JP2020527164A - グラム陰性病原体に対する抗微生物活性を示す抗微生物ペプチド及びその混合物 - Google Patents

グラム陰性病原体に対する抗微生物活性を示す抗微生物ペプチド及びその混合物 Download PDF

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Abstract

本発明は医学及び微生物学の分野、具体的には（特に薬剤耐性を示す又は発生しやすい）グラム陰性病原体が原因の感染症を治療するための手段及び方法に関する。（ｉ）膜透過活性及び／又はＬｉｐｉｄ ＩＩ結合活性を有する内膜作用性化合物と、（ｉｉ）ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、及びＸ１Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３−ＮＨ２（Ｘ１は存在しないかＫであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないかＲである）からなる群より選択される１又は複数の抗微生物ペプチドと、の混合物が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は医学及び微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、グラム陰性病原体（特に薬剤耐性を示すか、又は薬剤耐性を生じやすいグラム陰性病原体）が原因のヒト又は動物の感染症を治療するための手段及び方法に関する。
重大な耐性問題が今では臨界点に達し、世界的に重要かつ重大な公衆衛生上の脅威となっている。この半世紀の間に薬効範囲が広いか狭いかに関わらす新規の抗生物質は事実上開発されていない一方、既存の薬剤は急速に効果を失いつつある［１］。人間は年々抗生物質を頼るようになり、これらの薬剤を乱用するようにもなってきた［１］。不運なことに、この使用拡大が細菌の抗生物質耐性を拡大させたことに疑いはない［２，３］。２０１６年における調査において、抗微生物薬耐性（ＡＭＲ）の蔓延のために既に毎年７００，０００件の死亡件数が存在することが指摘されており、この数が将来的には１，０００，０００件になることが推定されている［４］。
世界保健機関（ＷＨＯ）は、抗生物質の研究、発見、及び開発を指導するための抗生物質耐性細菌の世界的優先順位リストを明らかにするレポートを発表した［５］。１２種類の細菌がリストに挙げられており、トップ３の細菌が「重要」というカテゴリーを構成し、６種類の細菌が「高位」と分類され、残りの３種類が「中位」に規定された。重要なことは、これらの１２種類の「スーパーバグ」のうちの９種類がグラム陰性病原体であり、３種類の「重要な」細菌は全てグラム陰性病原体（アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（カルバペネム耐性）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（カルバペネム耐性）、及びエンテロバクター科菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（カルバペネム耐性、第３世代セファロスポリン耐性））である。
特に、グラム陰性細菌の防護性外膜は複数種の抗微生物剤が細胞膜に到達することを妨げるための効率的な隔壁として機能するため、このことが多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陰性病原体の治療の困難さを著しく上昇させている［６，７］。この問題に取り組むため、グラム陰性生物に対する新規抗生物質又は新規治療戦略について調査する緊急の必要性が存在する。
本発明者らは、多剤耐性病原体の発生が危険な点に到達したと認識し、既存の薬剤の運用を改善し、且つ、新規薬剤の元を拡大しようとした。より具体的には、本発明者らは、グラム陰性病原性細菌による危機に適切に対応することを可能にする新規化合物及び新規治療戦略を提供することを目標とした。
驚くべきことに、特定のペプチド（本明細書において「グラム陰性外膜撹乱ペプチド」（ＧＮＰ）と称される）により、グラム陰性病原体に対する既知の抗微生物剤（例えば、グラム陽性細菌に対して一般的に最もよく作用するナイシン及びバンコマイシン）の抗細菌活性を大いに向上することができることが観察された。本明細書において以下に示されるように、選択されたＧＮＰは、商業的に合成され、グラム陰性病原体に対して単独で、又はナイシン若しくはバンコマイシンと組み合わせて検査された。その結果、ある特定のＧＮＰをナイシン又はバンコマイシンと組み合わせることで、５種類の選択された重要なグラム陰性病原体に対して非常に有効な相乗的効果を発揮することが明らかとなった。特に、グラム陰性細菌の増殖を阻害するために必要な各化合物の濃度が劇的に減少した（最大で４０倍）。
全体として、本発明において開示されるアプローチは、グラム陰性感染症の治療のための資源と戦略の多様性を拡張すると同時に、抗微生物剤の効力を高め、それらの薬剤のあり得る毒性を低下させ、且つ、グラム陰性細菌が薬剤耐性になる速度を減少させるための非常に有望な方法を提供する。
したがって、本発明は、
（ｉ）膜透過活性及び／又はＬｉｐｉｄ ＩＩ結合活性を有する内膜作用性化合物と、
（ｉｉ）ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、
ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、
ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、及び
Ｘ１Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３Ｒ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８／−９又はＧＮＰ−８変異体）
（ここで、Ｘ１は存在しないか、又はＫであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないか、又はＲである）
からなる群より選択される１又は複数の抗微生物ペプチドと、
の混合物であって、
上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい、上記混合物を提供する。
これらのうち、本発明は、
（ｉ）内膜又は細胞質作用性の化合物と、
（ｉｉ）ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、及びＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）からなる群より選択される１又は複数の抗微生物ペプチドと、
の混合物であって、
上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい、上記混合物を提供する。
本発明の抗微生物ペプチドは、膜透過活性及び／又はＬｉｐｉｄ ＩＩ結合活性を有する内膜作用性化合物と組み合わせると、グラム陰性病原体に対する活性について驚くべき相乗効果を示す。一実施形態では、内膜作用性化合物は「内膜作用性ポリペプチド」であり、これは、一般的に膜透過活性及び／又はＬｉｐｉｄ ＩＩ結合活性を有するリボソーム合成又は非リボソーム合成ペプチドを指し、例えば、ナイシン又は他のランチペプチド（ｌａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）又はその誘導体、又はバンコマイシン若しくはその誘導体、ダプトマイシン、ラスパルトマイシン、又はマクロライド系抗生物質を指す。ナイシンのようなランチビオティクス、及びそのランチビオティクス誘導体、並びにバンコマイシンなどの内膜作用性抗生剤が例に挙げられる。別の実施形態では、内膜作用性化合物は、１又は複数のデオキシ糖（通常はクラジノース（ｃｌａｄｉｎｏｓｅ）及びデソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ））が結合していてもよい大環状ラクトン環から構成される一群の天然産物であるマクロライドグループに属する。上記ラクトン環は、通常では１４員、１５員、又は１６員環である。マクロライド類は、ポリケチド類の天然産物に属する。幾つかのマクロライド類は抗生物質活性又は抗真菌活性を有し、医薬品として使用される。本発明において使用されるマクロライド類の例としては、アジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、フィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）、及びテリスロマイシン（ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）が挙げられる。
