JP2020524699A - タンパク質薬物とｐ／ａペプチドとのコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、タンパク質薬物と２つ以上のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲート、およびそれを含む医薬組成物に関する。本発明のコンジュゲートは、個々のアンマスク状態のタンパク質薬物と比較して免疫原性が有利に低く、安全性および忍容性のプロファイルが好適であり、このため、本発明のコンジュゲートは特に治療上の使用に適切となる。本コンジュゲートは、さらに血漿中半減期が向上しており、したがって、個々のアンマスク状態のタンパク質薬物と比較して作用持続時間が長く、このため、投与頻度の低減、ひいては副作用の負荷の低減が可能になる。本発明はまた、このようなコンジュゲートを調製するプロセス、およびコンジュゲートの調製における合成中間体として有用な活性化Ｐ／Ａペプチドも提供する。

Description

本発明は、タンパク質薬物と２つ以上のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲート、およびそれを含む医薬組成物に関する。本発明のコンジュゲートは、個々のアンマスク状態のタンパク質薬物と比較して免疫原性が有利に低く、安全性および忍容性のプロファイルが好適であり、このため、本発明のコンジュゲートは特に治療上の使用に適切となる。本コンジュゲートは、さらに血漿中半減期が向上しており、したがって、個々のアンマスク状態のタンパク質薬物と比較して作用持続時間が長く、このため、投与頻度の低減、ひいては副作用の負荷の低減が可能になる。本発明はまた、このようなコンジュゲートを調製するプロセス、およびコンジュゲートの調製における合成中間体として有用な活性化Ｐ／Ａペプチドも提供する。
タンパク質薬物などの多くの生物学的薬剤の主な欠点は、腎臓濾過による血液循環からのそのクリアランスが急速で、その治療有効性が著しく制限されることである。しかし、見かけの分子寸法を、腎臓糸球体の孔径を超えるほど大きくすることによって、治療用タンパク質の血漿中半減期を、数日という医学的に有用な範囲まで延長することができる。このような効果を実現するための１つの戦略は、生物学的薬剤を、合成ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と化学的にコンジュゲートすることである。これにより、いくつかの承認薬、例えば、ＰＥＧ−インターフェロンα２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、ＰＥＧ化抗ＴＮＦα−Ｆａｂ断片（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、および最近ではＰＥＧ化インターフェロンベータ−１ａ（Ｐｌｅｇｒｉｄｙ（登録商標））が出来ている。それでも、「ＰＥＧ化」技術にはいくつか欠点がある。特に、ＰＥＧは生分解性ではなく、継続処置をすると、腎臓上皮の空胞化などの副作用を引き起こす恐れがある。例えば、Gaberc-Porekar (2008) Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-50; Knop (2010) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288-308;またはArmstrong in: Veronese (Ed.), "PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications", Birkhauser Verlag, Basel 2009;またはIvens (2015) Toxicol Pathol. 43:959-983を参照されたい。さらに、動物とヒトの両方に抗−ＰＥＧ免疫の出現が認められており、これによりＰＥＧ化治療用物質のクリアランスが加速化し、そのため、治療有効性の低下につながる恐れがある（例えば、Yang et al. (2015) Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 7:655-677を参照）。
ＰＥＧ技術の欠点の一部を克服するために、一定の組換えポリペプチドミメティックが当技術分野において提供されており、その一部は、天然に存在するアミノ酸配列または合成アミノ酸ストレッチに基づいている。ほとんどの天然アミノ酸配列は、フォールディングされたコンフォメーション（二次構造）をとる傾向があり、またはアンフォールド状態の場合は通常不溶性で、凝集体を形成するため、生理学的溶液中では、ＰＥＧの重要な特徴を構成する理想的なランダム鎖のようには挙動しない。実際、ポリペプチドのランダム鎖挙動を調査するための従来の実験のほとんどは、変性条件下、すなわち、尿素または塩化グアニジウムのような化学的変性剤の存在下で行われた（例えば、Cantor (1980) Biophysical Chemistry. W.H. Freeman and Company, New Yorkを参照）。したがって、このような技術は、一般に、フォールディング、凝集および非特異的吸着に抵抗し、それにより、フォールディングされる治療用タンパク質ドメインに遺伝子的に融合されている場合でさえも生理学的緩衝液条件および温度下で安定なランダム鎖になる特殊なアミノ酸配列に基礎を置いている。これらの状況下で、このような組換えＰＥＧミメティックは、普通その分子量のみを基に予想されるよりも大幅に大きくサイズを増大させることができ、最終的に、腎臓濾過を遅延し、付着させた生物学的薬剤の血漿中半減期を相当な倍率で効果的に延長する。
最近、治療用タンパク質の血漿中半減期を延長する新規な方法が開発された。これは、小残基Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ（ＰＡＳ）を含み、流体力学的容積が大きく、コンフォメーションが無秩序なポリペプチド鎖を利用するもので、「ＰＡＳ化」と名付けられた（Schlapschy, M., Binder, U., Borger, C., Theobald, I., Wachinger, K., Kisling, S., Haller D. & Skerra, A. (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng. Des. Sel., 26(8), 489-501、国際公開第２００８／１５５１３４号パンフレット）。ＰＡＳ配列は、親水性、非荷電性の生物学的ポリマーであり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にきわめて類似した生物物理学的性質を有するが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）については、これを薬物に化学的にコンジュゲートすることが、血漿中半減期を延長するために確立された方法である。それに対し、ＰＡＳポリペプチドは、遺伝子レベルで治療用タンパク質に融合し、大腸菌（E. coli）が十分に活性な治療用タンパク質を産生するのを可能にし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングまたは修飾の各ステップを不要にすることが記述されている。さらに、ＰＡＳポリペプチドは生分解性であり、それ故、器官での蓄積を回避しながら血清中の安定性を示し、マウスにおいて毒性または免疫原性は認められていない。ＰｒｏおよびＡｌａからなるポリペプチドを用いる、治療用タンパク質の類似の修飾も提案されている（国際公開第２０１１／１４４７５６号パンフレット）。
しかしながら、治療特性が改善されたタンパク質薬物は、依然として必要とされ続けている。したがって、本発明の目的は、治療用酵素を含むタンパク質薬物の免疫原性を低下させる、および／または血漿中半減期を延長するための、新規なおよび／または改善された手段を提供することである。
本発明の内容において、驚くべきことに、２つ以上のＰ／Ａペプチドを、特定のＣ末端アミノ酸残基（ＲＣ、これは、そのアミノ基とそのカルボキシ基（β−アラニン、δ−アミノ吉草酸またはパラ−アミノシクロヘキサンカルボン酸など）との間に少なくとも２個の炭素原子を含む）を介してタンパク質薬物に化学的にコンジュゲートすると、タンパク質薬物の分子当たりのＰ／Ａペプチドのカップリング比が特に高いコンジュゲートが得られ、その結果、免疫原性がかなり低下し、血漿中半減期が向上することが発見された。さらに、この新規な技術は、触媒活性を損なわずに治療用酵素に適用することができ、対応するコンジュゲートの治療的価値を大いに高めることが発見された。
したがって、本発明は、タンパク質薬物と２つ以上のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであって、各Ｐ／Ａペプチドは、独立に、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣであり、（Ｐ／Ａ）は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基であるか、またはＲＮは存在せず、ＲＣは、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基であり、各Ｐ／Ａペプチドは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とタンパク質薬物の遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して、タンパク質薬物にコンジュゲートしており、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、タンパク質薬物のＮ末端α−アミノ基ではない、コンジュゲートを提供する。
