JP2020533963A - ゲノムを修飾するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

ゲノムＤＮＡ配列を修飾するための組成物及び方法が提供される。本方法は、ゲノムＤＮＡ配列の所定の標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、ゲノムの標的部位でのＤＮＡ配列の突然変異、挿入、及び／又は欠失を引き起こす。組成物は、目的の細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたＣｍｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を含む。ＤＮＡ構築物は、所定のゲノム遺伝子座でのゲノムＤＮＡの修飾を指向するために使用することができる。これらのＤＮＡ構築物を使用してゲノムＤＮＡ配列を修飾する方法は、本明細書に記載される。さらに、遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法が提供される。組成物は、必要に応じて転写活性を調節するドメインに連結された、ＤＳＢを生成する能力が廃止された突然変異型Ｃｍｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的の細胞で作動可能なプロモーターを含むＤＮＡ構築物を含む。この方法は、所定のゲノム遺伝子座での遺伝子の発現を上方又は下方制御するために使用することができる。

Description

本発明は、予め選択された位置でゲノム配列を編集し、遺伝子発現を調節するための組成物及び方法に関する。
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして送信された配列リストへの参照
配列リストの公式コピーは、仕様と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、米国規格情報交換（ＡＳＣＩＩ）に準拠したテキストファイルとして、ファイル名ＢＨＰ０１７Ｐ５配列リスト ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日とともに送信される。２０１８年８月３日、サイズは１，８４８Ｋｂである。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列リストは仕様の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ゲノムＤＮＡの修飾は、基礎研究及び応用研究にとって非常に重要である。ゲノム修飾は、疾患の原因を解明し、場合によっては治癒し、前記修飾を含む細胞及び／又は個体に望ましい特性を提供する可能性を有する。ゲノム修飾は、例えば、植物、動物、真菌、及び／又は原核生物のゲノム修飾の修飾を含み得る。ゲノムＤＮＡを変更する最も一般的な方法は、ゲノム内のランダムな部位でＤＮＡを変更する傾向があるが、最近の発見により、部位固有のゲノム変更が可能になった。このようなテクノロジーは、目的の部位でのＤＳＢの作成に依存する。このＤＳＢは、ＤＳＢへの宿主細胞のネイティブＤＮＡ修復機構の動員を引き起こす。ＤＮＡ修復機構を利用して、所定の部位に異種ＤＮＡを挿入したり、ネイティブゲノムＤＮＡを削除したり、目的の部位に点変異、挿入、又は削除を行ったりすることができる。部位特異的なゲノム修飾に特に関心があるのは、クラスター化され、規則的に散在している短い回文構造反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的分子とヌクレアーゼ及び塩基対と相互作用するガイド分子、多くの場合ガイドＲＮＡ分子を使用して、ヌクレアーゼが目的の部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できるようにする。ＤＳＢの作成には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在が必要である。ＰＡＭ配列が認識されると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは目的のＤＳＢを生成できる。Ｃｍｓ１ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと比較して特定の望ましい特性を持つＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのクラスである。
ゲノム修飾が行われている分野の１つは、植物ゲノムＤＮＡの修飾である。植物ゲノムＤＮＡの修飾は、基礎及び応用植物研究の両方にとって非常に重要である。ゲノムＤＮＡが安定的に修飾されたトランスジェニック植物は、除草剤耐性、耐虫性、及び／又はそれらに付与された医薬品タンパク質や工業用酵素を含む貴重なタンパク質の蓄積などの新しい特性を持つことができる。天然植物遺伝子の発現は、アップ又はダウンレギュレートされるか、又はその他の方法で変更され（例えば、天然植物遺伝子が発現される組織を変更することにより）、それらの発現は完全に廃止され、ＤＮＡ配列が変更される（例えば、点突然変異、挿入、又は削除を介して）、又は新しい非ネイティブ遺伝子を植物ゲノムに挿入して、植物に新しい特性を付与することができる。
Ｃｍｓ１ ＣＲＩＳＰＲシステムを使用してゲノムＤＮＡ配列を変更するための構成と方法が提供される。本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡは、線状及び／又は染色体ＤＮＡ、及び／又は目的の細胞又は細胞群に存在するプラスミド又は他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。この方法は、ゲノムＤＮＡ配列の所定の標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、ゲノムの標的部位でのＤＮＡ配列の突然変異、挿入、及び／又は削除を引き起こす。組成物は、目的の細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結されたＣｍｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号１７７〜１８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフを含む。他の実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号２８８〜２８９及び１８７〜２０１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフを含む。他の実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号２９０〜２９６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフを含む。特定の好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号１７７〜１８６からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸モチーフを含む。特定の好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号２８８〜２８９及び１８７〜２０１からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸モチーフを含む。特定の好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号２９０〜２９６からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸モチーフを含む。特定のＣｍｓ１タンパク質配列は、配列番号１０、１１、２０〜２３、３０〜６９、１５４〜１５６、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４に示されている。特定のＣｍｓ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７に記載されている。特定の好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１タンパク質は、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。本発明のＣｍｓ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物、又は本発明のＣｍｓ１タンパク質自体を使用して、所定のゲノム遺伝子座でのゲノムＤＮＡの改変を誘導することができる。これらのＤＮＡ構築物を使用してゲノムＤＮＡ配列を改変する方法は、本明細書に記載されている。酵母、アメーバ、昆虫、真菌、哺乳動物、植物、植物細胞、植物の部分及び種子を含む修飾真核生物及び真核細胞、ならびに細菌及び古細菌を含む修飾原核生物も含まれる。遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法も提供される。この方法は、タンパク質をゲノムの所定の部位にターゲティングし、遺伝子の発現がゲノムの標的部位によって調節される１つ又は複数の遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを行う。組成物は、ヌクレアーゼ活性が低下又は消失した修飾Ｃｍｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、任意で転写活性化又は抑制ドメインに融合したＤＮＡ構築物を含む。これらのＤＮＡ構築物を使用して遺伝子発現を改変する方法は、本明細書に記載されている。
図１は、示されたＶ型ヌクレアーゼのアミノ酸配列のＲｕｖＣアンカーＭＵＳＣＬＥアラインメントから得られた系統樹を示している。Ｓｍタイプ、Ｓｕｌｆタイプ、及びＵｎｋ４０タイプのＣｍｓ１ヌクレアーゼが示されている。 図２は、Ｓｍ型Ｃｍｓ１タンパク質に共通するアミノ酸モチーフのまとめである。ボックス１〜１０のウェブログの図は、それぞれ配列番号１７７〜１８６に対応し、ＳｍＣｍｓ１タンパク質（配列番号１０）上の位置が示されている。 図３は、Ｓｕｌｆ型Ｃｍｓ１タンパク質に共通するアミノ酸モチーフのまとめである。ボックス１〜１７のウェブログの図は、それぞれ配列番号２８８〜２８９及び配列番号１８７〜２０１に対応し、ＳｕｌｆＣｍｓ１タンパク質（配列番号１１）上の位置が示されている。 図４は、Ｕｎｋ４０型Ｃｍｓ１タンパク質に共通するアミノ酸モチーフのまとめである。ボックス１〜７のウェブログの図は、それぞれ配列番号２９０〜２９６に対応し、Ｕｎｋ４０Ｃｍｓ１タンパク質（配列番号６８）上の位置が示されている。
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓシステム及びその構成要素に関連する、ゲノム摂動又は遺伝子編集などの配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御のための方法及び組成物が提供される。本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃｍｓ酵素から選択される。Ｃｍｓ１オーソログ又は変異Ｃｍｓ１酵素である。Ｃｍｓ１は、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ及びＳｍｉｔｈｅｌｌａからのＣＲＩＳＰＲの略語であり、これらのグループの一部の細菌種がＣｍｓ１ヌクレアーゼをコードするため、そのように呼ばれている。Ｃｓｍ１及びＣｍｓ１という用語は、ここでは互換的に使用される。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ｆヌクレアーゼとも呼ばれている。この方法及び組成物は、標的ＤＮＡ配列に結合するための核酸を含む。核酸は、例えばペプチドよりも製造がはるかに簡単で安価であるため、これは有利であり、相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変えることができる。例えば、複数の指の複雑な３Ｄ配置は必要ない。
また、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする核酸、ならびにＣｍｓ１ポリペプチドを使用して、植物細胞を含む宿主細胞の染色体（すなわち、ゲノム）又はオルガネラＤＮＡ配列を修飾する方法も提供される。Ｃｍｓ１ポリペプチドは、Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に誘導する特定のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用する。この部位で、Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ修復プロセスによって修復可能な二本鎖切断を導入し、ＤＮＡ配列が変更された。特異性はガイドＲＮＡによって提供されるため、Ｃｍｓ１ポリペプチドは普遍的であり、様々なガイドＲＮＡとともに使用して様々なゲノム配列をターゲットにすることができる。Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲアレイで伝統的に使用されているＣａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）よりも優れている。例えば、Ｃｍｓ１関連のＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせずに、成熟したｃｒＲＮＡに処理される。また、Ｃｍｓ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、多くのＣａｓ９システムのターゲットＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭとは対照的に、Ｔリッチであることが多い短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が前にあるターゲットＤＮＡを切断できる。さらに、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を導入する可能性がある。本明細書に開示される方法を使用して、特定の染色体配列を標的化及び修飾し、及び／又は外因性配列を真核細胞及び原核細胞のゲノムの標的位置に導入することができる。これらの方法はさらに、オルガネラ（例えば、葉緑体及び／又はミトコンドリア）内の配列を導入するか又は領域を修飾するために使用され得る。さらに、ターゲティングは特定のものであり、対象外効果は限られている。
Ｉ．Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼ
本明細書では、植物ゲノムを含むゲノムの修飾に使用するためのＣｍｓ１エンドヌクレアーゼ、ならびにその断片及び変異体を提供する。本明細書で使用される場合、用語Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼ又はＣｍｓ１ポリペプチドは、配列番号１０、１１、２０〜２３、３０〜６９、１５４〜１５６、２０８〜２１１、及び２２２−２５４に示されるＣｍｓ１ポリペプチド配列のホモログ、オルソログ、及び変異体を指す。通常、Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用せずに作用し、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を引き起こす可能性がある。一般に、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。典型的には、ガイドＲＮＡは、Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用するステムループ構造を持つ領域を含む。このステムループは、多くの場合、配列ＵＣＵＡＣＮ３−５ＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１２−３１４、配列番号３１５−３１７によってエンコードされる）を含み、「ＵＣＵＡＣ」と「ＧＵＡＧＡ」の塩基対がステム−ループのステムを形成する。Ｎ３−５は、任意の塩基がこの位置に存在する可能性があり、３、４、又は５ヌクレオチドがこの位置に含まれる可能性があることを示す。Ｃｍｓ１ポリペプチドはまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、ならびに他のドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含む：ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインなどの部位特異的酵素活性を示す活性部分。
Ｃｍｓ１ポリペプチドは、野生型Ｃｍｓ１ポリペプチド、修飾Ｃｍｓ１ポリペプチド、又は野生型又は修飾Ｃｍｓ１ポリペプチドの断片であり得る。Ｃｍｓ１ポリペプチドは、核酸結合親和性及び／又は特異性を増大させるため、酵素活性を修飾するため、及び／又はタンパク質の別の特性を変化させるために修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾、削除、又は不活性化することができる。又は、Ｃｍｓ１ポリペプチドを切り詰めて、タンパク質の機能に必須ではないドメインを削除することもできる。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、野生型Ｃｍｓ１ポリペプチド又はその断片に由来し得る。他の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、修飾されたＣｍｓ１ポリペプチドに由来し得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾して、タンパク質の１つ又は複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変更することができる。あるいは、ＲＮＡ誘導切断に関与しないＣｍｓ１ポリペプチドのドメインをタンパク質から除去して、修飾Ｃｍｓ１ポリペプチドが野生型Ｃｍｓ１ポリペプチドよりも小さくなるようにすることができる。
一般に、Ｃｍｓ１ポリペプチドは少なくとも１つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含むが、Ｃａｓ９タンパク質に見られるようなＨＮＨドメインを含む必要はない。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインを不活性化するように修飾され得、その結果、それはもはや機能的ではない。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性であるいくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは二本鎖ＤＮＡを切断しない。特定の実施形態では、変異Ｃｍｓ１ポリペプチドは、最大に整列した場合、ＳｍＣｍｓ１の７０１位又は９２２位（配列番号１０）又はＳｕｌｆＣｍｓ１の８４８位及び１２１３位（配列番号１１）に対応する位置に１つ以上の変異を含む（ヌクレアーゼ活性を低減又は排除する最大同一性のために整列させた場合）。ヌクレアーゼドメインは、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、及び全遺伝子合成などの周知の方法、ならびに当技術分野で既知の他の方法を使用して修飾することができる。ヌクレアーゼドメインが不活性化されたＣｍｓ１タンパク質（ｄＣｍｓ１タンパク質）を使用すると、ＤＮＡ配列を変更せずに遺伝子発現を調整できる。特定の実施形態では、ｄＣｍｓ１タンパク質は、適切なｇＲＮＡを使用することにより、１つ又は複数の目的の遺伝子のプロモーターなどのゲノムの特定の領域を標的とすることができる。ｄＣｍｓ１タンパク質は、ＤＮＡの望ましい領域に結合でき、ＤＮＡのこの領域へのＲＮＡポリメラーゼの結合や、ＤＮＡのこの領域への転写因子の結合を妨害する可能性がある。この技術は、対象となる１つ以上の遺伝子の発現を上方又は下方制御するために使用できる。特定の他の実施形態では、ｄＣｍｓ１タンパク質をリプレッサードメインに融合させて、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子、又は他の転写レギュレーターが標的とする染色体ＤＮＡの領域との相互作用によって発現が調節される１つ又は複数の遺伝子の発現をさらにダウンレギュレートすることができるｇＲＮＡ。特定の他の実施形態では、ｄＣｍｓ１タンパク質を活性化ドメインに融合させて、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子、又は他の転写調節因子と標的とする、ｇＲＮＡによる染色体ＤＮＡの領域との相互作用によってその発現が調節される１つ又は複数の遺伝子の上方制御を行うことができる。
本明細書に開示されるＣｍｓ１ポリペプチドは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。一般に、ＮＬＳは一連の塩基性アミノ酸を含む。核局在化シグナルは、当該分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：５１０１−５１０５を参照のこと）。ＮＬＳは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣｍｓ１ポリペプチドの内部位置に配置できる。一部の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、少なくとも１つの細胞透過ドメインをさらに含むことができる。細胞透過ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はタンパク質の内部に配置できる。
本明細書に開示されるＣｍｓ１ポリペプチドは、少なくとも１つの色素体標的化シグナルペプチド、少なくとも１つのミトコンドリア標的化シグナルペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドを色素体及びミトコンドリアの両方に標的化するシグナルペプチドをさらに含み得る。色素体、ミトコンドリア、及びデュアルターゲティングシグナルペプチド局在化シグナルは当技術分野で知られている（例えば、Ｎａｓｓｏｕｒｙ ａｎｄ Ｍｏｒｓｅ（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７４３：５−１９；Ｋｕｎｚｅ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ（２０１５）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６：２５９；Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｎｅｕｐｅｒｔ（２００３）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ５５：２１９−２２５；Ｓｏｌｌ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ５：５２９−５３５；Ｃａｒｒｉｅ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３３：２５３−２５９；Ｃａｒｒｉｅ ｅｔ ａｌ（２００９）ＦＥＢＳ Ｊ ２７６：１１８７−１１９５；Ｓｉｌｖａ−Ｆｉｌｈｏ（２００３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ６：５８９−５９５；Ｐｅｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５４１：５４−６３；Ｍｕｒｃｈａ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６５：６３０１−６３３５；Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：５４８−５５４；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：３１１−３３８参照）。色素体、ミトコンドリア、又はデュアルターゲティングシグナルペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣｍｓ１ポリペプチドの内部に配置できる。
さらに他の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドはまた、少なくとも１つのマーカードメインを含み得る。マーカードメインの非限定的な例には、蛍光タンパク質、精製タグ、及びエピトープタグが含まれる。特定の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（例：ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、モノマーアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例：ＹＦＰ、ＥＹＦＰ）、シトリン、金星、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例：ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例：ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリシシアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色の蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）又はその他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグ及び／又はエピトープタグであり得る。例示的なタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ガイドＲＮＡを含むタンパク質−ＲＮＡ複合体の一部であり得る。ガイドＲＮＡはＣｍｓ１ポリペプチドと相互作用して、Ｃｍｓ１ポリペプチドを特定の標的部位に誘導する。ガイドＲＮＡの５’末端は、植物ゲノムの目的のヌクレオチド配列の特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成できる。核、色素体、ミトコンドリアゲノム。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」という用語は、植物細胞のゲノムにおける目的のヌクレオチド配列のＣｍｓ１ポリペプチド及び標的部位と相互作用するガイドＲＮＡを指す。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント、及びＣｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含み得る。
