JP2021042127A - 医薬組成物 - Google Patents

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和丈 辻川
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智春 内藤
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Tamami HIGUCHI
珠美 樋口
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貴宏 関口
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Abstract

【課題】ＡＢＨ８遺伝子の発現を優位に阻害することのできる医薬用組成物を提供すること。【解決手段】カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸と、を含む医薬用組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、ＡＢＨ８遺伝子に関連する疾患の治療等に有用な医薬用組成物に関する。
核酸医薬は、疾患に対する作用機序が明確で、副作用も少なく、次世代の医薬品として期待されている。例えば、アンチセンス核酸を用いた核酸医薬は、細胞に存在する標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の一部と相補的にハイブリダイズすることで翻訳を阻害し、標的遺伝子の発現を阻害することができる。その結果、特定の遺伝子または遺伝子群の以上な発現原因となって生じる疾患および症状を軽減または治療することができる。これらの核酸の機能を発現させるためには、核酸医薬を細胞内に送達することが必要である。
核酸を細胞内に効果的に送達する方法としては、一般にキャリア（ベクター）が用いられる。キャリア（ベクター）には、ウイルス性キャリアと非ウイルス性キャリアが挙げられる。ウイルス性キャリアは、病原性、免疫原生および細胞毒性の安全性の面で不明点が多いため、安全性の観点から非ウイルス性キャリアの使用が望まれている。
非ウイルス性キャリアとしてはリポソームなどが知られている。
一方、特許文献１には、ＡＢＨ８遺伝子の発現を阻害することによって癌細胞のアポトーシスが誘導されることが報告されており、ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質としてアンチセンス核酸を使用することが開示されている。
特許第５３５４６３４号公報
しかしながら、アンチセンス核酸の細胞内への送達が不十分であり、ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害効果が満足のいくものではなかった。そのため、ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害効果を十分に得られるような医薬用組成物の開発が望まれている。
本発明は、ＡＢＨ８遺伝子の発現を優位に阻害することのできる医薬用組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸とを含む医薬用組成物により上記課題を解決できることを見出した。
即ち、課題を解決するための手段は以下の通りである。
［１］ カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸とを含む医薬用組成物。
［２］ アンチセンス核酸が、配列番号１の塩基配列である、［１］に記載の医薬用組成物。
［３］ アンチセンス核酸が、架橋型核酸を含む、［１］または［２］に記載の医薬用組成物。
［４］ 架橋型核酸が、ＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）およびＡｍＮＡからなる群より選択される少なくとも１種である、［３］に記載の医薬用組成物。
［５］ リポソームが、更にステロールと、中性脂質と、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質と、を含む、［１］から［４］のいずれか一つに記載の医薬用組成物。
［６］ ステロールがコレステロールであり、中性脂質がホスファチジルコリンであり、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質がポリエチレングリコールで修飾したホスホエタノールアミンである、［１］から［５］のいずれか一つに記載の医薬用組成物。
［７］ 中性脂質がジパルミトイルホスファチジルコリンである、［６］に記載の医薬用組成物。
［８］ アンチセンス核酸の配合量が、リポソームの構成脂質成分全量に対して、モル比で１：２００〜１：３９００である、［１］から［７］のいずれか一つに記載の医薬用組成物。
［９］ アンチセンス核酸がリポソームに内包されている、［１］から［８］のいずれか一つに記載の医薬用組成物。
［１０］ カチオン性脂質が、下記一般式（１）；
Figure 2021042127
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物である、［１］から［９］のいずれか一つに記載の医薬用組成物。
［１１］ 抗癌剤用途である、［１］から［１０］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［１２］ 癌が膀胱癌である、［１１］に記載の医薬組成物。
［Ａ］ カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸とを含む医薬用組成物を投与することを含む、癌の処置方法。
［Ｂ］ 抗癌剤の製造のための、カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸との使用。
本発明の医薬用組成物は、低い細胞毒性を有する。また、標的細胞内に迅速に取り込まれ、効率よくアンチセンス核酸が放出されるため、ＡＢＨ８遺伝子の発現を優位に阻害することができる。そのため、ＡＢＨ８遺伝子に関連する疾患の治療に有用な医薬用組成物を提供することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
（１）ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
本発明の医薬組成物は、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸を含む。
ＡＢＨ８遺伝子とは、ＡＢＨ８タンパク質をコードする遺伝子である。
ＡＢＨ８遺伝子の転写産物とは、ＡＢＨ８遺伝子を鋳型として酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）によって合成されたＲＮＡの総称である。
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸としては、ある対象となるＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドを有し、そのポリヌクレオチドが当該領域の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる核酸のことを意味する。本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。
