JP2021045138A - 安定化したウイルスクラスｉ融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

【課題】融合前コンフォメーションで安定化した、安定な、組換え、クラスＩ融合タンパク質を提供する。【解決手段】ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中に、１つまたは複数の変異を含む、融合前コンフォメーションで安定な融合前クラスＩ融合タンパク質を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は医薬の分野に関する。本発明は、具体的には、組換え融合前クラスＩ融合タン
パク質、および例えば免疫原性組成物におけるその使用に関する。
ウイルス融合タンパク質は、準安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コン
フォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングによって膜融合を駆動する
動的な融合機構である。タンパク質の膜融合性はウイルス感染にとって重要である。
エンベロープウイルスの融合タンパク質は、ウイルスが標的細胞と融合するのを駆動す
るために示す一般的な不可逆的フォールディング機序に基づいて、異なるタイプに分類す
ることができる。無関係なウイルス由来の融合タンパク質、例えば、パラミクソウイルス
科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の融合タンパク質Ｆ、エボラＧＰ、レトロウイル
ス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）エンベロープタンパク質、コロナウイルス科（Ｃｏｒ
ｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）スパイク、ヘルペスビリデア（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄｅａ）ｇ
Ｂ、オルトミクソビリデアエ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａｅ）ヘマグルチニン（
ＨＡ）およびヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、ならびにその他のものはクラスＩ融
合タンパク質に分類され、これらは意味のある配列相同性を何ら呈していないのだが、類
似の機序によって不安定な融合前状態から安定な融合後状態にリフォールディングされる
。このように、クラスＩ融合タンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定
な融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパク質リフォールディングにより、ウイ
ルス膜と宿主細胞膜とを融合する。種々のクラスＩ融合タンパク質について、融合前コン
フォメーションおよび融合後コンフォメーションの構造が解明され、この複雑な融合機構
の機序に洞察が得られている。
通常、エボラＧＰおよびヘルペスｇＢを除き、不活性の成熟クラスＩ融合タンパク質（
例えばパラミクソウイルスのＦ０、オルトミクソウイルスのＨＡ）は、細胞内成熟の間に
開裂（多くの場合フューリン様プロテアーゼによる）を必要とし、その結果、Ｎ末端部分
とＣ末端部分とになる。開裂部位は２０〜２５疎水性アミノ酸の伸長（融合ペプチド）の
近傍にあるか、または隣接しており、その次にＣ末端部分の７アミノ酸繰り返し領域があ
る。これらはクラスＩ膜タンパク質であるため、Ｃ末端は膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有
し、開裂後に、膜が結合したＣ末端部分はＮ末端の疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を露出す
る（図１）。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディ
ングするためには、リフォールディングするために必要な２つの領域があり、これらはリ
フォールディング領域１（ＲＲ１）およびリフォールディング領域２（ＲＲ２）と呼ばれ
る。クラスＩ融合タンパク質ではすべて、ＲＲ１はＦＰおよび７アミノ酸繰り返しＡ（Ｈ
ＲＡ）を含む。トリガー発生後、三量体の３つすべてのプロトマーのＨＲＡは、ヘリック
スから、またはループのアセンブリーおよび二次的な構造から変形して、長い連続した三
量体ヘリックスコイルドコイルになる（図１）。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦ
Ｐは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、より
ＴＭに近いＲＲ２に向かって置かれたＣ末端であり、７アミノ酸繰り返しＢ（ＨＲＢ）を
含むことが多いリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、融合タンパク質の反対側へと移
動し、ＨＲＡコイルドコイル三量体をＨＲＢドメインに結合させて、またはインフルエン
ザＨＡのように伸長したポリペプチド鎖に結合させて、６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）
を形成する。これらの類似性は、これらの配列および構造的特徴を有するウイルス融合タ
ンパク質を、いわゆるクラスＩウイルス融合タンパク質グループとする命名によって認識
されている（Ｅａｒｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８５：２６−６６，（２００５）；
Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ５：２４−３３（２０１４））。
ウイルス融合タンパク質がワクチン成分として使用される場合、膜融合機能は重要では
ない。事実、ウイルスに結合することができる交差反応性抗体を誘導するために重要なの
は、成分の模倣のみである。したがって、強力で有効なワクチン成分の開発のためには、
準安定な融合タンパク質が、その融合前コンフォメーションで維持されることが望ましい
。融合前コンフォメーションで安定化した融合タンパク質は、有効な免疫応答を誘導する
ことができる。
本発明は、融合前コンフォメーションで安定化した、安定な、組換え、クラスＩ融合タ
ンパク質を提供する。
特定の実施形態では、融合前ポリペプチドは可溶性である。
本発明はまた、本発明による融合前ポリペプチドをコードする核酸分子およびそのよう
な核酸分子を含むベクターも提供する。
本発明はまた、クラスＩ融合前ポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを含
む組成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにクラスＩ融合タンパク質に対する免疫応
答を誘導するためのその使用、具体的にはワクチンとしてのその使用にも関する。
本発明はまた、対象に抗ウイルス免疫応答を誘導する方法であって、融合前ポリペプチ
ド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクタ
ーの有効量を対象に投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、誘導された免疫
応答は、ウイルスに対する中和抗体および／または前記ウイルス感染に対する防御免疫を
特徴とする。特定の態様において、本発明は、対象に抗ウイルス中和抗体を誘導する方法
であって、融合前ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸分子、および／また
は前記核酸分子を含むベクターを含む、有効量の免疫原性組成物を、対象に投与するステ
ップを含む方法に関する。
融合タンパク質三量体の、融合前コンフォメーションの図（左上）および中間状態の図（右上）、ならびにクラスＩ融合タンパク質の融合ドメインの保存要素の概略図（下）。融合ペプチド（ＦＰ）、リフォールディング領域１（ＲＲ１）、リフォールディング領域２（ＲＲ２）および膜貫通領域（ＴＭ）が示されている。融合タンパク質の分子構造はきわめて多様であり、分離型の受容体結合ドメインを含有する場合がある（左上、市松模様）が、すべての融合タンパク質は識別可能な融合ドメインを含有する（斜線部、黒塗りつぶし）。一般に、ＦＰはＣ末端部分に７アミノ酸繰り返し領域（黒塗りつぶしおよび斜線縞部）が続き、両者がＲＲ１を形成する。トリガー発生後、ヒンジループを介してベースヘリックス（斜線部）に結合しているＲＲ１のＮ末端部分（黒）がベースヘリックスの上にアセンブルして、長い連続したヘリックスコイルドコイルを形成する。融合タンパク質の融合後形態は、リフォールディング領域２がリフォールディングされたＲＲ１を束ねる際に形成される。これらはクラスＩ膜タンパク質であるため、Ｃ末端は膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する。 いくつかのクラスＩ融合タンパク質の、ＲＲ１（黒）、ヒンジループおよびベースヘリックス（斜線縞部）のフラグメントの、融合前コンフォメーション（上の列）および融合後コンフォメーション（下の列）の図。トリガー発生後、ヒンジループを介してベースヘリックス（斜線縞部）に結合しているＲＲ１のＮ末端部分（黒塗りつぶし）（上）がベースヘリックスの上にアセンブルして、長い連続したヘリックスを形成する（下）。ＲＳＶ ＦおよびＨＩＶ ｇｐ４１のヒンジの小さな白い円は、融合前コンフォメーションを安定化させるプロリンへの置換を表す。小さな黒い円は、白い円と構造的に相同な可能性のある位置であり、安定化置換の可能性のある位置である。 ５０１〜６０５位に安定化ジスルフィドを有するクレードＣのＥｎｖ（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ）のコンセンサス配列に基づいたＨＩＶ−１ ｅｎｖ配列におけるプロリン置換の、三量体のパーセンテージおよび収量。Ａ）Ｃタグ精製したＥｎｖを用いたＥＬＩＳＡ（黒い棒）および無細胞の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（灰色の棒）を使用して測定した三量体のパーセンテージ。ＥＬＩＳＡによって得られたＩ５５９Ｐ変異体の三量体のパーセンテージを使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡデータセットを正規化した。Ｂ）精製したＥｎｖを用いたＥＬＩＳＡ（黒い棒）および無細胞の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（灰色の棒）を使用して測定した三量体の収量。データを、Ｉ５５９Ｐ変異体を基準として正規化した。ＮＤ：未決定。ＨＩＶ−１ ｅｎｖのプロリン置換変異体は、表３に一層詳細に説明されている。 Ａ）ガランサス・ニバルス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｕｓ）レクチン精製したＨＩＶ−１ ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ Ｅｎｖ変異体（Ｉ５５９Ｐ置換（左）、およびＬ５５６Ｐ、Ｉ５５９Ｐの二重置換（右））のＳＥＣ−ＭＡＬＳプロファイル。クロマトグラムは、凝集体（クロマトグラムの左）、次いで三量体、次いでそれより小さいサブユニットの２つのピークを示す。Ｂ）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ中でＰＧＴ１４５結合を使用した、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ変異体の未処理の上清を６０℃で１時間インキュベートした後に残っている三量体の全個体数のパーセンテージ。 Ａ）ヒンジループ中でプロリン置換したエボラＧＰ変異体の無細胞の上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析。トランスフェクトしたｅｘｐｉ２９３細胞の上清をＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで解析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。レーンは変異体の発現および四次構造を示す。Ｂ）野生型、Ｔ５７７Ｐ変異体およびＬ５７９変異体の、三量体および単量体のバンドを判定し、それらの相対的パーセンテージを計算した。 示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）を使用した、野生型エボラＧＰ、ＥＢＯＶ１４株およびＴ５７７Ｐ置換した変異体の融解温度（Ｔｍ）の解析。 Ａ）エボラ株であるＭａｙｉｎｇａおよびＳｕｄａｎ Ｇｕｌｕ、ならびにヒンジループ中５７７位でプロリンに置換した変異体の、可溶性ＧＰをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析して得られたバンドに基づいた三量体のパーセンテージ。Ｂ）ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥに基づく、異なる可溶性ＧＰの三量体の相対的収量。 Ａ）ヒンジループ中７３位にプロリンまたはロイシンを有するインフルエンザミニＨＡ変異体の多量体特異的結合。Ｂ）ミニＨＡ変異体の、発現レベル、広域中和抗体への結合および三量体結合（Ａに示したとおり）の概要。Ｃ）多量体含有量を、６３Ｙを有する対照を基準とした６３Ｐのパーセンテージとして示した、６３位にＴｙｒまたはＰｒｏを有するミニＨＡ変異体の多量体含有量。