本明細書に開示されるＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、他の原核生物又は真核生物から、又は天然の宿主生物が不明又は不明であるメタゲノム由来の配列から対応する配列を単離することができる。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本明細書に記載される配列に対するそれらの配列相同性又は同一性に基づいてそのような配列を同定することができる。本明細書に記載の全Ｃｍｓ１配列又はそれらの変異体及び断片に対するそれらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明に含まれる。そのような配列には、開示されたＣｍｓ１配列のオルソログである配列が含まれる。「オルソログ」とは、共通の祖先遺伝子に由来し、種分化の結果として異なる種で見つかる遺伝子を意味することを意図する。それらのヌクレオチド配列及び／又はそれらがコードするタンパク質配列が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性を共有する場合、異なる種で見つかる遺伝子はオルソログと見なされる。オーソログの機能は、種間でよく保存されている。したがって、Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、本明細書に開示される配列と少なくとも約７５％以上の配列同一性を共有する単離されたポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。本明細書で使用する場合、Ｃｍｓ１エンドヌクレアーゼ活性は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ活性を指し、Ｃｍｓ１ポリペプチドに関連するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がＣｍｓ１−ｇＲＮＡ複合体を、ｇＲＮＡに相補的な所定のヌクレオチド配列に結合させる。及び、Ｃｍｓ１活性は、ｇＲＮＡによって標的化された部位又はその近くに二本鎖切断を導入することができる。特定の実施形態では、この二本鎖切断は、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断であり得る。本明細書で使用される場合、「千鳥状のＤＮＡ二本鎖切断」は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０の二本鎖切断をもたらし得る。切断後の３’又は５’末端のオーバーハングのヌクレオチド。特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、５’オーバーハングを有する互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を導入する。二本鎖切断は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）配列が標的化される配列又はその近くで起こり得る。
Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性を保持する、Ｃｍｓ１ポリヌクレオチド及びそれによりコードされるＣｍｓ１アミノ酸配列の断片及び変異体は、本明細書に含まれる。「Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性」とは、ガイドＲＮＡによって媒介される所定のＤＮＡ配列の結合を意図している。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが機能的なＲｕｖＣドメインを保持する実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性は、二本鎖切断誘導をさらに含むことができる。「断片」とは、ポリヌクレオチドの一部又はアミノ酸配列の一部を意味する。「変異体」は、実質的に類似した配列を意味することを意図している。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、５’及び／又は３’末端に欠失（すなわち、トランケーション）を有するポリヌクレオチドを含む。天然ポリヌクレオチドの１つ又は複数の内部部位での１つ又は複数のヌクレオチドの削除及び／又は付加；及び／又は天然ポリヌクレオチドの１つ以上の部位での１つ以上のヌクレオチドの置換。本明細書中で使用される場合、「ネイティブな」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それぞれ、天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載される配列アラインメントプログラム及びパラメーターによって決定されるような、その特定のポリヌクレオチドに対する少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
「変異体」アミノ酸又はタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端の１つ又は複数のアミノ酸の削除（いわゆるトランケーション）により、天然のアミノ酸又はタンパク質に由来するアミノ酸又はタンパク質を意味することを意図している天然タンパク質の；天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の削除及び／又は追加；又は天然タンパク質の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換である。本発明に包含される変異タンパク質は生物学的に活性であり、すなわちそれらは天然タンパク質の所望の生物学的活性を保持し続ける。天然ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本明細書に記載される配列アラインメントプログラム及びパラメーターにより決定した場合、天然配列のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性配列を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、又は１アミノ酸残基のようにそのタンパク質とは異なり得る。
変異配列はまた、配列決定されたゲノムの既存のデータベースの分析によって特定されてもよい。このようにして、対応する配列を同定し、本発明の方法で使用することができる。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。従って、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルアライメントアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のグローバルアライメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８のｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｌｏｃａｌアルゴリズム法；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７として修飾されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムが挙げられる。
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター実装は、配列の同一性を決定するための配列の比較に利用することができる。このような実装には、以下が含まれるが、これらに限定されない。ＣＬＵＳＴＡＬ（ＰＣ／Ｇｅｎｅプリグラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｋら利用可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから利用可能である）。これらのプログラムを使用した生越は、デフォルトのパラメーターを使用して実行できる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１により報告されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記のＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＡＬＩＧＮプログラムでは、ＰＡＭ１２０重み付け残差テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用できる。複数の配列アラインメントのＭＵＳＣＬＥアルゴリズムは、複数の核酸又はタンパク質配列の比較に使用することができる（Ｅｄｇａｒ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７）。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、上記のＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づいている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２で実行して、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３で実行して、本発明のタンパク質又はポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップのあるアラインメントを取得するにはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９に記載されているように、ギャップのあるＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０）を使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行できる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（前掲）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメーター（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）を使用できる。ウェブ部位ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。整列はまた、検査により手動で行うこともできる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はその断片若しくは変異体をコードする核酸分子は、目的の植物又は目的の他の細胞若しくは生物における発現のためにコドン最適化することができる。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されたそのコドン使用頻度を有する遺伝子である。核酸分子は、全体的又は部分的に、コドン最適化することができる。任意の１つのアミノ酸（メチオニンとトリプトファンを除く）はいくつかのコドンによってコードされているため、コードされたアミノ酸を変更することなく、核酸分子の配列を変更できる。コドン最適化は、アミノ酸が変更されないが特定の宿主生物における発現が増加するように、１つ又は複数のコドンが核酸レベルで変更される場合である。当業者は、広範な生物についての選好情報を提供するコドン表及び他の参考文献が当技術分野で利用可能であることを認識するであろう（例えば、Ｚｈａｎｇら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０５：６１−７２；Ｍｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌ。Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−５０８を参照）。植物での発現のためにヌクレオチド配列を最適化するための方法論は、例えば、米国特許第５，６９３，０４７号に提供されている。米国特許第６，０１５，８９１号、及びそこに引用されている参考文献。植物での発現のためのコドン最適化ポリヌクレオチドの例は、配列番号１６〜１９、１１０〜１２０、及び１７４〜１７６に示されている。
ＩＩ．融合タンパク質
本明細書では、Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はその断片若しくは変異体、及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質が提供される。Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ガイドＲＮＡによって標的部位に向けられ得、その部位で、エフェクタードメインは、標的化された核酸配列を修飾又は影響し得る。エフェクタードメインは、切断ドメイン、後成的修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、又は転写リプレッサードメインであり得る。融合タンパク質は、核局在化シグナル、色素体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、複数の細胞内位置へのタンパク質輸送が可能なシグナルペプチド、細胞透過ドメイン、又はマーカードメイン、これは、Ｎ末端、Ｃ末端、又は融合タンパク質の内部位置に配置できる。Ｃｍｓ１ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又は融合タンパク質の内部に配置できる。Ｃｍｓ１ポリペプチドは、エフェクタードメインに直接融合することも、リンカーと融合することもできる。特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドをエフェクタードメインと融合するリンカー配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、又は長さ５０アミノ酸。例えば、リンカーは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、２〜３、３〜１０、３〜２０、５〜２０、又は１０〜５０アミノ酸の長さの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣｍｓ１ポリペプチドは、野生型Ｃｍｓ１タンパク質に由来することができる。Ｃｍｓ１由来のタンパク質は、修飾された変異体又は断片であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性が低減又は排除されたヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ドメイン）を含むように修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１由来のポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインがもはや機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように、ヌクレアーゼドメインが削除又は変異されるように修飾され得る。特に、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、最大の同一性のために整列された場合、ＳｍＣｍｓ１の７０１位又は９２２位（配列番号１０）又はＳｕｌｆＣｍｓ１の８４８位及び１２１３位（配列番号１１）に対応する位置に変異を有し得る。ヌクレアーゼドメインは、部位特異的変異誘発、ＰＣＲを介した変異誘発、全遺伝子合成などの既知の方法、ならびに当該技術分野において公知の他の方法を用いて、１つ又は複数の削除変異、挿入変異、及び／又は置換変異により不活性化し得る。例示的な実施形態では、融合タンパク質のＣｍｓ１ポリペプチドは、Ｃｍｓ１ポリペプチドがヌクレアーゼ活性を持たないようにＲｕｖＣ様ドメインを変異させることによって修飾される。
融合タンパク質はまた、Ｎ末端、Ｃ末端、又は融合タンパク質の内部位置に位置するエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは切断ドメインである。本明細書で使用される場合、「切断ドメイン」は、ＤＮＡを切断するドメインを指す。切断ドメインは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから取得できる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ又はＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が知られている（Ｓ１ヌクレアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、膵ＤＮａｓｅ Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼなど）。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３も参照されたい。これらの酵素（又はその機能的断片）の１つ以上を切断ドメインのソースとして使用できる。
いくつかの実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼに由来し得る。タイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼは、通常、認識部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な認識及び切断ドメインを有する。これらの酵素は、一時的に会合して二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適切なＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏｌＩ、及びＳａｐＩが含まれる。
特定の実施形態では、タイプＩＩ−Ｓ切断は、２つの異なる切断ドメイン（それぞれがＣｍｓ１ポリペプチド又はその断片に結合している）の二量体化を促進するように修飾することができる。エフェクタードメインが切断ドメインである実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、そのエンドヌクレアーゼ活性が排除されるように、本明細書で論じられるように修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ポリペプチドがもはやエンドヌクレアーゼ活性を示さないようにＲｕｖＣ様ドメインを変異させることにより修飾することができる。
他の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、後成的修飾ドメインであり得る。一般に、エピジェネティックな修飾ドメインは、ＤＮＡ配列を変更せずにヒストン構造や染色体構造を変更する。ヒストン及び／又はクロマチン構造の変化は、遺伝子発現の変化につながる可能性がある。エピジェネティック修飾の例には、ヒストンタンパク質のリジン残基のアセチル化又はメチル化、及びＤＮＡのシトシン残基のメチル化が含まれるが、これらに限定されない。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例には、ヒストンアセチルタンスフェラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、及びＤＮＡデメチラーゼドメインが含まれる。
エフェクタードメインがヒストンアセチルタンスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインである実施形態では、ＨＡＴドメインは、ＥＰ３００（すなわち、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）、ＣＲＥＢＢＰ（すなわち、ＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＣＤＹ１、ＣＤＹ２、ＣＤＹＬ１、ＣＬＯＣＫ、ＥＬＰ３、ＥＳＡ１、ＧＣＮ５（ＫＡＴ２Ａ）、ＨＡＴ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＡＴ５、ＭＹＳＴ１、ＭＹＳＴ２、ＭＹＳＴ３、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＡＴ、Ｐ／ＣＡＦ、Ｔｉｐ６０、ＴＡＦＩＩ２５０、又はＴＦ３Ｃ４に由来し得る。エフェクタードメインが後成的修飾ドメインである実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、そのエンドヌクレアーゼ活性が排除されるように、本明細書で論じられるように修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ポリペプチドがもはやヌクレアーゼ活性を持たないようにＲｕｖＣ様ドメインを変異させることによって修飾することができる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり得る。一般に、転写活性化ドメインは、転写制御要素及び／又は転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して、１つ又は複数の遺伝子の転写を増加及び／又は活性化する。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインは、限定されないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＮＦκＢｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１及び２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、及びＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の実施形態では、転写活性化ドメインは、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、及びＬｅｕ３であり得る。転写活性化ドメインは、野生型であっても、元の転写活性化ドメインの修飾バージョンであってもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、ＶＰ１６又はＶＰ６４転写活性化ドメインである。エフェクタードメインが転写活性化ドメインである実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、そのエンドヌクレアーゼ活性が排除されるように、本明細書で論じられるように修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ポリペプチドがもはやヌクレアーゼ活性を持たないようにＲｕｖＣ様ドメインを変異させることによって修飾することができる。
さらに他の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写リプレッサードメインであり得る。一般に、転写リプレッサードメインは、転写制御要素及び／又は転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して、１つ又は複数の遺伝子の転写を減少及び／又は終了させる。適切な転写リプレッサードメインの非限定的な例には、誘導性ｃＡＭＰアーリーリプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、クルッペル関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ−Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、Ｉ ｋａｐｐａ．Ｂリプレッサー、及びＭｅＣＰ２が含まれる。エフェクタードメインが転写リプレッサードメインである実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、そのエンドヌクレアーゼ活性が排除されるように、本明細書で論じられるように修飾され得る。例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ポリペプチドがもはやヌクレアーゼ活性を持たないようにＲｕｖＣ様ドメインを変異させることによって修飾することができる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの追加のドメインをさらに含む。適切な追加のドメインの非限定的な例には、核局在化シグナル、細胞透過又は転座ドメイン、及びマーカードメインが含まれる。
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメインである場合、少なくとも１つの融合タンパク質を含む二量体が形成され得る。二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は２つの異なる融合タンパク質を含む。他の実施形態では、ヘテロダイマーは、１つの融合タンパク質及び追加のタンパク質を含む。
二量体は、２つの融合タンパク質単量体が一次アミノ酸配列に関して同一であるホモ二量体であり得る。二量体がホモ二量体である一実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性が排除されるようにＣｍｓ１ポリペプチドを修飾することができる。エンドヌクレアーゼ活性が排除されるようにＣｍｓ１ポリペプチドが修飾される特定の実施形態では、各融合タンパク質モノマーは、同一のＣｍｓ１ポリペプチド及び同一の切断ドメインを含み得る。切断ドメインは、本明細書で提供される例示的な切断ドメインのいずれかなど、任意の切断ドメインであり得る。そのような実施形態では、特定のガイドＲＮＡは、融合タンパク質モノマーを異なるが密接に隣接する部位に導き、その結果、二量体形成時に、２つのモノマーのヌクレアーゼドメインが標的ＤＮＡに二本鎖切断を作成する。
二量体は、２つの異なる融合タンパク質のヘテロ二量体であることもできる。例えば、各融合タンパク質のＣｍｓ１ポリペプチドは、異なるＣｍｓ１ポリペプチドから、又はオーソロガスＣｍｓ１ポリペプチドから得ることができる。例えば、各融合タンパク質は、異なる供給源に由来するＣｍｓ１ポリペプチドを含み得る。これらの実施形態では、各融合タンパク質は、異なる標的部位（すなわち、プロトスペーサー及び／又はＰＡＭ配列によって特定される）を認識するであろう。例えば、ガイドＲＮＡは、それらのヌクレアーゼドメインが標的ＤＮＡにおいて効果的な二本鎖切断を生成するように、ヘテロ二量体を異なるが密接に隣接する部位に配置することができる。
あるいは、ヘテロ二量体の２つの融合タンパク質は異なるエフェクタードメインを持つことができる。エフェクタードメインが切断ドメインである実施形態では、各融合タンパク質は、異なる修飾切断ドメインを含むことができる。これらの実施形態において、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、それらのエンドヌクレアーゼ活性が排除されるように修飾され得る。ヘテロダイマーを形成する２つの融合タンパク質は、Ｃｍｓ１ポリペプチドドメインとエフェクタードメインの両方が異なる可能性がある。
上記の実施形態のいずれかにおいて、ホモダイマー又はヘテロダイマーは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、色素体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、タンパク質を複数の細胞内位置に輸送することができるシグナルペプチド、細胞−上記のように、浸透、転座ドメイン及びマーカードメインが含まれ得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｃｍｓ１ポリペプチドの一方又は両方は、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ活性が排除又は修飾されるように修飾され得る。
ヘテロ二量体はまた、１つの融合タンパク質及び追加のタンパク質を含み得る。例えば、追加のタンパク質はヌクレアーゼであり得る。一実施形態では、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含む。ジンクフィンガーは３つのヌクレオチドを認識して結合する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３つのジンクフィンガーから約７つのジンクフィンガーを含み得る。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するタンパク質に由来するか、操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；ａｎｄ Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、本明細書で詳述される任意の切断ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナル、色素体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、タンパク質を複数の細胞内位置に輸送することができるシグナルペプチド、詳細な細胞浸透ドメイン又は転座ドメインから選択される少なくとも１つの追加ドメインを含むことができ、本明細書に詳述される。