本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
本発明で用いられる核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖またはリン酸バックボーンなどの少なくとも一部が修飾されていてもよく、塩基部の少なくとも一部が修飾されていてもよい。
糖部が修飾されている非天然型核酸としては、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルＲＮＡ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸、架橋型核酸などが挙げられる。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するものなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
リン酸バックボーンが修飾されている非天然型核酸としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体などが挙げられる。
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸は、架橋型核酸を含むことが好ましい。架橋型核酸としてはＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ、ＥＮＡ（エチレン架橋ＮＡ）、ｃＥｔＢＮＡ、ＡｍＮＡ（アミド型ＢＮＡ）などが挙げられる。本発明のアンチセンス核酸としては、ＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）およびＡｍＮＡからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
Figure 2021042127
Figure 2021042127
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写集結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できるかぎりにおいて、完全に相補的でなくてもよい。
例えば、ＡＢＨ８遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的である。コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物に対して約７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは約９０％以上、よりさらに好ましくは約９５％以上の相補性を有する。
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸としては、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドが最も好ましい。
配列番号１：５’−ＡＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣ−３’
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸は配列番号１の配列を有し、且つ、配列中に上述の架橋型核酸を含むことが好ましい。また、アンチセンス核酸中に架橋型核酸が５塩基程度含まれていることがより好ましく、アンチセンス核酸中の５’末端側に連続して架橋型核酸が３塩基含まれ、且つ、５’末端側から数えて１３番目と１４番目に架橋型核酸を含むことが更に好ましく、５’末端側から数えて１４番目のシトシンが５−メチルシトシンの架橋型核酸であることがより更に好ましい。更に、アンチセンス核酸のリン酸バックボーンはホスホロチオエートであることが好ましい。
本発明の医薬組成物において、アンチセンス核酸の配合量は、リポソームの構成脂質成分全量に対して１：２００〜１：３９００であることが好ましく、１：８００〜１：３９００であることがより好ましい。また、アンチセンス核酸はリポソームに内包されていることが好ましい。
（２）カチオン性脂質を含有するリポソーム
本発明の医薬用組成物は、カチオン性脂質を含有するリポソームを含む。
リポソームにカチオン性脂質を含有することで、アニオン性であるアンチセンス核酸を安定に保つことができる。
［カチオン性脂質］
本発明のカチオン性脂質としては、下記一般式（１）で表される化合物が好ましい。
Figure 2021042127
 式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基を意味し、好ましくは、炭素数１４〜１８のアルキル基であり、より好ましくはヘキサデシル基である。
一般式（１）で表される化合物は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する。アミノ基は静電的な相互作用によりアンチセンス核酸を安定に保つことができる。また、イミダゾイル基は、低いｐＨでプロトン化することで正電荷を有するようになる。したがって、一般式（１）で表される化合物をリポソームに導入することにより、リポソームと細胞膜またはエンドソーム膜との融合が容易に起こり、標的細胞内でアンチセンス核酸が放出されやすくなる。
一般式（１）で表される化合物は、特に限定されないが、例えば下記の方法により合成することができる。
Figure 2021042127
 式中、ＰＧは保護基を表し、Ｘは活性エステルを構成する脱離基を表す。Ｒ１およびＲ２は、上記と同様である。
すなわち、適切な保護基により保護されたヒスチジンの活性エステル（Ａ）と、アミン誘導体（Ｂ）を塩基存在下で反応させ、化合物（Ｃ）を得た後、適切な脱保護方法によって、一般式（１）で表される化合物を合成することができる。
ここで、ヒスチジンの活性エステル（Ａ）において使用できる保護基としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の保護基などが挙げられる。具体的には、Ｂｏｃ基（tert-ブトキシカルボニル基）、Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）などが好ましい例として挙げられる。
使用できる活性エステルの例としては、フェニルエステル、トリフルオロフェニルエステル、ペンタフェニルエステル、ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを挙げることができ、原料入手性または安定性の観点から、ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ましい。