本発明はまた、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物にも関する。さらに、本発明は、医薬品として使用するための、特に疾患／障害（例えば、後述される疾患／障害のうちいずれか１つ）の処置または予防に使用するための、前記コンジュゲートまたは前記医薬組成物に関する。本発明は同様に、特に疾患／障害（例えば、後述される疾患／障害のうちいずれか１つ）を処置または予防するための医薬品の調製における、本明細書において提供されるコンジュゲートの使用に関する。本発明は、さらに、疾患／障害（例えば、後述される疾患／障害のうちいずれか１つ）を処置または予防する方法であって、本発明のコンジュゲート、または前記コンジュゲートおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象（例えば、ヒトまたは動物）に投与するステップを含む、疾患／障害を処置または予防する方法を提供する。
本発明はさらに、本発明によるコンジュゲートを調製するプロセスであって、
（ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔ［式中、ＲＣ−ａｃｔは、ＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣおよび（Ｐ／Ａ）は、調製されるコンジュゲートにおいて定義されるとおりであり、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基である］の活性化Ｐ／Ａペプチドを、タンパク質薬物とカップリングして、タンパク質薬物と、ＲＮが保護基であるＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ、および
（ｂ）任意選択により、ステップ（ａ）において得られたコンジュゲートに含有されているＰ／Ａペプチドから保護基ＲＮを除去して、タンパク質薬物と、ＲＮが存在しないＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ
を含む、プロセスに関する。
さらに、本発明はまた、式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化Ｐ／Ａペプチドであって、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基であり、（Ｐ／Ａ）は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、ＲＣ−ａｃｔは、活性化カルボキシ基を有し、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とその活性化カルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基である、活性化Ｐ／Ａペプチドも提供する。この活性化Ｐ／Ａペプチドは、特に上記のプロセスで、本発明によるコンジュゲートの調製に使用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明によるコンジュゲートを調製するための活性化Ｐ／Ａペプチドの使用に関し、同様に、本発明によるコンジュゲートの調製における活性化Ｐ／Ａペプチドの使用に関する。
本発明に従って提供されるコンジュゲートは、以下でさらに詳細に説明される。この詳細な説明は、コンジュゲート自体のみならず、コンジュゲートを含む医薬組成物、コンジュゲートまたは医薬組成物を使用する治療適用および方法、コンジュゲートを調製するプロセス、およびコンジュゲートを調製するために使用することができる活性化Ｐ／Ａペプチドも含めて、本発明のすべての態様に関し、それらに適用可能である。
Ｐ／ＡペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ
本発明によるコンジュゲートに含まれる各Ｐ／Ａペプチドは、独立に、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣである。したがって、本発明のコンジュゲートに含まれるＰ／Ａペプチドの各々について、Ｎ末端の保護基ＲＮ（存在する場合）、アミノ酸配列（Ｐ／Ａ）、およびＣ末端アミノ酸残基ＲＣは、それらのそれぞれの意味からそれぞれ独立に選択される。したがって、本発明のコンジュゲートに含まれる２つ以上のＰ／Ａペプチドは、同じであってもよく、または互いに異なっていてもよい。好ましくは、コンジュゲートに含まれるＰ／Ａペプチドの全部が同じである。
さらに、コンジュゲートに含まれるＰ／Ａペプチドは、特にコンジュゲートが水性の環境（例えば、水性溶液または水性緩衝液）中に存在する場合に、好ましくはランダムコイルコンフォメーションをとる。ランダムコイルコンフォメーションの存在は、当技術分野において公知の方法を使用して、特に円二色性（ＣＤ）分光法などの分光技術によって判定することができる。
Ｐ／Ａペプチドは、例えば、実施例で言及している、および／または図３に図示している特定のＰ／Ａペプチドのいずれかから選択することができる。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれるアミノ酸配列（Ｐ／Ａ）
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれる（Ｐ／Ａ）部分は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。
（Ｐ／Ａ）を構成するアミノ酸残基の数は、好ましくは約７個〜約８００個のアミノ酸残基、より好ましくは約８個〜約６００個のアミノ酸残基、より好ましくは約８個〜約４００個のアミノ酸残基、より好ましくは約９個〜約２００個のアミノ酸残基、より好ましくは約９個〜約１００個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０個〜約８０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０個〜約６０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１２個〜約５５個のアミノ酸残基、より一層好ましくは約１２個〜約５０個のアミノ酸残基、より一層好ましくは約１５個〜約４５個のアミノ酸残基、さらにより一層好ましくは約２０個〜約４０個のアミノ酸残基である。
（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より一層好ましくは少なくとも９８％、さらにより一層好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％が、プロリンおよびアラニンから独立に選択されるのがさらに好ましい。（Ｐ／Ａ）中の残りのアミノ酸残基は、好ましくは、２０種の標準タンパク質原性のα−アミノ酸から、より好ましくはプロリン、アラニン、セリン、グリシン、バリン、アスパラギンおよびグルタミンから、より一層好ましくはプロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから選択される。したがって、（Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンの各残基から構成される（この場合、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の１０％未満、好ましくは５％未満がグリシン残基またはセリン残基である）のが好ましく、（Ｐ／Ａ）は、プロリン残基およびアラニン残基から構成される、すなわちプロリン残基およびアラニン残基のみからなるのが最も好ましい。当然のことながら、上に明記したように、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。
（Ｐ／Ａ）は、約８個〜約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含むのが特に好ましい。例えば、（Ｐ／Ａ）は、約８個〜約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリン、アラニンおよびグリシンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含むアミノ酸配列とすることができ；代替として、（Ｐ／Ａ）は、約８個〜約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリン、アラニンおよびセリンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含むアミノ酸配列とすることができる。
より好ましくは、（Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択される、１０個〜６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。例えば、（Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニンおよびグリシンから独立に選択される、１０個〜６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含むアミノ酸配列とすることができ；代替として、（Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニンおよびセリンから独立に選択される、１０個〜６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含むアミノ酸配列とすることができる。
