JP2021046402A

JP2021046402A - インテグリン標的タンパク質およびその使用方法

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Publication number: JP2021046402A
Application number: JP2020184439A
Authority: JP
Inventors: リュー，ジー‐レン; Zhi-Ren Liu; トゥラガ，チャクラ・ラヴィ; Ravi Turaga Chakra; ヤン，ジェニー; Yang Jenny
Original assignee: Georgia State University Research Foundation Inc; Proda Biotech LLC
Current assignee: Georgia State University Research Foundation Inc; Proda Biotech LLC
Priority date: 2015-03-06
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2021-03-25
Also published as: CA2978597A1; CN107709354B; JP2023052154A; AU2020280987A1; WO2016144815A1; CN107709354A; EP3265482A4; EP3265482A1; AU2016230009A1; RU2017135220A3; US20180044403A1; RU2017135220A; JP6789961B2; JP2018510861A

Abstract

【課題】対象の傷害または損傷組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の過度の蓄積を防ぐか、または減らすための医薬組成物を提供する。【解決手段】αｖβ３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、野生型細胞接着性タンパク質のドメイン１（Ｄ１−ＣＤ２）のバリアントを含み、前記バリアントが、Ｄ９９Ｎ、Ｉ１０２Ｖ、Ｑ１０３Ｉ、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ８Ｔ、Ｔ９Ｖ、Ｗ１０Ｑ、Ｇ１１Ｍ、およびＡ１２Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、医薬組成物である。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願］
本願は、２０１５年３月６日に出願された、米国仮特許出願第６２／１２９，４９９号
に対する利益を主張し、その全体が、参照により本明細書の一部をなすものとする。

［政府の利益］
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＣＡ１７５１２２に基づく政府の支
援により作製された。本政府は、本発明において一定の権利を有する。

［発明の分野］
本願は、線維症に関連する医学的症状の治療に有効であり得る化合物またはタンパク質
に関する。本開示は、概して、α_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドに
関する。本開示はさらに、血管形成、細胞増殖、および線維症を減らすための、および、
がん、門脈圧亢進症、ならびに線維症関連の疾患および症状を治療するためのポリペプチ
ドの使用方法に関する。

典型的には、固形腫瘍は、それら自体の血液供給を構築しなければ、直径３〜４ｍｍを
超えて増殖することができない。したがって、腫瘍血管の構築は、がんの転移に必須であ
る。

固形腫瘍の血管形成を抑制するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）等の抗血管形成薬剤が製造
されている。しかしながら、臨床研究では、これらの抗血管形成薬剤による患者の生存の
利益は有意なものでないと指摘されている。さらに、抗血管形成薬剤の開発は、主に、内
皮細胞増殖および転移の促進に役割を果たす、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達または
他のＲＴＫ経路を遮断する戦略に重点が置かれている。

インテグリンは、ヘテロ二量体の、すなわち、異なるαおよびβサブユニットの組み合
わせの細胞表面受容体である。インテグリンは、細胞外マトリクス（「ＥＣＭ」）への細
胞接着において重要な役割を果たすのみならず、多くの生物学的な合図に応答した細胞活
性化を可能にするインサイドアウトおよびアウトサイドインの双方向シグナル伝達分子と
して機能する。α_ｖβ_３インテグリンは、血管形成内皮細胞内で特殊な発現パターンおよ
び機能性を有する。それにもかかわらず、治療法の開発における最新の大部分の試みは、
インテグリンのリガンド結合に重点を置いている。標的部位（複数でもよい）および作用
機構（複数でもよい）における制約が、これらの治療の薬剤開発の成功を妨げている。

本開示は、インテグリンのリガンド結合を標的とすることなく、特に、ＶＥＧＦ／ＶＥ
ＧＦＲまたは任意の他のＲＴＫ経路を標的とすることなく、細胞の血管形成を抑制するタ
ンパク質を提供している。本開示の一態様は、α_ｖβ_３インテグリンの新規部位に結合す
る抗血管形成タンパク質に関し、タンパク質は、Ｄ１−ＣＤ２のバリアントを含む。

本開示の別の態様は、α_ｖβ_３インテグリンの新規部位に結合する抗血管形成タンパク
質を投与する方法に関する。本方法は、治療的に有効な量の抗血管形成タンパク質を投与
することを含み、抗血管形成タンパク質は、Ｄ１−ＣＤ２のバリアントを含む。

さらなる態様に従って、本特許発明は、線維症を減らすもしくは防ぐ必要がある対象、
または線維症の危険にさらされている対象内の、線維症を減らすまたは防ぐ方法を対象と
しており、本方法は、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ループの領域に
おけるβＡドメインでα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する単離されたポリペプチド
を投与することを含む。

さらなる態様に従って、本特許発明は、インテグリンに特異的に結合するポリペプチド
、および、線維症を減らすもしくは防ぐ必要がある対象または線維症の危険にさらされて
いる対象内の、線維症を減らすまたは防ぐ方法を対象とし、本方法は、α２ヘリックス、
Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ループの領域におけるβＡドメインでα_ｖβ_３インテグ
リンに特異的に結合する単離されたポリペプチドを対象に投与することを含む。

本明細書に開示されているように、いくつかの実施形態では、ａ_ｖβ_３インテグリンに
特異的に結合するポリペプチドは、野生型の細胞接着性タンパク質のドメイン１（Ｄ１−
ＣＤ２）の配列と少なくとも約７５％類似するアミノ酸配列を有するＤ１−ＣＤ２のバリ
アントを含み、ポリペプチドは、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ルー
プの領域におけるβＡドメインでα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する。いくつかの
実施形態では、タンパク質間の解離定数は、約１μＭ未満である。いくつかの実施形態で
は、親水性値を有するバリアントに対するアミノ酸置換は、野生型Ｄ１−ＣＤ２の元のア
ミノ酸の約−２〜約＋２の範囲である。

さらに、いくつかの実施形態では、バリアントが、（元の残基：置換）：（Ａｌａ：Ｇ
ｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｉｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ
、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｉｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、
（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｉｎ）、（Ｈｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｈｅ、Ｖａｌ）、
（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓ
ｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｈｅ、Ｌ
ｅｕ）からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを開示する。
いくつかの実施形態では、バリアントは、Ｌ９４Ｎ、Ｅ９５Ｄ、Ｋ９６Ｖ、Ｉ９７Ｃ、Ｆ
９８Ｎ、Ｄ９９Ｆ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０１Ｓ、およびＩ１０２Ｒからなる群から選択され
た少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、バリアントは、Ｌ９
４Ｎ、Ｅ９５Ｄ、Ｋ９６Ｖ、Ｉ９７Ｃ、Ｆ９８Ｎ、Ｄ９９Ｆ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０１Ｓ、
およびＩ１０２Ｒの置換を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、
Ｉ９７Ｙ、Ｆ９８Ｄ、およびＤ９９Ｙからなる群から選択された少なくとも１つの置換を
含む。ある特定の実施形態では、Ｉ９７Ｙ、Ｆ９８Ｄ、およびＤ９９Ｙの置換を有する配
列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、Ｄ９９Ｎ、Ｉ１０２Ｖ、Ｑ１０３Ｉ
、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ８Ｔ、Ｔ９Ｖ、Ｗ１０Ｑ、Ｇ１１Ｍ、Ａ１２Ｋからなる群から選択され
た少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、バリアントは、Ｄ９９Ｎ、Ｉ
１０２Ｖ、Ｑ１０３Ｉ、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ８Ｔ、Ｔ９Ｖ、Ｗ１０Ｑ、Ｇ１１Ｍ、Ａ１２Ｋの
置換を有する配列を含む。

さらにまた、いくつかの実施形態では、バリアントは、ａ_ｖβ_３インテグリンとの少な
くとも１つの分子間相互作用を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、βＡ溝
でα_ｖβ_３インテグリンに結合する。ある特定の実施形態では、バリアントは、ＴＥＭＫ
ＱＥＲにおいてα_ｖインテグリンに架橋される。ある特定の実施形態では、バリアントは
、ＦＮＥＥＶＫＫＱにおいてβ_３インテグリンに架橋される。また、他の特定の実施形態
では、バリアントは、ＦＮＥＥＶＫＫＱにおいてβ_３インテグリンに架橋される。いくつ
かの実施形態では、バリアントは、ＰＥＧ化されている。いくつかの実施形態では、バリ
アントは、ポリエチレングリコールによりＰＥＧ化されている。一実施形態では、ポリエ
チレングリコールは、ＰＥＧ−２０ｋＤａである。

現在開示されている主題事項の別の態様では、医薬組成物が提供されている。本組成物
は、上に開示されているような治療的に有効な量のポリペプチドを含む。いくつかの実施
形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

また、本開示の別の態様では、アポトーシスと関連する疾患を有する、またはこれを有
する危険にさらされている対象内のアポトーシスを誘導する方法が提供されている。本方
法は、上に開示されているような治療的に有効な量の医薬組成物を投与することを含む。

さらにまた、現在開示されている主題事項の別の態様は、対象の傷害または損傷組織に
おける細胞外マトリクス内の線維性物質の過度の蓄積を防ぐか、または減らす方法を提供
する。本方法は、傷害または損傷組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の蓄積を
防ぐまたは減らす必要がある対象を特定するステップと、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ
、およびα２−α３ループの領域におけるβＡドメインでα_ｖβ_３インテグリンに特異的
に結合する、本明細書に記載されているような単離されたポリペプチドを対象に投与する
ステップとを含み、それによって対象の組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の
過度の蓄積を防ぐか、または減らす。いくつかの実施形態では、対象は、肝線維症、膵線
維症、乳腺線維症、または他の種類の線維症の症状のうちの少なくとも１つを有する。

いくつかの実施形態では、線維症の疾患を有する対象またはその危険にさらされている
対象内の線維症の疾患を治療するための方法が提供されている。本方法は、本明細書で論
じられているような治療的に有効な量の医薬組成物を投与するステップを含む。線維症の
疾患の非制限的な例には、肝線維症および膵線維症が含まれる。

いくつかの実施形態では、本開示は、対象内の腫瘍を予防かつ治療する方法を提供して
いる。本方法は、本明細書に開示されているような治療的に有効な量の医薬組成物を投与
することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているような医薬組成物は、局所的な塗
布、注射、経口投与、または持続放出投薬のために好適である。

現在開示されている主題事項のいくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。い
くつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

さらにまた、いくつかの実施形態では、本開示は、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、お
よびα２−α３ループの領域におけるβＡドメインでα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結
合する単離されたポリペプチドを提供している。いくつかの実施形態では、特異的な結合
のＫ_Ｄは、約１μＭ未満である。他の実施形態では、特異的な結合のＫ_Ｄは、１０^−８〜
１０^−９Ｍである。

［定義］
「血管形成」は、組織灌流に有効な新規の血管系の形成として定義される。これは、既
存の血管からの内皮細胞の発芽による新規血管の形成、または組織の血液灌流を改善する
ために大きさ、熟成方向、または流動特性を変更するための既存の血管の再構築を含む。

「対象」、「個人」、「患者」、および「宿主」という用語は、本明細書でほとんど同
じ意味で使用されており、具体的には、任意の哺乳動物等の任意の脊椎動物を指し、最も
具体的には、ヒト対象、家畜、および哺乳動物のペットを含む。対象は、必ずしも必要で
はないが、医師または獣医師等の健康管理の専門家の管理下にある場合があり、かつ本開
示の組成物による治療処置を必要とし得る。

「線維性の」疾患、障害、または症状という用語は、本明細書で述べられているものを
含み、急性および慢性、線維形成関連の生物学および病理学が明白である臨床的または無
症状の所見をさらに含む。線維性の疾患、障害、または症状は、細胞外マトリクス内の線
維性物質の過度の生成、または、マトリクス関連の成分の、異常な、非機能的な、および
／もしくは過度の蓄積による正常な組織要素の置換を含む、線維性物質の過度の生成によ
って全体的または部分的に特徴付けられる疾患、障害、または症状を含む。線維性の疾患
、障害、または症状は、例えば、線維症によって特徴付けられる線維形成関連の生物学ま
たは病理学を含む。