特定の実施形態では、上で詳述した任意の融合タンパク質又は少なくとも１つの融合タンパク質を含む二量体は、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含むタンパク質−ＲＮＡ複合体の一部であり得る。ガイドＲＮＡは、融合タンパク質のＣｍｓ１ポリペプチドと相互作用して、融合タンパク質を特定の標的部位に向け、ガイドＲＮＡ塩基の５’末端は、特定のプロトスペーサー配列と対を形成する。
ＩＩＩ．Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸
本明細書に記載される任意のＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸が提供される。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７に示されている。一実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは５’キャップ及び／又は３’ポリアデニル化することができる。別の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸はＤＮＡである。ＤＮＡはベクター内に存在できる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸は、目的の植物細胞内のタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化できる。コドン最適化のためのプログラムは、当技術分野で利用可能である（例えば、ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲのＯＰＴＩＭＩＺＥＲ；ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ ｏｐｔ．ｈｔｍｌのＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ．ＴＭ）。
特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡは、少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結され得る。ＤＮＡコード配列は、目的の宿主細胞における発現のためにプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。「作動可能に連結された」は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、プロモーターと目的のコード領域（例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチド又はガイドＲＮＡをコードする領域）との間の作動可能な連結は、目的のコード領域の発現を可能にする機能的リンクである。動作可能にリンクされた要素は、隣接していても、隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、作動可能に連結されることにより、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることが意図される。
プロモーター配列は、構成的、調節的、成長段階特異的、又は組織特異的であり得る。Ｃｍｓ１ポリペプチド及び／又はガイドＲＮＡの発現のタイミング、位置及び／又はレベルを調節するために、核酸分子における異なるプロモーターを使用することにより、異なる適用が増強され得ることが認識される。そのような核酸分子はまた、必要に応じて、プロモーター調節領域（例えば、誘導的、構成的、環境的又は発生的に調節される、又は細胞又は組織特異的／選択的発現を与えるもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡ処理シグナル、転写終結部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、植物での発現のために、構成的、組織優先、発生優先、又は他のプロモーターと組み合わせることができる。植物細胞で機能する構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’又は２’プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルなどがある。アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、及び当業者に知られている様々な植物遺伝子からの他の転写開始領域が含まれる。低レベルの発現が望まれる場合、弱いプロモーターを使用することができる。弱い構成的プロモーターには、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター（ＷＯ９９／４３８３８及び米国特許第６，０７２，０５０号）、コア３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターなどが含まれる。他の構成的プロモーターとしては、例えば、米国特許第４，６９３，０４７号、５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；及び第５，６０８，１４２号。また、米国特許第５，６９３，０４７号も参照されたい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１７７，６１１号も参照されたい。
誘導性プロモーターの例は、低酸素症又は低温ストレスによって誘導可能なＡｄｈ１プロモーター、熱ストレスによって誘導可能なＨｓｐ７０プロモーター、両方とも光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモーター及びペプカルボキシラーゼプロモーターである。化学的に誘導可能なプロモーター、例えば、より安全に誘導される（米国特許第５，３６４，７８０号）、エストロゲン誘導されるＥＲＥプロモーター、及びオーキシン誘導及びタペータム特異的であるが、カルスで活性化されるＡｘｉｇ１プロモーターも有用である（ＰＣＴ ＵＳ０１／２２１６９）。
植物の発生制御下にあるプロモーターの例には、葉、根、果実、種子、又は花などの特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターが含まれる。「組織特異的」プロモーターは、特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用する遺伝子調節レベルの結果である。したがって、相同又は密接に関連する植物種からのプロモーターは、特定の組織における導入遺伝子の効率的かつ信頼性の高い発現を達成するために使用することが好ましい場合がある。いくつかの実施形態では、発現は、組織優先プロモーターを含む。「組織優先」プロモーターは、特定の組織において転写を優先的に開始するが、必ずしも完全に又は単独で開始するわけではないプロモーターである。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド及び／又はガイドＲＮＡをコードする核酸分子は、細胞型特異的プロモーターを含む。「細胞型特異的」プロモーターは、１つ又は複数の臓器における特定の細胞型での発現を主に駆動するプロモーターである。植物で機能する細胞型特異的プロモーターが主に活性である植物細胞のいくつかの例には、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根の血管細胞、葉、茎細胞、及び幹細胞が含まれる。核酸分子はまた、細胞型の好ましいプロモーターを含み得る。「細胞型優先」プロモーターは、１つ又は複数の器官における特定の細胞型において、必ずしもほとんど又は完全にではなく、主に発現を駆動するプロモーターである。植物で機能する細胞型の好ましいプロモーターが優先的に活性であり得る植物細胞のいくつかの例には、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根の血管細胞、葉、茎細胞、及び幹細胞が含まれる。本明細書に記載される核酸分子はまた、種子優先プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、種子優先プロモーターは、胚嚢、初期胚、初期胚乳、アリューロン、及び／又は基底内胚乳移植細胞層（ＢＥＴＬ）において発現を有する。
種子に好ましいプロモーターの例には、限定されないがｍ２７ｋＤのガンマゼインプロモーター及びワキシープロモーターが含まれ、Ｂｏｒｏｎａｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４７：９５−１０２；Ｒｅｉｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（２１）：６４２６；Ｋｌｏｅｓｇｅｎ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：２３７−２４４に記載される。胚、果皮、及び胚乳で発現するプロモーターは、米国特許第６，２２５，５２９号及びＰＣＴ公開ＷＯ００／１２７３３に開示されている。これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
胚嚢、初期胚、初期胚乳、アリューロン及び／又は基底内胚乳移動細胞層（ＢＥＴＬ）での発現を伴う植物種子優先様式で遺伝子発現を駆動することができるプロモーターを、本明細書で開示される組成物及び方法で使用することができる。このようなプロモーターとしては、限定されないが、Ｚｅａ ｍａｙｓ初期胚乳５遺伝子、Ｚｅａ ｍａｙｓ初期胚乳１遺伝子、Ｚｅａ ｍａｙｓ初期胚乳２遺伝子、ＧＲＭＺＭ２Ｇ１２４６６３、ＧＲＭＺＭ２Ｇ００６５８５、ＧＲＭＺＭ２Ｇ１２０００８、ＧＲＭＺＭ２Ｇ１５７８０６、ＧＲＭＺＭ２Ｇ１７６３９０、ＧＲＭＺＭ２Ｇ４７２２３４、ＧＲＭＺＭ２Ｇ１３８７２７、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＣＬＡＶＡＴＡ１、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＭＲＰ１、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰＲ６０２、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＰＲ９ａ、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴ１、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴＬ−２、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴＬ−３、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴＬ−４、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴＬ−９、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＢＥＴＬ−１０、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＭＥＧ１、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＴＣＣＲ１、Ｚｅａ ｍａｙｓ ＡＳＰ１、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＡＳＰ１、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ ＰＲ６０、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ ＰＲ９１、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ ＧＬ７、ＡＴ３Ｇ１０５９０、ＡＴ４Ｇ１８８７０、ＡＴ４Ｇ２１０８０、ＡＴ５Ｇ２３６５０、ＡＴ３Ｇ０５８６０、ＡＴ５Ｇ４２９１０、ＡＴ２Ｇ２６３２０、ＡＴ３Ｇ０３２６０、ＡＴ５Ｇ２６６３０、ＡｔＩＰＴ４、ＡｔＩＰＴ８、ＡｔＬＥＣ２、ＬＦＡＨ１２に天然に連結されるプロモーターが含まれる。追加のそのようなプロモーターは、米国特許第７８０３９９０号、８０４９０００号、７７４５６９７号、７１１９２５１号、７９６４７７０号、７８４７１６０号、７７００８３６号、米国特許出願公開第２０１００３１３３０１号、２００９００４９５７１号、２００９００８９８９７号、２０１００２８１５６９、２０１００２８１５７０、２０１２００６６７９５、２００４０００３４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ／１９９９／０５０４２７、ＷＯ／２０１０／１２９９９９、ＷＯ／２００９／０９４７０４、ＷＯ／２０１０／０１９９９６及びＷＯ／２０１０／１４７８２５（これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるに記載されている）に記載されている。本明細書に記載されるプロモーターの機能的変異体又は機能的断片は、本明細書に開示される核酸に機能的に連結することもできる。
化学的に調節されたプロモーターは、外因性の化学調節因子の適用を通じて遺伝子の発現を調節するために使用することができる。目的に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーター、又は化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであり得る。化学誘導性プロモーターは当技術分野で知られており、限定されないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、プレ−発芽性除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが含まれる。関心のある他の化学的に調節されたプロモーターには、ステロイド応答性プロモーターが含まれる（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１−１０４２５、及びＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）、及びテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，８１４，６１８及び５，７８９，１５６）が含まれる（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
組織優先プロモーターを利用して、特定の組織内の発現構築物の増強された発現を標的とすることができる。特定の実施形態では、組織優先プロモーターは、植物組織において活性であり得る。組織優先プロモーターは当技術分野で知られている。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０；Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５を参照されたい。そのようなプロモーターは、必要に応じて、弱い発現のために修飾することができる。
葉に好ましいプロモーターは当技術分野で知られている。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｇｏｔｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０を参照されたい。さらに、ｃａｂ及びｒｕｂｉｓｃｏのプロモーターも使用できる。例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９５８）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２７２３−２７２９及びＴｉｍｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５７−５８を参照されたい。
ルート優先プロモーターは知られており、文献から入手可能な多くのものから選択するか、又は様々な適合種から新規に単離することができる。例えば、Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０（２）：２０７−２１８（大豆根特異的グルタミン合成酵素遺伝子）；Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ （１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３（１０）：１０５１−１０６１（インゲンマメのＧＲＰ１．８遺伝子の根特異的制御要素）；Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４（３）：４３３−４４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根特異的プロモーター）；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３（１）：１１−２２ ダイズの根及び根粒で発現する部位ゾルのグルタミン合成酵素（ＧＳ）をコードする完全長のｃＤＮＡクローン）．を参照されたい。Ｂｏｇｕｓｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２（７）：６３３−６４１を参照されたい。ここでは、窒素固定非マメ科Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉからのヘモグロビン遺伝子から分離された２つの根特異的プロモーターと、関連する非窒素固定非マメ科Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａについて説明されている。これらの遺伝子のプロモーターは、β−グルクロニダーゼレポーター遺伝子にリンクされ、非マメ科ニコチアナタバクムとマメ科ロータスコルニキュラタスの両方に導入され、どちらの場合も根特異的プロモーター活性が維持された。リーチとアオヤギ（１９９１）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの高発現ｒｏＩＣ及びｒｏＩＤ根誘導遺伝子のプロモーターの分析について説明する（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）７９（１）：６９−７６を参照）。彼らは、エンハンサーと組織優先のＤＮＡ決定基がそれらのプロモーターで解離していると結論した。コードするアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ遺伝子が根端の表皮で特に活性であり、ＴＲ２’遺伝子が無傷の植物に根特異的であり、葉組織の損傷により刺激されることを示した。殺虫性又は殺虫性遺伝子で使用するための特に望ましい特性の組み合わせである（ＥＭＢＯ Ｊ．８（２）：３４３−３５０を参照）。ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合したＴＲ１’遺伝子は、同様の特性を示した。追加のルート優先プロモーターには、ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーターが含まれる（Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９（４）：７５９−７７２）；及びｒｏＩＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５（４）：６８１−６９１。米国特許第５，８３７，８７６号、５，７５０，３８６号、５，６３３，３６３号、５，４５９，２５２号、５，４０１，８３６号、５，１１０，７３２号、及び５，０２３，１７９号も参照。ファセオリン遺伝子（Ｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：４７６−４８２及びＳｅｎｇｏｐｔａ−Ｇｏｐａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８２：３３２０−３３２４）。プロモーター配列は野生型でも、より効率的又は効果的な発現のために修飾することもできる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列は、インビトロｍＲＮＡ合成のためにファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に機能的に連結することができる。そのような実施形態では、インビトロ転写されたＲＮＡは、本明細書に記載されているゲノム修飾の方法で使用するために精製することができる。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーター配列、又はＴ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーター配列のバリエーションであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする配列は、植物細胞におけるＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質のインビトロ発現のためのプロモーター配列に作動可能に連結され得る。そのような実施形態では、発現されたタンパク質は、本明細書に記載されるゲノム修飾の方法で使用するために精製することができる。
特定の実施形態において、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡはまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル及び目的の細胞において機能的な他のシグナル）及び／又は少なくとも１つの転写終結配列に連結され得る。さらに、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの核移行シグナル、少なくとも１つの色素体シグナルペプチド、少なくとも１つのミトコンドリアシグナルペプチド、複数の細胞内位置にタンパク質を輸送できる少なくとも１つのシグナルペプチド、少なくとも１つの細胞浸透ドメイン、及び／又は本明細書の他の箇所に記載されている少なくとも１つのマーカードメインをコードする配列に連結することもできる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ベクター中に存在することができる。適切なベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）が含まれる。一実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡは、プラスミドベクター中に存在する。適切なプラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＭＢＩＡ、及びそれらの変異体が含まれる。ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。追加情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３又は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み得る。ガイドＲＮＡをコードする配列は、目的の植物又は植物細胞におけるガイドＲＮＡの発現のために、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、及び７ＳＬ ＲＮＡプロモーターならびにイネＵ６及びＵ３プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ．ゲノムのヌクレオチド配列を変更する方法
本明細書では、ゲノムのヌクレオチド配列を修飾するための方法が提供される。ゲノムの非限定的な例には、細胞、核、オルガネラ、プラスミド、及びウイルスのゲノムが含まれる。この方法は、ゲノム宿主（例えば、細胞又はオルガネラ）に、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」、又は「ｃｒＲＮＡ」）、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドなどの１つ以上のＤＮＡ標的化ポリヌクレオチドを導入することを含む。ここで、ＤＮＡ標的化ポリヌクレオチドは、（ａ）標的ＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用し、ゲノムホストにＣｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する第２セグメントを含む。ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、（ａ）ｇＲＮＡ又は他のＤＮＡ標的ポリヌクレオチドと相互作用するポリヌクレオチド結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む。次に、ゲノム宿主は、Ｃｍｓ１ポリペプチドが発現され、ｇＲＮＡによって標的とされるヌクレオチド配列を切断する条件下で培養することができる。本明細書に記載されるシステムは、外因性のＭｇ２＋又は他の任意のイオンの添加を必要としないことに留意されたい。最後に、修飾ヌクレオチド配列を含むゲノム宿主を選択することができる。
本明細書に開示される方法は、本明細書に記載されるように、ゲノム宿主に少なくとも１つのＣｍｓ１ポリペプチド又は少なくとも１つのＣｍｓ１ポリペプチドをコードする核酸を導入することを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、単離されたタンパク質としてゲノム宿主に導入され得る。そのような実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、タンパク質の細胞取り込みを促進する少なくとも１つの細胞透過ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、ガイドポリヌクレオチドと複合した核タンパク質として（例えば、ガイドＲＮＡと複合したリボ核タンパク質として）ゲノム宿主に導入することができる。他の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子としてゲノム宿主に導入することができる。さらに他の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子としてゲノム宿主に導入することができる。一般に、本明細書に記載されるＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム宿主で機能するプロモーター配列に機能的に連結されている。ＤＮＡ配列は線状であっても、ＤＮＡ配列がベクターの一部であってもよい。さらに他の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質は、ガイドＲＮＡ又は融合タンパク質及びガイドＲＮＡを含むＲＮＡ−タンパク質複合体としてゲノム宿主に導入することができる。
特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、オルガネラ（例えば、色素体又はミトコンドリア）を標的とし得る。特定の実施形態では、１つ又は複数のガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、オルガネラ（例えば、色素体又はミトコンドリア）を標的とすることができる。特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び１つ以上のガイドＲＮＡは、オルガネラ（例えば、色素体又はミトコンドリア）を標的とし得る。オルガネラにｍＲＮＡをターゲティングする方法は、当技術分野で知られており（例えば、米国特許出願２０１１／０２９６５５１、米国特許出願２０１１／０３２１１８７、Ｇｏｍｅｚ ａｎｄ Ｐａｌｌａｓ（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１２２６９を参照）、参照により本明細書に組み入れられる。