より一層好ましくは、（Ｐ／Ａ）は、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、１５個〜４５個のアミノ酸残基からなる（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５個のアミノ酸残基からなる）アミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ中、（Ｐ／Ａ）部分に含まれるプロリン残基の数の、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数に対する割合は、好ましくは≧１０％および≦７０％であり、より好ましくは≧２０％かつ≦５０％であり、より一層好ましくは≧２５％かつ≦４０％である。したがって、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の総数の１０％〜７０％はプロリン残基であるのが好ましく、より好ましくは、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数の２０％〜５０％はプロリン残基であり、より一層好ましくは、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数の２５％〜４０％（例えば、２５％、３０％、３５％または４０％）はプロリン残基である。さらに、（Ｐ／Ａ）は連続するプロリン残基を含有しない（すなわち、（Ｐ／Ａ）は、部分配列ＰＰも、その多重配列も含有しない）のが好ましい。
好ましいアミノ酸配列（Ｐ／Ａ）の例としては、特に、（ｉ）ＡＡＰＡおよびＡＰＡＰから独立に選択される２つ以上の部分配列、および（ｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が挙げられる。（Ｐ／Ａ）のより好ましい例としては、（ｉ）１つまたは複数の部分配列ＡＡＰＡＡＰＡＰ、（ｉｉ）任意選択により、１つまたは２つの部分配列ＡＡＰＡ、および（ｉｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が挙げられる。そのようなアミノ酸配列（Ｐ／Ａ）の具体例は、実施例および／または図３に説明されており、対応するＰ／Ａペプチドまたはコンジュゲートを通して例示されている。
好ましいアミノ酸配列（Ｐ／Ａ）のさらなる例としては、（ｉ）配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（「ＰＡＳ＃１」とも呼ぶ）、もしくは（ｉｉ）配列ＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳＡ（「ＰＡＳ＃２」）、もしくは（ｉｉｉ）配列ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（「ＰＡＳ＃５」）、もしくは（ｉｖ）これらの配列のうちのいずれかの断片、または（ｖ）これらの配列の２つ以上の組合せ（同じであっても異なっていてもよい、すなわち、配列ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２および／またはＰＡＳ＃５の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０）の任意の組合せであってもよい；相応する例は、ＰＡＳ＃１の二量体（「ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１」）、すなわちＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡであり；さらなる例には、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２（すなわちＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳＡ）、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２−ＰＡＳ＃５、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃２、またはＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５−ＰＡＳ＃５が含まれる）を含む（または、より好ましくは、これらからなる）アミノ酸配列が挙げられる。
（Ｐ／Ａ）を構成するアミノ酸残基は、いずれの配置を有していてもよい。特に、（Ｐ／Ａ）に含まれる各α−アミノ酸残基は、Ｌ配置を有していても、Ｄ配置を有していてもよい。したがって、（Ｐ／Ａ）中のいずれのプロリン残基についても、Ｌ−プロリンの形態でもＤ−プロリンの形態でもよく、（Ｐ／Ａ）中のいずれのアラニン残基についても、Ｌ−アラニンの形態でもＤ−アラニンの形態でもよい。当然のことながら、すべてのアミノ酸が明確なＬ配置およびＤ配置を有しているわけではなく、特に、グリシン残基は１つの配置のみを有する。（Ｐ／Ａ）に含まれ、Ｌ配置またはＤ配置を有することができるα−アミノ酸残基の中で、前記α−アミノ酸残基の数の、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、さらにより一層好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％がＬ配置で存在する。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれるＮ末端の保護基ＲＮ
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ中のＲＮ基は、存在しないか、またはアミノ酸配列（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基、特にＮ末端α−アミノ基に付着している保護基である。当然のことながら、ＲＮが存在しない場合、対応するＰ／Ａペプチドは、ペプチド（Ｐ／Ａ）−ＲＣである。
ＲＮは、ホルミル（すなわち、−ＣＨＯ）、−ＣＯ（Ｃ１〜６アルキル）、ピログルタモイル（すなわち、５−オキソピロリジン−２−イル−カルボニル）、およびホモピログルタモイル（すなわち、６−オキソピペリジン−２−イル−カルボニル）から選択され、前記−ＣＯ（Ｃ１〜６アルキル）に含まれるアルキル部分は、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜４アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）（Ｃ１〜４アルキル）および−ＣＯＯＨから独立に選択される１つまたは複数の基（例えば、１つ、２つまたは３つの基）で任意選択により置換されているか、またはＲＮは存在しないのが好ましい。より好ましくは、ＲＮは、ホルミル、−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）、ピログルタモイルおよびホモピログルタモイルから選択され、前記−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）に含まれるアルキル部分は、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜４アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）（Ｃ１〜４アルキル）および−ＣＯＯＨから独立に選択される１つまたは２つの基で任意選択により置換されているか、またはＲＮは存在しない。より一層好ましくは、ＲＮは、ホルミル、アセチル、ヒドロキシアセチル、メトキシアセチル、エトキシアセチル、プロポキシアセチル、マロニル（すなわち、−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、プロピオニル、２−ヒドロキシプロピオニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−メトキシプロピオニル、３−メトキシプロピオニル、２−エトキシプロピオニル、３−エトキシプロピオニル、スクシニル（すなわち、−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ、またはシクロスクシニル、すなわち−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−）、ブチリル、２−ヒドロキシブチリル、３−ヒドロキシブチリル、４−ヒドロキシブチリル、２−メトキシブチリル、３−メトキシブチリル、４−メトキシブチリル、グリシンベタイニル（すなわち、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｎ＋（−ＣＨ３）３）、グルタリル（すなわち、−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、ピログルタモイル、およびホモピログルタモイルから選択されるか、またはＲＮは存在しない。ＲＮは、アセチルおよびピログルタモイルから選択されるのが特に好ましく、ピログルタモイルは特に好ましいＲＮ基である。
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣに含まれるＣ末端アミノ酸残基ＲＣ
ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ中のＲＣ基は、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基である。
当然のことながら、ＲＣのアミノ基とカルボキシ基との間の少なくとも２個の炭素原子は、ＲＣのアミノ基とカルボキシ基との間に少なくとも炭素原子２個分の距離を設けることができ（例えば、ＲＣがε−アミノヘキサン酸などのω−アミノ−Ｃ３〜１５アルカン酸である場合に当てはまる）、またはＲＣのアミノ基とカルボキシ基との間に炭素原子１個分のみの距離を設けることができる（例えば、ＲＣがアラニンである場合に当てはまる）。