本明細書で使用される場合、「治療的に有効な量」という用語は、治療される疾患、障
害、または症状の症候のうちの１つ以上を治療し、または少なくとも部分的に進行を止め
、もしくはある程度緩和するのに十分な疾患、症状、または障害をすでに罹患している患
者に投与された、修飾された非天然のアミノ酸ポリペプチドを含有する組成物の量を指す
。かかる組成物の有効性は、限定されないが、疾患、障害、または症状の重症度および進
行度、過去の治療、患者の健康状態および薬剤への反応、ならびに治療する医師の判断を
含む、症状に依存する。例示のみの方法によって、治療的に有効な量は、限定されないが
、用量漸増の臨床試験を含むルーチン実験によって判定され得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、外因性の遺伝子を宿主細胞へ
と安定して運搬することができる媒体として機能するＤＮＡ分子を意味する。有効な適用
のために、ベクターは、複製可能であり、それ自体を宿主細胞へと導入するためのシステ
ムを有し、かつ選択可能なマーカーを保持するべきである。

「アミノ酸」という用語は、天然および非天然のアミノ酸、ならびに天然に存在するア
ミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。自然にコ
ード化されたアミノ酸は、２０個の共通のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、
イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、
スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）およびピロリジンならびにセレ
ノシステインである。アミノ酸アナログは、例示のみの方法によって、水素、カルボキシ
ル基、アミノ基、およびＲ基に結合されたアルファ炭素等の、天然に存在するアミノ酸と
同じ基本的な化学構造を有する化合物を指す。かかるアナログは、修飾されたＲ基（例示
の方法によって、ノルロイシン）を有する場合があり、または天然に存在するアミノ酸と
同じ基本的な化学構造をまだ保持しながら、修飾されたペプチド骨格を有し得る。アミノ
酸アナログの非制限的な例には、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキサイ
ド、およびメチオニンメチルスルホニウムが含まれる。

本明細書で使用される場合、「有効な量」という用語は、治療される疾患または症状の
症候のうちの１つ以上をある程度緩和するのに十分な量の、投与される薬剤または化合物
を指す。結果は、兆候、症候、または疾患の原因の減少および／または緩和、もしくは生
物系の任意の他の所望の変化であり得る。例示の方法によって、投与される薬剤または化
合物には、限定されないが、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、
修飾された天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾された非アミノ酸ポリペプチドが含ま
れる。かかる天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された天然
アミノ酸ポリペプチド、または修飾された非天然のアミノ酸ポリペプチドを含有する組成
物が、予防、増強、および／または治療処置のために投与され得る。任意の個々の事例に
おける好適な「有効な」量は、用量漸増研究等の技術を用いて判定され得る。

本明細書で使用される場合、「細胞または細胞の集団」という用語は、組織から切除さ
れ、または組織培養技術によってインビトロで増殖された、単離された細胞または複数の
細胞を指す。最も具体的には、細胞の集団は、動物またはヒトの組織内のインビボでの細
胞を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞または細胞の集団に接触する」という用語は、本開
示に従ったペプチドまたはプローブを、単離または培養された細胞もしくは細胞の集団に
送達すること、または好適な薬学的に許容可能な担体におけるプローブを動物またはヒト
の標的組織に投与することを指す。投与とは、限定されないが、静脈内送達、腹腔内送達
、筋肉内送達、皮下、または当該技術分野で知られている任意の他の方法によるものであ
り得る。有効な一方法は、膵臓等の標的器官または組織へと直接導く血管へと直接送達し
、それによって一般的な循環系におけるプローブの希釈を低減することである。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、本開示のヘテ
ロ二量体プローブが投与され、かつ連邦または州政府の規制機関によって許可され、もし
くは米国薬局方、またはより具体的にはヒト等の動物において使用される他の一般に認識
されている薬局方に列挙された、希釈液、補助剤、賦形剤、または媒体を指す。かかる薬
学的な担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の石油、動物、野菜、または合成起源
の水および油を含む、水および油等の液体であり得る。薬学的な担体は、生理食塩水、ア
カシアガム、ゼラチン、澱粉糊、タルク、角質、コロイダルシリカ、尿素等であり得る。
患者に投与されたとき、ヘテロ二量体性プローブおよび薬学的に許容可能な担体は、無菌
であり得る。水は、ヘテロ二量体性プローブが静脈内投与されたきに有効な担体である。
生理食塩水および水性ブドウ糖ならびにグリセリン溶液がまた、特に注射液に対する液体
の担体として用いられ得る。好適な薬学的な担体にはまた、グルコース、ラクトース、ス
クロース、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノール等の賦形剤が含まれる。本発明の組成物はまた、所望され
る場合、少量の湿潤剤または乳化剤、もしくはｐＨ緩衝剤を含有し得る。本発明の組成物
は、有益なことに、溶液、乳剤、持続放出製剤、または任意の他の使用に好適な形態を取
り得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基
の重合体を指すように、本明細書でほとんど同じ意味で使用される。

「バリアント」という用語は、基準のペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、
本質的な特性を保持するペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ペプチドの典型的なバ
リアントは、アミノ酸配列において別の基準のペプチドとは異なる。一般に、その差異は
、基準のペプチドおよびバリアントの配列が、全体的に非常に類似しており、かつ多くの
領域において同一であるように限定されている。バリアントおよび基準のペプチドは、１
つ以上の改変（例えば、置換、追加、および／または削除）によってアミノ酸配列におい
て異なり得る。ペプチドのバリアントは、元の配列の保存的に修飾されたバリアント（例
えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、および約９９％
の保存的バリアント）を含む。置換され、または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝情報に
よってコードされたものであり得、またはそうでない場合がある。ペプチドのバリアント
は、対立遺伝子バリアント等の天然に存在するものであり得、または天然に存在するとは
知られていないバリアントである場合がある。

本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、検出することが所望されるペプチ
ド、組織、腫瘍等を指す。標的ペプチドは、細胞の表面上にある場合があり、本細胞は、
動物の宿主、培養された細胞、または動物の組織内の細胞もしくは細胞の集団から単離さ
れている。

本開示は、天然に存在するペプチドの配列から由来可能なペプチドを含む。ペプチドは
、天然に存在する配列を断片化することによって得られることができる場合、または天然
に存在するアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列
の知識に基づいて合成されることができる場合、「天然に存在するアミノ酸配列から由来
可能な」ものであると言われている。ペプチドの「誘導体」であると言われているこうし
た分子が、本開示の範囲内に含まれる。かかる「誘導体」または「バリアント」は、ペプ
チドまたはペプチドの同様にサイズ決めされた断片と実質的な類似性を共有し、かつペプ
チドと同じ生物活性により機能することができる。

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「特異的な結合」という用語
は、結合タンパク質の所定のタンパク質（例えば、インテグリン）への結合を指す。結合
の親和力は、解離定数（Ｋ_Ｄ）に鑑みて定義される。結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが約１０⁻
^８Ｍ以下、約１０^−９Ｍ以下、約１０^−１０Ｍ以下、約１０^−１１Ｍ以下、約１０^−１２
Ｍ以下、またはさらにこれ未満等、約１０^−７Ｍ未満であるときに、タンパク質に特異的
に結合し、少なくとも１００倍未満、例えば、少なくとも１，０００倍未満、少なくとも
１０，０００倍未満等、非特異的抗原（ＢＳＡ等）に結合するためのその親和力の少なく
とも１０倍未満であるＫ_Ｄと対応する親和力を有して所定のタンパク質に結合する。本明
細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」または「Ｋ_ｄ」という用語は、当該技術分野で知られて
いるような特異的なタンパク質間の結合相互作用の解離定数を指す。

本開示の誘導体は、天然に存在するペプチドの配列と実質的に類似する配列を含有する
ことに加えて、それらのアミノおよび／またはそれらのカルボキシ末端に１つ以上の追加
のアミノ酸を含有し得る断片を含む。同様に、本開示は、天然に存在するペプチドの配列
と実質的に類似する配列を含有するが、ペプチド上に自然に見られるそれらのアミノおよ
び／またはそれらのカルボキシ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を欠いている場合がある
ペプチド断片を含む。

本明細書で使用される場合、「予防的に有効な量」という用語は、治療される疾患、症
状、または障害の症候のうちの１つ以上をある程度緩和する、患者に予防的に適用される
少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチドまたは少なくとも１つの修飾された非天然
アミノ酸ポリペプチドを含有するある量の組成物を指す。かかる予防的な適用では、かか
る量は、患者の健康状態、体重等に依存し得る。限定されないが、用量漸増の臨床試験を
含むルーチン実験によって、かかる予防的に有効な量を判定することは、当該技術分野内
でよく考慮されている。

２つの核酸またはポリペプチドの文脈における「実質的に類似する」という語句は、例
えば下に記載されているようなもの等の配列比較アルゴリズムを用いて測定されるような
、または視覚検査による、最大の対応に対して比較され、かつ整列されたとき、少なくと
も７５％、好ましくは、少なくとも８５％）、より好ましくは、少なくとも９０％、９５
％以上、またはその間の任意の整数値のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の同一性を有
する、２つ以上の配列または部分配列を指す。好ましくは、少なくとも約１０、好ましく
は約２０、より好ましくは約４０〜６０の長さの残基またはその間の任意の整数値である
配列のある領域にわたって、好ましくは６０〜８０の残基より長い領域、より好ましくは
少なくとも約９０〜１００の残基にわたって、実質的な同一性が存在し、最も好ましくは
、本配列は、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域等、比較される配列の全長にわたっ
て実質的に同一である。

本明細書で使用される場合、「相乗的な」という用語は、任意の２つ以上の単一薬剤の
相加的な効果より有効である、予防的または治療的に有効な薬剤の組み合わせを指す。予
防的または治療的薬剤の組み合わせの相乗的な効果は、薬剤のうちの１つ以上のより低い
用量の使用、および／または特定の疾患もしくは症状を有する対象への薬剤のより頻度の
低い投与を可能にし得る。いくつかの事例では、予防的または治療的薬剤の組み合わせの
相乗的な効果を用いて、任意の単一の治療の使用と関連する有害な副作用または望ましく
ない副作用を回避するか、または低減し得る。

本明細書で使用される場合、「治療的に有効な量」という用語は、治療される疾患、障
害、または症状の症候のうちの１つ以上を治療し、または少なくとも部分的に進行を止め
、もしくはある程度緩和するのに十分な疾患、症状、または障害をすでに罹患している患
者に投与される、少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチドおよび／または少なくと
も１つの修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物の量を指す。かかる組
成物の有効性は、限定されないが、疾患、障害、または症状の重症度および進行度、過去
の治療、患者の健康状態および薬剤への反応、ならびに治療する医師の判断を含む症状に
依存する。例示のみの方法によって、治療的に有効な量は、限定されないが、用量漸増の
臨床試験を含むルーチン実験によって判定され得る。

