JP2021036810A - 組換え牛白血病ウイルス及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】外来遺伝子が挿入された組換え牛白血病ウイルス及びその利用を提供する。【解決手段】牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子が発現可能に組み込まれた、組換え牛白血病ウイルス。【選択図】図１

Description

本発明は、組換え牛白血病ウイルス及びその利用に関する。

牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、感染した牛に地方病性牛白血病（ＥＢＬ）と呼ばれる腫瘍性疾患を引き起こす病原体である。一度ＢＬＶに感染した個体は生涯にわたりウイルスを保有する。また、現時点において、ＥＢＬには有効な治療法が存在しない。そのため、ＢＬＶの感染予防法の開発、ＥＢＬの発症メカニズムの解明、ＢＬＶ感染牛の摘発淘汰基準を設定するための診断法の開発等、ＢＬＶに関連する研究が盛んに行なわれている。これらの研究には、非特許文献１に示されるようなＢＬＶの感染性クローンを作出する技術が活用されている。

ウイルス学分野、特にヒト医学の医薬品研究分野においては、抗ウイルス薬を用いたウイルス病の治療・予防技術が注目されている。そして、抗ウイルス薬の開発時のスクリーニングを効率的に行なうために用いられる、レポーター遺伝子を搭載した遺伝子組換えウイルスを開発する研究も、多くのウイルス種で盛んに行なわれている（非特許文献２）。

Inabe et al. 1998, Virology, Vol.245, 53-64 Tamura et. al. 2018，Journal of Virology, Vol.92, No.2, e01582-17

抗ウイルス薬の開発に用いられる遺伝子組換えウイルスには、野生型ウイルスと同様の構造を有しており、かつ、同様の挙動及び機能を示すことが求められる。しかしながら、ウイルスのゲノムサイズや必須遺伝子等の制限から、外来遺伝子の挿入が難しいウイルス種も存在する。また、ウイルスによっては、外来遺伝子の挿入のためにウイルス遺伝子の一部を欠損させる必要がある。したがって、野生型ウイルス本来の構造、挙動及び機能を保持したまま外来遺伝子を挿入することが困難な場合も多い。

ＢＬＶは、ゲノムサイズが８６００ｂｐ程度で比較的小さいうえに、そのゲノム内にｇａｇ−ｐｒｏ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｒｅｘ、Ｒ３、Ｇ４、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）等の各遺伝子が座上している。したがって、ＢＬＶの野生型ウイルス本来の構造、挙動及び機能を損なうことなく、レポーター遺伝子等の外来遺伝子を導入し、発現させることは困難であった。そのため、レポーター遺伝子が挿入されたＢＬＶ遺伝子組換体に関しては、これまで報告されていない。

このような理由から、ＢＬＶに対する抗ウイルス薬の研究はほとんど行われていないのが現状である。しかしながら、現在、日本国内の３０〜４０％の牛がすでにＢＬＶに感染している状況を考慮すると、ＢＬＶに対する抗ウイルス薬の開発は急務である。そのため、ＢＬＶに対する抗ウイルス薬の開発に不可欠な、レポーター遺伝子が挿入されたＢＬＶ遺伝子組換え体の作製が求められている。

すなわち、本発明の一態様は、外来遺伝子が挿入された組換え牛白血病ウイルス（組換えＢＬＶ）、およびその利用を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明は、以下の一態様を含む。
１） 牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子が発現可能に組み込まれた、組換え牛白血病ウイルス。
２） 牛白血病ウイルスの前記遺伝子配列は、（ａ）配列番号１に示す塩基配列；（ｂ）配列番号１に示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び（ｃ）配列番号１に示す塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列；からなる群より選択されるいずれかの塩基配列で示される、１）に記載の組換え牛白血病ウイルス。
３） 前記外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域である、１）又は２）に記載の組換え牛白血病ウイルス。
４） 前記ｔａｘ遺伝子配列と前記外来遺伝子との間に、ＩＲＥＳ配列が組み込まれた、１）から３）のいずれかに記載の組換え牛白血病ウイルス。
５） 前記外来遺伝子と前記３’末端側のＬＴＲ配列との間に、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列が組み込まれた、１）から４）のいずれかに記載の組換え牛白血病ウイルス。
６） 前記外来遺伝子は、レポーター遺伝子である、４）又は５）に記載の組換え牛白血病ウイルス。
７） 前記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、６）に記載の組換え牛白血病ウイルス。
８） 前記外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１８４番目から第８１８５番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域である、１）から７）のいずれかに記載の組換え牛白血病ウイルス。
９） １）から８）のいずれかに記載の組換え牛白血病ウイルスが発現可能に導入されている、細胞。
１０） 牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子を発現可能に組み込む工程を含む、組換え牛白血病ウイルスの製造方法。
１１） １）牛白血病ウイルスを含む環状の核酸構築物と、当該牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化するための試薬との組合せ、又は、２）牛白血病ウイルスを含む環状の核酸構築物において、当該牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化された核酸構築物、を含む、組換え牛白血病ウイルス製造キット。
１２） １）〜８）の何れか一項に記載の組換え牛白血病ウイルス、又は、９）に記載の細胞を使用する方法であって、外来遺伝子の発現を検出する工程を含む、方法。
１３） 前記外来遺伝子は、牛白血病ウイルス以外のウイルス由来の遺伝子である、１２）に記載の方法。