使用できる塩基としては、無機塩基、有機塩基を挙げることができる。無機塩基の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを挙げることができ、有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどを挙げることができる。使用する塩基は、反応に用いるヒスチジンの活性エステル（Ａ）の保護基によって、適切な塩基を用いることが好ましい。
使用できる溶媒としては、特に限定されないが、一般的な有機溶媒を用いることができる。具体的には、エーテル系溶剤、エステル系溶剤、アミド系溶剤、ハロゲン系溶剤を用いることができ、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤が好ましい例として挙げられる。
使用できる脱保護反応としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の方法などが挙げられる。
本発明において、一般式（１）で表される化合物としては、式（２）で表される化合物（２−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル−３−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）プロパンアミド）［本明細書中において化合物Ａとも称する］を使用することがより好ましい。
Figure 2021042127
本発明において、一般式（１）で表される化合物の配合量は、医薬用組成物に含まれるリポソームの構成脂質成分全量に対して１５ｍｏｌ％以上６０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下であるがより好ましい。
本発明の医薬用組成物に含まれるリポソームには、カチオン性脂質に加えて、更にステロール、中性脂質、およびポリエチレングリコール鎖を有する脂質を含むことが好ましい。
［ステロール］
本発明の医薬組成物に含まれるリポソームは、ステロールを含むことが好ましい。ステロールは、膜流動性を低下させる特性を有するため、リポソーム膜の安定化剤として機能する。
本発明に用いられるステロールとしては、特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど）、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル。コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテルなどを挙げることができる。これらの中でもコレステロールが好ましい。
本発明において、ステロールの配合量は、医薬用組成物に含まれるリポソームの構成脂質成分全量に対して１０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、１５ｍｏｌ％以上３０ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。
［中性脂質］
本発明の医薬組成物に含まれるリポソームは、中性脂質を含むことが好ましい。本発明に用いられる中性脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、セラミドなどが挙げられ、ホスファチジルコリンが好ましい。また、中性脂質としては、単独でも、複数の異なる中性脂質を組み合わせても良い。
ホスファチジルコリンとしては、特に限定されないが、大豆レシチン（ＳＰＣ）、水添大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、卵黄レシチン（ＥＰＣ）、水添卵黄レシチン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＣ）などが挙げられ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が好ましい。これらの中でも、相転移温度の観点から、ホスファチジルコリンとしては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンとしては特に限定されないが、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジテトラデシルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサデシルホスファチジルエタノールアミン、ジオクタデシルホスファチジルエタノールアミン、ジフィタニルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
スフィンゴミエリンとしては、特に限定されないが、卵黄由来スフィンゴミエリン、牛乳由来スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
セラミドとしては、特に限定されないが、卵黄由来セラミド、牛乳由来セラミドなどが挙げられる。
本発明に用いられる中性脂質には、中性脂質の加水分解物であるリゾ脂質が含まれていてもよい。本発明においては、リゾ脂質の含有量が多いほど優れた薬効が得られるため好ましい。リゾ脂質の含有量は、中性脂質に対して０．１ｍｏｌ％以上３０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、１ｍｏｌ％以上２０ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。
本発明において、中性脂質の配合量は、医薬用組成物に含まれるリポソームの構成脂質成分全量に対して３ｍｏｌ％以上５５ｍｏｌ％以下であることが好ましい。
［ポリエチレングリコール鎖を有する脂質］
本発明の医薬組成物に含まれるリポソームは、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質を含むことが好ましい。ポリエチレングリコール鎖を有する脂質としては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、ジアルキルグリセロールポリエチレングリコール誘導体、コレステロールポリエチレングリコール誘導体、セラミドポリエチレングリコール誘導体などが挙げられ、ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミンが好ましい。
ポリエチレングリコール鎖の重量平均分子量は、５００〜５０００が好ましく、７５０〜２０００がより好ましい。ポリエチレングリコール鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。
本発明において、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質の配合量は、医薬用組成物に含まれるリポソームの構成脂質成分全量に対して３ｍｏｌ％以上５５ｍｏｌ％以下であることが好ましい。
［リポソーム］
本発明の医薬組成物に含まれるリポソームとしては、多重リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、巨大一枚膜リポソームなどの構造が含まれるが、特に限定されない。