別段の定めがない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（
例えば、縮重したコドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示されている配列を
黙示的に包含する。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３
の位置が、混合基および／またはデオキシイノシン残基と置換される配列を生成すること
によって、縮重したコドン置換が達成され得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、
ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドとほとんど同じ意味で使用され
る。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、医薬組成物の投与の標的を指す。
本明細書で開示されている方法の対象は、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類
等の脊椎動物であり得る。したがって、本明細書で開示されている方法の対象は、ヒトま
たは非ヒトであり得る。したがって、現在開示されている主題事項に従って、獣医学的な
治療目的の使用が提供されている。このように、現在開示されている主題事項は、ヒトお
よび非ヒト霊長類等の哺乳動物、ならびにシベリアトラ等の絶滅の危機に瀕していること
に起因して重要な、ヒトによって消費されるために農場で生育された動物等の経済的に重
要な、かつ／またはペットとして買われている動物または動物園の動物等のヒトにとって
社会的に重要な、これらの哺乳動物に対する投与を提供している。かかる動物の例には、
限定されないが、ネコおよびイヌ等の肉食動物、ブタ、家畜のブタ、およびイノシシを含
むブタ、畜牛、雄牛、羊、キリン、鹿、ヤギ、バイソン、およびラクダ、ウサギ、モルモ
ット、およびネズミ等の反芻動物および／または有蹄動物が含まれる。絶滅の危機に瀕し
ている、かつ／または動物園で飼育されているこれらの種類の鳥類、ならびに家禽、より
具体的には家畜化された家禽、すなわちヒトにとって経済的に重要でもある、七面鳥、ニ
ワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウの治療を含む、鳥類の治療がまた、提供され
ている。したがって、限定されないが、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、馬（競
馬を含む）、家禽等を含む家畜の治療がまた、提供されている。本用語は、特定の年齢ま
たは性別を示すものではない。

本開示はまた、かかるバリアントが上に記載されている誘導体の活性と実質的に同一の
活性を有するという条件で、わずかなアミノ酸置換を有する（したがって、天然の配列の
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する）、上に記載されている断片の明確なまた
は自明のバリアントを包含する。明確なまたは自明の置換の例には、１つの基本的な残基
の別の残基に対する置換（すなわち、Ｌｙｓに対するＡｒｇ）、１つの疎水性の残基の別
の残基に対する置換（すなわち、Ｈｅに対するＬｅｕ）、または１つの芳香族の残基の別
の残基に対する置換（すなわち、Ｔｙｒに対するＰｈｅ）等が含まれる。

添付の図を参照して、詳細な説明が記載されている。図では、参照番号の最も左の数字
（複数可）が、その参照番号が最初に現れる図を特定している。異なる図での同じ参照番
号の使用は、同様のまたは同一の品目または特徴を示している。

本開示に従った、βＡ溝へのＤ１−ＣＤ２合体の描画である。本開示に従った、βＡ溝へのＤ１−ＣＤ２合体の描画である。本開示に従った、βＡ溝へのＤ１−ＣＤ２合体の描画である。本開示に従った、βＡ溝へのＤ１−ＣＤ２合体の描画である。本開示に従った、Ｄ１−ＣＤ２バリアントの分子間エネルギーを図示する管状表示である。本開示に従った、Ｄ１−ＣＤ２の構造的特性と類似する構造的特性を有するＰｒｏＡｇｉｏを図示するＨ−ＮＭＲ読み出しを示している。本開示に従った、インテグリンとのＰｒｏＡｇｉｏ相互作用を図示するグラフ表示である。本開示に従った、インテグリンとのＰｒｏＡｇｉｏ相互作用を図示するグラフ表示である。本開示に従った、インテグリンとのＰｒｏＡｇｉｏ相互作用を図示する管状表示である。本開示に従った、ＨＵＶＥＣ細胞のα_ｖβ_３発現を示している。本開示に従った、ＨＵＶＥＣ細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＣＨＯおよびＣＯＳ−７細胞における外因性α_ｖβ_３発現を示している。本開示に従った、α_ｖβ_３発現ＣＨＯおよびＣＯＳ−７細胞のＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレートへの付着を図示するグラフ表示である。本開示に従った、α_ＩＩＢβ_３インテグリン発現ＣＨＯ細胞のＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレートへの付着の欠如を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＨＵＶＥＣ細胞抽出物内のβ_３インテグリンとのＰｒｏＡｇｉｏの免疫共沈降を示している。本開示に従った、ＲＧＤの結合がＨＵＶＥＣ細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を防がないことを図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＲＧＤの結合がＨＵＶＥＣ細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を防がないことの確認を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏのα_ｖインテグリンへの架橋を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏのα_ｖインテグリンへの架橋を示している。本開示に従った、ビス（スルホスクシンイミジル）−グルタル酸を用いたＰｒｏＡｇｉｏの架橋を示している。本開示に従った、グルタルアルデヒドを用いたＰｒｏＡｇｉｏの架橋を示している。本開示に従った、グルタルアルデヒドを用いたＰｒｏＡｇｉｏの架橋を示している。本開示に従った、グルタルアルデヒドを用いたＰｒｏＡｇｉｏの架橋を示している。本開示に従って、β_３インテグリンに対する変異が、変異体を発現する細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を低減したことを示している。本開示に従って、変異が、変異体を発現するＣＨＯ細胞の付着を低減したことを示している。本開示に従って、変異が、変異体を発現するＣＨＯ細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を低減したことを図示するグラフ表示である。本開示に従って、変異が、ＰｒоＡｇｉｏおよびβ_３インテグリンの免疫共沈降を無効にすることを示している。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏにより治療されたＨＵＶＥＣ細胞においてアクチンフィラメントストレスファイバーが低減し、かつ消失したことを示している。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏ治療がＥＣＭへの付着によって活性化されたＦＡＫの不活性化を生じることを示している。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏがＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを誘導することを図示するグラフ表示である。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏが他の抗血管形成薬剤よりアポトーシスの誘導において有効であることを図示するグラフ表示である。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏが、外因性のインテグリンを発現するＨＵＶＥＣおよびＣＯＳ−７細胞のアポトーシスを誘導することを図示するグラフ表示である。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏが、外因性のインテグリンを発現するＨＵＶＥＣおよびＣＯＳ−７細胞のアポトーシスを誘導することを図示するグラフ表示である。本開示に従って、ＰｒｏＡｇｉｏ治療がＨＵＶＥＣ細胞の浮遊／剥離を生じないことを示している。本開示に従った、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ７、およびカスパーゼ３に対するＰｒｏＡｇｉｏ治療の効果を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏに対するカスパーゼ８阻害剤およびカスパーゼ９阻害剤の効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、カスパーゼ８阻害剤およびカスパーゼ９阻害剤の相互活性化における効果を示している。本開示に従った、インテグリンβ_３細胞質ドメインへのカスパーゼ８の補充に対するＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅの効果を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏのＰＥＧ化を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍の増殖抑制に対する効果および用量依存性を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍の増殖抑制に対する効果および用量依存性を図示するグラフ表示である。本開示に従った、腫瘍の増殖の後期に投与されたときのＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、腫瘍の増殖の後期に投与されたときのＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍血管に対する効果を分析するために回収された腫瘍から調製された組織切片についてのＣＤ３１の免疫染色を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍血管に対する効果を図示する管状表示である。本開示に従った、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）と比較した場合のＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）と比較した場合のＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）と比較した場合のＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）と比較した場合のＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍の増殖に対する効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍の増殖に対する効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの組織に対する効果を示している。本開示に従った、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの重量増加または減少に対する効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、線維症のマウス由来の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示している。本開示に従った、線維症のマウス由来の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示している。本開示に従った、線維症のマウス由来の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示す表である。本開示に従った、線維症のマウス由来の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示す表である。本開示に従った、一次的なヒト肝星細胞のアポトーシスに対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、線維症のマウス由来の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示している。本開示に従った、マウスの体重に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を図示するグラフ表示である。本開示に従った、線維症のマウスの肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を図示するグラフ表示である。ＰｒｏＡｇｉｏ濃度の肝線維症に対する効果を図示するグラフ表示である。乳がんの治療としてのＰｒｏＡｇｉｏの結果を示している。ＰｒｏＡｇｉｏが、硬変した間質細胞および線維形成細胞によって形成される、膵臓がん内の線維症を低減かつ予防することを示している。肝臓がんの治療としてのＰｒｏＡｇｉｏの結果を示している。

本開示は、抗血管形成剤または抗線維性薬剤、および血管形成を抑制する方法を提供す
るものであり、哺乳動物内の血管形成または線維症に依存する症状は、ＰｒｏＡｇｉｏと
称される抗血管形成薬剤を、顕著な毒性を示さずに前記症状の退行または進行の停止を生
じるように、治療的に有効な量および頻度で哺乳動物に投与することによって治療される
。血管形成に依存する症状は、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、前立腺がん、卵
巣がん、神経芽細胞腫、中枢神経腫瘍、神経芽細胞腫、多形性膠芽腫または黒色腫を含む
、固形腫瘍新生物を含む新生物からなる群から選択され得る。リストを完全なものにする
ことはできないが、すべてではないとしてもほとんどの固形腫瘍の退行または進行の停止
を供するために抗血管形成薬剤を使用することができる。本治療を受ける哺乳動物は、ヒ
トであり得る。

本開示は、一般に、ａ_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドに関する。
より具体的には、本開示は、野生型の細胞接着性タンパク質のドメイン１（Ｄ１−ＣＤ２
）の配列：
１ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴ
ＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱ
ＤＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲ１０６（配列番号１）
と少なくとも約７５％類似するアミノ酸配列を有するＤ１−ＣＤ２のバリアントに関する
。本開示はさらに、血管形成、細胞増殖、がん、ならびに線維症に関連する疾患および症
状の治療におけるポリペプチドの使用方法に関する。本開示はまた、α２ヘリックス、Ｂ
−Ｃループおよびα２−α３ループの領域中のβＡドメインにおいてα_ｖβ_３インテグリ
ンに特異的に結合する単離されたポリペプチドを含む。かかるポリペプチドの例は、Ｐｒ
ｏＡｇｉｏである。ＰｒｏＡｇｉｏの例示的な配列には、
ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤ
ＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩ
ＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＮＤＶＣＮＦＡＳＲＱＥＲ（配列番号２）
および
ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤ
ＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤ
ＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＹＤＹＬＫＩＱＥＲ（配列番号３）
が含まれる。

本明細書で開示されているように、ＰｒｏＡｇｉｏは、宿主タンパク質および細胞接着
性タンパク質ＣＤ２のドメイン１（「Ｄ１−ＣＤ２」）を含む。ＰｒｏＡｇｉｏは、新規
部位、すなわち、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループおよびα２−α３ループ領域中の溝（「
βＡ溝」）においてαｖβ３インテグリンを標的とする。βＡ溝は、ほとんどすべての他
のβインテグリン内に存在し、βＡドメイン内のＲＧＤ結合部位に比較的近接している。
したがって、ＰｒｏＡｇｉｏがαｖβ３インテグリンのβＡ溝を標的とし得ることが開示
されているが、当業者であれば、ＰｒｏＡｇｉｏを使用して、βＡ溝を含有する任意のβ
インテグリンのβＡ溝を標的とし得ることを理解すべきである。

一実施形態は、対象の傷害または損傷組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の
過度の蓄積を防ぐか、または減らす方法であって、蓄積を防ぐまたは減らすことを必要と
する対象を特定するステップと、野生型の細胞接着性タンパク質のドメイン１（Ｄ１−Ｃ
Ｄ２）の配列と少なくとも約７５％類似するアミノ酸配列を有するＤ１−ＣＤ２のバリア
ントを含む、ａ_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドを対象に投与するス
テップとを含み、ポリペプチドが、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループおよびα２−α３ルー
プの領域におけるβＡドメインにおいてα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する、方法
を含む。請求項２２に記載の方法では、対象は、肝線維症を有する。対象は、膵線維症、
肝線維症、または乳腺線維症を有し得る。

