では、ＤＮＲは、緑膿菌ＤＮＲである。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、対
応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、
転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または
遺伝子カセットを活性化する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、Ｒ
ＮＳを感知する転写因子は、ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ＮＯを感知し、ＮＯの代謝
に関与する遺伝子の発現を制御することができるＲｒｆ２型の転写リプレッサー」である
（Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＮｓｒＲによって抑
制される遺伝子の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｎ
ｓｒＲは、淋菌ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当
技術分野で公知である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年；Ｄｕｎｎら、２０１
０年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の遺伝子
、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子に作動可能に連結したｎｏｒＢのＲＮＳ抑
制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｓｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏ
ｒＢ調節領域にもはや結合せず、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結したペイ
ロード遺伝子を活性化し、ペイロードをコードするもの（ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ
ｐａｙｌｏａｄ（ｓ））を生成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の
発現を調節しないＲＮＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形
態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配
列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子を発
現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＮＳ感
知転写因子は、例えば、淋菌に由来するＮｓｒＲであり、ここで、大腸菌は、前記Ｎｓｒ
Ｒに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作
細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限にまたは
排除する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制性調節領域であり、対応
する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、転
写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連
結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ
感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。
代替実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調
節領域に結合することができる。

これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを発現させるために用いる、２
つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第
１のＲＮＳ感知リプレッサーおよび例えば、ペイロードをコードする遺伝子または遺伝子
カセットに作動可能に連結した、第２のリプレッサーを含む。これらの実施形態の一態様
では、ＲＮＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する、第２
のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施形態において有用な第２のリプレッサー
の例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが、これらに限定されない。第１のリプレ
ッサーによる結合の非存在（ＲＮＳの非存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーが
転写され、これが１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。第１のリプレッサーによる
結合の存在（ＲＮＳの存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーの発現が抑制され、
１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子が発現する。

ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域の配列によって
遺伝子発現を誘導、活性化、または抑制し得る。１つまたは複数の種類のＲＮＳ感知転写
因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作細菌に存在し得る。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、および例えば
、ｎｏｒＢに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、ならびに例えば、ｎ
ｏｒＢおよびａｎｉＡに由来する、２つまたはそれ以上の異なる対応する調節領域配列を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感
知転写因子、例えば、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲ、ならびに例えば、それぞれｎｏｒＢおよ
びｎｏｒＲに由来する、２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＮ
Ｓ応答性調節領域が複数の転写因子に結合できることがあり得る。いくつかの実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感知転写因子および１つの対応
する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳにより調節される調節領域の核酸配列は、当
技術分野で公知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００
９年；Ｄｕｎｎら、２０１０年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０
１２年）。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードす
る遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｎｓｒＲ遺伝子、誘導性プロ
モーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターも
しくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では
、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＮＳ感知転写因子を発
現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現
は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同
じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子および
治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜
菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ応答性調節領域を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来
するＲＮＳ感知転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知転
写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調
節領域と比較して、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を
増加させ得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子ＮｓｒＲおよび淋菌
に由来する対応する調節領域ｎｓｒＲを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＮＳ感知
転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実
施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、野生型活性を低減または消
失させるために欠失または突然変異させる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードす
る内因性遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態で
は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実
施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための
遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態で
は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子ま
たは遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ
感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、Ｒ
ＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺
伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写
因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセット
は、同じ染色体上に存在する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする野生型
遺伝子、例えば、ＮｓｒＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異し
ている、対応する調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同
じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる
。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、
ｎｏｒＢ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、
対応する転写因子、例えば、ＮｓｒＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型
転写因子と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施
形態では、ＲＮＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、ＲＮＳ感知転写因
子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌の野生型配列と比べて突然変異させる
。

いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能増強分子を産生する
ための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＮＳにより誘導される
プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の
方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／
またはｍＲＮＡの安定性を増大させることによって、発現がさらに最適化される。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）のいずれかを１つまたは複数の組
込み部位において細菌染色体に組み込むことができる。例えば、ペイロード遺伝子（複数
可）をコードする１つまたは複数の１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むこと
ができる。染色体に組み込まれた１つまたは複数の遺伝子の複数のコピーを有することに
より、ペイロード（複数可）のより多くの産生が可能となり、発現のレベルの微調整も可
能となる。あるいは、複数の異なる機能を果たすために治療用遺伝子（複数可）または遺
伝子カセット（複数可）に加えて、分泌または輸出回路のいずれかのような、本明細書に
記載の異なる回路を細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことが可
能である。

ＲＯＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、誘導性プロモ
ーターの制御下で発現するペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形
態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、細胞損傷の状態により活性化され
るプロモーターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生す
るための遺伝子は、細胞もしくは組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷
依存性プロモーター、例えば、活性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現する
。

本明細書で使用する場合、「活性酸素種」および「ＲＯＳ」は、同義で用いられ、分子
状酸素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＯＳ
は、好気的呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生され、酸化的損傷などの有害な細
胞効果をもたらし得る。ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）
、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシド
またはスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ_２）、オゾン（Ｏ_３）
、炭酸ラジカル、過酸化物またはペルオキシルラジカル（・Ｏ２−２）、次亜塩素酸（Ｈ
ＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、酸化
窒素（ＮＯ・）およびペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）
を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＯＳレベルを
感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なる
ＲＯＳレベルによって誘発され、異なる速度論で発生する（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４
年）。

本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知
転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の
遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域
に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節
領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知
し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化す
る。代替実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合し
、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子
発現を活性化する。ＲＯＳ誘導性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子配列、例えば、１
つもしくは複数のペイロードをコードする１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結
することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、ＲＯＳ
を感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作
動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数
の遺伝子の発現を誘導する。

本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感
知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制す
る、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制し
ない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。
ＲＯＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つもしくは複数のペイ
ロード（複数可）をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結することができ
る。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、もは
や調節領域に結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結し
た遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または
遺伝子カセットの発現を活性化する。

本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知
転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する
、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。
いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつか
の実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節
領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモ
ーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制性調節
領域は、１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯ
Ｓの存在下では、転写因子、例えば、ＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制
性調節領域に結合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発
現を阻止する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。

本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」は、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯ
Ｓ抑制性調節領域および／またはＲＯＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形
態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも
１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳを感知する転写因子
ならびにそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の
例は、表Ｂに示すものを含むが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知する
ことができる転写因子に直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。調
節可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接的または間接的に駆動することができる遺
伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結し、ひいてはＲＯＳレベルに対してペイロー
ドの発現を制御する。例えば、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、分
子は、ペイロードであり、例えば、炎症組織にＲＯＳが存在する場合、ＲＯＳ感知転写因
子は、調節領域に結合し、かつ／または活性化し、ペイロードの遺伝子配列の発現を駆動
し、それにより、ペイロードを生成する。その後、炎症が改善された場合、ＲＯＳレベル
が低下し、ペイロードの産生が減少または消失する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯ
Ｓの存在下で、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それに
より、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を駆動する。いくつかの実
施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、そ
れにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＯＳの非存
在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＯＳを感知するとき、それは、立
体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯ
Ｓを感知する転写因子は、ＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「過酸化物ストレス反応のグロ
ーバルな調節因子として主として機能し」、多くの遺伝子、例えば、「Ｈ_２Ｏ_２の解毒（
ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元剤供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔ
ｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ−
Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄移入システムの抑制（ｆｕｒ）に関与する遺伝
子」および「小調節ＲＮＡであるＯｘｙＳ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）を調節するこ
とができる。遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子の適切なＲＯＳ応
答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術
分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎｇら、２００１年；Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照
）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、ペイロード遺伝
子に作動可能に連結するｏｘｙＳのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、Ｈ_２
Ｏ_２の存在下で、ＯｘｙＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｘｙＳ調節領域を活性化し、
それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子の発現を駆動し、ペイロードを生成す
る。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、大腸菌ｏｘｙＲ遺伝子によりコードされる。
いくつかの実施形態では、ｏｘｙＳ調節領域は、大腸菌ｏｘｙＳ調節領域である。いくつ
かの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓおよびａｈｐＣの調節領
域から選択される。

代替実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感
知する対応する転写因子は、ＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラス
ターの酸化によって活性化される場合、それがＳｏｘＳの合成を増加させ、これがその標
的遺伝子発現を活性化する」（Ｋｏｏら、２００３年）。「ＳｏｘＲは、スーパーオキシ
ドおよび酸化窒素に主として応答することが公知であり」（Ｋｏｏら、２００３年）、Ｈ
_２Ｏ_２に応答することもできる。本発明の遺伝子操作細菌は、ＳｏｘＲにより活性化され
る遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによる活性化を受け
ることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｋｏｏら、２００３年参照
）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、ペイロードに作
動可能に連結しているｓｏｘＳのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳの存在下で、Ｓｏ
ｘＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それにより、作動可能
に連結したペイロード遺伝子の発現を駆動し、ペイロードを生成する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、対
応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、
転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または
遺伝子カセットを活性化する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、Ｒ
ＯＳを感知する転写因子は、ＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｏｈｒＡプロモーター部位
と重複する逆方向反復ＤＮＡ配列の対に結合し、それにより、転写イベントを抑制する」
が、酸化ＯｈｒＲは、「そのＤＮＡ標的に結合することが不可能である」（Ｄｕａｒｔｅ
ら、２０１０年）。ＯｈｒＲは、「有機過酸化物およびＮａＯＣｌの両方を感知する転写
リプレッサーであり」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、「Ｈ_２Ｏ_２により弱く活性化され
るが、有機ヒドロペルオキシドに対するはるかにより高い反応性を示す」（Ｄｕａｒｔｅ
ら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｈｒＲにより抑制される遺伝子の任意
の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによる抑制を受けることができる遺
伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。特定の実
施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロ
ード遺伝子に作動可能に連結されているｏｈｒＡのＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯ
Ｓ、例えば、ＮａＯＣｌの存在下で、ＯｈｒＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｈｒＡ調
節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子を活性化し
、ペイロードを生成する。

ＯｈｒＲは、ＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「Ｍａｒ
Ｒファミリーの大部分のメンバーは、転写リプレッサーであり、プロモーターにおける−
１０または−３５領域にしばしば結合し、ＲＮＡポリメラーゼの結合の立体阻害をもたら
す」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。このファンリーの他のメンバーは、当技術分
野で公知であり、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲおよびＳａｒＺを含むが、これらに限定
されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ
、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺであり、本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｓｐＲ、Ｍｇ
ＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺにより抑制される遺伝子の１つまたは複数の対応
する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺによる
抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、
２０１２年参照）。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、Ｒ
ＯＳを感知する対応する転写因子は、ＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「共通配列ＴＴＧＴ
ＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡを有する１８ｂｐ逆方向反復配列」に結合する「ＭａｒＲ
型転写調節因子」であり、「酸化剤Ｈ_２Ｏ_２により可逆的に阻害される」（Ｂｕｓｓｍａ
ｎｎら、２０１０年）。ＲｏｓＲは、「推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１
３２２、ｒｏｓＲの上流で、異なる遺伝子）、感覚ヒスチジンキナーゼ（ｃｇｔＳ９）、
Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子（ｃｇ３２９１）、グルタチオンＳ−トラ
ンフェラーゼファミリーのタンパク質（ｃｇ１４２６）、２つの推定ＦＭＮレダクターゼ
（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）ならびに４つの推定モノオキシゲナーゼ（ｃｇ０８
２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９およびｃｇ３０８４）」を含むが、これらに限定され
ない、多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２
０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより抑制される遺伝子の任意の適切
なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによる抑制を受けることができる遺伝子は
、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年参照）。特定の実
施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロ
ードに作動可能に連結されているｃｇｔＳ９のＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、
例えば、Ｈ_２Ｏ_２の存在下で、ＲｏｓＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｃｇｔＳ９調節領
域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子を活性化し、ペ
イロードを生成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の
発現を調節しないＲＯＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形
態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配
列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子を発
現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＯＳ感
知転写因子は、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来するＲｏｓＲであり、
大腸菌は、前記ＲｏｓＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転
写因子は、遺伝子操作細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット
効果を最小限にまたは排除する。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制性調節領域であり、対応
する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、転
写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連
結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ
感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。
代替実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調
節領域に結合することができる。

いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、Ｒ
ＯＳを感知する転写因子は、ＰｅｒＲである。枯草菌では、ＰｅｒＲは、「ＤＮＡに結合
した場合、酸化ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣおよびｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅ
ｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒおよびｚｏａＡ）ならびにそれ自体の合成（ｐｅｒＲ）に関与す
るタンパク質をコードする遺伝子を抑制する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。Ｐｅ
ｒＲは、「主としてＨ_２Ｏ_２に応答するグローバルな調節因子であり」（Ｄｕｂｂｓら、
２０１２年）、「ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内および近くに存在する特定の
回文構造共通配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）である、ｐｅｒボックスにおける
ＤＮＡと相互作用する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「プロモータ
ーの一部と重複するかまたはそのすぐ下流にある」調節領域に結合することができる（Ｄ
ｕｂｂｓら、２０１２年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより抑制される遺伝
子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによる抑制を受けることが
できる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。

これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを発現するために用いられる、
２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、
第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えば、ＰｅｒＲ、および第２のリプレッサー、例えば
、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードに作動可能に連結されている、Ｔｅ
ｔＲを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、遺伝子または
遺伝子カセットの転写を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施
形態において有用な第２のリプレッサーの例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが
、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、Ｐｅｒ
Ｒである。いくつかの実施形態では、第２のリプレッサーは、ＴｅｔＲである。この実施
形態では、ＰｅｒＲ抑制性調節領域は、ＴｅｔＲの発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性調節領
域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードの発現を駆動する。ＰｅｒＲ結
合の非存在（ＲＯＳの非存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲが転写され、ＴｅｔＲが遺伝
子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードの発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合の存在（
ＲＯＳの存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲの発現が抑制され、遺伝子または遺伝子カセ
ット、例えば、ペイロードが発現する。

ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域配列によって遺
伝子発現を誘導、活性化または抑制し得る。例えば、「ＯｘｙＲは、酸化条件下では主と
して転写活性化因子として考えられているが、ＯｘｙＲは、酸化および還元の両条件下で
リプレッサーまたは活性化因子として機能することができ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年
）、ＯｘｙＲは、「それ自体のリプレッサーならびにｆｈｕＦ（第二鉄イオンレダクター
ゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のそれであるこ
とが示された」（Ｚｈｅｎｇら、２００１年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲに
より抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施
形態では、ＯｘｙＲは、上述のように、２つのリプレッサー活性化調節回路に用いられる
。ＯｘｙＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば
、Ｚｈｅｎｇら、２００１年参照）。または、例えば、ＲｏｓＲは、多くの遺伝子を抑制
することができるが、それは、特定の遺伝子、例えば、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性
化することもできる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより活性
化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。さらに、「ＰｅｒＲ媒介性
の正の調節も認められ、遠隔上流部位へのＰｅｒＲの結合に関係すると思われる」（Ｄｕ
ｂｂｓら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより
活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。

１つまたは複数の種類のＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作
細菌に存在し得る。例えば、「ＯｈｒＲは、グラム陽性およびグラム陰性細菌に認められ
、ＯｘｙＲもしくはＰｅｒＲまたは両方と共存し得る」Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。い
くつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、Ｏｘ
ｙＲ、および例えば、ｏｘｙＳに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつか
の実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲ、
ならびに例えば、ｏｘｙＳおよびｋａｔＧに由来する２つまたはそれ以上の異なる対応す
る調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上
の種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲおよびＰｅｒＲ、ならびに例えば、ｏｘ
ｙＳおよびｋａｔＡに由来する２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つ
のＲＯＳ応答性調節領域は、複数の転写因子に結合し得る。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＯＳ感知転写因子、および１つの対応する
調節領域配列を含む。

いくつかの例示的なＯｘｙＲにより調節される調節領域の核酸配列を表Ｃに示す。Ｏｘ
ｙＲ結合部位は、下線付きの太字である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、
配列番号６３、６４、６５もしくは６６のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも
約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少な
くとも約９９％相同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードす
る遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｏｘｙＲ遺伝子、誘導性プロ
モーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターも
しくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では
、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＯＳ感知転写因子を発
現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現
は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。
いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同
じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写調節因子お
よび治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜
菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ応答性調節領域を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来
するＲＯＳ感知転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知転
写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調
節領域と比較して、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を
増加させ得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子ＯｘｙＲ、および大
腸菌に由来する対応する調節領域ｏｘｙＳを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＯＳ
感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代
替実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、野生型活性を低減また
は消失させるために欠失または突然変異させる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードす
る内因性遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態で
は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実
施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための
遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態で
は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子ま
たは遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ
感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、Ｒ
ＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺
伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写
因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセット
は、同じ染色体上に存在する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする野生型
遺伝子、例えば、ｓｏｘＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異し
ている、対応する調節領域、例えば、ｓｏｘＳ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同
じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＯＳの存在下でペイロードの発現を増加させる
。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、
ｏｘｙＳ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、
対応する転写因子、例えば、ＯｘｙＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型
転写因子と比較して、ＲＯＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施
形態では、ＲＯＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、ＲＯＳ感知転写因
子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌の野生型配列と比べて突然変異させる
。

いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは
、プラスミド上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。
いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、
染色体上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつ
かの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体
上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結
する。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセッ
トは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーター
に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法により、例え
ば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安
定性を増大させることにより、発現をさらに最適化する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロード（複数可）を産生することが
できる遺伝子（複数可）の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロー
ド（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）は、プラスミド上に存在し、ＲＯ
Ｓ応答性調節領域に作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ペイロードを産
生することができる遺伝子（複数可）は、染色体上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に作
動可能に連結している。

このように、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、
酸素レベル依存性プロモーター、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターまたは活性窒
素種（ＲＮＳ）依存性プロモーターおよび対応する転写因子の制御下で１つまたは複数の
ペイロードを産生する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを宿主細胞中で発現させるこ
とができ、宿主細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ ｖｉ
ｖｏで生存し、かつ／または増殖することができるように、ペイロードを産生するための
遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態で
は、細菌は、ペイロードをコードする遺伝子の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施
形態では、ペイロードをコードする遺伝子を低コピープラスミド上で発現させる。いくつ
かの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増大させるのに有用であり得
る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導性条件下で漏出性発現を減
少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子
を高コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは
、ペイロードの発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロ
ードをコードする遺伝子を染色体上で発現させる。

いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の
複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増加させるため）または複数の異なる
機能を果たす回路を含むように遺伝子操作を施す。例えば、遺伝子操作細菌は、４つの異
なる挿入部位に挿入された特定のペイロードをコードする遺伝子の４つのコピーを含み得
る。あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入された特定のペイロード
をコードする遺伝子の３つのコピーおよび３つの異なる挿入部位に挿入された異なるペイ
ロードをコードする遺伝子の３つのコピーを含み得る。

いくつかの実施形態では、ペイロードが発現する条件下で、本開示の遺伝子操作細菌は
、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２
倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０
倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約
３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少な
くとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１００
０倍、または少なくとも約１５００倍のペイロード、および／またはオペロンにおける遺
伝子（複数可）の転写物を産生する。

いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ペイロード遺伝子（複
数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。ペイロード遺伝
子（複数可）に固有のプライマーは、当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍ
ＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ペイロードｍＲ
ＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて
、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。
反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、
加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９
０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、
冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜
４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積
しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサ
イクルの数は、閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）である。各試料について少なくとも１つのＣ_Ｔ結果
を発生させ、Ｃ_Ｔ結果（複数可）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現
レベルを決定することができる。

いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ペイロード遺伝子（複
数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。ペイロード遺伝
子（複数可）に固有のプライマーは、当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍ
ＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ペイロードｍＲ
ＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて
、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。
反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、
加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９
０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、
冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜
４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積
しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサ
イクルの数は、閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）である。各試料について少なくとも１つのＣ_Ｔ結果
を発生させ、Ｃ_Ｔ結果（複数可）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現
レベルを決定することができる。

複数の作用機構
いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の
複数のコピーを産生する回路または複数の異なる機能を果たす回路を含むように遺伝子操
作を施す。挿入部位の例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ
、ｄａｐＡ、ｃｅａおよび図１８に示すその他を含むが、これらに限定されない。例えば
、遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａ
ｒａＣ／ＢＡＤおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの４つのコピーを含み得る。
あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ
／ＩおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの３つのコピーならびに３つの異なる挿
入部位ｄａｐＡ、ｃｅａおよびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された、３つの突然変異アルギニ
ンレギュロン、例えば、シトルリンを産生する２つおよびアルギニンを産生する１つを含
み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の異なる挿入部位
に挿入された１つまたは複数のアンモニア変換回路および１つまたは複数の他の挿入部位
に挿入された１つまたは複数の追加の回路を含み得る。例えば、遺伝子操作細菌は、１つ
もしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの１つもしくは複数のコピー
（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他の挿入部位における
１つもしくは複数の消化管バリア増強回路、例えば、１つもしくは複数の酪酸産生回路（
または他の消化管バリア増強回路（複数可）を含み得る。他の例示的実施形態では、遺伝
子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの１つも
しくは複数のコピー（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他
の挿入部位に挿入された、１つもしくは複数のＧＡＢＡ低減回路、例えば、ＧＡＢＡ輸送
および／またはＧＡＢＡ代謝回路（複数可）を含み得る。他の例示的実施形態では、遺伝
子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡ^ｆｂｒの１つも
しくは複数のコピー（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他
の挿入部位に挿入された１つもしくは複数のマンガン輸送回路（図４７Ａ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数のアンモニア変換回路（例えば、ａｒｇＡ^ｆ
ｂｒおよび／または他のアンモニア変換回路（複数可））、１つもしくは複数の消化管バ
リア増強回路（例えば、酪酸、プロピオン酸、酢酸生合成回路（複数可））、１つもしく
は複数のＧＡＢＡ低減回路（例えば、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路）、
ならびに１つもしくは複数のマンガン輸送回路が４つまたはそれ以上の異なる染色体挿入
部位に挿入されている（例えば、図４５）。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回
路、消化管バリア増強回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が３つの異な
る染色体挿入部位に挿入されている。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、Ｇ
ＡＢＡ輸送／ＧＡＢＡ代謝回路およびマンガン輸送回路が３つの異なる染色体挿入部位に
挿入されている（図４６Ｂ）。他の実施形態では、アンモニア変換回路およびマンガン輸
送回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている（図４７Ａ）。他の実施形態では
、アンモニア変換回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が２つの
異なる染色体挿入部位に挿入されている。さらに他の実施形態では、アンモニア変換回路
および消化管バリア増強回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。さらに他
の実施形態では、アンモニア変換回路およびマンガン低減回路が２つの異なる染色体挿入
部位に挿入されている。

表１４に本開示の実施形態の非限定的な例を示す。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌による酪酸の産生は、さらなる改変によって
さらに向上させることができる。嫌気的条件下の酪酸の産生は、内因性ＮＡＤＨプールに
依存する。いくつかの実施形態では、酪酸経路を経るフラックスは、ＮＡＤＨの利用の競
合経路を除去することによって増加させることができる。非限定的な例は、ＮＡＤＨを利
用して、ホスホエノールピルビン酸のコハク酸への変換を触媒する、ｆｒｄＡの突然変異
／欠失である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは
、ＮＡＤＨの利用の競合経路を除去する、突然変異、例えば、ｆｒｄＡの突然変異／欠失
をさらに含む。

分泌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌細胞質から、目的のタンパク質（複
数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌することができる天然分泌機構（例えば
、グラム陽性細菌）または非天然分泌機構（例えば、グラム陰性細菌）をさらに含む。多
くの細菌が細菌細胞外被を越えて基質を輸送する高機能の分泌システムを発達させた。小
分子、タンパク質およびＤＮＡのような、基質は、細胞外腔もしくはペリプラズム（消化
管内腔もしくは他の腔など）中に放出し、標的細胞中に注入し、または細菌膜に結合させ
ることができる。

グラム陰性細菌では、分泌機構は、内および外膜の１つまたは両方にわたり得る。いく
つかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然二重膜スパンニング分泌システムをさら
に含む。二重膜スパンニング分泌システムは、Ｉ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分
泌システム（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌システム（Ｔ
４ＳＳ）、ＶＩ型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）およびレジスタンス−ノジュレーション−デ
ィビジョン（ＲＮＤ）多剤排出ポンプのファミリーを含むが、これらに限定されない（Ｐ
ｕｇｓｌｅｙ、１９９３年；Ｇｅｒｌａｃｈら、２００７年；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎら、２
０１５年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年；Ｒｅｅｖｅｓら、２０１５年；国際公開第２０１
４１３８３２４号Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような分泌システム
の例を図６９〜７３に示す。グラム陰性様細胞外被を有する、マイコバクテリアもＶＩＩ
型分泌システム（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙら、２００３年）。Ｔ２Ｓ
Ｓを除いて二重膜スパンニング分泌は、一般的に基質を細菌細胞質から細胞外腔または標
的細胞内に直接的に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび外膜のみに及ぶ分泌システムは
、２ステップ機構を使用し得るものであり、基質は、最初に内膜スパンニング輸送体によ
ってペリプラズムに転位させられ、次に外膜に運ばれるかまたは細胞外腔に分泌される。
外膜スパンニング分泌システムは、Ｖ型分泌または自己輸送システム（Ｔ５ＳＳ）、カー
リー（ｃｕｒｌｉ）分泌システムおよび線毛アセンブリのシャペロン−アッシャー経路を
含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年）
。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、赤痢菌属、サルモネラ属、大腸
菌属、ビブリオ属（Ｂｉｖｒｉｏ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）
エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）またはシュー
ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来するＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌システ
ム（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、ニードル複合体を介して細菌細胞質から宿主
細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞質から分子を分泌す
るが、宿主細胞質に分子を注入しないように、改変することができる。したがって、分子
は、消化管内腔または他の細胞外腔に分泌される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、前記改変Ｔ３ＳＳを含み、細菌細胞質から目的のタンパク質（複数可）または治
療用タンパク質（複数可）を分泌することができる。いくつかの実施形態では、異種タン
パク質もしくはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質などの、分
泌分子は、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）が細菌から分
泌されることを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。

いくつかの実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路を用いて、目的の分子を分泌する。い
くつかの実施形態では、ペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えによ
り融合させることにより、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチドを分泌する。この
方法で、細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境中に移動
させることができる。

いくつかの実施形態では、Ｖ型自己輸送体分泌システム（Ｔｙｐｅ Ｖ Ａｕｔｏｔｒ
ａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、治療用ペプチドを
分泌する。このマシナリーの単純さおよび比較的に大きなタンパク質フラックスを扱う能
力のため、Ｖ型分泌システムは、組換えタンパク質の細胞外産生に魅力的である。図７０
に示すように、治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体
のベータドメインに融合させることができる。Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜
を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、
その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータドメインは、Ｂａｍ複合体（「ベータ−バ
レルアセンブリマシナリー」）に動員され、そこでベータドメインが折りたたまれ、ベー
タ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ
−バレル構造の中空孔を通り抜ける。細胞外環境に曝露したならば、治療用ペプチドは、
自触媒切断（Ｂａｍ複合体の左側）によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ
切断部位への膜結合ペプチド（黒いハサミ；Ｂａｍ複合体の右側）の標的化によってリン
カーシステムから解放される。このように、いくつかの実施形態では、異種タンパク質も
しくはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質などの、分泌分子は
、分子が細菌から分泌されるようにＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベ
ータドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ヘモリシンに基づく分泌システムを用いて、目的の分子を分
泌する。Ｉ型分泌システムは、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に
直接に移動させ、他の分泌の種類の２ステップ工程が不要となるという利点がある。図７
１に尿路病原性大腸菌のアルファ−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＡＴＰ
結合カセット輸送体である、ＨｌｙＢ；膜融合タンパク質である、ＨｌｙＤ；および外膜
タンパク質である、ＴｏｌＣを用いる。これらの３つのタンパク質の集合により、内およ
び外膜の両方を通るチャンネルが形成される。天然では、このチャンネルは、ＨｌｙＡを
分泌するために用いられるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分
泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプ
チドの分泌を媒介する。

代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然単一膜スパンニング分泌システムをさら
に含む。単一膜スパンニング輸出体は、分泌システムの構成要素としての役割を果たすか
、または基質を独立して輸出し得る。そのような輸出体は、ＡＴＰ結合カセットトランス
ロカーゼ、鞭毛／ビルレンス関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロ
カーゼ、一般的分泌システム（例えば、大腸菌におけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバ
クテリアおよびいくつかの種類のグラム陽性細菌（例えば、バシラス・アントラシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ、コリネバクテ
リウム・グルタミクム、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、黄色ブドウ球菌における付属分泌システム、およびツイン−アル
ギニン転位（ＴＡＴ）システムを含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６
年；ＲｉｇｅｌおよびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ、２００８年；Ａｌｂｉｎｉａｋら、２０１
３年）。一般的分泌およびＴＡＴシステムは、両方が切断可能なＮ末端シグナルペプチド
を用いて基質をペリプラズム内に輸出し得ることが公知であり、生物医薬の製造に関連し
て探究された。しかし、ＴＡＴシステムは、とりわけ折りたたまれた基質を輸送すること
ができ、それにより早発または不正折りたたみの可能性が解消される点で優位である。特
定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様システムを含み、細菌細胞
質から目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌することが
できる。当業者は、本明細書で開示した分泌システムは、細菌の種々の種、菌株および亜
型において機能を発揮するように改変し、かつ／または種々のペイロードを送出するよう
に構成することができることを理解するであろう。

タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外腔に移動させるために、ポリペプチ
ドは、最初に細胞内で移動させ、内膜を越えて移動させ、最後に外膜を越えて移動させな
ければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−とり
わけ真核生物由来のもの−は、３次および４次構造を安定化するためにジスルフィド結合
を含む。これらの結合は、酸化ペリプラズムコンパートメント内でペリプラズムシャペロ
ンの助けにより正しく形成することができるが、ポリペプチドを外膜を越えて移動させる
ために、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を再び広げなければならない。

グラム陰性細菌−とりわけジスルフィド結合を必要とするもの−における適切に折りた
たまれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定な外膜を有する細菌におけるペリプ
ラズムを標的にすることである。この方法により、タンパク質を酸化環境中に移動させ、
適切に折りたたませる。調和のとれた細胞外分泌システムと対照的に、タンパク質は、膜
の漏れによって正しく折りたたまれた形態でペリプラズム腔を脱出することができる。し
たがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は、生物活性の、適切にジスルフィ
ド結合したポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、「漏出性」または不安定な外膜を有する。漏れをもたらすために細菌の外膜を不
安定にすることは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌ
Ｂ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン
骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子を欠失または突然変異を起こさせることによっ
て達成することができる。Ｌｐｐは、細胞当たり約５００，０００コピーで存在する細菌
細胞中の最も豊富なポリペプチドであり、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ス
テープル」として機能する（Ｓｉｌｈａｖｙ Ｔ． Ｊ．、Ｋａｈｎｅ Ｄ．およびＷａ
ｌｋｅｒ Ｓ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ． Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２、 ａ０００４１４ （２
０１０年））。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出
性表現型を得るための他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ペリプラズムプロ
テアーゼが不活性化した場合に認められた。ペリプラズムは、タンパク質とともに非常に
密に充填されており、したがって、いくつかのペリプラズムタンパク質をコードして、タ
ンパク質のターンオーバーを促進する。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩのようなペリ
プラズムプロテアーゼを除去することにより、ペリプラズムタンパク質の過剰な蓄積が促
進されて、漏出性表現型がもたらされ得る。プロテアーゼの突然変異によっても、これら
のプロテアーゼによる標的化分解が妨げられることによりエフェクターポリペプチドを保
存することができる。さらに、これらの突然変異の組合せにより、細胞の生存の重大な犠
牲を伴わずに細胞の漏出性表現型が相乗的に高められる可能性がある。したがって、いく
つかの実施形態では、操作細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異膜遺伝子を有
する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、欠失または突然変異ｌｐｐ膜遺伝子を有す
る。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ遺伝子か
ら選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子（複数可）を有する。いくつ
かの実施形態では、操作細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される
１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作
細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有す
る。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択
される１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する
。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏ
ｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つ
もしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。

細胞の生存への擾乱を最小限にするために、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏ
ｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択され
る１つもしくは複数の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を誘導性プロモーターの
制御下におくことによって漏出性表現型を誘導性にすることができる。例えば、治療用ポ
リペプチドを送出（分泌）させる必要がある状態においてｌｐｐまたは他の細胞壁安定タ
ンパク質またはペリプラズムプロテアーゼの発現を抑制することができる。例えば、誘導
性条件下で、標的膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減する
転写リプレッサータンパク質または設計アンチセンスＲＮＡを発現させることができる。
逆に、特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシンまたはＴｏｌＡの第３のトポロジー
ドメインの過剰発現は、表現型の不安定化をもたらし得るものであり、治療用ポリペプチ
ドを送出（分泌）させる必要がある状態においてペプチドの過剰発現を誘導することがで
きる。これらの戦略の選別は、脆弱、漏出性表現型をバイオマス産生から切り離すもので
ある。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下
の１つもしくは複数の膜および／またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。