本発明の一態様によれば、外来遺伝子が挿入された組換えＢＬＶ、及びその利用を提供することができる。

本発明のＢＬＶゲノムの概略を示す模式図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の他の実施例の結果を示す図である。 本発明のさらに他の実施例の結果を示す図である。

以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「ポリペプチド」は、「タンパク質」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。

本明細書中において、「発現」は、遺伝子の転写、及び、転写されたＲＮＡのポリペプチドへの翻訳の両方又は一方を指すものとする。また、本明細書において、「３’末端」とは、遺伝子配列の下流における端部領域又は位置を意味し、「５’末端」とは、遺伝子配列の上流における端部領域又は位置を意味している。

〔組換え牛白血病ウイルス〕
本発明の一実施形態に係る組換え牛白血病ウイルス（以下、組換えＢＬＶとも言う）は、ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子が発現可能に組み込まれた遺伝子構築物である。組換えＢＬＶは、宿主細胞内又は無細胞タンパク質合成系内において発現させた場合に、ＢＬＶの遺伝子配列がコードするタンパク質と、外来遺伝子がコードするタンパク質とを発現する。

ＢＬＶの遺伝子配列は、図１に示すＢＬＶゲノムの全領域が実質的に含まれている遺伝子を意味する。図１は、本発明のＢＬＶゲノムの概略を示す模式図である。図１に示すように、ＢＬＶゲノムは、両末端のＬＴＲ配列間に、ｇａｇ−ｐｒｏ−ｐｏｌ遺伝子配列、ｅｎｖ遺伝子配列、ｒｅｘ遺伝子配列、及びｔａｘ遺伝子配列を、５’末端側からこの順で有している。

ＢＬＶの遺伝子配列は、公知のＢＬＶゲノムの塩基配列と同一であることは要さず、ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成可能なものである限り、公知のＢＬＶゲノムの塩基配列において、一部の塩基が置換、欠失または付加されたものであってもよい。ＢＬＶの遺伝子配列は、宿主細胞内又は無細胞タンパク質合成系内において発現させることで、野生型のＢＬＶが本来備えている構成、挙動及び機能を保持したＢＬＶのウイルス粒子を製造することができることがより好ましい。野生型のＢＬＶが本来備えている構成、挙動及び機能には、ウイルスの粒子構造、宿主細胞に対する感染能力、宿主細胞内における感染メカニズム等が含まれ得る。

ここで、「ＢＬＶの感染性ウイルス粒子」は、野生型のＢＬＶが備える宿主細胞に対する感染能力を備え、粒子構造をとるＢＬＶタンパク質であることが意図される。ＢＬＶの感染性ウイルス粒子は、牛白血病を引き起こす病原性が低下した弱毒株又は病原性が欠失した無毒株であってもよい。ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を製造するために、ＢＬＶの遺伝子配列は、ＢＬＶの機能配列を全て含んでいることが好ましい。

ＢＬＶの遺伝子配列の好ましい一例は、
（ａ）配列番号１に示す塩基配列；
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列；
からなる群より選択されるいずれかの塩基配列からなる。

前記（ａ）の塩基配列に関して、配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＬＣ１６４０８３に登録されているＢＬＶ全長塩基配列を示しており、この塩基配列からなる。

前記（ｂ）の塩基配列に関して、配列番号１に示す塩基配列で示される遺伝子の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント部分ヌクレオチド、他のヌクレオチドとの融合遺伝子等の塩基配列を意図しており、ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成可能である限り、その塩基配列については限定されない。

ここで、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数は、上記機能を失わせない限り、限定されていないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって、欠失、置換、又は付加できる程度の数をいい、１００〜８００塩基であってもよく、通常は５０塩基以内であるが、好ましくは３０塩基以内であり、より好ましくは２０塩基以内であり、さらに好ましくは１０塩基以内であり、最も好ましくは５塩基以内（例えば、５、４、３、２又は１塩基）である。前記（ｂ）の塩基配列に関して、配列番号１において欠失、置換又は付加される塩基は、Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）外の塩基、又は、後述する外来遺伝子挿入領域外の塩基であることが好ましい。

本明細書中において「変異体」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異体を主に意味するが、天然に存在する同様の変異体（バリアント）であってもよい。本明細書において「機能的に同等」とは、対象となる塩基配列で示される遺伝子が、目的とする塩基配列で示される遺伝子と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には当該遺伝子が発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入した遺伝子が所望の機能を有するかどうかは、その変異した遺伝子がＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成するタンパク質を発現させるかどうかを調べることにより判断できる。

前記（ｃ）の塩基配列に関して、配列番号１に示す塩基配列で示される遺伝子の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ヌクレオチド、他のヌクレオチドとの融合遺伝子等の塩基配列を意図しており、ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成可能である限り、その塩基配列については限定されない。前記（ｃ）の塩基配列に関して、配列番号１において変異する塩基は、ＯＲＦ外の塩基、又は、後述する外来遺伝子挿入領域外の塩基であることが好ましい。