特定の実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み得る。一般に、Ｃｍｓ１ポリペプチド及びガイドＲＮＡをコードする各配列は、ゲノム宿主におけるＣｍｓ１ポリペプチド及びガイドＲＮＡのそれぞれの発現を可能にする１つ又は複数の適切なプロモーター制御配列に機能的に連結されている。Ｃｍｓ１ポリペプチド及びガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、追加の発現制御、調節、及び／又はプロセシング配列をさらに含むことができる。Ｃｍｓ１ポリペプチド及びガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、線状であり得、又はベクターの一部であり得る。
本明細書に記載の方法はさらに、ガイドＲＮＡなどの少なくとも１つのポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つのガイドＲＮＡ又はＤＮＡをゲノム宿主に導入することを含み得る。ガイドＲＮＡは、Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用して、Ｃｍｓ１ポリペプチドを特定の標的部位に誘導し、その部位で、ガイドＲＮＡ塩基は、標的部位の特定のＤＮＡ配列と対になる。ガイドＲＮＡは３つの領域で構成される。ターゲットＤＮＡ配列の標的部位に相補的な第１領域、ステムループ構造を形成する第２領域、及び本質的に一本鎖のままである第３領域である。各ガイドＲＮＡの最初の領域は、各ガイドＲＮＡがＣｍｓ１ポリペプチドを特定の標的部位に誘導するように異なる。各ガイドＲＮＡの２番目と３番目の領域は、すべてのガイドＲＮＡで同じにすることができる。
ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対を形成できるように、ガイドＲＮＡの１つの領域は、標的化ＤＮＡの標的部位における配列（すなわち、プロトスペーサー配列）に相補的である。様々な実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、約８ヌクレオチドから約３０を超えるヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの最初の領域とヌクレオチド配列の標的部位との間の塩基対合の領域は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５であり得る。約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２２、約２３、約２４、約２５、約２７、約３０又は３０以上のヌクレオチド長であり得る。例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、長さが約２３、２４、又は２５ヌクレオチドである。ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成する第２の領域を含み得る。いくつかの実施形態では、二次構造は、ステム又はヘアピンを含む。茎の長さは様々である。例えば、ステムは、約５〜約６、約１０、約１５、約２０、約２５塩基対の長さの範囲であり得る。ステムは、１〜約１０ヌクレオチドの１つ又は複数のバルジを含むことができる。いくつかの好ましい実施形態では、ヘアピン構造は、「ＵＣＵＡＣ」と「ＧＵＡＧＡ」の塩基対合がステムを形成する、配列ＵＣＵＡＣＮ３−５ＧＵＡＧＡＵ（配列番号３１２−３１４、配列番号３１５−３１７によりコードされる）を含む。「Ｎ３−５」は、３、４、又は５ヌクレオチドを示す。したがって、第２の領域の全長は、約１４から約２５ヌクレオチド長の範囲であり得る。特定の実施形態では、ループは約３、４、又は５ヌクレオチド長であり、ステムは約５、６、７、８、９、又は１０塩基対を含む。
ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖のままである第３の領域を含み得る。したがって、第３の領域は、目的の細胞内のいかなるヌクレオチド配列に対しても相補性を有さず、ガイドＲＮＡの残りに対しては相補性を有さない。３番目の領域の長さは様々である。一般に、第３の領域は、長さが約４ヌクレオチドを超える。例えば、第３の領域の長さは、約５〜約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。ガイドＲＮＡの第２及び第３の領域（ユニバーサル又は足場領域とも呼ばれる）を合わせた長さは、約３０〜約１２０ヌクレオチド長の範囲であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡの第２及び第３の領域を合わせた長さは、約４０から約４５ヌクレオチド長の範囲である。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３つの領域すべてを含む単一の分子を含む。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別個の分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第１の領域及びガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の半分を含み得る。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第２の領域及びガイドＲＮＡの第３の領域の「ステム」の他の半分を含み得る。したがって、この実施形態では、第１及び第２のＲＮＡ分子はそれぞれ、互いに相補的なヌクレオチドの配列を含む。例えば、一実施形態では、第１及び第２のＲＮＡ分子はそれぞれ、他の配列と塩基対を形成して機能的ガイドＲＮＡを形成する配列（約６〜約２５ヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡ（すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせずに、染色体の標的部位及びＣｍｓ１ポリペプチドと相互作用する単一分子（すなわち、ｃｒＲＮＡ）である。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子としてゲノム宿主に導入することができる。ＲＮＡ分子はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することができる。あるいは、ＲＮＡ分子は化学的に合成することができる。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ分子としてゲノム宿主に導入することができる。このような場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ゲノム宿主におけるガイドＲＮＡの発現のために１つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結され得る。例えば、ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、線状又は環状であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ベクターの一部であり得る。適切なベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクターが含まれる。例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター中に存在する。適切なプラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＭＢＩＡ、及びそれらの変異体が含まれる。ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。
Ｃｍｓ１ポリペプチド及びガイドＲＮＡの両方がＤＮＡ分子としてゲノム宿主に導入される実施形態において、それぞれは、別個の分子（例えば、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質コード配列を含む１つのベクター及びガイドＲＮＡを含む第２のベクター）の一部であり得る。コード配列）又は両方は、同じ分子の一部であり得る（例えば、１つのベクターは、Ｃｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質及びガイドＲＮＡの両方のためのコード（及び調節）配列を含む）。
ガイドＲＮＡと組み合わせたＣｍｓ１ポリペプチドは、ゲノム宿主の標的部位に向けられ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、標的化ＤＮＡに二本鎖切断を導入する。標的部位には、配列の直前に（上流）コンセンサス配列があることを除いて、配列の制限はない。このコンセンサス配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とも呼ばれる。
ＰＡＭ配列の例には、ＴＴＴＮ、ＮＴＴＮ、ＴＴＴＶ、及びＮＴＴＶが含まれる（Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＶはＡ、Ｇ、又はＣとして定義される）。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが所望の二本鎖切断を生成することを可能にするために、適切なＰＡＭ配列が標的化ＤＮＡ配列に対して正しい位置に配置されなければならないことは、当該技術分野で周知である。これまでに特徴付けられたすべてのＣｍｓ１ヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はターゲットＤＮＡ配列のすぐ５’に位置する。特定のＣｍｓ１ヌクレアーゼのＰＡＭ部位要件は、現時点では計算で予測できず、代わりに、当技術分野で利用可能な方法を使用して実験的に決定する必要がある（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：７５９−７７１；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６９：１４６−１５７）。所与のヌクレアーゼ酵素に対するＰＡＭ配列特異性が酵素濃度によって影響を受けることは当技術分野でよく知られている（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：２５３）。したがって、目的の細胞又はインビトロ系に送達されるＣｍｓ１タンパク質の濃度を調節することは、そのＣｍｓ１酵素に関連する１つ又は複数のＰＡＭ部位を変更する方法を表す。目的のシステムでのＣｍｓ１タンパク質濃度の調整は、例えば、Ｃｍｓ１をコードする遺伝子の発現に使用されるプロモーターを変更することによって、細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏシステムに送達されるリボ核タンパク質の濃度を変更することによって、又はイントロンを追加又は削除することによって達成できる。それは遺伝子発現レベルの調節に役割を果たす場合がある。本明細書で詳述されるように、ガイドＲＮＡの最初の領域は、標的配列のプロトスペーサーに相補的である。典型的には、ガイドＲＮＡの最初の領域は、約１９から２１ヌクレオチドの長さである。
標的部位は、遺伝子のコード領域、遺伝子のイントロン、遺伝子の制御領域、遺伝子間の非コード領域などにあり得る。遺伝子は、タンパク質コード遺伝子又はＲＮＡコード遺伝子であり得る。遺伝子は、本明細書に記載されるように、関心のある任意の遺伝子であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドをゲノム宿主に導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、標的化ＤＮＡに見られる内因性又は天然の配列に対応する。例えば、ドナー配列は、標的部位又はその近くのＤＮＡ配列の一部と本質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。したがって、ドナー配列は、野生型配列の修飾バージョンを標的部位に含むことができ、天然配列との統合又は交換時に、標的位置の配列が少なくとも１つのヌクレオチド変化を含むようにする。例えば、変化は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせであり得る。修飾された配列の統合の結果として、ゲノム宿主は、標的化された染色体配列から修飾された遺伝子産物を産生することができる。
あるいは、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、外因性配列に対応し得る。本明細書で使用される場合、「外因性」配列は、ゲノム宿主にとって天然ではない配列、又はゲノム宿主におけるその天然の位置が異なる位置にある配列を指す。例えば、外因性配列は、タンパク質コーディング配列を含み得、これは、ゲノムへの組み込み時に、ゲノム宿主が組み込まれた配列によってコードされるタンパク質を発現できるように、外因性プロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ドナー配列は、本明細書の他の箇所に記載されているような農学的に重要な形質をコードするものなど、対象の任意の遺伝子であり得る。あるいは、その発現が内因性プロモーター制御配列によって調節されるように、外因性配列を標的化ＤＮＡ配列に組み込むことができる。他の反復では、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、又はＲＮＡコード配列であり得る。外因性配列の標的ＤＮＡ配列への組み込みは、「ノックイン」と呼ばれる。ドナー配列は、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチドから数十万ヌクレオチドまでの長さが異なり得る。
いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、標的部位の上流及び下流にそれぞれ位置する配列と実質的な配列同一性を有する上流配列及び下流配列に隣接している。これらの配列類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流及び下流配列は、ドナーポリヌクレオチドと標的配列との間の相同組換えを可能にし、ドナー配列を標的ＤＮＡ配列に組み込む（又は交換する）ことができる。
本明細書で使用される上流配列は、標的部位の上流のＤＮＡ配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流配列は、標的部位の下流のＤＮＡ配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で使用する場合、「実質的な配列同一性」という語句は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドの上流及び下流配列は、標的部位の上流又は下流の配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの上流及び下流配列は、標的部位の上流又は下流のヌクレオチド配列と約９５％又は１００％の配列同一性を有することができる。一実施形態では、上流配列は、標的部位のすぐ上流に（すなわち、標的部位に隣接して）位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流配列は、標的部位の上流約１００ヌクレオチド内に位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は、標的部位から上流にある約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、又は約８１〜約１００ヌクレオチドに位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有することができる。一実施形態では、下流配列は、標的部位のすぐ下流に（すなわち、標的部位に隣接して）位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流配列は、標的部位から下流の約１００（１００）ヌクレオチド内に位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は、標的部位の下流から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、又は約８１〜約１００ヌクレオチドに位置するヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を共有することができる。
各上流又は下流配列は、長さが約２０ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、上流及び下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、又は５０００ヌクレオチドを含み得る。例示的な実施形態では、上流及び下流配列は、長さが約５０〜約１５００ヌクレオチドの範囲であり得る。
標的ヌクレオチド配列に対して配列類似性を有する上流及び下流配列を含むドナーポリヌクレオチドは、直線状又は環状であり得る。ドナーポリヌクレオチドが環状である実施形態では、それはベクターの一部であり得る。例えば、ベクターはプラスミドベクターであり得る。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、Ｃｍｓ１ポリペプチドによって認識される少なくとも１つの標的化切断部位をさらに含み得る。ドナーポリヌクレオチドに加えられる標的化切断部位は、ドナー配列の上流又は下流に、又は上流及び下流の両方に配置することができる。例えば、ドナー配列は、Ｃｍｓ１ポリペプチドによる切断時に、ドナー配列が、Ｃｍｓ１ポリペプチドによる切断時に生成されるヌクレオチド配列におけるそれらと適合するオーバーハングにより隣接されるように、標的化切断部位により隣接され得る。したがって、ドナー配列は、非相同修復プロセスによる二本鎖切断の修復中に、切断されたヌクレオチド配列と連結することができる。一般に、標的化された切断部位を含むドナーポリヌクレオチドは、環状である（例えば、プラスミドベクターの一部であり得る）。
ドナーポリヌクレオチドは、Ｃｍｓ１ポリペプチドによって生成されるオーバーハングと互換性のある任意の短いオーバーハングを有する短いドナー配列を含む線状分子であり得る。そのような実施形態では、二本鎖切断の修復中に、ドナー配列を切断された染色体配列と直接連結することができる。場合によっては、ドナー配列は、約１，０００未満、約５００未満、約２５０未満、又は約１００未満のヌクレオチドであり得る。特定の場合において、ドナーポリヌクレオチドは、平滑末端を有する短いドナー配列を含む線状分子であり得る。他の反復において、ドナーポリヌクレオチドは、５’及び／又は３’オーバーハングを有する短いドナー配列を含む線状分子であり得る。オーバーハングは１、２、３、４、又は５ヌクレオチドを含むことができる。
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖及び／又は線状又は環状であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又はリポソーム若しくはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合化した核酸であり得る。特定の実施形態では、ドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドは、プラスミドベクターの一部であり得る。これらの状況のいずれにおいても、ドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つの追加の配列をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、方法は、１つのＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（又はコードＤＮＡ）をゲノム宿主に導入することを含み得、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、標的ＤＮＡに１つの二本鎖切断を導入する。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、ヌクレオチド配列の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復することができる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの削除、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせが、切断の修復中に発生する可能性がある。したがって、標的ヌクレオチド配列は、修飾又は不活化され得る。例えば、単一ヌクレオチド変化（ＳＮＰ）は、変化したタンパク質産物を生じ得るか、又はコード配列のリーディングフレームのシフトは、タンパク質産物が作製されないように配列を不活性化又は「ノックアウト」し得る。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、二本鎖切断の修復中に標的部位でヌクレオチド配列と交換又は統合することができる。ヌクレオチド配列中の標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列により、ドナー配列は、相同性により媒介される修復中に標的部位のヌクレオチド配列と交換又は組み込まれ得る。あるいは、ドナー配列が互換性のあるオーバーハング（又は互換性のあるオーバーハング）に隣接している実施形態では、ａｎｇｓはＣｍｓ１ポリペプチドによってその場で生成される）二本鎖切断の修復中に、非相同修復プロセスにより、ドナー配列を切断されたヌクレオチド配列と直接ライゲーションできる。ドナー配列のヌクレオチド配列への交換又は組み込みは、標的ヌクレオチド配列を修飾するか、又は外来ヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列に導入する。
本明細書に開示される方法はまた、１つ又は複数のＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード核酸）及び２つのガイドポリヌクレオチド（又はコードＤＮＡ）をゲノム宿主に導入することを含むことができ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは標的ヌクレオチド配列に２つの二本鎖切断を導入する。２つの切断は、数塩基対内、数十塩基対内、又は数千塩基対で区切ることができる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、結果として生じる二本鎖切断は、２つの切断部位間の配列が失われ、及び／又は少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせが切断の修復中に起こり得るように、非相同修復プロセスによって修復することができる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する実施形態において、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、相同性に基づく修復プロセス（例えば、ドナー配列が、ヌクレオチド配列の標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接している実施形態における）、又は非相同修復プロセス（例えば、ドナー配列が互換性のあるオーバーハングに隣接する実施形態における）のいずれかによる二本鎖切断の修復中に標的ヌクレオチド配列と交換又は統合され得る。
Ａ．植物ゲノムのヌクレオチド配列を修飾する方法
植物細胞は、核、色素体、ミトコンドリアのゲノムを有する。本発明の組成物及び方法は、核、色素体、及び／又はミトコンドリアゲノムの配列を修飾するために使用され得るか、又は核、色素体、及び／若しくはミトコンドリアゲノムによってコードされる遺伝子の発現を調節するために使用され得る。したがって、「染色体」又は「染色体」は、核、色素体、又はミトコンドリアのゲノムＤＮＡを意図している。植物細胞に適用される「ゲノム」は、核内に見られる染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えば、ミトコンドリア又は色素体）内に見られるオルガネラＤＮＡを含む。植物細胞、オルガネラ、又は胚における目的のヌクレオチド配列は、本明細書に記載の方法を使用して修飾することができる。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物ホルモン、植物防御タンパク質、栄養素輸送タンパク質、生物関連タンパク質、望ましい入力形質、望ましい出力形質、ストレス耐性遺伝子、疾患／病原体耐性遺伝子、雄性不妊症、発生遺伝子、調節遺伝子、光合成に関与する遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子、転写調節遺伝子、又は任意の他の、目的のポリヌクレオチド及び／若しくはポリペプチドなどの農学的に重要な形質をコードするヌクレオチド配列を修飾するために使用される。油、デンプン、タンパク質含有量などの農学的に重要な特性も変更できる。変更には、オレイン酸、飽和及び不飽和油の含有量の増加、リジンと硫黄のレベルの増加、必須アミノ酸の提供、及びデンプンの変更が含まれる。ホルドチオニンタンパク質修飾は、米国特許第５，７０３，０４９号、第５，８８５，８０１号、第５，８８５，８０２号、及び第５，９９０，３８９号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。別の例は、米国特許第５，８５０，０１６号に記載されているダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリジン及び／又は硫黄に富む種子タンパク質、ならびにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６に記載されている大麦由来のキモトリプシン阻害剤であり、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド（又はコード化核酸）、ガイドＲＮＡ（又はコード化ＤＮＡ）、及びオプションのドナーポリヌクレオチドは、形質転換を含む様々な方法で植物細胞、細胞小器官、又は植物胚に導入できる。形質転換プロトコル、ならびにポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる植物又は植物細胞のタイプ、すなわち単子葉植物又は双子葉植物に応じて異なり得る。ポリペプチド及びポリヌクレオチドを植物細胞に導入する適切な方法には、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム媒介形質転換（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５６３，０５５及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９８１，８４０）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２）、及び衝撃粒子加速（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，９４５，０５０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８７９，９１８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８８６，２４４；ａｎｄ，５，９３２，７８２；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）；及びＬｅｃ１形質転換（ＷＯ００／２８０５８）が含まれる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（オニオン）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（大豆；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（大豆）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（大豆）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，２４０，８５５；５，３２２，７８３；５，３２４，６４６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７３６，３６９（オオムギ）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６ （ｗｈｉｓｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーシ）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５及びＣｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（ｍａｉｚｅ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）もまた参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼと適切なガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質のバイオリスティック導入による植物細胞の部位固有のゲノム編集が実証されている（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１３２７４）；これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる。「安定した形質転換」とは、植物に導入されたヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に遺伝することができることを意味することを意図する。ヌクレオチド構築物は、植物の核、色素体、又はミトコンドリアのゲノムに組み込まれていてもよい。プラスチド形質転換の方法は当技術分野で知られており（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１４）Ｐａｌ Ｍａｌｉｇａ，ｅｄ．、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２０１１／０３２１１８７を参照）、植物ミトコンドリア形質転換の方法は当技術分野で説明されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願２０１１／０２９６５５１を参照されたい。