表１５および表１６にグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌システムを示す。こ
れらは、操作細菌から目的のポリペプチド、タンパク質または治療用タンパク質（複数可
）を分泌させるために用いることができ、これらは、その内容がその全体として参照によ
り本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｔｏｎ Ｈ． Ｓａｉｅｒ、Ｊｒ． Ｍｉｃｒｏｂｅ
／１巻、１号、２００６年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ｉｎ Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｐｏｓｓｅｓｓ ｍａｎｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−
ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｈａｔ ａｐｐａｒｅｎｔ
ｌｙ ｅｖｏｌｖｅｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ」に総説されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、治療用酵素の分泌のための本明細書に記
載の天然または非天然分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、
改変ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、
ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（
ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、単一膜分泌システム、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌システムから選
択される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌により分泌される治療用タンパク質は、プロ
テアーゼ、例えば、腸プロテアーゼに対する抵抗性を増大させるように改変する。

いくつかの実施形態では、分泌のための１つもしくは複数の目的のタンパク質または治
療用タンパク質は、本明細書に記載の通り、誘導性プロモーターの制御下にある。一例で
は、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、ＦＮＲプロモータ
ーの制御下にあり、嫌気的条件下で産生され、分泌される。いくつかの実施形態では、分
泌のための１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、構成的プロ
モーターの制御下にある。

１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質が微生物から分泌または
輸出される、いくつかの実施形態では、操作微生物は、分泌タグを含む遺伝子配列（複数
可）を含む。いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療
用タンパク質は、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質を特定の
分泌システムに導くためのＲＮＡまたはペプチド由来の「分泌タグ」を含む。例えば、Ｉ
型ヘモリシン分泌システムの分泌タグは、アルファヘモリシンタンパク質（ＨｌｙＡ）の
Ｃ末端５３アミノ酸、ＨｌｙＡ分泌シグナルにコードされる。

ＨｌｙＢが内膜に挿入して、孔を形成し、ＨｌｙＤがＨｌｙＢをＴｏｌＣ（外膜孔）と
一直線に並べ、それにより内および外膜を通るチャンネルを形成する。Ｃ末端分泌タグを
自触媒またはプロテアーゼ触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断により除去し、それにより、１つ
もしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質を細胞外環境中に放出すること
ができる。

Ｖ型自己分泌システムは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性ペプチドタグ（内膜）およびＣ末端タグ
（外膜）を利用する。これは、Ｓｅｃシステムを用いて、細胞質からペリプラズムに移動
する。Ｃ末端タグは、外膜に挿入して、「パッセンジャー」タンパク質が通る孔を形成す
る。外膜を越えたならば、パッセンジャー（抗癌分子）は、自触媒、インテイン様機構に
よりまたは膜結合プロテアーゼ（すなわち、ＯｍｐＴ）により膜埋込みＣ末端タグから放
出される。Ｎ末端タグは、Ｓｅｃシステムにより除去される。したがって、いくつかの実
施形態では、分泌システムは、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパ
ク質を操作細菌から分泌する前にこのタグを除去することができる。Ｖ型自己分泌媒介分
泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシステムによる細胞質からペリプラズム
コンパートメントへの「パッセンジャーペプチド」の転位時に除去される。さらに、自己
分泌型が外膜を越えて転位したならば、Ｃ末端分泌タグは、自触媒またはプロテアーゼ触
媒、例えば、ＯｍｐＴ切断により除去し、それにより抗癌分子（複数可）を細胞外環境中
に放出させることができる。

鞭毛改変ＩＩＩ型分泌では、タグは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域にコードされ、したが
って、切断／除去すべきペプチドタグが存在しない。この改変システムは、「シリンジ」
部分を含まず、その代わりに両膜を越え、形成鞭毛から出るための孔として鞭毛構造の基
底小体を使用する。ｆｌｉＣ／ｆｌｉＤ遺伝子（鞭毛「尾」／むちをコードする）が破壊
される場合、鞭毛が十分に形成し得ず、これが全体的な分泌を促進する。いくつかの実施
形態では、尾部を完全に除去することができる。ＩＩＩ型の伝統的なシステムでは、基底
小体は、鞭毛に極めて類似しているが、「尾」／むちの代わりに伝統的なＴ３ＳＳは、パ
ッセンジャータンパク質を宿主細胞に注射するためのシリンジを有する。分泌タグは、Ｎ
末端ペプチドによりコードされる（長さが変化し、いくつかの異なるタグが存在する、Ｐ
ＣＴ／ＵＳ１４／０２０９７２参照）。Ｎ末端タグは、この分泌システムにおけるポリペ
プチドから除去されない。

いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク
質は、大腸菌ＣＦＴ０７３のアルファ−ヘモリシン（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３アミノ酸
を含む融合タンパク質として発現する（タグ）を含む（Ｃ末端分泌タグ）。

必須遺伝子および栄養要求体
本明細書で使用する場合、「必須遺伝子」という語は、細胞の増殖および／または生存
に必要な遺伝子を意味する。細菌必須遺伝子は、当業者に周知であり、遺伝子の特異的欠
失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することが
できる（例えば、それぞれの全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｚ
ｈａｎｇおよび Ｌｉｎ、２００９年、ＤＥＧ ５．０、ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ
ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３７巻：Ｄ４５５〜Ｄ４５
８頁ならびにＧｅｒｄｅｓら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｃ ｍａｐｓ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻（５号）：
４４８〜４５６頁参照）。

「必須遺伝子」は、生物が生存する状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子
の突然変異、修飾または除去は、本開示の組換え細菌が栄養要求体になることをもたらし
得る。栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）
を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下
では細菌を死滅させることを意図するものである。

栄養要求性菌株を作製するために破壊または除去することができる例示的細菌遺伝子を
以下に示す。これらは、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に必要
な遺伝子を含むが、これらに限定されない。

栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠
いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では
細菌を死滅させることを意図するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載
の遺伝子操作細菌のいずれかは、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子における
欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば
、ｔｈｙＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａ
ｐＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまた
はＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、ｃｙｓ
Ｅ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓ
Ｂ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａ
Ａ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔ
Ｃ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含むが、これらに限定されない、細胞の生存および／
または増殖に必要な任意の遺伝子を標的にすることができる。表１７に栄養要求性菌株を
作製するために破壊または除去することができる例示的な細菌遺伝子を示す。これらは、
オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に必要な遺伝子を含むが、これ
らに限定されない。

表１８に強制経口投与後２４時間および４８時間目に検出されたマウス消化管内の種々
のアミノ酸栄養要求体の生存を示す。これらの栄養要求体は、大腸菌の非ニッスル株であ
るＢＷ２５１１３を用いて作製した。

例えば、チミンは、細菌細胞の増殖に必要な核酸であり、その非存在下では、細菌は、
細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによる、チミン
合成における第１のステップを触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼをコードする
（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺
伝子が欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｔｈｙＡ栄養要求体である
。ｔｈｙＡ栄養要求体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを加えることに
よって、またはｉｎ ｖｉｖｏでヒト消化管内で天然で認められる高いチミンレベルの存
在下で十分の量のチミンが存在する場合にのみ増殖することができる。いくつかの実施形
態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物消化管内に存在する場合、補足される遺伝
子における栄養要求体である。十分な量のチミンが存在しない場合、ｔｈｙＡ栄養要求体
は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要
求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。

ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、
細菌細胞壁の増殖に必要である（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１
９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、
ｄａｐＤが欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｄａｐＤ栄養要求体で
ある。ｄａｐＤ栄養要求体は、例えば、ＤＡＰをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えるこ
とによって、十分の量のＤＡＰが存在する場合にのみ増殖することができる。十分の量の
ＤＡＰが存在しない場合、ｄａｐＤ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、
栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化
管外）で生存しないことが確認される。

他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ｕｒａＡが欠失し、かつ／または無関
係の遺伝子で置換されているｕｒａＡ栄養要求体である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジン
ウラシルの取込みおよびその後の代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードす
る（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求体は、例えば、ウラシルをｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることによって十分の量のウラシルが存在する場合にの
み増殖することができる。十分の量のウラシルが存在しない場合、ｕｒａＡ栄養要求体は
、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌が栄養要求性遺
伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。

複雑なコミュニティーにおいて、細菌がＤＮＡを共有することは可能である。非常にま
れな状況では、栄養要求性細菌菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求体を永久的に救出
する非栄養要求性菌株からＤＮＡを受け取り得る。したがって、複数の栄養要求体を含む
細菌菌株を操作することにより、ＤＮＡ転移が栄養要求体を救出するのに十分な時間起こ
る可能性が著しく低くなり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、
細胞の生存および／または増殖に必要な２つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または突然変
異を含む。

必須遺伝子の他の例は、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂ
Ｄ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、
ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、
ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、
ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、
ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅ
ｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙ
ｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇ
ｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅ
ｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅ
ｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、
ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉ
ｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕ
ｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔ
ｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐ
Ｄ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ
、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ
、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒ
ｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎ
ａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、
ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒ
ｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐ
ｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ
、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎ
ａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅ
ｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐ
ｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐ
ｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄ
ｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃ
ｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ
、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、
ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、
ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔ
ｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉ
ｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ
、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ
、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇ
ｐｓＡを含むが、これらに限定されない。他の必須遺伝子は、当業者に公知である。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子
（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ
増殖する１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求体である（
その全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｌｏｐｅｚおよび Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ 「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄ−
Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＢＬ２１ ＤＥ３
Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｓｔｒａｉｎ」、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ
（２０１５） ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５参照）
。

いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子における突然変異を含む
。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧお
よびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突
然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉお
よびＳ３４５Ｃのうちの１つまたは複数を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では
、必須遺伝子は、突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４
０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必
須遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ
１８８Ｌのうちの１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須
遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１
８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３
６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇのうちの１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。いくつか
の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇを含むｔ
ｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４
７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃのうちの１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。いくつか
の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１
Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｉ４
Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇのうちの１つまたは複数を含むａｄｋである。いくつかの実施形
態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇを含むａｄｋである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドにより補足されている。いくつ
かの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチア
ゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸およびＬ−ヒスチジンメチルエス
テルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇおよ
びＡ５１Ｃ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２
−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸またはＬ−ヒ
スチジンメチルエステルにより補足される。ｄｎａＮ（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１
７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃ）における突然変異を有す
る細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより
補足される。ｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８
８Ｌ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾ
チアゾールにより補足される。ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）における
突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによ
り補足される。ａｄｋ（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）における突然変異を有する細菌細
胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールにより補足される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドに対して栄養要求性にする複数
の突然変異遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子にお
ける突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６
Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）ならびにｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇおよび
Ａ５１Ｃ）における突然変異を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子
における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ
３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ
５１Ｃ）ならびにｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ
１８８Ｌ）における突然変異を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、その必須遺伝子（複数可）が例えば、図
６６に示すアラビノース系を用いて置換されている条件付き栄養要求体である。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、栄養要求体であり、本明細書に
記載のキルスイッチ成分およびシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路も含む。
例えば、組換え細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な必須遺伝子における、例
えば、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡおよ
び／またはアミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡもしくはＭｅｔＡにおける欠失もしくは突
然変異を含み、環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）（述べたアラビノ
ース系のような）に応答して発現する１つもしくは複数の転写活性化因子により調節され
るあるいは外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）を感知すること
により発現する１つもしくは複数のリコンビナーゼ（本明細書および図６２〜６５に記載
するリコンビナーゼシステムのような）により調節される毒素遺伝子も含み得る。他の実
施形態は、その全内容が参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔら、「
ＧｅｎｅＧｕａｒｄ： Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉ
ｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ（２０１５年）４巻：３０７〜３１６頁に記載されている。いくつかの実施形態では、
本開示の遺伝子操作細菌は、栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ成分およ
びシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路、ならびに条件複製起点のような、他
のバイオセキュリティシステム（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）も含む。

他の実施形態では、栄養要求性の改変は、過剰のアンモニアを消費する突然変異細菌を
スクリーニングするためにも用いることができる。より具体的な態様では、栄養要求性の
改変は、アルギニンを過剰産生することによって過剰のアンモニアを消費する然変異細菌
をスクリーニングするために用いることができる。本明細書に記載の通り、アルギニン代
謝に関与する多くの遺伝子は、ＡｒｇＲとのその相互作用によるアルギニンによる抑制を
受ける。ａｓｔＣ遺伝子プロモーターは、アルギニン−ＡｒｇＲ複合体が、転写リプレッ
サーとは対照的に、転写活性化因子として作用する点で独特である。ａｓｔＣは、アンモ
ニア産生アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）経路の第３の酵素および大
腸菌におけるａｓｔＣＡＤＢＥオペロンの第１の酵素である、スクシニルオルニチンアミ
ノトランスフェラーゼをコードする（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８年）。特定の実施
形態では、遺伝子操作細菌は、ある遺伝子について栄養要求性であり、ａｓｔＣプロモー
ターの制御下で栄養要求性遺伝子産物を発現する。これらの実施形態では、栄養要求性は
、正のフィードバック機構の支配下にあり、アルギニンを過剰産生することにより過剰の
アンモニアを消費する突然変異細菌を選択するために用いる。正のフィードバック栄養要
求体の非限定的な例を図６０Ａおよび６０Ｂに示す。

遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するため
の重層的遺伝子調節回路を含む（例えば、その全体として参照により本明細書に組み込ま
れる、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号参照）。

特定の実施形態では、本発明は、アルギニンを過剰産生する遺伝子操作細菌を選択する
方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、代替代謝経路、例えば、ヒスチジ
ン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グ
ルタミン生合成経路およびトリプトファン生合成経路により過剰のアンモニアを消費する
遺伝子操作細菌を選択する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、突然変
異アルギニンレギュロンおよびＡｒｇＲ調節２リプレッサー活性化遺伝子調節回路を含む
遺伝子操作細菌を提供する。２リプレッサー活性化遺伝子調節回路は、アンモニアを減少
させるまたは栄養要求体を救出する突然変異細菌についてスクリーニングするために有用
である。いくつかの構築物において、高レベルのアルギニンおよびアルギニンによるＡｒ
ｇＲの結果として生じる活性化は、細胞の生存に必要な検出可能なレベルまたは必須遺伝
子の発現をもたらし得る。

２リプレッサー活性化調節回路は、第１のＡｒｇＲおよび第２のリプレッサー、例えば
、Ｔｅｔリプレッサーを含む。これらの実施形態の一態様では、ＡｒｇＲは、目的の特定
の遺伝子の転写、例えば、過剰なアンモニアを消費する突然変異体、および／または細胞
の生存に必要な必須遺伝子についてスクリーニングするために用いることができる、検出
可能な産物を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。ルシフェラーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼおよびＧＦＰのような蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない、
任意の検出可能な産物を用いることができる。いくつかの実施形態では、第２のリプレッ
サーは、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）である。この実施形態では、野生型
ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ抑制性プロモーターは、ＴｅｔＲの発現を駆動し、Ｔｅｔ
Ｒ抑制性プロモーターは、目的の少なくとも１つの遺伝子、例えば、ＧＦＰの発現を駆動
する。ＡｒｇＲ結合の非存在（低アルギニン濃度で起こる）下では、ｔｅｔＲが転写され
、ＴｅｔＲがＧＦＰの発現を抑制する。ＡｒｇＲ結合の存在（高アルギニン濃度で起こる
）下では、ｔｅｔＲの発現が抑制され、ＧＦＰが発生する。これらの実施形態に有用な他
の第２のリプレッサーの例は、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、Ｄ
ｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲおよびＰ
ｔｘＳ（米国特許出願公開第２００３０１６６１９１号）を含むが、これらに限定されな
い。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、スイッチを含む突然変異アルギ
ニンレギュロンを突然変異誘発にかけ、アルギニンを過剰産生することによってアンモニ
アを減少させる突然変異体を、例えば、フローサイトメトリー、検出可能な産物が蛍光を
発する場合には蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、検出可能な産物のレベルに基づ
いて選択する。

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、細菌の生存および／または増殖に必要な遺
伝子である。ＡｒｇＲの制御下を除いて遺伝子産物を産生しないようにするために対応す
る野生型遺伝子が除去または突然変異を起こさせた限り、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ
、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ
、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ
、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、および
ｔｈｉ１を含むが、これらに限定されない、任意のそのような遺伝子を用いることができ
る。いくつかの実施形態では、野生型ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ抑制性プロモーター
は、ＴｅｔＲタンパク質の発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性プロモーターは、細菌の生存お
よび／または増殖に必要な少なくとも１つの遺伝子、例えば、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡの発現
を駆動する（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細
菌が哺乳動物消化管内に存在する場合、補足されない遺伝子において栄養要求性であり、
前記遺伝子は、細菌に存在する第２の誘導性遺伝子により補足され、第２の遺伝子の転写
は、ＡｒｇＲ抑制性であり、十分に高い濃度のアルギニンの存在下で誘導される（ひいて
は栄養要求性遺伝子を補足する）。いくつかの実施形態では、２リプレッサー活性化回路
を含む突然変異アルギニンレギュロン突然変異誘発にかけ、過剰のアンモニアを減少させ
る突然変異体を、生存および／または増殖に必要な遺伝子産物の非存在下での増殖により
選択する。いくつかの実施形態では、２リプレッサー活性化回路を含む突然変異アルギニ
ンレギュロンを用いて、細菌が高レベルのアルギニンの非存在下（例えば、消化管外）で
生存しないことを確認する。

宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、宿主−プラスミド相互依存性を
もたらすように改変されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プ
ラスミドプラットフォームは、ＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年
）。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必須の複製イニ
シエータータンパク質がトランスで配置されている、条件複製起点、（ｉｉ）ゲノム転位
により宿主によって救出され、リッチ培地中の使用にも適合する栄養要求性の改変、およ
び／または（ｉｉｉ）広域スペクトルの毒素をコードする核酸配列を含む。毒素遺伝子は
、抗毒素を発現しない菌株（例えば、野生型細菌）に対してそれ自体不利であるプラスミ
ドＤＮＡを作製することによりプラスミドスプレッド（ｓｐｒｅａｄ）を対照として選択
するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミ
ドは、抗体分泌なしで少なくとも１００世代にわたり安定である。いくつかの実施形態で
は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプ
ラスミドは、本発明の遺伝子操作細菌における意図的でないプラスミドの増殖を著しく減
少させるために用いられる。

相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載のも
の（例えば、キルスイッチ、栄養要求体）などの、他のバイオセフティ機能と組み合わせ
て用いることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒ
ｄプラスミドを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラス
ミドおよび／または１つもしくは複数のキルスイッチを含む。他の実施形態では、遺伝子
操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の栄養要求
体を含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つ
もしくは複数のキルスイッチおよび／または１つもしくは複数の栄養要求体を含む。

プラスミド上の合成遺伝子回路発現は、短期では十分に機能し得るが、長期では能力お
よび／または機能を失う（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、遺
伝子操作細菌は、長期間にわたって目的の遺伝子を発現するための安定な回路を含む。い
くつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管増強分子を産生することができ、毒素
（ｈｏｋ）および短寿命抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素システムをさら
に含み、プラスミドの喪失は、細胞が長寿命毒素により殺滅されることをもたらす（Ｄａ
ｎｉｎｏら、２０１５年；図６８）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、枯草
菌プラスミドｐＬ２０に由来するａｌｐ７をさらに含み、細胞分裂中の等しい分離を保証
するために細胞の極にプラスミドを押すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉ
ｎｏら、２０１５年）。

キルスイッチ
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、キルスイッチも含む（例えば、
それぞれが参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６
２／１８３，９３５号、第６２／２６３，３２９号および第６２／２７７，６５４号参照
）。キルスイッチは、外部刺激に反応して操作された微小生物を能動的に殺滅することを
意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために死ぬという栄養要求性突然
変異と対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微小生物内の有毒分子の産生を誘
導する環境中の特定の因子によって誘発される。

キルスイッチにより操作された細菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究目的のために、例えば、
実験室環境の外部へのバイオ燃料産生微生物の広がりを制限するために操作された。疾患
または障害を治療するためのｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために操作された細菌は、１つま
たは複数の異種遺伝子、例えば、治療用遺伝子（複数可）の発現および送達の後または対
象が治療効果を経験した後の特定に時点に死ぬようにプログラムを組むこともできる。例
えば、いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発
現後の一定の期間の後に細菌を殺滅するように作動させる。いくつかの実施形態では、キ
ルスイッチは、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現後に例えば、アルギニンまたはシ
トルリンの産生の後に遅れて作動させる。あるいは、細菌は、細菌が疾患部位の外側に広
がった後に死ぬように操作することができる。とりわけ、微生物による対象への長期住み
つき、対象内の目的の範囲外への微生物の広がり（例えば、消化管の外側）、または対象
の外側の微生物の環境中への広がり（例えば、対象の大便を介する環境への広がりを防ぐ
ことは、有用であり得る。キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例は、バ
クテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、また
は他の機構により細胞死を引き起こす他の分子を含むが、これらに限定されない。そのよ
うな毒素は、個別にまたは組み合わせて用いることができる。それらの産生を制御するス
イッチは、例えば、転写活性化（トグルスイッチ；例えば、Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００
年参照）、翻訳（リボレギュレーター）またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼベースのス
イッチ）に基づくものであってよく、嫌気状態または活性酸素種のような環境刺激を検知
することができる。これらのスイッチは、単一環境因子により作動させることができるか
、または細胞死をもたらすためにＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理構成のいくつ
かの活性化因子を必要とし得る。例えば、ＡＮＤリボレギュレータースイッチは、細胞膜
を透過性にし、細胞を殺滅するリシンの発現を誘導するためのテトラサイクリン、イソプ
ロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびアラビノースにより活性
化される。ＩＰＴＧは、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、これらが次
に、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって活性化される。細胞死をもたら
すために３つの誘導物質のすべてが存在しなければならない。キルスイッチの例は、当技
術分野で公知である（Ｃａｌｌｕｒａら、２０１０年）。いくつかの実施形態では、キル
スイッチは、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現の後の期間後に細菌を殺滅するため
に作動させる。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル
依存性発現の後に遅らせて作動させる。

キルスイッチは、毒素が環境条件もしくは外部シグナルに反応して産生される（例えば
、細菌が外部キューに反応して殺滅される）ように設計する、または代わるべきものとし
て環境条件がもはや存在しなくなるもしくは外部シグナルが停止したならば、毒素が産生
されるように設計することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、例えば、低酸素環
境において外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いく
つかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒおよびリプッレ
サーＡｒｇＲを発現する細菌は、１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまた
は複数の遺伝子を含み、その発現は、環境条件またはシグナルに反応した誘導され、細胞
を殺滅する毒素の発現を最終的にもたらす１つまたは複数の組換え事象を引き起こす。い
くつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のレコンビナーゼによって
フリップされた後に構成的に発現する細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピ
ングである。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現は、遺伝子操作細菌を殺滅する。こ
れらの種類のキルスイッチシステムでは、操作細菌が外因性環境条件を感知し、目的の異
種遺伝子を発現したならば、組換え細菌細胞は、もはや生存しない。

他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒおよびリプッレ
サーＡｒｇＲを発現する細菌が少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件または
シグナルに反応して１つまたは複数のリコンビナーゼを発現し、遺伝子操作細菌は、外因
性環境条件またはシグナルに反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素
をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素をコー
ドする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバース
リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種
遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一
実施形態では、抗毒素は、毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作細菌の死を遅らせ
る。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種
遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。

他の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２
のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコ
ンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施
形態では、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリ
コンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実
施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナー
ゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では
、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼにより
フリップした後に構成的に発現する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子
は、それが第２のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形
態では、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。一実施形態では、遺伝子操作細
菌は、外因性環境条件に反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実
施形態では、抗毒素は、外因性環境条件が存在する場合に毒素の活性を阻害し、それによ
り遺伝子操作細菌の死を遅らせる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない
場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌
毒素により殺滅される。

一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２の
リコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコン
ビナーゼによる第３のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそ
れに続く第３のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピ
ングである。

一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第１の
切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第１の
切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と
第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第１の切除
酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に
構成的に発現する。一実施形態では、第１の切除酵素は、第１の必須遺伝子を切除する。
一実施形態では、プログラムされた組換え細菌細胞は、第１の必須遺伝子が切除された後
に生存しない。

一実施形態では、第１のリコンビナーゼは、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺
伝子をさらにフリップする。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺
伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識
配列との間に位置する。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする異種遺伝子は、そ
れが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では
、第１の必須遺伝子および第２必須遺伝子の両方が切除される場合、遺伝子操作細菌は、
死ぬかまたはもはや生存できない。一実施形態では、第１のリコンビナーゼにより第１の
必須遺伝子が切除されるかまたは第２の必須遺伝子が切除される場合、遺伝子操作細菌は
、死ぬかまたはもはや生存できない。

一実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後に死ぬ
。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後にも
はや生存できない。

これらの実施形態のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、
ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ
１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ
９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎ
ｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、
Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２
９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４からなる群ま
たはその生物学的活性な断片から選択されるリコンビナーゼであり得る。

上述のキルスイッチ回路において、毒素は、環境因子またはシグナルの存在下で産生さ
れる。キルスイッチ回路の他の態様では、毒素は、環境因子の存在下で抑制され（産生さ
れず）、環境条件または外部シグナルがもはや存在しなくなれば、産生され得る。毒素が
環境因子またはシグナルの存在下で抑制され（かつ外部シグナルが除去されたならば活性
化される）例示的キルスイッチを図６６〜６８に示す。本開示は、外因性環境においてア
ラビノースまたは他の糖を感知することにより１つまたは複数の異種遺伝子を発現する組
換え細菌細胞を提供する。この態様では、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコード
する、ａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の１つまたは複数の
遺伝子を含む。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモ
ーターの制御下の遺伝子の転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、
ＡｒａＣ転写因子は、所望の遺伝子、例えば、毒素遺伝子の発現を抑制するｔｅｔＲの発
現を誘導する、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、活性化することを可能にする立体配
座の変化を受ける。この実施形態では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在
下で抑制される。アラビノースが存在しない環境においては、ｔｅｔＲ遺伝子が活性化さ
れず、毒素が発現し、それにより細菌を殺滅する。必須遺伝子がアラビノースまたは他の
糖の存在下でのみ発現し、アラビノースまたは他の糖が環境に存在しない場合には発現し
ないという、アラビノース系を用いて、必須遺伝子を発現させることもできる。

したがって、外因性環境中のアラビノースを感知することにより１つまたは複数の異種
遺伝子が発現するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種遺伝子は、直接的また
は間接的にａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、発現異
種遺伝子は、異種治療用遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、リプレッサータンパク
質もしくはポリペプチド、例えば、ＴｅｔＲリプレッサーをコードする異種遺伝子、細菌
細胞に見いだされない必須タンパク質をコードする異種遺伝子および／または調節タンパ
ク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子のうちの１つまたは複数から選択され
る。

いくつかの実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、直接的または間接的にａｒａＢＡ
Ｄプロモーターの制御下にある。図１３に例示的なＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂ
ｒ構築物の概略図を示す。この実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、ａｒａＣ遺伝子
とａｒａＤ遺伝子との間に挿入されている。ａｒｇＡ^ｆｂｒは、リボソーム結合部位、Ｆ
ＲＴ部位および１つまたは複数の転写終結配列により隣接されている。例示的なＢＡＤプ
ロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ構築物の核酸配列を表１９に示す。すべての太字の配列は
ニッスルゲノムＤＮＡである。ａｒａＣ遺伝子の一部は太字の下線付きであり、ａｒｇＡ
^ｆｂｒ遺伝子は囲み線付きであり、間の太字の配列は、アラビノースの存在下で活性化さ
れるプロモーターである。リボソーム結合部位は斜体であり、終結配列は網掛け付きであ
り、ＦＲＴ部位は囲み線付きである。ａｒａＤ遺伝子の一部は点線の囲み線付きである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号６７のＢＡＤプロモーター配列ま
たはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、
少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号６７のＢＡＤプロモーター配列またはその機
能性断片を含む。

アラビノース誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、Ｐ_ａｒａ、Ｐ_ａｒａＢ
、Ｐ_ａｒａＣおよびＰ_{ａｒａＢＡＤ}を含む。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモ
ーターは、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、Ｐ_ａｒａＣプロモーターおよび
Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターは、二方向性プロモーターとして作動し、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プ
ロモーターは、１つの方向の異種遺伝子（複数可）の発現を制御し、Ｐ_ａｒａＣ（Ｐ_{ａｒ
ａＢＡＤ}プロモーターに近接し、それと反対側の鎖上の）は、他の方向の異種遺伝子（複
数可）の発現を制御する。アラビノースの存在下では、両プロモーターからの両異種遺伝
子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの非存在下では、両プロモーターからの両
異種遺伝子の転写は誘導されない。

本開示の１つの例示的実施形態では、本開示の操作細菌は、少なくとも以下の配列：テ
トラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）をコードする異種遺伝子に作動可能
に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作
動可能に連結したＰ_ａｒａＣプロモーター、およびテトラサイクリンリプレッサータンパ
ク質（Ｐ_ＴｅｔＲ）により抑制されるプロモーターに作動可能に連結した細菌毒素をコー
ドする異種遺伝子を有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転
写因子がＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターを活性化し、これがＴｅｔＲタンパク質の転写を活
性化し、これが次に毒素の転写を抑制する。しかし、アラビノースの非存在下では、Ａｒ
ａＣがＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現しな
い。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、毒素が発現する。毒素は、組換え細
菌細胞中に蓄積し、組換え細菌細胞は殺滅される。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子を
コードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、したがって、構成的
に発現する。

本開示の一実施形態では、組換え細菌細胞は、構成的プロモーターの制御下の抗毒素を
さらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質による
抑制のため、毒素が発現せず、抗毒素タンパク質が細胞中に蓄積する。しかし、アラビノ
ースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は
、組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が細胞中の抗毒素タンパク質の量と
等しいかまたはそれより多量に存在したならば、組換え細菌細胞がもはや生存できず、組
換え細菌細胞は、毒素により殺滅される。

本開示の他の実施形態では、組換え細菌細胞は、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの制御下
の抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲおよび
抗毒素が発現し、抗毒素が細胞中に蓄積し、ＴｅｔＲタンパク質による抑制により、毒素
は、発現しない。しかし、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒
素の両方が発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し始め
る。毒素タンパク質が発現したならば、組換え細菌細胞がもはや生存できず、組換え細菌
細胞は、毒素により殺滅される。

本開示の他の例示的実施形態では、本開示の操作細菌は、少なくとも以下の配列を有す
るキルスイッチを含む：組換え細菌細胞中に見いだされない（かつ生存に必要な）必須ポ
リペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターお
よびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰ_ａｒａＣプロモー
ター。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターを活
性化し、必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞が
生存することが可能になる。しかし、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣがＰ_{ａｒａ
ＢＡＤ}プロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質が発現しない。こ
の場合、組換え細菌細胞は、アラビノースの非存在下で死ぬ。いくつかの実施形態では、
組換え細菌細胞に見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に
連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素キルスイッ
チシステムとともに細菌細胞中に存在し得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞
に見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰ_{ａｒ
ａＢＡＤ}プロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシス
テムとともに細菌細胞中に存在し得る。

他の実施形態では、細菌は、短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミ
ドを含むプラスミド安定システムを含み得る。このシステムでは、細菌細胞は、毒素を中
和するために等量の毒素および抗毒素を産生する。しかし、細胞がプラスミドを失うなら
ば／場合、短寿命抗毒素は、減衰し始める。抗毒素が完全に減衰した場合、長寿命毒素が
細胞を殺滅した結果として、細胞は死ぬ。

いくつかの実施形態では、本開示の操作細菌、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒおよびリプレッ
サーＡｒｇＲを発現する細菌は、上述のキルスイッチ回路のいずれかの構成要素をコード
する遺伝子（複数可）をさらに含む。

上述の実施形態のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ
、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎ
Ｊ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａ
Ｖ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ
、ミクロシンＣ７−Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、
ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４
７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシ
ンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１
０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシン
Ｅ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６；コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシ
ンＭおよびクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択さ
れる。

上述の実施形態のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リシン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、Ｉｓ
ｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙ
ａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌ
Ｅ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥ^ＣＴＤ、ＭｃｃＦ
、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉ
ｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ
６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤおよびＣｍｉ、または
その生物学的に活性な断片からなる群から選択される。

一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して殺菌性である。一実施形態では
、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して静菌性である。

いくつかの実施形態では、本明細書に示す操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロン
が同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変レギュロンより多くのアルギニンおよび／または中
間副産物を産生するように、アルギニン生合成経路における、グルタミン酸をアルギニン
および／または中間副産物、例えば、シトルリンに変換することに関与する酵素をコード
するオペロンのそれぞれのアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の
核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異
体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アル
ギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レ
ダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナー
ゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼアルギニノコハ
ク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロ
ンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異
を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、それにより、レギュロンを活性化し、アル
ギニンおよび／または中間副産物の生合成を増強する。いくつかの実施形態では、遺伝子
操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然
変異体をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−ア
セチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモーターにより制御
される。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタ
ミン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに
より制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、フマル酸・硝酸レダクター
ゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元（ＡＮＲ）
プロモーターおよび異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）プロモーターから選択される。い
くつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
ターゼ突然変異体は、ａｒｇＡ^ｆｂｒである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニン
フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペ
ロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変
異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細
菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含み、細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生
型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較してアルギニンフィードバック阻害を減
少させるように突然変異させた機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードす
る遺伝子を含み、突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子の
発現は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにより制御され、突然変異
アルギニンレギュロンは、アルギニン合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−
アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ
、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカ
ルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼをコー
ドする遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンを含み、各オペロンは、ＡｒｇＲリプレッ
サーの結合によりオペロンのアルギニン媒介抑制を低減させる１つまたは複数の核酸突然
変異を特徴とする１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、オペロンにおける遺
伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持している
。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニン
フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペ
ロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変
異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む栄養要求体である。一実施形態では、アル
ギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
ターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスに
おける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子
操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ
、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ
、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ
、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求体から選択される栄養要求
体である。いくつかの実施形態では、操作細菌は、複数の栄養要求性を有する。例えば、
それらは、ΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。

いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗
性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少
なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異ア
ルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、本明細書で示すキルスイッチ回路のいずれ
かのような、キルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子
操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードす
る１つまたは複数の遺伝子および逆方向毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では
、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつ
かの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコン
ビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の逆方向切除遺伝子
をさらに含み、切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。い
くつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子
をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を
有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰ_{ａｒａ
ＢＡＤ}のような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲ
をコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素
をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニン
フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペ
ロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変
異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、本明細書に記載のキルスイッチ回路のい
ずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む栄養要求体である。

上述の遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ
−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上
に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で作動可
能に連結されている。他の実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチル
グルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌染色体に存在し、低酸素または嫌
気的条件下で誘導されるプロモーターに染色体において作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプッレサー機能が低下もし
くは不活性である、あるいは遺伝子操作細菌がアルギニンリプッレサーを有さず（例えば
、アルギニンリプッレサー遺伝子が欠失した）、レギュロンの抑制解除ならびにアルギニ
ンおよび／または中間副産物の生合成の増大をもたらすような１つまたは複数の核酸突然
変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変
異体をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセ
チルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモーターにより制御さ
れる。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミ
ン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターによ
り制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、フマル酸・硝酸レダクターゼ
調節因子（ＦＮＲ）プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元（ＡＮＲ）プ
ロモーターおよび異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）プロモーターから選択される。いく
つかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンタ
ーゼ突然変異体は、ａｒｇＡ^ｆｂｒである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレッ
サーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変
異体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンレギュロンを含み
、細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと
比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シ
ンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグ
ルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子の発現は、外因性環境条件により誘導される
プロモーターにより制御され、細菌は、機能性ＡｒｇＲリプレッサーを欠くように遺伝子
操作された。

いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニ
ンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操
作細菌は、栄養要求体である。一実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッ
サーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変
異体を含む遺伝子操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓ
ｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔ
ｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄ
ａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求体から選
択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、操作細菌は、複数の栄養要求性を
有する。例えば、それらは、ΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。

いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニ
ンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操
作細菌は、本明細書で示したキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路を
さらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーター
の制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および
逆方向毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコ
ードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、
誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは
複数の遺伝子および１つまたは複数の逆方向切除遺伝子をさらに含み、切除遺伝子（複数
可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操
作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形
態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒
素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰ_{ａｒａＢＡＤ}のような、アラビノースに
より誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む
。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺
伝子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレッ
サーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変
異体を含む栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかのような、
キルスイッチ回路をさらに含む。

上述の遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ
−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上
に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で作動可
能に連結されている。他の実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチル
グルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌染色体に存在し、低酸素または嫌
気的条件下で誘導されるプロモーターに染色体において作動可能に連結されている。

アンモニア輸送体
細胞内へのアンモニアの輸送を増大させるために本発明の遺伝子操作細菌におけるアン
モニア輸送体をさらに発現させるまたは改変することができる。ＡｍｔＢは、アンモニア
を細菌細胞内に輸送する膜輸送タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明の遺
伝子操作細菌は、天然ａｍｔＢ遺伝子の複数のコピーも含む。いくつかの実施形態では、
本発明の遺伝子操作細菌は、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子も含む。いくつかの
実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子の複
数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌における天然ａｍ
ｔＢ遺伝子は、改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は
、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、または天然プロモーターより強いプロモ
ーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーター、Ｐ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プ
ロモーターにより制御されるａｍｔＢ遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されて
おらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発
現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ^ｆ
ｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制
御下にゲノムに挿入されている。代替実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されて
おらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発
現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ^ｆ
ｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制
御下にゲノムに挿入されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されて
おらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、細菌におけるプラス
ミド上に存在し、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、Ｆ
ＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモー
ター、または構成的プロモーターの制御下にある。代替実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝
子は、改変されておらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、細
菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモー
ター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと異な
る誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子に突然変異を起こさせ、アンモニア輸送
の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異体したａｍｔＢ遺伝子を単離し、遺伝子操作
細菌に挿入する。いくつかの実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子に突然変異を起こさせ、
アンモニア輸送の増加を示す突然変異体を選択し、それらの突然変異体を用いて、本発明
の細菌を作製する。本明細書に記載のアンモニア輸送体の改変は、プラスミドまたは染色
体に存在し得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスル
における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然大腸菌ニッスルａｍｔＢ遺伝子
の１つもしくは複数の追加のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロ
モーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと
異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下に大腸菌ニッスルゲノム
に挿入されている。代替実施形態では、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は、
改変されておらず、異なる細菌、例えば、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａ
ｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、
またはａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的
プロモーターの制御下に大腸菌ニッスルゲノムに挿入されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスル
における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然大腸菌ニッスルａｍｔＢ遺伝子
の１つもしくは複数の追加のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡ^ｆ
ｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａ
ｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモー
ターの制御下にある。代替実施形態では、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は
、改変されておらず、異なる細菌、例えば、ラクトバシラス・プランタルムに由来する非
天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡ^ｆｂｒの
発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡ
^ｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの
制御下にある。

医薬組成物および製剤
本明細書に記載の遺伝子操作細菌を含む医薬組成物は、高アンモニア血症に関連する障
害または高アンモニア血症に随伴する症状（複数可）を治療する、管理する、改善する、
かつ／または予防するために用いることができる。１つまたは複数の遺伝子操作細菌を、
単独でまたは予防薬、治療薬および／または薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組
成物を提供する。

特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように操作さ
れた細菌の１つの種、菌株または亜型を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、本明細
書に記載の遺伝子改変を含むように操作された細菌の２つまたはそれ以上の種、菌株およ
び／または亜型を含む。

本明細書に記載の医薬組成物は、有効成分を医薬用組成物に加工することを促進する、
賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて通常の方法
で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知である（
例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ参照）。いくつかの
実施形態では、医薬組成物を打錠、凍結乾燥、直接圧縮、常法による混合、溶解、造粒、
研和、乳化、カプセル封入、封入または噴霧乾燥にかけて、腸溶コーティングを施しても
非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微
小錠剤、ペレット剤または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に依存する。

本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液剤、カプセル剤、
サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶性錠剤、懸濁散剤、顆粒剤または経
口投与用のマトリックス持続放出製剤）の、および任意の適切な種類の投与（例えば、経
口、局所、注射、即時放出、拍動性放出、遅延放出または持続放出）用の医薬組成物に製
剤化することができる。遺伝子操作細菌の適切な投与量は、約１０^５〜１０^１２細菌、例
えば、約１０^５細菌、約１０^６細菌、約１０^７細菌、約１０^８細菌、約１０^９細菌、約１
０^１０細菌、約１０^１１細菌または約１０^１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日、
週または月１回もしくは複数回投与することができる。組成物は、食事の前、食事中また
は後に投与することができる。一実施形態では、対象が食事をとる前に医薬組成物を投与
する。一実施形態では、医薬組成物を食事と同時に投与する。一実施形態では、対象が食
事をとった後に医薬組成物を投与する。

組成物は、日、週または月１回もしくは複数回投与することができる。遺伝子操作細菌
は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、界
面活性剤、中性もしくは陽イオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化
合物および他の薬学的に許容される担体または物質を含む医薬組成物に製剤化することが
できる。例えば、医薬組成物は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウ
ム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレ
ングリコールならびに例えば、ポリソルベート２０を含む表面活性剤の添加を含み得るが
、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、重炭酸
ナトリウムの溶液、例えば、重炭酸ナトリウムの１モル溶液（例えば、胃などの、酸性細
胞環境を緩衝するために）に製剤化することができる。遺伝子操作細菌は、中性または塩
の形態として投与すること、かつ製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩
酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンとで形成されるも
のならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロ
ピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン
等に由来するものなどの陽イオンとで形成されるものを含む。

本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、軟膏剤、クリーム剤、経皮貼付剤、ローション
剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、液剤、乳剤の形態でまたは当業者に周
知の他の形態で局所投与すること、かつ製剤化することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照されたい。一実施形態では、非噴霧
用局所剤形については、局所適用に適合性であり、水より大きい動粘度を有する担体また
は１つもしくは複数の賦形剤を含む粘稠から半固体または固体剤形が用いられる。適切な
製剤は、滅菌することができるまたは様々な特性、例えば、浸透圧に影響を及ぼすための
補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合することができる、
液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、塗布剤、軟膏剤等を含むが、これらに
限定されない。他の適切な局所剤形は、有効成分が固体または液体不活性担体と一緒に加
圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴射剤）との混合物でまたはスクィーズボ
トルに包装されている噴霧用エアゾール製剤を含む。保湿剤または湿潤剤も医薬組成物お
よび製剤に加えることができる。そのような付加的な成分の例は、当技術分野で周知であ
る。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生用品として製剤化す
ることができる。例えば、衛生用品は、抗菌製剤または発酵ブロスなどの発酵製品であり
得る。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、パスタ、ローシ
ョンおよびリップクリームであり得る。

本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、経口投与することができ、錠剤、丸剤、糖衣錠
、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として製剤化することが
できる。経口用医薬組成物は、固体賦形剤を用い、得られた混合物を場合によって粉砕し
、所望の場合、適切な補助剤を加えた後に、顆粒剤の混合物を処理して、錠剤または糖衣
錠コアを製造することができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトー
ルもしくはソルビトールを含む糖などの増量剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン
、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロ
ース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーを含むが、これらに限定されない
。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその
塩などの崩壊剤も加えることもできる。

錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビ
ニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、
ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ゴム、カ
オリンおよびトラガント）；増量剤（例えば、ラクトース、結晶セルロースもしくはリン
酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸
、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、
Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、
デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導
体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許
容される賦形剤を用いて通常の手段により調製することができる。錠剤は、当技術分野で
周知の方法により被覆することができる。コーティングシェルが存在していてもよく、一
般的な膜は、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、ア
ルギネート−ポリリシン−アルギネート（ＡＰＡ）、アルギネート−ポリメチレン−ｃｏ
−グアニジン−アルギネート（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メ
チルアクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロ
ニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メチルスルホン酸ナトリウ
ム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン
／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、珪質カプセル化物、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム
／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、
アルギン酸ナトリウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ゲラン−
キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−−ｃｏグリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ
無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸および腸溶コーティングポリマーを
含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例え
ば、大腸内への放出のために腸溶コーティングを施す。胃から結腸までの一般的なｐＨプ
ロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）およ
び５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルを修正することが
できる。いくつかの実施形態では、コーティングは、放出部位を規定するために特定のｐ
Ｈ環境において分解する。いくつかの実施形態では、少なくとも２種のコーティングを用
いる。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングが異なるｐＨ
レベルで分解する。

経口投与用の液体製剤は、液剤、シロップ剤、懸濁剤または使用前に水もしくは他の適
切な媒体で構成するための乾燥製剤の形態をとり得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤
（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（
例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エス
テル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプ
ロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される物質
を用いて通常の手段により調製することができる。製剤は、適宜、緩衝塩類、着香料、着
色剤および甘味料も含み得る。経口投与用の製剤は、本明細書に記載の遺伝子操作細菌の
徐放、制御放出または持続放出用に適切に製剤化することができる。

一実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、小児対象への投与に適する組成物に製剤
化することができる。当技術分野で周知のように、小児は、胃排出速度、ｐＨ、消化管透
過性等を含む多くの面で成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、２０１４年）。さらに、
投与経路および味覚特性などの、小児用製剤の受容性および好みは、容認できる小児のコ
ンプライアンスを達成するために重要である。したがって、一実施形態では、小児対象へ
の投与に適する組成物は、飲み込み易い若しくは溶ける剤形、または添加着香料、甘味料
もしくは味覚ブロッカーを含む組成物などの、より味の良い組成物を含み得る。一実施形
態では、小児対象への投与に適する組成物は、成人への投与に適するものでもあり得る。

一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、エ
リキシル剤、懸濁剤もしくは液剤として再構成するための散剤、分散／発泡錠、咀嚼錠剤
、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ剤、チューインガム、経
口薄型ストリップ、口内崩壊錠剤、サシェ剤、軟ゼラチンカプセル剤、振りかけ経口散剤
、または顆粒剤を含み得る。一実施形態では、組成物は、キャンディーに弾性、所望の噛
みごたえのある堅さおよびより長い貯蔵寿命を与える、ゼラチン基剤から製造されるグミ
キャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーは、甘味料または着香
料も含み得る。

一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、着香料を含み得る。本明細書で
使用する場合、「着香料」は、製剤に明白な風味および芳香をもたらす物質（液体または
固体）である。着香料は、製剤の食味を改善する助けともなる。着香料は、イチゴ、バニ
ラ、レモン、ブドウ、風船ガムおよびチェリーを含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、不活性希釈剤または同化可食性担体
とともに経口投与することができる。この化合物は、硬もしくは軟シェルゼラチンカプセ
ルに封入、錠剤に圧縮、または対象の食事に直接混入することもできる。経口治療投与の
ために、化合物は、賦形剤とともに組込み、摂食できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプ
セル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハースなどの形態で用いることができ
る。非経口投与以外により化合物を投与するためには、その不活性化を防ぐための材料で
化合物を被覆すること、またはそれ共に化合物を同時投与することが必要であり得る。

他の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、摂食可能な製剤、例えば
、食品であり得る。一実施形態では、食品は、乳、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酸乳、
フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉乳、アイスクリーム、クリームチーズ、ド
ライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜果実ジュース、果実ジュース、スポーツ飲料、菓子類
、砂糖菓子、乳児食（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料または栄養補助食品であ
る。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの、発酵食品である。一実施形態では、発
酵乳製品は、ヨーグルトである。他の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、乳、クリー
ム、アイスクリーム、ミルクセーキまたはケフィアである。他の実施形態では、本発明の
組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することを意図する他の生菌細胞を含む製
剤に組み込む。他の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、果実
ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブエキスを含む飲料である。他の実施形態
では、食品は、ゼリーまたはプリンである。本発明の組換え細菌の投与に適する他の食品
は、当技術分野で周知である。例えば、それぞれの内容が参照により本明細書に明確に組
み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第
２０１５／０２３８５４５号を参照されたい。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は
、パン、ヨーグルトまたはチーズなどの、食品に注入、噴霧、または振りかける。

いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングを施したまたは非被覆の、ナノ
粒子、ナノカプセル、マイクロカプセルまたは微小錠剤による、腸内投与、空腸内投与、
十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与または結腸内投与用に製剤化する。医薬組
成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を用いた、坐
剤または停留かん腸剤などの直腸組成物に製剤化することもできる。組成物は、油性また
は水性媒体中懸濁剤、液剤または乳剤であってよく、懸濁化、安定化および／または分散
剤を含み得る。

本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、エアゾールの形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の
形態に製剤化して鼻腔内に投与し、また適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタ
ン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の
適切なガス）を用いることにより、加圧パックまたはネブライザーからエアゾール噴霧剤
の形態で好都合に送達することができる。加圧エアゾールの投与単位は、定量を送出する
ために弁を備えることによって決定することができる。吸入器または吹送器に用いるカプ
セルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンの）は、ラクトースまたはデンプンなどの化
合物の粉末混合物および適切な粉末基剤を含むものを製剤化することができる。

遺伝子操作細菌は、デポ製剤として投与し、製剤化することができる。そのような長時
間作用性製剤は、埋め込みにより、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射を
含む注射、もしくは注入により投与することができる。組成物は、例えば、適切なポリマ
ーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用
いて、あるいはわずかに溶ける誘導体として（例えば、わずかに溶ける塩として）製剤化
することができる。

いくつかの実施形態では、単一剤形の、薬学的に許容される組成物を本明細書で開示す
る。単一剤形は、液体または固形であり得る。単一剤形は、変更なしに患者に直接投与す
ることができ、または投与前に希釈もしくは再構成することができる。特定の実施形態で
は、単一剤形は、ボーラス型で、例えば、単回注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤等
を含む経口投与を含む、単回経口投与で投与することができる。代替実施形態では、単一
剤形は、例えば、注入により、一定の時間にわたって投与することができる。

医薬組成物の単一剤形は、医薬組成物を、より小さい分割量、一回量容器、一回量液体
製剤、または腸溶コーティングを施しても非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒
子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット剤もしくは散剤などの、一回
量固形製剤に分割することによって用意することができる。固形製剤の一回量は、患者へ
の投与前に液体、一般的に滅菌水または生理食塩水を加えることにより再構成することが
できる。

他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムで送達することができ
る。一実施形態では、ポンプを用いて、本開示の治療薬の制御または持続放出を達成する
ことができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出製剤に用いら
れるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタ
クリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリメタク
ルリル酸、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、
ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラ
クチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエス
テルを含むが、これらに限定されない。持続放出製剤に用いられるポリマーは、不活性で
、浸出性不純物を含まず、保存で安定で、滅菌で、生分解性であり得る。いくつかの実施
形態では、制御または持続放出システムは、予防および治療標的の近くに配置することが
でき、したがって、全身投与量の一部を必要とするにすぎない。当業者に公知の任意の適
切な技術を用いることができる。

投与計画は、治療反応をもたらすように調節することができる。投与は、疾患の重症度
および反応性、投与経路、治療の時間経過（数日から数カ月、さらには数年）ならびに疾
患の改善までの時間などのいくつかの因子に依存し得る。例えば、単回ボーラスは、１回
で投与することができ、いくつかの分割量を所定の期間にわたって投与することができ、
あるいは治療状況によって示される通りに減量または増量することができる。用量の明細
は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果によって決定づけられ
る。投与量は、緩和されるべき状態の種類および重症度によって異なり得る。個別の対象
について、個々の必要および担当臨床医の専門的判断に従って具体的な投与計画を長期に
わたって調節することができる。本明細書で示す化合物の毒性および治療有効性は、細胞
培養または動物モデルにおける標準的な薬学的方法により判断することができる。例えば
、ＬＤ_５０、ＥＤ_５０、ＥＣ_５０およびＩＣ_５０を決定することができ、毒性および治療
効果の間の用量比（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）を治療指数として計算することができる。毒性
副作用を示す組成物は、副作用を低減するために起こり得る被害を最小限にする注意深い
修正を加えて用いることができる。投与は、最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルか
ら推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイならびに動物
試験から得られるデータは、ヒトに用いる一連の用量を策定するのに用いることができる
。

成分は、例えば、活性薬剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器に入れた
乾燥凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として、単位剤形で別個にまたは一緒に混合して
供給される。投与方法が注射による場合、投与前に成分を混合することができるように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意することができる。

医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器に包装することが
できる。一実施形態では、医薬組成物のうちの１つまたは複数を密閉容器に入れた乾燥滅
菌凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として供給し、対象への投与に適切な濃度に再構成
することができる（例えば、水または生理食塩水で）。一実施形態では、予防もしくは治
療薬または医薬組成物のうちの１つまたは複数を２℃〜８℃で保存された密閉容器に入れ
た乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給し、再構成した後１時間以内、３時間以内、５時間以
内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内または１週
間以内に投与する。凍結乾燥剤形について主として０〜１０％スクロース（最適には０．
５〜１．０％）などの凍結防止剤を含めることができる。他の適切な凍結防止剤は、トレ
ハロースおよびラクトースを含む。他の適切な充填剤は、いずれかを０〜０．０５％の濃
度で含めることができる、グリシンおよびアルギニン、ならびにポリソルベート８０（０
．００５〜０．０１％の濃度で任意選択で含める）を含む。さらなる界面活性剤は、ポリ
ソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含むが、これらに限定されない。医薬組成物
は、注射用容器として調製することができ、吸収または分散を高めるために用いられるも
の、例えば、ヒアルロニダーゼなどの佐剤として有用な物質をさらに含み得る。

治療の方法
本発明の他の態様は、高アンモニア血症に関連する疾患または障害を治療する方法を提
供する。いくつかの実施形態では、本発明は、これらの疾患または障害に随伴する１つも
しくは複数の症状を低減、改善または消失させる方法を提供する。いくつかの実施形態で
は、障害は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテ
ターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症およびオ
ルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素回路異常症である。代替実施形態では
、障害は、肝性脳症、急性肝不全もしくは慢性肝不全などの肝臓障害；有機酸障害；イソ
吉草酸尿症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿
症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチン回路欠損症；カルニチン欠乏症；β−酸化欠損症；リ
ジン尿性タンパク不耐症；ピロリン−５−カルボキシレートシンテターゼ欠損症；ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水素
酵素欠損症；インスリン過剰症高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ
酸療法；アスパラギナーゼ療法；完全腸管外栄養；グリシン含有溶液を用いる膀胱鏡検査
；肺／骨髄移植後；門脈体静脈短絡；尿路感染症；尿管拡張症；多発性骨髄腫；化学療法
；感染症；神経因性膀胱；または腸内細菌異常増殖である。いくつかの実施形態では、そ
れに随伴する症状（複数可）は、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力障
害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシスおよび低体温症を含むが、こ
れらに限定されない。

方法は、本明細書に記載の細菌の少なくとも１つの遺伝子操作種、菌株または亜型を含
む医薬組成物を調製し、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み得る。いく
つかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、液体懸濁剤で経口投与する。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ゲルキャップ中で凍結乾燥し、経
口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、胃管または胃シャン
トにより投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、直腸に、例え
ば、かん腸剤により投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、局
所、腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内投与する。

特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与により、対象におけるアンモニア濃度
が低下する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象におけるアンモニア濃度を
無処置または対照対象におけるレベルと比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、
３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ま
たはそれ以上低下させ得る。いくつかの実施形態では、低下は、医薬組成物の投与の前お
よび後の対象におけるアンモニア濃度を比較することによって測定する。いくつかの実施
形態では、高アンモニア血症を治療または改善する方法は、状態または障害の１つもしく
は複数の症状が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％またはそれ以上改善することを可能にする。

医薬組成物の投与前、投与中および後に、対象におけるアンモニア濃度は、血液、血清
、血漿、尿、糞便物質、腹水、腸粘膜剥離物などの生物学的試料、組織から採取した試料
、および／または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肛門管のうちの１つも
しくは複数の内容物から採取した試料について測定することができる。いくつかの実施形
態では、方法は、対象におけるアンモニア濃度を、検出できないレベルに、または治療前
の対象のアンモニア濃度の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０
％、５０％、６０％、７０％、７５％もしくは８０％より低いレベルに低下させるための
本発明の組成物の投与を含み得る。

特定の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、大腸菌
ニッスルである。遺伝子操作細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子（Ｓｏ
ｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）により、または投与の数時間もしくは数日後にキルス
イッチの活性化により、殺滅することができる。したがって、突然変異アルギニンレギュ
ロンを含む医薬組成物は、治療有効量および頻度で再投与することができる。マウスにお
けるｉｎ ｖｉｖｏでのニッスルの滞留期間を図３４および３５に示す。代替実施形態で
は、遺伝子操作細菌は、投与後数時間または数日以内に殺滅されず、増殖し、消化管にコ
ロニー形成し得る。

医薬組成物は、単独で、またはフェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムおよびフ
ェニル酪酸グリセロールを含むが、これらに限定されない、１つもしくは複数の追加の治
療薬と併用して投与することができる。１つもしくは複数の追加の治療薬の選択に際して
考慮すべき重要な事柄は、薬剤（複数可）が本発明の遺伝子操作細菌に適合すべきである
こと、例えば、薬剤（複数可）が細菌を殺滅してはならないことである。

一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥの予防、治療または管理のために投与する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥの再発を防ぐための他の治療アプロー
チと併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、分枝鎖アミノ酸補足と併用
して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、アセチル−１−カルニチンおよび／
または安息香酸ナトリウムおよび／または亜鉛および／またはアカルボースおよび／また
はオルニチンアスパラギン酸と併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、
患者におけるＨＥを治療し、かつ予防するために一般的に適用される、非吸収性二糖類と
併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ラクトースおよび／またはラク
チトールと併用して投与する。

一実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ＨＥの治療用の１つまたは複数の抗生物
質と併用して投与する。そのような抗生物質の例は、アミノグリコシド、例えば、ネオマ
イシンおよび／またはパラモマイシンなどの、非吸収性抗生物質を含むが、これらに限定
されない。一実施形態では、抗生物質は、リファマイシンである。一実施形態では、抗生
物質は、リファマイシン誘導体、例えば、リファキシミンを含むが、これに限定されない
、合成誘導体である。

リファキシミンは、６カ月間にわたって、プラセボと比較して、肝性脳症のエピソード
のリスクを著しく低下させることが示された（Ｂａｓｓら、Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ； Ｎ Ｅｎｇｌ
Ｊ Ｍｅｄ ２０１０；３６２巻：１０７１〜１０８１頁）。リファキシミンは、リフ
ァンピンの半合成誘導体であり、細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニ
ットに結合することにより作用し、それによって転写を阻止する。結果として、細菌のタ
ンパク質合成および増殖が抑制される。

リファキシミンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび臨床試験の両方において大腸菌に対して活
性であることが示された。したがって、リファキシミンとの併用療法が有効であるために
、遺伝子操作細菌がリファキシミン耐性をさらに含まなければならないことが理解される
。

リファキシミンに対する耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子の突然変異によって主としてもたらさ
れる。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ上の結合部位を変化させ、リファキシミ
ン結合親和性を低下させ、それにより、有効性を低下させる。一実施形態では、リファキ
シミン耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子における突然変異である。そのような突然変異の非限定的
な例は、例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｅｒｄｕｇｏ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ
ａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔ
ｈｅｒｍａｌ ｓｔｒｅｓｓ、ＢＭＣ Ｅｖｏｌ Ｂｉｏｌ．、２０１３年２月２２日、
１３巻：５０頁に記載されている。注目すべきことに、ｒｐｏＢ共通配列の同じ３コドン
における突然変異が数種の細菌種の無関係のリファキシミン耐性臨床分離株において反復
して起こる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ
：総説においてレビューされている；その内容がその全体として参照により本明細書に組
み込まれる、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（２０１４年）、
１〜６頁）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ｒｐｏＢ遺伝子にお
ける公知のリファキシミン耐性突然変異を含む。他の実施形態では、リファキシミン耐性
をもたらす有用な突然変異を同定するために、遺伝子操作細菌を漸増量のリファキシミン
に曝露する、スクリーニングを用いることができる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物を食物とともに投与する。代替実施形態では、食
物を摂食する前または後に医薬組成物を投与する。医薬組成物を、１つまたは複数の食事
改善、例えば、低タンパク質食およびアミノ酸補給と併用して投与することができる。医
薬組成物の用量および投与頻度は、症状の重症度および障害の進行に基づいて選択するこ
とができる。適切な治療有効量および／または投与頻度は、担当臨床医が選択することが
できる。

表２０に高アンモニア血症患者（ＵＣＤ＜ＨＥ）におけるフェニルアラニンの平均レベ
ルに基づく、標的分解速度の非限定的な例を示す。

ｉｎ ｖｉｖｏでの治療
本発明の遺伝子操作細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価する
ことができる。高アンモニア血症に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデル（
例えば、Ｄｅｉｇｎａｎら、２００８年；Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年参照）、例えば
、急性肝不全および高アンモニア血症のマウスモデルを用いることができる。この急性肝
不全および高アンモニア血症は、チオールアセトアミド（ＴＡＡ）による処理により誘発
することができる（Ｂａｓｉｌｅら、１９９０年；Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年）。あ
るいは、肝損傷は、物理的胆管結紮を用いてモデル化することができる（Ｒｉｖｅｒａ−
Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。高アンモニア血症は、酢酸アンモニウムおよび／または
塩化マグネシウムの経口補給によっても誘発することができる（Ａｚｏｒｉｎら、１９８
９年；Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。

さらに、ＣＣｌ_４は、動物における肝線維症および肝硬変を誘発するためにしばしば用
いられる（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉ
ｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｆｏｒ
ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ； Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４年、１巻（２号）：４３〜４９頁）。

本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、強制経口投与により動物に投与し、例えば、血液
試料中のアンモニアおよび／または糞便試料中のアルギニン、シトルリンもしくは他の副
産物を測定することによって治療有効性を判定することができる。