塩基配列の同一性とは、塩基配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。配列番号１に示す塩基配列と９１％程度の同一性を有する配列が、ＧｅｎＢａｎｋにＢＬＶとして登録されている。

塩基配列の同一性は、BLASTNのプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。この解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。

上述した配列番号１に示す塩基配列で示される遺伝子の変異体を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、配列番号１に示す塩基配列で示されるポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の変異体を作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡製，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。

（ｔａｘ遺伝子配列）
ｔａｘ遺伝子配列は、ＢＬＶのプロウイルス（ＤＮＡ）において、ｅｎｖ遺伝子配列と３’末端側ＬＴＲ配列との間に位置しており、例えば、配列番号１に示す塩基配列における第７２５２番目から第８１７７番目までの塩基配列が意図される。ｔａｘ遺伝子は、ＢＬＶのようなレトロウイルスにおいて、ウイルス遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子である。

（ＬＴＲ配列）
ＬＴＲ配列は、ＢＬＶゲノムの５’末端側及び３’末端側のそれぞれに位置しており、例えば、配列番号１に示す塩基配列における第１番目から第５３１番目までの５’末端側塩基配列、及び、配列番号１に示す塩基配列における第８１９０番目から第８７２０番目までの３’末端側塩基配列が意図される。ＬＴＲ配列は、ＢＬＶのようなレトロウイルスにおいて、遺伝子の発現に必要なプロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル等のエレメントを含む配列である。

（外来遺伝子挿入領域）
組換えＢＬＶにおける外来遺伝子挿入領域は、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間に位置している。外来遺伝子挿入領域は、発現させたい所望のタンパク質をコードする外来遺伝子を挿入するための領域である。外来遺伝子挿入領域は、野生型のＢＬＶが本来備えている構成、挙動及び機能を損なうことなく、ＢＬＶのタンパク質と、当該領域に挿入した外来遺伝子がコードするタンパク質とを発現させることが可能な領域である。

従来、ＢＬＶゲノムの何れの位置に外来遺伝子を挿入すれば、野生型ＢＬＶの本来の構成、挙動及び機能を保持したまま、外来遺伝子がコードするタンパク質とＢＬＶのタンパク質とを発現させることができるのかは知られていなかった。ＢＬＶはゲノムサイズが比較的小さい上に、そのゲノム上に多くの機能配列が座上しているので、外来遺伝子の挿入による悪影響を受けやすい。したがって、ＢＬＶの野生型ウイルス本来の構成、挙動及び機能を損なうことなく、ウイルスタンパク質及び外来タンパク質を発現させることは容易ではない。

本発明者らは、野生型ＢＬＶの本来の構成、挙動及び機能を保持したまま、ウイルスタンパク質及び外来タンパク質を発現させることを目的として鋭意検討を重ねた。その結果、ＢＬＶゲノムのｔａｘ遺伝子直下に外来遺伝子を挿入することで、ＢＬＶのウイルス粒子を構成するタンパク質と共に、外来遺伝子がコードするタンパク質を発現可能な組換えウイルスが得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明者らは、まず、図１に示すＢＬＶゲノムにおいて、ＯＲＦ等の機能配列を含まない領域Ｘ及び領域Ｙを、外来遺伝子挿入領域の候補として見出した。領域Ｘはｅｎｖ遺伝子直下であり、領域Ｙはｔａｘ遺伝子直下である。実施例に示すように、本願発明者らが、これらの候補領域に外来遺伝子を組み込んだＢＬＶの感染性クローンを作製し、培養細胞に導入したところ、領域Ｙに外来遺伝子を挿入した感染性クローンについてのみ、シンシチウムの形成と外来遺伝子の発現とが認められた。すなわち、領域Ｙであるｔａｘ遺伝子直下が有効な外来遺伝子挿入領域であることが、本発明者らによる検討により初めて見出された。

組換えＢＬＶは、ＢＬＶゲノムにおけるｔａｘ遺伝子直下、すなわち、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間に、外来遺伝子挿入領域を有していることによって、当該外来遺伝子挿入領域に発現可能に組み込まれた外来遺伝子がコードするタンパク質と、ＢＬＶを構成するタンパク質との両方を発現することができる。

組換えＢＬＶでは、ｔａｘ遺伝子直下に外来遺伝子が挿入されていることで、ｔａｘ遺伝子の制御配列の制御下に、ｔａｘ遺伝子とその下流の外来遺伝子とが、同一のｍＲＮＡとして転写される。野生型のＢＬＶは、感染細胞内において潜伏感染状態になるとｔａｘ遺伝子発現が抑制されることが知られている。組換えＢＬＶは、ｔａｘ遺伝子の制御配列依存的に外来遺伝子を発現させるため、感染細胞内において潜伏感染状態になると、ｔａｘ遺伝子発現と連動して、外来遺伝子の発現も低下又は消失し得る。したがって、組換えＢＬＶは、ＢＬＶの活性化−潜伏化を切り替える分子メカニズムを研究及び評価するためのツールとしても有用である。

