JP2020536848A

JP2020536848A - Ｉｌ−１２産生の刺激による癌の治療

Info

Publication number: JP2020536848A
Application number: JP2020512516A
Authority: JP
Inventors: フェストゥスチャールズモファット、ディヴィッド; ジョンペリー、マーティン; マークアンダートン、スティーブン; ルイーズドリス、クレアー
Original assignee: マクロファージファーマリミテッド
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2020-12-17
Also published as: WO2019043389A1; RU2020111355A; SG11202000565VA; AU2018326668A1; CN111356457A; MA50030A; IL272769A; CA3071550A1; RU2020111355A3; US11382902B2; EP3675851A1; US20200360359A1; MX2020001197A; KR20200129086A; GB201713975D0; BR112020003033A2

Abstract

本発明は、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための化合物及び組成物に関し、当該化合物は、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；及びN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンから選択される。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための化合物に関する。

発明の背景
インターロイキン12(IL-12)は多面発現性サイトカインであり、その作用により自然免疫と獲得免疫が相互接続(interconnection)される。自然免疫と獲得免疫を橋渡しし、IFN-γ（抗癌防御の自然なメカニズムを調整するサイトカイン）の産生を強力に刺激するため、IL-12は腫瘍微小環境における重要なサイトカインである。ヒトのIL-12の主な供給源は、樹状細胞や造血食細胞(hematopoietic phagocytes)（単球、マクロファージ、及び好中球も）などの活性化抗原提示細胞である。生物活性ヘテロダイマーIL-12 p70はNK細胞及びT細胞に作用して、IL-12作用の最も強力なメディエーターであるIFN-γの産生を増加させる。IL-12作用の他の重要な要素は以下のとおりである：活性化NK細胞、CD8+及びCD4+ T細胞の増殖及び細胞傷害性の刺激、CD4+ Th0細胞の分化をTh1表現型へシフトする；腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)の増強；ならびにIgGの誘導とB細胞からのIgE産生の抑制。しかし、他のいくつかのメカニズムも、IL-12の抗腫瘍活性に強く貢献する。これらは、抗血管新生サイトカイン及びケモカイン産生の誘導を介した強力な血管新生抑制効果、腫瘍周囲の細胞外マトリックス及び腫瘍間質のリモデリング、骨髄由来サプレッサー細胞のリプログラミング、ならびにプロセシング及びMHCクラスI分子の発現の増加の変化である。上記のメカニズムはすべて、腫瘍に対する応答中に集中し、IL-12の抗腫瘍効果の高い効力の原因であると仮定されている。

IL-12は、以下に示すように、いくつかの癌の治療において有益であることが知られている。

頭頸部癌：未治療のHNSCCの患者30人の研究では、組換えIL-12を原発性腫瘍に注射すると、ナチュラルキラー細胞の数が増加し、10人の治療された患者のリンパ節のB細胞の分布が変化することが示された。これらの効果は、末梢血から頸部のリンパ節へのリンパ球の再分布；ナチュラルキラー細胞の有意な増加、及びリンパ節と原発性腫瘍における細胞の割合の低下；ならびにリンパ節におけるIFNγ-mRNAの128倍の増加を含んでいた。最終的に、IL-12で治療した患者のリンパ節のTh2プロファイルはTh1プロファイルに変わった。(C. M. Van Herpen, M. Looman, M. Zonneveld et al., “Intratumoral administration of recombinant human interleukin 12 in head and neck squamous cell carcinoma patients elicits a T-Helper 1 profile in the locoregional lymph nodes,” Clinical Cancer Research, 10 (8) 2626-2635, 2004.)

メラノーマ：IL-12でプライミングされたエフェクターT細胞は、確立された皮下投与(s.c.)B16-F10メラノーマ腫瘍のマウスにおける増殖を劇的に減少させ、高度に免疫抵抗性の確立された頭蓋内腫瘍に対する生存率を有意に増加させた。CD8+ T細胞による腫瘍増殖の制御は、IL-12を介した高親和性IL-2R(CD25)の媒介アップレギュレーションと、それに続くIL-2刺激に対する感受性の増加に依存した。最終的に、IL-12でプライミングされたヒトPBMCは、IL-12でプライミングされたマウス腫瘍特異的T細胞と表現型及び機能的に類似した腫瘍特異的T細胞を生成した。(D. N. Lisiero, H. Soto, L.M. Liau and R. M. Prins Enhanced “Sensitivity to IL-2 Signaling Regulates the Clinical Responsiveness of IL-12-Primed CD8+ T Cells in a Melanoma Model” J Immunol 2011, 186 (9) 5068-5077.)

腎臓：パルスIL-2と組み合わせて投与されたIL-12は、原発性及び転移性Renca腫瘍の急速かつ完全な退縮を誘導した。(J.M. Wigginton, K.L., Komschlies, T.C. Back, J.L. Franco, M.J., Brunda, R.H. Wiltrout “Administration of Interleukin, 12 With Pulse Interleukin 2, and the Rapid and Complete, Eradication of Murine, Renal Carcinoma” Journal of the National Cancer Institute, 1996, 88(1), 38-43.)

前立腺：転移性前立腺癌異種移植片へのヒトIL-12融合タンパク質の特異的ターゲティングは、ヒトリンパ球活性化キラー細胞を移植したSCIDマウスでも有効であることが示された。(S.D. Gillies, Y. Lan, J.S. Wesolowski, X. Qian, R.A. Reisfeld, S. Holden, M. Super and K-M. Lo “Antibody-IL-12 Fusion Proteins Are Effective in SCID Mouse Models of Prostate and Colon Carcinoma Metastases” J Immunol. 1998, 160(12), 6195-6203.)

乳房：インターロイキン-12(IL-12)遺伝子治療は、4T1乳腺腺癌を含むいくつかの同系マウス腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を誘導した。(Rakhmilevich AL, Janssen K, Hao Z, Sondel PM, Yang N-S. “Interleukin 12 gene therapy of a weakly immunogenic mouse mammary carcinoma results in reduction of spontaneous lung metastases via a T cell independent mechanism” Cancer Gene Ther 2000, 7(6), 826-38.)

膀胱：抗腫瘍研究では、同所性膀胱腫瘍を有するマウスの88%から100%がキトサン/IL-12による4回の膀胱内処置後に治癒した。IL-12単独で処置したマウスの38%から60%。(D.A. Zaharoff, B.S. Hoffman, H.B. Hooper, C.J. Benjamin Jr., K.K. Khurana, K.W. Hance, C.J. Rogers, P.A. Pinto, J. Schlom and J.W. Greiner “Intravesical Immunotherapy of Superficial Bladder Cancer with Chitosan/Interleukin-12” Cancer Res 2009, 69(15), 6192-9.)

卵巣：マウスIL-12治療は、ヒト卵巣癌を移植したSCIDマウスで、有意な腫瘍増殖遅延及び腫瘍退縮をもたらした。(D.F. Silver, R.E. Hempling, M.S. Piver, E.A. Repasky “Effects of IL-12 on Human Ovarian Tumors Engrafted into SCID Mice” Gynecologic Oncology, 1999, 72(2), 154-160.)