本明細書を通して引用した参考文献の完全な典拠は、以下の通りである。
１．Ａｌｉｆａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐ
ａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎ
ｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９６ Ｍａｒ；６０（１）
：４４−６９．ＰＭＩＤ：８８５２８９５．
２．Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ
ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈ
ｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ａｐｒ ９；４０（３）：２２３−２２９．ＰＭＩＤ：１５０
３９０９８．
３．Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｕｒａｃｉｌ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａＡ ｍｕｔａｎｔ
ｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９
９５ Ａｐｒ；１７７（８）：２００８−２０１３．ＰＭＩＤ：７７２１６９３．
４．Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔ
ａｒｇｅｔｓ ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｏｃｔ ５；３３８（６１０３）：１
２０−１２３．ＰＭＩＤ：２２９０３５２１．
５．Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｕｒｅａｓｅ ｉ
ｎ ｍａｎ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｕｒｅａｓｅ．Ｇｕｔ．１９６
６ Ｄｅｃ；７（６）：６３１−６３５．ＰＭＩＤ：５９５７５１４．
６．Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｒ ａｎｄ ｎ
ｏｒ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＣＲＰ／ＦＮＲ−
ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ＤＮＲ，ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ＡＮＲ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９５ Ａｕｇ ２８；３
７１（１）：７３−７６．ＰＭＩＤ：７６６４８８７．
７．Ａｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（
ＣＮＳ）．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．１９９９ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；２０（２−３
）：１７３−１８０．ＰＭＩＤ：１０３８５８８１．
８．Ａｚｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９８９ Ｓｅｐ；１０（３）
：３１１−３１４．ＰＭＩＤ：２７５９５４９．
９．Ｂａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｏｍａ
ｂｙ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｅｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ（Ｒｏｌ５−１７８８）
．Ｌａｎｃｅｔ．１９８５；１：１３２４−１３２５．
１０．Ｂａｓｉｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ ａｒｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａ
ｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０ Ｊｕｌ；８７（１４）：５２６３−５２
６７．ＰＭＩＤ：１９７３５３９．
１１．Ｂｅａｒｄｅｎ ＳＷ，Ｐｅｒｒｙ ＲＤ．Ｔｈｅ Ｙｆｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｓ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｍａｎ
ｇａｎｅｓｅ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃ
ｅ ｏｆ ｐｌａｇｕｅ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；３２（２）
：４０３−４１４．ＰＭＩＤ：１０２３１４９５．
１２．Ｂｅｒｋ ＤＰ，Ｃｈａｌｍｅｒｓ Ｔ．Ｄｅａｆｎｅｓｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔ
ｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈ
ａｌｏｐａｔｈｙ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１９７０ Ｓｅｐ；７３（３）：３
９３−３９６．ＰＭＩＤ：５４５５９８９．
１３．Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｔｉｔｏｌ ｏｒ ｌａｃｔｕｌｏｓｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａ
ｌｏｐａｔｈｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｈｅｐａｔ
ｏｌｏｇｙ．１９９２ Ｆｅｂ；１５（２）：２２２−２２８．ＰＭＩＤ：１５３１２０
４．
１４．Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｗｈｏｌｅ−ｓｙｓｔｅｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｓ ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒ
ｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６ Ｎｏｖ；１５２（Ｐｔ １１
）：３３４３−３３５４．ＰＭＩＤ：１７０７４９０４．
１５．Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉ
ｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ
ｅｍ．２００８ Ｍａｒ ７；２８３（１０）：６３４７−６３５８．ＰＭＩＤ：１８１
６５２３７．
１６．Ｃａｌｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔ
ｈａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｍｏｌ
Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１０；１００ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１３−Ｓ１９．Ｒｅｖ
ｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２０３０３８１０．
１７．Ｃａｌｌｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ，ｔｕｎｉｎｇ，ａｎｄ ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔ
ｈｅｔｉｃ ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｓｅｐ ７；１０７（３６）：１５８９８−１５９０３．ＰＭＩ
Ｄ：２０７１３７０８．
１８．Ｃａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓ
ｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈ
ａｌｏｐａｔｈｙ．ＱＪＭ．２０１０ Ｊａｎ；１０３（１）：９−１６．ＰＭＩＤ：１
９９０３７２５．
１９．Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆ
ａｃｔｏｒ ＤＮＲ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｈａｅ
ｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９
Ｓｅｐ；１５５（Ｐｔ ９）：２８３８−２８４４．ＰＭＩＤ：１９４７７９０２．
２０．Ｃｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｒａｍｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９６ Ｊｕｎ；１２（６
）：２０１−２０４．ＰＭＩＤ：８９２８２２１．
２１．Ｃｈａｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ
−ｏｐｅｒａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｊｕｌ ２０；２２６（２）：３６７−３８
６．ＰＭＩＤ：１６４０４５６．
２２．Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ／ＥＢＰａｌ
ｐｈａ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ｕｒｅａ
ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓ
ｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００７ Ｍａｒ １；１６（５）：４８３−４９８
．ＰＭＩＤ：１７２１３２３３．
２３．Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｎｎｅｌ ｃｒｏｓｓｉｎｇ：ｈｏｗ
ａｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｈｉｐｐｅｄ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ
ｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ？ Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏ
ｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１５； ３７０：２０１５００２５．ＰＭＩＤ：２６
３７０９３７．
２４．Ｃｏｒｄｏｂａ Ｊ，Ｍｉｎｇｕｅｚ Ｂ．Ｈｅｐａｔｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ
ｐａｔｈｙ．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２００８； ２８（１）：７０−８０．
ＰＭＩＤ：１８２９３２７８．
２５．Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｇｒａｍ
−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５；１３
（６）：３４３−３５９．ＰＭＩＤ：２５９７８７０６．
２６．Ｃｒａｂｅｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＲＧ７ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏ
ｄｉｎｇ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｎ ｅｎｚｙ
ｍｅ ａｌｓｏ ｅｎｄｏｗｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎ
ｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７ Ｄｅｃ １；
２５０（２）：２３２−２４１．ＰＭＩＤ：９４２８６６９．
２７．Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉ
ｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｇ
ｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ Ｊｕｎ ２２；１０７（２５）
：１１５３７−４２．ＰＭＩＤ：２０５３４５２２．
２８．Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌ
ａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈ
ｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
−１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３ Ａｕｇ １１；１１（１５）
：５００７−５０１９．ＰＭＩＤ：６３４８７０３．
２９．Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ
．１９８６ Ｓｅｐ；５０（３）：３１４−５２．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ
：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９８７ Ｍａｒ；５１（１）：１７８．ＰＭＩＤ：３
５３４５３８．
３０．Ｄａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａ
ｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｍａｙ ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８４．ＰＭＩＤ：
２６０１９２２０．
３１．Ｄｅｉｇｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ
ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００８ Ｊａｎ；９３（１）：７−１４．ＰＭＩＤ
：１７９３３５７４．
３２．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃａ
ｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ａｐｒ；１１（２）：８７−９３．ＰＭＩＤ：１８
３５９２６９．
３３．Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．Ａｍｍｏｎｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｃ
ｏｇｎｉｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄ
ｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｅｎｙｌ
ｂｕｔｙｒａｔｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１３ Ｊｕｎ；５７（６）：２１７１−
９．ＰＭＩＤ：２２９６１７２７．
３４．Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄ
ｉｉ ＣＮＣＭ Ｉ−７４５ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｎｏｖ；１４
（１１）：１５９３−６０９．ＰＭＩＤ：２４９９５６７５．
３５．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ．Ａ ｎｅｗ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｒｓｅ
ｆｕｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｈｅｒｅｄ．１９７４ Ｍａｙ−Ｊ
ｕｎ；６５（３）：１９４−５．ＰＭＩＤ：４６０３２５９．
３６．Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅ
ｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９７５ Ｊｕｎ
１９；１３８（３）：２２５−３２．ＰＭＩＤ：１１０２９３１．
３７．Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．１９８９ Ｊｕｌ；３（７）：８６９−７８．ＰＭＩＤ：２６７７６０２
．
３８．Ｆｒａｇａ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ（１０．３．１−１０．３．３３）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．
３９．Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＦＮＲ−ｌｉｋｅ ｃｏｎｔ
ｒｏｌ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ Ｍａｒ；１７３（５）：１５９８
−６０６．ＰＭＩＤ：１９００２７７．
４０．Ｇａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｃＤＡＢＣ
ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１９９１ Ａｕｇ；１７３（１５）：４７４２−５０．ＰＭＩＤ：１９０６８
７１．
４１．Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｔｏｇｇｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔ
ｕｒｅ．２０００；４０３：３３９−４２．ＰＭＩＤ：１０６５９８５７．
４２．Ｇｏｒｋｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍａｎｙ ｗａｙｓ ｔｏ ｍａｋｅ ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｏｕｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２００８ Ａｕｇ；６（８）：６１３−２４．ＰＭＩＤ：１８６２８７６９．
４３．Ｈａｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｕｒｅａ ｃ
ｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．２０１２
Ｍａｙ ２９；７：３２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２６４２８８０．
４４．Ｈａｂｅｒｌｅ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓ
ｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｙｐｅｒａｍｍｏ
ｎｅｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１
３ Ａｕｇ １５；５３６（２）：１０１−８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６２８３
４３．
４５．Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎ
ｓｕｓ ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ＤＮＲ ｏｆ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｉｔｒｉ
ｔｅ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ｓｅｐ １５；１６６（２
）：２１３−７．ＰＭＩＤ：９７７０２７６．
４６．Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｐｆａｓｈ ｍｏｕｓｅ：ａ ｍｉｓｓｅ
ｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａ
ｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ａｌｓｏ ｃａｕｓｅｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｍＲＮＡ ｓｐ
ｌｉｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８９ Ｊｕｎ
；８６（１１）：４１４２−６．ＰＭＩＤ：２４７１１９７．
４７．Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｎｉｔ
ｒｏｕｓ−ｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎ
ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３ Ｎｏｖ １５；２１８
（１）：４９−５７．ＰＭＩＤ：８２４３４７６．
４８．Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ．Ｈａｎｄｂ Ｃｌｉｎ
Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３；１１３：１７５５−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６
２２３９９．
４９．Ｈｏｓｓｅｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ ａｓ ａ ｈｅａｌｔ
ｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｈｕｍａｎ ｇｕｔ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ．２０１１ Ｍａｙ；６９（５）：２４５−５８
．ＰＭＩＤ：２１５２１２２７．
５０．Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｔｉｍｕｌｏｎ ｉｎ Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１ Ｊａ
ｎ ２０；１２：５１．ＰＭＩＤ：２１２５１２５５．
５１．Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ ｅｔ ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｒｅａｓｅ ａｎｄ
ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．
Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２０１２ Ｄｅｃ；１３（８）：７８９
−８０６．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３３０５３６５．
５２．Ｌａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏ
ｐａｔｈｙ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ ｍａｎａｇ
ｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｇｌｕｍｉｃ ａｃｉｄ．Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ．２０１４ Ｏ
ｃｔ；２１（５）：ｅ７３６−９．ＰＭＩＤ：２５３０２０４６．
５３．Ｌｅｏｎａｒｄ（２００６）．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃ
ｙｃｌｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎｂｏｒｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４^ｔｈ ｅｄ（ｐｐ．２６３−２７２）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ｅｄｉｚｉｎ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
５４．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ａｒｇＲ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ａｎｄ ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐ
ｒｅｓｓｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｏｃｔ
；８４（１９）：６６９７−７０１．ＰＭＩＤ：３１１６５４２．
５５．Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉ
ｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ
ａｌｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００１
；２（４）．ＰＭＩＤ：１１３０５９４１．
５６．Ｍａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏ
ｆ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｉｂ
ｉｌｉｔｙ ｉｎ ｄｉｐｌｏｉｄｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６４ Ｍａｒ；８：
３６５−７０．ＰＭＩＤ：１４１６８６９０．
５７．Ｍａａｓ．Ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９４ Ｄｅｃ；５８（４）：
６３１−４０．ＰＭＩＤ：７８５４２５０．
５８．Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃａｄ ｏｐｅｒｏｎ：ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏ
ｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ
．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２ Ａｐｒ；１７４（８）：２６５９−６９．ＰＭＩ
Ｄ：１５５６０８５．
５９．Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＮＲ ｄｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｈａｒｇｅ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ．２００６ Ｎｏｖ ３；２８１（４４）：３３２６８−７５．ＰＭＩＤ：１
６９５９７６４．
６０．Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ｉｎｇ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８４；１９７（１）：８２−９．ＰＭＩＤ：６０９
６６７５．
６１．Ｎａｇａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ
ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔ
ａｂ．２０１２ Ｓｅｐ；１０７（１−２）：１０−４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２
８４１５１６．
６２．Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ，ｃｈｒｏｎｉ
ｃ，ａｎｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ ｂｙ ｗｉｌ
ｄ−ｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．
２００８ Ｏｃｔ；４８（４）：１１８４−９２．ＰＭＩＤ：１８６９７２１１．
６３．Ｎｉｃｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ
ｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００４ Ｓｅｐ
；１８６（１８）：６０５９−６９．ＰＭＩＤ：１５３４２５７５．
６４．Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄ
ｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏ
ｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ａｕｇ １１；３１３（５７８８）：
８４８−５１．ＰＭＩＤ：１６９０２１４２．
６５．Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｓｔｒａｉｎ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｄｉｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｕｔ
Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．２０１２ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５０１−９．ＰＭＩＤ：２
２８９５０８５．
６６．Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈ
ｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ａｎ ｅｎｔｉｔｙ ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｎ−ｐａｔｉｅｎｔ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；３７（１０）：１２２９−３２．Ｒｅｖｉｅｗ
．ＰＭＩＤ：２３９３２５４９．
６７．Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆｅｅｄ
ｂａｃｋ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔ
ａｓｅ（ａｒｇＡ） ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉ
ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｍａｙ；６４（５）：１８０５−１１．ＰＭＩＤ：９５
７２９５４．
６８．Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ａｎｒ ｇｅｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９７ Ｎｏｖ １５；１５６（２）：２２７−３２．ＰＭ
ＩＤ：９５１３２７０．
６９．Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．２０１４ Ｏｃｔ １０；１８７：１０６−７．ＰＭＩＤ：２５０９３９３６．
７０．Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅ
ｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９９ Ａｕｇ ２１；３５４（９１７９）：６３５
−９．ＰＭＩＤ：１０４６６６６５．
７１．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２
２^ｎｄ ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．
７２．Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐ
ｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２．Ｔｈｅ ｅｆｆ
ｅｃｔｓ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ＦＮＲ．Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｕｇ ８；２７８（３２）：２９８３７−５５．ＰＭＩＤ
：１２７５４２２０．
７３．Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｚＥＦ
ｓｕｉｃｉｄｅ ｍｏｄｕｌｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ ｄｅａｔ
ｈ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３ Ｍａｒ；１８５（６）：１８０３−７．ＰＭＩ
Ｄ：１２６１８４４３．
７４．Ｓａｗｅｒｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇ
ｕｌａｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１
ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｍ
ｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ＦＮＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１ Ｊｕｎ；５（６）：１４６９−
８１．ＰＭＩＤ：１７８７７９７．
７５．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａ
ｎｄ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐａｔｈ
ｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８
Ａｕｇ； １８０（１６）：４２７８−８６．ＰＭＩＤ：９６９６７７９．
７６．Ｓｃｈｕｌｔｚ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ
１９１７ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｌ
ａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．２００８ Ｊｕｌ；１４（７）：１０１２−８．Ｒｅｖｉ
ｅｗ．ＰＭＩＤ：１８２４０２７８．
７７．Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ − ｆｅａ
ｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｅｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．２００９；２１：１
２２−５８．
７８．Ｓｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｉｔｎｅｓｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ａ ｓｅａｓｏｎａｌ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００
３ Ｏｃｔ ２８；１００（２２）：１２７８２−６．ＰＭＩＤ：１４５５５７６６．
７９．Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ．Ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎ
ａｌ ｔｒａｃｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．１９６６ Ｎｏｖ；４５
（６）：４９１−６．ＰＭＩＤ：５９２５９００．
８０．Ｓｚｗａｊｋａｊｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｏｃｔ
５；３１２（５）：９４９−６２．ＰＭＩＤ：１１５８０２４１．
８１．Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅ
ｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｔｏ ｉｔｓ ｏ
ｐｅｒａｔｏｒ ｓｉｔｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｊｕｌ ２０；２２６
（２）：３８７−９７．ＰＭＩＤ：１６４０４５７．
８２．Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅ
ｅｎ ｔｈｅｉｒ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
１９９４ Ｊａｎ ７；２３５（１）：２２１−３０．ＰＭＩＤ：８２８９２４３．
８３．Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉ
ｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏ
ｆ ａｃｕｔｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｏｃ
ｔ ２３；２２（１）：５８−６４．ＰＭＩＤ：２５３３８９２１．
８４．Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｎｒ ａｎｄ Ｄｎｒ ｒｅｇｕｌｏｎｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
０１０ Ｊｕｎ；１２（６）：１７１９−３３．ＰＭＩＤ：２０５５３５５２．
８５．Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｕｒｅａ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７ Ｊａｎ；６３（１）：３３−８．ＰＭＩ
Ｄ：８９７９３３６．
８６．Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｅａｋｙ ｇｕｔ ｂｙ ｅｎｈａ
ｎｃｉｎｇ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００７ Ｄｅ
ｃ １２；２（１２）：ｅ１３０８．ＰＭＩＤ：１８０７４０３１．
８７．Ｕｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａ
ｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓ
ｅ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ａｃｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ．１９９７ Ｊｕｌ ４；１３２０（３）：２１７−３４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭ
ＩＤ：９２３０９１９．
８８．Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｕｖｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ ｍｕｔａｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗ
ｔｈ ｏｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｆｏｕｒ−ｇｅｎｅ
ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ
ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ Ｄｅｃ；１６０（３）：９２８−
３４．ＰＭＩＤ：６４３８０６４．
８９．Ｗａｌｋｅｒ．Ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎａｅｍｉａ ｉｎ ａｄｕｌ
ｔｓ ｎｏｔ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ Ｃｌ
ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２ Ｍａｙ；４９（Ｐｔ ３）：２１４−２８．Ｒｅｖｉ
ｅｗ．ＰＭＩＤ：２２３４９５５４．
９０．Ｗｉｎｔｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｕｌａｔ
ｏｒｓ ＡＮＲ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ａｎｄ ＦＮ
Ｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｖｅ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｂ
ｕｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃａ
ｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９
６ Ｍａｒ；１４２（ Ｐｔ ３）：６８５−９３．ＰＭＩＤ：８８６８４４４．
９１．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔ
ｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｆｏＸ ｂｙ ｃ
ｙｃｌｉｃ ＡＭＰ（ｃＡＭＰ） ａｎｄ ｃＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｏｃｔ ７；５：１４９２１．
ＰＭＩＤ：２６４４２５９８．
９２．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｃｙａｎｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ａｎｒ，ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｏｍ
ｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ｆｎｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１ Ｊｕｎ；５（６）：１４８３−９０．ＰＭＩＤ：１７
８７７９８．
９３．Ｗｒｉｇｈｔ Ｏ，Ｄｅｌｍａｎｓ Ｍ，Ｓｔａｎ ＧＢ，Ｅｌｌｉｓ Ｔ．Ｇｅ
ｎｅＧｕａｒｄ：Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｉｇｎｅ
ｄ ｆｏｒ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｒ
２０；４（３）：３０７−１６．ＰＭＩＤ：２４８４７６７３．
９４．Ｌｉｕ Ｙ，Ｗｈｉｔｅ ＲＨ，Ｗｈｉｔｍａｎ ＷＢ．Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｉ ｕｓｅ ｔｈｅ ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ（ＤａｐＬ） ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｌｙｓｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１０ Ｊｕｌ；１９２（１３）：３３０４−１０．ＰＭ
ＩＤ：２０４１８３９２．
９５．Ｄｏｇｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｓｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，Ｐｒｏｆ．Ｄｅｎｉｚ Ｅｋｉｎｃｉ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１
−００７６−８，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：
９６．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ／ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−ｏｆ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｂ
ｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
９７．Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２ Ｏｃｔ；１７４（１９
）：６０６１−７０．ＰＭＩＤ：１３５６９６４．
９８．Ｌｏｄｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ
．２００８ Ａｐｒ；３４（１−２）：９１−１０６．ＰＭＩＤ：１９６６９４９５．
９９．Ｒｅｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒ
ｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏ
ｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２０１２；８（
６）：ｅ１００２５３７．ＰＭＩＤ：２２６８５３９０．
１００．Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｕｔ
ｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔＪ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ
ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８４ Ｎｏｖ
２５；２５９（２２）：１４２８２−５．ＰＭＩＤ：６０９４５４９．
１０１．Ｓｈｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉ
ｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｍｅｔＪ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉ
ｏｎｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔＦ ｇｅｎｅ
．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８５ Ｊｕｎ；８２（１１
）：３６０１−５．ＰＭＩＤ：１６５９３５６４．
１０２．ｖａｎ Ｈｅｅｓｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｓｓｉｍｉｌａ
ｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｐｕｔｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｄａｔａ ｉｎｔｏ ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１３ Ｄｅｃ；７７（４）：６２８−９５．
ＰＭＩＤ：２４２９６５７５．
[実施例]

以下の実施例は、本開示の例示的実施形態を示す。当業者は、本開示の精神または範囲
を変更することなく実施することができる多くの変更形態および変形形態を認識する。そ
のような変更形態および変形形態は、本開示の範囲内に含まれる。実施例は、本開示を多
少なりとも限定するものではない。
アルギニンリプレッサー結合部位（ＡＲＧボックス）
[実施例１]

ＡＲＧボックス突然変異
大腸菌ニッスルにおける各アルギニン生合成オペロンのＡｒｇＲ結合部位を含む野生型
ゲノム配列を表３に示す。それらの配列の改変は、以下のパラグラフに従って設計される
。各野生型配列については、ＡＲＧボックスを斜体で示す。アルギニンレギュロンのＡＲ
Ｇボックスは、各オペロンのプロモーター領域と重複する。下線付きの配列は、ＲＮＡポ
リメラーゼ結合部位を表し、それらの配列は、変更しなかった。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡ
メチル化から保護される塩基は網掛け付きであり、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカ
ル攻撃から保護される塩基は太字である。網掛け付きの塩基および太字の塩基は、Ａｒｇ
Ｒ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。
[実施例２]

ラムダレッド組換え
ラムダレッド組換えを用いて、染色体改変、例えば、ＡＲＧボックス突然変異を施した
。ラムダレッドは、バクテリオファージラムダに由来する組換え酵素を用いて、カスタム
ＤＮＡの断片を大腸菌の染色体に挿入する手法である。ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ニ
ッスル宿主株に導入する。大腸菌ニッスル細胞をＬＢ培地中で一夜増殖させる。一夜培養
を５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ_６００に達するまで増
殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌細胞を４℃で２
，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する
。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍ
Ｌの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を
除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに
設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペッティングし
、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングすることによって混合する。乾燥キュベッ
トを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加
え、混合物を培養管に移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択培地プレー
ト上に広げ、３０℃で一夜インキュベートする。

表３に示す所望のＡＲＧボックス配列を含むＤＮＡ配列を遺伝子合成会社に発注した。
ａｒｇＡオペロンについては、突然変異調節領域は、以下の核酸配列（配列番号２）を含
む：ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａ
ｔｃａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇ。
ラムダ酵素を用いて、この構築物を相同的組換えにより大腸菌ニッスルのゲノムに挿入す
る。構築物は、そのＤＮＡ配列に基づいて大腸菌ニッスルのゲノムにおける特定の部位に
挿入される。構築物を特定の部位に挿入するために、構築物に隣接する相同ＤＮＡ配列を
識別する。ＤＮＡの相同配列は、突然変異配列の両側の約５０塩基を含む。相同配列は、
合成遺伝子の一部として注文する。あるいは、相同配列は、ＰＣＲにより加えることがで
きる。構築物を用いて、大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＡの上流の天然配列を置換する。
構築物は、組換えによって除去することができる抗生物質耐性マーカーを含む。得られる
突然変異ａｒｇＡ構築物は、ａｒｇＡの上流の相同性の約５０塩基、組換えによって除去
することができるカナマイシン耐性マーカー、
ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａｔｃ
ａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇ、および
ａｒｇＡと相同性の約５０塩基を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＲＧボックスは、上述のようにａｒｇＧ調節領域において
突然変異させ、ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーターをラムダレッド組換えを用いて
調節領域に挿入した（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５）。これらの細菌は、アルギニンを産生する
ことができた。代替実施形態では、ａｒｇＧ調節領域（配列番号１６）は、ＡｒｇＲ抑制
性のままであり（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４）、細菌は、シトルリンを産生することができた
。
[実施例３]

大腸菌ニッスルの形質転換
突然変異ＡＲＧボックス構築物をｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッスルに導入する。すべて
の管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。一夜培養をアンピシリンを含む５ｍＬの
ＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．１のＯＤ_６００に達するまで増殖させる。０．０５
ｍＬの１００Ｘ Ｌ−アラビノース保存溶液を加えて、ｐＫＤ４６ラムダレッド発現を誘
導する。培養を０．４〜０．６のＯＤ_６００に達するまで増殖させる。大腸菌細胞を４℃
で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁
する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．
５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上
清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋ
Ｖに設定する。０．５μｇの突然変異ＡＲＧボックス構築物を細胞に加え、ピペッティン
グにより混合し、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングする。乾燥キュベットを試
料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混
合物を培養管に移し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞をカナマイシンを含むＬ
Ｂプレート上に広げ、一夜インキュベートする。
[実施例４]

突然変異体の確認
突然変異体の存在をコロニーＰＣＲにより確認する。コロニーをピペットチップにより
採取し、上下にピペッティングすることによって２０μｌの冷ｄｄＨ_２Ｏに再懸濁する。
３μｌの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピ
ペットで移す。インデックスプレートを３７℃で一夜増殖させる。５μＬの１０Ｘ ＰＣ
Ｒ緩衝液、０．６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．４μＬの５０ｍＭ Ｍｇ_２ＳＯ_４、
６．０μＬの１０Ｘエンハンサーおよび３．０μＬのｄｄＨ_２Ｏを用いてＰＣＲマスター
ミックスを調製する（ＰＣＲ反応当たり１５μＬのマスターミックス）。ａｒｇＡ突然変
異構築物に特有の２μＬのプライマー（１００μＭ保存液）を１６μＬのｄｄＨ_２Ｏに混
合することによって１０μＭプライマーミックスを調製する。各２０μＬ反応について、
１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬ
のプライマーミックスおよび１．０μＬのＰｆｘ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＤＮＡ Ｐｏｌを
ＰＣＲ管中で混合する。ＰＣＲサーモサイクラーを次のようにプログラムし、ステップ２
〜４を３４回反復する：１） ５：００分に９４℃、２）０：１５分に９４℃、３）０：
３０分に５５℃、４）２：００分に６８℃、５）７：００分にｍ６８℃および次に４℃に
冷却する。１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５Ｘ染料を用いてＰＣＲ産物を
ゲル電気泳動により解析する。突然変異がゲノムに挿入された場合のみ、ＰＣＲ産物が形
成する。
[実施例５]

選択マーカーの除去
抗生物質耐性遺伝子をｐＣＰ２０で除去する。突然変異ＡＲＧボックスを有する各菌株
を０．４〜０．６のＯＤ_６００に達するまで抗生物質を含むＬＢ培地中で３７℃で増殖さ
せる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。細胞を４℃で２，０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を
４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水
に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細
胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。
１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌
済み冷却キュベット中にピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、
電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、
３０℃で１〜３時間インキュベートする。細胞をカナマイシンを含むＬＢプレート上に広
げ、一夜インキュベートする。一夜で十分なＯＤ_６００に増殖しないコロニーは、さらに
２４時間インキュベートする。２００μＬの細胞をアンピシリンプレート上に広げ、２０
０μＬの細胞をカナマイシンプレート上に広げ、両方を３７℃で一夜増殖させる。アンピ
シリンプレートは、ｐＣＰ２０を有する細胞を含む。カナマイシンプレートは、いくつの
細胞がエレクトロポレーションで生き残るかの兆候を示す。アンピシリンプレートからの
形質転換細胞を４３℃で非選択的に精製し、一夜増殖させる。
[実施例６]

形質転換細胞の確認
精製形質転換細胞をアンピシリンおよびカナマイシンに対する感受性について試験する
。４３℃で増殖したプレートからのコロニーを採取し、１０μＬのＬＢ培地に再懸濁する
。３μＬの細胞懸濁液を次の３つのプレートのそれぞれにピペッティングする。１）宿主
菌株のゲノムにおけるｋａｎＲ遺伝子の存否について試験する、カナマイシンを３７℃で
インキュベートしたＬＢプレート；２）ｐＣＰ２０プラスミドからのａｍｐＲ遺伝子の存
否について試験する、アンピシリンを３７℃でインキュベートしたＬＢプレート；および
３）３７℃でインキュベートした抗生物質を含まないＬＢプレート。個別のコロニーにつ
いてカナマイシンまたはアンピシリンプレート上に増殖が認められない場合、ｋａｎＲ遺
伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われたこととなり、さらなる解析のためにコ
ロニーを残しておく。残しておいたコロニーをＬＢプレート上に再び画線して、単一コロ
ニーを得て、３７℃で一夜増殖させる。突然変異ゲノムＡＲＧボックスの存在は、ゲノム
のａｒｇＡ領域の配列決定により確認する。

ラムダレッド組換えの方法、大腸菌ニッスルの形質転換、突然変異の確認、選択マーカ
ーの除去、および形質転換細胞の確認／配列決定を表３に示すＡＲＧボックス突然変異お
よびオペロンのそれぞれについて反復する。得られる細菌は、ＡＲＧボックスへのＡｒｇ
Ｒの結合が減少し、オペロンの調節領域への全ＡｒｇＲ結合が減少するような、アルギニ
ン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変
異を含む。
[実施例７]

アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂ
ｒ）
上述のＡＲＧボックスの突然変異に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、次のプロモーター
：テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番号１８〜２９から選択されるＦＮＲプロ
モーターのそれぞれの制御下に発現するアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグ
ルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ、配列番号３０）遺伝子をさらに含む。本明細
書に記載の通り、他のプロモーターを用いることができる。

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に
発現する。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１は、プラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、
テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒならびに各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧ
ボックスにおける突然変異を含む。プラスミドは、機能性ＡｒｇＲ結合部位、すなわち、
ＡＲＧボックスを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１を用いて、プラスミド上の野生型Ａｒ
ｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒならびに各アルギニン生
合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２を作製
した。該プラスミドは、機能性ＡｒｇＲ結合部位、すなわち、ＡＲＧボックスをさらに含
む。場合によっては、機能性ＡｒｇＲの存在および／または蓄積がＡＲＧボックス以外の
部位におけるオフターゲット結合をもたらし得る。このプラスミドに機能性ＡＲＧボック
スを導入することは、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させるのに、すなわ
ち、ＡｒｇＲシンクとしての役割を果たすことによって、有用なものであり得る。ＳＹＮ
−ＵＣＤ１０４は、低コピープラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサ
イクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧ、およびａｒｇＧを除
く各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ１０５は、低コピープラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイク
リン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、構成的に発現するａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プ
ロモーターを含む配列番号１７）および各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックス
における突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照ニッスル構築物である。

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を、大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａ
ｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数における細
菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参
照されたい。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要
求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部
位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢお
よびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間
であってもよい。挿入の部位において、挿入部位と、およびａｒｇＡ^ｆｂｒ構築物と相同
であるＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含む線状ＤＮ
Ａ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを上述のように実施する。

得られる大腸菌ニッスル細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの
１つまたは複数の、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのＡｒｇＲ結合およびアル
ギニン結合を介した、アルギニン媒介抑制を減少させる核酸突然変異を含むように遺伝子
操作されており、それによってアルギニンおよび／またはシトルリンの生合成が強化され
る。

アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）配列 大腸菌ニッスルにおける野生型ａｒｇＲヌ
クレオチド配列およびａｒｇＲ欠失後のヌクレオチド配列を以下の表２１および表２２に
示す。

[実施例９]

ＡｒｇＲの欠失
ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ニッスル宿主株に導入する。大腸菌ニッスル細胞をＬＢ
培地中で一夜増殖させる。一夜培養を５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．４〜
０．６のＯＤ_６００に達するまで増殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃
に予冷する。大腸菌細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、
細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００
ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エ
レクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大
腸菌細胞に加え、ピペッティングし、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングするこ
とによって混合する。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。
１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３０℃で１時間インキュ
ベートする。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一夜インキュベートする。

ＡｒｇＲ遺伝子の上流および下流の相同性の約５０塩基をＰＣＲによりｐＫＤ４プラス
ミドにおけるカナマイシン耐性遺伝子に加えて、次のＫａｎＲ構築物：（ＡｒｇＲの上流
の約５０塩基）（ターミネーター）（ｐＫＤ４のＦＲＴ部位により隣接されたｋａｎＲ遺
伝子）（ａｒｇＲの下流のＤＮＡ）を作製する。

いくつかの実施形態では、ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子の両方を上述のラムダレッド
組換えを用いて欠失させることにより、細菌は、シトルリンを産生することができる。
[実施例１０]

アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂ
ｒ）およびＡｒｇＲ欠失を有する細菌菌株
上述のＡｒｇＲ欠失に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、以下のプロモーターのそれぞれ
の制御下に発現するアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテタ
ーゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ、配列番号３０）遺伝子をさらに含む：テトラサイクリン誘導性プ
ロモーター、配列番１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーター。上述のように、他の
プロモーターを用いることができる。

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に
発現する。ＡｒｇＲは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ２０３のそれぞれにおいて欠失している（ΔＡｒｇＲ）。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１は、
野生型ａｒｇＡをさらに含むが、誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを欠いている。ＳＹＮ−ＵＣＤ２
０２は、ΔＡｒｇＲおよび高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーター
の制御下に発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲおよび
低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇ
Ａ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテ
トラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−
ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーター（
ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を、大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａ
ｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数における細
菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参
照されたい。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要
求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部
位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢお
よびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間
であってもよい。挿入の部位において、挿入部位と、およびａｒｇＡ^ｆｂｒ構築物と相同
であるＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含む線状ＤＮ
Ａ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを上述のように実施する。得られる大
腸菌ニッスル細菌は、欠失ＡｒｇＲおよび挿入フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタ
ミン酸シンテターゼを有し、それにより、アルギニンまたはシトルリン生合成を増加させ
る。
[実施例１１]

ΔＴｈｙＡの発生
栄養要求性突然変異は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を
欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下で
は細菌を死滅させる。栄養要求性の改変を有する遺伝子操作細菌を作製するために、オリ
ゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ニッスルにおけ
るｔｈｙＡの欠失は、チミジンが補給されない限り、ＬＢプレート上でコロニーを形成す
ることができない菌株を生じさせる。

ｔｈｙＡ：：ｃａｍ ＰＣＲ断片を以下のように３ラウンドのＰＣＲを用いて増幅した
。１００μｍの濃度で用いたプライマーの配列は、表２３に見いだされ
る。

第１のＰＣＲラウンドについては、鋳型としての１ｎｇ ｐＫＤ３、２５μｌ２ｘｐｈ
ｕｓｉｏｎ、０．２μｌプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８、ならびに０、０．２、０．
４または６μｌ ＤＭＳＯを含む４ｘ５０μｌ ＰＣＲ反応物をヌクレアーゼ不含有水を
用いて５０μｌとし、以下のサイクル条件下で増幅した。
ステップ１：３０秒間９８ｃ
ステップ２：１０秒間９８ｃ
ステップ３：１５秒間５５ｃ
ステップ４：２０秒間７２ｃ
反復ステップ２〜４：３０サイクル
ステップ５：５分間７２ｃ

その後、５μｌのＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行って、適切なサイズのＰＣＲ産物
を確認した。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを用いて製造業者の指示に従って
、残りのＰＣＲ反応からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ不含有水で溶出し
た。

第２のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、０
．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除き、上で述べた４ｘ５０μｌ ＰＣＲ
反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上述したの
と同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけて、増幅を確認し、精製し、上述の
ように３０μｌで溶出した。

第３のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、プ
ライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて、上で述べた４ｘ５０μｌ ＰＣＲ反応におけ
る鋳型として用いた。サイクル条件は、ラウンド１および２について述べたのと同じであ
った。上述のように増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出した。濃度および純度は、
分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に相同の９２ｂｐ、ｆｒｔ部位により隣接
されたクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同の９８ｂｐを含
む、得られた線状ＤＮＡ断片を組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッス
ル１９１７株に形質転換させた。エレクトロポレーションの後、３ｍＭチミジンを含む１
ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を振盪しながら３７℃で２時間回復させた。次いで細胞を
１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを
含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ ｔｈｙおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニ
コールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一夜インキュベートした。Ｌ
Ｂプレート上に出現したコロニーを再び画線した。＋ｃａｍ ２０μｇ／ｍｌ＋または−
ｔｈｙ ３ｍＭ（ｔｈｙＡ栄養要求体のみがｔｈｙ ３ｍＭを添加した培地中で増殖する
）

次に、ｐＣＰ２０形質転換によって抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌ
ｐ組換え遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子および温
度感受性複製を有する。細胞を選択抗生物質を含むＬＢ培地中でＯＤ_６００＝０．４〜０
．６となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＬの細胞を次のように洗浄した。細胞を１６，
０００ｘｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬ氷冷１０％グリセロ
ールに再懸濁した。この洗浄ステップを３回反復した。最終ペレットを７０μｌの氷冷１
０％グリセロールに再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡとと
もにエレクトロポレートし、３ｍＭチミジンを添加した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベッ
トに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。次に、細胞を
１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを
含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ ｔｈｙおよび１００μｇ／ｍｌカルベニシリ
ンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転
換細胞を４２℃で非選択的（無抗生物質）にコロニー精製した。