外来遺伝子挿入領域は、野生型ＢＬＶゲノムにおける当該領域内の塩基を全て含んでいてもよいが、組換えＢＬＶがＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成するタンパク質及び外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させることができる限り、当該領域内の塩基の一部又は全部が欠失又は置換されていてもよいし、外来遺伝子の塩基以外の塩基が付加されていてもよい。

外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域であることが好ましい。配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域は、ＢＬＶゲノムにおけるｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間であって、Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）等の機能配列を含まない領域である。

配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基の領域は、第８１７８番目の塩基から第８１８９番目の塩基までの１２塩基からなる領域であってもよいし、組換えＢＬＶがＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成するタンパク質及び外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させることができる限り、当該領域内の塩基の一部又は全部が欠失又は置換されていてもよいし、外来遺伝子の塩基以外の塩基が付加されていてもよい。

ここで、「対応する塩基」とは、配列番号１に記載の塩基配列とは異なる塩基配列における当該位置に該当する塩基を意味し、ＢＬＶのバリアントなども範疇に包含されることを意味している。より具体的には、例えば、「配列番号Ｘに記載の塩基配列のＹ番目の塩基に対応する塩基」とは、ホモロジー解析により、配列番号Ｘに記載の塩基配列のＹ番目に相当すると特定される塩基を指す。ホモロジー解析の方法としては、例えば、Needleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignmentによる方法や、ClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法が挙げられ、当業者であれば、これら方法に基づき、配列番号Ｘに記載の塩基配列を基準配列として用いて、解析対象の塩基配列中における「対応する塩基」を理解することができる。解析は、デフォルトの設定で行ってもよく、適宜、必要に応じてパラメーターをデフォルトから変更して行ってもよい。

配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域に外来遺伝子が発現可能に組み込まれていることで、組換えＢＬＶは、ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成するタンパク質と共に、外来遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる。

外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１８４番目から第８１８５番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域であることが好ましい。

配列番号１に示す塩基配列の第８１８４番目から第８１８５番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域に外来遺伝子が発現可能に組み込まれていることで、組換えＢＬＶは、ＢＬＶの感染性ウイルス粒子を構成するタンパク質と共に、外来遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる。

組換えＢＬＶにおける外来遺伝子挿入領域は、ＢＬＶゲノムのクローンを鋳型として、外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させることで、形成することができるが、外来遺伝子挿入領域を形成する方法はこれに限定されない。外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーは、ＢＬＶの遺伝子配列において、外来遺伝子挿入領域の両側の数塩基に相補的な配列を付加したプライマーが意図され、例えば、実施例４に記載された、配列番号１３及び１４に示すプライマーが挙げられる。

また、組換えＢＬＶにおける外来遺伝子挿入領域は、ＢＬＶの遺伝子配列を適切な制限酵素により切断することで形成することもできる。

＜外来遺伝子＞
外来遺伝子挿入領域に発現可能に組み込まれる外来遺伝子は、ＢＬＶのウイルスタンパク質と共に発現させるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＢＬＶ由来の遺伝子以外の遺伝子を意図している。外来遺伝子の遺伝子サイズは、６００ｂｐ以上１２００ｂｐ以下であることが好ましく、より好ましくは８００ｂｐ以上１０００ｂｐ以下である。外来遺伝子の遺伝子サイズが、６００ｂｐ以上１２００ｂｐ以下であることによって、ＢＬＶのウイルスタンパク質と共に外来遺伝子がコードする外来タンパク質を好適に発現させることができる。

外来遺伝子は、特に限定されないが、レポーター遺伝子であることが好ましい。レポーター遺伝子がコードするタンパク質をＢＬＶのウイルスタンパク質と共に発現させることで、ＢＬＶの抗ウイルス薬のスクリーニング等のＢＬＶに関する種々の実験に活用することができる。

外来遺伝子挿入領域に組み込むレポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましく、例えば、ＧＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等の公知のレポーター遺伝子を好適に使用可能である。

外来遺伝子は、抗原ペプチドをコードするＢＬＶ以外の遺伝子や、抗原性を有する核酸配列であってもよく、ＢＬＶ以外のウイルス遺伝子の少なくとも一部であることが好ましい。これにより、組換えＢＬＶを、例えば、ＢＬＶ及び他のウイルスに対する多価ワクチンの開発に使用することもできる。

＜ＩＲＥＳ配列＞
外来遺伝子は、ＩＲＥＳ配列と共に外来遺伝子挿入領域に組み込まれていることが好ましい。すなわち、組換えＢＬＶは、ｔａｘ遺伝子配列と外来遺伝子との間に、ＩＲＥＳ配列が組み込まれていることが好ましい。また、より好ましい一態様では、ＩＲＥＳ配列と外来遺伝子とは、同一のＲＮＡとして転写される。

ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列は、ＲＮＡのＣａｐ構造に依存しない翻訳開始を可能とする配列が意図される。ｔａｘ遺伝子配列と外来遺伝子との間にＩＲＥＳ配列を有することで、ＩＲＥＳ配列の下流に位置する外来遺伝子がコードする外来タンパク質が効率よく翻訳される。本明細書において、用語「ＩＲＥＳ配列」は、ＤＮＡについて用いる場合には、ＩＲＥＳ配列に相補的な配列であることを意味している。

ＩＲＥＳ配列としては、公知のものを使用することが可能であり、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルスのようなピコルナウイルス科のウイルス由来のＩＲＥＳ配列、フラビウイルス科のウイルス由来のＩＲＥＳ配列等を好適に使用可能である。ＩＲＥＳ配列は、外来遺伝子の直前（５’末端側）に配置させることが好ましい。

組換えＢＬＶは、ｔａｘ遺伝子の制御配列下にＩＲＥＳ配列と共に外来遺伝子が組み込まれているため、ｔａｘ遺伝子の制御配列の制御下に、ｔａｘ遺伝子とその下流の外来遺伝子とが、同一のｍＲＮＡとして転写されると共に、外来遺伝子がコードする外来タンパク質がｔａｘ遺伝子とは独立して翻訳される。このように、外来遺伝子がＩＲＥＳ配列と共に組み込まれていることによって、組換えＢＬＶは、ＢＬＶ由来の遺伝子発現に影響を与えることなく、外来遺伝子を発現させることができる。

＜ポリＡ配列＞
外来遺伝子は、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列と共に外来遺伝子挿入領域に組み込まれていることが好ましい。すなわち、組換えＢＬＶは、外来遺伝子と３’末端側のＬＴＲ配列との間に、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列が組み込まれていることが好ましい。外来遺伝子と３’末端側のＬＴＲ配列との間に、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列を有することで、外来遺伝子がコードする外来タンパク質が効率よく翻訳される。

ポリＡ配列は、外来遺伝子がコードする外来タンパク質の翻訳を促進するとともに、外来遺伝子の安定性に寄与し得るＲＮＡ配列が意図される。ポリＡ配列に相補的な配列は、ポリＡ配列に転写される配列であり、ポリＴ配列とも称される。また、ポリＡ付加シグナル配列は、転写されるＲＮＡの３’末端にポリＡ配列を付加する配列である。

ポリＡ配列は、少なくとも２個以上のＡ（アデニン）が連続する配列であり、連続するＡの数は特に限定されないが、好ましくは、３個以上３０個以下のＡが連続しており、より好ましくは、５個以上２５個以下のＡが連続しており、さらに好ましくは、１０個以上２０個以下のＡが連続している。また、ポリＡ配列には、Ａ以外にＧ、Ｔ及びＣを１又は数個介在させた状態で備えていてもよい。

外来遺伝子挿入領域には、５’末端側から順に、ＩＲＥＳ配列、外来遺伝子、並びに、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列が組み込まれていることがより好ましい。すなわち、組換えＢＬＶは、ｔａｘ遺伝子直下に、ＩＲＥＳ配列、外来遺伝子、並びにポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列を、５’末端側からこの順に含む遺伝子カセットが組み込まれていることが好ましい。これにより、ＢＬＶ由来の遺伝子発現に影響を与えることなく、外来遺伝子を好適に発現させることができる。

より好ましい一態様では、外来遺伝子とポリＡ配列とは、同一のＲＮＡとして転写され、さらに好ましい一態様では、ＩＲＥＳ配列、外来遺伝子、及びポリＡ配列が、同一のＲＮＡとして転写される。また、ｔａｘ遺伝子配列、ＩＲＥＳ配列、外来遺伝子、及びポリＡ配列がｔａｘ遺伝子の制御配列の制御下に、同一のＲＮＡとして転写されることが好ましい。

〔細胞〕
本発明の一実施形態に係る細胞は、上述した組換えＢＬＶが発現可能に導入されている。すなわち、細胞は、組換えＢＬＶを宿主細胞に導入することによって作製された形質転換細胞、並びに、組換えＢＬＶに感染した宿主細胞である。細胞は、作製された形質転換細胞、感染した宿主細胞、又は、これらの培養後代であってもよい。

組換えＢＬＶを導入する宿主細胞としては、組換えＢＬＶを導入して転写及び翻訳が可能な限り特に限定されないが、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞等が挙げられ、哺乳動物細胞であることが好ましい。哺乳動物細胞として、非特許文献１に例示された細胞を好適に使用可能であり、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＦＬＫ細胞、ＣＯＳ−１細胞、２３ＣＬＮ細胞等が挙げられる。

宿主細胞の形質転換方法については、宿主細胞の種類等に応じて適宜選択すればよく、例えば、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、ＢＬＶ本来の感染力により、組換えＢＬＶを上述した細胞に感染させて形質導入してもよい。

組換えＢＬＶを導入した形質転換細胞及び組換えＢＬＶに感染した宿主細胞は、組換えＢＬＶの発現可能な条件下で培養することで、ＢＬＶのウイルスタンパク質と、外来遺伝子がコードする外来タンパク質とを発現する。組換えＢＬＶに感染した宿主細胞を用いれば、より野生型ＢＬＶに近似した環境でタンパク質を発現させることができる。

