JP2020536934A - 呼吸器合胞体ウイルスgタンパク質中央保存領域の立体構造エピトープ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年10月13日に出願された米国特許出願第62/572,271号、2017年11月17日に出願された米国特許出願第62/588,022号、および2018年2月22日に出願された米国特許出願第62/633,999号の利益を主張する。上記の特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2018年10月12日に作成され、サイズが17,500バイトで、388512013700SeqListというタイトルのファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
組換えの態様
本発明の任意のタンパク質またはペプチドは、既知の技術を使用して組換えにより生成され得る。本発明はまた、それらをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにこれらのヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現システム、これらのヌクレオチド配列の発現のための発現システムまたはベクターを含む細胞、ならびにこれらの細胞を培養することおよび産生された結合部分を回収することによりペプチドを生成する方法を含む。原核生物、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞を含む、組換え法で典型的に使用される任意のタイプの細胞を使用することができる。関連するペプチドをコードする1つ以上の組換え分子で形質転換されたヒト細胞(例えば、筋細胞またはリンパ球)も含まれる。
CX3Cケモカインモチーフに基づく活性
全体として可変であるが、RSVG(298残基)には、グリコシル化されない高度に保存された約40アミノ酸の中央保存領域(CCR)が含まれており、ウイルス感染とウイルス病原性の両方で重要な役割を果たすことが示されている。具体的には、RSVGのCCRには、CX3Cケモカインモチーフが含まれ、これがヒトケモカイン受容体CX3CR1への結合を促進し、ヒト気道上皮細胞でのRSV感染を促進するだけでなく、CX3CR1+免疫細胞の輸送に影響するシグナル伝達を調節して気道の鬱血を引き起こす。例えば、RSV Gタンパク質のCCDに対するmAbによる治療は、接種5日後のアイソタイプのコントロール処理マウスと比較して、肺白血球の総数の減少と関連していたが、抗F mAb(Synagis)による治療はBAL細胞の総数を減少しなかった{Caidi,H.,et al.Antiviral Research(2018)154:149−157}。
免疫原
3つの設計目標は、Gタンパク質免疫原の最適化を支配し、それぞれが新しい構造情報によって大幅に促進される。
代替結合部分の開発
立体構造エピトープ模倣体は、それが組換えペプチドであれ、ペプチド模倣体であれ、アプタマーまたは代替足場などの既知の広域中和mAbと同様の活性を持つ非免疫グロブリン結合部分の均一な組成物の効率的な発見を可能にする。そのような模倣体は、優れた安定性、より低い製造コスト(例えば、哺乳動物細胞ではなく細菌での発現による)、およびより単純な吸入送達のための製剤を提供することができる。(エピトープ模倣体は、追加のmAbの同定にも使用できる)ヒトRSVのエピトープ模倣体のホモロジーモデリングを使用して、ウシRSV感染症の治療など、獣医学の適応症に役立つmAbを生成するための類似したエピトープ模倣体を開発することができる。ウシとヒトのRSV Gタンパク質の間のアミノ酸の相同性は30%しかないが、両方のウイルスのGタンパク質は、高度にグリコシル化された2つの可変ドメインが隣接する中央の保存されたシステインヌース領域を持っているという点で類似した特徴を共有する{Guzman,E.and Taylor,G.Mol Immunol(2015)66(1):48−56}。
用途
本発明はまた、本発明の結合部分、変異体または他のペプチドまたはペプチド模倣体を活性成分として含む医薬および動物用組成物に関する。組成物は、緩衝液などの生理学的に適合する好適な賦形剤および他の単純な賦形剤を含む。組成物は、追加の活性成分、特に免疫原の場合はワクチンアジュバントとしての免疫系刺激剤も含み得る。医薬または動物用組成物はまた、米国特許第9,718,875号に記載されているmAbの鼻腔内または吸入送達用の製剤を含む、他の製剤賦形剤を含み得る。
実施例1:タンパク質の生成
A.Fab 3D3およびScFv 2D10の生成
組換えmAb 3D3および2D10は、CHO細胞での一過性トランスフェクションおよび固定化プロテインAによる精製によって生成された。これらのmAbのCDRは、米国特許第8,273,354号の図5Aに開示されており、単鎖Fv配列は、それぞれ配列番号9および10として組換え体生成に使用されるものに含まれる。
B.エピトープの生成
RSVG外部ドメイン(G[ecto])P03423)をコードする合成遺伝子を、N末端TPAシグナル配列とC末端タンデム6ヒスチジンおよびTwin−Strep精製タグを有するpCFにインフレームでクローニングした(残基64〜298を含む配列番号7、UniProtKBエントリー)。G[ecto]はCHO細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、分泌されたG[ecto]はStrepTrapカラムでアフィニティー精製された。
実施例2:ELISAアッセイ