膵臓：AdIL-12/B7.1の単回腫瘍内注射により、膵管癌のマウスモデルにおいて、処置した動物の80%で免疫応答が延長され、完全退縮が媒介された。(Putzer B.M., Rodicker F., Hitt M.M., Stiewe T., Esche H. Improved treatment of pancreatic cancer by IL-12 and B7.1 costimulation: antitumor efficacy and immunoregulation in a nonimmunogenic tumor model. Mol. Ther. 2002, 5(4), 405-12.)

急性骨髄性白血病：ヒトU937 AML細胞株を腹腔内(i.p.)注射し、その後ヒト組換えIL-12又はPBS i.p.で処置したSCID-NODマウスを使用して、in vivo実験を行った。外植した腫瘍の組織学的、免疫組織化学的及びフローサイトメトリー分析により、IL-12が血管新生を減少させ、アポトーシスを誘導し、腫瘍細胞増殖を阻害したことが明らかになった。(Ferretti E, Di Carlo E, Cocco C, Ribatti D, Sorrentino C, Ognio E, Montagna D, Pistoia V, Airoldi I. “Direct inhibition of human acute myeloid leukemia cell growth by IL-12” Immunol Lett. 2010, 133(2), 99-105.)

子宮頸癌：IL-21及びIL-12は子宮頸癌SiHa細胞に対するPBMC細胞傷害性を有意に上昇させた。さらに、IL-21+IL-12は、IL-21単独及びIL-12単独と比較して、PBMC細胞傷害性を有意に上昇させた。また、IL-21+IL-12が、コントロールと比較してTreg及びTH17細胞比率を有意に減少させたことを見出した。特に、IL-21+IL-12は、IL-21単独と比較してTH17細胞比率を有意に減少させた。(Tian Y, Yuan C, Ma D, Zhang Y, Liu Y, Zhang W, Hou F, Cui B “IL-21 and IL-12 inhibit differentiation of Treg and TH17 cells and enhance cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cells in patients with cervical cancer” Int J Gynecol Cancer 2011 21(9), 1672-8.)

神経膠腫：同系マウス神経膠腫モデルでのGL261細胞の拒絶によって測定されたように、神経膠腫の拒絶は、CNSでIL-12を発現するマウスで有意に増強され、CD8+ T細胞の存在に主に依存していた。(Vetter M, Hofer MJ, Roth E, Pircher HP, Pagenstecher A “Intracerebral interleukin 12 induces glioma rejection in the brain predominantly by CD8+ T cells and independently of interferon-gamma” J Neuropathol Exp Neurol. 2009 May;68(5):525-34.)

肺：肺癌患者からの末梢血単核細胞は、IL-12との4日間のin vitroインキュベーション後に細胞殺傷活性を示した。IL-12による効果的なキラー誘導は、進行肺癌患者及び小細胞肺癌患者からの単核細胞でも観察された。IL-12及び最適値以下の用量(suboptimal dose)のIL-2は、肺癌患者及び対照被験者の両方の単核細胞にキラー活性を誘導する相加効果を有していた。IL-12を単独で、又はIL-2と組み合わせて添加すると、肺癌患者及び対照被験者からのMNCによるインターフェロン(IFN)-ガンマ産生が生じた。これらの観察は、IL-12がヒトの肺癌の免疫療法に有用となり得ることを示唆する。(Haku T, Yanagawa H, Nabioullin R, Takeuchi E, Sone S. “Interleukin-12-mediated killer activity in lung cancer patients” Haku T., Yanagawa H., Nabioullin R., Takeuchi E., Sone S. Cytokine 1997, 9(11), 846-52.)

胃癌：4-1 BBL遺伝子を担持する胃癌細胞全リボ核酸(RNA)でトランスフェクションしたDCワクチンは、T細胞増殖を促進し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の胃癌細胞を死滅させ、IL-12及びIFN-γを分泌する能力を高めることにより胃癌細胞を死滅させる強力な能力を有する。(Z. Song, C. Guo, Y. Li, B. Tan, L. Fan and J. Xiao, “Enhanced antitumor effects of a dendritic cell vaccine transfected with gastric cancer cell total RNA carrying the 4-1BBL gene in vitro” Experimental and Therapeutic Medicine 2012, 3, 319-323.)

肝細胞癌：MH134細胞を接種したマウスでは、mIL-12の腫瘍内遺伝子導入により、腫瘍内mIL-12、IFN-γ、及びIFN-γ誘導性タンパク質-10が上昇し、微小血管の数が有意に減少し、HCCの増殖が阻害された。(N. Harada, M Shimada, S Okano, T Suehiro, Y Soejima, Y Tomita and Yoshihiko Maehara “IL-12 Gene Therapy Is an Effective Therapeutic Strategy for Hepatocellular Carcinoma in Immunosuppressed Mice” J Immunol 2004, 173, 6635-6644.)

大腸：大腸癌CT26細胞を接種したマウスへのAdCMVIL-12の腫瘍内注射による大腸癌結節のin vivo遺伝子治療は、34匹中26匹(76%)のマウスでIL-12及びインターフェロン-ガンマレベルの局所的増加と腫瘍の完全な退縮を誘導した。腫瘍はベクター投与後7日目から10日目の間に消失した。抗腫瘍効果はCD8+ T細胞によって媒介され、大腸癌細胞に対する細胞傷害性Tリンパ球の生成と関連していた。(G. Mazzolini, C. Qian, X. Xie, Y. Sun, J. Lasarte, M. Drozdzik and J. Prieto “Regression of colon cancer and induction of antitumor immunity by intratumoral injection of adenovirus expressing interleukin-12” Cancer Gene Therapy, 1999, 6(6), 514-522.)

中皮腫：in vivoで非免疫原性マウスMM腫瘍細胞株(AB1)を使用して、マウス抗腫瘍免疫応答に対するrIL-12の効果を調べた。腫瘍接種時のrIL-12の全身投与は、処置したマウスの70%まででAB1腫瘍増殖を防ぎ、その50%は再チャレンジ時にAB1に依然として耐性であり、長期の免疫学的抗腫瘍効果が確立されたことを示している。このrIL-12誘導効果は、CD4(+)及びCD8(+)の両方の関与に依存していたが、ナチュラルキラー(NK)細胞には依存していなかった。(Caminschi I, Venetsanakos E, Leong CC, Garlepp MJ, Scott B, Robinson BW “Interleukin-12 induces an effective antitumor response in malignant mesothelioma” Am. J. Respir. Cell Mol Biol. 1998, 19(5):738-46.)