〔組換え牛白血病ウイルスの製造方法〕
本発明の一実施形態に係る組換えＢＬＶの製造方法は、ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子を発現可能に組み込む工程を含んでいる。

組換えＢＬＶの製造方法は、ＢＬＶの遺伝子配列におけるｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子を発現可能に組み込むことによって、ＢＬＶのウイルスタンパク質と外来遺伝子がコードする外来タンパク質とを発現することが可能な組換えＢＬＶを製造することができる。

組換えＢＬＶの製造方法においては、ＢＬＶの遺伝子配列において、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間の外来遺伝子挿入領域が開裂したクローンを作製し、この開裂した部分に外来遺伝子のＤＮＡ断片を融合させてもよい。外来遺伝子挿入領域が開裂したＢＬＶのクローンは、例えば、ＢＬＶゲノムのクローンを鋳型として、外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させることで作製することができるが、この方法に限定されない。外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーは、例えば、実施例４に記載された、ｔａｘ遺伝子直下で開裂した感染性クローン全長を増幅するための配列番号１３及び１４に示すプライマーが挙げられる。

組換えＢＬＶの製造方法においては、ＩＲＥＳ配列、レポーター遺伝子等の外来遺伝子、及びポリＡ配列を５’末端側からこの順で含む遺伝子カセットを、外来遺伝子挿入領域に組み込んでもよい。

〔キット〕
本発明の一実施形態に係る組換えＢＬＶ製造キットは、１）ＢＬＶを含む環状の核酸構築物と、当該ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化するための試薬との組合せ、又は、２）ＢＬＶを含む環状の核酸構築物において、当該ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化された核酸構築物、を含んでいる。組換えＢＬＶ製造キットを用いることにより、組換えＢＬＶを簡便に製造することができる。

ＢＬＶを含む環状の核酸構築物は、環状のプラスミドにＢＬＶの遺伝子配列が組み込まれたものが意図される。ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化するための試薬は、ＢＬＶの遺伝子配列を含むプラスミドにおける外来遺伝子挿入領域を切断する制限酵素や、ＢＬＶの遺伝子配列を含むプラスミドを鋳型として外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーが意図される。また、このようなプライマーとして、ＢＬＶの遺伝子配列において、外来遺伝子挿入領域の両側の数塩基に相補的な配列を付加したプライマーが挙げられる。

ＢＬＶを含む環状の核酸構築物における外来遺伝子挿入領域において線状化された核酸構築物は、ＢＬＶの遺伝子配列が組み込まれた環状のプラスミドに対して、上述した外来遺伝子挿入領域において線状化するための試薬を用いて外来遺伝子挿入領域を形成し、線状化された核酸構築物が意図される。

組換えＢＬＶ製造キットは、外来遺伝子挿入領域に組み込む外来遺伝子を含んでいてもよい。組換えＢＬＶ製造キットに含まれる外来遺伝子は、ＩＲＥＳ配列、レポーター遺伝子等の外来遺伝子、及びポリＡ配列を５’末端側からこの順で含む遺伝子カセットであってもよい。また、組換えＢＬＶ製造キットは、外来遺伝子の外来遺伝子挿入領域への相同組換えを行うための試薬を含んでいてもよい。相同組換えを行うための試薬には、ＰＣＲタグが含まれる。

組換えＢＬＶ製造キットは、キットに含まれる材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装品が意図される。また、組換えＢＬＶ製造キットは、組換えＢＬＶを製造するための説明書を備えていることが好ましい。さらに、組換えＢＬＶ製造キットに、組換えＢＬＶを導入する又は感染させる宿主細胞と、当該細胞を培養するための培養容器とを加えた組換えＢＬＶ発現キットも、本発明の範疇に含まれる。組換えＢＬＶ発現キットを用いれば、組換えＢＬＶを発現させることで、ＢＬＶのウイルスタンパク質と外来遺伝子がコードする外来タンパク質を製造することができる。

また、組換えＢＬＶ製造キットに含まれる、ＢＬＶの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のＬＴＲ配列との間の外来遺伝子挿入領域が開裂している組換えＢＬＶに替えて、ＢＬＶゲノムのクローンと、これを鋳型として外来遺伝子挿入領域を形成するためのプライマーとを含む組換えＢＬＶ製造キットについても、本発明の範疇に含まれる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

〔組換えＢＬＶ又は細胞を使用する方法〕
本発明の一実施形態に係る組換えＢＬＶ又は細胞を使用する方法は、上述した本発明の一実施形態に係る組換えＢＬＶの何れか、又は、上述した本発明の一実施形態に係る細胞のいずれかを使用する方法であって、外来遺伝子の発現を検出する工程を含む。また、当該方法において、外来遺伝子は、牛白血病ウイルス以外のウイルス遺伝子の少なくとも一部であってもよい。