濃度5μg/mL(合計150μL)の精製mAbを、96ウェルELISAマイクロタイタープレート中、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを、0.05%Tween20を含むPBS(PBST)で3回洗浄した。5%BSAのPBSを150μL加え、室温で1時間インキュベートした後、PBSTで3回洗浄して、ウェルをブロックした。1%BSAのPBS中で、5μg/mLの組換えRSVG[ecto]または20μg/mLのRSVG[161−197]を、1%BSAのPBSで1:3に段階希釈した。ウェルを150μLのRSV Gタンパク質と一緒に室温で1時間インキュベートし、プレートをPBSTで3回洗浄した。次いで、プレートを、1%BSAのPBSで1:5000に希釈した150μLのHRP結合HisProbe(ThermoFisher Scientific)と一緒に室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質o−フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD)を0.05Mリン酸−クエン酸緩衝液pH5.0および1.5%過酸化水素に加えて室温で10分間現像した。反応を、2N硫酸と室温で10分間インキュベーションして停止させ、490nmで吸光度を測定した。ELISA実験は、生物学的トリプリケートで行った。
実施例3:免疫原性の試験
本発明のペプチド、変異体およびペプチド模倣体は、以下の基準を使用してマウスモデルで評価される。
CX3CR1のRSVG調節のためのインビトロアッセイは、ヒト単球THP−1細胞の受容体を介した走化性を測定する{Tripp,R.A.et al.Nature Immunology(2001)2:732−738}。このアッセイでは、組換えRSVG[161−197]は、RSVG外部ドメイン全体と同等のレベルで走化性を誘導し、3D3または2D10または3G12とのプレインキュベーションにより、抗CX3CR1ポリクローナル血清によって提供されるものと同等なレベルで、活性が遮断された。表2は、3D3および2D10に関するこの分析の結果を示す。
実施例5:結晶解析による抗体−エピトープ境界面の決定
Fab 3D3−RSVG[162−172]複合体の形成および構造決定RSVGアミノ酸162〜172をコードする実施例1Bの合成ペプチド(UniProtKBエントリーP03423)(配列番号2)を、10mM Tris−HCl pH8.0および150mM NaCl中で17.5mg/mlの実施例1Aの精製Fab 3D3と5モル濃度過剰で混合した。結晶は、23%PEG3350および0.05M酢酸亜鉛のウェル溶液で、4℃でハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。結晶を、26%PEG3350、0.05M酢酸亜鉛、および25%エチレングリコールの凍結保護溶液に移し、液体窒素で瞬間凍結した。回折データは、Advanced Light Sourceのビームライン8.3.1において、1.11503Åの波長を使用して、極低温で収集された。単結晶の回折データは、iMosflmとAimlessで処理された。Fab 3D3−RSVG[162−172]複合体の構造は、Fabホモロジーモデルとの分子置換およびプログラムPHASERによって解析され、PHENIXとCootをそれぞれ使用して構造が精密化され手動により再構築された。最終的なFab 3D3−RSVG[162−172]複合体の構造(PDBコード5WNB)は、次のラマチャンドラン統計値を有した:96.5%favored,3.5%allowed,0%outliers。
図4に示す高親和性抗体2D10および3D3と複合体化したRSVGのCCRタンパク質の構造の決定は、高親和性mAbエピトープを生成する能力を損なうことなく、CX3CR1結合を無効にするRSVG免疫原を設計するためのロードマップを提供する。具体的には、6つの高度に保存されたアミノ酸が同定されており、その側鎖はmAb 3D3および2D10と分子接触しないため、これらのmAbと同様の高親和性mAbの生成に影響を与えることなく置換することができる。したがって、これらの残基は、CX3CR1への結合を妨害するための置換の候補である。一般に、電荷の変化(電荷スイッチ)および/またはサイズまたは形状の変化を与えると、立体障害(立体衝突)が起こり、そのような結合に悪影響が生じると予想される。表4は、RSVGのCCRタンパク質のこれらの残基の代表的な置換の結果を示す。実施例4に記載された走化性アッセイにより測定されるように、6つの代表的な変異体によるCX3CR1機能への影響について試験がなされた。表4は、表示された残基のアミノ酸の標準的な1文字略語を用いて重複アッセイ(標準偏差を使用)の結果をまとめたものである。
実施例7:エピトープ模倣体の安定化
合成とアッセイのためコンビナトリアルケミストリー手法を活用した化学合成ペプチドテクノロジーは、DNAタグと次世代シーケンシングを用いたヒットの逆畳み込みによって非常に大規模なライブラリー(数十億の化合物)の構築とスクリーニングを可能にする進展とともに、エピトープ模倣体を作製する成熟したテクノロジーとなっている{Chan,A.I.,et al.Curr Opin Chem Biol(2015)26:55−61}。例えば、らせん状立体構造は、α−メチル化アミノ酸(例えば、Aib)などの立体構造空間が制限されたアミノ酸の挿入により、せん状エピトープを安定化する側鎖の架橋または「ステープル」により、およびヘリックスキャップと水素結合代替物の使用により、安定化し得る。例としては、水素結合代替物としてのヒドラゾン架橋、Freidinger様ラクタム、ターンを安定させるための偽プロリンなどがある{Estieu−Gionnet,K.and Guichard,G.Exp.Opin.Drug Discov(2011)6:937−963}。
実施例8:非免疫グロブリン結合剤の同定
本発明のペプチド、変異体およびペプチド模倣体は、有効な非免疫グロブリン結合剤を同定するために使用できる。
開示された配列の概要