その他の実施形態では、内膜作用性化合物は、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）又はシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）である。ダプトマイシンは、グラム陽性生物が原因の全身性及び致命的感染症の治療に使用されるリポペプチド抗生物質である。ダプトマイシンは、土壌腐生生物ストレプトマイセス・ロゼオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）に見られる天然化合物である。ダプトマイシンの特徴的な作用機序のために、ダプトマイシンは複数の薬剤耐性細菌が原因の感染症の治療に有用である。他の具体例としては、ダプトマイシン、ラスパルトマイシン（ｌａｓｐａｒｔｏｍｙｃｉｎ）、マクロライド及びシプロフロキサシンが挙げられる。
抗微生物ペプチド間に相乗作用が認めることができることは、当技術分野において知られている。例えば、Ｌｕｄｅｒｓら（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００３ Ｍａｒ； ６９（３）： １７９７−１７９９）は、原核生物抗微生物ペプチド（ＡＭＰ；より一般的にはバクテリオシンと呼ばれる）であるペヂオシンＰＡ−１、サカシンＰ、及びキュアバシンＡ（全て、乳細菌［ＬＡＢ］により産生）を真核生物ＡＭＰである魚由来リューロシジンと組み合わせたときに得られる抗微生物効果について調査した。ＬＡＢ ＡＭＰとリューロシジンは、必要とされる濃度がそれでも比較的に高かったものの、グラム陰性大腸菌株に対して相乗的に作用することがわかった。
Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１（８）：１２６５−７ Ｍａｙ ２００９）は、５１残基のヒツジ由来カテリシジンとナイシンのグラム陽性黄色ブドウ球菌１０５６ＭＲＳＡ株に対する相乗効果を報告しているが、グラム陰性細菌に対しては相乗効果を報告していない。
Ｚｈｏｕら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１６， ４， ｐ． １−７ ７ ｐ．， ７内）は、全長型又は短縮型ナイシンのＣ末端に、幾つかの抗グラム陰性ペプチド（例えば、アピデシン１ｂ、オンコシン）又はそれらの一部を遺伝的融合することにより、グラム陰性細菌に対するランチビオティクスの活性が改善可能であるかどうか調査した。アピデシン１ｂからの８アミノ酸（ＰＲＰＰＨＰＲＬ）テールがナイシンに取り付けられると、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＣＥＣＴ１０１に対するナイシンの活性が２倍よりも高く上昇することがわかった。
さらに、ＧＮＰ−８及びその変異体以外の上記抗微生物ペプチドの各々は、それら自体が当技術分野において知られている。表１を参照されたい。しかしながら、重要なことに、本発明に記載の内膜作用性ポリペプチドと混合して（すなわち、物理的に別個の要素として）使用される場合の本規定のＧＮＰの相乗効果は、当技術分野において教示又は示唆されていない。

本発明の一実施形態では、内膜作用性ポリペプチドは、ナイシン又はその変異体若しくは誘導体である。ナイシンは、その高い抗細菌活性とヒトに対する低い毒性のため、数十年にわたって天然保存剤として食品産業において使用されてきた［８，９］。実際には、ナイシンが細菌の原形質膜に到達した後、ナイシンの最初の２つの環とＬｉｐｉｄ ＩＩのピロリン酸に関連する水素結合を介してピロリン酸ケージが形成される。Ｌｉｐｉｄ ＩＩは、（ペンタペプチド部分を除いて）その性質を変更することができず、且つナイシンの経膜配向を促進するので、ピロリン酸ケージは細菌のナイシンに対する低耐性に関与する［１０，１１］。ナイシン誘導体は当技術分野において知られている。例えば、強化された機能性（活性及び／又は安定性）を示し、それにより臨床的見地からより魅力的となった改変ナイシン誘導体ナイシンＶ及びナイシンＩ４Ｖを参照されたい（Ｃｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １１ ９５−１０５； Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ６ １８７−１９２．）。また、従来の抗生物質の効力を増強するナイシン及びナイシン誘導体の可能性について開示しているＦｉｅｌｄらの論文（Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６ Ａｐｒ １８；７：５０８）も参照されたい。一実施形態では、ナイシン誘導体は、最初の３つ／５つの環を含む全長型又は短縮型のナイシンとの融合体である（例えば、Ｚｈｏｕら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１６， ４， ｐ． １−７ ７ ｐ．， ７内）、Ｌｉら（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１８ Ｍａｙ ３１；８４（１２））、又はＭｏｎｔａｌｂａｎ−Ｌｏｐｅｚら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２０１７ Ｊａｎ；４１（１）：５−１８）の論文において開示されている）。
別の実施形態では、内膜作用性ポリペプチドは、バンコマイシン又はその誘導体である。バンコマイシンは、ＷＨＯによってリスト化された最も有効で安全な医薬品のうちの１つである［１２］。バンコマイシンは、糖ペプチド抗生物質の一種であり、グラム陽性細菌を殺菌するそのメカニズムは細胞壁の構築の阻害である［１３］。ナイシン及びバンコマイシンは両方とも、ナノモル濃度レベルであっても最小阻害濃度（ＭＩＣ）でグラム陽性細菌に対して非常に有効である［１３−１５］。しかしながら、グラム陰性細菌に対するこれらの活性はずっと低い。バンコマイシン誘導体の例としては、ジピコリル−バンコマイシン複合体（Ｄｉｐｉ−ｖａｎ）及びＹｕｋｉ Ｎａｋａｍａら（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２０１０， ５３ （６）， ｐｐ ２５２８−２５３３）又は国際公開第２０１６／１３４６２２号パンフレットに開示されているものが挙げられる。
本発明において使用されるナイシン及びバンコマイシン誘導体並びに変異体の例が、表２（表２−１〜２−４）及び表３（表３−１〜３−４）において灰色（ＷＴと同等の活性）又は暗灰色（上昇した活性）で強調されて示されている。一実施形態では、本発明の混合物は、表２に示されるものから選択されるナイシン変異体を含み、ここで、上記ナイシン変異体は、野生型ナイシンと比較して活性が向上していることが好ましい。別の実施形態では、本発明の混合物は、表３に示されるものから選択されるバンコマイシン誘導体を含み、ここで、上記バンコマイシン誘導体は、非改変型バンコマイシンと比較して活性が向上していることが好ましい。
本発明の一実施形態では、上記混合物は、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、及びＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）からなる群より選択される抗微生物ペプチドを含む。
αアミノ酸は自然界に見られる最も一般的な形態であるが、それはＬ異性体の形で生じるときのみの話である。α炭素上に区別できない水素原子２個有しているグリシンを例外として、α炭素はキラル炭素原子である。したがって、グリシンを除く全てのαアミノ酸は、相互に鏡像であるＬアミノ酸又はＤアミノ酸と呼ばれる２種類のエナンチオマーのうちのいずれかとして存在することができる。本発明に使用される抗微生物ペプチドは、Ｌ−アミノ酸若しくはＤ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＬ−アミノ酸若しくはＤ−アミノ酸から構成されていてもよい。例えば、１又は複数の「従来の」Ｌ−アミノ酸がＤ−アミノ酸によって置換されていてもよい。一実施形態では、上記抗微生物ペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成される。別の実施形態では、上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸から構成される。Ｄ−アミノ酸は、自然界では幾つかの細菌を除いて生物中に生じることは稀である。Ｄ−アミノ酸はプロテアーゼ介在性分解に対して高い耐性を有し、且つ、低い免疫原性応答を有する。これにより、Ｄ−ペプチドは、本発明の混合物への使用について特に興味深いものになっている。
特に、本明細書において以下に示されるように、Ｄ−ＧＮＰは、Ｌ体の相対物と比較して、より高い活性をグラム陰性病原体に対して示す。全ての事例において、濃度はＬ−ＧＮＰのＭＩＣと同等であるか、又は最大で４倍低い。これらのデータは、選択されたＧＮＰが受容体と特異的に相互作用しないことを示している。
特定の態様において、上記抗微生物ペプチドは、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、及びＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）からなる群より選択され、上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、上記抗微生物ペプチドがＤ−アミノ酸から構成されることが好ましい。