組換えＢＬＶ又は細胞を使用する方法において、例えば外来遺伝子としてレポーター遺伝子を用いれば、レポーター遺伝子の発現の程度を観察することでウイルスの活動状況を監視することができる。組換えＢＬＶをウシ等の感受性動物に投与することで、レポーター遺伝子の発現を指標として感染生体内でのウイルスの挙動のリアルタイムイメージングを行うこともできる。

また、外来遺伝子の発現を検出する工程を候補物質の存在下で行うことで、例えば、候補物質の非存在下と比較して発現が抑制される場合には、当該候補物質がＢＬＶのウイルスの活動を抑制する物質（治療薬候補等）であると予測することができる。抗原ペプチドをコードするＢＬＶ以外の遺伝子や、抗原性を有する核酸配列、ＢＬＶ以外のウイルス遺伝子の少なくとも一部を外来遺伝子として組み込んだ組換えＢＬＶを用いれば、例えば、ＢＬＶ及び他のウイルスに対する多価ワクチンの開発に使用することもできる。

本発明の一実施例について以下に説明する。

〔実施例１：ＢＬＶ感染性クローンの構築〕
培養容器より回収したＦＬＫ−ＢＬＶ細胞をＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で処理し、ＢＬＶゲノムを含むｔｏｔａｌ ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として、ＢＬＶ遺伝子（配列番号１）の断片を配列番号２及び３、並びに、配列番号４及び５に示すプライマーセットを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）で増幅した。プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ）を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断処理し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを用いて切断端を脱リン酸化処理した。

上記増幅ＤＮＡ断片及びプラスミドを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合し、大腸菌ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ導入して、配列番号１に示すＢＬＶゲノムをクローニングした感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを得た（配列番号６）。

〔実施例２：ＢＬＶ由来の機能遺伝子を発現しない領域の探索〕
既知の論文報告等の情報をもとに、配列番号１において、ＢＬＶ由来の機能遺伝子がコードされていない領域を探索した。その結果、ｅｎｖ遺伝子およびｔａｘ遺伝子の直下に、機能遺伝子をコードしていない領域が存在することを見出した（図１の領域Ｘ及びＹ）。

ここで、「ｅｎｖ遺伝子直下」とは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＬＣ１６４０８３に登録されているＢＬＶ全長ゲノム配列の第６３７４番から第６３９６番の塩基の範囲のいずれかの領域を指す。また、「ｔａｘ遺伝子直下」とは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＬＣ１６４０８３に登録されているＢＬＶ全長ゲノム配列の第８１７８番から第８１８９番の塩基の範囲のいずれかの領域を指す。

〔実施例３：ＢＬＶゲノムのｅｎｖ遺伝子直下へのＧＦＰ遺伝子の挿入〕
実施例１で構築した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを鋳型として、実施例２で見出したｅｎｖ遺伝子直下で開裂した感染性クローンの全長を、配列番号７及び８に示すプライマーセットを用いてＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、配列番号９及び１０に示すプライマーを用いて、ＩＲＥＳ配列、ＧＦＰ遺伝子及びポリＡ付加シグナル配列を含むＤＮＡ断片を増幅した（配列番号１１）。

これらの増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合し、大腸菌ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ導入して、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ポリＡに相補的な配列をｅｎｖ遺伝子の直下に挿入した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを得た（配列番号１２）。

〔実施例４：ＢＬＶゲノムのｔａｘ遺伝子直下へのＧＦＰ遺伝子の挿入〕
実施例１で構築した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを鋳型として、実施例２で見出したｔａｘ遺伝子直下で開裂した感染性クローンの全長を、配列番号１３及び１４に示すプライマーを用いて、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、配列番号１５及び１６に示すプライマーを用いて、ＩＲＥＳ配列、ＧＦＰ遺伝子及びポリＡに相補的な配列を含むＤＮＡ断片を増幅した（配列番号１７）。

これらの増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合し、大腸菌ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ導入して、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ポリＡに相補的な配列をｔａｘ遺伝子の直下に挿入した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを得た（配列番号１８）。

〔実施例５：培養細胞への感染性クローン導入及びＧＦＰ遺伝子組換えＢＬＶの確認〕
培養容器に播種した２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、実施例１、３及び４で得られた感染性クローンを導入した。感染性クローンを導入した２９３Ｔ細胞を数日間培養し、必要に応じて継代を行った。感染性クローンの導入数日後に、実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて多核融合細胞（シンシチウム）の形成と蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現とを観察した。

結果を図２及び３に示す。図２において、画像１０１０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを導入した２９３Ｔ細胞の実体顕微鏡画像であり、画像１０２０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを導入した２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像である。図３において、画像１０３０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した２９３Ｔ細胞の実体顕微鏡画像であり、画像１０４０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像である。

ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを導入した２９３Ｔ細胞は、画像１０１０に示すようにシンシチウムを形成したが（矢印箇所）、画像１０２０に示すようにＧＦＰによる緑色蛍光は認められなかった。一方、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した２９３Ｔ細胞は、画像１０３０に示すようにシンシチウムを形成すると共に（矢印箇所）、画像１０４０に示すようにシンシチウムと一致してＧＦＰによる緑色蛍光が認められた。なお、図示していないが、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｅｎｖ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した２９３Ｔ細胞は、シンシチウムを形成せず、また、ＧＦＰによる蛍光も認められなかった。