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物に成長（すなわち、培養）され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。このようにして、本発明は、ゲノムに安定に組み込まれた核酸修飾を有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）を提供する。
核酸断片（例えば、組換えＤＮＡ構築物）を細胞に挿入する文脈において「導入される」とは、「トランスフェクション」又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、植物への核酸断片の組み込みへの言及を含む。核酸断片が細胞のゲノムに組み込まれる可能性がある細胞（例：核染色体、プラスミド、色素体染色体、ミトコンドリア染色体）、自律レプリコンに変換される、又は一過性に発現される（例：トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
本発明は、単子葉植物及び双子葉植物（すなわち、それぞれ、単子葉植物の及び双子葉植物の）を含むがこれらに限定されない任意の植物種の形質転換に使用され得る。対象となる植物種の例には、限定されないが、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、種子油の供給源として有用なそれらのＢｒａｓｓｉｃａ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、キビ（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワキビ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）、チコリ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、お茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ．）、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、野菜、観賞植物、及び針葉樹が挙げられる。
Ｃｍｓ１ポリペプチド（又はコードする核酸）、ガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）、及びオプションのドナーポリヌクレオチドは、植物細胞、オルガネラ、又は植物胚に同時に又は連続して導入できる。Ｃｍｓ１ポリペプチド（又はコード化核酸）とガイドＲＮＡ（又はコード化ＤＮＡ）の比は、一般に、ほぼ化学量論的であり、２つの成分がターゲットＤＮＡとＲＮＡ−タンパク質複合体を形成できる。一実施形態では、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター内で一緒に送達される。
本明細書に開示される組成物及び方法は、光合成に関与する遺伝子などの、植物における目的の遺伝子の発現を変化させるために使用され得る。したがって、光合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現は、対照植物と比較して調節され得る。「対象の植物又は植物細胞」は、突然変異などの遺伝子修飾が目的の遺伝子に関して行われたものであるか、又はそのように修飾された植物又は細胞に由来し、変更を含む植物又は植物細胞である。「対照」又は「対照植物」又は「対照植物細胞」は、対象の植物又は植物細胞の表現型の変化を測定するための基準点を提供する。したがって、発現レベルは、本発明の方法に応じて、対照植物における発現レベルよりも高い又は低い。
対照植物又は植物細胞は、例えば、以下を含み得る：（ａ）野生型植物又は細胞、すなわち、対象の植物又は細胞をもたらした遺伝子改変のための出発材料と同じ遺伝子型のもの；（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物などの目的の形質に既知の影響を及ぼさない構築物）で形質転換された植物又は植物細胞；（ｃ）対象の植物又は植物細胞の子孫の中で非形質転換分離個体である植物又は植物細胞；（ｄ）対象の植物又は植物細胞と遺伝的に同一であるが、目的の遺伝子の発現を誘導する条件又は刺激に曝露されていない植物又は植物細胞；又は（ｅ）対象の遺伝子が発現されない条件下での対象植物又は植物細胞自体。
本発明は形質転換植物に関して記載されているが、本発明の形質転換生物はまた、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び胚芽、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根の先端、葯などの植物又は植物の一部に無傷である植物細胞を含むことが認識される。穀物とは、種の栽培又は繁殖以外の目的で商業栽培者が生成する成熟した種子を意味する。再生された植物の子孫、変異体、及び突然変異体もまた、これらの部分が導入されたポリヌクレオチドを含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。
コード配列の誘導体は、コードされたポリペプチドにおける予め選択されたアミノ酸のレベルを増加させるために、本明細書に開示された方法を使用して作製され得る。例えば、オオムギ高リジンポリペプチド（ＢＨＬ）をコードする遺伝子は、オオムギキモトリプシン阻害剤に由来し、１９９６年１１月１日出願の米国出願番号０８／７４０，６８２、及びＷＯ９８／２０１３３を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。他のタンパク質には、ヒマワリの種（Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ），ｐｐ．４９７−５０２；本明細書に援用）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７１：３５９；ともに本明細書に援用）；及びイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１２：１２３、本明細書に援用）などに由来するメチオニンに富む植物タンパク質が含まれる。他の農学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ ２、成長因子、種子貯蔵因子、及び転写因子をコードする。
本明細書に開示される方法は、除草剤耐性形質を修飾するために使用でき、例えば、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害するように作用する除草剤、特にスルホニル尿素型除草剤（例えば、このような耐性をもたらす突然変異、特にＳ４及び／又はＨｒａ突然変異、を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）に対する耐性をコードする遺伝子、又はホスフィノスリシン若しくはバスタなどのグルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤；グリホサート（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子及びＧＡＴ遺伝子；例えば、米国公開番号２００４００８２７７０及びＷＯ０３／０９２３６０を参照されたい）に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、バー遺伝子）；又は当該技術分野において公知である他のこのような遺伝子が含まれる。ｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質カナマイシン及びジェネティシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は除草剤クロルスルフロンに対する耐性をコードする。追加の除草剤耐性特性は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願２０１６／０２０８２４３に記載されている。
生殖不能遺伝子も修飾することができ、物理的な分解の代替手段となる。そのような方法で使用される遺伝子の例には、米国特許第５，５８３，２１０号に記載されている、雄性組織優先遺伝子及びＱＭなどの雄性不妊表現型を有する遺伝子が含まれる。他の遺伝子には、キナーゼと、雄性又は雌性の配偶体発生に毒性のある化合物をコードする遺伝子が含まれる。追加の無菌特性は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願２０１６／０２０８２４３に記載されている。
穀物の品質は、油のレベルとタイプ、飽和と不飽和、必須アミノ酸の品質と量、セルロースのレベルなどの特性をコードする遺伝子を変更することによって変更できる。トウモロコシにおいて、修飾されたホルドチオニンタンパク質は、米国特許第５，７０３，０４９号、第５，８８５，８０１号、第５，８８５，８０２号、及び第５，９９０，３８９号に記載されている。
商業的特徴はまた、遺伝子を修飾することによって変更することができ、又は例えばエタノール生成のためのデンプンを増加させることができ、又はタンパク質の発現を提供することができる。修飾された植物の別の重要な商業的用途は、米国特許第５，６０２，３２１号に記載されているようなポリマー及びバイオプラスチックの生成である。β−ケトチオラーゼ、ＰＨＢａｓｅ（ポリヒドロキシブリーレートシンターゼ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７を参照）などの遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の発現を促進する。
外因性産物には、植物酵素及び産物、ならびに原核生物及び他の真核生物を含む他の供給源からの産物が含まれる。そのような製品には、酵素、補因子、ホルモンなどが含まれる。タンパク質のレベル、特に植物の栄養価を改善するためにアミノ酸分布が改善された修飾タンパク質のレベルを上げることができる。これは、強化されたアミノ酸含有量を有するそのようなタンパク質の発現によって達成される。
本明細書に開示される方法はまた、異種遺伝子の挿入及び／又は天然植物遺伝子発現の修飾のために使用されて、望ましい植物形質を達成することができる。そのような特性には、例えば、耐病性、除草剤耐性、干ばつ耐性、耐塩性、昆虫耐性、寄生雑草に対する耐性、植物栄養価の向上、飼料消化率の向上、穀物収量の増加、細胞質雄性不稔、果実熟成の変化、貯蔵の増加植物又は植物部分の寿命、アレルゲン産生の減少、及びリグニン含有量の増加又は減少が含まれる。これらの望ましい特性を与えることができる遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願２０１６／０２０８２４３に開示されている。
Ｂ．非植物真核生物ゲノムのヌクレオチド配列を修飾する方法
非植物真核細胞又は非植物真核細胞小器官のヌクレオチド配列を修飾するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、非植物真核細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、非植物真核細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。この方法は、標的細胞又はオルガネラに、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（ａ）ターゲットＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメントを含む；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用し、Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的細胞又は細胞小器官に導入する第２セグメント、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、（ａ）相互作用するＲＮＡ結合部分ＤＮＡをターゲットとするＲＮＡ；（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分。次いで、標的細胞又はオルガネラは、キメラヌクレアーゼポリペプチドが発現され、ヌクレオチド配列を切断する条件下で培養され得る。本明細書に記載されるシステムは、外因性のＭｇ２＋又は他の任意のイオンの添加を必要としないことに留意されたい。最後に、修飾されたヌクレオチド配列を含む非植物真核細胞又はオルガネラを選択することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、１つのＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（又はコードＤＮＡ）を非植物真核細胞又はオルガネラに導入することを含むことができ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、核又はオルガネラ染色体ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列に１つの二本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、方法は、１つのＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード核酸）及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（又はコードＤＮＡ）を非植物真核細胞又はオルガネラに導入することを含むことができ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、核又はオルガネラ染色体ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列に２つ以上の二本鎖切断（すなわち、２つ、３つ、又は４つ以上の二本鎖切断）を導入する。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、ヌクレオチド配列の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復することができる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの削除、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせが、切断の修復中に発生する可能性がある。したがって、標的ヌクレオチド配列は、修飾又は不活化され得る。例えば、単一ヌクレオチド変化（ＳＮＰ）は、変化したタンパク質産物を生じさせることができ、又はコード配列のリーディングフレームのシフトは、タンパク質産物が作製されないように配列を不活性化又は「ノックアウト」することができる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する実施形態では、二本鎖切断の修復中に、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列を標的部位のヌクレオチド配列と交換又は組み込むことができる。例えば、ドナー配列が、非植物真核細胞又はオルガネラのヌクレオチド配列における標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接している実施形態では、ドナー配列相同性指向の修復プロセスによって媒介される修復中に、標的部位のヌクレオチド配列と交換又は統合することができる。あるいは、ドナー配列が適合性オーバーハングに隣接している（又は適合性オーバーハングがＣｍｓ１ポリペプチドによりインサイチュで生成される）実施形態では、ドナー配列は、二本鎖切断の修復中の非相同修復プロセスにより、切断されたヌクレオチド配列と直接ライゲーションされ得る。ドナー配列のヌクレオチド配列への交換又は組み込みは、標的ヌクレオチド配列を修飾するか、又は非植物真核細胞又はオルガネラの標的ヌクレオチド配列に外因性配列を導入する。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの作用によって引き起こされる二本鎖切断は、非植物真核細胞又はオルガネラの染色体からＤＮＡが削除されるように修復される。いくつかの実施形態では、１塩基、数塩基（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０塩基）、又はＤＮＡの大きなセクション（すなわち、１０を超える、５０を超える、１００を超える、又は５００を超える塩基）が非植物真核細胞又はオルガネラの染色体から削除される。
いくつかの実施形態では、非植物真核生物遺伝子の発現は、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼによって引き起こされる二本鎖切断の結果として調節され得る。いくつかの実施形態では、非植物真核生物遺伝子の発現は、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成できないようにする突然変異を含む変異Ｃｍｓ１酵素によって調節され得る。いくつかの好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成できないようにする突然変異を含む変異体Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは、転写活性化又は転写抑制ドメインに融合され得る。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＣｍｓ１ヌクレアーゼの作用によって引き起こされるその核及び／又はオルガネラ染色体ＤＮＡに変異を含む真核細胞を培養して、真核生物を産生する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＣｍｓ１ヌクレアーゼ、又は１つ又は複数の変異型Ｃｍｓ１ヌクレアーゼの結果として遺伝子発現が調節される真核細胞を培養して、真核生物を産生する。非植物真核細胞を培養して真核生物を産生する方法は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許出願２０１６／０２０８２４３及び２０１６／０１３８００８であり、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、動物（哺乳動物、昆虫、魚、鳥、及び爬虫類を含むがこれらに限定されない）、真菌、アメーバ、及び酵母を含むがこれらに限定されない任意の真核生物種の形質転換に使用できる。
ヌクレアーゼタンパク質、ヌクレアーゼタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、及び任意のドナー配列ＤＮＡ分子を非植物真核細胞又はオルガネラに導入する方法は、当技術分野で、例えば米国特許出願２０１６／０２０８２４３で知られている。これは、参照により本明細書に組み込まれる。非植物真核細胞又はオルガネラに対する例示的な遺伝的修飾は、産業用途に特に価値がある可能性があり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願２０１６／０２０８２４３において、当技術分野においても知られている。
Ｃ．原核生物ゲノムのヌクレオチド配列を修飾する方法
原核生物（例えば、細菌又は古細菌）細胞のヌクレオチド配列を修飾するための方法が本明細書で提供される。この方法は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを標的細胞に導入することを含み、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（ａ）中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメントを含む。ターゲットＤＮＡ；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用し、Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に導入する第２のセグメント。ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは以下を含む：（ａ）と相互作用するＲＮＡ結合部分ＤＮＡターゲティングＲＮＡ；（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分。次に、標的細胞を、Ｃｍｓ１ポリペプチドが発現され、ヌクレオチド配列を切断する条件下で培養することができる。本明細書に記載されるシステムは、外因性のＭｇ２＋又は他の任意のイオンの添加を必要としないことに留意されたい。最後に、修飾ヌクレオチド配列を含む原核細胞を選択することができる。さらに、修飾ヌクレオチド配列を含む原核細胞は、目的のＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの天然の宿主細胞ではなく、非天然のガイドＲＮＡを使用して、原核細胞ヌクレオチド配列に望ましい変化をもたらす。さらに、標的ＤＮＡは原核生物の染色体の一部として存在してもよく、又は原核生物の細胞内の１つ又は複数のプラスミド又は他の非染色体ＤＮＡ分子上に存在してもよいことに留意されたい。
いくつかの実施形態では、方法は、１つのＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（又はコードＤＮＡ）を原核細胞に導入することを含むことができ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、原核細胞ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列に１つの二本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、方法は、１つのＣｍｓ１ポリペプチド（又はコード化核酸）及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（又はコード化ＤＮＡ）を原核細胞に導入することを含むことができ、Ｃｍｓ１ポリペプチドは２つ以上の二本鎖切断（すなわち、２つ、原核細胞ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列における３つ、又は４つ以上の二本鎖切断）を導入する。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、ヌクレオチド配列の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復することができる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの削除、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせが、切断の修復中に発生する可能性がある。したがって、標的ヌクレオチド配列は、修飾又は不活化され得る。例えば、単一ヌクレオチド変化（ＳＮＰ）は、変化したタンパク質産物を生じさせることができ、又はコード配列のリーディングフレームのシフトは、タンパク質産物が作製されないように配列を不活性化又は「ノックアウト」することができる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する実施形態では、二本鎖切断の修復中に、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列を標的部位のヌクレオチド配列と交換又は組み込むことができる。例えば、ドナー配列が、原核細胞のヌクレオチド配列における標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接している実施形態では、ドナー配列は、又は相同性指向の修復プロセスによって媒介される修復中に、標的部位のヌクレオチド配列に組み込まれる。あるいは、ドナー配列が適合性オーバーハングに隣接している（又は適合性オーバーハングがＣｍｓ１ポリペプチドによりインサイチュで生成される）実施形態では、ドナー配列は、二本鎖切断の修復中の非相同修復プロセスにより、切断されたヌクレオチド配列と直接ライゲーションされ得る。ドナー配列のヌクレオチド配列への交換又は組み込みは、標的ヌクレオチド配列を修飾するか、又は外因性配列を原核細胞ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列に導入する。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの作用によって引き起こされる二本鎖切断は、ＤＮＡが原核細胞のＤＮＡから削除されるように修復される。いくつかの実施形態では、１塩基、数塩基（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０塩基）、又はＤＮＡの大きなセクション（すなわち、１０以上、５０以上、１００以上、又は５００以上の塩基）が原核細胞のＤＮＡから削除される。