第１の態様において、上記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸から構成されるＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２である。第２の態様において、上記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸から構成されるＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣである。第３の態様において、上記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３Ｒ−ＮＨ２であって、ここで、Ｘ１は存在しないか、又はＫであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、且つ、Ｘ３は存在しないか、又はＲであり、上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい。一実施形態では、Ｘ１及び／又はＸ３は存在しない。別の実施形態では、Ｘ１がＫであり、且つ／又はＸ３がＲである。これは、Ｘ３がＲ、Ｋ、又はＡであることと組み合わさってよく、好ましくはＸ２はＲ又はＫである。例えば、上記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸から構成されるＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、ＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、又はＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）である。
上記抗微生物ペプチドが、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されるＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、好ましくはＤ−アミノ酸から構成されるＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（本明細書において「ＧＮＰ−Ｄ８」とも呼ばれる）である場合に、非常に良好な結果が得られる。ＧＮＰ−Ｄ８とナイシン／バンコマイシンの組合せにより生じるＦＩＣＩ値は０．０７８〜０．３７５の範囲であった。このことは、非常に顕著なインビトロ相乗効果を示唆した。ＧＮＰ−Ｄ８は、ナイシン又はバンコマイシンのどちらかが内膜に到達するための補助として非常に有効であった。
本明細書において提供される混合物には、追加の抗微生物剤を補足すると有利であることは、当業者に理解されるであろう。本発明に係る混合物と、薬学的に許容可能なベヒクル、キャリア、又は希釈剤と、を含む医薬組成物も提供される。
本発明の更なる態様は、アミノ酸配列Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３−ＮＨ２の抗微生物ペプチドに関し、ここで、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないか、又はＲであり、上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される。一実施形態では、本発明は、配列ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、又はＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）の抗微生物ペプチドであって、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される上記抗微生物ペプチドを提供する。
このようなペプチドは、当技術分野において開示又は教示されていない。米国特許出願公開第２０１５／０３４４５２７号明細書は、幾つかの抗微生物ペプチドを教示しており、それらのうち５種類のペプチドが配列ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＬＫＷＫＫＬＧＹを有する。ヒトカテリシジンＬＬ−３７から設計された様々な短ペプチド類似体が当技術分野において知られており［２５］、それらには配列ＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２のＫＲ−１２−ａ２が含まれ、したがって追加のＮ末端リシンを有し、且つ、本明細書において上記したような微生物ペプチドＧＮＰ−９に対応する。驚くべきことに、特定の病原体に対するリシン残基が存在しないと、ナイシンと混合して使用した場合に、抗微生物相乗効果を上昇させることが観察された。表４及び表５を参照されたい。さらに、ペプチドＫＲ−１２−ａ２／ＧＭＰ−９の第２位のアルギニンのリシン又はアラニンによる置換、及び／又はＣ末端アルギニンの欠失により、驚くべき抗微生物活性を示す新規ペプチドが得られることがわかった（表１０〜表１２参照）。
したがって、本発明は、アミノ酸配列Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３−ＮＨ２のペプチドと、薬学的に許容可能なベヒクル、キャリア、又は希釈剤と、を含む医薬組成物にも関し、ここで、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないか又はＲであり、上記ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される。一実施形態では、本発明は、ペプチドＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、ペプチドＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、ペプチドＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、又はペプチドＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）のうちの１又は複数のペプチドと、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成されるＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２のペプチドと、薬学的に許容可能なベヒクル、キャリア、又は希釈剤と、を含む医薬組成物を提供し、ここで、上記ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される。
また、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成されるアミノ酸配列ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２のペプチドを含み、任意に１又は複数の追加の抗微生物剤及び賦形剤を含む殺菌性組成物も提供される。
本発明の組成物は、対象（好ましくは哺乳類対象、より好ましくはヒト対象）における病原性感染症の予防又は治療の方法に使用することが有利であることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、上記感染症は、グラム陰性病原体が原因のものであってよい。特定の実施形態では、上記感染症は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅａｅ）、及びサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）からなる群より選択される細菌が原因のものである。一実施形態では、上記感染症は、ＥＳＫＡＰＥ病原体（すなわち、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニイ、緑膿菌、及びエンテロバクター属種）として当技術分野において知られている１又は複数の病原体が原因のものである。
本発明のさらに有利な態様は、対象（好ましくは哺乳類対象、より好ましくはヒト対象）における病原性感染症を予防又は治療する方法におけるペプチド、混合物、又は組成物の使用に関し、ここで、上記病原性感染症は、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌、好ましくは臨床的に関連のあるＭＤＲ細菌によって引き起こされる。例えば、上記感染症は、以下の細菌のうちの１又は複数が原因のものである。
・大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２株
・大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２４５２株
・大腸菌Ｂ１９２７株、臨床分離体
・クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ７００６０３株
・クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ＢＡＡ−２５２４株
・クレブシエラ・ニューモニエＢ１９４５株、臨床分離体
・緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３株
・緑膿菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１０８株
・緑膿菌Ｂ１９５４株、臨床分離体
・アシネトバクター・バウマンニイＡＴＣＣ１７９７８株
・アシネトバクター・バウマンニイＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６０５株
・アシネトバクター・バウマンニイＢ２０２６株、臨床分離体
特定の態様において、本発明は、対象（好ましくは哺乳類対象、より好ましくはヒト対象）における病原性感染症を予防又は治療する方法におけるペプチドＧＮＰ−Ｄ６の使用を提供し、ここで、上記病原性感染症は、以下の細菌のうちの１又は複数が原因のものである：大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２４５２株、大腸菌Ｂ１９２７株、クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ＢＡＡ−２５２４株、クレブシエラ・ニューモニエＢ１９４５株、緑膿菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１０８株、緑膿菌Ｂ１９５４株、アシネトバクター・バウマンニイＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６０５株、アシネトバクター・バウマンニイＢ２０２６株。
また、本明細書では、グラム陰性病原体に対する内膜作用性化合物の治療有効性及び治療効力を増強するための方法が提供され、ここで、上記内膜化合物は、ナイシン、バンコマイシン、及びそれらの機能性誘導体からなる群より選択されることが好ましく、上記方法は、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、ＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）、及びＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）からなる群より選択される抗微生物ペプチドの存在下で、上記グラム陰性病原体と上記内膜作用性化合物を接触させることを含み、ここで、上記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい。
本発明の更なる態様は、グラム陰性病原体に対する内膜作用性ポリペプチドの治療有効性及び治療効力を高めるための抗微生物ペプチドの使用に関し、ここで、上記抗微生物ペプチドは、ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、及びＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）からなる群より選択され、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい。本明細書において上記された抗微生物ペプチド及び内膜作用性ポリペプチドと同じ好ましい傾向が適用される。
相乗効果判定プレートの模式図である。階乗用量マトリックス（ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｄｏｓｅ ｍａｔｒｉｘ）を用いて、２種類の段階希釈された単一化合物の全ての混合物を試験した。増殖対照のウェルには抗生物質を添加しなかった一方、無菌対照のウェルには培地のみを添加した。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ａ）大腸菌ＬＭＧ１５８６２株。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｂ）クレブシエラ・ニューモニエ。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｃ）緑膿菌ＬＭＧ６３９５株。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｄ）アシネトバクター・バウマンニイＬＭＧ０１０４１株。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｅ）エンテロバクター・アエロゲネスＬＭＧ０２０９４株。 ５種類の異なるグラム陰性病原体に対する様々な組み合わせのＦＩＣＩ。パネルＡ〜パネルＥ：異なるグラム陰性病原体に対してのナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。パネルＦ：５種類のグラム陰性病原体に対してのナイシン＋ＧＮＰ−８／Ｄ８及びバンコマイシン＋ＧＮＰ−８／Ｄ８。異なる色は異なる組合せに対応する。 ナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害分析。パネルＡ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ａ）大腸菌ＬＭＧ１５８６２株。注記：ここでのナイシン及びペプチドの実際の出発濃度は、グラム陰性病原体に対して単独で使用されるときのナイシン、バンコマイシン、又はＧＮＰのＭＩＣ、すなわち病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害効果である。対照と非常に顕著な違いが存在することがわかる。抗生物質及びＧＮＰのＦＩＣＩを計算するために使用したこの組合せでは、病原体の増殖が完全に阻害された。ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６のＦＩＣＩは比較的に高い（わずかに低い相乗効果）が、必要な実際の絶対ＭＩＣ値はＧＮＰ８又はＧＮＰ−Ｄ８の値よりもずっと低い値であることに留意されたい。 ナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害分析。パネルＡ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｂ）クレブシエラ・ニューモニエ。注記：ここでのナイシン及びペプチドの実際の出発濃度は、グラム陰性病原体に対して単独で使用されるときのナイシン、バンコマイシン、又はＧＮＰのＭＩＣ、すなわち病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害効果である。対照と非常に顕著な違いが存在することがわかる。抗生物質及びＧＮＰのＦＩＣＩを計算するために使用したこの組合せでは、病原体の増殖が完全に阻害された。ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６のＦＩＣＩは比較的に高い（わずかに低い相乗効果）が、必要な実際の絶対ＭＩＣ値はＧＮＰ８又はＧＮＰ−Ｄ８の値よりもずっと低い値であることに留意されたい。 ナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害分析。パネルＡ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｃ）緑膿菌ＬＭＧ６３９５株。注記：ここでのナイシン及びペプチドの実際の出発濃度は、グラム陰性病原体に対して単独で使用されるときのナイシン、バンコマイシン、又はＧＮＰのＭＩＣ、すなわち病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害効果である。対照と非常に顕著な違いが存在することがわかる。抗生物質及びＧＮＰのＦＩＣＩを計算するために使用したこの組合せでは、病原体の増殖が完全に阻害された。ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６のＦＩＣＩは比較的に高い（わずかに低い相乗効果）が、必要な実際の絶対ＭＩＣ値はＧＮＰ８又はＧＮＰ−Ｄ８の値よりもずっと低い値であることに留意されたい。 ナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害分析。パネルＡ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｄ）アシネトバクター・バウマンニイＬＭＧ０１０４１株。注記：ここでのナイシン及びペプチドの実際の出発濃度は、グラム陰性病原体に対して単独で使用されるときのナイシン、バンコマイシン、又はＧＮＰのＭＩＣ、すなわち病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害効果である。対照と非常に顕著な違いが存在することがわかる。抗生物質及びＧＮＰのＦＩＣＩを計算するために使用したこの組合せでは、病原体の増殖が完全に阻害された。ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６のＦＩＣＩは比較的に高い（わずかに低い相乗効果）が、必要な実際の絶対ＭＩＣ値はＧＮＰ８又はＧＮＰ−Ｄ８の値よりもずっと低い値であることに留意されたい。 ナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害分析。パネルＡ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ。（Ｅ）エンテロバクター・アエロゲネスＬＭＧ０２０９４株。注記：ここでのナイシン及びペプチドの実際の出発濃度は、グラム陰性病原体に対して単独で使用されるときのナイシン、バンコマイシン、又はＧＮＰのＭＩＣ、すなわち病原体に対するナイシン／バンコマイシン＋ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８の阻害効果である。対照と非常に顕著な違いが存在することがわかる。抗生物質及びＧＮＰのＦＩＣＩを計算するために使用したこの組合せでは、病原体の増殖が完全に阻害された。ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６のＦＩＣＩは比較的に高い（わずかに低い相乗効果）が、必要な実際の絶対ＭＩＣ値はＧＮＰ８又はＧＮＰ−Ｄ８の値よりもずっと低い値であることに留意されたい。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ａ：指示株：大腸菌ＬＭＧ１５８６２株。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｂ：指示株：クレブシエラ・ニューモニエ。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｃ：指示株：緑膿菌ＬＭＧ６３９５株。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｄ：指示株：アシネトバクター・バウマンニイＬＭＧ０１０４１株。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｅ：指示株：エンテロバクター・アエロゲネスＬＭＧ０２０９４株。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｆ：グラム陰性病原体に対するバンコマイシン＋ＧＮＰ８。 グラム陰性病原体に対して組み合わせて試験されたときのナイシン／バンコマイシン／ＧＮＰの正確な濃度。Ａ〜Ｅ：異なるグラム陰性病原体に対するナイシン＋ＧＮＰ。Ｇ：グラム陰性病原体に対してのバンコマイシン＋ＧＮＰ−Ｄ８。
実施例１〜実施例８の材料及び方法
１．１．材料及びペプチド
以前に記載されたように［２６］、ＨＰＬＣを使用してナイシンの精製と定量を実施した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カナダ）からバンコマイシンを購入した。Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ（フランス）及びＰｅｐｓｃａｎ（オランダ）によって合成ペプチドが供給された。
１．２．細菌株と培養条件
本研究において使用された細菌を表４に示す。使用した細菌は全て、ベルギー微生物保存機関（ＢＣＣＭ）から得られた。
大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニイ、エンテロバクター・アエロゲネスは、３７℃でルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中に振盪（２００ｒｐｍ）して培養されるか、又はＬＢ寒天培地上で培養された。ナイシン、バンコマイシン、合成ペプチド（ＧＮＰ）、及び混合試験の最小阻害濃度（ＭＩＣ）をそれぞれ検討するために、これらの株の全てを使用した。
１．３．最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
Ｗｉｅｇａｎｄ及びＨｉｌｐｅｒｔ［２７］に従って、滅菌ポリプロピレンマイクロタイタープレート内での液体増殖阻害微小希釈アッセイにより反復してＭＩＣ検査を実施した。最初に、適切な寒天プレート上に指示株を画線（ｓｔｒｅａｋｅｄ ｏｎ）し、一晩培養した。無作為に３〜５個のコロニーを選別し、生理食塩水（０．９％（重量／体積）ＮａＣｌ）中に再懸濁して、ＯＤ６２５が約０．０８〜０．１３（１〜２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌懸濁液を作製した。ミュラー・ヒントン培地（ＭＨＢ）を使用して１：１００の比率でこの懸濁液を希釈した。最終接種材料は５×１０５ＣＦＵ／ｍＬである。各株について、ペプチドを含まない第１１列を増殖対照として含め、培地のみのウェルからなる第１２列を無菌対照として含めた。抗微生物剤を１つずつ１／２に段階希釈し、各ウェルに希釈した５０μＬの細菌懸濁液を添加して最終体積が１００μＬになるようにした。ウェル１１から１０μＬを取り出し、１０００倍に希釈して固形培地上に１／１０懸濁液をプレーティングすることにより、増殖対照を達成した。マイクロタイタープレート及びコロニー計数対照を、振盪せずに３７℃で１６〜２０時間にわたって保温し、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００）を使用してＯＤ６００を測定して増殖阻害を評価した。対照寒天プレート上のコロニーの数は、接種材料の濃度と実験の有効性を確実にするために約５０でなくてはならなかった。指示株の可視可能な増殖を阻害する抗微生物剤の最低濃度が、ＭＩＣとして特定される。
１．４．ナイシンとＧＮＰの相乗効果検査
標準チェッカーボード培地微小希釈アッセイ［２８，２９］を実行することにより、相乗効果の検査を実施した。ナイシン（薬品Ｘ）を、Ｘ軸の第１列から第１０列まで２倍段階希釈して負荷した一方、ＧＮＰ（薬品Ｙ）を、Ｙ軸のＡ行からＨ行まで８行に２倍段階希釈して負荷した（図１）。元のペプチド濃度はそれぞれのＭＩＣであった。上記の通り、ペプチドを含まない増殖対照として第１１列を使用しており、ＭＨＢ培地のみのウェルを含む第１２列を無菌対照として含めた。５０μＬの新しい細菌懸濁液をウェル１〜１１に添加した。プレート上の各ウェルの最終体積は１００μＬである。
１．５．バンコマイシンとＧＮＰの相乗効果検査
方法１．４と同様に、相乗効果の検査を実施した。Ｘ軸とＹ軸について別々にバンコマイシンとＧＮＰを２倍段階希釈した。
１．６．相乗性を計算するためのアルゴリズム
上記併用療法が相加的であるか、相乗的であるか、又は拮抗的であるのか判定するため、部分阻害濃度（ＦＩＣ）インデックス［３０］を計算した。
ＦＩＣＩ＝ＦＩＣａ＋ＦＩＣｂ
＝ＭＩＣａｃ／ＭＩＣａ＋ＭＩＣｂｃ／ＭＩＣｂ［２８、３０］。
ＭＩＣａ／ＭＩＣｂは、化合物Ａ／Ｂ単独のＭＩＣである。ＭＩＣａｃは、化合物Ｂと組み合わせた化合物ＡのＭＩＣであり、ＭＩＣｂｃは、化合物Ａと組み合わさったときの化合物ＢのＭＩＣである。ＦＩＣは、化合物単独のＭＩＣを、他の化合物と組み合わせた化合物のＭＩＣにより除算したものである。ＦＩＣａは化合物ＡのＦＩＣであり、ＦＩＣｂは化合物ＢのＦＩＣである。ＦＩＣＩは次のように解釈される。相乗的、ＦＩＣＩ≦０．５；相加的、０．５＜ＦＩＣＩ＜１；中立的、１＜ＦＩＣＩ＜２；拮抗的、ＦＩＣＩ＞２。
実施例１：ナイシン及びＬ体ＧＮＰの単独でのグラム陰性病原体に対する活性
ナイシン及びＬ−アミノ酸ベースのＧＮＰの活性検査を、５種類のグラム陰性病原体に対して実施した。ＭＩＣの結果を表５に示す。ＧＮＰのＭＩＣは、ペプチド及び病原体の間で相互に非常に異なっており、２μＭから２５６μＭ超まで変化したことがわかる。全ＧＮＰの中でＧＮＰ−４が最低の活性を示した一方、ＧＮＰ−５及びＧＮＰ−６は最も強力である。
実施例２：混合物中のナイシンとＬ体ＧＮＰの相乗効果
方法１．４に従って、ナイシンとＧＮＰの相乗効果を決定した。ＧＮＰのＭＩＣは異なっているが、それらの全てをナイシンと組み合わせて、大腸菌に対して検査した。結果を表６に示した。各組合せに対して２種類のＦＩＣＩが示されている。
ＦＩＣＩは次のように解釈される：相乗的、ＦＩＣＩ≦０．５；相加的、０．５＜ＦＩＣＩ＜１。したがって、ナイシンはＧＮＰ−２とＧＮＰ−３について相加的であり、大腸菌に対して検査されたその他のペプチドの全てについては相乗的であると結論することができる。ＧＮＰ−８＋ナイシンの混合物が最良の組合せのようであったが、別々の抗微生物剤として使用される場合の元の濃度の１／４と１／３０まで作用濃度を下げることができる。
ナイシン＋ＧＮＰ４のＦＩＣＩは０．３７５であった。これは、３μＭのナイシンと８μＭのＧＮＰ−４の混合物、又は１．５μＭのナイシンと１６μＭのＧＮＰ−４の混合物により大腸菌の増殖を完全に阻害することが可能であることを意味する。しかしながら、８μＭ又は１６μＭという濃度は、インビボ検査で使用するにはやはりどちらかというと高い濃度である。したがって、相乗効果を判定するための以下の実験では、ＧＮＰ−１、ＧＮＰ−５、ＧＮＰ−６、ＧＮＰ−７、及びＧＮＰ−８のペプチドに焦点を当てる。
クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニイ、及びエンテロバクター・アエロゲネスに対する混合試験の結果を表７（表７−１〜７−２）に示す。０．１よりも低いＦＩＣＩを示すために赤色を使用したが、これは、ナイシン及びＧＮＰの濃度の両方が少なくとも３０倍低いことを示している。混合物の効率（μＭ）は、クレブシエラ・ニューモニエに対して最高であり、緑膿菌ＬＭＧ６３９５株に対して最低であった。ナイシン＋ＧＮＰ−８の混合物（１．５μＭナイシン＋０．５μＭ ＧＮＰ−８又は０．７５μＭナイシン＋１μＭ ＧＮＰ−８）及びナイシン＋ＧＮＰ−９の混合物（３μＭナイシン＋１μＭ ＧＮＰ−９又は０．７５μＭナイシン＋４μＭ ＧＮＰ−９）は、クレブシエラ・ニューモニエに対して最良の相乗効果を示す組合せである。これらの混合物では、ナイシン及びＧＮＰ−８のＭＩＣは、元のＭＩＣの１／３２又は１／６４ほどの低さであり得る。一方、緑膿菌及びエンテロバクター・アエロゲネスが指示株として使用された場合、幾つかの混合物は、２種類の化合物の間での相加的効果を及ぼすことも示された。ＧＮＰ−６及びＧＮＰ−７は、上記５種類のグラム陰性病原体の全てに対して、ナイシンとの混合物の状態で相乗的に作用するように見受けられた。大半の事例において、これらのＭＩＣは４〜８倍まで低下し得る。
実施例３：グラム陰性病原体に対するバンコマイシンとＤ体ＧＮＰの混合物の活性
これまでの実施例において示してきたように、ＧＮＰ−６、ＧＮＰ−７、ＧＮＰ−８、及びＧＮＰ−９のペプチドは、ナイシンとの混合物の状態で特有の相乗効果をグラム陰性病原体に対して示す。ＧＮＰ−８ペプチドとＧＮＰ−９ペプチドの配列は非常に似ているが、ＧＮＰ−８は有している正味の（正の）電荷がより少ないが、その電荷は体により好適に吸収され、且つ、利用されている可能性がある。この実施例では、Ｄ−アミノ酸からのみ構成されるＧＮＰ−６ペプチド、ＧＮＰ−７ペプチド、及びＧＮＰ−８ペプチド（それぞれＧＮＰ−Ｄ６、ＧＮＰ−Ｄ７、及びＧＮＰ−Ｄ８と呼ぶ）を評価した。
重要且つ広く使用されている内膜作用性糖ペプチドであるバンコマイシンを選択して、ＧＮＰとの相乗効果を検査した。ナイシンと同様に、バンコマイシンも細胞膜と接触し、細胞壁合成を阻害する。
表８は、５種類のグラム陰性病原体に対して個々の薬剤として使用された場合のバンコマイシン並びにＧＮＰ−Ｄ６、ＧＮＰ−Ｄ７、及びＧＮＰ−Ｄ８のＭＩＣを示している。予想されたように、バンコマイシン単独ではグラム陰性細菌に対して有効ではない。グラム陰性病原体の防護的外膜が、バンコマイシンが内膜に到達することを妨げることが主な理由であり得る。驚くべきことに、これらのＤ体のＧＮＰは、Ｌ体のＧＮＰと比較するとグラム陰性病原体に対して上昇した活性を示すことがわかった。
実施例４：Ｄ体ＧＮＰとの混合物中のナイシンの相乗効果
本実施例は、ナイシンとＤ体ＧＮＰの混合物の抗微生物活性を示す。表９（表９−１〜表９−２）に示す通り、ナイシン＋ＧＮＰ−Ｄ８は５種類のグラム陰性病原体の全てに対して高い効率を示し、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニイ及びエンテロバクター・アエロゲネスについてのＦＩＣＩ値は０．１よりも低い。大腸菌を指示株として使用した場合、ＧＮＰ−６＋ナイシン及びＧＮＰ−７＋ナイシンの効果は相加的であることが示された。クレブシエラ・ニューモニエに対するＧＮＰ−Ｄ８及びナイシンのＦＩＣＩは０．０６３又は０．０７３であり、ＧＮＰ−８＋ナイシンのＦＩＣＩは０．０４７である。大腸菌及びエンテロバクター・アエロゲネスを指示株と使用した場合にも、このような高レベルの相乗効果が観察された。図２に、相乗効果のデータ分析を示す。
実施例５：バンコマイシンとＧＮＰ−８／ＧＮＰ−Ｄ８又はＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６の相乗効果
バンコマイシンとＧＮＰの混合物を使用して抗微生物検査も実施した。これまでの実施例によれば、相乗性検査においてＧＮＰ−８及びＧＮＰ−Ｄ８が非常に良い成績を収めた。そこで、これらをバンコマイシンとの混合物の状態で、５種類のグラム陰性病原体に対して検査した。表１０に示されるように、混合物は両方とも、５種類のグラム陰性病原体の全てに対して高い相乗効果を示した。化合物の濃度は両方とも、ＭＩＣ単独の１／３２〜１／８まで低下した。クレブシエラ・ニューモニエについてのＦＩＣＩは０．０９４であり、これは両方の化合物のＭＩＣが同時に１６倍又は３２倍低下したことを意味する。相乗効果のデータ分析を図３に示す。表１１は、ＧＮＰ−６／ＧＮＰ−Ｄ６とバンコマイシンについて観察された相乗効果を示している。
実施例６：ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−９変異体とナイシン／バンコマイシンの相乗効果
本実施例では、ＧＮＰ−８／ＧＮＰ−９に基づく６種類ワンセットの変異体ペプチドを設計し、合成し、検査した。変異体ＧＮＰ−８．１、ＧＮＰ−８．２、ＧＮＰ−８．３、ＧＮＰ−８．４、ＧＮＰ−８．５、及びＧＮＰ−８．６の配列を表１２に示す。
変異体ＧＮＰ８−１では、このペプチドの正味の電荷を減少させるために、ＧＮＰ−８のＣ末端アルギニンが欠失された。Ｎ末端アルギニンは、変異体ＧＮＰ８−２ではリシンで置換され、変異体ＧＮＰ８−３ではアラニンで置換された。ＧＮＰ８−４及びＧＮＰ８−５では、親水性及び正の電荷を増加させるために、バリン及びグルタミンがアルギニン及びリシンにより置換された。ＧＮＰ８−４及びＧＮＰ８−５では、アルギニンとリシンの順序が逆転された。変異体ＧＮＰ８−６では、Ｃ末端のロイシン残基を欠失することにより、同じ正味の電荷を有するが、正に帯電したＣ末端アミノ酸間の空間が狭くなったペプチドが得られた。
５種類のグラム陰性病原体に対するナイシン、バンコマイシン及びｄｅ ＧＮＰ−８変異体の各々単独の活性が表１３に記載されており、ナイシン又はバンコマイシンとのペプチド混合物の結果が表１４（表１４−１〜表１４−３）及び表１５（表１５−１〜表１５−３）に記載されている。バンコマイシン単独では、グラム陰性病原体に対して非常に控えめであり、５種類の選択されたグラム陰性病原体の増殖を抑えるためには少なくとも３２μＭのバンコマイシンが必要であった。さらに、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及びエンテロバクター・アエロゲネスに対するバンコマイシンのＭＩＣはそれぞれ１２８μＭ、１２８μＭ、及び１９２μＭであった。特に、個々のＧＮＰ−８変異体のＭＩＣは、互いに非常に異なっていた。ＧＮＰ−８と比較すると、ＧＮＰ８−１、ＧＮＰ８−２、及びＧＮＰ８−３はある特定の細菌に対して同等の活性を示す一方で、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニイ、及びエンテロバクター・アエロゲネスに対するＧＮＰ８−４、ＧＮＰ８−５、及びＧＮＰ８−６のＭＩＣは全て２５６μＭより上であった。これらの結果は、ペプチドの抗微生物活性に対するコア配列ＩＶＱＲＩＫＫＷＬの重要性を強調している。
実施例８：多剤耐性病原体に対するバンコマイシン、ＧＮＰ−Ｄ６、及びＧＮＰ−Ｄ８の活性
数種類の多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陰性病原体に対して、バンコマイシン、ＧＮＰ−Ｄ６、及びＧＮＰ−Ｄ８を個々に検査した（表１６）。ＭＩＣ値を表１７に示す。
実施例８：バンコマイシン及びＧＮＰ−Ｄ６／ＧＮＰ−Ｄ８の細胞傷害性及び溶血活性
ヒトＨＥＫ２９３細胞を使用して、バンコマイシン、ＧＮＰ−Ｄ６、及びＧＮＰ−Ｄ８の細胞傷害性を評価した。各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を添加し、５分間保温した後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３で発光を測定することによりＡＴＰレベルを測定した。様々な濃度の化合物が存在する状態で得られたシグナルを、これらの添加化合物が無い対照ウェルについて得られたシグナルと比較することにより、細胞生存度に対する効果を決定した。その後、それらの効果を算出し、ＩＣ５０値として表し、表１７に示した。
バンコマイシン及びＧＮＰ−Ｄ８は、検査した濃度ではＡＴＰレベルに影響しないことが示されている。ＧＮＰ−Ｄ６のＩＣ５０が３２．９μＭであった一方で、グラム陰性病原体の増殖を抑えるための作用濃度は常に２μＭである（表１０）。
新鮮なヒト赤血球（ＨＲＢｃ）を溶血検査に使用した。様々な濃度の検査化合物と共に３７℃で１時間保温した後に、上清の吸光度を測定した。ＨＣ５０を表１８に示した。それぞれ５００μＭ及び３００μＭの濃度でも、バンコマイシン及びＧＮＰ−Ｄ８はＨＲＢｃに対して溶血を誘導しなかった。ＧＮＰ−Ｄ６のＨＣ５０は１６８．９μＭであり、後者はＧＮＰ−Ｄ６の作用濃度よりも８０倍高かった。
結論として、バンコマイシン及びＧＮＰ−Ｄ８は、検査した濃度においてはヒト赤血球の溶解を引き起こすこともなければ、ヒト細胞株ＨＥＫ−２３９に対して有意な傷害性を示すこともない。このことは、バンコマイシン、ＧＮＰ−Ｄ６、及びＧＮＰ−Ｄ８の使用が安全であり、ヒト細胞に対して傷害性を引き起こさないことを示している。