多発性骨髄腫：発現ベクターpcDNA-IL-12が生成され、J558骨髄腫細胞にトランスフェクトされた後、骨髄由来DCが操作されたJ558/IL-12細胞と融合された。融合ハイブリッドDC/J558/IL-12のワクチン接種に由来する抗腫瘍性免疫を、in vitro及びin vivoで評価した。DC/J558/IL-12細胞は組換えIL-12(1.6 ng/mL)を分泌し、DC/J558/IL-12ハイブリッドのBALB/cマウスへの接種はTh1優位な免疫応答を誘導し、腫瘍退縮をもたらした。操作したDC/J558/IL-12ハイブリッドを用いたマウスの免疫は、DCとJ558/IL-12との混合物、J558/IL-12及びＪ558をそれぞれ用いた免疫よりも、in vitroでより強いJ558腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発し、in vivoでJ558腫瘍チャレンジに対するより強力な保護免疫を誘発した。さらに、in vivoでのDC/J558/IL-12腫瘍細胞ワクチン接種によって媒介される抗腫瘍免疫は、CD8+ CTLに依存しているように思われた(Shi M, Su L, Hao S, Guo X, Xiang J “Fusion hybrid of dendritic cells and engineered tumor cells expressing interleukin-12 induces type 1 immune responses against tumor” Tumori 2005, 91(6), 531-8.)。

リンパ腫：腫瘍標的化IL12-IL2融合タンパク質は、標的化されたIL2又はIL12単独と比較して、休止T細胞の活性化において炎症誘発性サイトカインを増幅及び分泌するのに優れていた。NK細胞は、デュアルサイトカインタンパク質によっても活性化され、IFN-γを分泌し、標的細胞を溶解した。腫瘍標的化IL12-IL2は、樹立された抗原陽性リンパ腫腫瘍を有する免疫適格性マウスへのi.v.注射により適用されたとき、腫瘍部位に蓄積され、腫瘍退縮を誘発した。(T. Jahn., M. Zuther., B. Friedrichs, C. Heuser, S. Guhlke, H. Abken, A. Hombach An IL12-IL2-Antibody Fusion Protein Targeting Hodgkin’s Lymphoma Cells Potentiates Activation of NK and T cells for an Anti-Tumor Attack PLoS ONE 7(9): e44482.)

食道癌：トラスツズマブ及びパクリタキセルと組み合わせたIL-12は、許容可能な毒性プロファイルを示し、食道癌を含むHER2過剰発現癌の患者で活性を有する。(Bekaii-Saab TS, Roda JM, Guenterberg KD, Ramaswamy B, Young DC, Ferketich AK, Lamb TA, Grever MR, Shapiro CL, Carson WE 3rd. “A phase I trial of paclitaxel and trastuzumab in combination with interleukin-12 in patients with HER2/neu-expressing malignancies” Mol Cancer Ther. 2009, 8(11), 2983-91.)

甲状腺癌：トラスツズマブ及びパクリタキセルと組み合わせたIL-12は、許容可能な毒性プロファイルを示し、甲状腺癌を含むHER2過剰発現癌の患者で活性を有する。(Bekaii-Saab TS, Roda JM, Guenterberg KD, Ramaswamy B, Young DC, Ferketich AK, Lamb TA, Grever MR, Shapiro CL, Carson WE 3rd. “A phase I trial of paclitaxel and trastuzumab in combination with interleukin-12 in patients with HER2/neu-expressing malignancies” Mol Cancer Ther. 2009, 8(11), 2983-91.)

WO2007/129040、WO2009/060160及びWO2014/060742はp38 MAPキナーゼ阻害剤であるアルファアミノ酸エステルを開示している。開示された化合物は、p38 MAPK(p38α、β、γ、及びδ)並びにそのアイソフォーム及びスプライスバリアント、特にp38α、p38β及びp38β2の強力で選択的な阻害剤であると述べられている。

WO2007/129040はまた、それに関連する化合物がマクロファージに選択的に蓄積する化合物を含むことを開示している。WO2009/060160は、WO2007/129040の一般的な開示の範囲に含まれるが、その中で具体的に同定も例示もされていない特定の化合物群を開示している。化合物は上述のマクロファージ選択性を示している。

WO2014/060742は、化合物tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート及び対応する酸化合物N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンを開示している。これらの化合物は、p38 MAPキナーゼ活性を阻害することに特に優れていることが見出された。

発明の概要
IL-12は、いくつかの癌の治療に有益であることが知られており、IL-12産生の刺激は癌の治療において有望な発展である。p38 MAPK阻害剤の免疫調節はまだ十分に理解されていないが、p38の阻害はTNF-α、IFN-γ及びIL-10に対する阻害効果をもたらすことが知られている。IL-12産生におけるp38阻害剤の役割は、進行中の研究分野である。

単球、マクロファージ及び樹状細胞によるIL-12産生に対するp38 MAPK阻害剤の効果は、IFN-γの存在に依存すると考えられる。T細胞機能におけるp38の役割に関する研究は、既知のp38阻害剤SB203580を使用して行われている(S Zhang et al., The Journal of Immunology, 2000, 165, 1374-1380)。これらの研究は、IL-12がp38 MAPKを活性化することを示しており、IL-12によって誘導されるIFN-γ発現にはIL-12によって活性化されるp38 MAPKが必要であることを示唆している。

Marriottらによる報告(Marriot et al, Clin Exp Immunol 2001; 125:64-70)は、p38 MAPKの阻害に選択的なp38 MAPK阻害剤がIL-12産生をアップレギュレートすることを見出した。しかし、IFN-γプライミングは必須であり、単離されたマクロファージ及び単球に外因性IFN-γが存在しない場合、IL-12の増加は見られなかった。全血及びPBMCアッセイでは、リンパ球集団により十分なIFN-γプライミングが提供されたが、IL-12産生が増強された一方で、IFN-γの産生は阻害された。

IL-12の主要な抗腫瘍作用の１つは、T細胞によるIFN-γの産生の増加である。IL-12の上昇が、IFN-γのレベルの上昇及びその増加から生じる免疫結果に変換されない場合、IL-12の上昇にはほとんど利点がない。この技術は、p38阻害がIL-12誘導IFN-γ発現を抑制することを明確に教示している。したがって、p38 MAPK阻害剤は、IFN-γ産生の減少がこの点で有害と考えられるので、有益な抗腫瘍免疫効果を提供するとは予想されないだろう。そのため、p38 MAPK阻害剤は、免疫調節による癌の治療、特にIL-12産生の影響を受ける癌の治療におけるさらなる研究の適切な候補として同定されないだろう。

しかし、本発明で使用される化合物であるp38阻害剤は、IL-12産生の増加とIFN-γ産生の増加の両方の利点を組み合わせて提供することが見出されており、したがって、IL-12産生の増加が有益な癌の治療において薬理学的に有効であると予想される。p38阻害剤としての化合物の既知の用途を考えると、この発見は全く予想外である。さらに、IL-12産生の大きさは、従来のp38阻害剤で見られるよりも有意に高いことが判明した。特に、この化合物は、免疫応答を達成するのに最も有益な生物活性ヘテロダイマーであるIL-12p70の産生を増加させる。従来の化合物に関する多くの以前の報告は、IL-12p40でのみ効果を示す。この発見は、IL-12レベルの上昇が鍵である癌の治療において、これまで認識されていなかった当該化合物の用途を提供し、当該化合物の治療用途を見出すことができる新しい治療経路と新しい臨床状況を切り開く。

具体的には、本発明者らは、既知のp38 MAPK阻害剤であるtert-ブチルN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、IL-12産生(例えば、IL-12p70産生)の刺激をもたらし、特に、当該化合物が細胞内で予想外に高レベルのIL-12を提供することを見出した。好ましくは、当該化合物は、細胞内で予想外に高レベルのIL-12p70を提供する。