好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨであり、任意選択により、前記Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨに含まれるヒドロカルビル部分中の１つまたは複数の−ＣＨ２−単位はそれぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）−から独立に選択される基で置換されており、さらに、任意選択により、前記Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨに含まれるヒドロカルビル部分中の１つまたは複数の＝ＣＨ−単位（存在する場合）はそれぞれ、＝Ｎ−で置換されている。前記Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨに含まれるヒドロカルビル部分は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、またはこれらの任意の組合せ（例えば、アルカリールまたはアラルキル、例えば、ベンジル、フェネチルまたはメチルフェニルなど）とすることができる。さらに、前記ヒドロカルビル部分は、好ましくは３個〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくは４個〜８個の炭素原子を有する。上記の環式ヒドロカルビル基（前記アリールまたは前記シクロアルキルなどであり、後続の段落で述べられるＨ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−フェニル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨに含まれるフェニルなど、以下で述べられる特定の環式基のいずれかも含む）上の２つの付着部位は、同一の環炭素原子上にも、隣接する環炭素原子上にもないのがさらに好ましい。そのような環式基が６個の環原子を有する（フェニルまたはシクロヘキシルのように）場合、１，４位−付着（パラ）または１，３位−付着（メタ）が好ましく、１，４位−付着が特に好ましい。さらに、前記Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨに含まれるヒドロカルビル部分中の−ＣＨ２−単位も＝ＣＨ−単位（存在する場合）も、上記のヘテロ基で置換されていない（すなわち、−ＣＨ２−単位は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）−で置換されておらず、＝ＣＨ−単位は、存在する場合、＝Ｎ−で置換されていない）のが好ましい。したがって、ＲＣは、より好ましくはＨ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨである。
より一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２アルキル）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−フェニル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−（Ｃ３〜８シクロアルキル）−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨから選択される。より一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（Ｃ１〜１１アルキル）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ１〜１１アルキル）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−フェニル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−（Ｃ３〜８シクロアルキル）−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨから選択される。より一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｃ１〜１０アルキル）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ１〜１０アルキル）−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−フェニル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−（Ｃ３〜８シクロアルキル）−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨから選択される。さらにより一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２〜１２−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−フェニル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）０〜２−シクロヘキシル−（ＣＨ２）０〜２−ＣＯＯＨから選択される。さらにより一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３〜１０−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−フェニル−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−シクロヘキシル−ＣＯＯＨから選択される。
より一層好ましくは、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）８−ＣＯＯＨ、
から選択される。したがって、ＲＣは、δ−アミノ吉草酸、ε−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、パラ−アミノ安息香酸、およびパラ−アミノシクロヘキサンカルボン酸（すなわち、４−アミノシクロヘキサンカルボン酸）から選択されるのが特に好ましい。
添付の実施例にも示しているように、特に前述の好ましいＲＣ残基のいずれかを含む、本明細書に定義しているＣ末端アミノ酸残基ＲＣを使用すると、驚くべきことに、タンパク質薬物の分子当たりのＰ／Ａペプチドのカップリング比が有利に高く、このため、免疫原性が有利に低く、血漿中半減期が有利に向上したコンジュゲートが得られることが発見された。
ＲＣとして、天然アミノ酸（そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含む）、特に、アラニンまたはプロリンなどの標準タンパク質原性のα−アミノ酸を使用すると、そのようなアミノ酸が安全で忍容性が高いと考えられるため、有利でもあり得る。したがって、ＲＣは、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含む、標準タンパク質原性のα−アミノ酸、特に、アラニンまたはプロリンとすることもできる。
したがって、ＲＣは、例えば、アラニン（例えば、Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）、プロリン（例えば、Ｌ−プロリン）、β−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）、ε−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸（Ａｏａ）、９−アミノノナン酸、パラ−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）、パラ−アミノシクロヘキサンカルボン酸（ＡＣＨＡ、例えば、ｃｉｓ−ＡＣＨＡまたはｔｒａｎｓ−ＡＣＨＡ）、およびパラ−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（ＡＭＣＨＡ、例えばｃｉｓ−ＡＭＣＨＡまたはｔｒａｎｓ−ＡＭＣＨＡ）から選択することもできる。
Ｐ／Ａペプチドのタンパク質薬物へのコンジュゲート
本発明によるコンジュゲートにおいて、各Ｐ／Ａペプチド、すなわち、各ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣは、Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基とタンパク質薬物の遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して、タンパク質薬物にコンジュゲートしている。タンパク質薬物の遊離アミノ基は、例えば、タンパク質薬物のＮ末端α−アミノ基または側鎖アミノ基（例えば、タンパク質薬物に含まれるリシン残基のε−アミノ基）とすることができる。タンパク質薬物が複数のサブユニットから構成されている場合、複数のＮ末端α−アミノ基（すなわち、各サブユニットに１個）が存在してもよい。
本発明によれば、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、タンパク質薬物のＮ末端α−アミノ基ではない（すなわち、それとは異なる）。したがって、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、タンパク質薬物の側鎖アミノ基であるのが好ましく、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、タンパク質薬物のリシン残基のε−アミノ基であるのが特に好ましい。