実施例９：臨床的に意義あるグラム陰性病原体に対する抗微生物活性
本実施例では、確立された培地微小希釈法を用いて、１２種類の異なる細菌株に対するペプチドＧＮＰ−Ｄ６（「Ｄ６−ペプチド」）及びＧＮＰ−Ｄ８（「Ｄ８−ペプチド」）の抗細菌活性を、単独及びバンコマイシンと組み合わせて検査する。ＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協議会）ガイドラインに従って検査を実施した。本実験で得られた情報は、μｇ／ｍＬ単位で表される最小阻害濃度、すなわちＭＩＣの決定であった。並行して、細胞生存度に対する効果について個々のペプチド、バンコマイシン、及びそれらの組合せをＨＥＫ２９３細胞株において検査した。
バンコマイシン及びペプチドを単独で、１２８μｇ／ｍＬから始まる複数の濃度において検査した。バンコマイシンとペプチドの３種類の異なる組合せ、すなわち、バンコマイシン＋Ｄ６ペプチドを１／０．３、１／０．１、及び１／０．０３の比率で、また、バンコマイシン及びＤ８ペプチドを１／１、１／０．３、及び１／０．１の比率で検査した。
検査した細菌株は、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及びアシネトバクター・バウマンニイの株であり、各種の細菌について１つはＡＴＣＣ品質管理株であり、１つはＡＴＣＣ耐性株であり、１つは臨床分離体であった。
材料及び方法
１．１．材料
１．１．１．検査化合物
・バンコマイシン塩酸塩：Ｓｉｇｍａ、Ｖ２００２−２５０ＭＧ、ロット番号０３７Ｍ４００８Ｖ
・Ｄ６ペプチド
・Ｄ８（Ｄ−ＫＲ）ペプチド
１．１．２．微生物株及び細胞
・大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２株
・大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２４５２株
・大腸菌Ｂ１９２７株、臨床分離体
・クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ７００６０３株
・クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ ＢＡＡ−２５２４株
・クレブシエラ・ニューモニエＢ１９４５株、臨床分離体
・緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３株
・緑膿菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１０８株
・緑膿菌Ｂ１９５４株、臨床分離体
・アシネトバクター・バウマンニイＡＴＣＣ１７９７８株
・アシネトバクター・バウマンニイＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６０５株
・アシネトバクター・バウマンニイＢ２０２６株、臨床分離体
・ＨＥＫ２９３、ＥＣＡＣＣ、カタログ番号８５１２０６０２）
１．１．３．培地及び装置
・ＢＢＬ（商標）ミュラー・ヒントン培地：ＲＥＦ２７５７３０、ロット番号７００９６９９、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
・ミュラー・ヒントン寒天培地２：参照番号９７５８０−５００Ｇ−Ｆ、ロット番号ＢＣＢＶ４６４６、Ｓｉｇｍａ
・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：カタログ番号４１９６６−０２９、Ｇｉｂｃｏ
・ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：カタログ番号Ｆ７５２４、Ｓｉｇｍａ
・非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）１００×：カタログ番号１１１４０−０３５、Ｇｉｂｃｏ
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：ｐＨ７．４（１０ｘ）、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号７００１１−０３６、ロット番号１９７２０２０
・ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
・ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マイクロプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ
１．２．方法
１．２．１．ペプチドの調製
検査のために、ペプチド（固形物）をＰＢＳ中に溶解して５ｍｇ/ｍＬの溶液を調製した。バンコマイシンを５ｍｇ、１ｍＬの滅菌水にを溶解して調製した。
化合物単独の検査のために、これらのＰＢＳ溶液のうち、７６．８μＬをディープウェル中の１４２３．２μＬのＭＨ培地中に移した。組合せの検査のために、バンコマイシンとＤ６ペプチドを１：０．３、１：０．１、及び１：０．０３の比率で混合し（７６．８μＬのバンコマイシン＋２３．１μＬのＤ６＋１４００．１μＬのＭＨ培地；７６．８μＬのバンコマイシン＋７．７μＬのＤ６＋１４１５．５μＬのＭＨ培地；７６．８μＬのバンコマイシン＋２．６μＬのＤ６＋１４２０．６μＬのＭＨ培地）、バンコマイシンとＤ８ペプチドを１：１、１：０．３、及び１：０．１の比率で混合した（７６．８μＬのバンコマイシン＋７６．８μＬのＤ８＋１３４６．４μＬのＭＨ培地；７６．８μＬのバンコマイシン＋２３．１μＬのＤ８＋１４００．１μＬのＭＨ培地；７６．８μＬのバンコマイシン＋７．７μＬのＤ８＋１４１５．５μＬのＭＨ培地）。これらの作用溶液のうち、１００μＬを９６ウェルアッセイプレートの第３列に移した。アッセイプレートには、第３列のウェルを除く全てのウェルに５０μＬのＭＨ培地を予め満たした。ペプチド及びバンコマイシンの添加の際には、５０μＬを第３列から第４列に移した後で、第４列から第５列に移し、それを繰り返した。このようにして、ペプチド及びバンコマイシンを２倍段階希釈して９６ウェルアッセイプレートに蒔いて、１２８〜０．２５μｇ／ｍＬの終濃度範囲にした。
１．２．２．接種材料の調製
使用した微生物は全て、ＭＨ寒天プレート上に播種されることにより、−７０℃で保存されたスキムミルクから再生された。翌日に、各微生物の単一コロニーを再び新しい寒天プレート上に画線した。翌日、直接コロニー懸濁法を用いて、各微生物について０．５マクファーランド標準に等価の濁度を達成している培地溶液を調製した。これにより、１〜２×１０８ＣＦＵ／ｍＬを含む懸濁液が得られた。これらの懸濁液をＭＨ培地で１００×に希釈して、２〜８×１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終部生物数にすることにより、実際の接種材料を調製した。各株の微生物について、２０ｍＬのこれらの接種材料溶液を調製した。９６ウェルプレートの第２列から第１２列まで、５０μＬのこれらの溶液を各ウェルに移した。第１列には、ウェル当たり５０μＬの純粋な培地を添加した。このように、第１列を、使用した培地の無菌対照として使用し、第２列を、微生物増殖の対照として使用し、プレートの残りを、ＭＩＣ決定のために使用した。全てのプレートを３７℃で１６〜２４時間にわたって保温した。
１．２．３．ＭＩＣの決定
９６ウェルプレート内での細菌増殖の目視検査によりＭＩＣを決定した。細菌の可視可能な増殖が無い第１列を、その特定の行について検査されたペプチド又は混合物のＭＩＣ値として決定した。
１．２．４．細胞生存度の評価
１％ＮＥＡＡ及び１０％ＦＢＳを添加した１００μＬのＤＭＥＭ培地中に、ウェル当たり３０，０００細胞の濃度でＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに播種した。１００μＬの滅菌ＰＢＳを境界セルに満たした。翌日、細胞に化合物を添加した。まず、９６ウェルＶ底プレートにおいて、ＰＢＳ中に化合物を２倍に希釈した。その後、９６ディープウェルプレートにおいて、終濃度まで化合物を培地と混合した。３枚のプレートから増殖培地を吸引除去し、１００μＬの調製済み化合物と置き換えた。化合物の検査は二組の複製実験で行った。各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を添加し、５分間保温した後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３で発光を測定することにより、ＡＴＰレベルを測定した。様々な濃度の化合物が存在する状態で得られたシグナルを、対照ウェルについて得られたシグナルと比較することにより、細胞生存度に対する検査化合物の潜在的な効果を決定した。その後、それらの潜在的効果を算出し、ＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）として表した。
結果
検査したペプチド及び組合せのＭＩＣを表１９及び表２０に示す。