例示的な線維症の疾患、障害および症状には、例えば、強皮症（限局性強皮症、全身性
限局性強皮症、または線形強皮症を含む）、腎線維症（糸球体硬化症、腎尿細管間質性線
維症、進行性腎疾患、または糖尿病性腎症を含む）、心線維症（例えば、心筋線維症）、
肺線維症（例えば、糸球体硬化性肺線維症、特発性肺線維症、珪肺症、石綿症、間質性肺
疾患、間質性線維性肺疾患、および化学療法／放射線誘導性肺線維症）、口腔線維症、心
内膜心筋線維症、三角筋線維症、膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、結節性筋膜炎、好酸
球性筋膜炎、様々な程度で正常な筋肉組織の線維組織との置換によって特徴付けられた一
般的な線維症症候群、後腹膜線維症、肝線維症、肝硬変、慢性腎不全、骨髄線維症（骨髄
線維症）、薬剤誘導性エルゴチン中毒、リ・フラウメニ症候群における膠芽細胞腫、散在
性膠芽細胞腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖症候群、
婦人科がん、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン蓄積大腸炎、および急性線維症が含ま
れる。線維症は、慢性または急性のいずれかであり得る。線維性の症状には、機能不全、
および潜在的に、臓器不全を生じる組織を形成する、組織内の過剰な量の細胞外マトリク
スの蓄積を含む、過剰な量の線維組織が含まれる。

本開示は、腫瘍の増殖を抑制し、かつＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲまたは任意の他のＲＴＫ経
路を標的とすることなく、血管形成内皮細胞アポトーシスの誘導において活性を示す、以
後、ＰｒｏＡｇｉｏと称される、非毒性タンパク質を含む。

単一の理論に縛られるものではないが、ＰｒｏＡｇｉｏが、β_３の細胞質ドメインでカ
スパーゼ８を補充しかつ活性化することによって、高効率でα_ｖβ_３インテグリン発現細
胞のアポトーシスを特異的に誘導するものと考えられる。がん関連膵星細胞（ＣＡＰａＳ
Ｃ）および血管形成内皮細胞の両方が高レベルのα_ｖβ_３インテグリンを発現するため、
ＰｒｏＡｇｉｏは、ＣＡＰａＳＣを枯渇させ、腫瘍または他の組織内およびその周りの新
規の血管を除去する可能性がある。

ＰｒｏＡｇｉｏは、リガンド結合により、またはリガンド結合なしに、アポトーシスを
誘導し、かつ、ＰｒｏＡｇｉｏ結合はＲＧＤ結合を妨げないことから、ＰｒｏＡｇｉｏの
効果がリガンド結合から独立していることを示唆している。ＰｒｏＡｇｉｏは、アノイキ
スとは異なる機構によりα_ｖβ_３インテグリン介した細胞アポトーシスを誘導する。した
がって、ＰｒｏＡｇｉｏは、強いインテグリン−リガンド間の相互作用と必ずしも競合す
る必要はなく、複数対のインテグリンと複数種類のＥＣＭとの間の相互作用を含む血管形
成内皮細胞−ＥＣＭ接着に起因して生じないこともあるアノイキスを誘導する必要はない
。

一実施形態は、活性化された肝星細胞および膵星細胞ならびに筋線維芽細胞のアポトー
シスを誘導することができるタンパク質を含み、これらのタンパク質は、肝臓および他の
器官における細胞外マトリクスの主な源であると考えられる。星細胞および筋線維芽細胞
は、肝臓および他の器官内に存在する様々な増殖因子およびサイトカインと反応し、その
うちのいくつかはまた、肝線維症を生じる。星細胞のアポトーシス誘導、マトリクス分解
の促進、または星細胞アポトーシスの促進が、肝線維症を低減する。肝臓で活性化された
肝星細胞において、脱分化された類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）は、高レベルのα_ｖβ_３イン
テグリンを有する。ＰｒｏＡｇｉｏの脱分化されたＬＳＥＣを死滅させる効果が、門脈圧
亢進症を低減する。

本開示のペプチドの構造において、改変および変更が行われる可能性があり、またペプ
チドと類似する特徴（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する分子を得ることができる。
例えば、一定のアミノ酸は、活性の著しい喪失なく、ある配列の他のアミノ酸に対して置
換され得る。それはペプチドの生物学的な機能活性を定義するペプチドの相互作用的な能
力および性質であるため、一定のアミノ酸配列の置換が、ペプチド配列において行われる
可能性があり、それにも関わらず、同様の特性を有するペプチドを得ることができる。

図１Ａ〜１９は、βＡ溝に結合するＰｒｏＡｇｉｏの設計を示している。本明細書に記
載されているＰｒｏＡｇｉｏはα_ｖβ_３インテグリンのβＡ溝に結合することができるが
、当業者であれば、上に記載されているようなβＡ溝を含有する任意のインテグリンに結
合し得ることを理解すべきである。

本薬剤は、アポトーシスおよび線維症を抑制するかまたは制御することによって、血管
形成を抑制または予防するものと思われる。開発されたポリペプチドは、インビトロ分析
において、上皮細胞および線維芽細胞に対して影響せずに、内皮細胞アポトーシスの誘導
において強い活性を証明した。加えて、開発されたポリペプチドは、すでに存在する正常
な血管に対する毒性を発揮しなかった。生存因子は、血管内皮細胞の増殖因子またはマイ
トジェン、ならびに直接的な増殖刺激効果を有するようには思われないが、細胞が損傷か
ら回復することを可能にするこれらの因子を含む。

これらの薬剤は、抗血管形成および抗線維性薬剤を投与するステップを含む、血管形成
を抑制することによって哺乳動物を治療する方法へと組み込まれ得る。一定の実施形態で
は、抗血管形成または抗線維性ポリペプチドは、小分子および短鎖ペプチド薬剤と比較し
て、循環時間の延長を示した。

ある特定の実施形態は、血管形成または線維症を抑制する方法、および血管形成関連ま
たは線維性の疾患を治療する方法を提供している。他の実施形態では、本発明は、腫瘍の
増殖を抑制するか、または低減する方法、およびがんを罹患している個人を治療する方法
を提供している。これらの方法は、上に記載されているような治療的に有効な量の１つ以
上のポリペプチド治療薬剤を個人に投与することを含む。これらの方法は、動物、より具
体的には、ヒトの治療的かつ予防的処置を特に目的としている。

本明細書に記載されているように、血管形成関連または線維性の疾患には、以下に限定
されないが、例えば、固形腫瘍、白血病等の血管感染性腫瘍、および腫瘍転移を含む血管
形成依存性がん、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、およ
び化膿性肉芽腫、免疫性および非免疫性炎症等の炎症性疾患、慢性関節リウマチおよび乾
癬、毛の血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植
拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス、オスラーウェーバー症
候群、心筋血管形成、プラークの新血管形成、毛細血管拡張症、血友病関節症、血管線維
腫、および創部の肉芽形成ならびに創傷治癒、毛細血管拡張症乾癬強皮症、化膿性肉芽腫
、冠側副血行、虚血肢血管形成、角膜疾患、ルベオーシス、関節炎、糖尿病の新血管形成
、骨折、脈管形成、造血を含む、血管形成依存性がんが含まれる。

抗血管形成剤または抗線維性薬剤と化学療法薬剤との組み合わせの潜在的な利点の一つ
は、低減された用量の化学療法薬剤による血管形成依存性症状の治療および制御の改善で
あり得る。本組み合わせは、持続的な期間投与され得、または任意に、より短い持続時間
の治療が、本組み合わせの有効性の増加に起因して施され得る。

組み合わせ治療の性質に応じて、本発明のポリペプチド治療薬剤の投与が継続され得る
と同時に、他の治療薬が投与され、かつ／またはその後も投与される。ポリペプチド治療
薬剤の投与は、単一用量で、または複数用量で行われ得る。いくつかの例では、ポリペプ
チド治療薬剤の投与は、従来型の治療の少なくとも数日前に開始され、他の例では、従来
型の治療の投与の直前またはそれと同時に、投与が開始される。

インシリコおよびインサイチュでの分析は、α_ｖβ_３インテグリンを結合することがで
きるタンパク質を示している。注目すべきことに、β_３のβＡは、リガンド結合およびイ
ンテグリンのシグナル伝達に影響を与える。ヒトおよびラットの両方に由来するＤ１−Ｃ
Ｄ２は、α_ｖβ_３インテグリンの既知の結合部位に対して、むしろ弱い親和力を示す。Ｄ
１−ＣＤ２は、新規部位、すなわち、様々な配向でのβＡ溝を含むβＡドメインのいくつ
かの部位と合体する（図１Ａ〜１Ｄに示されている）。しかしながら、βＡ溝の残基との
強い接触の欠如に起因して、Ｄ１−ＣＤ２のβＡ溝への合体は、βＡ溝内の対応する残基
とより良く合致するように、接触位置でのＤ１−ＣＤ２の残基を変異させることによって
改善された。先に述べられた変異による潜在的な構造的妨害を無効にし、かつ野生型βシ
ートパッキングを維持するために、さらなる変異がＤ１−ＣＤ２へと導入された。インテ
グリン上でのこれらのＤ１−ＣＤ２バリアントの合体によって表されたエネルギーは、変
異前のＤ１−ＣＤ２と比較して、実質的に増加された（図２に示されている）。さらに、
結合エネルギーは、インテグリンにおける対応する残基が変異されたときに有意に低下し
、それによって設計された接触を妨げた。

Ｄ１−ＣＤ２バリアントは、大腸菌において発現され、その後、精製された。ＰｒｏＡ
ｇｉｏは、Ｈ−ＮＭＲ（図３に示されている）、遠紫外線ＣＤ、および蛍光スペクトル分
析によって証明されているように、潜在的なＤ１−ＣＤ２タンパク質の構造的特性と類似
する構造的特性を示した。これは、ＰｒｏＡｇｉｏが有効に折り畳まれていることを示し
ている。さらに、ＢＩＡＣＯＲＥ結合分析は、ＰｒｏＡｇｉｏがα_ｖβ_３インテグリンと
高い親和力により相互作用することを証明している。ＰｒｏＡｇｉｏはまた、他の２対の
インテグリンと弱く相互作用し、α_ｖβ_３インテグリンと特異的に相互作用することを示
唆している（図４Ａ〜４Ｃに示されている）。

ＰｒｏＡｇｉｏによりコートされたプレートを用いた細胞付着アッセイは、ＰｒｏＡｇ
ｉｏ／α_ｖβ_３インテグリンの相互作用を検証している。高レベルのα_ｖβ_３発現を有す
る（図５に示されている）ＨＵＶＥＣ細胞は、ＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレートに強
力に付着した（図６に示されている）。α_ｖβ_３を発現しないＣＨＯおよびＣＯＳ−７細
胞は、ＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレートに付着しなかった。α_ｖβ_３はまた、ＣＨＯ
およびＣＯＳ−７細胞内で外因的に発現され（図７に示されている）、上に記載されてい
る同じ細胞付着分析が、これらの細胞上で行われた。α_ｖβ_３発現ＣＨＯおよびＣＯＳ−
７細胞は、ＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレートに付着した（図８に示されている）。対
照群として、α_ｖβ_３インテグリン発現ＣＨＯ細胞は、ＰｒｏＡｇｉｏをコートしたプレ
ートに付着しなかった（図９に示されている）。これらの細胞付着アッセイ分析は、細胞
表面上のα_ｖβ_３インテグリンとのＰｒｏＡｇｉｏ相互作用を示している。

ＰｒｏＡｇｉｏのインテグリンとの相互作用は、ＨＵＶＥＣ細胞抽出液内のβ_３インテ
グリンとのＰｒｏＡｇｉｏの免疫共沈降によってさらに検証された（図１０に示されてい
る）。

ＰｒｏＡｇｉｏがβＡ溝に結合するため、ＰｒｏＡｇｉｏとＲＧＤとが同じ部位に結合
しないことから、ＰｒｏＡｇｉｏ結合は、ＲＧＤ結合と競合しない。付着アッセイが行わ
れ、ＨＵＶＥＣ細胞がＲＧＤとともにインキュベートされ、続いてＰｒｏＡｇｉｏの付着
に対して検査された。この実験は、ＲＧＤおよびＰｒｏＡｇｉｏの両方が、妨害なくＨＵ
ＶＥＣ細胞へと結合することを証明している（図１１に示されている）。