以上の結果から、外来遺伝子をｅｎｖ遺伝子の直下に挿入した場合は組換えＢＬＶは得られないこと、並びに、ＢＬＶのゲノム中に外来遺伝子を挿入する場合には、ｔａｘ遺伝子直下への挿入が適していることが明らかとなった。

〔実施例６：ＢＬＶゲノムのｔａｘ遺伝子直下へのＤｓＲｅｄ遺伝子の挿入〕
実施例１で構築した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶを鋳型として、実施例２で見出したｔａｘ遺伝子直下で開裂した感染性クローンの全長を、配列番号１３及び１４に示すプライマーを用いて、ＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。プラスミドｐＩＲＥＳ２ ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、配列番号１５及び１６に示すプライマーを用いて、ＩＲＥＳ配列、ＤｓＲｅｄ遺伝子及びポリＡに相補的な配列を含むＤＮＡ断片を増幅した（配列番号１９）。

これらの増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合し、大腸菌ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ導入して、ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ−ポリＡに相補的な配列をｔａｘ遺伝子の直下に挿入した感染性クローンｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄを得た（配列番号２０）。

〔実施例７：培養細胞への感染性クローン導入及びＤｓＲｅｄ遺伝子組換えＢＬＶの確認〕
培養容器に播種した２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、実施例６で得られた感染性クローンを導入した。感染性クローンを導入した２９３Ｔ細胞を数日間培養し、必要に応じて継代を行った。感染性クローンの導入数日後、実体顕微鏡又は蛍光顕微鏡を用いて多核融合細胞（シンシチウム）の形成と蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）の発現とを観察した。

結果を図４に示す。図４において、画像１０５０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄを導入した２９３Ｔ細胞の実体顕微鏡画像であり、画像１０６０は、ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄを導入した２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像である。

ｐＵＣ１９／ＦＬＫ−ＢＬＶ／ｔａｘ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄを導入した２９３Ｔ細胞は、画像１０５０に示すようにシンシチウムを形成し（矢印箇所）、シンシチウムと一致してＤｓＲｅｄによる赤色蛍光が認められた。

実施例５及び７の結果から、ＢＬＶゲノムにおいて、ｔａｘ遺伝子直下には様々な外来遺伝子を挿入可能であることが示された。

本発明は、医療分野、製薬分野等に利用することができる。

Claims (13)

1. 牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子が発現可能に組み込まれた、組換え牛白血病ウイルス。
2. 牛白血病ウイルスの前記遺伝子配列は、
   （ａ）配列番号１に示す塩基配列；
   （ｂ）配列番号１に示す塩基配列における、少なくとも１つの塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列；及び
   （ｃ）配列番号１に示す塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列；
   からなる群より選択されるいずれかの塩基配列で示される、請求項１に記載の組換え牛白血病ウイルス。
3. 前記外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１７８番目から第８１８９番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域である、請求項１又は２に記載の組換え牛白血病ウイルス。
4. 前記ｔａｘ遺伝子配列と前記外来遺伝子との間に、ＩＲＥＳ配列が組み込まれた、請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え牛白血病ウイルス。
5. 前記外来遺伝子と前記３’末端側のＬＴＲ配列との間に、ポリＡ配列に相補的な配列又はポリＡ付加シグナル配列が組み込まれた、請求項１から４のいずれか１項に記載の組換え牛白血病ウイルス。
6. 前記外来遺伝子は、レポーター遺伝子である、請求項４又は５に記載の組換え牛白血病ウイルス。
7. 前記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項６に記載の組換え牛白血病ウイルス。
8. 前記外来遺伝子挿入領域は、配列番号１に示す塩基配列の第８１８４番目から第８１８５番目の塩基又は当該塩基に対応する塩基の領域である、請求項１から７のいずれか１項に記載の組換え牛白血病ウイルス。
9. 請求項１から８のいずれか１項に記載の組換え牛白血病ウイルスが発現可能に導入されている、細胞。
10. 牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域に、外来遺伝子を発現可能に組み込む工程
    を含む、組換え牛白血病ウイルスの製造方法。
11. １）牛白血病ウイルスを含む環状の核酸構築物と、当該牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化するための試薬との組合せ、又は、
    ２）牛白血病ウイルスを含む環状の核酸構築物において、当該牛白血病ウイルスの遺伝子配列における、ｔａｘ遺伝子配列と３’末端側のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列との間の外来遺伝子挿入領域において線状化された核酸構築物、を含む、組換え牛白血病ウイルス製造キット。
12. 請求項１〜８の何れか一項に記載の組換え牛白血病ウイルス、又は、請求項９に記載の細胞を使用する方法であって、
    外来遺伝子の発現を検出する工程を含む、方法。
13. 前記外来遺伝子は、牛白血病ウイルス以外のウイルス遺伝子の少なくとも一部である、請求項１２に記載の方法。