これは、IL-12駆動性IFN-γ産生を介して達成されると理解される。IL-12及びIFN-γのレベルの上昇は、癌、特に腫瘍関連細胞がIL-12低表現型細胞である癌の治療に大きな利益をもたらす。

この化合物は、サイトカインIL10の制御が鍵である癌などの細胞増殖性疾患の治療に有用であると以前に同定されていた。同じ化合物がサイトカインIL10の産生を制御し、IL-12誘導IFN-γ発現が起こる全く別のプロセスを介してIL-12の増加を可能にすることは予見できなかっただろう。

化合物が追加の予想外の免疫効果を提供するという事実は、既存の患者により効果的な治療を提供するため、及び/又は新しい患者群を治療するために使用され得ることを意味する。この化合物は、例えば、サイトカインIL10の産生を制御するだけでは効果がないか、又はなんらかの点で不十分であると考えられている患者の治療に使用できるだろう。例えば、特に攻撃的な癌の治療、又は例えば、効果的な治療を提供するためにサイトカインIL10の産生を制御することと、IL-12産生を増加させることの両方が必要であるために代替薬が効かない患者の治療における当該化合物の使用が含まれる。

したがって、本発明は、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；及びN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンから選択される、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための化合物を提供する。

また、本発明により、本明細書で定義される化合物を、１以上の製薬上許容され得る担体及び/又は賦形剤とともに含む、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための組成物が提供される。

本発明はまた、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；及びN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンから選択される、IL-12産生の刺激による細胞増殖性疾患の予防又は治療に使用するための化合物を提供する。好ましくは、当該化合物は、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための化合物である。

また、本発明により、対象におけるIL-12産生及びIFN-γ産生を刺激する方法であって、本明細書で定義される化合物又は本明細書で定義される組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法が提供される。また、本発明により、IL-12産生の刺激による細胞増殖性疾患の予防又は治療方法であって、本明細書で定義される化合物又は本明細書で定義される組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法が提供される。

さらに本発明により、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激用薬剤の製造における、本明細書で定義される化合物又は本明細書で定義される組成物の使用が提供される。また、IL-12産生の刺激による細胞増殖性疾患の予防又は治療用薬剤の製造における、本明細書で定義される化合物又は本明細書で定義される組成物の使用が提供される。

IL-10レベルの制御が鍵である癌の治療に当該化合物を使用し得ることが以前に知られていたため、本発明は、当該化合物の新しい用途を提供するだけでなく、単一の活性剤でIL-10とIL-12の両方のレベルを有利に制御する能力を介して、新しい領域の癌を治療する可能性を有する化合物もまた提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、(i) tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物（本明細書ではエステル化合物と称する）；及び(ii) N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニン（本明細書では酸化合物と称する）から選択される化合物の使用に関する。
好ましくは、化合物は、エステル化合物、すなわち、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物である。
エステル化合物は、塩、水和物又は溶媒和物の形態で製造しうる。典型的には、塩は製薬上許容され得る塩である。

本明細書で用いる場合、製薬上許容され得る塩は、製薬上許容され得る酸又は塩基との塩である。製薬上許容され得る酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、二リン酸、臭化水素酸又は硝酸などの無機酸、及びクエン酸、サリチル酸、グルタミン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、酒石酸、安息香酸、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はp-トルエンスルホニル酸などの有機酸の両方が挙げられる。製薬上許容され得る酸は、特にジカルボン酸、例えば、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、シュウ酸又はアジピン酸であってよい。製薬上許容され得る塩基としては、アルカリ金属(例えば、ナトリウム又はカリウム)及びアルカリ土類金属(例えば、カルシウム、バリウム又はマグネシウム)水酸化物、ならびにアルキルアミン、アラルキルアミン及び複素環アミンなどの有機塩基が挙げられる。適切な有機塩基の例としては、N-メチル-D-グルカミン、コリントリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、L-アルギニン、L-リジン、N-エチルピペリジン、ジベンジルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な塩の総説のために、Stahl及びWermuthによるHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use(Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照されたい。
好ましくは、製薬上許容され得る塩は、メタンスルホン酸塩又はエタンスルホン酸塩である。より好ましくは、製薬上許容され得る塩は、エタンスルホン酸塩である。

用語「溶媒和物」は、本明細書では、前記化合物と、化学量論量の1以上の製薬上許容され得る溶媒分子、例えばエタノールとを含む分子複合体を表すのに用いられる。用語「水和物」は、該溶媒が水のときに用いられる。

誤解を避けるために、前記化合物は、任意の互変異性型で使用しうる。

酸化合物は、エステルの代謝物である。したがって、対象にエステルを投与すると、エステルが加水分解されて細胞内で前記酸が提供される。

前記化合物は、キラル中心を含む。前記化合物は、典型的にはL-アラニン又はL-アラニネート誘導体(すなわち、実施例1に図示される)の形態である。しかしながら、前記化合物は、D-アラニン又はD-アラニネート誘導体又はD-体及びL-体の混合物として存在してもよい。ここで混合物が存在する場合、好ましくは、少なくとも90%、95%又は99%が、L-体として存在する。

前記化合物の生成の適当なスキーム及びプロセスは、続く実施例のセクションを参照して、以下に述べる。

原料は、典型的には、4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩及び2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノールである。2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノールは実施例セクションのスキーム１に類似した下記スキームを用いて製造しうる:

ジフルオロニトロベンゼンは市販されている。工程１は、tert-ブチルアセテート基をフェニル環にニトロ基に対してパラに付加することが要求される。工程２は、対応する酸を形成するためにエステル基の加水分解が要求される。酸は、工程３で１級アルコールに還元される。工程４では、ニトロ基がアミンに還元される。

4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩は、WO 2003076405に記載された実験手順を用いて製造しうる。

エステル化合物は、その後、実施例セクションのスキーム２に類似の下記スキームを用いて合成しうる。

工程１において、2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール及び4-クロロフェニル3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩を一緒に反応させて2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロフェニル)エチルアセテートを形成する。工程２において、プロピオル酸を加えて、2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテートを形成する。工程３において、アセテート基を加水分解してアルコールにし、工程４において、得られたアルコール基を酸化してアルデヒドにする。本発明の化合物は、その後工程５において、tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩の付加により形成される。tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩は市販されている。
酸化合物は、エステル化合物の加水分解により製造しうる。

本発明は、また前記化合物、典型的には、エステル化合物を、１以上の製薬上許容され得る担体及び/又は賦形剤とともに含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、典型的に本発明の化合物を85重量％以下含む。より典型的には、本発明の化合物を50重量％以下含む。好ましい医薬組成物は、無菌性でパイロジェンフリーである。

前記化合物は、多様な剤型で投与することができる。したがって、例えば、錠剤、トローチ、カプセル、ロゼンジ、水性懸濁液もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは分散性顆粒として経口的に投与することができる。前記化合物は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（intrasternally）、経皮的又は点滴技術のいずれかで非経口的にも投与しうる。あるいは、投与は腹腔内又は口腔内投与であってもよい。用いるビヒクル及び濃度に応じて、薬剤は、ビヒクル中に懸濁又は溶解できる。有利には、局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などアジュバントをビヒクル中に溶解できる。また化合物は、坐剤として投与してもよい。化合物は、吸入器又は噴霧器を介して、エアロゾルの形態で吸入により投与してもよい。