以下の表で、記載事項に「と付加物」を含むリストの配列は、目的のコード配列に、開始コドン、グリシンスペーサー、ヒスチジンタグなどの発現および/または精製の補助剤、またはTwin−Strepなどの他の精製補助剤が補充されているものを指す{Schmidt,T.G.,et al.Protein Expr Purif(2013)92(1):54−61}。これらを、以下の配列表で詳しく説明する。
配列番号1
長さ:37アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAb 3D3、2D10および3G12によって認識される免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基161〜197]
配列
長さ:11アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAb 3D3によって認識されるがmAb2D10では認識されない免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基162〜172]
配列
長さ:30アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAb2D10によって認識されるがmAb 3D3では認識されない免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基169〜198]
配列
長さ:50アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAb 3D3、2D10、および3G12によって認識される免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基157〜197]
配列
長さ:45アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAbsによって認識される免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基148〜197]
配列
長さ:39アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:mAbsによって認識される免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基161〜195]
配列
長さ:295アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:免疫原
その他の情報:RSV Gタンパク質外部ドメイン[RSV A2株の残基64〜298、GenBank KT992094.1、2つの同義変異(下線)] N末端TPA分泌シグナルおよびC末端6His−2Strepタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:45アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:免疫原を含む
他の情報:RSV Gタンパク質[残基161〜197] N末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびC末端6Hisタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:54アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:免疫原を含む
他の情報:RSV Gタンパク質[残基157〜197] N末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびC末端6Hisタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:45アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:免疫原を含む
他の情報:RSV Gタンパク質[残基148〜197] N末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびC末端6Hisタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:39アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:免疫原
他の情報:RSV Gタンパク質[残基161〜195] N末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびC末端6Hisタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:308アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:単鎖抗体
他の情報:mAb 3D3単鎖Fv(scFv3D3) N末端Bipシグナルシーケンス、内部フレキシブルリンカー、C末端トロンビンプロテアーゼ切断部位、続いて6His−2Strepタグを含む
配列
DNA配列:
長さ:315アミノ酸
型:PRT
生物名:人工配列
特徴:単鎖抗体
他の情報:mAb2D10単鎖Fv(scFv 2D10) N末端Bipシグナルシーケンス、内部フレキシブルリンカー、およびC末端トロンビンプロテアーゼ切断部位、続いて6His−2Strepタグを含む
配列
DNA配列:
Claims (20)
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)Gタンパク質の残基161〜197(配列番号1)、または位置169〜198(配列番号3)、または位置157〜197(配列番号4)、または位置148〜197(配列番号5)、または位置161〜195(配列番号6)のアミノ酸配列を有するペプチドの変異体またはペプチド模倣体(peptidemimetic)であって、それぞれ、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5もしくは配列番号6のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体の活性化に関して減少した活性を有し、