脂質形成の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームの脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持つ構造などを確認することができる。また、エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認することができる。
本発明の医薬組成物に含まれるリポソームの粒子径は特に限定されないが、キュムラント平均粒子径が好ましくは１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、より好ましくは５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは７５ｎｍ以上３５０ｎｍ以下である。粒子径の測定方法は、特に限定されないが、一般的な方法（例えば、動的散乱法、レーザー回折法など）により測定することができる。
本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンス核酸の配合量は、リポソームを構成する成分全量に対するモル比で、１：２００〜１：３９００であることが好ましく、１：８００〜１：３９００であることがより好ましい。
本発明の医薬組成物の製造法は特に限定されないが、好ましい製造法としては、後述の製造法である。
本発明の医薬組成物の好ましい製造法としては、下記一般式（１）；
Figure 2021042127
 （Ｒ１およびＲ２は、上記と同様である）で表される化合物、ステロール、および中性脂質およびポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、アルコール、およびエステルを含む油相を加熱溶解する工程（ａ）；
工程（ａ）で得た油相と、アンチセンス核酸を含む水相と、を混合する工程（ｂ）；
工程（ｂ）で得た油相および水相を含む混合液（以下、油相−水相混合液と称することがある）を冷却し医薬組成物を晶出する工程（ｃ）；
工程（ｃ）で得られた油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程（ｄ）；により調製される方法である。
上述の製造法により得られた医薬組成物は、必要に応じてサイジングまたは濃縮などを行うことができる。なお、油相とは、一般式（１）で表される化合物、ステロール、中性脂質およびポリエチレングリコール鎖を有する脂質からなる群より選択される少なくとも１種の脂質、アルコール、およびエステルを混合して得られる組成物中に含まれる油性成分を意味する。
工程（ａ）において、油相を加熱する際の温度は、４０℃以上７０℃以下であることが好ましく、４５℃以上６５℃以下であることがより好ましい。
工程（ｂ）において、水相は、アンチセンス核酸を、水または緩衝液に溶解することで得ることができる。必要に応じて酸化防止剤などの成分を添加することができる。水相と油相を混合する比率（質量比）は、３．０：１．０〜１．０：１．０が好ましく、１．６：１．０〜１．１：１．０がより好ましい。
工程（ｂ）において、水相と油相を混合する際の温度は、４０℃以上７０℃以下であることが好ましく、４５℃以上６５℃以下であることがより好ましい。また、混合する時間は、液全体が均一になっていることが確認できればよく、特に限定されない。また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。
工程（ｃ）において、油相−水相混合液を冷却し医薬組成物を晶出する工程では、油相−水相混合液の冷却条件は１０℃以上３０℃以下が好ましく、１５℃以上２５℃以下がより好ましい。
工程（ｄ）において、油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法により除去することができる。
上述の製造法によって得られる医薬組成物は、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングの方法は、特に限定されないが、エクストルーダーなどを用いて粒子径を小さくすることができる。
本発明の医薬組成物は、抗癌剤用途として使用することができる。抗癌剤として使用する場合、たとえば、癌の発生、または転移・着床、再発を防止する予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
本発明の医薬組成物が抗癌剤用途である場合、癌の種類としては、ＡＢＨ８遺伝子が関連する癌が挙げられる。ＡＢＨ８遺伝子が関与する癌としては、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌などが挙げられるが、膀胱癌用の抗癌剤が好ましい。
本発明の医薬組成物が抗癌剤用途である場合には、その投与方法は特に限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤、軟膏剤または注射剤などの形態で経口または非経口で投与することができる。なお、上述の医薬組成物の剤型については、常法に従って調整することができる。
本発明の医薬組成物は、注射剤での投与方法が好ましく、注射による局所投与方法がより好ましい。
本発明の医薬組成物が抗癌剤用途である場合には、その投与量としては、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などによって異なる。一般的には、医薬組成物の投与量としては、例えば、一回の投与について体重１ｋｇあたり０．０００００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ぶことが可能であるが、これらの範囲に限定されるものではない。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［１］実施例１、３、８の調製
油相の調整
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、化合物Ａ、コレステロール（Chol）、Ｎ-（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１、２-ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（PEG- DSPE）を、２６／２６／４４／４のモル比となるように、それぞれ３７ｍｇ、３０ｍｇ、３３ｍｇ、２２ｍｇ量り取り、エタノールを０．３ｍＬ、酢酸エチルを０．７ｍＬ加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相０．５２５ｍＬに、後述のアンチセンス核酸５ｍｇを滅菌水０．２５２ｍＬで溶解した核酸水溶液０．０２ｍＬ、さらに滅菌水を０．２９２ｍＬ、２００ｍＭヒスチジン溶液を０．３１３ｍＬ添加し、５５℃で１０分間過熱した。その後攪拌しながら室温で放冷した。つづいて１００ｍＭヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール／酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子（以下、核酸保持脂質粒子と称することがある）を得た。
［２］実施例２の調製