表２１は、ＨＥＫ２９３細胞における検査化合物のＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）として提示される、細胞生存度に対するペプチド及びバンコマイシンとペプチドの組合せの効果を示している。
これらのデータは、細胞傷害性がＤ６については低く、Ｄ８については非常に低いことを示している。
表２及び表３の参照文献
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Claims (17)

  1. （ｉ）膜透過活性及び／又はＬｉｐｉｄ ＩＩ結合活性を有する内膜作用性化合物と、
    （ｉｉ）ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
    ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、
    ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、
    ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、及び
    Ｘ１Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３−ＮＨ２
    （ここで、Ｘ１は存在しないか、又はＫであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないか、又はＲである）
    からなる群より選択される１又は複数の抗微生物ペプチドと、
    の混合物であって、
    前記１又は複数の抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含んでいてもよいか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されていてもよい、前記混合物。
  2. 前記抗微生物ペプチドが、
    ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
    ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、
    ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、
    ＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）、及び
    ＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）
    からなる群より選択される、請求項１に記載の混合物。
  3. 前記１又は複数の抗微生物ペプチドがＬ−アミノ酸から構成される、請求項１又は請求項２に記載の混合物。
  4. 前記１又は複数の抗微生物ペプチドがＤ−アミノ酸から構成される、請求項１又は請求項２に記載の混合物。
  5. 前記抗微生物ペプチドが、
    ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、
    ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、
    ＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）、及び
    ＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）
    からなる群より選択され、
    好ましくは前記抗微生物ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の混合物。
  6. 前記抗微生物ペプチドが、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成されるＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）又はＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）であり、
    好ましくは前記抗微生物ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される、請求項５に記載の混合物。
  7. 前記内膜作用性化合物が、内膜作用性ポリペプチドであり、好ましくはナイシン、バンコマイシン、並びに表２又は表３に記載されるそれらの物質の活性型変異体及び活性型誘導体からなる群より選択される内膜作用性ポリペプチドである、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の混合物。
  8. 前記内膜作用性ポリペプチドがナイシン又はバンコマイシンである、請求項７に記載の混合物。
  9. 前記内膜作用性化合物がマクロライドグループに属する、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の混合物。
  10. Ｘ２ＩＶＱＲＩＫＫＷＬＸ３−ＮＨ２という配列の抗微生物ペプチドであって、
    ここで、Ｘ２はＲ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ３は存在しないか、又はＲであり、
    前記抗微生物ペプチドは、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される、前記抗微生物ペプチド。
  11. ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、又はＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）、好ましくはＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）という配列の抗微生物ペプチドであって、
    Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成され、好ましくはＤ−アミノ酸から構成される、請求項１０に記載の抗微生物ペプチド。
  12. 請求項１０又は請求項１１に記載のペプチドを含み、
    任意に１又は複数の更なる抗微生物剤、及び賦形剤を含む殺菌性組成物。
  13. 請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の混合物又は請求項１０若しくは請求項１１に記載の抗微生物ペプチドと、
    薬学的に許容可能なベヒクル、キャリア、又は希釈剤と、
    を含む医薬組成物。
  14. 対象におけるグラム陰性病原体が原因の病原体感染症を予防又は治療する方法に使用される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記感染症が、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニイ、エンテロバクター・クロアカ、及びサルモネラ・エンテリカからなる群より選択される細菌によって引き起こされ、好ましくは前記細菌が多剤耐性（ＭＤＲ）細菌である、請求項１４に記載の使用のための組成物。
  16. グラム陰性病原体に対する内膜作用性化合物の治療有効性及び治療効力を増強するための方法であって、
    ＲＲＬＦＲＲＩＬＲＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−６）、
    ＧＮＮＲＰＶＹＩＰＱＰＲＰＰＨＰＲＬ（ＧＮＰ−１）、
    ＲＩＷＶＩＷＲＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−５）、
    ＧＩＧＫＨＶＧＫＡＬＫＧＬＫＧＬＬＫＧＬＧＥＣ（ＧＮＰ−７）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８）、
    ＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．１）、
    ＫＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．２）、
    ＡＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−８．３）、及び
    ＫＲＩＶＱＲＩＫＫＷＬＲ−ＮＨ２（ＧＮＰ−９）
    からなる群より選択され、Ｄ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸を含むか、又はＤ−アミノ酸若しくはＬ−アミノ酸から構成される抗微生物ペプチドの存在下で、前記内膜作用性化合物を前記グラム陰性病原体と接触させることを含む、前記方法。
  17. 前記内膜化合物が、ナイシン若しくはバンコマイシン、又は表２若しくは表３に記載されるそれらの物質の活性型変異体若しくは活性型誘導体である、請求項１６に記載の方法。
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