さらに、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基は、タンパク質薬物の任意のリシン残基のε−アミノ基、タンパク質薬物またはタンパク質薬物の任意のサブユニットのＮ末端α−アミノ基、およびそれらの任意の組合せから選択されるのが好ましい。Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち１個は、タンパク質薬物のＮ末端α−アミノ基であり、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基のうち、それ以外は、それぞれ、タンパク質薬物のリシン残基のε−アミノ基であるのが特に好ましい。代替としては、Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている遊離アミノ基の各々が、タンパク質薬物のリシン残基のε−アミノ基であるのが好ましい。
本発明によるコンジュゲートは、１つのタンパク質薬物（すなわち、１つのタンパク質薬物分子）と、２つ以上のＰ／Ａペプチドから構成される。対応するコンジュゲートは、例えば、１つのタンパク質薬物（すなわち、１つのタンパク質薬物分子）と、タンパク質薬物にそれぞれコンジュゲートしている、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの（もしくはそれより多い）Ｐ／Ａペプチドからなるものであってもよい。一般に、タンパク質薬物のアミノ酸残基の数が多いほど、対応するタンパク質薬物にコンジュゲートするべきＰ／Ａペプチドが多くなり、さらには、Ｐ／Ａペプチドの（Ｐ／Ａ）部分のアミノ酸残基の数が少ないほど、それぞれのタンパク質薬物にコンジュゲートするべきＰ／Ａペプチドが多くなる。
コンジュゲートは、タンパク質薬物（すなわち、１つまたは複数のサブユニットからなっていてもよいタンパク質薬物分子）とＰ／Ａペプチドとから、ある一定の比で構成されるのが好ましい。好ましくは、比ｍ（Ｐ／Ａペプチド）／ｍ（タンパク質薬物）［ｍ（Ｐ／Ａペプチド）は、コンジュゲートに含まれる全Ｐ／Ａペプチドの（Ｐ／Ａ）部分中のアミノ酸残基を合わせた総数であり、ｍ（タンパク質薬物）は、コンジュゲートに含まれるタンパク質薬物中のアミノ酸残基の総数である］は、０．１〜５０の値を取る。より好ましくは、比ｍ（Ｐ／Ａペプチド）／ｍ（タンパク質薬物）は、０．２〜１０の値を取る。より一層好ましくは、比ｍ（Ｐ／Ａペプチド）／ｍ（タンパク質薬物）は、０．５〜５の値を取る（すなわち、前記比が０．５〜５の間である、例えば、前記比は、０．５、０．７、１、２、３、４または５であってもよい）。
タンパク質薬物
本発明のコンジュゲートに含まれるタンパク質薬物は、治療的／薬理学的に活性な任意のタンパク質、すなわち、医薬品として使用するのに適切な、任意のタンパク質とすることができる。「タンパク質薬物」という用語は、本明細書では、「治療用タンパク質」および「治療用タンパク質薬物」と同義で使用される。
好ましくは、タンパク質薬物は、約２ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有し、より好ましくは、サブユニット当たり約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有する。
タンパク質薬物の分子量は、本明細書ではダルトン（Ｄａ）で示され、これは統一原子質量単位（ｕ）の代替名である。したがって、例えば、５００Ｄａの分子量は、５００ｇ／ｍｏｌに等しい。「ｋＤａ」（キロダルトン）という用語は、１０００Ｄａのことを指す。
タンパク質薬物の分子量は、当技術分野において公知の方法、例えば、質量分析法（例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、ＥＳＩ−ＭＳ、またはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、ゲル電気泳動法（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを使用するポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、流体力学法（例えば、ゲル濾過／サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ、または勾配沈降法）、または動的光散乱法（ＤＬＳ）もしくは静的光散乱法（例えば、多角度光散乱法、ＭＡＬＳ）などを使用して決定することができ、あるいは、タンパク質薬物の分子量は、タンパク質薬物の既知のアミノ酸配列（および存在すれば、既知の翻訳後修飾）から計算することができる。好ましくは、タンパク質薬物の分子量は、質量分析法を使用して決定される。
タンパク質薬物は、酵素、特に、上記で定義したとおりの分子量を有する酵素であるのが好ましい。より好ましくは、タンパク質薬物は、尿酸オキシダーゼ（または尿酸ヒドロキシラーゼもしくはウリカーゼ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、Ｌ−フェニルアラニン分解酵素（例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼなど）、抗酸化酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼなど）、ロダネーゼ、有機ホスフェート分解酵素（例えば、ホスホトリエステラーゼ（アリールジアルキルホスファターゼもしくは有機リンヒドロラーゼ）または有機リンアンヒドロラーゼなど）、アルコール酸化酵素（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールオキシダーゼなど）、アセトアルデヒド分解酵素（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼなど）、Ｌ−グルタミン分解酵素（例えば、グルタミナーゼなど）、Ｌ−アルギニン分解酵素（例えば、アルギナーゼまたはアルギニンデイミナーゼなど）、プラスミノーゲン活性化酵素（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（例えばレテプラーゼ）、ストレプトキナーゼ、またはウロキナーゼなど）、フィブリノーゲン溶解酵素（例えば、アンクロドまたはバトロキソビンなど）、シスタチオニン−β−シンターゼ、ホモシステインチオラクトン（ＨＴＬ）分解酵素（例えば、パラオキソナーゼ１、ブレオマイシンヒドロラーゼ、ヒト血清ＨＴアーゼ、またはヒトビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質など）、メチオニン分解酵素（例えば、メチオニナーゼまたは改変シスタチオニン−γ−リアーゼなど）、ホモシステイン分解酵素、システイン分解酵素、シスチン分解酵素、ヒアルロニダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、グルコセレブロシダーゼ（例えば、イミグルセラーゼなど）、Ｐ／Ａペプチドに対する活性のない広域スペクトルプロテアーゼ（例えば、アナナイン、コモサイン、またはオクリプラスミンなど）、アセチルコリン分解酵素（例えば、ブチリルコリンエステラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼなど）、コカイン分解酵素（例えば、コカインエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなど）、コンドロイチナーゼ、コラゲナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（またはα−Ｌ−イズロノヒドロラーゼ（α-L-iduronohydrolase）もしくはラロニダーゼ）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（またはヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ＤＮアーゼ（例えば、ドルナーゼαなど）、オキサレート分解酵素（例えば、オキサレートデカルボキシラーゼなど）、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（またはヘパランＮ−スルファターゼ）、アセチルＣｏＡα−グルコサニミドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−α−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、凝固第ＩＸ因子、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＶＩＩａ因子、凝固第Ｘａ因子、凝固第ＩＶ因子、凝固第ＸＩＩＩ因子、補体経路のタンパク質に特異性のあるプロテアーゼ（例えば、因子Ｃ３特異性について改変された型の膜タイプセリンプロテアーゼ１など）、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に特異性のあるプロテアーゼ（例えば、改変された型の膜タイプセリンプロテアーゼ１など）、ヒトアンジオテンシン変換酵素２、ＲＮアーゼ（例えば、オンコナーゼ（onconase）、ランピルナーゼ、ウシ精液ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＴ１、α−サルシン、ＲＮアーゼＰ、アクチビンド（actibind）、またはＲＮアーゼＴ２など）、アルカリホスファターゼ（例えば、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼまたはアスホターゼアルファなど）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アスパルトアシラーゼ、α−マンノシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１、グランザイムＢ、エンドリシンおよびエクトリシン（ectolysin）を含む溶菌素（例えば、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、Ｌ−アラノイル−Ｄ−グルタメートエンドペプチダーゼ、システイン／ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ、リソスタフィン、ファージ尾部関連壁溶解酵素（tail-associated