コロニー精製形質転換細胞を試験するために、コロニーを４２℃プレートからピペット
チップで採取し、１０μｌのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を次の一組の３つの
プレート上にピペッティングした：Ｃａｍ（３７℃；宿主菌株のゲノムにおけるＣａｍＲ
遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ（３０℃；ｐＣＰ２０プラスミドから
のＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）および３７℃のＬＢのみ（クロラムフェニ
コールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）。ＣａｍまたはＡｍｐ
プレートのいずれにおいても増殖が存在しない場合、コロニーは治癒したとみなし、採取
し、ＬＢプレート上に再画線して、単一コロニーを得て、３７℃で一夜増殖させた。
[実施例１２]

アンモニアの定量
上述の遺伝子操作細菌を５ｍＬのＬＢ中で一夜増殖させた。翌日、細胞をペレット化し
、Ｍ９＋グルコースで洗浄し、ペレット化し、３ｍＬのＭ９＋グルコースに再懸濁した。
細胞培養を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４時間インキュベートし、Ｃｏｙ嫌気性チャン
バー（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）中で３７℃で好気的または嫌気的にイ
ンキュベートした。各細胞の相対存在量を決定するために、ベースライン時（ｔ＝０）、
２時間目および４時間目に各細胞培養のＯＤ_６００を測定した。

培地中のアンモニアの濃度を決定するために、ｔ＝０、２時間および４時間目に各細胞
培養の１ｍＬアリコートをＮｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ ３００で分析した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２
の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができた（図２６）。図２５、２
６および２７にＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３お
よびブランク対照を用いたアンモニア濃度の棒グラフを示す。
[実施例１３]

アルギニンおよびシトルリンの定量
いくつかの実施形態では、上述の遺伝子操作細菌をＬＢ中で振盪しながら３７℃で一夜
増殖させる。細菌を５ｍＬのＬＢで１：１００に希釈し、振盪しながら３７℃で１．５時
間増殖させる。細菌培養を以下のように誘導する。（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを
含む細菌を３７℃のＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２および
２０ｍＭ硝酸塩を供給）中で嫌気的条件でＬＢ中で３７℃で最長４時間誘導する。（２）
テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む細菌をアンヒドロテトラサイクリン（１０
０ｎｇ／ｍＬ）により誘導する。（３）アラビノース誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む細菌を
グルコース欠損培地中で１％アラビノースにより誘導する。誘導後、細菌細胞をインキュ
ベーターから除去し、最大速度で５分間遠沈する。細菌を１ｍＬのＭ９グルコースに再懸
濁し、ＯＤ_６００を測定する。細胞をＯＤ_６００が０．６〜０．８となるまで希釈する。
Ｍ９グルコース培地中の再懸濁細胞を振盪しながら３７℃で好気的に増殖させる。１００
μＬの細胞再懸濁液を除去し、０時間目にＯＤ_６００を測定する。質量分析（ＬＣ−ＭＳ
／ＭＳ）のために１００μＬアリコートを丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結する
。その後の各時点に、１００μＬの細胞懸濁液を除去し、ＯＤ_６００を測定し、質量分析
のために１００μＬアリコートを丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結する。試料は
、アルギニンおよび／またはシトルリン濃度について分析する。各時点に、質量分析対Ｏ
Ｄ_６００により測定された標準化濃度を用いて、単位時間当たり細胞当たりのアルギニン
および／またはシトルリンの産生の速度を決定する。

いくつかの実施形態では、上述の遺伝子操作細菌を寒天上の単一コロニーのグリセロー
ル保存液から画線する。コロニーを採取し、３ｍＬのＬＢ中で４時間または一夜増殖させ
、次いで２５００ｒｃｆで５分間遠心分離する。培養を０．５％グルコースを含むＭ９培
地で洗浄する。培養を０．５％グルコースを含む３ｍＬのＭ９培地に再懸濁し、ＯＤ_６０
０を測定する。すべてのＯＤ_６００が０．４〜０．５となるように、培養を０．５％グル
コースを含み、ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含みまたは含まず、２０ｍＭグルタミンを
含むまたは含まないＭ９培地で希釈する。各試料の０．５ｍＬアリコートを除去し、１４
，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、残しておく。上清を−８０℃で凍結
し、細胞ペレットを−８０℃で凍結する（ｔ＝０）。残りの細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）
しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％
Ｈ_２を供給）中で３７℃で好気的または嫌気的にインキュベートする。１つの０．５ｍＬ
アリコートを各試料から２時間ごとに除去し、ＯＤ_６００を測定する。アリコートを１４
，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去する。上清を−８０℃で凍結し、細胞ペ
レットを−８０℃で凍結する（ｔ＝２、４および６時間）。試料を氷上におき、質量分析
を用いてアルギニンおよびシトルリンレベルを測定する。

細菌培養上清について、水中５００、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬアルギ
ニンおよびシトルリン標準の試料を調製する。丸底９６ウエルプレートにおいて、２０μ
Ｌの試料（細菌上清または標準）を、最終２μｇ／ｍＬ濃度のＬ−アルギニン−^１３Ｃ_６
，^１５Ｎ_４（Ｓｉｇｍａ）およびＬ−シトルリン−２，３，３，４，４，５，５−ｄ７（
ＣＤＮ同位体）内部標準を含む８０μＬの水に加える。プレートをＰｉｅｒｃｅＡＳｅａ
ｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合する。Ｖ型底９６ウエルポリプロピレンプレ
ートにおいて、５μＬの希釈試料を９５μＬの誘導体化ミックス（８５μＬの１０ｍＭ
ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．７および１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ塩化ダンシル（アセトニトリ
ルで希釈））に加える。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、
十分に混合する。試料を誘導化のために６０℃で４５分間インキュベートし、４０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離する。丸底９６ウエルプレートにおいて、２０μＬの誘導体化試料
を０．１％ギ酸を含む１８０μＬの水に加える。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシート
を用いて熱融着させ、十分に混合する。

アルギニンおよびシトルリンは、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘ三連
四重極質量分析計を用いたタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−
ＭＳ／ＭＳ）により測定する。以下の表２４にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要を示す。

ＡＴＣもしくは嫌気性誘導物質の存在下または非存在下における遺伝子操作細菌におけ
る細胞内アルギニンおよび分泌（上清）アルギニン産生を測定し、同じ条件下の同じ菌株
の対照細菌と比較する。

ＡＴＣもしくは嫌気性誘導物質の存在下または非存在下における遺伝子操作細菌におけ
る６時間にわたる総アルギニン産生を測定し、同じ条件下の同じ菌株の対照細菌と比較す
る。
[実施例１４]

高アンモニア血症および急性肝不全のマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに急性肝不全および高アンモニア血症を引き起こす、チ
オールアセトアミド（ＴＡＡ）を投与する（Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年）。ＴＡＡマ
ウスモデルは、業界で受け入れられているＨＥのｉｎ ｖｉｖｏモデルである。マウスに
非改変対照ニッスル細菌または上述の高レベルのアルギニンもしくはシトルリンを産生す
るように操作されたニッスル細菌を投与する。

１日目に、５０ｍＬの細菌培養を一夜増殖させ、ペレット化する。ペレットを５ｍＬの
ＰＢＳに約１０^１１ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で再懸濁する。マウスにおける血中アンモニ
アレベルは、下顎採血により測定し、ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）によりアンモニアレベルを決定する。マウスに１００μＬの細
菌（約１０^１０ＣＦＵ）を強制経口投与する。マウスの飲料水を０．１ｍｇ／ｍＬのアン
ヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および味を良くするための５％スクロースを含むよう
に交換した。

２日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を
強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料
水を与え続ける。

３日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を
強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料
水を与え続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中２５０ｍｇ／ｋｇ
体重）の腹腔内（ＩＰ）注射を受ける。

４日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を
強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料
水を与え続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中２５０ｍｇ／ｋｇ
体重）のもう１回のＩＰ注射を受ける。マウスにおける血中アンモニアレベルを下顎採血
により測定し、ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａ
ｙ）によりアンモニアレベルを決定する。

５日目に、マウスにおける血中アンモニアレベルを下顎採血により測定し、Ｐｏｃｋｅ
ｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）によりアンモニアレベ
ルを決定する。糞便ペレットをマウスから採取して、液体クロマトグラフィー−質量分析
（ＬＣ−ＭＳ）によりアルギニン含量を測定する。遺伝子操作ニッスルおよび非改変対照
ニッスルを投与したマウスにおけるアンモニアレベルを比較する。
[実施例１５]

高アンモニア血症およびＵＣＤのマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
オルニチントランスカルバミラーゼは、尿素回路酵素であり、ｓｐｆ−ａｓｈ突然変異
を含むマウスは、部分的オルニチントランスカルバミラーゼ欠損を示し、これがヒトＵＣ
Ｄのモデルとしての役割を果たす。マウスに非改変対照ニッスル細菌または上述の高レベ
ルのアルギニンもしくはシトルリンを産生するように操作されたニッスル細菌を投与する
。

６０匹のｓｐｆ−ａｓｈマウスに本発明の遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ２０４）またはＨ２Ｏ対照を１００μｌ ＰＯ ＱＤで投与した：Ｈ２Ｏ対
照、通常食（ｎ＝１５）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ１
０３、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、高タンパク質食（ｎ＝１５
）。１日目に、マウスの体重を測定し、各群に選別して、ケージ当たりのマウスの体重の
変動を最小限にした。マウスに強制経口投与し、２０ｍｇ／Ｌ ＡＴＣを含む水をケージ
に加えた。２日目に、マウスに午前および午後に強制経口投与した。３日目に、マウスに
朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、ベースラインア
ンモニアレベルを得た。マウスに午後に強制経口投与し、飼料を７０％タンパク質飼料に
変更した。４日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。５日目に、マウスに朝
に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベル
を得た。６および７日目に、マウスに朝に強制経口投与した。８日目に、マウスに朝に強
制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得
た。９日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。１０日目に、マウスに朝に強
制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得
た。１２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。１３日目に、マウスに朝に
強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを
得た。血中アンモニアレベル、体重および生存率を解析する（図２９）。
[実施例１６]

高タンパク質食で飼育した高アンモニア血症およびＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）のマウスモ
デルにおける遺伝子操作細菌の有効性
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルを用いて、高
タンパク質食の投与時のアンモニアレベルに対する低コピープラスミド上のｆｎｒプロモ
ーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコードする遺伝子操作細菌のｉｎ ｖｉｖｏで
の有効性を評価した。

低コピープラスミド上のｆｎｒプロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコード
する２つの菌株ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡならびに低コピープ
ラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーター（ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡｆｂ
ｒを含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ２０５（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦ
ＮＲ誘導性プロモーター（ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）を比
較して、チミジン栄養要求性が血液からのアンモニア除去の有効性に影響を及ぼし得るか
どうかを判断した。

Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０
６）またはＨ２Ｏ対照の経口投与により治療した。通常または高タンパク質食を次のよう
に与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６
、高タンパク質食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タン
パク質食（ｎ＝１０）。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６については、
細菌を１回投与した１、５、６および７日目を除いて、＞１×１０^１０細胞／ｍｌの１０
０μｌの用量を１２日間にわたり１日２回投与した。１日目に、マウスの体重を測定し、
無作為化した。Ｔ＝０ ＮＨ_４レベルをＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａ
ｌｙｚｅｒ （Ａｒｋｒａｙ）を用いて下顎採血により測定し、その後、マウスに強制経
口投与した。２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。３日目に、マウスに
朝および午後に強制経口投与し、飼料を通常飼料から７０％タンパク質飼料に変更した。
４日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。５日目に、マウスに朝に強制経口
投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。８
〜１２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。

図３０に見られるように、高タンパク質食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニア
レベルは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６群における高タンパク質食
への切り替え後４８時間目にＨ２Ｏ高タンパク質食対照群と比較して低下し、ＦＮＲ誘導
性プロモーターがＡｒｇＡｆｂｒの発現を駆動し、操作細菌を投与したマウスの血液中の
アンモニアレベルの低下をもたらしたことがわかる。アンモニアレベルの観測された低下
は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の両方において同様であり、Ｔｈ
ｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の有効性に有意な影響を有さないことが示唆され
る。
[実施例１７]

染色体挿入を用いた細菌菌株の操作
ＡｒｇＡｆｂｒがＭＡＬＥＫ部位においてＦＮＲ応答性プロモーターの制御下に大腸菌
ニッスルのゲノムに直接組み込まれている細菌菌株を構築した。

ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒをニッスルＭａｌＥおよびＭａｌＫ遺伝子座において染色
体に組み込むことができるベクターを作製するために、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて
、ニッスルＭＡＬＥ／Ｋ遺伝子座と相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列をノックインノック
アウト（ＫＩＫＯ）プラスミド上のフリッパーゼ組換え標的（ＦＲＴ）部位フランククロ
ラムフェニコール耐性（ｃｍＲ）カセットの両側に加えた。次いでＧｉｂｓｏｎアセンブ
リを用いて、ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ部位に隣接する、これらの相同性アーム間のＰｆｎ
ｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ ＤＮＡ配列をクローニングした。断片の挿入の成功は、配列決定
によってバリデートした。ＰＣＲを用いて、全ＭａｌＥＫ：：ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ：
：ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ：：ＭａｌＫ領域を増幅する。このノックインＰＣＲ断片
を用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含む
エレクトロコンピテントニッスル菌株を形質転換した。形質転換の後、細胞を３７℃で２
時間増殖させた。３７℃での増殖により、温度感受性プラスミドが治癒する。該断片の染
色体組込みの成功を有する形質転換細胞を２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにより
選択した。

いくつかの実施形態では、リコンビナーゼベースのスイッチを用いて、ＰｆｎｒＳ−Ａ
ｒｇＡｆｂｒの発現を活性化することができる。リコンビナーゼベースのスイッチがＡｒ
ｇＡｆｂｒの発現を調節することを可能にする菌株を構築するために、ＰｆｎｒＳ駆動Ｉ
ｎｔ５遺伝子およびｒｒｎＢＵＰ駆動のリコンビナーゼ部位フランクＡｒｇＡｆｂｒａｒ
ｅをＧｅｎｅｗｉｚ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）により合成した。Ｇｉｂｓｏｎアセン
ブリを用いて、ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−ＡｒｇＡｆｂｒ配列の両側のニッ
スルｍａｌＥおよびｍａｌＫ遺伝子座と相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列を加え、相同性
アーム間のこの配列をクローニングした。ＫＩＫＯプラスミドへの断片の挿入の成功は、
配列決定によってバリデートする。ＰＣＲを用いて、全ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢ
ＵＰ−ＡｒｇＡｆｂｒ領域を増幅する。このノックインＰＣＲ断片を用いて、ラムダレッ
ドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントニッスル菌株を形質転換する
。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させる。ｍａｌＥＫ遺伝子間領域におけるＰｆ
ｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒの組込みの成功を有する形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマ
イシンにより選択する。この戦略は、ＡｒｇＡｆｂｒ発現のためにＴ７ポリメラーゼ活性
を必要とするリコンビナーゼベースの菌株を構築するためにも用いることができる。
[実施例１８]

染色体挿入およびプラスミド保有操作細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ遺伝子座におけるｆｎｒ誘導性プロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂ
ｒの染色体挿入を有する遺伝子操作細菌菌株とｆｎｒ誘導性プロモーターにより駆動され
るＡｒｇＡｆｂｒを含む低コピープラスミドを含む菌株との間のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性
を比較するために、嫌気的誘導後の様々な時点に培地中のアルギニンレベルを測定した。
さらに、チミジンに対する栄養要求性がアルギニン産生効率に対して影響を有し得るかど
うかを評価するために、低コピープラスミド上にまたは染色体に組み込まれたｆｎｒ−Ａ
ｒｇＡｆｂｒを含む、ＴｈｙＡ欠失を含むもしくは含まない操作細菌菌株のアルギニン産
生を比較した。

一夜培養をＬＢで１：１００に希釈し、振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で増殖さ
せた。１．５時間の増殖の後に、細菌培養を以下のように誘導した。（１）ＦＮＲ誘導性
ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を３７℃のＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２
、５％Ｈ_２および２０ｍＭ硝酸塩を供給）中で嫌気的条件でＬＢ中３７℃で４時間誘導し
た；（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌をアンヒドロテトラサイク
リン（１００ｎｇ／ｍＬ）により誘導した。誘導後、細菌をインキュベーターから除去し
、最大速度で５分間遠沈した。細胞を１ｍＬのＭ９グルコースに再懸濁し、ＯＤ_６００を
測定した。細胞をＯＤ_６００が０．６〜０．８となるまで希釈した。Ｍ９グルコース培地
中再懸濁細胞を振盪しながら３７℃で好気的に増殖させた。１００μＬの細胞再懸濁液を
除去し、時間＝０におけるＯＤ_６００を測定した。１００μＬのアリコートを質量分析（
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結した。その後の各
時点（例えば、３０、６０および１２０分）に、１００μＬの細胞懸濁液を除去し、ＯＤ
_６００を測定し、１００μＬのアリコートを質量分析のために丸底９６ウエルプレートで
−２０℃で凍結した。試料をアルギニン濃度について分析した。各時点に、質量分析対Ｏ
Ｄ_６００により測定された標準化濃度を用いて、単位時間当たり細胞当たりのアルギニン
産生の速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要は、上に示されている。

誘導後３０、６０および１２０分目におけるアルギニンの産生を、（１）Ｓｙｎ−ＵＣ
Ｄ３０１（ＳＹＮ８２５；ΔＡｒｇＲおよびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込
まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、（２）Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ２０５（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモータ
ーの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）ならびに（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（Δ
ＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡならびに低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの
制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３を対照
ニッスル構築物として用い、結果を図３１Ａに示す。

図３１Ａに０、３０、６０および１２０分目に測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ
−ＵＣＤ２０６およびＳｙｎ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生のレベルを示す。アルギニ
ンの産生は、３菌株すべてで同等であり、最大のアルギニンの産生は、１２０分目にＳｙ
ｎ−ＵＣＤ３０１で認められ、ＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組込みが、同じ構築物
を発現する低コピープラスミド菌株で認められたのと同様のレベルのアルギニン産生をも
たらし、アルギニンの産生の速度をわずかに増加させ得ることがわかる。ＳＹＮ−ＵＣＤ
２０６は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳｙｎ−ＵＣＤ３０１と比較してアルギニン産生
の低下（６０分目により低いアルギニンレベル）を示したが、１２０分目に同等のアルギ
ニン産生レベルに達したことから、ΔＴｈｙＡがアルギニン産生に対するわずかな減弱化
作用を有し得ることがわかる。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３対照については、アルギニン産生が
検出されなかった。

次に、試料を上述のように調製し、誘導後１２０分目におけるアルギニンの産生を、（
１）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン
誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（２）Ｓｙｎ−
ＵＣＤ３０１（ΔＡｒｇＲ、ＣｍＲおよびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込ま
れたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、（３）ＳＹ
Ｎ−ＵＣＤ３０２（ΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性）およ
びｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下
に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）および（４）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＡｒｇＲ、Δ
ＴｈｙＡ、ＫａｎＲ（カナマイシン耐性）およびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組
み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で
比較した。

ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０６を対照ニッスル構築物とし
て用いた。結果を図３１Ｂに示す。図３１Ｂに見られるように、アルギニンの産生は、０
．７〜０．９μｍｏｌ／１×１０^９細胞に上昇し、アルギニンの産生が、プラスミド上に
ＡｒｇＡｆｂｒを有する菌株とＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有する菌株で同様
同じレベルであることがわかる。
[実施例１９]

高タンパク質食で飼育した高アンモニア血症およびＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）のマウスモ
デルにおける遺伝子操作細菌の有効性
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルを用いて、高
タンパク質食の投与時のアンモニアレベルに対する細菌染色体に組み込まれたｆｎｒプロ
モーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコードする遺伝子操作細菌のｉｎ ｖｉｖｏ
での有効性を評価した。マウスを非改変対照ニッスル細菌または上述のように高レベルの
アルギニンもしくはシトルリンを産生するように操作されたニッスル細菌により治療した
。

１つはＴｈｙＡ欠失を含み（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）、１つはＴｈｙＡ欠失を含まない
（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１）、２つの菌株を有効性について試験し、ΔＴｈｙＡが、染色体
ｆｎｒ−ＡｒｇＡｆｂｒを有するこれらの菌株による血液からのアンモニア除去の有効性
に影響を及ぼし得るかどうかを判断するために比較した。

Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０
３）またはＨ２Ｏ対照の経口投与により治療した。通常または高タンパク質食を次のよう
に与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３
、高タンパク質食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タン
パク質食（ｎ＝１０）。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３およびＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ１０６については、細菌を１回投与した１、５、６および７日目を除いて、＞１×１
０^１０細胞／ｍｌの１００μｌの用量を１２日間にわたり１日２回投与した。実施例１６
で述べたのと本質的に同じプロトコールに従い、アンモニアレベルを得るために血液を５
日目に採取した（図３２Ａ）。１０日目に、生存率を解析し、生存の時間的経過を図３２
Ｂに示す。

図３２Ａに示すように、高タンパク質食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレ
ベルは、Ｈ２Ｏ高タンパク質食対照群と比較してＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ３０３群において低下したことから、構築物が染色体に組み込まれた場合、ＦＮＲ誘
導性プロモーターがＡｒｇＡｆｂｒ発現を駆動し、操作細菌により治療したマウスの血液
中のアンモニアレベルの低下をもたらし得ることがわかる。アンモニアレベルの観測され
た低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方において同様であり
、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の有効性に有意な影響を有さないことがわ
かる。図３２Ｂに見られるように、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は
、対照と比較して長期の生存を示した。実験を２回連続して行ったところ、同様の結果が
得られた。
[実施例２０]

様々な用量における有効性の比較
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルにおける最適
アルギニン産生を達成しながら、用いることができる最低用量を決定するために、ＳＹＮ
−ＵＣＤ３０３の３用量を投与した。
Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）またはＨ２Ｏ対照の
強制経口投与により治療した。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３については、１×１０^７、１×１０
^８、１×１０^９および１×１０^１０ ＣＦＵｓの用量を、細菌を１回投与した１、５、６
および７日目を除いて、１２日間にわたって１日２回１００μｌの容量で投与した。通常
食または高タンパク質食を次のように与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０^７ＣＦＵ
）、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０^８ＣＦＵ）、高タン
パク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０^９ＣＦＵ）、高タンパク質食（
ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１０
）。実施例１６で述べたのと本質的に同じプロトコールに従い、アンモニアレベルを得る
ために血液を５日目に採取した。５日目に血中アンモニアレベルを各用量について解析し
た。結果を図３３に示す。１×１０^８および１×１０^９の両用量は、このモデルにおける
血中アンモニアレベルの有意な低下をもたらすのに十分であった。
[実施例２１]

ニッスルの滞留時間
非改変大腸菌ニッスルおよび本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、消化管または血清中
の防御因子により殺滅され得る。細菌のｉｎ ｖｉｖｏでの滞留時間を計算することがで
きる。大腸菌ニッスルのストレプトマイシン耐性菌株を用いる非限定的な例を以下に述べ
る。代替実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌の滞留時間を計算する。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを動物施設において１週間馴化させた。１週間の馴化後（すなわ
ち、０日目）に、ストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）を１〜３日
目に強制経口投与によりマウスに投与した。マウスに抗生物質を前投与しなかった。投与
された細菌、すなわち、接種物の量を表２５に示す。接種物のＣＦＵを決定するために、
接種物を連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で
平板培養した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、コロニーを計数した。

２〜１０日目に、最大で６匹のマウス（ＩＤ番号１〜６；表１４）から糞便ペレットを
採取した。ペレットをＰＢＳを含む管に量り入れ、ホモジナイズした。糞便ペレット中の
ニッスルのＣＦＵを決定するために、ホモジナイズした糞便ペレットを連続希釈し、スト
レプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で平板培養した。プレートを
３７℃で一夜インキュベートし、コロニーを計数した。

１日目の糞便ペレットも採取し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ
プレート上で平板培養して、ストレプトマイシン耐性であったマウス胃腸管に固有の菌株
が存在していたかどうかを判断した。マウス胃腸管内に依然として滞留していた投与ニッ
スルの時間経過および量を表２６に示す。
図３４にｉｎ ｖｉｖｏでのニッスルの滞留のグラフを示す。ストレプトマイシン耐性
ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべて
のマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している
投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日
間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。

[実施例２２]

ｉｎ ｖｉｖｏでの細菌菌株の腸内滞留および生存
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（組込みｆｎｒＳ誘導性プロモーター駆動ＡｒｇＡｆｂｒ、カナ
マイシン耐性、ΔＴｈｙＡ、図３５Ｃ）の局在および腸内滞留時間をＳＹＮ−ＵＣＤ１０
６（ΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡおよびクロラムフェニコール耐性、図３５Ｂ）およびＳＹＮ
−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性ニッスル、図３５Ａ）と比較した。マウスに強
制経口投与し、様々な時点に屠殺し、流出物を小腸、盲腸および結腸の様々な部分から採
取した。

細菌培養を一夜増殖させ、ペレット化した。ペレットを約１０^１０ＣＦＵ／ｍＬの最終
濃度でＰＢＳに再懸濁した。マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、１０〜１２週齢）に１００μＬ
の細菌（約１０^９ＣＦＵ）を強制経口投与した。マウスの飲料水を０．１ｍｇ／ｍＬのア
ンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および味を良くするための５％スクロースを含むよ
うに交換した。各時点（強制経口投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目）に、
動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に切断
し、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。各部分を０．５ｍｌの冷ＰＢＳで
フラッシュし、別個の１．５ｍｌ管に収集した。盲腸を採取し、内容物をしぼり出し、０
．５ｍｌの冷ＰＢＳでフラッシュし、１．５ｍｌ管に収集した。腸流出物を連続希釈平板
培養のために氷上においた。

各流出物中の細菌のＣＦＵを決定するために、流出物を連続希釈し、カナマイシンを含
むＬＢプレート上で平板培養した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、コロニー
を計数した。各コンパートメントに認められた細菌の量ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、
ＳＹＮ−ＵＣＤ１０６およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の滞留時間を図３５に示す。図３５に
見られるように、３つの菌株すべてが同様に挙動する。図３５Ａを図３５Ｂと比較すると
、ΔＴｈｙＡ栄養要求性およびΔＡｒｇＲは、滞留および通過時間に対する実質的な影響
を有さないと思われる。
[実施例２３]

腸滞留時間に対する栄養要求性の影響
栄養要求性が局在および滞留時間に対して影響を有し得るかどうかを判断するために、
上述のマウスモデルを用いて、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＴｈｙＡ）の滞留をＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ３０４（野生型ＴｈｙＡ）と比較した。ＡｒｇＲ欠失およびａｒｇＡｆｂｒが滞留に
対する影響を有するかどうかを判断するために、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイ
シン耐性対照ニッスル）を並行して投与する。

実施例２２で述べたように細菌を用意し、マウスに強制経口投与し、安楽死させ、様々
な時点に腸流出物を採取する。各流出物中の細菌のＣＦＵを決定するために、実施例２０
で述べたように流出物を連続希釈し、平板培養する。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３についてはス
トレプトマイシン含有プレートを、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１についてはクロラムフェニコー
ル含有プレートを用いる。
[実施例２４]

高アンモニア血症のＴＡＡモデル
マウスのＴＡＡ処理は、ＵＣＤ、急性もしくは慢性肝臓疾患ならびにＨＥに随伴する血
中アンモニアレベルの増加を模擬するために以前に文献において用いられた（Ｗａｌｌａ
ｃｅ ＭＣら、Ｌａｂ Ａｎｉｍ．、２０１５年４月；４９巻（増補１）：２１〜９頁、
Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ： ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ ｍｏｄｅ
ｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ）。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症
のＴＡＡ誘発性マウスモデルを用いて、血中アンモニアレベルを低下させる遺伝子操作細
菌の能力を検討する。ＴＡＡは、ｓｐｆ−ａｓｈモデルの代替としての役割を果たす。ｓ
ｐｆ−ａｓｈモデルは、遺伝モデルであるため、マウスの数が限られており、したがって
、野生型マウスにおける誘導性モデルを開発することは、目的の可能性がある菌株のｉｎ
ｖｉｖｏ試験を著しく促進することとなる。

血中アンモニアの長期の上昇に対する操作細菌の影響を検討するために、３００ｍｐｋ
の用量のチオアセトアミド（ＴＡＡ）も投与するＣ５７ＢＬ６マウスに細菌を投与する。

Ｃ５７ＢＬ６（１０週齢）にＳＹＮ−ＵＣＤ１０３もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１
００μｌの＞１×１０^１０細胞／ｍｌ）または媒体対照を１日１回投与する。あるいは、
マウスに２一日量の細菌（１００μｌの＞１×１０^１０細胞／ｍｌ）（各治療群につきｎ
＝５）を午前に１回、午後に１回投与する。細菌の前投与の３日後に、マウスに３００ｍ
ｐｋのチオアセトアミド（ＴＡＡ）または対照としてのＨ_２Ｏを腹腔内投与する。あるい
は、マウスに２５０ｍｐｋを１日２回、午前に１回、午後に１回投与する。試験の期間は
、５日である。アンモニアレベルを測定し、全般的な健康状態、生存、体重変化をモニタ
ーする。

手短に述べると、動物を７日間馴化する。時間経過の１日目に、動物の体重を測定し、
採血して、ベースラインアンモニアを測定し、糞便ペレットを採取し（ケージごとに）、
初期血中アンモニアレベルに基づいて無作為化する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０
３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前およ
び午後）強制経口投与により投与する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ ＡＴＣに交換
する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１
００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与す
る。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣ
Ｄ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与
により投与する。さらに、動物に３００ｍｐｋ ＴＡＡ（または生理食塩水対照）を腹腔
内投与する。あるいは、動物に２５０ｍｐｋ ＴＡＡ（または生理食塩水対照）を午前に
１回、午後に１回投与する。４日目に、動物の体重を測定し、採血し、血中アンモニアを
測定する。糞便ペレットをケージごと採取する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３ま
たはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午
後）強制経口投与により投与する。動物に２５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照
）も投与してもよい。５日目に、動物の体重を測定し、採血し、血中アンモニアを測定す
る。糞便ペレットを採取する（ケージごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３また
はＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後
）強制経口投与により投与する。アンモニアレベル、糞便ペレットにおける細菌負荷なら
びに全般的な健康状態、生存および体重変化をモニターする。
[実施例２５]

アルギナーゼ阻害剤を用いた高アンモニア血症のモデル
遺伝的ｓｐｆ−ａｓｈモデルの代替として、アルギナーゼ阻害剤＋／−高タンパク質食
を高アンモニア血症の誘導性モデルとして用いる。アルギナーゼ阻害剤は、少なくとも２
つのクラスに分類される（Ｓｔｅｐｐａｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３
年；４巻：２７８頁、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｒｇｉｎａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙ
ｓｆｕｎｃｔｉｏｎに記載されている）。アルギナーゼ阻害剤の第１の群は、ｌ−アルギ
ニン（２）Ｓ−アミノ−６−ヘキサン酸（ＡＢＨ）のボロン酸類似体およびＳ−２−ＢＥ
Ｃからなり、その両方がアルギナーゼの触媒活性を阻害する。Ｎ−ヒドロキシ−ｌ−アル
ギニン（ＮＯＨＡ）およびＮ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）に
よって主として代表される、アルギナーゼ阻害剤の他のカテゴリーは、Ｎ−ヒドロキシ−
グアニジニウム側鎖を特徴とし、アルギナーゼの金属架橋水酸化物イオンをそれらのＮ−
ヒドロキシ基で置換することによってアルギナーゼを阻害する。モデル開発試験で、各群
のアルギナーゼ阻害剤、ＢＥＣおよびノル−ＮＯＨＡ＋／−高タンパク質食（７０％タン
パク質）を用いる。

操作細菌が血液中のアンモニアレベルを変化させることができるかどうかを判断するた
めに、野生型マウスにおいて各群のアルギナーゼ阻害剤、ＢＥＣおよびノル−ＮＯＨＡ、
＋／−高タンパク質食（７０％タンパク質）を用いた誘導性モデルを用いる。Ｃ５７ＢＬ
６（雌、８週）を遺伝子操作細菌（１００μｌの＞１×１０^１０細胞／ｍｌ）または媒体
対照の強制経口投与およびＢＥＣまたはノルＮＯＨＡの腹腔内投与により治療し、通常食
（治療群当たりｎ＝５）または高タンパク質食（治療群当たりｎ＝５）を与えて飼育する
。投与群は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３および媒体対照治療動物について次の通りである：通
常食（ｎ＝５）；高タンパク質食（７０％タンパク質食；ｎ＝５）；高タンパク質食（＋
）ＢＥＣ（ｎ＝５）；高タンパク質食（＋）ノルＮＯＨＡ（ｎ＝５）。