架橋剤としてのビス（スルホスクシンイミジル）−グルタル酸（ＢＳ２Ｇ）（図１２と
して示されている）を用いた化学架橋は、ＰｒｏＡｇｉｏがβＡ溝部位に結合することを
証明している。この架橋に続くトリプシン消化およびＬＣ−ＭＳ分析は、ＴＥＭＫＱＥＲ
（ａａ１１６−１２２）でインテグリンａｙに架橋されたＰｒｏＡｇｉｏＷＥＫＴＳ
ＤＫＫ（ａａ３５−４３）を示している（図１３Ａ〜１３Ｃとして示されている）。Ｐ
ｒｏＡｇｉｏおよびβ_３インテグリンの相互作用は、立体的な妨害に起因して、すなわち
、かさ容積の架橋反応基に起因したＢＳ２Ｇのせいで検出されなかった。

これに応じて、架橋剤としてのグルタルアルデヒド（図１４として示されている）を用
いた架橋が予め行われた。ＰｒｏＡｇｉｏＮＬＫＶＩＩ（ａａ９９−１０５）は、グ
ルタルアルデヒドによってβ_３インテグリンＦＮＥＥＶＫＫＱ（ａａ２０３−２１０）
に架橋した（図１５Ａ〜１５Ｂとして示されている）。これはまた、ＰｒｏＡｇｉｏ［１
０６］がβＡ溝部位でα_ｖβ_３インテグリンと相互作用することを証明している。

ＰｒｏＡｇｉｏのβＡ溝への結合が、変異の分析によってさらに検証された。接点Ｑ１
５８Ａ、Ｋ２３３Ａ、およびＫ２３４Ａでのβ_３インテグリン上の変異は、インテグリン
変異体発現細胞のＰｒｏＡｇｉｏへの付着を低減した（図１６として示されている）。コ
ンピュータ計算は、前記変異がＰｒｏＡｇｉｏ／α_ｖβ_３インテグリンの合体を弱めるこ
とを証明している。前記変異はまた、変異体発現ＣＨＯ細胞（図１７として示されている
）のＰｒｏＡｇｉｏ（図１８に示されている）への付着を低減し、ＰｒｏＡｇｉｏおよび
β_３インテグリンの免疫共沈降を無効にした（図１９として示されている）。

図２０〜３０は、β_３インテグリンの細胞質ドメインに対するカスパーゼ８の補充およ
び活性化による細胞アポトーシスに対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示している。ＰｒｏＡ
ｇｉｏの存在下および不在下でのＨＵＶＥＣ細胞のアクチンフィラメントストレスファイ
バーおよび焦点接着複合体の形成を分析して、インテグリン活性のＰｒｏＡｇｉｏ治療の
効果を判定した。アクチンフィラメントストレスファイバーは、ＨＵＶＥＣ細胞がＰｒｏ
Ａｇｉｏにより治療される際に低減かつ消失した（図２０に示されている）。ストレスフ
ァイバーの先端でのビンキュリンの蓄積はまた、ＰｒｏＡｇｉｏによるＨＵＶＥＣ細胞の
治療時に減少された（示されていない）。これは、焦点接着複合体の解離を示している。

さらに、ＰｒｏＡｇｉｏ治療は、ＥＣＭへの付着によって活性化された焦点接着キナー
ゼ（「ＦＡＫ」）を不活性化する（図２１に示されている）。したがって、ＰｒｏＡｇｉ
ｏは、内皮細胞内のインテグリンの機能を無効にする。

ＰｒｏＡｇｉｏはまた、ＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを誘導する。具体的には、Ｐｒ
ｏＡｇｉｏは、１０時間の治療で１．４μＭほどのＥＣ５０にて、ＨＵＶＥＣ細胞アポト
ーシスを誘導する（図２２に示されている）。

ＨＵＶＥＣ細胞を用いて、ＰｒｏＡｇｉｏをいくつかの抗血管形成薬剤と比較した。抗
血管形成薬剤は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）（中国で
肺がん治療に対して許可されているエンドスタチン誘導体）、ＬＭ６０９（登録商標）（
α_ｖβ_３インテグリンのリガンド結合部位でのモノクローナル抗体標的）、およびＣｉｌ
ｅｎｇｉｔｉｄｅ（登録商標）（ＲＧＤ系ペプチド模倣物）である。ＰｒｏＡｇｉｏは、
アポトーシスの誘導において他の抗血管形成薬剤より有効であった（図２３に示されてい
る）。

さらなる試験を行って、ＰｒｏＡｇｉｏのアポトーシス誘導に対する効果がα_ｖβ３イ
ンテグリンに依存しているかどうかを判定した。α_ｖβ_３インテグリンの外因的な発現を
有する、または有しないいくつかの細胞、すなわち、ＨＵＶＥＣ、ＰＣ−３、ＨＥＫ、お
よびＣＯＳ−７により、同様の細胞アポトーシスアッセイを行った。ＨＵＶＥＣ細胞は、
高レベルのα_ｖβ_３を発現し、ＰＣ−３細胞は、限界レベルのα_ｖβ_３インテグリンを発
現し、ＨＥＫ細胞は、α_ｖを発現するが、β_３を発現せず、ＣＯＳ−７細胞は、α_ｖβ_３
を発現しない。ＰｒｏＡｇｉｏは、ＰＣ−３、ＣＯＳ−７、またはＨＥＫ細胞の存在下で
アポトーシスを誘導しない。しかしながら、ＰｒｏＡｇｉｏは、α_ｖβ_３インテグリンを
外因的に発現するＨＵＶＥＣおよびＣＯＳ−７細胞のアポトーシスを誘導する（図２４お
よび２５に示されている）。アポトーシスはまた、ＰＣ−３細胞が高濃度のＰｒｏＡｇｉ
ｏ、すなわち、＞３０μＭにより治療されたときに観察された（示されていない）。した
がって、アポトーシス誘導におけるＰｒｏＡｇｉｏの効果は、α_ｖβ_３に依存している。

抗血管形成活性を検証するために、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて内皮管形成アッセイを行っ
た。ＰｒｏＡｇｉｏは、内皮管をほとんど完全に破壊した。

Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅおよび他のインテグリン標的分子の効果とは対照的に、Ｐｒｏ
Ａｇｉｏ治療は、ＨＵＶＥＣ細胞の浮遊／剥離を生じず（図２６に示されている）、アノ
イキスとは異なる機構によってアポトーシスを誘導することを示している。

ＰｒｏＡｇｉｏ治療時のＨＵＶＥＣ細胞内の様々なカスパーゼの活性化は、ＰｒｏＡｇ
ｉｏが内皮細胞のアポトーシスを誘導する分子機構を証明している。カスパーゼ８および
カスパーゼ９が強力に活性化されると同時に、カスパーゼ７およびカスパーゼ３も活性化
された（図２７に示されている）。

カスパーゼ８および／またはカスパーゼ９の開始の活性化へのＰｒｏＡｇｉｏアポトー
シス誘導依存性がまた、試験された。カスパーゼ８およびカスパーゼ９阻害剤を利用した
。カスパーゼ９阻害剤は、アポトーシス誘導におけるＰｒｏＡｇｉｏの効果を無効にせず
、カスパーゼ８阻害剤は、ＰｒｏＡｇｉｏの効果を大きく無効にした（図２８に示されて
いる）。他方、カスパーゼ９阻害剤は、カスパーゼ８の活性化を無効にしなかったが、カ
スパーゼ９の活性化は、カスパーゼ８阻害剤によって大きく抑制され（図２９に示されて
いる）、その結果カスパーゼ８の活性化がアポトーシスを誘導する際のＰｒｏＡｇｉｏの
効果を媒介したことを示唆している。

非連結β３インテグリンは、インテグリン媒介性死（「ＩＭＤ」）として知られている
機構により、その細胞質ドメインにカスパーゼ８を直接補充することによって、細胞アポ
トーシスを生じることができる。ＰｒｏＡｇｉｏは、ＩＭＤの機構と類似すると同時に、
他のインテグリン拮抗薬の機構とは異なる機構によって内皮細胞アポトーシスを誘導し得
る。ＰｒｏＡｇｉｏ治療が、免疫共沈降によるβ_３インテグリンの細胞質部位に対するカ
スパーゼ８の直接的な補充および活性化を生じるかどうかを試験した。カスパーゼ８は、
ＰｒｏＡｇｉｏ治療時にβ_３インテグリンと免疫共沈降した。対照群として、カスパーゼ
８は、ＰｒｏＡｇｉｏ治療なしにβ_３インテグリンと共沈降しなかった。Ｃｉｌｅｎｇｉ
ｔｉｄｅは、同じ条件下で、β_３インテグリン細胞質ドメインにカスパーゼ８を補充しな
かった（図３０に示されている）。

図３１〜４３は、腫瘍の増殖の抑制、および腫瘍血管の低減におけるＰｒｏＡｇｉｏの
有効性を示している。ＰｒｏＡｇｉｏは、導入されたＣｙｓ残基で線形の形状のＰＥＧ鎖
（「ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧ」）を有する分子であるＰＥＧ−２０ｋＤａを用いて、ポリ
エチレングリコールによりＰＥＧ化された（図３１に示されている）。Ｃｙｓ変異が、イ
ンテグリン接触に関わらない部位に導入された。ＨＵＶＥＣ細胞によるインビトロ試験は
、ＰｒｏＡｇｉｏのＰＥＧ化が活性の有意な減少を生じないことを示している。

ＰＣ−３の異種移植モデルを生成した。腫瘍を保有しているマウスに、様々な用量のＰ
ｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧおよびＰＥＧ化されたＤ１−ＣＤ２、または緩衝食塩水を、一日お
きに一用量により２０日間、腹腔内投与した。これらの治療を、腫瘍接種後５日目に開始
した。ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧが、１０または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量を受けた
群において腫瘍の増殖を抑制する（２つおよび１つの腫瘍が、それぞれ、２０および１０
ｍｇ／ｋｇ用量の群において完全に消失した）と同時に、腫瘍は、緩衝剤またはＰＥＧ化
されたＤ１−ＣＤ２のいずれかにより治療されたマウスにおいて正常な速度で増殖した。

ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの腫瘍の増殖の抑制に対する効果は、用量に依存している。し
かしながら、用量依存性は、１０ｍｇ／ｋｇを超えると劇的ではなくなった（図３２およ
び３３に示されている）。

ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧはまた、腫瘍の増殖の後期に投与されたときに有効である（図
３４および３５に示されている）。

ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧの治療の腫瘍血管に対する効果を分析するために、回収された
腫瘍から調製された組織切片による、内皮マーカーであるＣＤ３１の免疫染色を行った（
図３６に示されている）。ＰｒｏＡｇｉｏは、血管の密度、分岐点、および長さを低減し
た（図３７に示している）。

下記の補充増強薬剤、抗がん補充増強薬剤、三環系抗鬱剤（例えば、イミプラミン、デ
シプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドクサピン、ノルト
リプチリン、プロトリプチリン、アモキサピンおよびマプロチリン）、非三環系抗鬱剤（
例えば、セルトラリン、トラゾドンおよびシタロプラム）、Ｃａ．ｓｕｐ．＋＋拮抗薬（
例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ニトレンジピンおよびカロベリン）、カルモデュリ
ン阻害剤（例えば、プレニラミン、トリフルオペラジンおよびクロミプラミン）、アムホ
テリシンＢ、トリパラノールアナログ（例えば、タモキシフェン）、抗不整脈剤（例えば
、キニジン）、降圧剤（例えば、レセルピン）、チオール消失剤（例えば、ブチオニンお
よびスルホキシイミン）およびクレマフィールＥＬ等の多剤耐性還元剤を含む抗がん補充
増強薬剤と共に、抗血管形成薬剤が使用され得ると考えられる。また、本発明の化合物に
、顆粒球コロニー刺激因子等のサイトカインが投与され得る。高ＦＩ薬剤と組み合わせて
有効である、この範疇の薬剤内に該当する多数の他の化合物。