muralytic enzyme）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のファージ−Ｋ由来の尾部関連壁溶解酵素（ＴＡＭＥ）触媒ドメイン（Ｌｙｓ１６）とリソスタフィンの細胞−壁−結合ＳＨ３ｂドメインとからなる融合タンパク質など）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ−１、エンド−β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２など）、免疫グロブリン分解酵素（例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）のＩｄｅＳまたは淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＩｇＡプロテアーゼなど）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アリールスルファターゼＡ、サイクリン依存性キナーゼ様５タンパク質、グリアジンペプチダーゼ、キヌレニン−分解酵素（例えば、キヌレニナーゼなど）、ミオチューブラリン、および触媒抗体またはその機能性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２またはｓｃＦｖ）から選択される。タンパク質薬物は、ウリカーゼまたはアデノシンデアミナーゼであるのが特に好ましい。さらに、タンパク質薬物は、Ｌ−アスパラギナーゼではない（すなわち、タンパク質薬物はＬ−アスパラギナーゼとは異なる）のが好ましい。
治療適用
本発明はまた、本発明のコンジュゲート（すなわち、タンパク質薬物と２つ以上のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲート）および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物も提供する。加えて、本発明はさらに、医薬品として使用するための前記コンジュゲートまたは前記医薬組成物に関する。
本発明のコンジュゲート、または前記コンジュゲートおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、特に、対応するタンパク質薬物（コンジュゲートに含まれる）それ自体が適切であると知られている、またはそのように提案されている治療適用、すなわち疾患／障害の処置または予防に使用することができる。例えば、本発明のコンジュゲートに含まれるタンパク質薬物が、とりわけ高尿酸値症の処置または予防に有効であると知られている尿酸オキシダーゼである場合、このコンジュゲート（尿酸オキシダーゼをタンパク質薬物として含む）を、例えば、高尿酸値症の処置または予防に使用することができる。
様々な代表的タンパク質薬物およびその各治療適応症を以下の表にまとめている。これらのタンパク質薬物の各々の、表中のおよび／またはさらなる治療適用を記載している参考文献も示している。本発明は、特に、コンジュゲート中のタンパク質薬物が、この表で各薬物について示されている対応する疾患／障害のうちいずれか（またはその薬物についての各参考文献に開示されているいずれかの疾患／障害）の処置または予防に使用するための、下の表に示されているタンパク質薬物のうちいずれか１つである、本発明のコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。本発明はまた、対応する疾患／障害のうちいずれかを処置または予防するための医薬品を調製するための対応するコンジュゲートの使用にも関する。同様に、本発明は、下の表に挙げられている（または引用した参考文献のいずれかに開示されている）疾患／障害のうちいずれか１つを処置または予防する方法であって、コンジュゲート中のタンパク質薬物が下の表の対応する行に示されているとおりである、本発明のコンジュゲートまたは医薬組成物を、それを必要とする対象／患者（例えば、ヒトまたは動物）に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明によるコンジュゲートは、それ自体が投与されてもよく、または医薬品／医薬組成物として製剤化されてもよい。医薬品／医薬組成物には、任意選択により、１種または複数種の薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、賦形剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、顔料、安定化剤、保存剤、および／または抗酸化剤などを含めてもよい。
医薬組成物は、当業者に公知の技術、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Pharmaceutical Press, 22ndeditionに公表されている技術によって製剤化することができる。医薬組成物は、経口投与、非経口投与、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、動脈内、心臓内、直腸、鼻内、局所、エアゾールまたは腟内の各投与のための剤形として製剤化することができる。経口投与用の剤形としては、コーティング錠剤および非コーティング錠剤、軟ゼラチンカプセル剤、硬ゼラチンカプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、再構成用の散剤および顆粒剤、分散性の散剤および顆粒剤、薬用ガム、咀嚼錠剤ならびに発泡性錠剤が挙げられる。非経口投与用の剤形としては、溶液剤、乳剤、懸濁剤、分散剤ならびに再構成用の散剤および顆粒剤が挙げられる。乳剤は、非経口投与に好ましい剤形である。直腸投与および腟内投与用の剤形としては、坐剤および腟坐剤が挙げられる。鼻内投与用の剤形は、吸入および通気を介して、例えば定量吸入器によって投与することができる。局所投与用の剤形としては、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤（ointments）、蝋膏剤（salves）、貼付剤および経皮送達システムが挙げられる。
本発明のコンジュゲート、または本発明のコンジュゲートを含む上記の医薬組成物は、全身的／末梢的にせよ、所望の作用部位にせよ、以下のうち１つまたは複数を含むが、これらに限定されない任意の好都合な投与経路によって、対象に投与することができる。経口投与（例えば、錠剤、カプセル剤として、または摂取可能な溶液剤として）、局所投与（例えば、経皮、鼻腔内、経眼、頬側および舌下）、非経口投与（例えば、注射技術または輸注技術を使用して、および例えば注射によって、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、鞘内、髄腔内、関節包内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下または胸骨内を含み、例えば、デポー剤のインプラントによって、例えば、皮下または筋肉内を含む）、経肺投与（例えばエアゾール剤を使用し、例えば、口または鼻を通しての吸入または通気治療による）、胃腸投与、子宮内投与、眼内投与、皮下投与、眼部投与（硝子体内または前房内を含む）、直腸投与、または腟内投与。
前記コンジュゲートまたは医薬組成物が非経口的に投与される場合、そのような投与の例として、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、鞘内に、脳室内に、尿道内に、胸骨内に、心臓内に、頭蓋内に、筋肉内にもしくは皮下に、および／または輸注技術の使用によって、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することのうち１つまたは複数が挙げられる。非経口投与の場合、コンジュゲートは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするために十分な塩またはブドウ糖を含有していてもよい滅菌水性溶液の形態で使用するのが最良である。水性溶液は、必要であれば適切に緩衝（好ましくはｐＨ３〜９に）されるべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術で容易に実現される。
前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出または制御放出で適用するための、香味剤または着色剤を含有していてもよい、錠剤、カプセル剤、卵形剤（ovule）、エリキシル剤、溶液剤または懸濁剤の形態で、経口投与することもできる。