いくつかの実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼによって引き起こされる二本鎖切断の結果として、原核生物遺伝子の発現を調節することができる。いくつかの実施形態では、原核生物遺伝子の発現は、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成できないようにする突然変異を含む変異型Ｃｍｓ１ヌクレアーゼによって調節することができる。いくつかの好ましい実施形態では、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を生成できないようにする突然変異を含む変異体Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは、転写活性化又は転写抑制ドメインに融合され得る。
本発明は、任意の原核生物種、例えば、限定されないが、シアノバクテリア、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ ｓｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｘｙｌｅｌｌａ ｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ．の形質転換に使用することができる。
ヌクレアーゼタンパク質、ヌクレアーゼタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、及び任意のドナー配列ＤＮＡ分子を原核細胞又はオルガネラに導入する方法は、例えば米国特許出願２０１６／０２０８２４３に記載れ、参照により本明細書に組み込まれる。産業用途に特定の価値があり得る原核細胞への例示的な遺伝子修飾もまた、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願２０１６／０２０８２４３において当技術分野で知られている。
Ｄ．ウイルスゲノムのヌクレオチド配列を修飾する方法
本明細書では、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列を修飾するための方法が提供される。この方法は、目的のウイルスを含む細胞に、ＤＮＡ標的ＲＮＡ又はＤＮＡ標的ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ＤＮＡ標的ＲＮＡは、以下を含む：（ａ）ターゲットＤＮＡ内の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用し、Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に導入する第２のセグメント。ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは以下を含む：（ａ）と相互作用するＲＮＡ結合部分ＤＮＡターゲティングＲＮＡ；（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分。次に、目的のウイルスを含む標的細胞を、Ｃｍｓ１ポリペプチドが発現され、ウイルスのヌクレオチド配列を切断する条件下で培養することができる。あるいは、ウイルスゲノムをインビトロで操作することができ、ガイドポリヌクレオチド、Ｃｍｓ１ポリペプチド、及び任意のドナーポリヌクレオチドは、細胞宿主の外側で目的のウイルスＤＮＡ配列とインキュベートされる。
Ｖ．遺伝子発現を調節する方法
本明細書に開示される方法は、ヌクレオチド配列の修飾又はゲノム宿主におけるヌクレオチド配列の発現の調節をさらに包含する。この方法は、ゲノム宿主に、少なくとも１つの融合タンパク質又は少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み得、ここで、融合タンパク質は、Ｃｍｓ１ポリペプチド又はその断片若しくは修飾体及びエフェクタードメインを含み、及び（ｂ）少なくとも１つガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、ここで、ガイドＲＮＡは融合タンパク質のＣｍｓ１ポリペプチドを標的ＤＮＡの標的部位に導き、融合タンパク質のエフェクタードメインは染色体配列を修飾するか、又は標的ＤＮＡ配列の近くで１つ以上の遺伝子の発現を調節する。
Ｃｍｓ１ポリペプチド又はその断片又は変異体及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質は、本明細書に記載されている。一般に、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、色素体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、又はタンパク質を複数の細胞内位置に輸送することができるシグナルペプチドをさらに含み得る。融合タンパク質をコードする核酸は本明細書に記載されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、単離されたタンパク質（細胞透過ドメインをさらに含むことができる）としてゲノム宿主に導入することができる。さらに、単離された融合タンパク質は、ガイドＲＮＡを含むタンパク質−ＲＮＡ複合体の一部であり得る。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＡ分子（キャッピング及び／又はポリアデニル化することができる）としてゲノム宿主に導入することができる。さらに他の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ分子としてゲノム宿主に導入することができる。例えば、融合タンパク質及びガイドＲＮＡは、別個のＤＮＡ分子として、又は同じＤＮＡ分子の一部としてゲノム宿主に導入され得る。そのようなＤＮＡ分子はプラスミドベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書の他の場所に記載されている少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドをゲノム宿主に導入することをさらに含む。細胞などのゲノム宿主に分子を導入するための手段、ならびに細胞（オルガネラを含む細胞を含む）を培養するための手段は、本明細書に記載されている。
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメインである特定の実施形態では、方法は、１つの融合タンパク質（又は１つの融合タンパク質をコードする核酸）及び２つのガイドＲＮＡ（又は２つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）をゲノム宿主に導入することを含み得る。２つのガイドＲＮＡは、融合タンパク質を染色体配列の２つの異なる標的部位に向け、そこで融合タンパク質は二量体化し（例えば、ホモ二量体を形成）、その結果、２つの切断ドメインは、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断を導入することができる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、標的化ＤＮＡ配列の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復することができる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの削除、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせが、切断の修復中に発生する可能性がある。したがって、標的とされる染色体配列は、修飾又は不活化され得る。例えば、単一ヌクレオチド変化（ＳＮＰ）は、変化したタンパク質産物を生じ得るか、又はコード配列のリーディングフレームのシフトは、タンパク質産物が作製されないように配列を不活性化又は「ノックアウト」し得る。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、二本鎖切断の修復中に標的部位で標的ＤＮＡ配列と交換又は統合することができる。標的ＤＮＡ配列の標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接し、修復により標的部位で標的部位の標的ＤＮＡ配列とドナー配列を交換又は統合することができる。あるいは、ドナー配列が互換性のあるオーバーハング（又は互換性のあるオーバーハング）に隣接している実施形態では、オーバーハングはＣｍｓ１ポリペプチドによってその場で生成される）ドナー配列は、二本鎖切断の修復中に非相同修復プロセスによって切断された標的ＤＮＡ配列と直接ライゲーションできる。標的ＤＮＡ配列へのドナー配列の交換又は統合は、標的ＤＮＡ配列を修飾するか、又は外来ＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列に導入する。
融合タンパク質のエフェクタードメインが切断ドメインである他の実施形態では、方法は、２つの異なる融合タンパク質（又は２つの異なる融合タンパク質をコードする核酸）及び２つのガイドＲＮＡ（又は２つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）をゲノム宿主に導入することを含み得る。融合タンパク質は、本明細書の他の場所で詳述されるように異なり得る。各ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を標的ＤＮＡ配列の特定の標的部位に誘導する。融合タンパク質は二量体化（例えば、ヘテロ二量体を形成）できるため、２つの切断ドメインが標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断を導入できる。任意のドナーポリヌクレオチドが存在しない実施形態では、結果として生じる二本鎖切断は、非相同修復プロセスによって修復され得、少なくとも１つのヌクレオチドの削除、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又はそれらの組み合わせは、切断の修復中に発生する可能性がある。任意のドナーポリヌクレオチドが存在する実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、相同性に基づく修復プロセス（例えば、ドナー配列が、染色体配列の標的部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的な配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接している実施形態において）又は非相同修復プロセス（例えば、ドナー配列が適合するオーバーハングにより隣接されている実施形態において）のいずれかによる二本鎖切断の修復中に染色体配列と交換又は統合することができる。
融合タンパク質のエフェクタードメインが転写活性化ドメイン又は転写リプレッサードメインである特定の実施形態では、方法は、１つの融合タンパク質（又は１つの融合タンパク質をコードする核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（又は１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）をゲノムホストに導入することを含むことができる。ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を特定の標的化ＤＮＡ配列に向け、転写活性化ドメイン又は転写リプレッサードメインは、標的化ＤＮＡ配列の近くに位置する遺伝子の発現をそれぞれ活性化又は抑制する。すなわち、転写は、標的化されたＤＮＡ配列に近接した遺伝子に影響を及ぼし得るか、又は標的化されたＤＮＡ配列からさらに離れて位置する遺伝子に影響を及ぼし得る。遺伝子転写は、転写開始部位から数千塩基離れた位置にある、又は別の染色体上にさえある遠くに位置する配列によって調節できることは、当技術分野でよく知られている（Ｈａｒｍｓｔｏｎ ａｎｄ Ｌｅｎｈａｒｄ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：７１８５−７１９９）。
融合タンパク質のエフェクタードメインがエピジェネティック修飾ドメインである別の実施形態では、方法は、ゲノム宿主に１つの融合タンパク質（又は１つの融合タンパク質をコードする核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（又は１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することを含み得る。ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を特定の標的化ＤＮＡ配列に向け、ここで、エピジェネティック修飾ドメインは、標的化ＤＮＡ配列の構造を修飾する。エピジェネティックな修飾には、アセチル化、ヒストンタンパク質のメチル化及び／又はヌクレオチドのメチル化が含まれる。いくつかの例において、染色体配列の構造的修飾は、染色体配列の発現の変化をもたらす。
ＶＩ．遺伝子組み換えを含む生物
Ａ．真核生物
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるＣｍｓ１ポリペプチド媒介又は融合タンパク質媒介プロセスを使用して修飾された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む真核生物、真核細胞、オルガネラ、及び植物胚である。対象の染色体配列又は融合タンパク質を標的とするＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及びオプションで１つ以上の真核生物、真核細胞、オルガネラ、及び植物胚も提供される。ドナーポリヌクレオチド。本明細書に開示される遺伝子修飾真核生物は、修飾ヌクレオチド配列についてヘテロ接合性であり得るか、又は修飾ヌクレオチド配列についてホモ接合性であり得る。オルガネラＤＮＡに１つ又は複数の遺伝子修飾を含む真核細胞は、ヘテロプラズム又はホモプラズムであり得る。
真核生物、真核細胞、オルガネラ、及び植物胚の修飾された染色体配列は、それが不活性化され、発現が上方制御又は下方制御され、又は変化したタンパク質産物を生成するか、又は統合配列を含むように修飾され得る。修飾された染色体配列は、配列が転写されないように、及び／又は機能的タンパク質産物が産生されないように、不活性化され得る。したがって、不活性化された染色体配列を含む遺伝子修飾された真核生物は、「ノックアウト」又は「条件付きノックアウト」と呼ばれる場合がある。不活性化された染色体配列は、欠失突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（すなわち、停止コドンが導入されるように、単一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換など）を含むことができる。突然変異の結果として、標的とされた染色体配列は不活性化され、機能的なタンパク質は産生されません。不活性化された染色体配列は、外から導入された配列を含まない。また、本明細書には、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の染色体配列が不活性化されている遺伝子組み換え真核生物も含まれる。
修飾された染色体配列はまた、修飾タンパク質産物をコードするように修飾され得る。例えば、修飾された染色体配列を含む遺伝子修飾された真核生物は、修飾されたタンパク質産物が産生されるように、標的化された点突然変異又は他の修飾を含み得る。一実施形態では、染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドが変化し、発現したタンパク質が１つの変化したアミノ酸残基（ミスセンス変異）を含むように修飾することができる。別の実施形態では、染色体配列は、複数のアミノ酸が変化するように、複数のミスセンス変異を含むように修飾することができる。さらに、染色体配列は、発現されたタンパク質が単一のアミノ酸の欠失又は挿入を含むように、３ヌクレオチドの欠失又は挿入を有するように修飾され得る。修飾又は変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、基質特異性の変化、酵素活性の変化、反応速度の変化など、特性又は活性が変化する可能性がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核生物は、少なくとも１つの染色体に組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。組み込まれた配列を含む遺伝子修飾された真核生物は、「ノックイン」又は「条件付きノックイン」と呼ばれ得る。組み込まれた配列であるヌクレオチド配列は、例えば、オーソロガスタンパク質、内因性タンパク質、又は両方の組み合わせをコードすることができる。一実施形態では、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、染色体配列が不活性化されるが外因性配列が発現されるように、タンパク質をコードする核又はオルガネラ染色体配列に組み込まれ得る。そのような場合、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、プロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。あるいは、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、染色体配列の発現に影響を与えることなく、核又はオルガネラ染色体配列に組み込まれ得る。例えば、タンパク質をコードする配列は、「セーフハーバー」遺伝子座に組み込むことができる本開示はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の配列である遺伝子修飾真核生物を包含する。タンパク質をコードする配列を含む配列は、ゲノムに組み込まれる。本明細書に開示される任意の目的の遺伝子は、真核生物の核又はオルガネラの染色体配列に組み込まれて導入され得る。特定の実施形態では、植物の成長又は収量を増加させる遺伝子が染色体に組み込まれる。
タンパク質をコードする染色体に組み込まれた配列は、目的のタンパク質の野生型をコードするか、又はタンパク質の修飾バージョンが生成されるように少なくとも１つの修飾を含むタンパク質をコードすることができる。例えば、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする染色体に組み込まれた配列は、生成されたタンパク質の修飾バージョンが関連する障害を引き起こすか又は増強するように、少なくとも１つの修飾を含み得る。あるいは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする染色体に組み込まれた配列は、タンパク質の修飾バージョンが真核生物又は真核細胞を関連する疾患又は障害の発症から保護するように、少なくとも１つの修飾を含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子修飾真核生物は、タンパク質の発現パターンが変化するように、タンパク質をコードする少なくとも１つの修飾染色体配列を含むことができる。例えば、プロモーター又は転写因子結合部位などのタンパク質の発現を制御する調節領域は、タンパク質が過剰発現されるように、又はタンパク質の組織特異的又は時間的発現が変更されるように変更することができる、又はそれらの組み合わせ。あるいは、タンパク質の発現パターンは、条件付きノックアウトシステムを使用して変更することができる。条件付きノックアウトシステムの非限定的な例には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムが含まれる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムは、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素、すなわち、核酸分子の特定の部位（ｌｏｘ部位）間の核酸配列の組換えを触媒することができる部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを含む。このシステムを使用して時間的及び組織特異的発現を生成する方法は、当技術分野で知られている。
Ｂ．原核生物
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるようなＣｍｓ１ポリペプチド媒介又は融合タンパク質媒介プロセスを使用して修飾された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む原核生物及び原核細胞である。目的のＤＮＡ配列又は融合タンパク質を標的とするＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び任意で１つ以上のドナーポリヌクレオチドを含む原核生物及び原核細胞も提供される。
原核生物及び原核細胞の修飾されたＤＮＡ配列は、それが不活性化されるか、発現が上方調節又は下方調節されるか、又は変化したタンパク質産物を産生するか、又は組み込まれた配列を含むように修飾され得る。修飾されたＤＮＡ配列は、配列が転写されないように、及び／又は機能性タンパク質産物が生成されないように、不活性化され得る。したがって、不活性化された染色体配列を含む遺伝子修飾された原核生物は、「ノックアウト」又は「条件付きノックアウト」と呼ばれる場合がある。不活性化されたＤＮＡ配列は、欠失突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（すなわち、停止コドンが導入されるように、単一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換など）を含むことができる。突然変異の結果として、標的ＤＮＡ配列は不活性化され、機能性タンパク質は産生されません。不活性化されたＤＮＡ配列は、外因的に導入された配列を含まない。本明細書には、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のＤＮＡ配列が不活性化されている遺伝子組み換え原核生物も含まれる。
修飾されたＤＮＡ配列はまた、修飾タンパク質産物をコードするように修飾され得る。例えば、修飾されたＤＮＡ配列を含む遺伝子修飾された原核生物は、修飾されたタンパク質産物が産生されるように、標的化された点突然変異又は他の修飾を含み得る。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドが変化し、発現したタンパク質が１つの変化したアミノ酸残基（ミスセンス変異）を含むように修飾することができる。別の実施形態では、ＤＮＡ配列は、複数のアミノ酸が変化するように、複数のミスセンス変異を含むように修飾することができる。さらに、ＤＮＡ配列は、発現されたタンパク質が単一のアミノ酸の欠失又は挿入を含むように、３ヌクレオチドの欠失又は挿入を有するように修飾され得る。修飾又は変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、基質特異性の変化、酵素活性の変化、反応速度の変化など、特性又は活性が変化する可能性がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾原核生物は、少なくとも１つの組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。組み込まれた配列を含む遺伝的に修飾された原核生物は、「ノックイン」又は「条件付きノックイン」と呼ばれ得る。組み込まれた配列であるヌクレオチド配列は、例えば、オーソロガスタンパク質、内因性タンパク質、又は両方の組み合わせをコードすることができる。一実施形態では、オルソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、原核生物配列が不活性化されるが、外因性配列が発現されるように、タンパク質をコードする原核生物ＤＮＡ配列に組み込まれ得る。そのような場合、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、プロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。あるいは、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、天然の原核生物配列の発現に影響を与えることなく原核生物のＤＮＡ配列に組み込まれ得る。例えば、タンパク質をコードする配列は、「セーフハーバー」遺伝子座に組み込むことができる本開示はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の配列である遺伝子組み換え原核生物を包含する。タンパク質をコードする配列を含む、原核生物がホストする原核生物のゲノム又はプラスミドに組み込まれる。ここに開示されている目的の遺伝子は、原核生物の染色体、プラスミド、又は他の染色体外ＤＮＡのＤＮＡ配列に組み込まれて導入できる。
タンパク質をコードする統合された配列は、目的のタンパク質の野生型をコードするか、又はタンパク質の修飾バージョンが生成されるように少なくとも１つの修飾を含むタンパク質をコードすることができる。例えば、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする統合配列は、生成されたタンパク質の修飾バージョンが関連する障害を引き起こすか又は増強するように、少なくとも１つの修飾を含むことができる。あるいは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする統合配列は、タンパク質の修飾バージョンが原核生物の感染性を低下させるように、少なくとも１つの修飾を含むことができる。
特定の実施形態では、遺伝子修飾原核生物は、タンパク質の発現パターンが変化するように、タンパク質をコードする少なくとも１つの修飾ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、プロモーター又は転写因子結合部位などのタンパク質の発現を制御する調節領域は、タンパク質が過剰発現されるように、又はタンパク質の一時的発現が変更されるように、又はそれらの組み合わせが変更され得る。あるいは、タンパク質の発現パターンは、条件付きノックアウトシステムを使用して変更することができる。条件付きノックアウトシステムの非限定的な例には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムが含まれる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムは、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素、すなわち、核酸分子の特定の部位（ｌｏｘ部位）間の核酸配列の組換えを触媒することができる部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを含む。このシステムを使用して時間的発現を生成する方法は、当技術分野で知られている。
Ｃ．ウイルス
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるＣｍｓ１ポリペプチド媒介又は融合タンパク質媒介プロセスを使用して修飾された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むウイルス及びウイルスゲノムである。目的のＤＮＡ配列又は融合タンパク質を標的とするＣｍｓ１ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及びオプションで１つ以上のドナーポリヌクレオチドを含むウイルス及びウイルスゲノムも提供される。