一実施形態はまた、抗血管形成薬剤および化学療法薬剤を含む、哺乳動物における血管
形成依存性症状を治療するためのキットを含む。血管形成の阻害または退行を生じるため
に治療的に有効な量および頻度での投与を可能にするための薬剤の組み合わせが提供され
ている。一定の実施形態では、抗線維性薬剤および／またはポリヌクレオチドは、単独で
、または抗炎症薬剤と組み合わせて投与される。本発明の抗血管形成薬剤と共に投与され
得る抗炎症薬剤には、限定されないが、コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブ
デソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プ
レドニゾロンプレドニゾン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド系非炎症薬剤（例
えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニ
ン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフ
ェナメート、メフィナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン
、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、お
よびトルメチン）、ならびに抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリー
ル酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体
、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトア
ミドカプロン酸、Ｓ−メチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、
ベンダザック、ベンジンダミン、ブクローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルフ
ァゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、
パラニリン、ペリソキサール、ピフォキシム、プロクアゾン、プロキサゾール、およびテ
ニダプが含まれる。

医薬的な薬剤は、下記の範疇および具体的な例を含む。本範疇は、具体的な例によって
限定されることを意図していない。当業者であれば、中枢神経系の外部で有用性がある、
こうした医薬的な薬剤を容易に特定することができるだろう。本範疇内に該当し、かつ本
発明に従って有効である多数の他の化合物。

いくつかの実施形態では、抗血管形成薬剤の溶解度および血液循環時間を増加させるこ
とが所望され得る。ポリペプチドの溶解度、血液循環時間を増加させるために、ポリエチ
レングリコールを使用して、本発明のポリペプチドを誘導体化し得、例えば、ポリ（エチ
レングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポロキサマー、ポリソルベー
ト、およびポリ（ビニルアルコール）が含まれ、ＰＥＧ重合体が特に好適である。ＰＥＧ
重合体は、約１００〜約４０，０００の分子量を有するＰＥＧ重合体である。上に例示さ
れたものに加えて、他の好適な親水性の重合体は、本開示に基づいて当業者に容易に明ら
かであろう。一般に、使用される重合体は、アルキル化またはアシル化反応を介して、本
発明のポリペプチドに付着され得る重合体を含み得る。一例では、抗血管形成薬剤は、２
０ｋＤａのＰＥＧ−鎖によりＰＥＧ化された。

ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、ポリペプチドの機能性または
抗原性ドメインに対する効果に鑑みて、ポリペプチドに付着されるべきである。当業者が
利用可能な多数の付着方法がある。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまた
はカルボキシル基等の反応基を介したアミノ酸残基を通して共有的に結合され得る。反応
基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得るものである。遊離アミノ
基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が含まれ得、遊離カ
ルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端
アミノ酸残基が含まれ得る。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を付
着するための反応基として使用され得る。Ｎ末端またはリジン基での付着等、アミノ基で
の付着が、治療目的のために好ましい。Ｎ末端で化学的に修飾されたポリペプチドが特に
所望され得る。本発明の組成物の図示としてポリエチレングリコールを用いて、様々なポ
リエチレングリコール分子（分子量、分岐等による）、反応混合内でのポリエチレングリ
コール分子のポリペプチド（ポリペプチド）分子に対する比率、実行されるＰＥＧ化反応
の種類、および選択されたＮ末端でＰＥＧ化されたポリペプチドを得る方法から選択され
得る。好適な反応条件下で、カルボニル基含有重合体によるＮ末端でのポリペプチドの実
質的に選択的な誘導体化が達成される。

様々な投与経路が利用可能である。選択される具体的なモードは、抗血管形成薬剤、治
療される具体的な症状、および有効性に対して必要とされる用量に依存し得る。これらの
方法は、臨床的に許容できない有害な効果を生じることなく、有効なレベルの免疫反応を
生じる任意のモードを意味する、医薬的に許容可能である任意のモードの投与を用いて実
行され得る。一定のモードの投与は、非経口的な経路である。

一定で特定の実施形態がまた、医薬組成物を提供している。かかる組成物は、治療的に
有効な量の活性成分（例えば、抗血管形成薬剤、抗血管形成薬剤＋化学治療的または抗血
管形成薬剤プラス抗炎症薬剤）、および薬学的に許容可能な担体を含む。かかる薬学的な
担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の石油、動物、野菜、または合成起源の水お
よび油を含む、水および油等の滅菌液であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される
ときの担体である。生理食塩水および水性ブドウ糖ならびにグリセリン溶液がまた、特に
注射液に対する液体担体として利用され得る。好適な医薬的賦形剤には、デンプン、グル
コース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ス
テアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥
スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。
本組成物はまた、所望される場合、少量の湿潤剤または乳化剤、もしくはｐＨ緩衝剤を含
有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、タブレット、ピル、カプセル、粉末
、持続放出製剤等の形態を取り得る。本組成物は、トリグリセリド等の従来型の結合剤お
よび担体を含む坐薬として処方され得る。経口製剤には、医薬的な等級のマンニトール、
ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース
、炭酸マグネシウム等の標準的な担体が含まれ得る。かかる組成物は、患者への適切な投
与のための形態を提供するために、好適な量の担体と共に、治療的に有効な量の抗血管形
成薬剤を含有するだろう。本製剤は、投与のモードに適合するべきである。

より具体的には、薬剤または医薬組成物は、ヒトでの使用前に、所望の治療的または予
防的な活性のために、インビトロで、次に、インビボで試験され得る。例えば、化合物ま
たは医薬組成物の治療的または予防的な有用性を証明するためのインビトロアッセイは、
細胞株または患者の組織試料に対する化合物の効果を含む。化合物または組成物の細胞株
および／または組織試料に対する効果は、限定されないが、ロゼット形成アッセイおよび
細胞溶解アッセイを含む、当業者に知られている技術を利用して判定され得る。本発明に
従って、具体的な化合物の投与が示されているかどうかを判定するために使用され得るイ
ンビトロアッセイは、患者の組織試料が培養内で増殖され、化合物を被り、そうでなけれ
ば投与され、かかる化合物の組織試料に対する効果が観察される、インビトロ細胞培養ア
ッセイを含む。

例えば、α２ヘリックス、「Ｂ−Ｃ」ループ、および「α２−α３」ループにおいてα
_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドを含む組成物を投与するステップを
含む、（１）線維性物質、（２）細胞外マトリクス内の線維性物質の過度の生成、および
／または（３）マトリクス関連成分の異常な、非機能的、および／または過度の蓄積によ
る正常な組織要素の置換によって、全体的に、または部分的に特徴付けられる、線維症、
および様々な線維性の疾患、障害、または症状を有する、または有する疑いがある、もし
くはその傾向がある、またはその危険にさらされている対象を治療する方法を含む、様々
な疾患、障害、および症状を、全体的に、または部分的に治療し、かつ／または予防する
ための特定の実施形態。

抗血管形成薬剤は、ヒトへの静脈内投与のために適合された医薬組成物としてルーチン
工程に従って処方され得ると考えられる。典型的に、静脈内投与のための組成物は、無菌
等張水性緩衝液内の溶液である。必要に応じて、本組成物はまた、可溶化剤および注射の
部位での痛みを和らげるためのリグノカイン等の局所麻酔薬を含み得る。一般に、本成分
は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋等の密封容器内の凍結乾燥粉末また
は無水濃縮物として、単位投与形態で、個別にまたは共に混合されて供給される。本組成
物が点滴によって投与される場合、医薬的な等級の滅菌水または生理食塩水を含有する点
滴ボトルにより分注され得る。本組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水ま
たは生理食塩水のアンプルが、本成分が投与前に混合され得るように提供され得る。

例えば、リポソーム内のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現するこ
とができる組み換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他の
ベクター等の一部としての核酸の構成等の様々な送達システムが知られており、本発明の
化合物を投与するために使用され得る。導入の方法は、限定されないが、皮内、筋肉内、
腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む。本化合物または組成物
は、例えば、点滴またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の内壁（例えば、口
腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収によって等、任意の便利な経路によって投与
され得、他の生物学的活性薬剤と共に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る
。加えて、心室内および髄腔内注射を含む、本発明の医薬化合物または組成物を任意の好
適な経路によって中枢神経系へと導入することが望ましい場合があり、心室内注射は、心
室内カテーテルによって利用され得る。

ある特定の実施形態では、治療が必要な部位に局所的に抗血管形成薬剤を投与すること
が望ましい場合がある。これは、例えば、限定の方法によるものではないが、外科手術中
の局所点滴、例えば、外科手術後の創傷包帯と併せた局所的な塗布によって、カテーテル
の手段によって、坐薬の手段によって、または埋め込みの手段によって、達成され得、本
埋め込みは、シラスティック膜または線維等の膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゲル
状物質からなる。ポリペプチドを投与するとき、ポリペプチドが吸収しない物質を使用す
るように注意を払うべきである。

ある特定の実施形態では、抗血管形成薬剤は、ポリペプチドをコードする核酸であり、
核酸は、それを好適な核酸発現ベクターの一部として構成し、かつ例えば、レトロウイル
スベクターの使用によって、または直接的な注射によって、あるいは微粒子の照射の使用
、または脂質もしくは細胞表面受容体または導入薬剤の塗布によって、あるいは神経核に
進入することが知られているホメオボックス状のペプチドに結合してそれを投与すること
によって等、それが細胞内にあるように投与することによって、そのコードされたポリペ
プチドの発現を促進するようにインビボで投与され得る。代替的に、核酸は、細胞内に導
入され得、かつ相同組み換えによって発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。

他の実施形態は、抗血管形成薬剤をコードするポリヌクレオチド、宿主細胞を含有する
ベクター、および合成および組み換え技術による抗血管形成薬剤の生成を対象とする。ベ
クターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターで
あり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であり得る。後者の事例
では、ウイルス増殖は、一般に、宿主細胞を補完する際にのみ生じるだろう。抗血管形成
薬剤をコードしたポリヌクレオチドは、宿主の増殖に対する選択可能なマーカーを含有す
るベクターに接合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物等
の沈殿物内に、または荷電脂質との複合体で導入される。ポリヌクレオチドのインサート
は、いくつか例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ、大腸菌ｌａｃ、Ｔｒｐ、ｐ
ｈｏＡおよびｔａｃプロモータ、ＳＶ４０初期および後期プロモータ、およびレトロウイ
ルスＬＴＲのプロモータ等の好適なプロモータに動作可能に連結されるべきである。他の
好適なプロモータが、当業者に知られているだろう。発現構築物は、転写開始、終了のた
めの部位、および非転写領域での翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有するだろ
う。構築物によって発現された転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペ
プチドの末端に好適に位置付けられた開始および終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡ
Ｇ）での翻訳開始コドンを含むだろう。指摘されているように、発現ベクターは、好まし
くは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むだろう。

調節遺伝子および配列は、抗血管形成薬剤の発現および複製と共に使用し得ると考えら
れる。遺伝子発現に対する調節配列の性質は、種または細胞タイプ間で変化し得るが、Ｔ
ＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等、それぞれ転写および翻訳の開始に
関わる、５’非転写および５’翻訳配列を、必要に応じて含み得る。プロモータは、構成
的または誘導的であり得る。調節配列はまた、所望される場合、エンハンサ配列または上
流活性化因子配列を含み得る。