時間経過の１日目に、動物の体重を測定し、採血して、ベースラインアンモニアを測定
し、初期血中アンモニアレベルに基づいて無作為化する。糞便ペレットを採取する（ケー
ジごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μ
ｌ／用量／動物）の強制経口投与により投与する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ Ａ
ＴＣに交換する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ
１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与
により投与する。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３または
ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）
の強制経口投与により投与する。さらに、動物にＢＥＣ（２５ｍｐｋ）またはノルＮＯＨ
Ａ（１００ｍｐｋ）または生理食塩水対照を腹腔内投与する。高タンパク質食群について
、飼料を通常食から７０％タンパク質食に変更する。４日目に、動物の体重を測定し、採
血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットをケージごとに採取する。動物にＨ２Ｏ
、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回
または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物にＢＥＣ（２５ｍｐ
ｋ）またはノルＮＯＨＡ（１００ｍｐｋ）を腹腔内投与する。４日目に、動物にＨ２Ｏ、
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回ま
たは２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物の体重を測定し、投与
後１時間目に採血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットをケージごとに採取する
。動物にＢＥＣ（２５ｍｐｋ）またはノルＮＯＨＡ（１００ｍｐｋ）の腹腔内投与も行う
。５日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００
μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する
。動物の体重を測定し、投与後１時間目に採血し、アンモニアレベルを測定する。

ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０３菌株を用い
た同様の試験を行った。結果を図２８に示す。
[実施例２６]

アルギニン産生に対する増殖能および代謝活性の影響
遺伝子操作細菌によるアルギニン産生のための細胞分裂および／または活性代謝の必要
条件をＳＹＮＵＣＤ−３０３菌株において検討した。

ＳＹＮＵＣＤ−３０３を７０％イソプロパノールまたは対照としてのリン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）とともに振盪しながら１時間インキュベートした。７０％イソプロパノー
ルは、細胞膜を破壊し、細胞分裂を妨げたが、細胞代謝を可能にする。ＰＢＳインキュベ
ーションは、細胞に対して何の影響も有さなかった（示さず）。処理後、細胞を、０．５
％グルコースおよび３ｍＭチミジンを添加したＭ９培地中で特定の比で混合した。細胞を
振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、Ｍ９培地に含まれていた塩化
アンモニウムを用いてアルギニンを形成することができる。ゼロ時間目および２時間のイ
ンキュベーションの後に再度アルギニン濃度を培地中で測定し、１０億個の細胞当たり１
時間当たり産生されるアルギニンの量を計算した。図３６Ａおよび３６Ｂに見られるよう
に、培養中のイソプロパノール処理細胞と非処理細胞との比率がより大きい場合に、平板
培養により決定されるより少数のＣＦＵｓおよびより低いレベルのアルギニン産生がもた
らされる。存在する細菌の量に対するアルギニンの産生量は、様々な培養にわたり一定の
ままであった（図３６Ｃ）。これらの結果は、生存細菌のみがアルギニン産生に寄与する
ことを示すものである。
[実施例２７]

カニクイザルにおける２８日間にわたり毎日経鼻胃管投与した後のＳＹＮ−ＵＣＤ−３０
３の反復投与薬物動態および薬力学試験（非ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌または大腸菌ニッスル単独の投与により生じる可能性がある毒性を評価
するために、雌カニクイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後のＳ
ＹＮ−ＵＣＤ−３０３およびカナマイシン耐性を有する大腸菌ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ
１０７）の薬物動態および薬力学を試験した。カニクイザルを選択した理由は、この種が
系統発生学的にかつ生理学的にヒトと密接に関連しており、非臨床的毒性評価に一般的に
用いられる種であるためである。遺伝子操作細菌は、ヒトにおける提案された投与経路と
一致する、経鼻胃管により投与した。動物の全般的健康状態（臨床的観察）、体重、臨床
病理（血清化学、血液学および凝固）を追跡した。糞便試料を細菌負荷について検査した
。血漿をアンモニアレベルについて分析した。

Ａ． 材料、動物および投与計画：
本試験は、非臨床実験室試験に関する、米国食品医薬品局により公布された安全性試験
の実施に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎｓ）（Ｔｉｔｌｅ ２１ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｔ ５８；１９７９年６月２０日発効）およびＯＥＣＤ
ＧＬＰ原則（ＯＥＣＤ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｎ Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年発効）に従って実施され
た。動物は、実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃ
ａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ２０１１）に記載の勧告に基づいて個別収
容した。

本試験に用いた動物は、３〜６ｋｇ（最初の身体検査）で、年齢３〜８年（最初の身体
検査）の雌パーパスブレッド非ナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌ
ａｒｉｓ）（ＳＮＢＬ ＵＳＡストック、原産：Ｃａｍｂｏｄｉａ）であった。

バイアスの制御のために、動物を、同様の群別体重分布が得られるように体重で層別し
て群に無作為化した。無作為化に選択された動物数ならびにそれらの体重および年齢を表
２７に含める。

１７匹の動物を投与開始前の７日間馴化させ、１５匹の動物を治療群に割り付けた。予
備の動物を１日目に試験から除去した。

試験期間中、動物にＰＭＩ ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）Ｆｉｂｅｒ−Ｐｌｕｓ（登録
商標）Ｍｏｎｋｅｙ Ｄｉｅｔ ５０４９ビスケットを毎日２回与えた。投与前の少なく
とも２時間動物を絶食させ、投与後１時間以内に給餌した。動物はまた、特定の処置（例
えば、血清化学検査のための採血、糞便採取の前）による必要に応じて絶食させた。飼料
を汚染物質について定期的に分析しており、製造業者の規格の範囲内であることが認めら
れた。試験の結果に支障を来たすようなレベルの汚染物質は存在するとは予期されない。

新鮮な飲料水をすべての動物に供給し、自由に摂取させた。水を汚染物質について定期
的に分析した。試験の結果に支障を来たすようなレベルの汚染物質は存在しなかった。動
物に試験中果実、野菜、他の補助食品およびケージエンリッチメントデバイスを与えた。

事前に検疫した動物を投与の開始（１日目）の前の７日間試験室に馴化させた。最終投
与は、２８日目に行った。体重を組み込んだ層化無作為化スキームを用いて、動物を試験
群に割り付けた。動物を群に割り付け、表２８に示すように処置した。

ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３保存液は、２．２％グルコースおよ
び３ｍＭチミジンを含む１ＸＰＢＳ中１５％グリセロール中１×１０^９ｃｆｕ／ｍＬおよ
び１×１０^１１ｃｆｕ／ｍＬで調製し、８６〜−６０℃で保持した（表２８参照）。重炭
酸ナトリウムを含む２０％グリセロールで調製したＰＢＳを対照媒体として用いた。重炭
酸濃度は、０．３６Ｍであり、重炭酸ナトリウムについては０．１２Ｍであった（表２８
参照）。投与当日に、細菌および媒体対照を冷凍庫から取り出し、氷上において解凍し、
投与するまで氷上においた。

動物に０、１×１０^９または１×１０^１２ｃｆｕ／動物で投与した。すべての動物に２
８日間にわたり１日１回、経鼻胃管（ＮＧ）により投与した後、対照／媒体でフラッシュ
した。重炭酸塩の濃度および各群の容量を表２８に明記する。バイアルは、注射器に投与
液を吸引する前に少なくとも３回反転した。投与部位および投与時間（フラッシュ時間の
終了）を記録した。６日目に、群４（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、１×１０^９／動物）におけ
る動物１９、２１および２３は、１４ｍＬの代わりに５ｍＬの重炭酸塩フラッシュを、そ
の後に被験物質投与を受けた。

Ｂ． 解析
全般的状態および重量
全般的状態： 臨床的観察は、−６日目に開始して、４４日目まで、１日２回実施した
。第１の観察は、午前であった。第２の観察は、午前の観察の後４時間より早くない時点
であった。投与期間中は、第２の観察は、投与後４時間（±１０分）目に実施した。必要
に応じて、追加の臨床的観察を実施した。
被験物質に関連した臨床的観察所見は、本試験では確認されなかった。

同様に収容される動物に一般的に認められ、個体間で散発的に発生した偶発的かつ／ま
たは処置上の所見は、対照動物に認められ、馴化期間にも存在し、投与群間で重症度およ
び発生率が増加しなかった。これらは、皮膚に関連する所見（痂皮／結痂、創傷、擦過傷
、異常な皮膚変色、紫斑）、脱毛、曲尾、凹眼、食欲不振、嘔吐および泌尿生殖器分泌物
を含む。

重量： 体重は、−６、１、８、１１、１５、２２、２９、３６および４３日目、適宜
、最初の給餌および投与前に測定した。

体重に対する被験物質に関連する影響は、本試験では確認されなかった。ベースライン
（１日目）と比べて、３６日目までに５〜１０％の体重の減少が、対照を含むすべての群
にわたり明らかであり、試験処置に関連すると判断された。値はベースラインに完全には
戻っていなかったが、３６日目と比較して、上向き傾向が４３日目の入手可能な体重デー
タで認められた。

臨床病理
血液採取： 動物は、毎日の投与前に一夜ならびに血清化学および血漿生物分析用の試
料を含む各一連の採取の少なくとも４時間前に絶食させた。これらの場合、関連する臨床
病理評価は、絶食動物についてのものであった。血液は、拘束した覚醒動物の末梢静脈の
静脈穿刺によって１回の採血（可能な場合）で採取し、分析用の適切な管に次のように分
割した：血液学：約１．３ｍＬ、Ｋ２ＥＤＴＡ管；凝固：約１．８ｍＬ、３．２％クエン
酸ナトリウム管；血清化学：約１．０ｍＬ、血清分離管（ＳＳＴ）；血漿試料：約１．０
ｍＬ、ヘパリンリチウム；臨床病理評価用の血液は、ＳＮＢＬ ＵＳＡ ＳＯＰｓに従っ
て、血清もしくは血漿に処理するか、またはそのままで用いた。

可能な場合には、血液は、１回の採血により採取し、次に適切に分割する。試料採取頻
度を表２９に要約する。

表３０に臨床病理評価情報を要約する。

血液学、凝固および血清化学パラメーターにおける被験物質に関連した影響は、本試験
では確認されなかった。

血漿試料： 動物は、試料の除去の前の４時間絶食させた。約１Ｌｍの血液を、−１お
よび３０日目に、ならびに２、７、１４および２８日目の投与前に大腿静脈から採取し、
２ｍＬヘパリンリチウム管に移した。管内への標的容積の血液の採取後に、約０．０５（
−１および２日目）または０．１ｍＬ（７、１４、２８および３０日目）の鉱油を加えて
、管内の血液の表面を覆った。管は、反転せずに、湿潤氷上においた。

試料を採取してから１５分以内に２〜８℃で遠心分離して、血漿を得て、血漿は−６０
〜−８０℃での保存の前にドライアイス上に保持した。

試料の分析は、血中アンモニア分析機器を用いて行った。

糞便試料の採取： 動物当たり２つの糞便試料を表２９に示す標的時点に採取した。試
料採取日時を記録した。約５ｍＬのＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管を容器として用い
た（糞便が液体である場合、ＰＢＳを加えない）。糞便試料の重量を得るために、容器の
試料採取前後の重量を測定した。試料は、各動物のケージの底から採取した。新鮮で、非
汚染試料を得るために、採取前に残存食物を除去し、ケージパンを掃除し、ゴムぞうきん
をかけて、デブリおよび／または水を除去した。−５、２、４、７および１４日目に、最
初の給餌および／または投与の後に食物除去およびパン掃除を実施した。１８、２０、２
４、２８、３０、３５、４０、４６および５０日目に、食物除去およびパン掃除を各採取
の前の夜に実施した。視覚的に新鮮な糞便試料も臨床的観察を除く、処置を行う前の朝に
採取した。

糞便スワブ採取： 糞便試料が予定日の終了までに採取されなかった場合、処置用ケー
ジに拘束した動物の直腸から綿チップアプリケーターを用いて糞便スワブ試料を採取した
。
試料は、採取直後に湿潤氷上においた。試料を分析時まで−２０〜−１５℃で保存した
。試料の分析は、実施例３１で述べたＰＣＲ分析法を用いて行った。

動物当たり２つの糞便試料を−５日目に、ならびに２、４、７および１４日目の投与後
に採取し、動物当たり３つの糞便試料を２９、３０、３５、４０、４６および５０日目に
、ならびに１８〜２８日目の投与前に採取した。約５ｍＬのＰＢＳを含む５０ｍＬファル
コン管を−５〜１４日目の採取に用い、管１については約５ｍＬのＰＢＳ、管２について
は２０ｍＬの５０％グリセロールおよび１０ｍＭチミジン、管３については２０ｍＬの５
０％グリセロール／ＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管を１８〜５０日目の採取に用いた
。試料を採取直後に湿潤氷上におき、１８〜５０日目に採取した各管の内容物を滅菌済み
舌圧子を用いて破壊し、混合した。

採取日の終了時までに表２９に示した動物から糞便試料が採取されなかったので、動物
当たり２つの糞便スワブ試料を採取した。試料の採取後、スワブの綿部分を１ｍＬのＰＢ
Ｓを含む５ｍＬクリオバイアルに移し、直ちに湿潤氷上においた。

結果を図３７に示すが、糞便試料から定量した細菌の量がカナマイシン耐性対照ニッス
ル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７）およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について類似したパターンに従
うことが示されている。糞便試料中の細菌は、３５日目までに糞便１ｍｌ当たり１０００
個未満の細菌のレベルに達する。結果から、これらの投与条件下では、糞便中の対照カナ
マイシン耐性ニッスルと同様の量の細菌が栄養要求体ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について回収
されたことがわかる。同様の結果がマウスで観測された。結論として、ＳＹＮ−ＵＣＤ３
０３は、ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７）とほぼ同じ濃度でＮＨＰ糞便中に存在すると
思われる。

全体的結論として、被験物質であるＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、１×１０^１２ＣＦＵ／動
物までの用量で２８日間毎日のＮＧ投与後に雌カニクイザルによって十分に耐えられた。
被験物質に関連した死亡は発生せず、臨床的観察、体重および臨床病理評価について被験
物質に関連した影響は確認されなかった。
[実施例２８]

カニクイザルにおける２８日間にわたり毎日経鼻胃管投与した後のＳＹＮ−ＵＣＤ−３０
３の反復投与薬物動態および薬力学試験（非ＧＬＰ）
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５およびＳＹＮ−
ＵＣＤ３０６の薬物動態および薬力学は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に雌カニ
クイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後に試験する。カニクイザ
ルを選択した理由は、この種が系統発生学的にかつ生理学的にヒトと密接に関連しており
、非臨床的毒性評価に一般的に用いられる種であるためである。遺伝子操作細菌は、ヒト
における提案された投与経路と一致する、経鼻胃管により投与した。動物の全般的健康状
態（臨床的観察）、体重、臨床病理（血清化学、血液学および凝固）を追跡する。血漿を
アンモニアレベルについて分析し、糞便試料を細菌負荷について検査する。
[実施例２９]

カニクイザルにおける２週間の回復期間を含む４週間の毒性試験（ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌の投与により生じる可能性がある毒性を評価するために、ＧＬＰ条件下
での雌カニクイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後のＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ３０３の薬物動態および薬力学を試験する。

他の実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および／またはＳＹ
Ｎ−ＵＣＤ３０６について試験を行う。

試験は、本試験は、非臨床実験室試験に関する、米国食品医薬品局により公布された安
全性試験の実施に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（Ｔｉｔｌｅ ２１ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅ
ｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｔ ５８；１９７９年６月２０日発効）および
ＯＥＣＤ ＧＬＰ原則（ＯＥＣＤ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｎ Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年発効）に従って
実施される。動物は、実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ２０１１）に記載の勧告に基づい
て個別収容する。

すべての材料がＧＭＰ基準に従って製造されることを除いて、実施例２７で述べたのと
本質的に同様に動物にＳＹＮ−ＵＣＤ３０３または対照媒体を投与する。投与を表３１に
示す。さらに、動物を１４日間馴化させ、投与期間は、毎日２８日間であり、その後に２
８日間の回復期間をおく。さらに、動物を試験の終了時に安楽死させて、組織学的分析を
行う。

試験解析は、表３２に示すように行う。血液学、凝固、血清化学および血漿試料パラメ
ーターは、実施例２７で述べたのと本質的に同様であり、実施例２７で述べた方法を用い
て解析する。糞便試料の採取および分析は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に行う
。

[実施例３０]

マウスにおける４週間の回復期間を含む４週間の反復投与毒性試験（ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌の投与により生じる可能性がある毒性を評価するために、
ＧＬＰ条件下での２週間の回復を後続させる４週間にわたる毎日の経鼻胃管投与の後のＳ
ＹＮ−ＵＣＤ３０３の薬物動態および薬力学を試験する。

すべての材料をＧＬＰ条件下で製造する。試験開始時に６〜８週齢のＣＤ−１マウスを
７日間馴化させる。雄および雌マウスの群を別個に試験する。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３また
は媒体対照を表３３に示すように投与する。

特定の実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および／またはＳ
ＹＮ−ＵＣＤ３０６について試験を行う。

試験解析は、表３４に示す。血液学、凝固、血清化学および血漿試料パラメーターは、
実施例２７で述べたのと本質的に同様であり、実施例２７で述べた方法を用いて解析する
。糞便試料の採取および分析は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に行う。組織学は
、実施例２９と同様に行う。

[実施例３１]

非ヒト霊長類の糞便試料中のニッスルの存在の決定
ニッスルの存在について非ヒト霊長類（ＮＨＰｓ）の糞便試料を分析するために、ｑＰ
ＣＲを用いた試料中のＤＮＡの量に基づいてＮＨＰ試料における細菌の数を定量した。い
くつかの実施形態では、このプロトコールは、マウスおよびヒトを含むが、これらに限定
されない、他の哺乳動物の糞便試料の分析に用いられる。

試料の均質化： 糞便試料（−２０℃で保存）を室温で９０分間解凍した。固体糞便試
料については、適切な固体の容積を推定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を容積の２
倍まで加えた。液体糞便試料については、追加のＰＢＳを加えなかった。次いで試料を管
ごとに３０秒間ボルテックスした。糞便試料をエッペンドルフチューブ中、ＰＢＳ中で使
い捨て乳棒（Ｆｉｓｈｅｒ １２−１４１−３６３）を用いてホモジナイズし、後の処置
のために氷上に保持する。

ＤＮＡの精製： 均質化試料（２５０μＬ）を、最初にグラデーションラインで切断さ
れた滅菌済みフィルターチップ（Ｒａｃｋｅｄ Ｇｉｌｓｏｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｔｅｒ
ｉｌｉｚｅｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｉｐｓ）を用いて除去し、エッペンドルフチューブに移
した。ＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってＭｏＢｉｏ ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ
ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１２８５５−１００）を用
いて均質化試料（２５０μＬ）から精製した。各試料から回収された精製ＤＮＡの量は、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｂａｓｉｃで試料のＯＤ２６０
を測定することによって定量した。

ＰＣＲ反応： ２つの反応（反応１および反応２）をアセンブルし、３連で行った。第
１の反応は、ニッスルの量を定量する役割を、第２の反応は、糞便試料中に存在する細菌
の総量を定量する役割を果たす。第１のｑＰＣＲ反応については、精製ＤＮＡ（５ｎｇ）
、０．４μＬのプライマー１（１０μＭ）、０．４μＬのプライマー２（１０μＭ）およ
び１０μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： ４３６８５７７）を水で２０μＬとした。第２の
ｑＰＣＲ反応については、精製ＤＮＡ（５ｎｇ）、０．４μＬのプライマー３（１０μＭ
）、０．４μＬのプライマー４（１０μＭ）および１０μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐ
ＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：
４３６８５７７）を水で２０μＬとした。

１０μＭの濃度で反応に用いたプライマーの配列は、表３５に見いだされる。

増幅された細菌ＤＮＡの量の定量のために、各反応について標準曲線を作成した。標準
曲線を得るために、断片＃１（１組の濃度で合成した）（表３６）を以下の量が得られる
、１０倍連続希釈で、８ウエルが断片＃１の１０^６コピーを有するまで、希釈した：無Ｄ
ＮＡ、断片＃１の１コピー、断片＃１の１０コピー、断片＃１の１００コピーなど。次い
で標準ＤＮＡｓを反応＃１のｑＰＣＲ反応混合物に加えた。

標準曲線、ならびに反応１および２のＰＣＲ反応条件を表３７に示す。

品質管理処置として、試験ｑＰＣＲ反応の融解曲線を各プライマーセットの陽性対照と
比較して、陽性対照の融解曲線が試験試料の融解曲線と一致することを保証した。ニッス
ルおよび総細菌の存在および量は、標準曲線と対照して、ＣＴ値（サイクル閾値）を解析
することによって決定した。
[実施例３２]

酪酸を過剰産生するためのベクターの構築
上述のアンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および／またはマン
ガン輸送回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、消化管バリア増強分子を産生するための
１つまたは複数の回路をさらに含む。

大腸菌ニッスルにおける酪酸の誘導性産生を促進するために、ペプトクロストリジウム
・ディフィシル６３０に由来する酪酸産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、
ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｂｐｔおよびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）、ならび
に転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクタ
ーｐＢＲ３２２にクローニングした。酪酸遺伝子カセットは、配列番号１８〜２９（表６
）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下におかれる。特定の構築物では、ＦＮＲ応答性
プロモーターは、強いリボソーム結合部位配列にさらに融合されている。酪酸遺伝子の効
率的な翻訳のために、オペロンにおける各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部
位に由来する１５塩基対リボソーム結合部位によって分離させた。

特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢ
の制御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコード
する遺伝子をさらに含む（例えば、表３８および３９参照）。特定の構築物では、酪酸遺
伝子カセットは、ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、
対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例
えば、表１４〜１７参照）。特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、テトラサイクリ
ン誘導性または構成的プロモーターの制御下におかれる。

ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチ
リル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対する依存性を示し得る
。本発明の組換え細菌は、酸素制限環境（例えば、哺乳動物消化管）において酪酸を産生
するように設計されているため、酸素に対する依存性は、消化管内の酪酸産生の負の影響
を有し得る。トレポネーマ・デンティコラ、トランス−２−エノイルＣｏＡレダクターゼ
に由来する単一遺伝子（ｔｅｒ）がこの３遺伝子複合体を酸素非依存的に機能的に置換す
ることができることが示された。したがって、ｔｅｒ遺伝子が第１の酪酸カセットのｂｃ
ｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子を置換した第２の酪酸遺伝子カセットを合成する（
Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。ｔｅｒ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／
ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて大腸菌コドン使用のために
コドン最適化されている。第２の酪酸遺伝子カセット、ならびに転写および翻訳エレメン
トを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニ
ングする。第２の酪酸遺伝子カセットは、上述のＦＮＲ調節領域の制御下におかれる。特
定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制
御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする
遺伝子をさらに含む（例えば、表３８および３９参照）。特定の構築物では、酪酸遺伝子
カセットは、ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、対応
するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば
、表Ｃおよび表４０参照）。

特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、テトラサイクリン誘導性または構成的プロ
モーターの制御下におかれる。第３の酪酸遺伝子カセットでは、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝
子がｔｅｓＢで置換されている。ｔｅｓＢは、ブチリル−ｃｏＡから酪酸を切り離し、そ
れによりｐｂｔ−ｂｕｋの必要性を除去する大腸菌に見いだされるチオエステラーゼであ
る。

一実施形態では、ｔｅｓＢは、表６における配列のいずれかから選択されるＦＮＲ調節
領域の制御下におかれる。代替実施形態では、ｔｅｓＢは、ＲＮＳ応答性調節領域、例え
ば、ｎｏｒＢの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓ
ｒＲをコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、ｔｅｓＢは、ＲＯＳ応答性調
節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、
例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む。特定の構築物では、異なる記載され
ている酪酸遺伝子カセットがそれぞれ、テトラサイクリン誘導性または構成的プロモータ
ーの制御下におかれる。例えば、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子が硝酸応答性調節エレメント
の制御下に発現するｔｅｓＢで置換されている酪酸遺伝子カセットを含む遺伝子操作ニッ
スルを作製する。配列番号８６は、淋菌に由来するｎｓｒＲリプレッサー遺伝子の逆方向
相補体（下線付き）、ｎｓｒＲおよび酪酸生成遺伝子カセットならびにそれらのそれぞれ
のＲＢＳを制御する多様なプロモーターを含む遺伝子間領域（太字）、ならびにＲＢＳに
よって分離された酪酸遺伝子（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ−ｔｅｓＢ）を含む。

[実施例３３]

ｔｅｔ誘導性プロモーター用いる酪酸を過剰産生するためのベクターの構築
大腸菌ニッスルにおける酪酸の誘導性産生を促進するために、ペプトクロストリジウム
・ディフィシルに由来する酪酸産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ、ｅｔｆＢ、ｅｔｆＡ、
ｔｈｉＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｐｔおよびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）、ならびに転写および翻訳
エレメントを合成し（Ｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲにクローニ
ングし、ｐＬｏｇｉｃを作製した。合成されたとき、遺伝子を、ｔｅｔ誘導性合成酪酸オ
ペロンから分岐した、構成的に発現するｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を含む、テトラ
サイクリン誘導性プロモーターの制御下においた。酪酸遺伝子の効率的な翻訳のために、
オペロンにおける各合成遺伝子を、Ｔプロモーターに由来する塩基対リボソーム結合部位
によって分離させた。

ｂｃｄ−ｅｔｆＡ−ｅｔｆＢの遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡ
に変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対する依存性を示し得る。有効なプロ
バイオティクは酸素制限環境（例えば、哺乳動物消化管）で機能することができるため、
またトレポネーマ・デンティコラの単一遺伝子がこの３遺伝子複合体を酸素非依存的に機
能的に置換することができる（トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ；ｔｅｒ）こと
が示されたので、我々は、大腸菌において酪酸の産生の能力のある第２のプラスミドを作
製した。逆ＰＣＲを用いて、ｂｃｄ−ｅｔｆＡ−ｅｔｆＢ領域の外側のｐＬｏｇｉｃの全
配列を増幅した。ｔｅｒ遺伝子をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／
ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて大腸菌コドン使用のためにコドン最適化し、合成し（Ｇｅｎ
ｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてこの逆ＰＣＲ
断片にクローニングして、ｐＬｏｇｉｃを作製した。
[実施例３４]

大腸菌の形質転換
各プラスミドを大腸菌ニッスルまたは大腸菌ＤＨ５ａに形質転換する。すべての管、溶
液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌ニッスルまたは大腸菌ＤＨ５ａの一夜培養
を５ｍＬの溶原培地（ＬＢ）で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達す
るまで増殖させる。細胞培養培地は、選択マーカー、例えば、プラスミドに適するアンピ
シリンを含む。次いで大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去
し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を再び４℃で２，０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を再び４℃
で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を最後に０．１ｍＬの４℃
水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。０．５μｇの上記のプ
ラスミドの１つを細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌済み冷却キュベットに
ピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。
１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３７℃で１時間インキュ
ベートする。細胞をアンピシリンを含むＬＢプレート上に広げ、一夜インキュベートする
。

代替実施形態では、酪酸カセットを相同的組換えによりニッスルゲノムに挿入すること
ができる（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。構築物およびヌクレオチド配
列の構成を本明細書に示す。合成酪酸カセット構築物を染色体に組み込むことができるベ
クターを作製するために、まず、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ニッスルｌａｃＺ遺
伝子座に相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ起源プラスミドｐＫＤ３に加えた。こ
れは、ニッスルゲノムにおけるｌａｃＺ遺伝子座に組み込まれるこれらの相同性アーム間
にクローニングされるＤＮＡを標的とする。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、これらの
アーム間の断片をクローニングした。ＰＣＲを用いて、相同性アームの全配列、ならびに
それらの間の酪酸カセットを含むこのプラスミドの領域を増幅する。このＰＣＲ断片を用
いて、ラムダレッドレコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含む菌株
である、エレクトロコンピテントニッスル−ｐＫＤ４６を形質転換する。形質転換後、２
０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール上で３７℃で平板培養する前に細胞を２時間増殖さ
せた。３７℃での増殖もｐＫＤ４６プラスミドを治癒させる。カセットを含む形質転換細
胞は、クロラムフェニコール耐性であり、ｌａｃマイナス（ｌａｃ−）である。
[実施例３５]

組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッ
スルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。
酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増
殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を
振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ
_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍ
Ｌの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために
静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４およ
び２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌
株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。
[実施例３６]

組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッ
スルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。
酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増
殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を
振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ
_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍ
Ｌの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために
静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４およ
び２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌
株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。
[実施例３７]

ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いた組換え大腸菌における酪酸の産生
図４８にｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下の上述の酪酸カセットを示す。下文の実施
例４０で述べる方法を用いて酪酸の産生を評価する。試験したｔｅｔ誘導性カセットは、
（１）８遺伝子すべてを含むｔｅｔ−酪酸カセット（ｐＬＯＧＩＣ０３１）；（２）ｔｅ
ｒが置換されているｔｅｔ−酪酸カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６）ならびに（３）ｔｅｓ
Ｂがｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子の代わりに置換されているｔｅｔ−酪酸カセットを含む。
図５１Ａに酪酸産生の有意な差がない、酸素の存在下および非存在下でのｐＬＯＧＩＣ０
３１およびｐＬＯＧＩＣ０４６菌株における酪酸産生を示す。酪酸産生の増大が、最終２
遺伝子（ｐｂｔ−ｂｕｋ）の欠失および内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡか
ら酪酸部分を切り離すチオエステラーゼ）によるそれらの置換を含むｐＬＯＧＩＣ０４６
を発現する低コピープラスミドにおけるニッスルで示された。

細胞の一夜培養をＬｂで１：１００に希釈し、初期対数期に達するまで１．５時間増殖
させ、その時点に無水ｔｅｔを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えて、プラスミドの発現
を誘導した。２時間の誘導後、細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含むＭ９最少培地に
ＯＤ６００＝０．５で再懸濁した。試料を表示時間に除去し、細胞を遠沈した。上清をＬ
Ｃ−ＭＳを用いて酪酸の産生について試験した。図５１Ｂにｔｅｒ置換（ｐＬＯＧＩＣ０
４６）またはｔｅｓＢ置換（ｐｔｂ−ｂｕｋ欠失）を有するｔｅｔ−酪酸カセットを含む
菌株における酪酸の産生を示すが、ｔｅｓＢ置換菌株がより大きい酪酸産生を有すること
が実証された。

図５２に一般的クローニング菌株であり、大腸菌突然変異体のＫＥＩＯ集合のバックグ
ラウンドである、大腸菌のＢＷ２５１１３菌株を示す。ＮｕｏＢ欠失を有するＮｕｏＢ突
然変異体が得られた。ＮｕｏＢは、呼吸成長時（電子伝達を必要とする成長の形）のＮＡ
ＤＨの酸化に関与するタンパク質複合体である。ＮＡＤＨ酸化の電子伝達へのカップリン
グを妨げることにより、酪酸産生を維持するために用いられるＮＡＤＨの量が増加する。
図５２に野生型ニッスルと比較して、ＮｕｏＢの欠失が酪酸のより多くの産生をもたらす
ことを示す。

[実施例３８]

組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッ
スルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。
酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増
殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を
振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ
_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍ
Ｌの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために
静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４およ
び２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌
株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。

代替実施形態では、一夜細菌培養を新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、１．５時間増殖
させて、初期対数期に入ることを可能にした。この時点に、長半減期酸化窒素ドナー（Ｄ
ＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−酸化窒素付加体）を０．３ｍＭの最終濃度で培養
に加えて、プラスミドからの発現を誘導した。２時間の誘導後、細胞を遠沈し、上清を捨
て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最少培地に再懸濁した。次いで培養上清を表示
時点に分析して、酪酸の産生のレベルを評価した。（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎ
ｏｒＢ−酪酸オペロン構築物；ＳＹＮ−ＵＣＤ５０７）または（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎ
ｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物；ＳＹＮ−ＵＣＤ５０８）を含む遺伝子操作ニッ
スルは、野生型ニッスルと比較して有意に多くの酪酸を産生する。

ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がテトラサイクリンプロモーターの制御下に発現するｔｅｓ
Ｂ（配列番号４８）で置換されている酪酸遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｔｅｓ
Ｂ−酪酸；配列番号８８）を含む遺伝子操作ニッスルを作製した。配列番号８８は、ｔｅ
ｔＲリプレッサーの逆方向相補体（下線付き）、ｔｅｔＲならびに酪酸オペロンおよびそ
れらのそれぞれのＲＢＳを制御する多様なプロモーターを含む遺伝子間領域（太字）、な
らびにＲＢＳにより分離された酪酸遺伝子（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔ
ｅｓＢ）を含む。

一夜細菌培養を新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて、初期対数期
に入ることを可能にした。この時点に、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／
ｍｌの最終濃度で培養に加えて、プラスミドからの酪酸遺伝子の発現を誘導した。２時間
の誘導後、細胞を遠沈し、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最少培地に
再懸濁した。次いで培養上清を表示時点に分析して、酪酸の産生のレベルを評価した。ｐ
ｂｔおよびｂｕｋのｔｅｓＢによる置換が、より大きいレベルの酪酸産生をもたらす。