前記化合物は、典型的には、製薬上許容され得る担体又は希釈剤と一緒に投与用に製剤化する。例えば、固形経口形態は、活性化合物と一緒に、可溶化剤、例えば、シクロデキストリン又は修飾シクロデキストリン;希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、蔗糖、セルロース、トウモロコシデンプン又は馬鈴薯デンプン;滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び/又はポリエチレングリコール;結合剤;例えば、デンプン、アラビアゴム、トラガントガム、ゼラチン、シロップ剤、アカシア、ソルビトール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン;脱凝集剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギネート又はデンプングリコール酸ナトリウム;発泡性混合物;染料;甘味料;レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸類などの湿潤剤;及び一般的に、医薬品の処方に使用される非毒性及び薬理学的に不活性な物質を含んでもよい。かかる医薬製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣又はフィルムコーティングプロセスの手段により製造しうる。

経口投与用の分散液は、液剤、シロップ剤、乳剤及び懸濁剤であり得る。液体製剤は、懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン硬化食用油；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールなどの油状エステル；防腐剤、例えばメチルもしくはプロピルp-ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸、などの通常の添加剤、ならびに所望により通常の矯味矯臭剤又は着色剤を含みうる。液剤は可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンを含みうる。シロップ剤は、担体として、例えば蔗糖又は蔗糖グリセリン及び/又はマンニトール及び/又はソルビトールを含みうる。

懸濁剤及び乳剤は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含みうる。筋肉内注射用の懸濁剤又は液剤は、活性化合物と一緒に、製薬上許容し得る担体、例えば滅菌水、オリーブ油、エチルオレエート、グリコール、例えばプロピレングリコール;可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリン、ならびに所望により適当な量の塩酸リドカインを含みうる。

静脈内又は点滴用液剤は、担体として、例えば滅菌水、アルコール類及び可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンを含みうる。あるいは好ましくは無菌性、水性、等張生理食塩水溶液の形態であり得る。例えば、液剤は、担体として、滅菌水及び可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンを含みうる。
静脈内(IV)投与のための好ましい溶媒は、エタノール、プロピレングリコール及びシクロデキストリン類である。１以上の前記溶媒を含む製剤は、投与前に、生理食塩水又はデキストロース水溶液(例えば、5%デキストロース溶液)と混合することができる。あるいは、それはさらなる希釈を伴わずに投与されてもよい。
水溶液への溶解度は、pHを変化させる薬剤を添加することによって増加させることができる。特定の塩基性化合物は、有機酸又は無機酸を添加することにより塩に変換することができる。これは水溶液への溶解度を増加させ、pHを低下させる。適切な塩は、本明細書に記載のものであり、特に、塩酸塩、硫酸塩及びジカルボン酸塩（例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩又はアジピン酸塩)である。これらの塩は、対応する酸、すなわち、塩酸、硫酸又はジカルボン酸（例えば、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、シュウ酸又はアジピン酸）の添加により形成することができる。
前記化合物は、放出制御製剤又は徐放性製剤で提供され得る。このような製剤には、例えば、グリコリド、ラクチド(DL-ラクチド)、カプロラクトン、及びポリエチレングリコールなどのポリマー、これらのいずれかの共重合体を用いることができる。例としては、ポリDL-ラクチド、ポリDL-ラクチド-コ-グリコリド、ポリカプロラクトン、及びポリカプロラクトンとポリエチレングリコールのブロックコポリマー又はブレンドが挙げられる。

皮膚への局所適用のために、薬剤は、クリーム、ローション又は軟膏剤として製造できる。薬剤に使用し得るクリーム又は軟膏の製剤は、例えば英国薬局方のような製薬の標準的な参考書に記載されるような当該技術分野で周知の通常の製剤である。

吸入による局所適用のために、薬剤は、例えば圧力駆動噴射噴霧器又は超音波噴霧器によるか、あるいは好ましくは噴射剤駆動計量供給エアロゾル又は微粉末の噴射剤フリーの投与、例えば吸入カプセルもしくはその他の「乾燥粉末」送達系によるエアロゾル送達用に処方できる。賦形剤、例えば噴射剤(例えば計量供給エアロゾルの場合、Frigen)、界面活性剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤、矯味矯臭剤及び充填剤(例えば粉末吸入器の場合、ラクトース)が、このような吸入製剤に存在し得る。吸入の目的のために、患者に適した吸入法を用いて、最適粒子サイズのエアロゾルを発生させ投与できる多数の装置が利用可能である。アダプタ(スペーサー、エキスパンダー)及び洋ナシ形の容器(例えばNebulator（登録商標）、Volumatic（登録商標）)、及び特に粉末吸入器の場合の計量供給エアロゾル用の吹きかけるスプレーを発射する自動装置(Autohaler(登録商標))の使用に加えて、多くの技術的解決法が利用可能である(例えば、Diskhaler（登録商標）、Rotadisk（登録商標）、Turbohaler（登録商標）、又は例えば欧州特許出願EP 0 505 321に記載されるような吸入器)。

眼への局所適用のために、薬剤は、適切な滅菌の水性又は非水性のビヒクル中の液剤又は懸濁剤として製造できる。添加剤、例えばメタ重亜硫酸ナトリウム又はエデト酸二ナトリウムなどの緩衝剤；防腐剤、例えば酢酸もしくは硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジンなどの殺菌剤及び殺真菌剤、及びヒプロメロースなどの増粘剤も含むことができる。

治療有効量の前記化合物が対象に投与される。いずれの特定の患者についての具体的な用量レベルが、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与の時間、投与ルート、排泄率、薬物の組み合わせ及び治療を受ける特定の疾患の重篤度などの種々の因子に依存することが理解される。最適な用量レベル及び投与の頻度は、臨床試験により通常決定される。

典型的な１日用量は、具体的な化合物の活性、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態、疾患の種類や重篤度ならびに投与頻度やルートにしたがって、体重１ｋｇあたり５０ｍｇ以下、例えば体重１ｋｇあたり０．００１〜５０ｍｇである。好ましくは、１日投与量レベルは、０．０５ｍｇ〜２ｇ、好ましくは、０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。前記化合物は、典型的に非毒性の量で患者に投与される。

前記化合物は、脂質ベースの製剤として提供され得る。当業者が理解するように、脂質ベースの製剤は、例えば、投与経路及び薬物毒性に応じて異なり得る。好ましくは、脂質ベースの製剤は経口投与用である。前記化合物を脂質ベースの薬物として製剤化することの利点は、前記化合物の生物学的利用能を高め、及び/又は前記化合物の溶解度を高める可能性を含む(例えば、Drug Discovery, 2007, 6:231-248参照)。

脂質ベースの製剤は、例えば、前記化合物及び親油性相を、任意で少なくとも１つの製薬上許容され得る界面活性剤及び/又は製薬上許容され得る水混和性溶媒とともに含み得る。好ましくは、脂質ベースの製剤は、治療有効量の前記化合物を含む。