ウイルス及びウイルスゲノムの修飾されたＤＮＡ配列は、それが不活化されるか、発現が上方調節又は下方調節されるか、又は変化したタンパク質産物を産生するか、又は組み込まれた配列を含むように修飾され得る。修飾されたＤＮＡ配列は、配列が転写されないように、及び／又は機能性タンパク質産物が生成されないように、不活性化され得る。したがって、不活性化された染色体配列を含む遺伝子修飾ウイルスは、「ノックアウト」又は「条件付きノックアウト」と呼ばれる場合がある。不活性化されたＤＮＡ配列は、欠失突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（すなわち、停止コドンが導入されているように、単一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換など）を含むことができる。突然変異の結果として、標的ＤＮＡ配列は不活性化され、機能性タンパク質は産生されない。不活性化されたＤＮＡ配列は、外因的に導入された配列を含まない。本明細書には、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のウイルス配列が不活性化されている遺伝子組み換えウイルスも含まれる。
修飾されたＤＮＡ配列はまた、修飾タンパク質産物をコードするように修飾され得る。例えば、修飾されたＤＮＡ配列を含む遺伝子修飾されたウイルスは、修飾されたタンパク質産物が産生されるように、標的化された点突然変異又は他の修飾を含み得る。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドが変化し、発現したタンパク質が１つの変化したアミノ酸残基（ミスセンス変異）を含むように修飾することができる。別の実施形態では、ＤＮＡ配列は、複数のアミノ酸が変化するように、複数のミスセンス変異を含むように修飾することができる。さらに、ＤＮＡ配列は、発現されたタンパク質が単一のアミノ酸の欠失又は挿入を含むように、３ヌクレオチドの欠失又は挿入を有するように修飾され得る。修飾又は変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、基質特異性の変化、酵素活性の変化、反応速度の変化など、特性又は活性が変化する可能性がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ウイルスは、少なくとも１つの組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。組み込まれた配列を含む遺伝的に修飾されたウイルスは、「ノックイン」又は「条件付きノックイン」と呼ばれ得る。組み込まれた配列であるヌクレオチド配列は、例えば、オーソロガスタンパク質、内因性タンパク質、又は両方の組み合わせをコードすることができる。一実施形態では、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、ウイルス配列が不活性化されるが、外因性配列は発現されるように、タンパク質をコードするウイルスＤＮＡ配列に組み込まれ得る。そのような場合、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、プロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。あるいは、オーソロガスタンパク質又は内因性タンパク質をコードする配列は、天然のウイルス配列の発現に影響を与えることなくウイルスＤＮＡ配列に組み込まれ得る。例えば、タンパク質をコードする配列を「セーフハーバー」遺伝子座に組み込むことができる本開示はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の配列である遺伝子修飾ウイルスも包含する。本明細書に開示されるような任意の目的の遺伝子は、ウイルスゲノムのＤＮＡ配列に組み込まれて導入され得る。
タンパク質をコードする統合された配列は、目的のタンパク質の野生型をコードするか、又はタンパク質の修飾バージョンが生成されるように少なくとも１つの修飾を含むタンパク質をコードすることができる。例えば、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする統合配列は、生成されたタンパク質の修飾バージョンが関連する障害を引き起こすか又は増強するように、少なくとも１つの修飾を含むことができる。あるいは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする統合配列は、タンパク質の修飾バージョンがウイルスの感染力を低下させるように、少なくとも１つの修飾を含むことができる。
特定の実施形態では、遺伝子組み換えウイルスは、タンパク質の発現パターンが変化するように、タンパク質をコードする少なくとも１つの修飾ＤＮＡ配列を含むことができる。例えば、プロモーター又は転写因子結合部位などのタンパク質の発現を制御する調節領域は、タンパク質が過剰発現されるように、又はタンパク質の一時的発現が変更されるように、又はそれらの組み合わせが変更され得る。あるいは、タンパク質の発現パターンは、条件付きノックアウトシステムを使用して変更することができる。条件付きノックアウトシステムの非限定的な例には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムが含まれる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムは、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素、すなわち、核酸分子の特定の部位（ｌｏｘ部位）間の核酸配列の組換えを触媒することができる部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを含む。このシステムを使用して時間的発現を生成する方法は、当技術分野で知られている。
本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示す。すべての出版物及び特許出願は、あたかも各個々の出版物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の発明は、理解を明確にする目的で例証及び例としてある程度詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び修正を実施できることは明らかであろう。
本発明の実施形態は以下を含む。
１．真核細胞のゲノムの標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記真核細胞に
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは以下を含む：（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；ならびに
（ｉｉ）Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは以下を含む：（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分
を導入することを含む。
２．原核細胞のゲノムの標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記原核細胞に
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは以下を含む：（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；ならびに
（ｉｉ）Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは以下を含む：（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分、ここで、前記原核細胞は、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする遺伝子の天然の宿主ではない
を導入することを含む。
３．植物細胞のゲノムの標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記植物細胞に
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは以下を含む：（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；ならびに
（ｉｉ）Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは以下を含む：（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分
を導入することを含む。
実施形態３の方法であって、さらに、
Ｃｍｓ１ポリペプチドが発現され、標的部位でヌクレオチド配列を切断して修飾ヌクレオチド配列を生成する条件下で植物を培養すること；及び前記修飾ヌクレオチド配列を含む植物を選択することを含む。
５．標的部位でのヌクレオチド配列の切断が、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列が標的化される配列又はその近くの二本鎖切断を含む、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
６．前記二本鎖切断が千鳥状の二本鎖切断である、実施形態５に記載の方法。
７．千鳥状の二本鎖切断が３〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングを作成する、実施形態６に記載の方法。
８．前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記修飾ヌクレオチド配列が、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの挿入、細胞のゲノムからのヌクレオチド配列の欠失、又は細胞のゲノムにおいて少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む、実施形態１〜８のいずれか１つの方法。
１０．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５−２８７からなる群から選択される、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２−２５４からなる群から選択される１つ又は複数のポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０−１４６、１７４−１７６、２１２−２１５、及び２５５−２８７からなる群から選択される１つ又は複数の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．Ｃｍｓ１ポリペプチドがホモダイマー又はヘテロダイマーを形成する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記植物細胞が単子葉植物種に由来する、実施形態３に記載の方法。
１６．前記植物細胞が双子葉植物種に由来する、実施形態３に記載の方法。
１７．Ｃｍｓ１ポリペプチドの発現が誘導性又は構成的プロモーターの制御下にある、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．Ｃｍｓ１ポリペプチドの発現が、細胞型特異的又は発生上好ましいプロモーターの制御下にある、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．ＰＡＭ配列が５’−ＴＴＮを含み、Ｎが任意のヌクレオチドであり得る、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．植物細胞のゲノム中の標的部位における前記ヌクレオチド配列が、ＳＢＰアーゼ、ＦＢＰアーゼ、ＦＢＰアルドラーゼ、ＡＧＰアーゼ大サブユニット、ＡＧＰアーゼ小サブユニット、スクロースリン酸シンターゼ、デンプンシンターゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードするピルビン酸リン酸ジキナーゼ、トランスケトラーゼ、ルビスコスモールサブユニット、若しくはルビスコアクチバーゼタンパク質をコードするか、又はＳＢＰａｓｅ、ＦＢＰａｓｅ、ＦＢＰアルドラーゼ、ＡＧＰａｓｅラージサブユニット、ＡＧＰａｓｅスモールサブユニット、スクロースリン酸シンターゼ、デンプンシンターゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、トランスケトラーゼ、ルビスコ小サブユニット、若しくはルビスコアクティベースタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を調節する転写因子をコードする、実施形態３の方法。
２１．標的部位をドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドの一部であり、ドナーポリヌクレオチドのコピーがターゲットＤＮＡに組み込まれる、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法。
２２．標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように修飾される、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態１から２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記ヌクレオチド配列の発現が増加又は減少する、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、構成的、細胞特異的、誘導可能、又は自殺エクソンの選択的スプライシングによって活性化されるプロモーターに機能的に連結される、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低減又は排除する１つ又は複数の変異を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが、アイデンティティを最大化するたえに整列した場合、ＳｍＣｍｓ１（配列番号：１０）の７０１又は９２２位に対応する位置、又はＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号：１１）の８４８又は１２１３位に対応する位置に変異を含む、実施形態２６に記載の方法。
２８．ＳｍＣｍｓ１（配列番号１０）の７０１位又は９２２位に対応する位置の前記変異がそれぞれＤ７０１Ａ及びＥ９２２Ａであり、又はＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号：１１）の８４８位及び１２１３位の１２１３位に対応する位置の前記変異がそれぞれＤ８４８Ａ及びＤ１２１３Ａである、実施形態２７の方法。
２９．変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが転写活性化ドメインに融合される、実施形態２６〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが転写活性化ドメインに直接融合されるか、又はリンカーを用いて転写活性化ドメインに融合される、実施形態２９に記載の方法。
３１．変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが転写抑制因子ドメインに融合される、実施形態２６〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３２．変異Ｃｍｓ１ポリペプチドがリンカーを用いて転写リプレッサードメインに融合される、実施形態３１の方法。
３３．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが核局在化シグナルをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記核局在化シグナルが配列番号１を含むか、又は配列番号２によってコードされる、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが葉緑体シグナルペプチドをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドがミトコンドリアシグナルペプチドをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドを複数の細胞内位置に標的化するシグナルペプチドをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３８．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド配列は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されている、核酸分子。
３９．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド配列は、真核細胞での発現のためにコドン最適化されている、核酸分子。
４０．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド配列は、原核細胞における発現のためにコドン最適化されており、前記原核細胞は、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドの天然宿主ではない。
４１．実施形態３８〜４０のいずれか１つの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５−２８７、又はその断片若しくは変異体からなる群から選択され、あるいは前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択されるＣｍｓ１ポリペプチドをコードし、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列は、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して異種であるプロモーターに機能的に連結される。
４２．実施形態３８〜４０のいずれか１つの核酸分子であって、前記変異ポリヌクレオチド配列が、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、又は前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｍｓ１ポリペプチドをコードし、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列は、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して異種であるプロモーターに作動可能に連結される。
４３．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４、又はその断片又は変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３８〜４０のいずれか１つの核酸分子。
４４．前記変異ポリペプチド配列が、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、実施形態４３に記載の核酸分子。
４５．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、植物細胞において活性であるプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３８〜４４のいずれか１つの核酸分子。
４６．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、真核細胞において活性であるプロモーターに機能的に連結されている、実施形態３８〜４４のいずれか１つに記載の核酸分子。
４７．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、原核細胞において活性であるプロモーターに機能的に連結されている、実施形態３８〜４４のいずれか１つに記載の核酸分子。
４８．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、又は発生上好ましいプロモーターに機能的に連結される、実施形態３８〜４４のいずれか１つに記載の核酸分子。
４９．前記核酸分子が、前記Ｃｍｓ１ポリペプチド及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする、実施形態３８〜４４のいずれか１つに記載の核酸分子。
５０．前記エフェクタードメインが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、核局在化シグナル、及び細胞透過シグナルからなる群から選択される、実施形態４９に記載の核酸分子。
５１．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドがヌクレアーゼ活性を低減又は排除するように変異されている、実施形態５０に記載の核酸分子。
５２．前記変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが、同一性が最大になるように整列させた場合、ＳｍＣｍｓ１（配列番号１０）の７０１位又は９２２位、又はＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号１１）の８４８位及び１２１３位に対応する位置に変異を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
５３．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドがリンカーを用いて前記エフェクタードメインに融合される、実施形態４９〜５２のいずれか１つの核酸分子。
５４．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが二量体を形成する、実施形態３８〜５３のいずれか１つの核酸分子。
５５．実施形態４９〜５４のいずれか１つの核酸分子によってコードされる融合タンパク質。
５６．実施形態３８〜４４のいずれか１つの核酸分子によってコードされるＣｍｓ１ポリペプチド。
５７．ヌクレアーゼ活性を低減又は排除するように変異したＣｍｓ１ポリペプチド。
５８．前記変異Ｃｍｓ１ポリペプチドが、同一性が最大になるように整列させた場合、ＳｍＣｍｓ１（配列番号１０）の７０１又は９２２位に対応する位置、又はＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号１１）の８４８及び１２１３位に対応する位置に突然変異を含む、実施形態５７に記載のＣｍｓ１ポリペプチド。
５９．実施形態３８〜５４のいずれか１つの核酸分子を含む、植物細胞、真核細胞、又は原核細胞。
６０．実施形態５５〜５８のいずれか１つの融合タンパク質又はポリペプチドを含む植物細胞、真核細胞、又は原核細胞。
６１．実施形態１及び３〜３７のいずれか１つの方法によって生成された植物細胞。
６２．実施形態３８〜５４のいずれか１つの核酸分子を含む植物。
６３．実施形態５５〜５８のいずれか１つの融合タンパク質又はポリペプチドを含む植物。
６４．実施形態１及び３〜３７のいずれか１つの方法によって生成された植物。
６５．実施形態６２〜６４のいずれか１つの植物の種子。
６６．前記修飾ヌクレオチド配列が、形質転換細胞に抗生物質又は除草剤耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む、実施形態１及び３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
６７．抗生物質又は除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号７を含むか、又は配列番号８を含むタンパク質をコードする、実施形態６６に記載の方法。
６８．植物細胞のゲノム中の前記標的部位が配列番号１２を含む、又は配列番号１２の一部若しくは断片と少なくとも８０％の同一性を共有する、実施形態３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡポリヌクレオチドが配列番号１５を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
７０．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が核移行シグナルをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つに記載の核酸分子。
７１．前記核局在化シグナルが配列番号１を含むか、又は配列番号２によってコードされる、実施形態７０に記載の核酸分子。
７２．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、葉緑体シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つに記載の核酸分子。
７３．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ミトコンドリアシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つに記載の核酸分子。
７４．Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドを複数の細胞内位置に標的化するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つに記載の核酸分子。
７５．前記融合タンパク質が、核移行シグナル、葉緑体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、又は前記Ｃｍｓ１ポリペプチドを複数の細胞内位置に標的化するシグナルペプチドをさらに含む、実施形態５５に記載の融合タンパク質。
７６．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、核局在化シグナル、葉緑体シグナルペプチド、ミトコンドリアシグナルペプチド、又は前記Ｃｍｓ１ポリペプチドを複数の細胞内位置に標的化するシグナルペプチドをさらに含む、実施形態５６〜５８のいずれか１つのＣｍｓ１ポリペプチド。
７７．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号１７７〜１８６からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
７８．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２８８〜２８９及び１８７〜２０１からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
７９．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２９０〜２９６からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
８０．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号１７７〜１８６からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つの核酸分子。
８１．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２８８〜２８９及び１８７〜２０１からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つの核酸分子。
８２．前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２９０〜２９６からなる群から選択される１つ又は複数の配列モチーフを含む、実施形態３８〜５４のいずれか１つに記載の核酸分子。
以下の例は、説明のために提供されており、限定のためではない。
実験
実施例１−植物形質転換構築物のクローニング