一実施形態では、抗血管形成薬剤をコードしたポリヌクレオチドは、真核または原核細
胞の特定の区画へのポリペプチドの局所化を配向するか、かつ／またはポリペプチドの分
泌を配向するシグナル配列をコードしたポリヌクレオチドに融合され得る。例えば、大腸
菌において、細胞周辺腔へのタンパク質の発現を配向することが望まれ得る。いくつかの
ベクターは、タンパク質の局所化を配向する融合タンパク質の構成に対して市販されてい
る。

ある特定の実施形態は、略管状構造（例えば、螺旋形状を含む）を含むステントを提供
しており、その表面は、上に記載されているような抗血管形成薬剤によりコートされてい
る。ステントは、経路の閉鎖または再閉鎖を防ぐために、疾患の経過によって（例えば、
腫瘍による増殖において）狭められ、不規則に輪郭付けられ、塞がれ、または閉塞された
身体経路（例えば、胆管）または身体経路の一部分へと挿入され得る、通常は筒状の形態
の足場であり得る。

ある特定の実施形態はまた、広範囲の外科手術工程における抗血管形成薬剤の使用を提
供している。例えば、本発明の一態様内では、抗血管形成タンパク質（例えば、スプレー
またはフィルムの形態で）は、悪性組織から正常な周辺組織を隔離するために、かつ／ま
たは周辺組織への疾患の伝播を防ぐために、腫瘍の除去前の部位に塗布するか、またはス
プレーするように使用され得る。本発明のまた他の態様内では、抗血管形成タンパク質が
コートされた外科手術メッシュが、外科手術メッシュを利用し得る任意の工程において利
用され得る。

下記に続く実施例は、本発明の理解の助けとするために記載されているが、任意の方法で
本発明の範囲を限定するものことを意図しておらず、またそのように解釈されるべきでな
い。

ＰＣ−３異種移植片を用いた、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧ対Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）
およびＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧ対Ｅｎｄｏｓｔａｒ（登録商標）の効果を比較するための
実験を行った。ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧは、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏ
ｓｔａｒ（登録商標）と比較して、腫瘍の増殖を抑制する効果がより高かった（図３８〜
４１に示されている）。

さらに、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧ治療は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）およびＥｎｄｏ
ｓｔａｒ（登録商標）の血管減少より高程度の血管減少を生じる（示されていない）。

腫瘍の血管形成は、一般に、腫瘍を囲む微小環境によって影響を受ける。したがって、
免疫適合性マウスによる同所性モデルを実施した。具体的には、Ｂａｌｂ／ｃ系マウスを
用いたマウス胸部４Ｔ−１細胞による実験を行った。ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧまたはＤ１
−ＣＤ２−ＰＥＧのいずれかの同じ投薬計画によって、腫瘍を保有しているマウスを治療
した。腫瘍接種の５日後に治療を開始した。ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧ治療群と緩衝液治療
群との間の腫瘍の増殖において有意な差があり（図４２および４３に示されている）、同
所性モデルによる腫瘍の増殖の抑制に有効であることを示している。

図４４および４５は、ＰｒｏＡｇｉｏの正常な組織および器官への非毒性を証明してい
る。良好な抗血管形成薬剤は、正常な組織／器官における既存の血管に対して最小の毒性
を有するべきである。ＰｒｏＡｇｉｏのこの属性を評価するために、異なる薬剤によって
治療されたマウスの肝臓、肺、心臓、および腎臓からの組織切片を準備した。ヘマトキシ
リンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色および免疫染色によって、組織切片を分析した。
Ｈ＆Ｅ染色は、ＰｒｏＡｇｉｏが組織の細胞構造の明らかな異常または損傷、例えば、病
変／壊死等を生じないことを明らかにした（図４４に示されている）。抗ＣＤ３１抗体を
用いた免疫蛍光染色は、ＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧが、肝臓、肺、心臓、または肝臓におい
て、ＰＥＧ化されたＤ１−ＣＤ２または緩衝食塩水よりも、血管を妨害または低減するこ
とを示している（図４４に示されている）。さらに、ＰｒｏＡｇｉｏは、異常な重量増加
または喪失を生じない（図４５に示されている）。

ＰｒｏＡｇｉｏの毒性をさらに分析するために、４８時間にわたって健康なＣＤ−Ｉマ
ウスに３回の用量の６０ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧを点滴投与した。マウスを
１４日間観察した。すべてのマウスが、正常に挙動した。血液および尿の試料を回収した
。プラズマＡＳＴ／ＡＬＴ、ＴｎＴ、クレアチニン、および尿中アルブミンを、薬剤投与
の４８時間後に試験した。本試験は、これらの用量でのＰｒｏＡｇｉｏ−ＰＥＧがマウス
の肝臓、腎臓、または心臓への損傷を生じないことを示した（示されていない）。

図４６〜５０は、ＰｒｏＡｇｉｏを利用した、線維性の疾患および他の疾患の治療を示
している。図４６〜４８は、肝線維症のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系マウス）に対するＰｒｏ
Ａｇｉｏの効果を示している。マウスの飲料水内に一週間で２回の用量の２５０ｍｇ／ｋ
ｇ＋１０％のアルコールを用いて６週間の期間に渡って、肝線維症が誘導された。線維症
の誘導の直後に、ＰｒｏＡｇｉｏ（１０ｍｇ／ｋｇ）または緩衝液を、１０回マウスに腹
腔内投与した。最初の４回の用量を毎日投与し、続く６回の用量を一日おきに一度投与し
た。図４６は、線維症のマウスの治療された肝臓を示している。図４７は、線維症のマウ
スの治療された肝臓の拡大図を示している。図４８は、アルコールおよび緩衝液またはア
ルコールおよびＰｒｏＡｇｉｏで治療されたマウスの肝臓の重量を証明している。ＳＤは
、標準的な偏差であり、対応なしの両側ｔ検定を用いて、β値を計算した。重要なことに
、ＰｒｏＡｇｉｏ治療群の肝臓の大きさおよび重量は、緩衝液治療群のものより小さく、
より軽かった（平均で３５％〜４５％）。

図４９は、アルコールおよび緩衝液またはアルコールおよびＰｒｏＡｇｉｏにより治療
されたマウスから回収された肝臓から調製された肝臓抽出液内のＴＩＭＰ１レベル（ｎｇ
／ｇ肝臓試料）を示している。ＰｒｏＡｇｉｏ治療群の肝臓抽出液内のＴＩＭＰ１レベル
は、緩衝液治療群におけるものの約５倍未満であった。さらに、ＰｒｏＡｇｉｏ治療群の
肝臓抽出液内のＭＭＰ２レベルは、緩衝液治療群におけるものの約３０％超であった（示
されていない）。ＳＤは、標準的な偏差であり、対応なしの両側ｔ検定を用いて、β値を
計算した。

図示されていない実験では、１１週間、一週間に二回の２５０ｍｇ／ｋｇの１０％アル
コール供給治療を投与することによって、肝線維症が誘導された。続いて、１０ｍｇ／ｋ
ｇのＰｒｏＡｇｉｏまたは緩衝食塩水のいずれかを腹腔内投与した。最初の供給治療から
１２週で開始し、最初の３回の用量を毎日投与し、続く７回の用量を一日おきに一度投与
した。緩衝液治療群内の４匹のマウスが死に、ＰｒｏＡｇｉｏ治療群内のマウスが一匹も
死ななかった。ＰｒｏＡｇｉｏ治療群の肝臓の大きさおよび重量は、緩衝液治療群のもの
より小さく、より軽かった（平均で５０％〜６０％）。

別の図示されていない実験では、ＴＩＭＰ１およびＭＭＰ２測定値を判定した。Ｐｒｏ
Ａｇｉｏ治療群の肝臓抽出液内のＴＩＭＰ１レベルは、緩衝液治療群のものの約７倍未満
であった。さらに、ＰｒｏＡｇｉｏ治療群の肝臓抽出物内のＭＭＰ２レベルは、緩衝液治
療群のものの約２５％超であった。

細胞実験も行った。肝線維症の主な原因は、肝星細胞の活性化である。図５０は、主な
ヒト肝星細胞（「ｈＨＳＣ」）のアポトーシスに対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示してい
る。コートされていないプラスチック培養プレート内で８日間培養することによって、ｈ
ＨＳＣを活性化した。活性化されていないｈＨＳＣは、培養の第１日目の細胞であった。
非活性化または活性化ｈＨＳＣを、５μｍのＰｒｏＡｇｉｏ（黒色の棒）または緩衝液（
白色の棒）により治療した。アポトーシスキットによって、アポトーシスを測定し、任意
の治療を受けていない非活性化細胞を０％として定義することによって、％アポトーシス
として提示した。活性化および非活性化ｈＨＳＣのＰｒｏＡｇｉｏによる治療は、Ｐｒｏ
Ａｇｉｏが活性化ｈＨＳＣのアポトーシスを有効に生じ、ＰｒｏＡｇｉｏが非活性化ｈＨ
ＳＣに対して効果がないことを示した。エラーバーは、５回の独立した実験全体にわたる
標準的な偏差を図示している。

図５１〜５３は、肝線維症のマウスに対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を証明する実験を示
している。１２週間、１週間に２回投与された２５０ｍｇ／ｋｇのＴＡＡ＋１０％アルコ
ール供給治療を用いて、肝線維症が誘導された。続いて、治療を腹腔内投与した。最初の
３回の治療用量を毎日投与し、続く６回の治療用量を一日おきに一度投与した。３回の治
療群は、１０ｍｇ／ｋｇのＰｒｏＡｇｉｏ（群当たり８匹）、２０ｍｇ／ｋｇのＥｓｂｒ
ｉｅｔ（登録商標）（肺線維症の治療に対して新規に許可された薬剤）（群当たり８匹）
、および緩衝食塩水（群当たり８匹）を含んだ。緩衝液群内のマウス１匹、およびＥｓｂ
ｒｉｅｔ（登録商標）内のマウス１匹が死んだ。

図５４Ａ〜５４Ｂは、線維症の肝臓に対するＰｒｏＡｇｉｏの効果を示している。星細
胞は、肝臓における細胞外マトリクスの主な源であると考えられている。ＰｒｏＡｇｉｏ
治療時の線維性の肝臓内の血流の実際の図５４Ａの効果。肝臓線維性のマウスを指摘され
ている薬剤によって治療した。門脈を通る血流をドップラー撮像によって測定し、１秒当
たりのｍｍ^３として提示した。対照群は、線維症の誘導のないマウスの測定値である。エ
ラーバーは、６匹のマウスの測定値の標準的な偏差である。図５４Ｂは、活性化された肝
臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）のアポトーシスがＰｒｏＡｇｉｏによって誘導されたことを
示している。ヒトの主なＬＳＥＣは、ＶＥＧＦなしの培養において活性化された。指摘さ
れている濃度で１０時間、ＰｒｏＡｇｉｏによって、活性化されたＬＳＥＣを治療した。
対照群は、活性化のないＬＳＥＣである。アポトーシスは、％アポトーシスとして提示さ
れている。エラーバーは、５回の独立した実験の標準的な偏差である。ＰｒｏＡｇｉｏは
、線維症を低減するのみならず、肝臓の血管を正常化した。

図５５Ａ〜５５Ｄは、乳がんの治療としてＰｒｏＡｇｉｏの結果を示している。マウス
の乳がん４Ｔ−１（よく知られている乳がんモデル）を１０回の用量に対する１０ｍｇ／
ｋｇのＰｒｏＡｇｉｏによって治療した。図５５Ａは、エンドポイントでの腫瘍の大きさ
を示している（サイズ超過およびＩＡＣＵＣ調節による実験の事前終端に起因して、１つ
の腫瘍を省略する）。図５５Ｂは、腫瘍の組織切片の筋線維芽細胞の染色のレベルを示す
、シリウスレッド（コラーゲン）およびα―ＳＭＡの代表的な画像を示している。図５５
Ｃは、ある定量のシリウスレッド染色または各領域でのポジティブ染色の染色された部位
の割合として提示されている染色を示している。図５５Ｄは、各領域でのポジティブ染色
の画素として提示されている別の定量のα―ＳＭＡを示している。（Ｃ）および（Ｄ）に
おけるエラーバーは、５匹のマウスの測定値の標準的な偏差である。