ウイルス−細胞融合は、ヒト病原体、例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）およびエボラウイルスなどを含むすべてのエンベロープウイルスが、
細胞に侵入し、疾患を引き起こす複製のサイクルを開始する手段である。ウイルス−細胞
融合は、一般に融合タンパク質と呼ばれるものを含む１種または複数種のウイルス表面糖
タンパク質によって行われる。エンベロープウイルスの融合タンパク質は、それらの一般
的な不可逆的フォールディング機序に基づいて、異なるタイプに分類することができる。
したがって、無関係なウイルス由来の融合タンパク質、例えば、パラミクソウイルス科（
Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の融合タンパク質Ｆ、エボラＧＰ、レトロウイルス科
（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）エンベロープタンパク質、オルトミクソビリデア（Ｏｒｔ
ｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａ）ヘマグルチニン（ＨＡ）およびヘマグルチニンエステラー
ゼ（ＨＥ）はクラスＩ融合タンパク質に分類される。クラスＩ融合タンパク質は、不安定
な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションへの不可逆的なタンパ
ク質リフォールディングにより、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合する。
既知の他のクラスＩ融合タンパク質には、例えば、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉ
ｒｉｄａｅ）のＧＰタンパク質、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のＥ１／Ｅ
２タンパク質、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のＥタンパク質、Ｅ（Ｔ
ＢＥＶ）、Ｅ１／Ｅ２（ＨＣＶ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）のＧ
Ｎ／ＧＣタンパク質、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のＧタンパク質
、およびヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のｇＢ、ｇＤ、ｇＨタンパ
ク質がある。
クラスＩ融合タンパク質はすべて、通常、同じ構造的特徴を含む（図１を参照）。リフ
ォールディング領域１（ＲＲ１）は融合ペプチド（ＦＰ）および７アミノ酸繰り返しＡ（
ＨＲＡ）を含む。トリガー発生後、三量体の３つすべてのプロトマーのＨＲＡおよびＦＰ
は、ヘリックスから変形し、またはループのアセンブリーおよび二次的な構造を形成して
、長い連続した三量体ヘリックスコイルドコイルになる（図１）。ＲＲ１のＮ末端セグメ
ントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることがで
きる。次に、よりＴＭに近いＲＲ２に向かって置かれたＣ末端であり、７アミノ酸繰り返
しＢ（ＨＲＢ）を含むことが多いリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、融合タンパク
質の反対側へと移動し、ＨＲＡコイルドコイル三量体をＨＲＢドメインに結合させて、ま
たはインフルエンザＨＡのように伸長したポリペプチド鎖に結合させて、６ヘリックスバ
ンドルを形成する。これらの類似性は、これらの配列および構造的特徴を有するウイルス
融合タンパク質を、いわゆるクラスＩウイルス融合タンパク質グループとする命名によっ
て認識されている（Ｅａｒｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８５：２６−６６，（２００
５）；Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ５：２４−３３（２０１４）。
ＲＲ１コイルドコイルの形成および６ヘリックスバンドルを完成させるためのＲＲ２の
移動は基本的な類似性であるが、融合機序における多様性は高い。いくつかのクラスＩ融
合タンパク質の構造研究は、それらがきわめて異なる構造的サブファミリーを表している
ことを示した。融合タンパク質の包括的なフォールディング、およびアンフォールディン
グのトリガーはファミリーメンバーによって異なり、イベントの配列は各クラスＩ融合タ
ンパク質によって異なる場合がある。例えば、多種のパラミクソウイルスについて、ＨＲ
Ｂは、ＨＲＡドメインの放出および形成の前に、露出され、放出されると提唱されている
。
ＲＲ１およびＲＲ２は別にして、既知のクラスＩ融合タンパク質はすべて、別の特有の
構造的特徴を共有しており、それを本明細書ではベースヘリックスと呼んでいる。ベース
ヘリックスとは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの変形中に
コンフォメーションを変化させない、動的な融合タンパク質の一部である。ベースヘリッ
クスは融合タンパク質の中心にあり、三量体のヘリックスベースを形成する。トリガーが
発生し、リフォールディングが開始した後、三量体のヘリックスベースはＲＲ１の最初の
ヘリックスのアセンブリーによって伸ばされる。呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（
ＲＳＶ Ｆ）では、ベースヘリックスはヘリックスα５である。リフォールディングの後
は、ヘリックスα４が、構造的に保護され、予め形成されたα５ヘリックスベースの上に
アセンブルする最初の構造要素である。フレキシブルなα４−α５ループは、α５の上の
α４というアセンブリーを実現するためにつなぎ合わす必要のある、この動的タンパク質
の最初の領域であるため、重要な構造要素である（図２）。
本発明を導いた研究において、このヒンジループ中の疎水性残基、特にプロリン（Ｐｒ
ｏ）置換がループを安定化することができることが発見された。安定性は疎水性相互作用
によって得られるが、特にヒンジ領域中のペプチド鎖の骨格コンフォメーションを制限す
るプロリンの強固性によって得られる。このきわめて重要なヒンジ領域中の、プロリン置
換により、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションは、ヒンジ運動が制限され、ヘリック
ス５の上のヘリックス４の運動およびアセンブリーが妨げられることによって安定化され
た。驚くべきことに、ＨＩＶについても、ヒンジループ中の安定化プロリン置換が記述さ
れている（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７
６，８８７５−８８８９（２００２））。
近年、ＨＩＶの融合ドメインｇｐ４１の融合前コンフォメーションの結晶構造が解明さ
れた（Ｐａｎｃｅｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１４，４５５−４６１（２０１４
））。それをｇｐ４１の融合後６ＨＢの既知の構造と比較することによって、ヘリックス
７をベースヘリックスとして同定することができる。ＲＲ１のリフォールディング後に、
α６とα７の間のヒンジループとヘリックスα６とがベースヘリックスα７の上に乗って
、長く伸びたコイルドコイルを形成する。ＲＳＶ融合前Ｆのα４−α５ヒンジループと同
様に、融合前ＨＩＶ ｇｐ４１のα６−α７ヒンジループもまた、融合タンパク質の最も
不規則な要素である。ｇｐ４１のα６−α７ループは、実際、完全に不規則であり、結晶
構造中の電子密度を測定することができなかった。融合前ｇｐ４１の安定性を高める重要
な置換は、ＲＳＶ−Ｆの安定化Ｓ２１５Ｐと構造的に相同な位置に位置しているＩ５５９
Ｐである。ｇｐ４１ Ｉ５５９Ｐは構造が不可視であるが、ベースヘリックスと上に乗っ
たヘリックスとの間のヒンジループ中の位置は、融合前ＲＳＶ−Ｆのヒンジループ中の２
１５位ときわめて似ている（図２）。Ｉ５５９Ｐは６ＨＢ融合後コンフォメーションを不
安定にするように設計されたが、融合前ＲＳＶ Ｆにおいて２１５位のプロリンがα４−
α５ヒンジのヒンジ運動を阻害するのと同様に、５５９位のプロリンはα６−α７ループ
のヒンジ運動を防止する（Ｋｒａｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ８１４３（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ９１４
３）。この２種の無関係なクラスＩ融合タンパク質の類似性により、ＲＲ１のリフォール
ディングにおけるきわめて重要なステップとしてヒンジの重要性が明らかになる。それは
また、不安定なヒンジループを安定化することが、クラスＩ融合タンパク質の不安定な融
合前コンフォメーションの安定化を成功させる戦略であることも示す。このように、ヒン
ジループに、好ましくはベースヘリックスの比較的近傍にプロリンを導入することは、ク
ラスＩ融合タンパク質の融合前コンフォメーションを安定化するための共通の解決策とし
て使用することができ、これにより、クラスＩ融合タンパク質を優れたワクチン成分にす
ることになる。
本発明によって、いくつかのクラスＩ融合タンパク質、特に、インフルエンザＨＡ、レ
トロウイルスのエンベロープタンパク質およびエボラＧＰのように、融合前の構造が解明
されているクラスＩ融合タンパク質について、安定化したヒンジループが設計された。こ
れらの例のすべてについて、ベースヘリックスへのヒンジループＣ末端のプロリン残基が
融合前コンフォメーションを安定化することが本発明によって示されている。したがって
、クラスＩ融合タンパク質のベースヘリックスを同定し、ＲＳＶ ＦおよびＨＩＶ ｇｐ
４１のヒンジループ中の安定化プロリンの位置を基に、他のヒンジループ中の安定化プロ
リンのおおよその位置を推定した（図２および表１）。
したがって、本発明は、融合前コンフォメーションで安定化した、組換え融合前クラス
Ｉ融合タンパク質を提供する。本発明の安定なクラスＩ融合前タンパク質は融合前コンフ
ォメーションであり、すなわちそれは融合タンパク質の融合前コンフォメーションに特異
的なエピトープを含む（提示する）。融合前コンフォメーションのタンパク質に特異的な
エピトープは、融合後コンフォメーションでは提示されないエピトープである。いかなる
特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、クラスＩ融合タンパク質の融合前
コンフォメーションは、天然のビリオンに発現するタンパク質上のエピトープと同じエピ
トープを含有することができ、したがって、防御中和抗体を誘発する利点を備え得ると考
えられる。したがって、特定の実施形態では、本発明のタンパク質は融合前に特異的なモ
ノクローナル抗体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。
本発明により、クラスＩ融合タンパク質は、ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在す
るヒンジループ中で、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基の変異によって、特に１つま
たは複数の特定の疎水性アミノ酸残基からプロリン（Ｐｒｏ）への変異によって安定化す
ることができることが示された。表２は、いくつかのクラスＩ融合タンパク質のヒンジル
ープを含む領域のアミノ酸配列を開示している。実際のヒンジループは表２の下線部の配
列に相当する。
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質はレトロウイルスのエンベロープタンパ
ク質である。
特定の実施形態では、レトロウイルスのエンベロープタンパク質はＨＩＶ−１エンベロ
ープタンパク質である。特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列：
Figure 2021045138
 の中に含まれる。
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、ヒン
ジループ中に、５５５位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ｌｅｕの
変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は
、ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏへの変異、５５６位のア
ミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａか
らＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は
、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けは完全長ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質におけるアミノ酸
残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５５５位、５５６位および／または５５
８位のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−１エン
ベロープタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、５５５位、５５６位および／または５５８位のアミノ
酸残基がプロリンである配列番号９のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩＶ−１エン
ベロープタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、安定な融合前ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、さらに５５
９位にプロリンを含む。
特定の実施形態では、レトロウイルスのエンベロープタンパク質はＨＩＶ−２エンベロ
ープタンパク質である。
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列：
５３８ ＱＳＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮ
ＬＱＳＲＶ ５７８（配列番号３０）の中に含まれる。
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は、ヒン
ジループ中に、５５３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または５５４位のアミノ酸
残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ａｌａの変異、および／または５５７位のア
ミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定なＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は、ヒン
ジループ中に、５５３位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、５５４位のアミノ酸
残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異、５５６位のアミノ酸残基ＡｌａからＰｒｏヘの変異、お
よび／または５５７位のアミノ酸残基ＶａｌからＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質は
、
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＰＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３１）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＰＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３２）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＰＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３３）；およ
び
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＰＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３４）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けは完全長ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質におけるアミノ酸
残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５５３位、５５４位、５５６位および／
または５５７位のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＩ
Ｖ−２エンベロープタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、５５３位、５５４位、５５６位および／または５５７
位のアミノ酸残基がプロリンである配列番号３５のアミノ酸配列を含む、安定な融合前Ｈ
ＩＶ−２エンベロープタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質はフィロウイルス融合タンパク質（ＧＰ
）である。
特定の実施形態では、フィロウイルスＧＰタンパク質はエボラウイルスＧＰタンパク質
である。
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列
Figure 2021045138
 の中に含まれる。
特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジル
ープ中に、５７７位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５７９位のアミノ酸残
基Ｌｅｕの変異を含む。特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタ
ンパク質は、ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基ＴｈｒからＰｒｏヘの変異、お
よび／または５７９位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定なエボラウイルスＧＰタンパク質は、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けは完全長エボラウイルスＧＰタンパク質におけるアミノ酸残基
の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５７７位および／または５７９位のアミ
ノ酸残基がプロリンである、安定な融合前エボラウイルスＧＰタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、５７７位および／または５７９位のアミノ酸残基がプ
ロリンである配列番号１３のアミノ酸配列を含む、安定な融合前エボラウイルスＧＰタン
パク質を提供する。
特定の実施形態では、フィロウイルスＧＰタンパク質はマールブルグウイルスＧＰタン
パク質である。
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）はアミノ酸配列
Figure 2021045138
 の中に含まれる。
特定の実施形態では、本発明によるマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジル
ープ中に、５７８位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５８０位のアミノ酸残
基Ｇｌｕの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明によるマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、ヒンジル
ープ中に、５７８位のアミノ酸残基ＴｈｒからＰｒｏヘの変異、および／または５８０位
のアミノ酸残基ＧｌｕからＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定なマールブルグウイルスＧＰタンパク質は、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けは完全長マールブルグウイルスＧＰタンパク質におけるアミノ
酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、５７８位および／または５８０位のアミ
ノ酸残基がプロリンである、安定な融合前マールブルグウイルスＧＰタンパク質を提供す
る。
特定の実施形態では、本発明は、５７８位および／または５８０位のアミノ酸残基がプ
ロリンである配列番号１７のアミノ酸配列を含む、安定な融合前マールブルグＧＰタンパ
ク質を提供する。
特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質は、インフルエンザＡウイルスのインフ
ルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である。特定の実施形態では、インフルエン
ザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、系統発生群１のインフルエンザＡウイルスのＨ
Ａタンパク質である。特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タン
パク質はＨ１ ＨＡタンパク質である。
インフルエンザＨＡタンパク質は、通常、ＨＡ１ドメイン（約３２９アミノ酸残基を含
む）およびＨＡ２ドメイン（約１７５アミノ酸残基を含む）から構成される。
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）は、アミノ酸配列３８
Figure 2021045138
 の中に含まれる。
特定の実施形態では、ＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６
３位（ＨＡ２の番号付け）のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または７３位のアミノ酸
残基Ｌｅｕの変異を含む。
特定の実施形態では、ＨＡタンパク質は、ヒンジループ中に、６３位のアミノ酸残基Ｐ
ｈｅからＰｒｏヘの変異、および／または７３位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変
異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｈ１ ＨＡタンパク質は、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けはＨＡ２ドメインにおけるアミノ酸残基の番号付けに関連して
いることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの６３位および／または
７３位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの６３位および／または７３位のアミ
ノ酸残基がプロリンである配列番号２１のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパ
ク質を提供する。
特定の実施形態では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、系統発生
群２のインフルエンザＡウイルスのＨＡタンパク質である。特定の実施形態では、インフ
ルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質はＨ３ ＨＡタンパク質である。
特定の実施形態では、ヒンジループ（下線部）は、アミノ酸配列
Figure 2021045138
 の中に含まれる。
特定の実施形態では、安定なインフルエンザＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ
（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または８２位のアミノ酸
残基Ｖａｌの変異を含む。
特定の実施形態では、安定なインフルエンザＨＡタンパク質は、ＨＡ２のヒンジループ
（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基ＰｈｅからＰｒｏヘの変異および／または８２
位のアミノ酸残基ＶａｌからＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｈ３ ＨＡタンパク質は、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けはＨＡ２ドメインにおけるアミノ酸残基の番号付けに関連して
いることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２ドメインの７２位および／または
８２位のアミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、７２位および／または８２位のアミノ酸残基がプロリ
ンである配列番号２５のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、クラスＩ融合ポリペプチドは、インフルエンザＢウイルスのイン
フルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである。
特定の実施形態では、ヒンジループは、アミノ酸配列
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮＥＩＬ
ＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２６）
の中に含まれる。
特定の実施形態では、安定なＨＡポリペプチドは、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）
中に、６２位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または７２位のアミノ酸Ｌｅｕの変異
を含む。
特定の実施形態では、安定なＨＡポリペプチドは、ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）
中に、６２位のアミノ酸残基ＬｅｕからＰｒｏヘの変異および／または７２位のアミノ酸
ＬｅｕからＰｒｏヘの変異を含む。
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前Ｂ ＨＡタンパク質は、
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＰＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮＥＩＬ
ＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２７）；および
ＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＰＨＮＥＩＬ
ＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤ（配列番号２８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸残基の番号付けは完全長インフルエンザＢウイルスＨＡ２タンパク質における
アミノ酸残基の番号付けに関連していることが、当業者には理解されるであろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２の６２位および／または７２位の
アミノ酸残基がプロリンである、安定な融合前ＨＡタンパク質を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ２の６２位および／または７２位のアミノ酸残基
がプロリンである配列番号２９のアミノ酸配列を含む、安定な融合前ＨＡタンパク質を提
供する。
したがって、本発明によれば、安定な融合前クラスＩタンパク質は、野生型クラスＩ融
合と比較して、ヒンジループ中に少なくとも１つの安定化するための変異を含む。本出願
の全体にわたって使用される場合、アミノ酸位置は、完全長クラスＩ融合タンパク質の配
列を参照して（またはインフルエンザＨＡタンパク質についてはＨＡ２ドメインを参照し
て）付与される。配列アラインメントは、当該技術分野で周知の方法を使用して、例えば
ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＢｉｏｅｄｉｔまたはＣＬＣ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈによって行うこと
ができる。
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、また
は例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれ
らの変異体のいずれであってもよく、または例えばノルロイシンなど、タンパク質中に天
然には見出されないいずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、その特性に基づい
て、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性ま
たは疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタン
パク質−タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン
残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステ
イン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキ
シブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の略語お
よび特性を示す。
特定の実施形態では、安定な融合前クラスＩタンパク質は完全長である。
特定の実施形態では、安定な融合前クラスＩタンパク質は可溶性タンパク質、例えば外
部ドメインまたは外部ドメインのサブドメインをベースにした可溶性タンパク質である。
タンパク質に対する変異は、慣例の分子生物学手順により行い得ることが当業者にはわ
かるであろう。本発明による変異は、好ましくは、これらの変異を含まないクラスＩ融合
ポリペプチドと比較して、融合前クラスＩポリペプチドの発現レベルが増加し、および／
または安定性が高くなる。
本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは安定である、すなわち、例
えば精製、凍結融解サイクル、および／または保存などの、ポリペプチドの処理を行って
も、融合後コンフォメーションへと容易に変化しない。
特定の実施形態では、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは、変
異のないクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドと比較して、４℃での保存時の安定性が高
くなっている。特定の実施形態では、ポリペプチドは、４℃での保存時に、少なくとも３
０日間、好ましくは少なくとも６０日間、好ましくは少なくとも６カ月間、より一層好ま
しくは少なくとも１年間安定である。
特定の実施形態では、本発明によるクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドは、前記変異
のないクラスＩ融合タンパク質ポリペプチドと比較して、熱に曝されたときに安定性が高
い。特定の実施形態では、クラスＩ融合タンパク質ポリペプチドの融合前コンフォメーシ
ョンは、５５℃の温度、好ましくは５８℃の温度、より好ましくは６０℃の温度で少なく
とも３０分間熱に安定である。「熱に安定」とは、ポリペプチドが、少なくとも３０分間
、高温（すなわち、５５℃以上の温度に曝された後も依然として少なくとも１つの融合前
特異的エピトープを提示することを意味する。
特定の実施形態では、タンパク質は、適切な製剤緩衝剤中で１〜６回の凍結融解サイク
ルに供された後も、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド
配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提
示される。
本発明は、本発明による融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子をさらに提供
する。
好ましい実施形態では、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細
胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドン最適化の方法は既
知であり、これまでに記述されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレ
ット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドン
で置換される場合に、配列はコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましく
ないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用され
る頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において、好ましくないコド
ンと比べて使用される頻度が高いコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は
、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏ
ｎに見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほ
とんどまたはすべての好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられる。好ま
しくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列に使用される。好まし
いコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポ
リペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。当業者が慣例の技術を使
用して、ポリペプチドを発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映
するように、核酸分子がコードするポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置
換を行い得ることも、理解される。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列を
コードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌク
レオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
核酸配列は、慣例の分子生物学技術を使用してクローン化することができ、またはＤＮ
Ａ合成により新規に作製することができ、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クロー
ニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐ
ｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、慣例の手順を使用して実施す
ることができる。
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形
態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者
に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細
胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細
胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的
に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使
用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、目的の核酸の転写に使用することが
できるいずれのベクターでもよい。本発明による好適なベクターは、例えば、Ａｄ２６ま
たはＡｄ３５などのアデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニ
アウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発
現ベクターを選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。
融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞も本発明の一部を形成
する。融合前クラスＩタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ
．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしく
はトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成する
ことができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態では
、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細
胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本
発明の融合前クラスＩタンパク質などの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でその
クラスＩタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資
する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるポリペプチド発現を可能にすること
を含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であっ
てもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発
現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を
得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。プロモーターは構成
的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を
含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が、目的
のタンパク質、ここでは融合前クラスＩタンパク質を発現するように慣例的に選択するこ
とができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ぶ）は、宿主細胞に天然には存
在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入
される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば
、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さら
なる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使
用可能であり、それらは当業者に公知であり、例えば、それらは、ウイルス、哺乳動物、
合成のプロモーターなどを含んでもよい。真核細胞内での発現を得るのに適したプロモー
ターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細
書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロ
モーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナ
ル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書
）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用されてい
る発現ベクターが当該技術分野で商用供給源から入手可能であり、例えば、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系列、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓのｐＭＳＣＶ
およびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがあり、こ
れらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適なプロモーター
および／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することが
できる。
細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した
細胞、および懸濁培養を含む、いずれのタイプの細胞培養でもよい。大抵の大規模懸濁培
養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ工程または流加工程とし
て操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、また
好適でもある。好適な培地も当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得るこ
と、または標準プロトコルに従って注文生産することが可能である。培養は、例えば、バ
ッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター
内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は既知である（例えばＴｉｓｓ
ｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅ
ｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０
００，ＩＳＢＮ ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
本発明は、上記のような融合前クラスＩタンパク質および／または核酸分子、および／
またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、クラスＩタンパ
ク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在し
ないエピトープを提示する融合前クラスＩタンパク質を含む組成物を提供する。本発明は
また、このような融合前クラスＩタンパク質をコードする核酸分子および／またはベクタ
ーを含む組成物も提供する。本発明は、上記のような融合前クラスＩタンパク質および／
または核酸分子、および／またはベクターを含む免疫原性組成物をさらに提供する。本発
明はまた、前記クラスＩタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための、本発明に
よる安定化した融合前クラスＩタンパク質、核酸分子、および／またはベクターの使用も
提供する。さらに、クラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための方
法であって、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質および／または核酸分子、およ
び／またはベクターを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、前記クラ
スＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明によ
る融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターも提供する。さらに
、前記クラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製
造するための、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質および／または核酸分子、お
よび／またはベクターの使用を提供する。特定の実施形態では、本発明による融合前クラ
スＩタンパク質はワクチンとして使用するためのものである。
本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベクターは、例
えば、前記クラスＩ融合タンパク質を含むウイルスを原因とする疾患または病態のスタン
ドアロンの処置および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイ
ルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防処置および／または治療処置と
組み合わせて、使用することができる。
本発明は、本発明による融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／またはベク
ターを利用して、対象のウイルス感染を防止および／または処置する方法をさらに提供す
る。特定の実施形態では、対象のウイルス感染を防止および／または処置する方法は、そ
れを必要とする対象に、上記の融合前クラスＩ融合タンパク質、核酸分子および／または
ベクターの有効量を投与するステップを含む。治療有効量とは、前記クラスＩ融合タンパ
ク質を含むウイルスによる感染に起因する疾患または病態を防止する、寛解させる、およ
び／または処置するのに有効なクラスＩ融合タンパク質、核酸分子またはベクターの量を
指す。防止は、ウイルスの伝播の阻害もしくは低減、または前記ウイルスによる感染に関
連した症状の１つもしくは複数の発症、進展もしくは進行を阻害もしくは低減することを
包含する。本明細書で使用される寛解とは、目に見えるもしくは認知できる疾患の症状、
ウイルス血症、またはウイルス感染の他の任意の測定可能な徴候の低減を指すことができ
る。
ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載の融合前クラスＩ融合タ
ンパク質、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤
とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という
用語は、担体または賦形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与する対象に望
ましくない影響も悪影響も何ら引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容
される担体および賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇ
ｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］
；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ
Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；お
よびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，
３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐ
ｒｅｓｓ［２０００］を参照）。融合前クラスＩポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾
燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが好
ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によ
って調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。
溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。
特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数種のアジュバントをさら
に含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントが当該技術
分野で公知である。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では
同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数種の物質と定義される。こ
れに関連して、アジュバントは、本発明のクラスＩ融合タンパク質に対する免疫応答を増
強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび
／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水
中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公
開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免
疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；
国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレッ
ト、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６
２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホ
リルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ
含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物
のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原自体またはＣＤ１
ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、
ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると、免疫応
答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組
み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜
１．０ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、アジュバントとして含む。
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
実施例１
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の不安定な融合前コンフォメーションを安定化する
ために、ヒンジループ中の５５５位、５５６位および５５８位（ＨＸＢ２の番号付けによ
る）のアミノ酸残基をプロリン残基に置換した。エンベロープの全ｇｐ１４０発現、三量
体の性質（三量体のパーセンテージ）および三量体の全収量を、既知の安定化Ｉ５５９Ｐ
置換を有する変異体（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２，ｓｕ
ｐｒａ）およびヒンジループ中にプロリン置換のないエンベロープタンパク質と比較した
。三量体のパーセンテージ、収量および安定性を、ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡおよ
び／またはＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して測定した。野生型ヒンジループ、単Ｐｒｏ置換、
二重Ｐｒｏ置換および三重Ｐｒｏ置換の一部を表３に示す。
ＨＩＶ−１ ＥｎｖコンセンサスＣ配列の生成
ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ配列はクレードＣに基づくコンセンサス配列に基づくものとした。
したがって、アラインメントをＬｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からダウンロードした（
ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ。全部で３，４３４配列）。Ｌｏｓ
Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶデータベースウェブサイトのコンセンサスメーカーの中で、Ｃ−ク
レードＥＮＶ（１，２５２配列）のみを使用した。
安定化ＳＯＳ修飾（５０１Ｃ−６０５Ｃ）を有するコンセンサスＣに基づいた組換えタ
ンパク質は、下記のように、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）に発現させた。ＥＬＩＳＡに使用したＥｎｖタンパク質は、Ｃ末端Ｃタグおよび追加の
Ｉ２０１Ｃ−Ａ４３３Ｃ変異を含有していた（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕ
ｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，（２０１５），２２（７）：５２２−５３１）。ＡｌｐｈａＬ
ＩＳＡおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳに使用したＥｎｖタンパク質は、Ｃ末端のＳｏｒｔＡ−Ｆ
ｌａｇ−３５ＧＳ−Ｈｉｓタグを含有していた。製造元の説明書に従い、ＥｘｐｉＦｅｃ
ｔａｍｉｎｅ２９３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞に一過性
トランスフェクトし、振盪培養器中で３７℃および８％ＣＯ２にて培養した。ＨＩＶエン
ベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を含有する培養上清を、トランスフェクト後３日目（Ａｌ
ｐｈａＬＩＳＡ用）または５日目（ＥＬＩＳＡおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳ用）に回収し、滅
菌濾過した。ＣタグのあるＥｎｖを、Ｃタグ親和性クロマトグラフィーを使用して精製し
、ＳｏｒｔＡ−Ｆｌａｇ−３５ＧＳ−ＨｉｓタグのあるＥｎｖを、ガランサス・ニバルス
（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｕｓ）レクチンクロマトグラフィーを使用して精製し
、次いでＳＥＣ−ＭＡＬＳを行った。ガラントゥス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉ
ｖａｌｉｓ）−レクチンカラム（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＡＬ−１２４３、ロットＺ０３
２５）を初回の精製に適用し、その後ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム
（ＧＥ）を残留汚染物質の除去のための仕上げ工程に適用する２段階精製プロトコルによ
って、組換えＨＩＶ ｅｎｖタンパク質を精製した。初回のレクチン工程では、培養上清
を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５で希釈し、４ｍｌ ＣＶの
Ｔｒｉｃｏｒｎ１０−５０レクチンアガロースカラムに分速４ｍｌで通過させた。その後
、カラムを４カラム体積（ＣＶ）の４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７
．５で洗浄し、４ＣＶの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ マンノピロ
ノシド（Ｍａｎｎｏｐｙｒｏｎｏｓｉｄｅ）ｐＨ７．５を１．６ｍＬ／分の上向流で溶離
した。溶離液を、スピン濃縮器（ｓｐｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（５０Ｋ，Ａｍ
ｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質を、ｓｕｐ
ｅｒｄｅｘ２００カラムを使用し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７
．４をランニングバッファーとして使用して、さらに精製した。２番目のピークはＨＩＶ
ｇｐの１４０三量体を含有していた。このピークを含有する画分を再びプールし、ＯＤ
２８０を使用してタンパク質濃度を測定し、使用するまで４℃で保存した。バンドの同定
は、ウエスタンブロッティング（示さず）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびウエスタンブロッ
トを使用して検証した。細胞培養上清または精製したタンパク質サンプルを、４〜１２％
（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、１Ｘ ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、還元条件下または非還元条件下にて解析し、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットした。すべての手順を、製造元
の説明書に従って行った。純度解析のために、ゲルをＫｒｙｐｔｏｎ Ｉｎｆｒａｒｅｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＳＹＰＲ
Ｏ Ｒｕｂｉタンパク質染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。ブロットを抗Ｈｉｓ−ＨＲ
Ｐでプローブした。ゲルおよびブロット膜をＯｄｙｓｓｅｙ装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ）でスキ
ャンし、画像はＯｄｙｓｓｅｙ３．０ソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して解析した
。
ＥＬＩＳＡに投入するための全Ｅｎｖ発現レベルをＣタグ精製クロマトグラムの曲線下
面積の計算によって求めた。ＣタグのあるＥｎｖを、Ｈｉｓタグのある抗ＣタグＶＨＨを
使用して捕捉した。精製したタンパク質の正確な三量体のコンフォメーションを、ＥＬＩ
ＳＡにおけるＰＧＴ１４５抗体への結合によって確認した。１００％三量体のＥｎｖを対
照として使用して三量体のパーセンテージを計算した（図３Ａ）。三量体の収量は、三量
体のパーセンテージを全Ｅｎｖ発現レベルに乗じて計算し、１と設定したＩ５５９Ｐを基
準として正規化した（図３Ｂ）。置換したものはすべて、ヒンジループ中にプロリン置換
のないタンパク質と比較して、三量体のパーセンテージおよび収量が高い。二重置換はす
べて、Ｉ５５９Ｐ変異体と比較して、三量体のパーセンテージおよび特に三量体の収量が
高い。これらの発見に基づいて、三重変異体Ｌ５５６Ｐ、Ａ５５８Ｐ、Ｉ５５９Ｐを構築
し、Ｉ５５９Ｐならびに二重変異体Ｌ５５６Ｐ、Ｉ５５９ＰおよびＡ５５８Ｐ、Ｉ５５９
Ｐと比較した。これらの変異体は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して無細胞の上清中で解析
した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡはビーズをベースにした近接アッセイであり、ドナービーズの高エ
ネルギー放射によって生成した一重項酸素分子が、およそ２００ｎｍ以内の距離にあるア
クセプタービーズに移動する。その後、次々と起こる一連の化学反応により、化学発光シ
グナルが生成する（Ｅｇｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（
２００８），１：２−１０）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイでは、コンスト
ラクトにＦｌａｇ−Ｈｉｓタグを（間に３５ＧＳリンカーを用いて）備えた。ＨＩＶコン
ストラクトをＥｘｐｉ２９３細胞中に発現させ、これを９６ウェルプレート（２００μｌ
／ウェル）中で３日間培養した。未処理の上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡバッファー（ＰＢ
Ｓ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１２０倍希釈した。そ
の後、この希釈液１０μｌをハーフエリア９６ウェルプレートに移し、アクセプタービー
ズ４０μｌと混合し、ドナービーズおよびＰＧＴ１４５と混合した。ＰＧＴ１４５の配列
はＰＤＢファイル３Ｕ１Ｓに由来し、Ｅｎｖ（フューリン無添加）のように発現させ、Ｍ
Ａｂ ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。ビーズを
十分に混合してから使用した。室温で、振盪せずに２時間インキュベートした後、シグナ
ルをＮｅｏ（ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。ドナービーズを、ｍＡｂに結合することができ
るＰｒｏｔＡ（Ｃａｔ＃：ＡＳ１０２Ｍ、Ｌｏｔ＃１８３１８２９、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプタービーズを抗Ｈｉｓ抗体（Ｃａｔ＃：ＡＬ１
１２Ｒ、Ｌｏｔ＃２０３６８６０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートして、
タンパク質のＨｉｓタグを検出した。タンパク質収量の定量化には、ニッケルをコンジュ
ゲートしたドナービーズ（Ｃａｔ＃：ＡＳ１０１Ｍ、Ｌｏｔ＃：２０２７４９８、Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と抗Ｆｌａｇ抗体を有するアクセプタービーズ（Ｃａｔ＃：ＡＬ１
１２Ｒ、Ｌｏｔ＃：２０３６８６０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とを一緒にした組合せ
を使用した。平均偽シグナルを、様々なＥｎｖタンパク質について測定したＡｌｐｈａＬ
ＩＳＡカウントから減算した。参照としてＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ骨格を使用し、全データ
セットをＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰシグナルで割って、シグナルを、当該骨格を基準として正
規化した。これらの正規化したシグナルで、定量化のために得られた正規化したシグナル
を割って、三量体のパーセンテージを得た。骨格三量体のパーセンテージを、ＳＥＣ−Ｍ
ＡＬＳの結果に従って３０％に設定した。
正確な三量体のコンフォメーションを、ＰＧＴ１４５抗体結合に結合させることによっ
て確認し、発現レベルを、ＳｏｒｔＡ−Ｆｌａｇ−３５ＧＳ−Ｈｉｓタグを検出すること
によって定量化した。三量体のパーセンテージは、ＰＧＴ１４５シグナルを定量化シグナ
ルで割って計算した（図３Ａ）。三量体の収量は、ＰＧＴ１４５シグナルを、１と設定し
たＩ５５９Ｐのシグナルを基準として正規化することによって、ＡｌｐｈａＬＩＳＡから
導いた（図３Ｂ）。三重変異体は、他のすべての変異体と比較して、三量体のパーセンテ
ージおよび収量が最も高い。ガランサス・ニバルス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｕ
ｓ）レクチン精製したＩ５５９ＰおよびＬ５５６Ｐ、Ｉ５５９Ｐの、三量体のパーセンテ
ージおよび収量を、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＯｐｔｉｌａｂ Ｔ−ｒＥＸ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄ
ｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗｙａｔｔ）に連結したｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ（Ｗｙ
ａｔｔ）装置を使用する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および多角度光散乱
（ＭＡＬＳ）解析を使用して確認した。全部で４０μｇのタンパク質を、ランニングバッ
ファー（１５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中
で１ｍＬ／分にて平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加えた。データをＡｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージで解析
し、分子量計算は屈折率シグナルから導いた。ＳＥＣ−ＭＡＬＳクロマトグラムによる三
量体含有量は、曲線下面積を計算することによって求め、ＥＬＩＳＡおよびＡｌｐｈａＬ
ＩＳＡと同程度の結果が得られた（図４Ａ）。三量体の安定性は、６０℃で１時間インキ
ュベートした未処理の上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ中のＰＧＴ１４５結合を使用して判定し
た。熱安定性アッセイについては、２０μｌの未処理の上清を、ＰＣＲブロック中で６０
℃にて１時間加熱した。プレートを最高速度で５分遠心分離して、凝集体を除去した。未
処理の上清および熱処理した上清を４０倍希釈した。次いで、定量化のために三量体の特
異的抗体としてＰＧＴ１４５、およびニッケル／Ｆｌａｇを使用して、上記のようにＡｌ
ｐｈａＬＩＳＡアッセイを行った。
インキュベーション後の三量体の全個体数のパーセンテージは、インキュベーション前
のＰＧＴ１４５シグナルおよびインキュベーション後のシグナルを分割して計算した。二
重変異体および三重変異体はすべて、三量体の安定性がＩ５５９Ｐ変異体より高い（図４
Ｂ）。これらの結果から、レトロウイルスのＨＩＶ−１のクラスＩ融合タンパク質につい
てヒンジ安定性が成功していることがわかる。
実施例２
フィロウイルス融合タンパク質ＧＰの融合前コンフォメーションを安定化するために、
ヒンジループ中の５７５位、５７６位、５７７位、５７９位、５８１位および５８３位の
残基をプロリンに置換し、エボラＧＰの発現レベル、多量体の性質および安定性を、それ
ぞれＮａｔｉｖｅＰＡＧＥおよび示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）を使用して入手した。図
５は、５７５位、５７６位、５７７位、５７９位、５８１位および５８３位でプロリン置
換したエボラＧＰ変異体由来の上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ解析を示す。図５Ａに示すよ
うに、５７７位および５７９位で置換した変異体のみが、野生型配列と比較して発現が多