Ｃｍｓ１を含むコンストラクトを表１にまとめる。簡単に言うと、Ｃｍｓ１遺伝子を植物コドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でｄｅ ｎｏｖｏ合成し、ＰＣＲで増幅して、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化タグ（配列番号２）目的のＣｍｓ１コード配列及びクローニングのための制限酵素部位とインフレームで行う。適切な制限酵素部位を使用して、各Ｃｍｓ１遺伝子を２ｘ３５ｓプロモーター（配列番号３）の下流にクローニングした。ＡＤｕｒｂ．１６０Ｃｍｓ１タンパク質（配列番号２０）をコードする配列番号１６は、使用された普遍的な遺伝暗号のように、停止コドンではなくＴＧＡコドンを使用してグリシンをコードしているように見える生物に由来することに留意されたい。ほとんどの生物によって。したがって、ＡＤｕｒｂ．１６０Ｃｍｓ１タンパク質（配列番号２４）をコードするネイティブ遺伝子には、複数の時期尚早の停止コドンのように見えるものが含まれる。ただし、グリシンをコードするＴＧＡを使用したこの遺伝子の分析では、完全長のオープンリーディングフレームが明らかになる。同様に、配列番号８２、９１、９２、１００、１０５、２１３、２５５、２５９、２６６、２６７、２６８、２７０、２７１、２７２、２７３、２７５、２７６、２７７、２７９、２８０、２８４、２８５、また２８６は、グリシンをコードするＴＧＡコドンとともに、非普遍的な遺伝暗号を使用している。
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｋｉｔａａｋｅ）の領域をターゲットとするガイドＲＮＡをコードするプラスミドＣＡＯ１遺伝子（配列番号１２）は、イネＵ６（ＯｓＵ６）プロモーター（配列番号５）が隣接するガイドＲＮＡと合成された。その５’末端とその３’末端のＯｓＵ６ターミネーター（配列番号６）。ガイドＲＮＡは、配列番号１５の配列を有していた。ガイドＲＮＡプラスミドを表２にまとめる。
修復ドナーカセット（配列番号１３）を含むプラスミド１３１６３２は、ＯｓＣＡＯ１遺伝子内の標的部位の上流と下流に約１，０００塩基対の相同性を持つように設計されている。修復ドナーカセットには、３末端にカリフラワーモザイクが隣接しているハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号７、配列番号８をコードする）に作動可能に連結されたトウモロコシユビキチンプロモーター（配列番号９）が含まれた。ウイルス３５ＳポリＡ配列（配列番号４）。プラスミド１３１５９２はプラスミド１３１６３２と同様に設計されているが、ハイグロマイシンカセットの上流又は下流に相同性アームはない。そのため、プラスミド１３１５９２は、３’末端にカリフラワーモザイクウイルス３５ＳポリＡ配列（配列番号４）が隣接している、ハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号７、配列番号８をコードする）に機能的に連結されたトウモロコシユビキチンプロモーター（配列番号９）を含む、配列番号１３のヌクレオチド１，００１〜４，３０２を含む。
１−各Ｃｍｓ１遺伝子は、５’末端でＳＶ４０核局在化シグナル（配列番号２、配列番号１のアミノ酸配列をコードする）とインフレームで融合された。
実施例２−イネの形質転換
イネ細胞へのＣｍｓ１カセット、ｇＲＮＡ含有プラスミド、及び修復ドナーカセットの導入には、パーティクルボンバードメントが使用された。衝撃のために、０．６μｍの金粒子２ｍｇを量り取り、滅菌１．５ｍＬチューブに移した。５００ｍＬの１００％エタノールを加え、チューブを１０〜１５秒間超音波処理した。遠心分離後、エタノールを除去した。次に、１ミリリットルの無菌の二重蒸留水を金のビーズが入っているチューブに加えた。ビーズペレットを短時間ボルテックスし、遠心分離により再形成した後、チューブから水を除去した。無菌層流フード内で、ＤＮＡをビーズにコーティングした。表３に、ビーズに添加されたＤＮＡの量を示す。Ｃｍｓ１カセットを含むプラスミド、ｇＲＮＡを含むプラスミド、及び修復ドナーカセットをビーズに加え、滅菌二重蒸留水を加えて、総容量を５０μＬにした。これに、２０μＬのスペルミジン（１Ｍ）、続いて５０μＬのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を加えた。金粒子を重力によって数分間ペレット化させ、その後遠心分離によってペレット化した。上澄み液を除去し、１００％エタノール８００μＬを加えた。短時間の超音波処理に続いて、金粒子を重力により３〜５分間ペレット化し、次にチューブを遠心分離してペレットを形成した。上清を除去し、３０μＬの１００％エタノールをチューブに加えた。ＤＮＡ被覆金粒子をボルテックスによりこのエタノールに再懸濁し、再懸濁した金粒子１０μＬを３つのマクロ担体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のそれぞれに添加した。マクロ担体を層流フード内で５〜１０分間風乾させて、エタノールを蒸発させた。
イネカルス組織が衝撃に使用された。イネのカルスはカルス誘導培地（ＣＩＭ；３．９９ｇ／Ｌ Ｎ６塩とビタミン、０．３ｇ／Ｌカゼイン加水分解物、３０ｇ／Ｌスクロース、２．８ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、８ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ５．８に調整）、衝撃前の暗所で２８℃で４〜７日間維持された。約８０〜１００個のカルス片（それぞれサイズが０．２〜０．３ｃｍ、重量が合計で１〜１．５ｇ）を、浸透圧固形培地（０．４Ｍのソルビトールと０．４Ｍのマンニトールを添加したＣＩＭ）を含むペトリ皿の中央に、粒子衝撃前の４時間の浸透前処理のために配置した。衝撃のために、ＤＮＡコーティングされた金粒子を含むマクロキャリアをマクロキャリアホルダーに組み立てた。ラプチャーディスク（１，１００ｐｓｉ）、停止スクリーン、及びマクロキャリアホルダーは、製造元の指示に従って組み立てられた。衝撃されるイネカルスを含むプレートを停止スクリーンの下６ｃｍに配置し、真空チャンバーが２５〜２８インチＨｇに達した後、カルス片を衝撃した。衝撃の後、カルスを浸透培地に１６〜２０時間置いた後、カルス片を選択培地（５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン及び１００ｍｇ／Ｌタイムテンチンを添加したＣＩＭ）に移した。プレートをインキュベーターに移し、２８℃で暗所に保持して、形質転換細胞の回収を開始した。２週間ごとに、カルスを新鮮な選択培地で継代培養した。ハイグロマイシン耐性カルス片は、選択培地で約５〜６週間後に出現し始めた。個々のハイグロマイシン耐性カルス片を新しい選択プレートに移し、細胞を分裂及び成長させて、分子分析用にサンプリングするのに十分な組織を作製した。表４は、これらのイネ襲撃実験に使用されたＤＮＡベクターの組み合わせをまとめたものである。
実施例３−イネの分子分析
各形質転換実験からの個々のハイグロマイシン耐性カルス片を新しいプレートに移した後、それらはサンプリングに十分なサイズに成長させた。ハイグロマイシン耐性イネカルスの個々のピースから少量の組織を採取し、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列、及びＴ７エンドヌクレアーゼ（Ｔ７ＥＩ）分析のためにこれらの組織サンプルからＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ分析は、野生型イネＤＮＡからも修復ドナープラスミドのみからもアンプリコンを生成しないプライマーを用いて設計されたが、代わりに相同性アームの外側のイネゲノムにある１つのプライマー結合部位と、挿入カセットの別のプライマー結合を有し、したがって、イネＣＡＯ１遺伝子座での挿入イベントを示す。
上記のＰＣＲ分析から生成されたＰＣＲアンプリコンのサンガー配列及び／又は次世代配列を実行して、ＰＣＲアンプリコンが実際の実験的アーチファクトではなく、意図したゲノム遺伝子座での挿入を実際に示していることを確認した。表５は、これらの配列分析の結果をまとめたものである。
ＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析に加えて、Ｔ７ＥＩ分析を実行して、ＣＡＯ１遺伝子座での小さな挿入及び／又は欠失の存在を検出した。
Ｔ７ＥＩ分析は、以前に説明されているように実行された（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１１６０６）。Ｔ７ＥＩ分析が挿入又は欠失の可能性を示すカルスサンプルの場合、ＤＮＡ配列分析を実行して、ＣＡＯ１遺伝子座での挿入及び／又は削除の存在を検出した。
実施例４−ＣＡＯ１遺伝子座での遺伝子修飾によるイネ植物の再生
上記のように形質転換されたイネカルスは、組織培養培地で培養されて苗条を生成する。その後、これらの苗条は発根培地に移され、発根した植物は温室での栽培のために土壌に移される。発根した植物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列解析を行う。Ｔ０世代の植物は成熟するまで育てられ、自家受粉してＴ１世代の種子を生成する。これらのＴ１世代の種子が植えられ、その結果得られたＴ１世代の植物が遺伝子型決定されて、ホモ接合性、ヘミ接合性、及びヌル分離植物が識別される。植物は、ＣＡＯ１遺伝子のホモ接合型ノックアウトに関連する黄葉表現型を検出するために表現型分類される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５７：８０５−８１８）。
実施例５−トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の所定のゲノム遺伝子座の編集
１つ又は複数のｇＲＮＡは、トウモロコシのゲノム内の目的の部位にアニールし、１つ以上のＣｍｓ１タンパク質との相互作用を可能にするように設計される。これらのｇＲＮＡは、植物細胞において作動可能であるプロモーター（「ｇＲＮＡカセット」）に作動可能に連結されるようにベクターにクローニングされる。Ｃｍｓ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子は、植物細胞で機能するプロモーター（「Ｃｍｓ１カセット」）に機能的に連結されるようにベクターにクローニングされる。ｇＲＮＡカセットとＣｍｓ１カセットは単一のベクターにクローン化されるか、あるいは植物の形質転換に適した２つの別々のベクターにクローン化され、このベクター又はこれらのベクターはその後アグロバクテリウム細胞に形質転換される。これらの細胞は、形質転換に適したトウモロコシ組織と接触させられる。このアグロバクテリウム細胞とのインキュベーションに続いて、トウモロコシ細胞は無傷の植物の再生に適した組織培養培地で培養される。トウモロコシ植物は、Ｃｍｓ１カセットとｇＲＮＡカセットを含むベクターを保持するアグロバクテリウム細胞と接触させられた細胞から再生される。トウモロコシ植物の再生に続いて、植物組織が収穫され、ＤＮＡが組織から抽出される。必要に応じて、Ｔ７ＥＩアッセイ、ＰＣＲアッセイ、及び／又は配列アッセイを実行して、目的のゲノム位置でＤＮＡ配列の変化が発生したかどうかを判断する。
あるいは、微粒子銃を使用して、Ｃｍｓ１カセットとｇＲＮＡカセットをトウモロコシ細胞に導入する。Ｃｍｓ１カセットとｇＲＮＡカセットを含む単一のベクター、又はＣｍｓ１カセットとｇＲＮＡカセットをそれぞれ含む個別のベクターは、それぞれ再生に適したトウモロコシ組織を砲撃するために使用される金ビーズ又はチタンビーズにコーティングされる。衝撃に続いて、トウモロコシ組織をトウモロコシ植物の再生のために組織培養培地に移す。トウモロコシ植物の再生に続いて、植物組織が収穫され、ＤＮＡが組織から抽出される。必要に応じて、Ｔ７ＥＩアッセイ、ＰＣＲアッセイ、及び／又は配列アッセイを実行して、目的のゲノム位置でＤＮＡ配列の変化が発生したかどうかを判断する。
実施例６−Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ及び他のタイプＶヌクレアーゼの計算分析
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプによって分類されることが多く、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはタイプＩＩヌクレアーゼとして分類され、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼはタイプＶとして分類される（Ｋｏｏｎｉｎら（２０１７年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７−７８）。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼタンパク質配列を調べると、これらのヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインの存在とＨＮＨドメインの不在に一部基づいてタイプＶヌクレアーゼとしてグループ化する必要があることが示唆されている。Ｃｐｆ１（タイプＶ−Ａとも呼ばれる）、Ｃ２ｃ１（タイプＶ−Ｂとも呼ばれる）、Ｃ２ｃ３（タイプＶ−Ｃとも呼ばれる）、ＣａｓＹ（タイプＶ−Ｄと呼ばれる）、及びＣａｓＸ（タイプＶ−Ｅとも呼ばれる）を含む、ヌクレアーゼの複数のグループが科学文献に記載されている。
タイプＶアミノ酸配列の筋肉アラインメントは、通常、これらのタンパク質のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインの触媒残基を正しく整列することができなかった。タンパク質の機能におけるこれらのドメインの中心的な重要性を考えると、これらの残基の正しい配置が不可欠である。本明細書及び米国特許第９，８９６，６９６号に開示されているＣｍｓ１ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号：１０、１１、２０〜２３、３０〜６９、及び１５４〜１５６）について、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ触媒残基が同定された。３つのＣｐｆ１ヌクレアーゼ（配列番号：１４７−１４９）、Ｃ２ｃ１ヌクレアーゼ（配列番号：１５０及び１５７−１６４）、Ｃ２ｃ３ヌクレアーゼ（配列番号：１５２及び１６６−１６８）（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６０：３８５−３９７）、ＣａｓＸヌクレアーゼ（配列番号：１５１及び１６５）、及びＣａｓＹヌクレアーゼ（配列番号：１５３及び１６９−１７３）（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７−２４１）。表６は、これらの各ドメインの触媒残基と、触媒残基の直前の３つのアミノ酸及び触媒残基の直後の３つのアミノ酸を示している。
配列のアライメントと他の計算分析では、ＣａｓＹ．５又はＣａｓＹ．６の明確なＲｕｖＣＩＩＩ触媒残基は示されなかった。Ｕｎｋ６４とＵｎｋ６９の推定触媒残基は、それぞれリジンとアスパラギンであるが、他のすべての残基にはこの位置に不変のアスパラギン酸残基がある。残りのタイプＶヌクレアーゼについて、表６にまとめたＲｕｖＣ触媒残基を使用して、以前に記載された方法（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＢｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：１０．１１０１／１９２７９９）を用いて、触媒残基が固定されたアンカーとして薬出すＲｕｖＣアンカー型配列アライメントを生じさせた。結果のＲｕｖＣアンカー型アミノ酸アラインメントを使用して、系統樹を構築した（図１を参照）。この図が示すように、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは他のタイプＶヌクレアーゼとは別のクレードにある。さらに、この分析で一緒にクラスター化するＣｍｓ１ヌクレアーゼの少なくとも３つの別個のグループがある（表６では、これらのグループはそれぞれＭｉｃｒｏＣｍｓ１からＵｎｋ７８Ｃｍｓ１、ＳｕｌｆＣｍｓ１からＵｎｋ７１Ｃｍｓ１、及びＵｎｋ４０Ｃｍｓ１からＵｎｋ７６Ｃｍｓ１で構成されている）。これは、この大きなグループ内のＣｍｓ１ヌクレアーゼの少なくとも３つのグループの存在を示唆している。これらの３つのグループは、それぞれＳｍＣｍｓ１（配列番号１０）、ＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号１１）、及びＵｎｋ４０Ｃｍｓ１（配列番号６８）を含むヌクレアーゼのグループに対して、それぞれ「Ｓｍタイプ」、「Ｓｕｌｆタイプ」、及び「Ｕｎｋ４０タイプ」というラベルが付けられている。
Ｃｍｓ１ヌクレアーゼのアミノ酸配列アラインメントを調べて、これらのヌクレアーゼ間でよく保存されているタンパク質配列内のモチーフを特定した。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼは、図１に示されている系統樹の３つの十分に分離されたクレードで検出されたことが観察された。これらのクレードの１つにはＳｍＣｍｓ１（配列番号１０）が含まれ、別のクレードにはＳｕｌｆＣｍｓ１（配列番号１１）が含まれ、もう１つにはＵｎｋ４０Ｃｍｓ１（配列番号６８）が含まれる。したがって、これらの各クレードのメンバーは、これらのヌクレアーゼ間で部分的及び／又は完全に保存されたアミノ酸モチーフを特定するために別々に整列された。ＳｍＣｍｓ１様ヌクレアーゼのアラインメントについては、配列番号１０、２０、２３、３０、３２−３４、３７−３９、４１、４３、４４、４６−６０、６７、１５４−１５６、２０８−２１１、２２２、２２３、２２５、２２８、２２９、２３２、２３４、２３６、２３７、２４１、２４３、２４５、２４８、２５０、２５１、２５３、及び２５４が整列された。ＳｕｌｆＣｍｓ１様ヌクレアーゼのアラインメントのために、配列番号１１、２１、２２、３１、３５、３６、４０、４２、４５、６１−６６、６９、２２７、２３０、２３１、２３５、２３９、２４０、２４２、２４４、及び２４７が整列された。Ｕｎｋ４０様ヌクレアーゼの整列のために、配列番号６８、２２４、２２６、２３３、２３８、２４６、２４９、及び２５２が整列された。これらのアライメントはＭＵＳＣＬＥを使用して実行され、結果として得られたアライメントは手動で検査され、整列されたすべてのタンパク質間で保存性を示した領域が特定された。配列番号１７７〜１８６に示されるアミノ酸モチーフは、ＳｍＣｍｓ１様ヌクレアーゼの整列から同定された。配列番号２８８〜２８９及び１８７〜２０１に示されるアミノ酸モチーフは、ＳｕｌｆＣｍｓ１様ヌクレアーゼのアラインメントから同定された。配列番号２９０〜２９６に示されるアミノ酸モチーフは、Ｕｎｋ４０Ｃｍｓ１様ヌクレアーゼのアラインメントから同定された。ウェブログは、配列アラインメントを使用して作成され、図２〜４（ＳｍＣｍｓ１−ｌｉｋｅ、ＳｕｌｆＣｍｓ１−ｌｉｋｅ、及びＵｎｋ４０Ｃｍｓ１−ｌｉｋｅ配列モチーフ、それぞれｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）に図示されている。それと同時に、ＳｍＣｍｓ１、ＳｕｌｆＣｍｓ１、及びＵｎｋ４０Ｃｍｓ１タンパク質配列上のこれらの保存されたモチーフの位置を示す概略図が示されている。
本明細書に記載のＣｍｓ１ヌクレアーゼによる植物ゲノムの編集は、タイプＶヌクレアーゼの他のいくつかの説明と一致して、ＴＴＴＮ又はＴＴＮ ＰＡＭ部位がすべてではないにしても多くのＣｍｓ１ヌクレアーゼからアクセス可能であることを示唆した。Ｃｍｓ１ヌクレアーゼをコードするコンティグに存在するＣＲＩＳＰＲスペーサーに対応するＢＬＡＳＴヒットを特定するために、計算分析が行われた。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒオンライン（ｃｒｉｓｐｒ．ｉ２ｂｃ．ｐａｒｉｓ−ｓａｃｌａｙ．ｆｒ／Ｓｅｒｖｅｒ／）を使用して特定された；これらのスペーサーは、メタゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索のシードとして使用された。ＢＬＡＳＴヒットは、ＡｕｘＣｍｓ１、Ｕｎｋ１５Ｃｍｓ１、Ｕｎｋ１９Ｃｍｓ１、及びＵｎｋ４０Ｃｍｓ１（それぞれ、配列番号２９７〜３００）をコードするコンティグからのＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して識別された。これらのＢＬＡＳＴヒットは、配列番号：３０１〜３０７に示され、ＢＬＡＳＴヒットの前後のヌクレオチドと共に表７にまとめられている。
表７では、下線が引かれた塩基がＣＲＩＳＰＲスペーサーＢＬＡＳＴヒットを表す。特に、ＢＬＡＳＴヒットの５’直後の塩基はすべてＴＴＡ又はＴＴＣを示し、この表の１１個のＢＬＡＳＴヒットの７つはＴＴＴＡ又はＴＴＴＣを示す。これらのデータと上記の植物ゲノム編集データを組み合わせると、少なくともこれらのＣｍｓ１ヌクレアーゼ（及びおそらくほとんど又はすべてのＣｍｓ１ヌクレアーゼ）が、ＴＴＴＭ ＰＡＭ部位を優先して、少なくともＴＴＭ ＰＡＭ部位から下流の標的部位にアクセスできることが強く示唆される。特に、これらのタイプの計算で特定されたＰＡＭ部位は、ヌクレアーゼＰＡＭ要件だけでなく、ＣＲＩＳＰＲスペーサー取得機構要件も考慮に入れているため、ヌクレアーゼは、計算で特定されたものよりも幅広いＰＡＭ部位にアクセスできる可能性がある。

Claims (24)

  1. 真核細胞のゲノムにおける標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記真核細胞に
    （ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む；ならびに
    （ｉｉ）Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む、
    を導入することを含み、
    ここで、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドは、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性を有し、前記方法は、前記標的部位で前記ヌクレオチド配列を修飾し、真核細胞の前記ゲノムは、核、色素体、又はミトコンドリアのゲノムである上記方法。
  2. 原核細胞のゲノムにおける標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記原核細胞に
    （ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及び（ｂ）Ｃｍｓ１ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む；ならびに
    （ｉｉ）Ｃｍｓ１ポリペプチド、又はＣｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで、Ｃｍｓ１ポリペプチドは、（ａ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；及び（ｂ）部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む、
    を導入することを含み、
    ここで、前記Ｃｍｓ１ポリペプチドは、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有し、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性を有し、原核細胞の前記ゲノムは、染色体、プラスミド、又は他の細胞内ＤＮＡ配列であり、前記原核細胞は前記Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする遺伝子の天然の宿主ではない上記方法。
  3. 前記真核細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. Ｃｍｓ１ポリペプチドが発現され、標的部位でヌクレオチド配列を切断して修飾ヌクレオチド配列を生成する条件下で植物細胞を培養して植物を生成し；及び
    前記修飾ヌクレオチド配列を含む植物を選択する
    ことをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記Ｃｍｓ１ポリペプチドが、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記修飾ヌクレオチド配列が、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの挿入、細胞のゲノムからのヌクレオチド配列の欠失、又は細胞のゲノムにおける少なくとも１つのヌクレオチドの突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記修飾ヌクレオチド配列が、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの挿入、細胞のゲノムからのヌクレオチド配列の欠失、又は細胞のゲノムにおける少なくとも１つのヌクレオチドの突然変異を含む、請求項２に記載の方法。
  9. 前記修飾ヌクレオチド配列が、形質転換細胞に抗生物質又は除草剤耐性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 抗生物質又は除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号７を含むか、又は配列番号８を含むタンパク質をコードする、請求項９に記載の方法。
  11. Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７からなる群から選択される配列、又はその断片若しくは変異体と少なくとも９５％の同一性を有し、又は前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣｍｓ１ポリペプチドをコードし、Ｃｍｓ１ヌクレアーゼ活性を有し、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列は、Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して異種であるプロモーターに作動可能に連結されている上記核酸分子。
  12. Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む前記核酸分子が、配列番号１６〜１９、２４〜２７、７０〜１４６、１７４〜１７６、２１２〜２１５、及び２５５〜２８７からなる群から選択される配列を含み、又は配列番号２０〜２３、３０〜６９、２０８〜２１１、及び２２２〜２５４からなる群から選択される配列を含むＣｍｓ１ポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 請求項１１に記載の核酸分子によってコードされるＣｍｓ１ポリペプチド。
  14. 請求項１１に記載の核酸分子を含む、植物細胞、真核細胞、又は原核細胞。
  15. 請求項１２に記載の核酸分子を含む、植物細胞、真核細胞、又は原核細胞。
  16. 請求項１に記載の方法によって生成された真核細胞。
  17. 前記真核細胞が植物細胞である、請求項１６に記載の真核細胞。
  18. 請求項１１に記載の核酸分子を含む植物。
  19. 請求項１２に記載の核酸分子を含む植物。
  20. 請求項３に記載の方法によって生成された植物。
  21. 請求項１８に記載の植物の種子。
  22. 請求項２０に記載の植物の種子。
  23. Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、植物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１１に記載の核酸分子。
  24. Ｃｍｓ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項３記載の方法。
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