図５３Ｃにグルコースおよび酸素の存在下／非存在下でのＦＮＲ−酪酸カセットｓｙｎ
３６３（ｔｅｒ置換を有する）を含む菌株における酪酸産生を示す。図５３Ｃは、細菌
がＦＮＲプロモーターからの酪酸産生のためにグルコースおよび嫌気的条件の両方を必要
とすることを示している。細胞は、グルコース不含有培地（ＬＢ）中または０．５％グル
コース含有培地（ＲＭＣ）中で好気的または嫌気的に増殖させた。培養試料を表示時点に
採取し、上清の一部をＬＣ−ＭＳを用いて酪酸濃度について評価した。これらのデータか
ら、ＳＹＮ３６３が酪酸の産生のためにグルコースを必要とし、グルコースの存在下では
、嫌気性ＦＮＲ調節ｙｄｆＺプロモーターの制御下にある場合、嫌気的条件下で酪酸の産
生を増大させることができることがわかる。
[実施例３９]

アンモニア代謝および酪酸産生回路を含む細菌菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
アンモニアの取込みおよびアルギニンへの変換ならびに酪酸の産生を１つの菌株におい
て達成することができるかどうかを判断するために、酪酸産生カセット構築物を含むプラ
スミド（Ｌｏｇｉｃ１５６）を最初の概念実証実験に用いた。以下の菌株をプラスミドを
用いて作製した：ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ
−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍ耐性）を含む）；およびＳＹＮ−ＵＣＤ−３０５であり、
Ｌｏｇｉｃ１５６をさらに含むＳＹＮ−ＵＣＤ６０１（すなわち、ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１
は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−Ａｒｇ
Ａｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸
プラスミド；ａｍ耐性）を含む）。酪酸のみの産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１、アルギニン
のみの産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および複合酪酸／アルギニン産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ−
６０１の間でアルギニンおよび酪酸の産生を比較した。用いた酪酸カセットの配列を表３
８に示す。

手短に述べると、凍結グリセロールストックからの細菌を含む３ｍｌのＬＢ（選択的抗
生物質（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０１についてＡｍｐ）ならびにＳ
ＹＮ−ＵＣＤ３０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０１について３ｍＭチミジンを含む）。細菌
を振盪しながら３７℃で一夜増殖させた。一夜培養を１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ
中で１０ｍｌのＬＢ（上記のように必要な場合、抗生物質およびチミジンを含む）に１：
１００の希釈度で希釈した。培養を振盪しながら３７℃で好気的に約１．５時間増殖させ
、次いで３７℃の嫌気的チャンバーに４時間移した。細菌（２×１０^８ＣＦＵ）を小遠心
管中５０ｍＭ ＭＯＰＳを０．５％グルコースとともに含む１ｍｌのＭ９培地に加えた。
細胞を平板培養して、細胞数を測定した。アッセイ管を３７℃の嫌気性チャンバーに入れ
た。表示時間（１、２、２４時間）に、１２０μｌの細胞を除去し、１４，０００ｒｐｍ
で１分間ペレット化し、１００μｌの上清を９６ウエルアッセイプレートに移し、アルミ
ニウムフォイルで密封し、アルギニンおよび酪酸濃度のＬＣ−ＭＳ（実施例１３および実
施例４０で述べる）による分析時まで−８０℃で保存した。

結果を図５３Ａおよび図５３Ｂに示す。ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５と同様のレベルのアルギニンを、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１と同様のレ
ベルの酪酸を産生することができることが示されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９０の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号９０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９０のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９０と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９２の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号９２と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９２のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９２と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９４の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号９４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９４のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９４と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９６の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号９６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９６のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９６と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９８の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号９８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９８のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９８と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１００の核酸配列またはその機
能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別
とすれば、配列番号１００と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断
片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１００のＤＮＡ配列も
しくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１００と同じ
ポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なく
とも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相
同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０４の核酸配列またはその機
能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別
とすれば、配列番号１０４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断
片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０４のＤＮＡ配列も
しくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０４と同じ
ポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なく
とも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相
同である核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８の核酸配列またはその機能
性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別と
すれば、配列番号４８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を
含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８のＤＮＡ配列もしくは
その機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号４８と同じポリペプ
チドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である
核酸配列を含む。

代替実施形態では、ｐｂｔおよびｂｕｋがＴｅｓＢ（配列番号４８）で置換されている
。
いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、誘導性プロモーターにより駆動される。例
えば、配列番号におけるｙｄｆＺの代わりに他のＦＮＲプロモーターを用いることができ
る。

非限定的なＦＮＲプロモーター配列を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、本発
明の遺伝子操作細菌は、表６に見いだされるプロモーター配列、例えば、ｎｉｒＢプロモ
ーター、ｙｄｆＺプロモーター、強いリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢ、強いリボ
ソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子（
ｆｎｒＳプロモーター）である、ｆｎｒＳ、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモー
ター、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳのうちの１つまたは複数の制御下の酪酸
カセットを含む。

いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、消化管内に存在する代謝物により誘導され
るプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、ＨＰ特異的
分子または肝損傷を示す代謝物、例えば、ビリルビンにより誘導される。いくつかの実施
形態では、酪酸カセットは、炎症または炎症反応により誘導性である、プロモーター（例
えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーター）の制御下におかれる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、それらの血液および腸における分子また
は代謝物、例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンア
ミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファ
ターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプ
ロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチ
ン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンにより誘導されたプロモーター
により駆動される酪酸カセットを含む。これらの分子またはそれらの代謝物の１つに応答
するプロモーターは、本明細書で示した遺伝子操作細菌に用いることができる。

いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、アラビノースにより誘導性であり、Ａｒａ
ＢＡＤプロモーターにより駆動される。
[実施例４０]

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる酪酸の定量
実施例３７における酪酸の測定値を得るために、酪酸の定量のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
プロトコールを用いた。

試料の調製
最初に、新鮮な酪酸ナトリウム保存溶液（１０ｍｇ／ｍ）ならびに１０００、５００、
２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム標準を水を用いて調
製した。次いで、１０μＬの試料（細菌上清および標準）をＶ型底ポリプロピレン９６ウ
エルプレートにピペッティングし、最終溶液中４μｇ／ｍＬの酪酸−ｄ７（ＣＤＮ同位体
）内部標準を含む９０μＬの６７％ＡＣＮ（反応当たり６０μＬ ＡＣＮ＋３０μＬ水）
を各試料に加えた。プレートを熱融着させ、十分に混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心
分離した。丸底９６ウエルポリプロピレンプレートにおいて、２０μＬの希釈試料を、１
０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ４．５、２０ｍＭ ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）
−Ｎ’−エチルカルボジイミド）および２０ｍＭ ＴＦＥＡ（２，２，２−トリフルオロ
エチルアミン）を含む１８０μＬの緩衝液に加えた。プレートを再び熱融着させ、十分に
混合し、試料を室温で１時間インキュベートした。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
酪酸は、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用い
たタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定
した。ＨＰＬＣの詳細を表４５および表４６に示す。タンデム質量分析の詳細は、表４７
に見いだされる。

[実施例４１]

胆管結紮モデルにおけるアルギニンおよび／または酪酸を産生する遺伝子操作細菌の有効
性
げっ歯類における総胆管の結紮は、肝臓胆汁うっ滞および線維症を誘発する多年にわた
る研究における実験的処置として用いられている（例えば、Ｔａｇら、Ｂｉｌｅ Ｄｕｃ
ｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍ
ａｔｏｒｙ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｙ Ｏｂｓｔｒ
ｕｃｔｉｖｅ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、２０１５年２月；９６；ｅ５２４３８頁、その中の参考文献
参照）。

肝臓炎症および線維症の症状の低減におけるアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株
の有効性を判定するために、胆管結紮モデルを用いる。ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１
０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪
酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌
株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を本試験で比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、線維症（門脈
、類洞周囲および総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントであり、動物の全般
的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。

動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週）は、Ｈ２Ｏ対照（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０
７（ｎ＝１２；カナマイシン耐性ニッスル）、またはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０
５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒ
Ｓ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよび無抗生物質耐性を含む）、または酪酸産生ＳＹＮ
−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含
む）、またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座におい
て染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよび染色体に組み込
まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセット、ならびに無抗生物質耐性を含む）の強制経口投
与により治療する。細菌を＞１０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−Ａｒｇ
Ａｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ
酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、ｍａ
ｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡ
およびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐
性を含む））をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる。

０日目に、胆管結紮手術を実施例４０で述べたように実施する。１日目に、マウスの体
重を測定し、無作為化する。マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹ
Ｎ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後
に強制経口投与する。２日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ７９８およびＳＹ
Ｎ９９３を午前および午後に強制経口投与する。３日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ
、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−
ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ／
ＡＳＴの分析のために血液を採取する。４〜６日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣ
Ｄ６０５を午前および午後に強制経口投与する。７日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ
、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−
ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ／
ＡＳＴの分析のために血液を採取する。８〜９日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣ
Ｄ６０５を午前および午後に強制経口投与する。１０日目に、マウスに１００μｌのＨ２
Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ
−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ
／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。１１〜１３日目に、マウスに１００μｌのＨ２
Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ
−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。１４日目に、動物に１００μｌの
Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳ
ＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する。次いで、投与の４時間後に動物を安楽死
させ、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために心臓採血により血液を採取する。組織学的評価によ
る線維症の分析のために肝臓組織を採取する。
[実施例４２]

胆管結紮処置
胆管結紮
手術前の準備：
完全な実験中に、動物を麻酔システムに永続的に接続された、３７℃の温度の加温プレ
ート上に保持し、手術野を液体浸透性の自己接着性ドレープで全体的に覆う。

マウスは、麻酔の誘導のための４Ｌ／分の流量の１００％酸素中４容積％イソフルラン
の吸入により麻酔する。麻酔の深さは、次のバイタル基準に達する場合、十分である：規
則的な自発呼吸、指間疼痛刺激の無反射および疼痛への無反応。マウスの腹部の被毛を電
気ファーシェーバーで剃毛し、眼および鼻軟膏を用いて眼を乾燥から保護する。マウスを
３７℃の加熱ホットプレート上にのせ、マウスの鼻をＦｌｕｏｖａｃ麻酔システムのＦｌ
ｕｏｖａｃマスクに挿入し、動物の脚を絹テープのストライプで固定する。
マウスの麻酔は、１Ｌ／分の流量の１００％酸素中１．５〜３容積％イソフルランの吸入
により維持し、ブプレノルフィン溶液（０．９％ ＮａＣｌ溶液に溶解した０．１ｍｇ／
ｋｇ ＢＷ）の腹腔内注射により周術期の鎮痛を誘導する。

剃毛腹部皮膚を皮膚の術前処置用の調製済みの標準消毒アルコール溶液で湿らせたガー
ゼスワブ滅菌する。

外科手術
１１．５ｃｍ外科用鋏で真皮と筋膜を同時に切断することにより約２ｃｍの長さの正中
線開腹術により腹部を開く。鋏を延展器として用いることによって腹膜の上部の結合組織
を切開した。腹膜を白線に沿って切断して、腹腔を開く。保持縫合糸を胸骨に挿入し、縫
合糸のフィラメントを持ち上げることによって腔を拡大し、それをＦｌｕｏｖａｃマスク
の上部に固定する。Ｃｏｌｉｂｒｉ牽引器を腹腔に挿入することによって手術野を広げる
。その腹側が横隔膜に向かって突き出て、門が明瞭に見えるように、湿らせた（０．９％
ＮａＣｌ溶液）綿スワブで肝臓を持ち上げる。腸の尾側移動による胆管を露出させる。小
鋸歯状鉗子を用いて胆管を隣接門脈静脈および肝動脈から注意深く分離する。５−０縫合
糸を胆管の周囲に設置し、２つの外科結びにより固定する。結び目を作る場合、牽引力を
連続的に増加させて、胆管を断ち切ることなく効果的な閉塞を保証する。第２の頭側結紮
を間の胆管を切断することなく同様な方法で加える。縫合糸の末端を切断し、胸骨を下げ
、牽引器を除去する。腹腔を０．９％ＮａＣｌ溶液ですすぎ、腹部臓器を生理的位置に戻
す。両腹部層（腹膜および真皮と筋膜）を６−０ Ｍｅｒｓｉｌｋを用いた別個の連続縫
合によって閉鎖する。縫合糸の末端を切断し、手術野を消毒溶液で湿らせたガーゼスワブ
で滅菌する。

術後処置およびフォローアップ：
マウスが十分に覚醒し、活動的になるまで、マウスを赤外ランプで加温されたケージ内
で回復させる。その後、マウスを通常のケージに移動させ、水および食物を自由に摂取さ
せる。手術後、内部動物管理使用委員会の現地の勧告に従って、動物を定期的にモニター
し、適切な鎮痛薬（例えば、ブプレノルフィン溶液）を用いてフォローアップ術後処置を
行う。動物に実験の終了まで食物および水を自由に摂取させることを維持した。
[実施例４３]

肝性脳症のＴＡＡモデル
ＵＣＤ、急性および慢性肝疾患ならびにＨＥに関連する血中アンモニアレベルの増加を
模擬するためのマウスのＴＡＡ処理は、文献において以前に用いられた（Ｗａｌｌａｃｅ
ＭＣら、Ｌａｂ Ａｎｉｍ．、２０１５年４月；４９巻（増補１）：２１〜９頁、Ｓｔ
ａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ： ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ ｍｏｄｅｌ
ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌の活性
の持続時間を検討し、肝性脳症の治療へのこのアプローチを支援するための追加データを
得るために高アンモニア血症のＴＡＡ誘発マウスモデルを用いる。

肝臓炎症および線維症の症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有
効性を判定するために、ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッス
ル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５
０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を
ＴＴＡモデル試験において比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、線維症（門脈、類洞周囲お
よび総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントである。動物の全般的な健康状態
が本試験の副次的エンドポイントである。

血中アンモニアの長期の上昇に対する操作細菌の影響を検討するために、３００ｍｐｋ
の用量のチオアセトアミド（ＴＡＡ）も投与するＣ５７ＢＬ６マウスに細菌を投与する。

Ｃ５７ＢＬ６（１０週齢）にＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ
＝１２）、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２）、もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１
２）（１００μｌの＞１×１０^１０細胞／ｍｌ）または媒体対照の一日量を投与する。あ
るいは、マウスに２一日量の細菌（１００μｌの＞１×１０^１０細胞／ｍｌ）（各治療群
につきｎ＝５）を午前に１回、午後に１回投与する。細菌の前投与の３日後に、マウスに
３００ｍｐｋのチオアセトアミド（ＴＡＡ）または対照としてのＨ_２Ｏを腹腔内投与する
。あるいは、マウスに２５０ｍｐｋを１日２回、午前に１回、午後に１回投与する。試験
の期間は、５日である。アンモニアレベルを測定し、全般的な健康状態、生存、体重変化
をモニターする。

手短に述べると、動物を７日間馴化させる。時間経過の１日目に、動物の体重を測定し
、ベースラインＡＬＴ／ＡＳＴを測定するために採血し、糞便ペレット（ケージごと）を
採取し、ＡＬＴ／ＡＳＴレベルに基づいて無作為化する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ
１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１
００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与
する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ ＡＴＣに変更する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、
ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口
投与により投与する。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ
／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。さ
らに、動物に３００ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）を腹腔内投与する。あるい
は、動物に２５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）を午前に１回、午後に１回投
与する。４日目に、動物の体重を測定し、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する
。糞便ペレットをケージごとに採取する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ
−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量
／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物に２
５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）も投与することができる。５日目に、動物
の体重を測定し、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。糞便ペレットをに採取
する（ケージごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回また
は２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、糞便
ペレット中の細菌負荷ならびに全般的な健康生存期間および体重変化をモニターする。組
織学的評価による線維症の分析のために肝臓組織を採取する。
[実施例４４]

肝性脳症の四塩化炭素（ＣＣｌ_４）モデル
ＣＣｌ_４は、動物における肝線維症および肝硬変を誘発するためにしばしば用いられる
。その理由は、基礎をなす生化学的機構および組織学的特性がヒト肝硬変に認められるも
のに類似しているからである（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ
ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒ
ｏｓｉｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４年、１巻（２号）：４３〜４９頁
）。

ＣＹＰ２Ｅ１は、細静脈周囲肝細胞において発現し、ＣＣｌ_４をＣＣｌ_３＋ラジカルに
変換する酵素である。ＣＣｌ_３＋ラジカルの蓄積は、小葉中心性壊死ならびに肝細胞形質
およびミトコンドリア膜の透過性の変化を引き起こす。結果として、炎症および線維形成
の増加、ならびに細胞外マトリックスの沈着が認められる。慢性ＣＣｌ_４曝露は、創傷治
癒過程の産物である、小結節の形成および線維症をもたらす。ＣＣｌ_４処理は、２〜４週
後に線維症、５〜７週後に著しい架橋線維症、９〜１１週後に硬変および１０〜２０週後
に小結節性硬変を引き起こすことが示された（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎ
ｔ ｏｆ ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔ
ｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ； Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４年、１巻（２号
）：４３〜４９頁、およびそれにおける参考文献）。

肝臓炎症および線維症の症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有
効性を判定するために、肝硬変のＣＣｌ_４マウスモデルを用いる。ニッスル対照（ＳＹＮ
−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３
０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を
産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を本試験において比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベ
ル、線維症（門脈、類洞周囲および総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントで
ある。動物の全般的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。試験期間は８週
間である。

動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週齢）をＨ_２Ｏ対照（ｎ＝１２）またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０７
（ｎ＝１２；カナマイシン耐性ニッスル）、もしくはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０
５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒ
Ｓ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない）もしくは酪酸産生Ｓ
ＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型Ｔ
ｈｙＡ、および染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含む）もしくは
ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組
み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡ、染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ
−ｔｅｒ酪酸カセットを含み、抗生物質耐性を含まない）の強制経口投与により治療する
。細菌は、１００μｌの容量で＞１０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−Ａｒｇ
Ａｆｂｒ、 野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅ
ｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、
ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈ
ｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍ
ｐ耐性）を含む）をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる
。

１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ
−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６
０５を午前に強制経口投与する。さらに、動物にオリーブ油（擬似対照）またはオリーブ
油中１ｍｌ／ｋｇ ＣＣＬ_４（他のすべての治療群）を強制経口投与する。動物に１００
μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２ま
たはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午後に強制経口投与する。

１〜８週目に、動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３
０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を１日２回強制経口投与する。
さらに、動物にオリーブ油（擬似対照）またはオリーブ油中１ｍｌ／ｋｇ ＣＣＬ_４（他
のすべての治療群）を３ｘ／週、強制経口投与する。動物の体重を３ｘ／週測定し、ＡＬ
Ｔ／ＡＳＴ分析用の血液を１ｘ／週採取する。

８週目の終了時に、動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣ
Ｄ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する
。投与の４時間後に、動物の体重を測定し、安楽死させ、ＡＬＴ／ＡＳＴ分析のために心
臓採血により血液を採取する。組織学的評価による線維症の分析のために肝臓を採取する
。
[実施例４５]

ＤＳＳマウスモデルにおける酪酸発現細菌の有効性
上述の酪酸カセットを含む細菌をＬＢ中で一夜増殖させた。次いで細菌を適切な選択マ
ーカー、例えば、アンピシリンを含むＬＢで１：１００に希釈し、０．４〜０．５の光学
濃度まで増殖させ、次いで遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸緩衝生理食塩水
に再懸濁し、１００μｌをマウスに強制経口投与する。細菌の強制経口投与前の７日間に
わたり３％デキストラン硫酸ナトリウムを含む飲料水を補給することによってマウスにお
ける消化管の損傷を誘発させる。マウスを１週間にわたり毎日処理し、糞便ホモジネート
を適切な選択マーカー、例えば、アンピシリンを添加した寒天プレート上で平板培養する
ことによって糞便試料中の細菌を検出する。５日間の細菌処理の後、内視鏡法を用いて生
存マウスにおける消化管の損傷を採点する。内視鏡的損傷スコアは、結腸の透過性、フィ
ブリン付着、粘膜および血管の病変、および／または糞便の特性を評価することにより確
定する。マウスを屠殺し、結腸組織を単離する。遠位結腸切片を固定し、炎症および潰瘍
形成について採点する。結腸組織をホモジネートし、酵素アッセイキットを用いてミエロ
ペルオキシダーゼ活性ならびにサイトカインレベル（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６
、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）について測定を行う。
[実施例４６]

ＨＥのＤＳＳ誘導マウスモデルの作製
述べた遺伝子操作細菌は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスモデにお
いて試験することができる。動物へのＤＳＳの投与は、炎症誘発性腸内容物（例えば、内
腔抗原、腸内細菌、細菌産物）に炎症を伝播させ、誘発させる、腸上皮の化学的損傷をも
たらす（Ｌｏｗら、２０１３年）。ＤＳＳ処理用のマウスを準備するために、マウスを耳
パンチまたは任意の他の適切な標識法を用いて標識する。マウスは、ＤＳＳ誘導に対して
異なる感受性および反応性を示すので、個々のマウスを標識することにより、研究者が各
マウスにおける疾患の進行を追跡することができる。次いでマウスの体重を測定し、必要
な場合、群間の任意の有意な体重差を解消するために平均群体重を均衡させる。後のアッ
セイの対照として、ＤＳＳの投与の前に糞便も採取する。炎症の糞便マーカー（例えば、
サイトカインレベルまたはミエロペルオキシダーゼ活性）の例示的アッセイを以下に述べ
る。

ＤＳＳの投与のために、高圧滅菌水中ＤＳＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎ
ｔａ Ａｎａ、ＣＡ；カタログ番号１６０１１０）の３％溶液を調製する。次に、ケージ
の水ボトルに１００ｍＬのＤＳＳ水を満たし、対照マウスにＤＳＳの補給のない同じ量の
水を与える。この量は、一般的に５匹のマウスに対して２〜３日間は十分なものである。
ＤＳＳは室温で安定であるが、両方の種類の水を２日ごと、またはボトル内の濁りが認め
られた場合に交換する。

腸炎症の急性、慢性および集束性モデルは、ＤＳＳの用量（通常１〜５％）およびＤＳ
Ｓ投与の期間を変更することによって達成される（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４年）
。例えば、急性および集束性消化管損傷は、１週間以下にわたるＤＳＳへの単一連続曝露
後に達成することができるのに対して、慢性消化管損傷は、回復期間により中断されるＤ
ＳＳの周期的投与（例えば、４サイクルの７日間のＤＳＳ処理、と続く７〜１０日の水）
によって一般的に誘導される。

図５３ＤにＦＮＲプロモーターの制御下のＤＳＳマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ
で産生された酪酸が消化管防護的であり得ることが示されている。ＬＣＮ２およびカルプ
ロテクチンは、両方が消化管バリアの破壊（このアッセイでＥＬＩＳＡにより測定される
）の尺度である。図５３ＤにＳｙｎ３６３（ｔｅｒ置換）がＳｙｎ９４（野生型ニッスル
）と比較して炎症を低減し、かつ／または消化管バリアを保護することが示されている。
[実施例４７]

疾患の進行のｉｎ ｖｉｖｏでのモニタリング
ＤＳＳの初回投与後、単一マウスを空のケージ（床敷き材料を含まない）に１５〜３０
分間入れることにより、糞便を各動物から毎日採取する。しかし、ＤＳＳの投与が進み、
炎症が強くなるにつれて、採取に必要な時間が長くなる。糞便試料は、滅菌済み鉗子を用
いて採取し、遠心管に入れる。単一ペレットを用いて、
以下の採点法に従って潜血をモニターする：０、正常な糞便の堅さと潜血陰性；１、軟便
で、潜血陽性；２、非常に軟便で、微量の血液；および３、水様便で、可視直腸出血。こ
の採点基準は、腸出血の比較解析に用いられる。すべての残存糞便は、炎症マーカーの測
定のために確保し、−２０℃で凍結する。

各動物の体重も毎日測定する。体重は、最初のＤＳＳの投与後の最初の３日間にわずか
に増加し、次いで出血の開始後徐々に減少し始める。急性大腸炎のマウスモデルについて
は、ＤＳＳは、一般的に７日間投与する。しかし、この期間は、研究者の裁量で変更する
ことができる。
[実施例４８]

ＤＳＳ誘導後の遺伝子操作細菌のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、ＨＥのＤＳＳ誘導動物モデルにおいて試験するこ
とができる。細菌は、適切な抗生物質を添加したＬＢ中で一夜増殖させる。次いで細菌を
選択抗生物質を含む新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、０．４〜０．５の光学濃度まで増
殖させ、遠心分離によりペレット化する。次いで細菌をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
に再懸濁する。細菌の強制経口投与前の７日間にわたり３％ＤＳＳを含む飲料水を補給す
ることによって、マウスにおける消化管損傷を誘発させる。ＤＳＳ処理の７日目に、１０
０μＬの細菌（または媒体）をマウスに強制経口投与により投与する。細菌処理を１週間
にわたり毎日１回反復し、糞便ホモジネートを選択寒天プレート上で平板培養することに
よって糞便試料中の細菌を検出する。

細菌処理の５日後に、Ｃｏｌｏｖｉｅｗシステム（Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｚ Ｖｅｔｅｒ
ｉｎａｒｙ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を用いて生存マウスにおける消
化管損傷を採点する。１．５〜２．０％イソフルラン麻酔下のマウスにおいて、結腸を空
気で拡張し、近位結腸の約３ｃｍを視覚化することができる（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２
０１４年）。内視鏡的損傷は、最大スコアが１８となる、結腸の透過性（スコア０〜３）
、腸壁へのフィブリンの付着（スコア０〜３）、粘膜顆粒度（スコア０〜３）、血管病変
（スコア０〜３）、糞便の特性（正常〜下痢；スコア０〜３）および内腔における血液の
存在（スコア０〜３）を評価することにより採点する。マウスを屠殺し、実施例８および
９で述べたプロトコールを用いて結腸組織を単離する。遠位結腸切片を固定し、炎症およ
び潰瘍形成について採点する。残りの結腸組織をホモジナイズし、サイトカインレベル（
例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）ならびにミ
エロペルオキシダーゼ活性を下で述べる方法を用いて測定する。
[実施例４９]

ＨＥのげっ歯類モデルの安楽死処置法
屠殺の４および２４時間前に、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ番号Ｂ２３１５１）を供給業者の
推奨の通りに、マウスに腹腔内投与することができる。ＢｒｄＵを用いて、標準抗Ｂｒｄ
Ｕ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いた免疫組織化学により腸上皮細
胞の増殖および／または移動をモニターする。

屠殺の当日に、マウスに４時間絶食させ、次いでＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（
４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）を強制経口投与する。糞便ペレットを採取し、ＦＩＴＣ
−デキストラン投与後３時間目にマウスを安楽死させる。次いで動物の心臓から採血して
、無溶血血清を採取する。腸透過性は、適切に希釈された血清の蛍光強度（励起４８８ｎ
ｍ、発光５２０ｎｍ）と相関しており、分光光度法を用いて測定する。マウス血清中の既
知量のＦＩＴＣ−デキストランの連続希釈を用いて、標準曲線を作成する。

あるいは、腸炎症は、血清ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、リポカリン２、カ
ルプロラクチンおよび／またはＣＲＰ−１のレベルにより定量する。これらのタンパク質
は、炎症性疾患の活動性の信頼できるバイオマーカーであり、製造業者の指示に従って、
ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、
ＭＮ）を用いて測定する。これらのアッセイについては、対照血清試料は、ＫＣについて
１：２または１：４に、リポカリン２について１：２００に希釈する。ＤＳＳ処理マウス
からの試料は、相当高い希釈を必要とする。
[実施例５０]

肝性脳症の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）モデル
ＮＯＤマウスは、消化管バリア増強回路、例えば、酪酸生合成カセットを含む細菌の有
効性を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏモデルとして用いることができる。
その理由は、これらのマウスは、密着結合タンパク質（例えば、オクルジン、ゾニュラオ
クルジン、ムチン、Ｅ−カドヘリン）のレベルの低下によって明らかである、顕著な「漏
出性消化管」表現型を示すからである。

「漏出性消化管」に関連する症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株
の有効性を判定するために、ＮＯＤマウスモデルを用いる。ＮＯＤマウスは、膵島β細胞
の自己免疫性破壊に起因する。ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性
ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−Ｕ
ＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０
５）を本試験において比較する。消化管上皮の完全性（オクルジンおよび他の密着結合マ
ーカー）ならびに消化管炎症（炎症性バイオマーカー、例えば、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−６、
ＴＮＦａ、ＩＬ−２１）が本試験の主要なエンドポイントである。動物の全般的な健康状
態が本試験の副次的エンドポイントである。試験の期間は、８週間である。

動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週齢）をＨ_２Ｏ対照（ｎ＝１２）または酪酸１００ｍＭ（ｎ＝
１２）、もしくはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌ
ＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを
含み、抗生物質耐性を含まない）もしくは酪酸産生ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；野
生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡ、および染色体に組み込まれ
たＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含む）もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；
ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆ
ｂｒ、ΔＴｈｙＡ、染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含み、抗生
物質耐性を含まない）の強制経口投与により治療する。細菌は、１００μｌの容量で＞１
０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−Ａｒｇ
Ａｆｂｒ、 野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅ
ｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、
ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈ
ｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍ
ｐ耐性）を含む）をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる
。

１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００
ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を
午前に強制経口投与する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ
３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午後に強制経口投与する。
動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５
０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を１日２回強制経口投与する。動物の体重を毎日測定す
る。

５日目に、マウスを４時間絶食させ、次いで０．６ｍｇ／ｇ ＦＩＴＣ−デキストラン
（４０ｋＤ）を強制経口投与する。ＦＩＴＣ−ｄｅｘの投与後３時間目にマウス体重を測
定し、心臓採血により血液を採取し、結腸および糞便ペレットを採取する。

ハプトグロビン／ゾヌリンおよびＬｃｎ２を測定する。ＴＪＰ１、ＯＣＬＮ、ＣＬＤＮ
２５およびＥＰＣＡＭのＲＮＡレベルを結腸試料において測定する（これらのマーカーの
レベルの増加は治療効果を示す）。炎症バイオマーカーのＲＮＡレベルを血液試料におい
て測定する（これらのマーカーのレベルの低下は治療効果を示す）。
[実施例５１]

ＧＡＢＡ輸送および代謝回路
上述のアンモニア変換回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、１つもしくは複数のＧＡ
ＢＡ輸送および／または１つもしくは複数のＧＡＢＡ代謝回路をさらに含む。少なくとも
１つのＧＡＢＡ輸送回路を含む遺伝子操作菌株は、ＧａｂＰ（配列番号１０５、表４８；
配列番号１０６、表４９）などの、例示的ＧＡＢＡ輸送タンパク質をコードする遺伝子を
含み、上述の方法を用いて構築される。少なくとも１つのＧＡＢＡ代謝回路を含む遺伝子
操作菌株は、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨを含むが、これらに限定されない、ＧＡＢＡ代謝に
必要な酵素をコードする遺伝子を含み、上述の方法を用いて構築される。

ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プ
ロモーター、配列番号１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーターまたはＨＥ関連分子
もしくは代謝物により誘導されるプロモーターの制御下に発現する。ＧａｂＰ、ＧＳＳＴ
およびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、同じまたは異なるプロモーターの制御下に発現し
得る。本明細書に記載の通り、他のプロモーターを用いることができる。ＧａｂＰ、ＧＳ
ＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドま
たは染色体上に発現する。ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、大
腸菌ニッスルにおける次の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈ
ｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適
切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参照されたい。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０６の核酸配列またはその機
能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別
とすれば、配列番号１０６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断
片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０６のＤＮＡ配列も
しくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０６と同じ
ポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なく
とも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相
同である核酸配列を含む。
[実施例５２]

マンガン輸送回路
上述の回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、１つもしくは複数のマンガン輸送回路を
さらに含む。少なくとも１つのマンガン輸送回路を含む遺伝子操作菌株は、ＭｎｔＨ（配
列番号１０７、表５０；配列番号１０８、表５１）などの、例示的マンガン輸送タンパク
質をコードする遺伝子を含み、上述の方法を用いて構築される。

ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番号１８
〜２９から選択されるＦＮＲプロモーターまたはＨＥ関連分子もしくは代謝物により誘導
されるプロモーターの制御下に発現する。本明細書に記載の通り、他のプロモーターを用
いることができる。ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラ
スミドまたは染色体上に発現する。ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、大腸菌ニッスルにお
ける次の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／
Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を用
いることができる。例えば、図１８を参照されたい。

[実施例５３]

ＴｅｓＢを含む回路
ＴｅｓＢの核酸配列は、以下のように翻訳される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０９のアミノ酸配列またはそ
の機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０９のア
ミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくと
も約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、
あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０９と同じポリペプチドまたは
その機能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９１のアミノ酸配列またはその
機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９１のアミノ
酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、ある
いは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９１と同じポリペプチドまたはその機
能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９３のアミノ酸配列またはその
機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９３のアミノ
酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、ある
いは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９３と同じポリペプチドまたはその機
能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９５のアミノ酸配列またはその
機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９５のアミノ
酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、ある
いは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９５と同じポリペプチドまたはその機
能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９７のアミノ酸配列またはその
機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９７のアミノ
酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、ある
いは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９７と同じポリペプチドまたはその機
能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９９のアミノ酸配列またはその
機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９９のアミノ
酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、ある
いは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９９と同じポリペプチドまたはその機
能性断片をコードする核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０１のアミノ酸配列またはそ
の機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０１のア
ミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくと
も約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、
あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０１と同じポリペプチドまたは
その機能性断片をコードする核酸配列を含む。