く、三量体含有量が多かった。野生型、Ｔ５７７Ｐ変異体およびＬ５７９Ｐ変異体の、三
量体および単量体のバンドを判定し（図５Ｂ）、それらの相対的パーセンテージを計算し
た（図５Ｃ）。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルシステム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、一過性トランスフェクトした細胞由来の上清を解析し
た。その後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅで染色した。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲルを、Ｂ
ｉｏｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰを使用してスキャンした。定量化は、Ｂｉｏｒａｄ
ｓ Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用し、「レーンおよびバンド」解析ツールを使
用して行った。したがって、タンパク質レーンが強調され、目的のタンパク質バンドが選
択される。強調されたバンドの強度をソフトウェアが計算し、それらの相対量が計算され
た。
次に、ＨＩＳタグ精製したＧＰ変異体を、温度安定性についてＤＳＦで試験した。タン
パク質を、９６ウェルオプティカルｑＰＣＲプレート中でＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ蛍光
染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５０）と混合した。最適な染料およ
びタンパク質の濃度を実験によって決定した。タンパク質の希釈はすべてＰＢＳで行い、
減算参照用として染料のみを含有する陰性対照サンプルを使用した。測定はｑＰＣＲ装置
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７）により、次のパラメータ、す
なわち毎秒０．０１５℃の速度での２５℃から８５℃までの温度勾配を使用して行った。
データは連続的に取得した。Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅシグナルの最初の陰性派生物が、
８５度までの温度勾配中に幾度か間隔をおいて測定された。ＶｉｉＡ７アウトプット（Ｓ
ｙｐｒｏアッセイ用に使用した機械）の構文解析をし、サンプル情報を融解曲線データと
マージするＲスクリプトを使用して、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅアッセイの生データを解
析した。Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを使用して、データから対照を減じた（Ｓｙｐｒ
ｏ Ｏｒａｎｇｅを有するバッファー）。次いで、それにより融解曲線の最大値と最小値
を決定し、曲線を０〜１００の値に正規化する。二重反復試験から二重反復を平均化し、
Ｔｍを最大値の半分に決定する。融解温度（シグナルが最大値の５０％に到達する点）は
、Ｓｐｏｔｆｉｒｅを使用してデータあてはめをしてから、野生型タンパク質（６１．５
℃）およびＴ５７７Ｐ変異体（６４℃）について決定することが可能である。あてはめを
したデータを図６に示す。Ｔ５７７Ｐ置換を有する変異体は野生型タンパク質より高い温
度安定性を示した。
Ｔ５７７Ｐの安定化効果の普遍性を試験するために、５７７Ｐ置換を、エボラＭａｙｉ
ｎｇａ株（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０６６２４６．１
）、エボラＳｕｄａｎ Ｇｕｌｕ株（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
：ＹＰ＿１３８５２３．１）のＧＰ中でも評価した。図７に示すように、プロリン置換に
より、フィロウイルスＧＰの発現レベルおよび三量体含有量が増加した。これらの結果は
、ヒンジ安定性が、エボラウイルスのクラスＩ融合タンパク質についても成功しているこ
とを示す。
実施例３
インフルエンザの融合ドメインは、シアル酸（ヘマグルチニンの官能基）への結合を担
う頭部ドメイン（ほとんどがＨＡ１）および融合ドメインを含有するステムドメイン（ほ
とんどがＨＡ２）を有するヘマグルチニンタンパク質中に隔離されている。インフルエン
ザヘマグルチニン融合ドメインの安定性を試験するために、半安定なステム領域に相当し
、ＨＡ２外部ドメインおよびＨＡ１のフラグメントを含有する、いわゆるミニＨＡ（＃４
６５０）（Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ Ａｕｇｕｓ
ｔ，２０１５）中に点変異を作製した。インフルエンザミニヘマグルチニン４６５０の半
安定な融合前コンフォメーションを安定化するために、ＨＡ２ Ｓｅｒ７３をＬｅｕまた
はＰｒｏに置換して７１位のグリカンを除去し、ヒンジループ（Ｂループ）中の、疎水性
を強固にするプロリン残基対疎水性ロイシン残基の効果を試験した。ミニヘマグルチニン
は頭部ドメインを含有しておらず、リシンは本来Ｂループと頭部ドメインとの間の保存塩
橋に含まれるため、Ｌｙｓ６８をＧｌｎ６８に置換した変異体を作製した。頭部が除去さ
れているため、塩橋はなく、リシンを中性のグルタミンに変更し得る。組換えタンパク質
を２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞中に発現させた（下記のとおり）。ミニヘマグルチニ
ン変異体の安定性を、タンパク質の多量体含有量が測定されるＥＬＩＳＡによって入手し
た。トランスフェクトした細胞の上清を、多量体ＥＬＩＳＡ中で試験した。プレートをス
テム特異的広域中和ＭＡｂ ＣＲ９１１４でコーティングした（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ．
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１２），３３７（６１００）：１３４３−８）。上清を
滴定し、コーティングしたプレートでインキュベートした。洗浄後、捕捉した多量体をビ
オチン化ＣＲ９１１４と共にインキュベートした。次にウェルを、ＨＲＰをコンジュゲー
トしたストレプトアビジンと共にインキュベートし、次いでＨＲＰ基質を添加した（Ｉｍ
ｐａｇｌｉａｚｚｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５）。図８は、ヒンジルー
プ（Ｂループ）中にＰ７３を有する変異体の方がＬ７３を有する変異体より多量体発現が
多かったことを示す。加えて、ミニ−ＨＡ＃４６５０の６３位のＴｙｒからＰｒｏへの置
換も、多量体発現がほぼ２倍であった（図８Ｃ）。これらの結果は、ヒンジ安定性が、オ
ルトミクソウイルスインフルエンザＨＡのクラスＩ融合タンパク質についても成功してい
ることを示す。
実施例４
タンパク質コンストラクトの発現
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ０８８５４）またはＧｅｎｅ Ａ
ｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でコンストラク
トを合成し、コドン最適化した。コンストラクトは、ｐＣＤＮＡ２００４にクローンした
か、または部位特異的変異生成およびＰＣＲを含む標準方法で生成し、配列決定した。製
造元の説明書に従って、ＨＥＫ−Ｅｘｐｉ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、タン
パク質をインサートしたｐＣＤＮＡ２００４プラスミド（およびＨＩＶ Ｅｎｖの場合、
９０％ｅｎｖおよび１０％フューリン−ｐＣＤＮＡ２００４）で一過性トランスフェクト
し、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間
遠心して、細胞および細胞片を除去した。次いで、０．２２μｍの真空フィルターを使用
して、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで４℃で保存した。
Figure 2021045138
Figure 2021045138
Figure 2021045138
配列
シグナルペプチドを有するＨＩＶ−１ ＨＸＢ２ ｇｐ１６０（配列番号９）。
Figure 2021045138
ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質（配列番号３５）。
Figure 2021045138
エボラＧＰ（配列番号１３）（ＭＡＹＩＮＧＡ−７６株）
Figure 2021045138
マールブルグＧＰ（配列番号１７）
Figure 2021045138
ヘマグルチニンインフルエンザＡウイルス（グループ１）（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９
／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号２１）。
Figure 2021045138
ヘマグルチニンインフルエンザＡウイルス（グループ２）Ｋ７Ｎ５Ｌ２＿９ＩＮＦＡ（配
列番号２５）。
Figure 2021045138
ヘマグルチニンインフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８
）（配列番号２９）
Figure 2021045138
ヘマグルチニンインフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８）（配列番号２９）
Figure 2021045138
以下の態様を包含し得る。
［１］ ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中に、１つまたは複数の変異を含む、安定な融合前クラスＩ融合タンパク質。
［２］ 前記クラスＩ融合タンパク質がフィロウイルス融合Ｆタンパク質である、上記［１］に記載のタンパク質。
［３］ 前記フィロウイルスＦタンパク質がエボラウイルスＦタンパク質である、上記［２］に記載のタンパク質。
［４］ ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異および／または５７９位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、上記［３］に記載のタンパク質。
［５］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＰＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲ（配列番号１１）；および
ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＰＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤＦＬＬＱＲ（配列番号１２）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエボラウイルスＦタンパク質である、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［６］ 前記フィロウイルスＦタンパク質がマールブルグウイルスＦタンパク質である、上記［２］に記載のタンパク質。
［７］ ヒンジループ中に、５７８位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５８０位のアミノ酸残基Ｇｌｕの変異を含む、上記［６］に記載のタンパク質。
［８］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＰＥＥＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＡＲ（配列番号１５）；および
ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＴＥＰＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤＦＬＬＡＲ（配列番号１６）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマールブルグウイルスＦタンパク質である、上記［６］または［７］に記載のタンパク質。
［１０］ 前記クラスＩ融合タンパク質がレトロウイルスのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、上記［１］に記載のタンパク質。
［１１］ ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａの変異を含む、上記［１０］に記載のタンパク質。
［１２］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号３）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号４）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩ（配列番号５）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号６）；
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号７）；および
ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴＲＶ（配列番号８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、上記［１０］または［１１］に記載のタンパク質。