図５６は、ＰｒｏＡｇｉｏが、がん間質および線維形成細胞によって形成された、膵臓
がん内の線維症を低減し、かつ予防することを示している。膵臓がんでは、高レベルのα
ｖβ３インテグリンを有する、活性化された線維形成細胞または膵星細胞。セクションＡ
は、指摘されている薬剤の治療下で、ＰａＳＣと共に埋め込まれたＭＩＡ−Ｐａｃａ−２
の異種移植片腫瘍の増殖が、４日毎の腫瘍の容積を測定することによって観察されたこと
を示している。ＰａＳＣをマウスの膵臓から単離し、市販のｈＴＥＲＴキットによって不
死化させた。腫瘍が平均２５０ｍｍ^３の大きさに達したときに治療を開始した。セクショ
ンＢ、ＣおよびＤは、腫瘍の組織切片のＣＤ３１染色、セクションＢ、シリウスレッド染
色、セクションＣ、および染色、セクションＤ、血管の長さ、密度、および分岐点の定量
分析を示している。セクションＣでは、コラーゲン含有量が、コラーゲン染色部位の％と
して提示されている。セクションＤでは、ポジティブα―ＳＭＡが、領域当たりの正の画
素として提示されている。（Ｃ）および（Ｄ）の対照群は、がんでない膵臓組織の定量の
部分による結果である。（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）のエラーバーは、６匹のマウスの実
験の測定値からの標準的な偏差である。対でない両側スチューデントｔテストを用いて、
ｐ値を計算した。（Ｃ）および（Ｄ）では、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．
０１を意味し、かつ＊＊＊はＰ＜０．００１を意味している。（Ｃ）および（Ｄ）の画像
は、指摘されている治療群の表示である。

図５７Ａ、図５７Ｂ、および図５７Ｃは、ＰｒｏＡｇｉｏが肝臓がん内の線維症を低減
し、かつ予防することを示している。これらの図は、ＰｒｏＡｇｉｏが肝臓がん内の線維
症を低減し、かつ予防し、結果として肝臓腫瘍の容積の低減を生じることを示している。
肝臓がんでは、活性化された線維形成細胞または肝星細胞は、αｖβ３インテグリンの高
レベルの発現を有する。図５７Ａおよび５７Ｂは、肝臓がんの異種移植片に対するＰｒｏ
Ａｇｉｏの効果を示している。これらの実験は、ＨｅｐＧ腫瘍（６匹のヌードマウス／群
）および１×１０７ＨｅｐＧ単独または半々のＨｅｐＧ＋ＬＸ−２細胞で開始された腫瘍
の異種移植片に対するものであった。２０日間２日毎に、かつ腫瘍接種の約１８日後に、
一用量１０ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）の治療により、腫瘍の容積は、ＰｒｏＡｇｉｏにより低
減した。これらの（他の種類の腫瘍における筋線維芽細胞のような）細胞は、腫瘍内のが
ん細胞を支持し、かつ維持し、その結果、それらのアポトーシスは、腫瘍を収縮させた。
コラーゲン内容物は定量化され、コラーゲン染色部位の％として提示されている。撮像Ｊ
を用いた３１９．８×３１９．８ｍｍ^２の視野内で、定量的な測定値を手動で計算する。
量子化は、各腫瘍からの一致した位置の４つの部分におけるランダムに選択された３つの
領域の平均値である。対照群は、がんでない肝臓組織の部分による結果である。エラーバ
ーは、６匹のマウスの実験の測定値からの標準的な偏差である。図５７Ｃは、ＰｒｏＡｇ
ｉｏによる治療後の腫瘍内のコラーゲンまたは線維を示している。動物群当たり合計８０
個のスライドおよびスライド当たり３つの領域を試験し、対照群は、正常な肝臓組織の染
色である対照群である。ＰｒｏＡｇｉｏは、肝臓がんを治療した。

ＰｒｏＡｇｉｏは、他の線維性の疾患の治療および骨粗しょう症の治療に適用可能であ
り得る。さらに、ＰｒｏＡｇｉｏは、リウマチ関節炎の治療のための他の薬剤と組み合わ
せて使用され得る。

本開示の一態様は、本明細書に開示されているようなタンパク質の活性部位、および本
明細書に開示されているようなその特殊性である。

本明細書に開示されている具体的な例は、単なる図示目的として解釈されるべきであり
、いかなる任意の方法でも本開示の残りの部分を制限するものと解釈されるべきでない。
さらなる詳細なしに、当業者であれば、本明細書の説明に基づいて、その最も完全な程度
まで本発明の開示を利用することができると考えられる。

本開示されている例は、本方法を実行する方法および本明細書で開示され、主張されて
いる組成物および化合物を使用する方法についての完全な開示および説明を当業者に提供
するために記載されている。例えば、量、温度等の数値に関しての正確性を確保するため
の取り組みがなされてきたが、いくつかの誤差および偏差は説明されるべきである。別段
指摘されていない限り、部分は、重量による部分であり、温度は、℃によるものであり、
圧力は、雰囲気で、またはほぼ雰囲気である。標準的な温度および圧力は、２０℃および
１雰囲気として定義されている。

割合、濃度、量、および他の数値データは、本明細書において範囲の書式で表現され得
ることに留意すべきである。かかる範囲の書式は、利便性および簡潔さのために使用され
ると理解されるべきであり、したがって、範囲の限定として明示的に列挙されている数値
のみならず、各数値および小範囲が明示的に列挙されているかのように範囲内に包含され
ている個々の数値または小範囲のすべてを含むように、柔軟な方法で解釈されるべきであ
る。図示のために、「約０．１％〜約５％」の濃度範囲は、約０．１重量％〜約５重量％
の明示的に列挙されている濃度のみならず、例えば、指摘されている範囲内の、例えば、
１％、２％、３％、および４％等の個々の濃度、ならびに例えば、０．５％、１．１％、
２．２％、３．３％、および４．４％等の小範囲等を含むものと解釈されるべきである。
「約」という用語は、修飾される数値（複数可）の±１％、±２％、±３％、±４％、±
５％、±６％、±７％、±８％、±９％、または±１０％以上を含み得る。

Claims

対象の傷害または損傷組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の過度の蓄積を防
ぐか、または減らす方法であって、前記蓄積を防ぐまたは減らすことを必要とする対象を
特定するステップと、野生型細胞接着性タンパク質のドメイン１（Ｄ１−ＣＤ２）の配列
と少なくとも約７５％類似するアミノ酸配列を有するＤ１−ＣＤ２のバリアントを含む、
ａ_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合するポリペプチドを前記対象に投与するステップと
を含み、前記ポリペプチドが、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ループ
の領域中のβＡドメインにおいてα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する、方法。
前記ポリペプチドが、約１μＭ未満の解離定数を有する、請求項１に記載の方法。
前記ポリペプチドに対するアミノ酸置換が、前記野生型Ｄ１−ＣＤ２の元のアミノ酸の
約−２〜約＋２の親水性値の範囲を有する、請求項１に記載の方法。
前記対象が、肝線維症、膵線維症、または乳腺線維症を有する、請求項１に記載の方法
。
前記バリアントが、Ｌ９４Ｎ、Ｅ９５Ｄ、Ｋ９６Ｖ、Ｉ９７Ｃ、Ｆ９８Ｎ、Ｄ９９Ｆ、
Ｌ１００Ａ、Ｋ１０１Ｓ、およびＩ１０２Ｒからなる群から選択された少なくとも１つの
アミノ酸置換を含む、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、Ｌ９４Ｎ、Ｅ９５Ｄ、Ｋ９６Ｖ、Ｉ９７Ｃ、Ｆ９８Ｎ、Ｄ９９Ｆ、
Ｌ１００Ａ、Ｋ１０１Ｓ、およびＩ１０２Ｒの置換を有する配列を含む、請求項１に記載
の方法。
前記バリアントが、Ｉ９７Ｙ、Ｆ９８Ｄ、およびＤ９９Ｙからなる群から選択された少
なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、Ｉ９７Ｙ、Ｆ９８Ｄ、およびＤ９９Ｙの置換を有する配列を含む、
請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、Ｄ９９Ｎ、Ｉ１０２Ｖ、Ｑ１０３Ｉ、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ８Ｔ、Ｔ９Ｖ
、Ｗ１０Ｑ、Ｇ１１Ｍ、Ａ１２Ｋからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む
、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、Ｄ９９Ｎ、Ｉ１０２Ｖ、Ｑ１０３Ｉ、Ｅ１０４Ｉ、Ｅ８Ｔ、Ｔ９Ｖ
、Ｗ１０Ｑ、Ｇ１１Ｍ、Ａ１２Ｋの置換を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、ａ_ｖβ_３インテグリンとの少なくとも１つの分子間相互作用を有す
る、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、βＡ溝においてα_ｖβ_３インテグリンに結合する、請求項１に記載
の方法。
前記バリアントが、ＴＥＭＫＱＥＲでα_ｖインテグリンに架橋される、請求項１に記載
の方法。
前記バリアントが、ＦＮＥＥＶＫＫＱでβ_３インテグリンに架橋される、請求項１に記
載の方法。
前記バリアントが、ＦＮＥＥＶＫＫＱでβ３インテグリンに架橋される、請求項１に記
載の方法。
前記バリアントが、ＰＥＧ化されている、請求項１に記載の方法。
前記バリアントが、ポリエチレングリコールによりＰＥＧ化されている、請求項１５に
記載の方法。
前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ−２０ｋＤａである、請求項１に記載の方法。
医薬組成物であって、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ループの領域
中のβＡドメインにおいてα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する治療的に有効な量の
ポリペプチドを含み、それによって前記対象の前記組織における細胞外マトリクス内の線
維性物質の過度の蓄積を防ぐか、または減らす、医薬組成物。
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
対象の組織内でアポトーシスを誘導する方法であって、請求項１９または２０に記載の
治療的に有効な量の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
肝臓の門脈圧亢進症を防ぐか、または減らす方法であって、α２ヘリックス、Ｂ−Ｃル
ープ、およびα２−α３ループの領域中のβＡドメインにおいてα_ｖβ_３インテグリンに
特異的に結合する単離されたポリペプチドを対象に投与するステップを含み、それによっ
て前記対象の前記組織における細胞外マトリクス内の線維性物質の過度の蓄積を防ぐ、ま
たは減らす、方法。
前記対象が、肝線維症を有する、請求項２２に記載の方法。
前記対象が、膵線維症を有する、請求項２２に記載の方法。
前記対象が、乳腺線維症を有する、請求項２２に記載の方法。
対象の組織における細胞外マトリクス内に線維性物質の過度の蓄積を有する疾患を治療
する方法であって、請求項１９または２０に記載の治療的に有効な量の前記医薬組成物を
投与するステップを含む、方法。
前記疾患が、肝線維症または膵線維症である、請求項２３に記載の方法。
対象内の腫瘍を予防し、かつ治療する方法であって、請求項１９または２０の治療的に
有効な量の前記医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
前記医薬組成物が、局所的な塗布、注射、経口投与、または持続放出投薬のために好適
である、請求項２１〜２５に記載の方法。
前記対象が、哺乳動物である、請求項２１〜２６に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、請求項２１〜２７に記載の方法。
α２ヘリックス、Ｂ−Ｃループ、およびα２−α３ループの領域中のβＡドメインにお
いてα_ｖβ_３インテグリンに特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
Ｋ_Ｄが、約１μＭ〜１ｐＭである、請求項２９に記載のペプチド。