mAb 3D3、および/もしくは2D10および/もしくは3G12と結合し、かつ/または
RSV Gタンパク質に対して免疫反応性の抗体を誘発する、変異体またはペプチド模倣体。 - 抗体への結合時に示される立体構造を保持するように化学的に安定化されている、請求項1に記載の変異体。
- 前記RSV Gタンパク質のアミノ酸162、164、166、177、187、192および/または193に少なくとも1つの置換を含む、請求項1に記載の変異体。
- mAb 3D3、および/または2D10および/または3G12と免疫反応性である、請求項1に記載の変異体またはペプチド模倣体。
- 前記ウイルスのA株とB株との間で保存されているRSV Gタンパク質のエピトープと免疫反応性のサブnM親和性抗体を誘発する、請求項1に記載の変異体またはペプチド模倣体。
- 請求項1に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物またはワクチン。
- 対象におけるRSV感染に対して予防的または治療的効果を発揮する方法であって、そのような効果を必要とする対象に有効量の、請求項5に記載の医薬または動物用組成物またはワクチンを投与することを含む、方法。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体を刺激または阻害する、変異体または模倣体。
- それぞれ、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、請求項8に記載の変異体またはペプチド模倣体。
- 前記刺激または阻害が走化性アッセイで決定される、請求項8に記載の変異体またはペプチド模倣体。
- 請求項8に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物。
- 対象において予防的または治療的効果を発揮する方法であって、そのような効果を必要とする対象に、有効量の、請求項11に記載の医薬または動物用組成物またはワクチンを投与することを含む、方法。
- RSV Gタンパク質の保存領域に対する株非依存性の高親和性および中和活性の特徴を有する結合部分であって、候補結合部分と、図2A、2Bまたは2Cに示された形状を有する立体構造が保持された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含む方法によって同定され、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも100pM程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場(alternative scaffolds)のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、結合部分。
- 請求項13に記載の結合部分を有効成分として含む医薬または動物用組成物。
- 対象におけるRSV感染に関して予防的または治療的処置を提供する方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量の、請求項14に記載の医薬または動物用組成物を投与することを含む、方法。
- 請求項13に記載の結合部分を同定する方法であって、候補結合部分と、図2A、2Bまたは2Cに示された前記形状を有する立体構造的に拘束された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含み、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも100pM程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、方法。
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)Gタンパク質の、残基161〜197(配列番号1)のアミノ酸配列、または位置162〜172(配列番号2)、もしくは位置169〜198(配列番号3)、もしくは位置157〜197(配列番号4)、もしくは位置148〜197(配列番号5)、もしくは位置161〜195(配列番号6)のアミノ酸配列を有するペプチドであって、抗体への結合時に示される立体構造を保持するようにそれぞれ化学的に安定化されているペプチド、あるいは
配列番号1〜6の前記ペプチドのいずれかの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ、配列番号1〜6のいずれかのペプチドと比較して、増強した免疫原性を有するか、または配列番号1〜6のいずれかのペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、変異体またはペプチド模倣体。 - 前記化学的安定化が共有結合により架橋することを含むか、または、前記変異体が前記ペプチドのアッセイで使用するための、若しくは前記ペプチドの精製で使用するための部分と結合されている、請求項17に記載のペプチド。
- 5つ以下のアミノ酸置換および/もしくは欠失および/もしくは付加を含む変異体であり、かつ/またはフラクタルカインに応答するケモカイン受容体を活性化する薬理活性が低下している、請求項17に記載の変異体。
- 前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている、請求項19に記載の変異体。
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