実施例２は、核酸水溶液０．０１ｍＬ、滅菌水を０．３０２ｍＬ加えた以外は実施例１、３と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［３］実施例４の調製
実施例４は、核酸水溶液０．０４ｍＬ、滅菌水を０．２７２ｍＬ加えた以外は実施例１、３と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［４］実施例５の調製
実施例５は、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、１２／４０／４４／４のモル比となるようにした以外は実施例２と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［５］実施例６の調製
実施例６は、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、１２／４０／４４／４のモル比となるようにした以外は実施例１、３と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［６］実施例７の調製
実施例７は、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、１２／４０／４４／４のモル比となるようにした以外は実施例４と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［７］実施例９の調製
実施例９は、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、リゾホスファチジルコリン（Lyso lipid）、パルミチン酸を、２３／２５／４３／４／３／３のモル比となるようにした以外は実施例１，３，８，と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［８］実施例１０の調製
実施例１０は、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、リゾホスファチジルコリン、パルミチン酸を、２０／２５／４２／４／５／５のモル比となるようにした以外は実施例１，３，８，と同様の方法で調製し、目的とする脂質粒子分散液を得た。
［９］比較例１の調製
比較例１は後述の核酸を600ｎＭになるように培地で希釈した。
［１０］比較例２の調製
比較例２はLipofectamine 3000 Reagent 0.2μＬを培地4.8 μＬに希釈し、P3000TM Reagent 0.3μＬと4.7μＬの核酸溶液（濃度12762 ｎＭ）の混ぜた液と混和することで、10μＬの核酸-脂質分散液を得た。この液を90μＬの培地に希釈した。
実施例２〜１０は以下の配列のアンチセンス核酸を使用した。
５'−Ａ(Ｌ)＾Ｇ(Ｌ)＾Ｔ(Ｌ)＾ｃ＾ｃ＾ｔ＾ｇ＾ｃ＾ａ＾ｇ＾ｇ＾ｃ＾Ａ(Ｌ)＾５(Ｌ)＾ｃ−３’ （配列番号２）
配列番号２の小文字のアルファベットはＤＮＡを表し、 「Ｎ(Ｌ)」はＬＮＡを表し、 「５(Ｌ)」は５−メチルシトシンのＬＮＡを表し、「＾」はホスホロチオエートを表す。
実施例１及び比較例１〜２は以下の配列のアンチセンス核酸を使用した。
５'−Ａ(Ａｍ)＾Ｇ(Ａｍ)＾Ｔ(Ａｍ)＾ｃ＾ｃ＾ｔ＾ｇ＾ｃ＾ａ＾ｇ＾ｇ＾ｃ＾Ａ(Ａｍ)＾５(Ａｍ)＾ｃ−３’ （配列番号３）
配列番号３の小文字のアルファベットはＤＮＡを表し、 「Ｎ(Ａｍ)」はＡｍＮＡを表し、 「５(Ａｍ)」は５−メチルシトシンのＡｍＮＡを表し、「＾」はホスホロチオエートを表す。
脂質粒子の細胞への薬剤暴露
3×10３個のUM-UC-3細胞（ヒト膀胱癌細胞株）を血清含有培地に希釈し播種した96穴プレートに対し、翌日、培地を一度除去し、血清抜きの培地に60-1000 ｎＭの濃度の核酸内包リポソームを希釈した100μＬ交換した。核酸内包リポソームを癌細胞に暴露させてから30分から4時間経過後に薬剤入りの培地を除去し、培養用の血清入りの培地に置き換え、72時間培養した。
生存率測定
上記の方法で薬剤に暴露させた96穴プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中で72時間インキュベートしのち生細胞の測定をした。測定にはCellTiterGloを用い、Envision2104Multilabelreaderを用いて検出した。
結果を表１及び表２に示す。
Figure 2021042127
Figure 2021042127
表１及び表２に示すように、実施例１〜１０は、ＡＢＨ８遺伝子の発現を優位に阻害し、非常に高い癌細胞の増殖抑制効果を示した。

Claims (12)

  1. カチオン性脂質を含有するリポソームと、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸とを含む医薬用組成物。
  2. アンチセンス核酸が、配列番号１の塩基配列である、請求項１に記載の医薬用組成物。
  3. アンチセンス核酸が、架橋型核酸を含む、請求項１または２に記載の医薬用組成物。
  4. 架橋型核酸が、ＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）およびＡｍＮＡからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の医薬用組成物。
  5. リポソームが、更にステロールと、中性脂質と、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質と、を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  6. ステロールがコレステロールであり、中性脂質がホスファチジルコリンであり、ポリエチレングリコール鎖を有する脂質がポリエチレングリコールで修飾したホスホエタノールアミンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  7. 中性脂質がジパルミトイルホスファチジルコリンである、請求項６に記載の医薬用組成物。
  8. アンチセンス核酸の配合量が、リポソームの構成脂質成分全量に対して、モル比で１：２００〜１：３９００である、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  9. アンチセンス核酸がリポソームに内包されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. カチオン性脂質が、下記一般式（１）；
    Figure 2021042127
     （式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基である）で表される化合物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
  11. 抗癌剤用途である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 癌が膀胱癌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
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