いくつかの実施態様において、前記化合物は、経口投与用のソフトゼラチンカプセル又はソフトゲルで提供され得る。ソフトゲル技術の例としては、OptiGel(登録商標)及びOptiShell(登録商標)が挙げられる。典型的には、ソフトゼラチンカプセルは、前記化合物を含む液体製剤を含有する。液体製剤は、例えば、脂質ベースの薬物として前記化合物を含み得る。ソフトゼラチンカプセルは、例えば、ゼラチン、水、乳白剤及び可塑剤(例えば、グリセリン又はソルビトール)を含み得る。ゼラチンカプセルは、例えば、標的化された送達を助けるため、修飾された放出プロファイルを提供するため、化合物の安定性を改善するため、及び/又は副作用を低減するために任意にコーティングされ得る。

上記のように、前記化合物は、細胞内で予想外に高いレベルのIL-12を提供する。すなわち、前記化合物は、細胞内のIL-12のレベルを増加させる。好ましくは、前記化合物は、予想外に高いレベルのIL-12p70を提供する。細胞増殖性疾患の治療に特に有益な効果をもたらすのは、IL-12、特にIL-12p70のアップレギュレーションである。

特に、末梢血単核細胞(ヒトPBMC)サンプル中のヒト単球からのIL-12産生及びIFN-γ産生の刺激が観察される。従って、本化合物は、PBMC中又は全血中のIL-12(IL-12 p70)及びIFN-γの両方の産生を増加させることができる。本発明の化合物を使用する場合に観察されるIL-12レベルの増加は、他の既知のp38 MAPK阻害剤と比較してはるかに低いEC₅₀値をもたらす。IL-12(IL-12 p70)及びIFN-γの両方の増加が300nM未満の濃度でPBMC又は全血で観察される。例えば、≦1nMのIL-12 p70 EC₅₀レベル及び1nMのIFN-γ EC₅₀レベルが、LPSで刺激されたPBMCで観察される。p38阻害剤PF-797804 (3-ブロモ-4-[(2,4-ジフルオロベンゾイル)オキシ]-1-[5-[(メチルアミノ)カルボニル]-2-メチルフェニル]-6-メチルピリジン-2(1H)-オン、3-[3-ブロモ-4-[(2,4-ジフルオロフェニル)メトキシ]-6-メチル-2-オキソ-1(2H)-ピリジニル]-N,4-ジメチル-ベンズアミド)及び6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[2,6-ジフルオロフェニル]ピリジン-2(1H)-オンの場合、例えば、IL12の増加は300 nM未満の阻害剤濃度では観察されない。

本発明の化合物は、p38 MAPK阻害剤として活性を有することが知られている。p38 MAPK阻害剤は、p38 MAPKが関与している特定の癌の治療に有用であり得る。しかしながら、本発明者らの知見、すなわち、前記化合物が有益な免疫調節を提供することは、前記化合物に新たな適用の可能性をもたらす。特に、前記化合物は、免疫応答が有益である、特定の細胞増殖性疾患、特に癌の治療に有用である。従って、前記化合物は、免疫系の調節による、特にIFN-γ産生の増加に関連してIL-12の刺激の増加による癌の治療に有用である。

従って、本発明に用いられる化合物又は組成物は、IL-12産生の刺激による、特にIL-12産生及びIFN-γ産生の刺激による癌の治療において有用であり得る。

前記化合物で治療され得る癌は、特に腫瘍関連マクロファージ及び樹状細胞がIL-12低表現型(IL-12^low phenotype)を示す癌である。当業者が知っているように、樹状細胞、リンパ球及びマクロファージの免疫細胞集団は免疫組織化学(IHC)によって特徴付けることができ、Th1サイトカインインターフェロン(IFN)-γ及びその上流インデューサーインターロイキン(IL)-12の組織メッセンジャーRNA(mRNA)レベルはリアルタイムPCRで定量することができる(Cui et al, Cancer Immunol Immunother. 2007, 56(12),1993-2001)。

IL-12のレベルを増加させることにより治療され得る癌の例としては、頭頸部癌、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、急性骨髄性癌(acute myeloid cancer)、子宮頸癌、神経膠腫、肺癌、胃癌、肝細胞癌、大腸癌、中皮腫、多発性骨髄腫、リンパ腫、食道癌及び甲状腺癌が挙げられる。一実施形態では、癌は、卵巣癌、乳癌及び肺癌である。

好ましくは、IL-12のレベルを増加させることにより治療され得る癌は、頭頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、急性骨髄性癌、子宮頸癌、神経膠腫、胃癌、肝細胞癌、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌又は甲状腺癌を含む。より好ましくは、IL-12のレベルを増加させることにより治療され得る癌は、子宮頸癌である。
一実施形態では、前記化合物は哺乳動物の対象、特にヒト対象に投与される。
本発明を以下の実施例でさらに説明する。

本発明で使用されるエステル化合物は、以下の実施例に従い製造されうる。

略語
CDI=カルボニルジイミダゾール
DCM=ジクロロメタン
DMF=ジメチルホルムアミド
EtOAc=酢酸エチル
HCl=塩酸
LCMS=高速液体クロマトグラフィー/質量分析
MeOH=メタノール
MgSO₄=硫酸マグネシウム
Na₂CO₃=炭酸ナトリウム
NaHCO₃=炭酸水素ナトリウム
NMR=核磁気共鳴
STAB=ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド
THF=テトラヒドロフラン
g=グラム
mg=ミリグラム
mL=ミリリットル
mmol=ミリモル

市販の試薬及び溶媒(HPLCグレード)は、更なる精製をしないで使用した。溶媒は、Buchiロータリーエバポレータを用いて除去した。マイクロ波照射は、Biotage Initiator（登録商標）Eightマイクロ波合成装置を用いて行った。フラッシュクロマトグラフィーカラムによる化合物の精製は、Fluorochemから得た粒子サイズ40〜63μm(230〜400メッシュ)のシリカゲルを用いて行った。

¹H NMRスペクトルは、重水素化溶媒中でのBruker 300 MHz AV分光計で記録した。ケミカルシフト(d)は、百万分率である。薄層クロマトグラフィー(TLC)分析は、Kieselgel 60 F₂₅₄(Merck)プレートで行い、UV光を用いて視覚化した。

分析HPLC/MSは、Agilent HP1100 LC システムで、逆相Luna C18 カラム(3mm、50x4.6mm)、2.25分かけてのグラジエント5-95%B(A=水/0.1%ギ酸、B=アセトニトリル/0.1%ギ酸)、流量=2.25mL/分を用いて行った。UVスペクトルは、220及び254nmにてG1315B DAD検出器を用いて記録した。質量スペクトルは、m/z150〜800の範囲にわたりLC/MSD SL G1956B検出器で得た。データは、ChemStation及びChemStation Data Browserソフトウェアを用いて積分して報告した。