図１Ａは、非誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）は、ＡｒｇＡ（くねった線ξ）と相互作用してＡｒｇＡ活性を阻害し（「Ｘ」印で示す）、一方、酸素（Ｏ_２）は、ＦＮＲ（点線の囲み線付きのＦＮＲ）が二量体化し、ＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）およびその制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）ため好気的条件下で比較的に低いアルギニンの産生を示す。図１Ｂは、誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。ＦＮＲが二量体化し（点線の囲み線付きの２つのＦＮＲ）、アルギニンによる阻害に抵抗性である、ＡｒｇＡ^ｆｂｒ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ上のくねった線ξ）のＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）媒介発現を誘導するため嫌気的条件下でのアルギニンの産生の上方制御を示す。これは、ＡｒｇＡ（ａｒｇＡを示す四角の上のくねった線ξ）と相互作用するアルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）により引き起こされる野生型ＡｒｇＡの阻害を克服する（曲がった矢印）。アルギニンレギュロンにおける各遺伝子を遺伝子の名称を含む長方形によって示す。長方形の１つまたは集合に隣接する各矢印は、そのような遺伝子（複数可）の矢印の方向の転写を駆動することに関与するプロモーターを示す。１つまたは一連の長方形に隣接するより太い直線は、この細菌においてＡｒｇＲが欠失しているので利用されないＡｒｇＲ結合部位を示す。各長方形の上の矢印は、各遺伝子の発現産物を示す。 図２Ａは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。好気的条件下での実施形態を示し、酸素の存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、単量体として留まり、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動するＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化することができない。野生型ＡｒｇＡタンパク質は、機能性であるが、アルギニンに結合することにより負のフィーバック抑制を受けやすく、それによりアルギニンレベルを正常以下に維持する。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線；黒色の「Ｘ」印）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させた。図２Ｂは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。嫌気的条件下での図２Ａと同様の実施形態を示し、酸素の非存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、二量体化し、ＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化する。これは、アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）によるフィーバック抑制に抵抗性である、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動する（黒色のくねった線（ξ）＝ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現産物）。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させ（黒色の「Ｘ」印）、ひいてはアルギニン−ＡｒｇＲ複合体による阻害を妨げた。これにより、アルギニンの高レベルの産生が可能となる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、遺伝子Ｘの発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲとＸとの間の黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、遺伝子Ｘの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、遺伝子Ｘの発現（黒色のくねった線（ξ））が可能になる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲ楕円に結合した黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、ＧＦＰの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、ＧＦＰの発現が可能になる。この構築物を含む宿主を突然変異させることによって、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）を用いてＧＦＰの発現に基づいて高アルギニン産生体を選択することができる。 本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサーの発現（示さず）を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（ＡｒｇＲ−Ａｒｇ複合体により結合された黒色の線）を含む構築物は、宿主の生存に必要な栄養要求性タンパク質（「ＡＵＣ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。高アルギニン濃度下では、ＡｒｇＲ−アルギニン複合体がＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＡＵＸの発現が可能となり、宿主が生存することが可能になる。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲがｔｅｔＲ遺伝子から発現し、ＡＵＸの発現を阻害し、ひいては宿主を殺滅する。図５における構築物は、ＡＵＸ発現のその制御により宿主細胞の生存のためにそれを必要にすることによって高アルギニン（「Ａｒｇ」）産生を増強する。 強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。 強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の他の概略図である。他の調節エレメントも存在し得る。 弱いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。 図９Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示し、制限部位は太字で示す。図９Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢプロモーター）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。他の調節エレメントも存在し得る。 図１０Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。制限部位を太字で示したＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示す。図１０Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳプロモーター）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。 大腸菌ニッスル（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）における構成的に発現したａｒｇＧ構築物の例示的実施形態を示す図である。構成的プロモーターは、灰色の囲み線付きのＢＢａ＿Ｊ２３１００である。クローニングに用いる制限部位は太字である。 大腸菌ニッスルの野生型ａｒｇＧオペロンおよびその構成的に発現する突然変異体のマップを示す図である。四角囲みのＡＲＧは、野生型オペロンに存在するが、突然変異体には存在しない。ＡｒｇＧは、ＢＢａ＿Ｊ２３１００プロモーターの制御下で構成的に発現する。 例示的ＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ構築物の概略図である。この実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子がａｒａＣ遺伝子とａｒａＤ遺伝子との間に挿入されている。ＡｒｇＡ^ｆｂｒに、リボソーム結合部位、ＦＲＴ部位および１つまたは複数の転写終結配列が隣接している。 ａｒｇＲ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。 ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。 ＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。 ａｒｇＧを除くアルギニン生合成オペロンのすべてにおけるＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。 大腸菌１９１７ニッスル染色体内の例示的組込み部位のマップを示す図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨げることなく、回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を用いて、挿入が発散的または収束的に発現する遺伝子間に起こることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内の挿入は、栄養要求性を作るのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、個々の回路成分を複数の示された部位に挿入する。ｍａｌＥ／Ｋ部位を丸で囲む。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒをｍａｌＥＫ遺伝子座に挿入する。 赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現する３つの細菌菌株を示す図である。菌株１〜３において、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入され、蛍光灯下で様々な程度の輝度をもたらす。非改変大腸菌ニッスル（菌株４）は、非蛍光性である。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０２を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたΔＡｒｇＲ、ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡおよびクロラムフェニコール耐性を含む。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０６、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０９を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。 本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０８およびＳＹＮ−ＵＣＤ３１０を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。 誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１は、ΔＡｒｇＲを含み、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲおよび高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。 誘導条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０５により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンおよびシトルリンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧ、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、構成的に発現したａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーター）、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。 酸素の存在（＋Ｏ_２）または非存在（−Ｏ_２）下で、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４により産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照ニッスル構築物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。 ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ１０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１は、野生型ＡｒｇＲおよび野生型ＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡＦｂｒを含まず、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む。 ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がΔＡｒｇＲ、それぞれ高コピープラスミドまたは低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、Ａｍｐ耐性および野生型ＴｈｙＡを含む。 図２８Ａは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。非改変対照ニッスルまたはＡｒｇリプレッサー遺伝子が欠失し、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子が高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子操作菌株であるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与した高アンモニア血症マウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。合計９６匹のマウスを試験した。エラーバーは、標準誤差を表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与したマウスにおける血中アンモニア（ＢＡ）レベルは、４日目および５日目において非改変対照ニッスルを投与したマウスにおけるアンモニアレベルより低い（ニッスル、ＢＡ＝２２０ｍＭ；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＢＡ＝１０５ｍＭ；ＢＡ_{Ｎｉｓｓｌｅ}−ＢＡ_{ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２}＝１１５ｍＭ；平均血液容積＝１．５ｍＬ）。図２８Ｂは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）および媒体のみの対照と比較して、ＴＡＡマウスモデルにおけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０４のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（アンモニア消費）を示す棒グラフを示す。図２８Ｃは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ＴＡＡ処理後２４〜４８時間目の血中アンモニア濃度の変化の百分率の棒グラフを示す。 高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。５６匹のｓｐｆ^ａｓｈマウスを４群に分けた。群１に通常の飼料を与え、群２〜４に初期の採血の後に７０％タンパク質飼料を与えた。各群にストレプトマイシン耐性ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）またはＳＹＮ−ＵＣＤ２０４を水とともに１日２回強制経口投与し、最初の強制経口投与の４時間後に血液を採取した。ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡ^ｆｂｒを含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、血中アンモニアを高アンモニア血症閾値を下回るレベルに有意に低下させた。 高タンパク食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。マウスにＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含む）または水を投与し、次いで、２日後に高タンパク食に切り替えた。図３０に見られるように、高タンパク食への切り替えの４８時間後にアンモニアレベルがＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の両方において同様の程度に低下し、ＴｈｙＡ栄養要求性が有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。 図３１Ａは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。０、３０、６０および１２０分目に測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。図３１Ｂは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（これらの３つすべてが組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ΔＡｒｇＲおよびｗｔＴｈｙＡを含み、ＳＹＮ３０３は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む）のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。結果から、ＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組込みが、同じ構築物を発現する低コピープラスミド菌株で認められたのと同様のレベルのアルギニン産生をもたらすことがわかる。 図３２Ａは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスのアンモニアレベルおよび生存曲線の棒グラフである。ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）はＴｈｙＡ欠失を有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１）は有さない２つの菌株を比較した。通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。高タンパク食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレベルは、Ｈ_２Ｏ高タンパク食対照群と比較してＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３群において低下した。アンモニアレベルの観測された低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方において同様であり、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。図３２Ｂは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスの生存曲線を示す図であり、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３が対照と比較して生存期間の延長を示したことを表す。 通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおける血中アンモニアレベルのグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９および１×１０^１０細胞の用量を１２日間にわたり毎日投与した。血中アンモニアレベルを５日目に測定した。１×１０^８および１×１０^９の両用量は、このモデルにおける血中アンモニアレベルの有意な低下をもたらすのに十分であった。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。 ニッスルのｉｎ ｖｉｖｏでの滞在を示すグラフである。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。 図３５Ａは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性ニッスル）の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｂは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡｆｂｒを含まないＳＹＮ−ＵＣＤ１０６の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｃは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０^９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含むＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。 図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、生存細菌細胞およびアルギニン産生の棒グラフである。細胞を７０％イソプロパノールまたは対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とともに振盪しながら１時間インキュベートした。処理後、細胞を、０．５％グルコースおよび３ｍＭチミジンを添加したＭ９培地中で特定の比率で混合し、振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。図３６Ａおよび３６Ｂに見られるように、培養中のイソプロパノール処理細胞と非処理細胞とのより大きい比率は、平板培養により決定されるより少ないＣＦＵｓおよびより低いレベルのアルギニンの産生をもたらす。存在する細菌の量に対するアルギニンの産生は、種々の培養にわたり一定のままであった（図３６Ｃ）。これらの結果から、生存細菌のみがアルギニンの産生に寄与していることがわかる。 非ヒト霊長類毒性試験において採取した糞便試料中の定量された細菌の数を示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７（カナマイシン耐性ニッスル）およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む）の投与により得られた薬物動態および薬力学を５０日にわたり比較した。結果から、これらの投与条件下では、糞便中に対照カナマイシン耐性ニッスルと同様の量の細菌が栄養要求体ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について回収されたことがわかる。同様の結果がマウスにおいて観測された。 肝性脳症および高アンモニア血症を特徴とする他の障害を治療するための例示的合成遺伝子回路を示す図である。アンモニア変換回路において、アンモニアが細菌（例えば、大腸菌ニッスル）によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための４つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。第３の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。第４の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、４つの回路すべてがそれぞれ同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、４つの回路が異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧＡＢＡのレベルを低下させるための追加の回路、例えば、ＧＡＢＡを代謝する（異化する）ための回路をさらに含み得る。 図４１Ａは、合成遺伝子回路を含む遺伝子操作細菌への取込みの後のＧＡＢＡの異化を示す図である。細胞への侵入により、ＧＡＢＡがＧＡＢＡ α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ（ＧＳＳＴ）によりスクシニルセミアルデヒドに変換される。次にコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）が、ＧＡＢＡ異化における第２および唯一の他の特定のステップである、スクシニルセミアルデヒドのコハク酸への酸化を触媒する。最終的に、コハク酸がクエン酸（ＴＣＡ）回路の基質になる。ＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）は、アルファ−ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換する。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＧＯＴのうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されないＧＡＢＡ消費回路を含む。図４１Ｂは、大腸菌ニッスルにおけるＧＡＢＡ利用経路の概略図である。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。 本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。本明細書に記載の酪酸カセットのうちの１つまたは複数は、アルギニン（および／またはシトルリン）産生回路を含む遺伝子操作細菌により発現させることができる。 複数の作用機構（ＭｏＡｓ）を含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。 複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が４つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４６Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が３つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４６Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が３つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４７Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路およびマンガン輸送回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４７Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が２つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。 図４８Ａは、酪酸の産生のための代謝経路を示す。図４８Ｂおよび図４８Ｃは、両方がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、２種の酪酸産生回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３およびＳＹＮ−ＵＣＤ５０４に見いだされる）の概略図を示す。図４８Ｄは、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の第３の酪酸遺伝子カセット（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５に見いだされる）の概略図を示す。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセットを含む。「ｂｄｃ２カセット」または「ｂｄｃ２酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子がｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｒカセット」または「ｔｅｒ酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｓＢ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子が存在し、ｔｅｓＢ遺伝子がｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢカセット」または「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢ酪酸カセット」は、少なくともｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する。本開示の代替酪酸カセットは、少なくともｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｔｅｓまたはｔｅｓＢカセットは、テトラサイクリン以外の誘導性プロモーターの制御下にある。ｔｅｓＢカセットの発現を制御し得る例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ， ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。 本開示の例示的な操作細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図４９Ａおよび４９Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図４９Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図４９Ｃおよび４９Ｄに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および酸化窒素（ＮＯ）の存在下でのその抑制解除を示す。図４９Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節領域に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図４９ＥおよびＦに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ_２Ｏ_２の存在下でのその誘導を示す。図４９Ｅにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｆにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ_２Ｏ_２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。 本開示の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図５０Ａおよび５０Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図５０Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図５０Ｃおよび５０Ｄに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯの存在下でのその抑制解除を示す。図５０Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図５０Ｅおよび５０Ｆに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ_２Ｏ_２の存在下でのその誘導を示す。図５０Ｅにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｆにおいて、Ｈ_２Ｏ_２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ_２Ｏ_２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。 図４８に示した回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０５）を用いた酪酸産生のグラフである。細胞を０．２％グルコースを含むＭ９最少培地中で増殖させ、初期対数期にＡＴＣにより誘導した。図５１Ａに見られるように、好気性対嫌気的条件下で各構築物について同様の量の酪酸が産生された。ｔｅｒ菌株は、全般的により多くの酪酸を産生する。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、ｐＬｏｇｉｃ０３１（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセット）を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット）を含む。図５１ＢにＳＹＮ−ＵＣＤ５０４（ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット））ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ５０５（プラスミドｐＬＯＧＩＣ０４６−デルタｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋、ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子の欠失およびｔｅｓＢ遺伝子によるそれらの置換を含む酪酸構築物を含むＡＴＣ誘導性ｔｅｒを含むニッスル株）の酪酸の産生を示す。ｔｅｓＢ構築物は、より大きい酪酸の産生をもたらす。 ｎｕｏＢ遺伝子の欠失を含む異なる酪酸産生回路を用いた酪酸の産生のグラフである。示した菌株は、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０３と同じである）およびＳＹＮ−ＵＣＤ５１１（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１１は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０４と同じである）である。ＮｕｏＢ遺伝子の欠失は、酪酸産生菌株における野生型親対照と比較してより大きいレベルの酪酸産生をもたらす。ＮｕｏＢは、呼吸成長時のＮＡＤＨの酸化に関与する主要なタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨ酸化と電子伝達との共役を妨げることにより、酪酸の産生を維持するために用いられるＮＡＤＨの量が増加する。 図５３Ａは、ＦＮＲプロモーターの制御下の酪酸産生回路の概略図である。図５３Ｂは、酪酸産生の嫌気性誘導の棒グラフである。ＦＮＲ応答性プロモーターをｂｃｄまたはｔｅｒ回路を含む酪酸カセットに融合させた。形質転換細胞をＬＢにおいて初期対数期まで増殖させ、嫌気性チャンバー内に４時間入れて、酪酸遺伝子の発現を誘導した。細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含む最少培地に再懸濁し、微好気的にインキュベートして、酪酸の産生を経時的にモニターした。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、嫌気的条件下で有意な酪酸産生をもたらした。図５３Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコースおよび酸素の存在下および非存在下でのＳＹＮ−ＵＣＤ５０１についての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５００は、ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０６は、ｐＳＣ１０１ ｎｉｒＢ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含む。図５３Ｄは、ＨＥのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける糞便試料を用いてＥＬＩＳＡにより定量したマウスリポカリン２およびカルプロテクチンのレベルを示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、対照ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３と比較して炎症を低減し、かつ／または消化管バリア機能を保護する。 （１）酪酸産生菌株、（２）アルギニン産生菌株（アンモニア消費菌株）ならびに（３）酪酸を産生し、アンモニアも消費する菌株についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニン（図５４Ａ）および酪酸（図５４Ｂ）産生を示す棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まないアルギニン産生／アンモニア消費菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０１（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１ ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生およびアルギニン産生／アンモニア消費菌株）。データから、ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１がｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＹＮ−ＵＣＤ３０５と同様のレベルのアルギニンを、またＳＹＮ−ＵＣＤ５０１と同様のレベルの酪酸を産生することができることがわかる。 本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５５Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５５ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。 例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。 図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、例示的な操作された細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５７Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５７ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。図５７Ｃに例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す。 本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５８Ａに酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、ｔｅｓＢ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５８ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。 例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。 図６０Ａおよび６０Ｂは、正のフィードバック栄養要求体を作製し、高アルギニン産生のために選択するために用いることができる例示的構築物を示す図である。図６０ＡにｔｈｙＡの発現を駆動するａｓｔＣプロモーターのマップを示す。図６０ＢにａｓｔＣプロモーターの制御下のｔｈｙＡ遺伝子の概略図を示す。調節領域は、ＣＲＰ、ＡｒｇＲおよびＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の結合部位を含み、追加の調節エレメントも含み得る。 アンモニアをシトルリンまたはアルギニンなどの所望の産物への変換により、尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするための操作細菌菌株の他の例示的実施形態を示す図である。該菌株は、ａｒｇＲが欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするように操作された合成生物も図６５に記載するキルスイッチ実施形態を有する。この例では、ＩｎｔリコンビナーゼおよびＫｉｄ−Ｋｉｓ毒素抗毒素システムをＵＣＤを治療するための組換え細菌細胞に用いる。組換え細菌細胞は、過剰のアンモニアを消費して、患者予後を改善するための有益な副産物を産生するように操作されている。組換え細菌細胞は、安全性を保証するための高度に制御可能なキルスイッチも含む。低酸素環境（例えば、消化管内に見いだされるような）に反応して、ＦＮＲプロモーターは、Ｉｎｔリコンビナーゼの発現を誘導し、Ｋｉｓ抗毒素の発現も誘導する。Ｉｎｔリコンビナーゼは、Ｋｉｄ毒素遺伝子を活性化立体配座に転換させるが、蓄積されたＫｉｓ抗毒素の存在が発現Ｋｉｄ毒素の活性を抑制する。酸素の存在下（例えば、消化管外）では、抗毒素の発現は停止する。毒素は、構成的に発現するので、蓄積し続け、細菌細胞を殺滅する。高アンモニア血症は、他の病変にも寄与し得る。 例示的なリコンビナーゼシステムを示す図である。 例示的なリコンビナーゼシステムを示す図である。 例示的なリコンビナーゼシステムを示す図である。 例示的なリコンビナーゼシステムを示す図である。 図６６Ａは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーター（Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}）に結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。図６６Ａに組換え細菌に見いだされない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の必須遺伝子の転写を抑制する立体配座をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これが必須遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能力を維持する。図６６Ｂは、抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔＲの発現を誘導し、ひいては毒素の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場会、ＴｅｔＲは、発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素に打ち勝ち、細胞を殺滅する。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターより弱いプロモーターであるべきである。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターの制御下にある。図６６Ｃは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。 操作された安全構成要素としてのＧｅｎｅＧｕａｒｄｓの使用を示す図である。すべての操作されたＤＮＡは、条件付きで破壊することができるプラスミド上に存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ： Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４巻、３０７〜３１６頁を参照されたい。 短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定システムを含む、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。細胞がプラスミドを失った場合、抗毒素がもはや産生されず、毒素が細胞を殺滅する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、等量のＨｏｋ毒素および短寿命Ｓｏｋ抗毒素を産生する。上のパネルにおいて、細胞は、等量の毒素および抗毒素を産生し、安定である。中間のパネルにおいて、細胞は、プラスミドを失い、抗毒素が崩壊し始める。下のパネルにおいて、抗毒素が完全に崩壊し、細胞が死ぬ。 細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境に移動させることができるようにペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることによって、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチド（星）を分泌する鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌システムの概略図である。 治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌システムの概略図である。このシステムにおいて、Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体に動員され、そこでベータ−ドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。次いで治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。治療用ペプチドは、自触媒切断によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（ハサミ）の標的化によってリンカーシステムから解放される。 内および外膜の両方を通るチャンネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を用いてパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接転位させる、Ｉ型分泌システムの概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。 漏出性または不安定化外膜を作製し、それにより、細胞外腔への治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含む真核生物由来の治療用ポリペプチドの転位を促進するためのグラム陰性細菌の外および内膜、ならびにいくつかの欠失標的の概略図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ留めるタンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を発生させる。突然変異の組合せは、漏出性表現型を相乗的に増強させ得る。 細菌が消化管内腔に分泌治療用タンパク質を注入することを可能にする改変された３型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を示す図である。誘導性プロモーター（小矢印、上）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、タグ付きペプチドを細胞外に分泌する装置を作るＴ３分泌システム遺伝子カセット（３つの大矢印、上）の発現を誘導する。誘導性プロモーター（小矢印、下）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、次にタグ付き治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する、調節因子、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの発現を駆動する。 例示的なＬ−ホモセリンおよびＬ−メチオニン生合成経路を示す図である。円形は、ＭｅｔＪにより抑制される遺伝子を表し、ｍｅｔＪの欠失は、これらの遺伝子の構成的発現および経路の活性化をもたらす。 例示的なヒスチジン生合成経路を示す図である。 例示的なリシン生合成経路を示す図である。 例示的なアスパラギン生合成経路を示す図である。 例示的なグルタミン生合成経路を示す図である。 例示的なトリプトファン生合成経路を示す図である。 本開示の遺伝子操作細菌を設計し、作製する非限定的な方法の概略を示す図である。「定義する」ステップは、１．微生物生理学および疾患生物学に基づく多様な候補アプローチの特定、２．候補代謝経路を決定するためのバイオインフォマティクスの使用、最適化操作された合成生物の要求される性能目標を決定するための予測ツールの使用を含む。「設計する」ステップは、１．経路構成のコンビナトリアル試験を可能にするための最先端のＤＮＡアセンブリ、２．経路の効率を予測するための数学モデル、３．操作された回路の制御および調節を可能にする専用のスイッチおよび部品の内部安定の使用を含む。「構築する」ステップは、１．コア構造「シャーシー」を構築すること、２．操作された回路を、効率的発現のための最適な染色体位置に安定に組み込むこと、３．固有の機能アッセイを用いて、遺伝子回路の忠実性および活性を評価することを含む。「組み込む」ステップは、１．動物モデルにおける合成生物の局在および通過時間のモニタリングを可能にする、染色体マーカーの使用、２．特定の疾患状態がＧＩ微生物叢および当環境における合成生物の挙動にどのように影響を及ぼすかの理解を拡大するための専門のマイクロバイオームネットワークおよびバイオインフォマティクスを利用すること、３．開発候補の前臨床への速やかで、途切れのない移行を可能にする、発見段階における組織内での方法の開発研究および最適化を活発にすること、候補合成生物の用意周到で、高品質の試験を支援する、特殊疾患動物モデルの改良の広範な経験を利用することを含む。 図８１Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、本開示の遺伝子操作細菌の上流および下流生産のための非限定的な製造方法の略図である。図８１Ａは、種培養１（ＳＣ１）のパラメーター：白金耳量−グリセロール保存液、継続時間一夜、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｂは、種培養２（ＳＣ２）のパラメーター：ＳＣ１からの１／１００希釈、継続時間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｃは、生産バイオリアクターのパラメーター：接種物−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、継続時間２４時間を示す。図８１Ｄは、収集のパラメーター：４０００ｒｐｍの速度および３０分の継続時間での遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、再懸濁１０％グリセロール／ＰＢＳを示す。図８１Ｅは、バイアル充填／貯蔵のパラメーター：１〜２ｍＬの小分け、−８０℃を示す。 ＡＴＣ（図８２Ａ）または酸化窒素誘導性（図８２Ｂ）リポーター構築物を示す図である。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。対照、ＡＴＣ誘導性Ｐ_ｔｅｔ−ＧＦＰリポーター構築物または酸化窒素誘導性Ｐ_ｎｓｒＲ−ＧＦＰリポーター構築物を含むプラスミドを含むニッスル細胞は、一連の濃度にわたり誘導した。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。図８２Ｃは、構築物の概略図を示す図である。 構成的プロモーターの制御下のＮｓｒＲを発現するプラスミドおよびＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下のリポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を含む細菌のドットブロットを示す図である。ＤＳＳ投与マウスをＨＥの例示的モデルとする。ＨＥ対象と同様に、マウスの消化管は、飲料水に２〜３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加することによって損傷する。化学発光は、ＤＳＳ投与マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターで示されている。 野生型ニッスルと比較してより多くの酪酸を産生する、ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０７）またはｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０８）を含む遺伝子操作ニッスルによる酪酸の産生を示す図である。

Claims (78)

1. アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ
   細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィ
   ードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝
   子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコ
   ードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結して
   おり、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、消化管バリア機
   能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、遺伝子操作細菌。
2. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、外因性環
   境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の遺伝
   子操作細菌。
3. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
   テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記消化管バリア機
   能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーター
   が、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項２に記載の遺伝子操作細菌。
4. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、前記低い
   アルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを
   コードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に
   連結している、請求項１または請求項２に記載の遺伝子操作細菌。
5. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
   テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記消化管バリア機
   能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーター
   が、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項２から４の
   いずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
6. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
   テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、低酸素または嫌気的
   条件下で誘導される、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
7. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
   テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモ
   ーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択
   される、請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
8. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
   テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモ
   ーターである、請求項１から７のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
9. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
   連結したプロモーターが、低酸素または嫌気的条件下で誘導される、請求項２から８のい
   ずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
10. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよび
    ＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項２から９のいずれか一項に
    記載の遺伝子操作細菌。
11. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーターである、請求項２から１０のいずれ
    か一項に記載の遺伝子操作細菌。
12. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、肝損傷を示す１つも
    しくは複数の分子または代謝物により誘導される、請求項１から４のいずれか一項に記載
    の遺伝子操作細菌。
13. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、肝損傷を示す１つもしくは複数の分子または代謝物により誘導
    される、請求項２から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
14. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、活性窒素種の存在により誘導される、請求項２から８のいずれ
    か一項に記載の遺伝子操作細菌。
15. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、活性酸素種の存在により誘導される、請求項２から８のいずれ
    か一項に記載の遺伝子操作細菌。
16. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に
    連結したプロモーターが、哺乳動物消化管に天然で存在しない環境因子により誘導される
    、請求項２から４および６から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
17. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子が、細菌における染色体上に存在する、請求項１から１６の
    いずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
18. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子が、細菌におけるプラスミド上に存在する、請求項１から１
    ６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
19. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、細菌にお
    ける染色体上に存在する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
20. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、細菌にお
    けるプラスミド上に存在する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌
    。
21. 対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、１つもしくは
    複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により、独立に欠失したまたは不活性にされ
    ている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
22. 対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、欠失している
    、請求項２１に記載の遺伝子操作細菌。
23. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、酪酸をコ
    ードする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
24. 前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、プロピオ
    ン酸をコードする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
25. ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１から２４のいずれか一
    項に記載の遺伝子操作細菌。
26. ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質がＧａｂＰである、請求項２５に記載の遺伝子操作細菌。
27. １つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求
    項１から２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
28. 前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項２
    ７に記載の遺伝子操作細菌。
29. マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から２８のいずれ
    か一項に記載の遺伝子操作細菌。
30. アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ
    細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィ
    ードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝
    子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコ
    ードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結して
    おり、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、ＧＡＢＡ膜輸送
    タンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
31. 前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導され
    るプロモーターに作動可能に連結している、請求項３０に記載の遺伝子操作細菌。
32. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記ＧＡＢＡ膜輸送
    タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーター
    の別個のコピーである、請求項３１に記載の遺伝子操作細菌。
33. 前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子が、前記低いアルギニンフィードバ
    ック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作
    動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項
    ３１または請求項３２に記載の遺伝子操作細菌。
34. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記ＧＡＢＡ膜輸送
    タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に
    見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項３１から３３のいずれか一項に記
    載の遺伝子操作細菌。
35. ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質がＧａｂＰである、請求項３０から３４のいずれか一項に記
    載の遺伝子操作細菌。
36. １つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求
    項３０から３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
37. 前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項３
    ６に記載の遺伝子操作細菌。
38. マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３０から３７のいずれか一
    項に記載の遺伝子操作細菌。
39. 消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項３
    ０から３８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
40. 前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項３９に記載の遺伝子操作細菌。
41. 前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項３９に記載の遺伝子操作
    細菌。
42. アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ
    細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィ
    ードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝
    子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコ
    ードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結して
    おり、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、１つまたは複数
    のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
43. 前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子が、外因
    性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項４２に記載
    の遺伝子操作細菌。
44. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記１つまたは複数
    のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモー
    ターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項４３に記載の遺伝子操作細菌。
45. 前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子が、前記
    低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテター
    ゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可
    能に連結している、請求項４３または請求項４４に記載の遺伝子操作細菌。
46. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記１つまたは複数
    のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモー
    ターが、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項４２か
    ら４５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
47. 前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項４
    ２から４６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
48. ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項４２から４７のいずれか
    一項に記載の遺伝子操作細菌。
49. マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項４２から４８のいずれか一
    項に記載の遺伝子操作細菌。
50. 消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項４
    ２から４９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
51. 前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項５０に記載の遺伝子操作細菌。
52. 前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項５０に記載の遺伝子操作
    細菌。
53. アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ
    細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィ
    ードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝
    子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコ
    ードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結して
    おり、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、マンガン輸送タ
    ンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
54. 前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導される
    プロモーターに作動可能に連結している、請求項５３に記載の遺伝子操作細菌。
55. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記マンガン輸送タ
    ンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーターの
    別個のコピーである、請求項５４に記載の遺伝子操作細菌。
56. 前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子が、前記低いアルギニンフィードバッ
    ク阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動
    可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項５
    ４または請求項５５に記載の遺伝子操作細菌。
57. 前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シン
    テターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記マンガン輸送タ
    ンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に見
    いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項５３から５６のいずれか一項に記載
    の遺伝子操作細菌。
58. ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項５３から５７のいずれか
    一項に記載の遺伝子操作細菌。
59. １つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求
    項５３から５８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
60. 消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項５
    ３から５９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
61. 前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項６０に記載の遺伝子操作細菌。
62. 前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項６０に記載の遺伝子操作
    細菌。
63. 非病原性細菌である、請求項１から６２のいずれか一項に記載の細菌。
64. プロバイオティク細菌である、請求項６３に記載の細菌。
65. バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、大腸菌、乳酸桿菌
    属および乳酸球菌属からなる群から選択される、請求項６４に記載の細菌。
66. 大腸菌ニッスルである、請求項６５に記載の細菌。
67. 細菌が、哺乳動物消化管内に存在する場合、補足される遺伝子における栄養要求体であ
    る、請求項１から６６のいずれか一項に記載の細菌。
68. 哺乳動物消化管がヒト消化管である、請求項６７に記載の細菌。
69. ジアミノピメリン酸またはチミン生合成経路における酵素における栄養要求体である、
    請求項６７または６８に記載の細菌。
70. 細菌に対して有毒な物質をコードする追加の遺伝子を有するようにさらに操作され、前
    記追加の遺伝子が、哺乳動物消化管に天然で存在しない環境因子により直接的または間接
    的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項１から６９のいずれか一項に記載の
    細菌。
71. 請求項１から７０のいずれか一項に記載の細菌および薬学的に許容される担体を含む薬
    学的に許容される組成物。
72. 経口投与用に製剤化された、請求項７１に記載の組成物。
73. 高アンモニア血症を低減するまたは高アンモニア血症に関連する疾患を治療する方法で
    あって、それを必要とする対象に、請求項７１または請求項７２に記載の組成物を投与す
    るステップを含む方法。
74. 高アンモニア血症が尿素回路異常症である、請求項７３に記載の方法。
75. 尿素回路異常症が、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン
    酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症
    またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である、請求項７４に記載の方法。
76. 高アンモニア血症に関連する障害が、肝臓障害；有機酸障害；イソ吉草酸尿症；３−メ
    チルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸尿症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損
    ；カルニチン回路欠損症；カルニチン欠損症；β−酸化欠損症；リシン尿性タンパク不耐
    症；ピロリン−５−カルボン酸シンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症
    ；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン症−
    高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法
    ；完全腸管外栄養；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体静脈
    短絡；尿路感染症；尿管拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染；神経因性膀胱；または腸
    内細菌過剰増殖である、請求項７３に記載の方法。
77. 肝臓障害が、肝性脳症、急性肝不全または慢性肝不全である、請求項７６に記載の方法
    。
78. 高アンモニア血症に関連する障害の症状が、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精
    神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシスおよび低体温症
    からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。

Images