［１３］ 前記タンパク質が、クラスＩ融合タンパク質が、レトロウイルスのＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である、上記［１］に記載のタンパク質。
［１４］ ヒンジループ中に、５５３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または５５４位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ａｌａの変異、および／または５５７位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、上記［１３］に記載のタンパク質。
［１５］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＰＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３１）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＰＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３２）；
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＰＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３３）；および
ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＰＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３４）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である、上記［１３］または［１４］に記載のタンパク質。
［１６］ 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、上記［１］に記載のタンパク質。
［１７］ ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６３位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または７３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、上記［１６］に記載のタンパク質。
［１８］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、上記［１６］または［１７］に記載のタンパク質。
［１９］ 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、上記［１］に記載のタンパク質。
［２０］ ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／または８２位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、上記［１９］に記載のタンパク質。
［２１］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である、上記［１９］または［２０］に記載のタンパク質。
［２２］ 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである、上記［１］に記載のタンパク質。
［２３］ ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６２位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または７２位のアミノ酸Ｌｅｕの変異を含む、上記［２２］に記載のタンパク質。
［２４］ 前記クラスＩ融合タンパク質が、
Figure 2021045138
 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである、上記［２２］または［２３］に記載のタンパク質。
［２５］ 上記［１］〜［２４］のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。
［２６］ 上記［１］〜［２５］のいずれか／一項に記載のタンパク質および／または核酸を含む組成物。

Claims (25)

  1. ベースヘリックスとＲＲ１との間に存在するヒンジループ中に、１つまたは複数の変異
    を含む、安定な融合前クラスＩ融合タンパク質。
  2. 前記クラスＩ融合タンパク質がフィロウイルス融合Ｆタンパク質である、請求項１に記
    載のタンパク質。
  3. 前記フィロウイルスＦタンパク質がエボラウイルスＦタンパク質である、請求項２に記
    載のタンパク質。
  4. ヒンジループ中に、５７７位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異および／または５７９位のア
    ミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＰＥＬＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤ
    ＦＬＬＱＲ（配列番号１１）；および
    ＧＬＩＣＧＬＲＱＬＡＮＥＴＴＱＡＬＱＬＦＬＲＡＴＴＥＰＲＴＦＳＩＬＮＲＫＡＩＤ
    ＦＬＬＱＲ（配列番号１２）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエボラウイルスＦタンパク質である、請求
    項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  6. 前記フィロウイルスＦタンパク質がマールブルグウイルスＦタンパク質である、請求項
    ２に記載のタンパク質。
  7. ヒンジループ中に、５７８位のアミノ酸残基Ｔｈｒの変異、および／または５８０位の
    アミノ酸残基Ｇｌｕの変異を含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＰＥＥＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤ
    ＦＬＬＡＲ（配列番号１５）；および
    ＮＬＶＣＲＬＲＲＬＡＮＱＴＡＫＳＬＥＬＬＬＲＶＴＴＥＰＲＴＦＳＬＩＮＲＨＡＩＤ
    ＦＬＬＡＲ（配列番号１６）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマールブルグウイルスＦタンパク質である
    、請求項６または７に記載のタンパク質。
  9. 前記クラスＩ融合タンパク質がレトロウイルスのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質で
    ある、請求項１に記載のタンパク質。
  10. ヒンジループ中に、５５５位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ｌ
    ｅｕの変異、および／または５５８位のアミノ酸残基Ａｌａの変異を含む、請求項１０に
    記載のタンパク質。
  11. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡ
    ＲＩ（配列番号３）；
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡ
    ＲＩ（配列番号４）；
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡ
    ＲＩ（配列番号５）；
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＰＬＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴ
    ＲＶ（配列番号６）；
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＰＲＡＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴ
    ＲＶ（配列番号７）；および
    ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＬＲＰＩＥＡＱＱＨＭＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＴ
    ＲＶ（配列番号８）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である
    、請求項１０または１１に記載のタンパク質。
  12. 前記タンパク質が、クラスＩ融合タンパク質が、レトロウイルスのＨＩＶ−２エンベロ
    ープタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
  13. ヒンジループ中に、５５３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／または５５４位のア
    ミノ酸残基Ｌｅｕの変異、５５６位のアミノ酸残基Ａｌａの変異、および／または５５７
    位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
  14. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＰＬＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３１）；
    ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＰＤＡＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３２）；
    ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＰＶＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３３）；お
    よび
    ＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＡＰＫＲＱＱＥＬＬＲＬＴＶＷＧ（配列番号３４）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−２エンベロープタンパク質である
    、請求項１３または１４に記載のタンパク質。
  15. 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質
    である、請求項１に記載のタンパク質。
  16. ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６３位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／
    または７３位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異を含む、請求項１６に記載のタンパク質。
  17. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    Figure 2021045138
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ１ヘマグルチニン（ＨＡ
    ）タンパク質である、請求項１６または１７に記載のタンパク質。
  18. 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質
    である、請求項１に記載のタンパク質。
  19. ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、７２位のアミノ酸残基Ｐｈｅの変異および／
    または８２位のアミノ酸残基Ｖａｌの変異を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
  20. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    Figure 2021045138
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ
    ）タンパク質である、請求項１９または２０に記載のタンパク質。
  21. 前記クラスＩ融合タンパク質がインフルエンザＢウイルスのインフルエンザヘマグルチ
    ニン（ＨＡ）ポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
  22. ＨＡ２のヒンジループ（Ｂループ）中に、６２位のアミノ酸残基Ｌｅｕの変異および／
    または７２位のアミノ酸Ｌｅｕの変異を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
  23. 前記クラスＩ融合タンパク質が、
    Figure 2021045138
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むインフルエンザＢウイルスのインフルエン
    ザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載のタンパク
    質。
  24. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。
  25. 請求項１〜２５のいずれか／一項に記載のタンパク質および／または核酸を含む組成物
    。
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