中間体
中間体１：4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩

中間体１は、WO 2003076405に記載された実験手順を用いて製造できる。

中間体２：2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール

中間体２は、次のスキーム１に示すルートを用いて合成した。

工程1 - tert-ブチル (3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)アセテート
無水DMF(200mL)中のジフルオロニトロベンゼン(24.96g、157mmol)及びtert-ブチルクロロアセテート(38.0mL、267mmol)の溶液を、窒素下で、1時間かけて、無水DMF(200mL)中のカリウム tert-ブトキシド(61.61g、549mmol)の冷(-35℃)懸濁液に滴下した。反応混合物を-35℃で1.5時間撹拌し、2N HCl(240mL)でクエンチし、ヘプタン(4x200mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を水(3x200mL)、食塩水(200mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、減圧下で濃縮し黄色のオイルを得た。カラムクロマトグラフィ(ヘプタン中の10%EtOAc)による精製により黄色のオイル(37.64g)を得た。別の二つのバッチ(10.00g及び23.54gのジフルオロニトロベンゼン)から、それぞれ14.30g及び31.39gの生成物を得た。３つのバッチのすべての¹H NMRは、所望の化合物と少量の未同定不純物を示した。３つのバッチは合わせて、更なる精製をすることなく次の工程で使用した。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 7.05 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.56 (2H, s), 1.46 (9H, s).

工程2 - (3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)酢酸
トリフルオロ酢酸(150mL)をDCM(300mL)中のtert-ブチル (3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)アセテート(83.33g、305mmol)の冷(0℃)溶液に20分にわたり滴下した。添加完了時に、反応混合物を室温まで昇温し、3時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し粘着性の褐色の固体を得た。ヘプタンで粉砕することにより、黄色の固体(53.29g、2工程を経て収率67%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 7.08 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.74 (2H, s), -CO₂ H not visible.

工程3 - 2-(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)エタノール
ボラン-ジメチルスルフィド錯体(35mL、368mmol)を窒素下で20分にわたり、無水THF(500mL)中の(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)酢酸(53.29g、245mmol)の冷(0℃)溶液に滴下した。添加完了後、反応混合物を室温まで昇温し、16時間撹拌し、0℃に冷却し、注意深くMeOH(300mL)でクエンチし、減圧下で濃縮し褐色のオイルを得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン中60-80% EtOAc)による精製によりオレンジ色のオイル(38.90g、収率78%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 7.01 (2H, d, J=8.7 Hz), 3.93 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.92 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.34 (1H, br s).

工程4 - 2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール
2-(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)エタノール(38.90g、191mmol)をEtOAc(250mL)中に溶解した。反応容器の脱気及び窒素充填を３回行った。パラジウム炭素(10重量％、4.00g)を加え、容器の脱気及び窒素充填を３回行った。最終的に、容器を脱気し水素を充填し、容器に水素を含むバルーンを装着した。その後、水素下で室温で15時間撹拌し、水素バルーンを再充填し、混合物をさらに25時間撹拌した。反応混合物をCelite(登録商標)を通してろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し褐色のオイルを得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン中50% EtOAc)による精製によりベージュ色の固体(20.70g、収率62%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.73-6.70 (2H, m), 3.81 (2H, t, J=6.4 Hz), 2.75 (2H, t, J=6.4 Hz), -OH 及び -NH ₂ not visible.

実施例1：tert-ブチル N-(2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート

実施例１は、次のスキーム２に示すルートを用いて合成した。

工程1 - 2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロフェニル)エチルアセテート
2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール(20.71g、120mmol)を氷酢酸(400mL)中のクロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩(41.26g、114mmol)の溶液に添加した。反応混合物を80℃で2.5時間撹拌し、無水酢酸(21mL、228mmol)を加えた。80℃でさらに45分後、反応混合物を室温まで放冷し、減圧下で濃縮し褐色のオイルを得た。EtOAcで粉砕しベージュ色の固体を得て、その固体をジエチルエーテルで洗浄した。その固体をNaHCO₃の飽和水溶液中に取り、30分間激しく撹拌した。固体をろ取し、水で洗浄し、減圧下で乾燥し、ベージュ色の固体(23.36g、収率52%)として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 397 [M+H]⁺.

工程2 - 2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテート
プロピオル酸(5.4mL、88mmol)を、窒素下で無水THF(400mL)中のCDI(14.27g、88mmol)の冷(0℃)溶液に5分かけて滴下した。添加完了後、反応混合物を室温まで昇温し、1時間撹拌した。無水THF(200mL)中の2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロ-フェニル)エチルアセテート(23.26g、59mmol)の溶液を加え、反応混合物を還流で6.5時間撹拌した。反応混合物を室温まで放冷し、16.5時間放置した。プロピオル酸(5.4mL、88mL)、CDI(14.27g、88mmol)及びTHF(200mL)を上述した通りに処理し、反応混合物に加え、続いて還流でさらに6時間撹拌した。続いて反応混合物を室温まで放冷し減圧下で濃縮し、褐色のオイルを得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(DCM中5% MeOH)による精製により暗褐色の固体を得た。さらにその固体をEtOAcで粉砕することにより精製し、黄色の固体(7.45g、収率28%)として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 449 [M+H]⁺及び471 [M+Na]⁺.

工程3 - 6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[2,6-ジフルオロ-4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]ピリジン-2(1H)-オン
2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテート(7.45g、17mmol)を6N HCl(80mL)中に懸濁し、反応混合物を21.5時間還流した。固体をろ取し、NaHCO₃の飽和水溶液(200mL)中に取り、30分間激しく撹拌した。固体をろ取し、水で洗浄し、真空オーブン(40℃)内で乾燥し、ベージュ色の固体として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 407 [M+H]⁺及び 429 [M+Na]⁺.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) 7.57 (1H, td, J=6.6, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.4, 9.7 Hz), 7.37-7.29 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 4.78 (1H, t, J=5.1 Hz), 3.76-3.70 (2H, m), 2.86 (2H, t, J=6.7 Hz), -NH ₂ not visible

工程4 - {4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}-アセトアルデヒド
デス-マーチンペルヨージナン（Dess-Martin periodinane）(1.03g、2.4mmol)を、DCM(20mL)中の6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[2,6-ジフルオロ-4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]ピリジン-2(1H)-オン(823mg、2.0mmol)の懸濁液に加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、NaHCO₃の飽和水溶液(10mL)及びチオ硫酸ナトリウムの飽和水溶液(10mL)でクエンチし、30分間激しく撹拌した。水層を分離し、さらにDCM(2x20mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、減圧下で濃縮し、淡褐色の固体(819mg)として標記の化合物を得た。これを更なる精製をすることなく次の工程で使用した。

工程5 - tert-ブチル N-(2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート
tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩(552mg、3.0mmol)及びSTAB(1.29g、6.1mmol)を{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}-アセトアルデヒド(819mg、2.0mmol)の溶液に加えた。反応混合物を室温で3.5時間撹拌し、Na₂CO₃の飽和水溶液(20mL)でクエンチし、20分間激しく撹拌した。水層を分離し、さらにEtOAc(2x20mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水(20mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、減圧下で濃縮し黄色のオイルを得た。カラムクロマトグラフィ(DCM中5% MeOH)による精製により、淡黄色の固体(492mg,2工程を経て収率78%)として標記の化合物を得た。
LCMS：純度98%, m/z 534 [M+H]⁺.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) 7.58 (1H, td, J=6.8, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.3, 9.8 Hz), 7.37-7.30 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 3.20 (1H, d, J=7.0 Hz), 2.89-2.70 (4H, m), 1.42 (9H, s), 1.16 (3H, d, J=7.0 Hz), -NH ₂及び -NH- not visible

生物学的活性の測定
実施例2
6人の健康なドナーからのヒトPBMCを全血から単離した。PBMCをRPMI-10にlxl0⁶/mLで再懸濁し、96ウェル丸底培養プレートに2xl0⁵/ウェル(200μL)の密度で播種した。さまざまな濃度の治療薬又は参照コントロールを、クライアント/サプライヤーの指示に従ってDMSO中で調製し、0.2μL/ウェル(1:1000)の最終容量でウェルに直接添加した。2時間後、LPSを培養物に添加した(1μg/mL最終、10μL/ウェル)。細胞を37℃、5%C0₂で72時間培養した。培養期間の終わりに無細胞上清を集め、新しい96ウェルプレートに移し、ELISA及びマルチプレックスイムノアッセイによるIFN-γ、IL-10、IL-12p70及びTNF-αの評価の前に-80℃で凍結した。

研究デザイン
含まれるグループ：
刺激されていないPBMC
刺激されたPBMC + ビヒクル(DMSO)
刺激されたPBMC + 6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-l-[2,6-ジフルオロフェニル]ピリジン-2(lH)-オン試験濃度 1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM
刺激されたPBMC + tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート試験濃度 1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM
刺激されたPBMC + PH797804 試験濃度 1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM

テクニカルレプリケートを提供するために培養を3回行い、生物学的レプリケートを提供するために6人の健康なドナーからのPBMCを含めた。

試験処方
試験物質及び参照物質の保存
試験物質は、凍結乾燥されたものは室温で保存し、再構成後は-20℃で保存した。参照物質は、凍結乾燥されたものはサプライヤーにより提供された指示に従って-20℃で保存し、再構成後は-80℃で保存した。

試験物質及び参照物質の処方
全ての試験物質及び参照物質を、無水DMSO中に10mMのストック濃度で製剤化し、ろ過し、アリコートで凍結した。アッセイへの添加の直前に、ストック溶液をDMSOで希釈して、必要な最終濃度の1000倍の溶液を調製した。全ての最終製剤は、培養物に添加する前に、新たに調製し、無菌状態に保ち、遮光した。

データ処理及び統計分析
ELISAプレートを、Infinite F50(Tecan)吸光度リーダー及びMagellan(登録商標)リーダーコントロール及びデータ解析ソフトウェアを使用して450nmで読み取った。Luminex MAGPIXマルチプレックスシステム及びProcartaPlex Analyst 1.0ソフトウェアを使用して、マルチプレックスイムノアッセイを読み取った。Graphpad Prism (v6.0)を使用してグラフを作成した。データは、ドナーの変動を説明するために、各生物学的レプリケート内のそれぞれのビヒクルコントロール群(100%)の平均に正規化した。

tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートと6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-l-[2,6-ジフルオロフェニル]ピリジン-2(lH)-オンとの間で、二元配置分散分析(two-way ANOVA)を用いて統計分析を行った後、Dunnettの多重比較検定を行った。P<0.05のときに統計学的有意性が推定された。

表2のデータは、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、＜1nMのEC50値で、末梢血単核細胞(PBMC)サンプルにおいてヒト単球からのIL-12産生の刺激を示すことを実証する。

表3のデータは、EC50値1nMの阻害剤濃度でIFN-γ産生を増加させる、PBMC中に存在する単球における、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートから誘導される酸のhCE-1を介した蓄積の別の予想外の結果を示す。

これらのデータは、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、IL-12産生及びIFN-γ産生の両方を刺激し、他の既知のp38 MAPK阻害剤よりも有利な、腫瘍の免疫拒絶における予想外の利益を提供することを示す。

これらのデータは、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、p38 MAPK阻害剤の細胞内蓄積を引き起こさない6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-l-[2,6-ジフルオロフェニル]ピリジン-2(lH)-オン及びPH797804のような従来のp38 MAPK阻害剤よりも少なくとも10倍低い濃度でIL10産生を阻害することを実証する。tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-l-[2,6-ジフルオロフェニル]ピリジン-2(lH)-オン及びPH797804よりもp38 MAPKに対して10倍弱い阻害活性を示すことを考慮すれば、当該化合物によりもたらされるIL10阻害活性の増加は、他の既知のp38 MAPK阻害剤よりも有利な、腫瘍の免疫拒絶における予想外の利益を提供する。

Claims

tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；及び
N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニン
から選択される、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための化合物。
化合物が、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物である、請求項１に記載の使用のための化合物。
化合物が、tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートのエタンスルホン酸塩である、請求項１又は請求項２に記載の使用のための化合物。
請求項１から３のいずれか１項で定義される化合物を、１以上の製薬上許容され得る担体及び/又は賦形剤とともに含む、IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激に使用するための組成物。
tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；及び
N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-l(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニン
から選択される、IL-12産生の刺激による細胞増殖性疾患の予防又は治療に使用するための化合物。
化合物が、請求項２又は請求項３で定義される化合物である、請求項５に記載の使用のための化合物。
請求項１から３のいずれか１項で定義される化合物を、１以上の製薬上許容され得る担体及び/又は賦形剤とともに含む、IL-12産生の刺激による細胞増殖性疾患の予防又は治療に使用するための組成物。
請求項１から３、５及び６のいずれか１項に記載の使用のための化合物、又は請求項４もしくは請求項７に記載の使用のための組成物であって、IL-12産生の刺激による癌の治療に使用するための化合物又は組成物。
請求項１から３、５及び６のいずれか１項に記載の使用のための化合物、又は請求項４もしくは請求項７に記載の使用のための組成物であって、頭頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、急性骨髄性癌、子宮頸癌、神経膠腫、胃癌、肝細胞癌、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌又は甲状腺癌の治療に使用するための化合物又は組成物。
対象におけるIL-12産生及びIFN-γ産生を刺激する方法であって、請求項１から３、５及び６のいずれか１項で定義される化合物、又は請求項４もしくは請求項７で定義される組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
IL-12産生の刺激により癌を治療する方法である、請求項１０に記載の方法。
前記方法が癌を治療する方法であって、癌が、頭頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、急性骨髄性癌、子宮頸癌、神経膠腫、胃癌、肝細胞癌、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌及び甲状腺癌から選択される、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
IL-12産生及びIFN-γ産生の刺激用薬剤の製造における、請求項１から３、５及び６のいずれか１項で定義される化合物、又は請求項４もしくは請求項７で定義される組成物の使用。
化合物又は組成物が、IL-12産生の刺激による癌の治療に使用するための化合物又は組成物である、請求項１３に記載の使用。
化合物又は組成物が、頭頸部癌、前立腺癌、膀胱癌、急性骨髄性癌、子宮頸癌、神経膠腫、胃癌、肝細胞癌、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌又は甲状腺癌の治療に使用するための化合物又は組成物である、請求項１３又は請求項１４に記載の使用。