錠剤は、微結晶セルロース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシンなどの添加剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカの各デンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび一定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴムなどの造粒結合剤を含有していてもよい。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリンおよびタルクなどの滑沢剤が含まれていてもよい。類似の種類の固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中に充填剤として使用されてもよい。その際に、好ましい添加剤には、乳糖、デンプン、セルロース、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤については、コンジュゲートは、種々の甘味剤または香味剤と、着色料または染料と、乳化剤および／または懸濁化剤と、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの賦形剤と、ならびにこれらの組合せと組み合わされてもよい。
代替として、前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、坐剤または腟坐剤の形態で投与することができ、またはゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤または散粉剤の形態で局所的に適用することができる。本発明のコンジュゲートはまた、例えば皮膚貼付剤の使用によって、皮膚にまたは経皮的に投与することもできる。
前記コンジュゲートまたは医薬組成物はまた、持続放出システムによって投与することもできる。持続放出組成物の適切な例としては、形状のあるものの形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、例えば、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、エチレン酢酸ビニルまたはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。持続放出医薬組成物にはまた、リポソームに封入されたコンジュゲート、すなわち、本発明のコンジュゲートを含有するリポソームも含まれる。
前記コンジュゲートまたは医薬組成物はまた、経肺経路、直腸経路、または経眼経路によって投与することもできる。眼部に使用するために、前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、等張の、ｐＨ調整した、滅菌の生理食塩水中の微粒子化した懸濁剤として、または好ましくは、等張の、ｐＨ調整した、滅菌の生理食塩水中溶液剤として、任意選択により塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と組み合わせて製剤化することができる。代替として、ワセリンなどの軟膏剤に製剤化してもよい。
経肺投与、特に吸入用として、本発明によるコンジュゲートの乾燥粉末製剤を調製することも想定される。そのような乾燥粉末は、実質的に非晶質ガラス状の、または実質的に結晶質の、生理活性のある粉末をもたらす条件下で噴霧乾燥することによって調製することができる。本発明のコンジュゲートの溶液製剤の噴霧乾燥は、例えば、一般に、"Spray Drying Handbook", 5th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY (1991)、または噴霧乾燥に関する他のテキストもしくは科学文献に記載されているように行うことができる。
皮膚に局所適用するために、前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、例えば、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、乳化ワックスおよび水のうち１種または複数種との混合物中に懸濁または溶解させた活性化合物を含有する、適切な軟膏剤として製剤化することができる。代替として、前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水のうち１種または複数種の混合物中に懸濁または溶解させた、適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる。
したがって、本発明は、本明細書において提供されるコンジュゲートまたは医薬組成物に関し、対応するコンジュゲートまたは医薬組成物は、経口経路；経皮、鼻腔内、経眼、頬側、または舌下の各経路を含む局所経路；皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、鞘内、髄腔内、関節包内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、胸骨内、脳室内、尿道内、または頭蓋内の各経路によるものを含む、注射技術または輸注技術を使用する非経口経路；吸入または通気治療によるものを含む経肺経路；胃腸経路；子宮内経路；眼内経路；皮下経路；硝子体内経路または前房内経路によるものを含む眼部経路；直腸経路；または腟内経路のうちいずれか１つによって投与される。特に好ましい投与経路は非経口投与（例えば皮下投与）である。
通常は、医師が、個々の対象に最適となる実際の投与量を決定することになる。任意の特定の個々の対象に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は多様である可能性があり、使用される特定のコンジュゲートの活性、そのコンジュゲートの代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与方式および投与時間、排泄速度、薬物の併用、特定の状態の重症度、および治療を受ける個々の対象を含む種々の要因に依存することになる。
本発明によるコンジュゲートのヒト（およそ７０ｋｇの体重）への皮下投与のための、提案されるが非限定的な用量は、単位用量当たりの活性成分が０．０５〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇとすることができる。単位用量は、例えば、月に１〜８回投与することができる。単位用量はまた、月に１〜４回、例えば、週に１回以下で投与することもできる。当然のことながら、患者／対象の年齢および体重ならびに処置を受ける状態の重症度に応じて、投与量に対し、ルーチンに変動性をもたせることが必要な場合がある。正確な用量および投与経路もまた、最終的には担当医師または獣医師の裁量によることになる。
本発明によるコンジュゲート、または前記コンジュゲートを含む医薬組成物は、単剤治療（例えば、さらなる治療剤を併用投与しない、またはそれぞれのコンジュゲートで処置または予防されることになる同じ疾患に対してさらなる治療剤を併用投与しない）で投与することができる。しかしながら、本発明のコンジュゲート、または前記コンジュゲートを含む医薬組成物はまた、１種または複数種のさらなる治療剤と併用して投与することもできる。本発明のコンジュゲートが、同じ疾患または状態に対して活性な第２の治療剤との併用で使用される場合、各薬剤の用量は、対応する薬剤が単独で使用される場合の用量とは異なってもよく、特に、各薬剤の用量を下げて使用することができる。本発明のコンジュゲートと１種または複数種のさらなる治療剤との併用には、コンジュゲートとさらなる治療剤との同時の／相伴う投与（単一医薬製剤で、または別個の医薬製剤で）、またはコンジュゲートとさらなる治療剤との逐次の／別々での投与を含めてもよい。投与が逐次の場合、本発明によるコンジュゲートまたは１種もしくは複数種のさらなる治療剤のいずれかが最初に投与されてもよい。投与が同時の場合、１種または複数種のさらなる治療剤は、コンジュゲートと同じ医薬製剤に含まれていてもよく、１つまたは複数の異なる（別個の）医薬製剤で投与されてもよい。
本発明に従って処置される対象または患者は、動物（例えば非ヒト動物）、脊椎動物、哺乳動物、齧歯動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、またはマウス）、ウシ科の動物（例えばウシ）、イヌ科の動物（例えばイヌ）、ネコ科の動物（例えばネコ）、ブタ類の動物（porcine）（例えばブタ（pig））、ウマ科の動物（例えばウマ）、霊長目または真猿亜目の動物（例えば、長尾小型のサル（monkey）または短尾大型のサル（ape）、例えば、マーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、またはテナガザルなど）、またはヒトとすることができる。本発明によれば、経済学的、農学的または科学的に重要である動物が処置対象となることが想定される。科学的に重要な生物には、以下に限定されないが、マウス、ラットおよびウサギが含まれる。農学的に重要な動物の非限定的な例には、ヒツジ、ウシおよびブタがあり、一方、例えば、ネコおよびイヌは、一般に愛玩動物のように経済学的に重要な動物と考えることができる。好ましくは、対象／患者は哺乳動物である。より好ましくは、対象／患者は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、長尾小型のサル、短尾大型のサル、マーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル、ヒツジ、ウシ、またはブタなど）である。最も好ましくは、対象／患者はヒトである。
コンジュゲートの調製
本発明によるコンジュゲートは、当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。特に、以下に記載されているプロセスを使用して、かつ／または実施例に記載されている手順に従って、もしくはそれと同様にして調製することができる。
したがって、本発明はまた、本発明によるコンジュゲートを調製するプロセスであって、次のステップ：
（ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔ
［式中、ＲＣ−ａｃｔは、ＲＣのカルボキシ活性化形態であり、
ＲＣおよび（Ｐ／Ａ）は、調製されるコンジュゲートにおいて定義されるとおりであり、かつ
ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基である］
の活性化Ｐ／Ａペプチドを、タンパク質薬物とカップリングして、タンパク質薬物と、ＲＮが保護基であるＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ、および
（ｂ）任意選択により、ステップ（ａ）において得られたコンジュゲートに含有されているＰ／Ａペプチドから保護基ＲＮを除去して、タンパク質薬物と、ＲＮが存在しないＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ、
を含む、プロセスも提供する。
活性化Ｐ／Ａペプチドに含まれるカルボキシ活性化したＣ末端アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔは、Ｐ／Ａペプチドに関して本明細書に記載され、定義されているとおりのいずれのアミノ酸残基ＲＣでもよく、この場合、ＲＣのカルボキシ基は、活性化カルボキシ基の形態である。
一連の様々な活性化カルボキシ基は当技術分野において公知であり、例えば、El-Faham et al., 2011; Montalbetti et al., 2005; Klose et al., 1999; Valeur et al., 2007; Carpino et al., 1995; Valeur et al., 2009;またはHermanson, 2013に記載されている。活性化Ｐ／Ａペプチドの活性化カルボキシ基は、例えば、上記の参考文献のうちいずれか１つに記載されている活性化カルボキシ基のうちいずれかから選択することができる。
特に、活性化Ｐ／Ａペプチド中のアミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、例えば、活性エステル基、無水物基、またはハロゲン化アシル基とすることができる。
ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基が活性エステル基である場合、それは、好ましくは次の活性エステル基：
のうちいずれか１つから選択される。
特に好ましい活性エステル基は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステル基である。したがって、ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は次式：
の基であるのが特に好ましい。
ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基はまた、無水物基であってもよい。そのような無水物基の好ましい例としては、特に、プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）基（下に示したとおり）または混合炭酸無水物基が挙げられる。
混合炭酸無水物基は、例えば、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ１〜６アルキル）基とすることができる。対応する好ましい例を以下に示す。
ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基がハロゲン化アシル基である場合、それは好ましくは塩化アシル（すなわち−ＣＯ−Ｃｌ基）またはフッ化アシル（すなわち−ＣＯ−Ｆ基）である。
本プロセスは、ステップ（ａ）の前に、式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ［式中、ＲＣおよび（Ｐ／Ａ）は、調製されるコンジュゲートにおいて定義されるとおりであり、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基である］のＰ／Ａペプチドを活性化Ｐ／Ａペプチドに変換するさらなるステップを追加として含んでもよい。
例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル基をＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基として有する活性化Ｐ／Ａペプチドを得るために、Ｐ／Ａペプチドを活性化Ｐ／Ａペプチドに変換するステップは、塩基の存在下で、Ｐ／Ａペプチドを、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）のホスホニウム、ウロニウムまたはインモニウムエステルの塩と反応させることによって行うことができる。ＨＯＢｔのホスホニウム、ウロニウムまたはインモニウム誘導体の塩は、好ましくは、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルジエチルホスフェート（ＢＤＰ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ベンゾトリアゾールオキシ−ビス（ピロリジノ）カルボニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＣＣ）、２−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＤＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモネート（ＢＯＭＩ）、および５−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−３，４−ジヒドロ−１−メチル−２Ｈ−ピロリウムヘキサクロロアンチモネート（ＢＤＭＰ）から選択され、より好ましくはＴＢＴＵである。
カップリングステップ（ａ）および先行する任意選択の、Ｐ／Ａペプチドを活性化Ｐ／Ａペプチドに変換するステップは、例えば、文献、例えば、El-Faham et al., 2011; Montalbetti et al., 2005; Klose et al., 1999; Valeur et al., 2007; Carpino et al., 1995; Valeur et al., 2009;またはHermanson, 2013のうちいずれかに記載されているペプチドカップリングまたはアミド結合形成手順のいずれかを使用して行うことができる。そのような手順に適切な試薬および反応条件は、上記の文献およびその中に引用されているさらなる参考文献に、さらに記載されている。
任意選択のステップ（ｂ）において必要となる保護基ＲＮを除去する手順は、当技術分野において周知であり、例えば、Wuts et al., 2012および／またはIsidro-Llobet et al., 2009に記載されている。したがって、任意選択のステップ（ｂ）は、例えば、上記の参考文献のうちいずれかの中で、対応する保護基ＲＮについて記載されているように行うことができる。
活性化Ｐ／Ａペプチド
本発明はまた、式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化Ｐ／Ａペプチドであって、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基であり、（Ｐ／Ａ）は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、ＲＣ−ａｃｔは、活性化カルボキシ基を有し、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とその活性化カルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基である、活性化Ｐ／Ａペプチドにも関する。
したがって、この活性化Ｐ／Ａペプチドは、本明細書に記載され、定義されているＰ／Ａペプチドに対応し、これをタンパク質薬物とカップリングして本発明によるコンジュゲートを得ることができるが、異なる点は、この活性化Ｐ／Ａペプチドが、そのＣ末端アミノ酸残基（ＲＣ−ａｃｔ）に活性化カルボキシ基を有することである。したがって、式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化Ｐ／Ａペプチドに含まれるＲＮ基および（Ｐ／Ａ）基は、本発明のコンジュゲートに関して本明細書に記載されているＰ／Ａペプチドに含まれる、対応するＲＮ基および（Ｐ／Ａ）基と同じ意味（同じ好ましい意味を含む）を有する。
同様に、活性化Ｐ／Ａペプチドに含まれるＲＣ−ａｃｔ基は、本発明のコンジュゲートに関して本明細書に記載されているＰ／Ａペプチドに含まれる、対応するＲＣ基と同じ意味（同じ好ましい意味を含む）を有するが、異なる点は、ＲＣ−ａｃｔは、ＲＣのカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）の代わりに活性化カルボキシ基を有することである。活性化Ｐ／Ａペプチドに含まれるＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、本発明によるコンジュゲートを調製するプロセスに関して本明細書で上に記載されている活性化カルボキシ基と同じである（例えば、活性エステル基、無水物基、またはハロゲン化アシル基であり、本明細書の上記の対応する好ましい基のうちいずれかを含む）。
本明細書において提供される式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化Ｐ／Ａペプチドは、本発明によるコンジュゲートの調製（特に、そのようなコンジュゲートを調製する上記のプロセスを含む）における合成中間体または前駆体として使用することができる。活性化Ｐ／Ａペプチドは、例えば、容器中に保管してもよい有機溶媒または水性媒体中に供給することができる。好ましくは、活性化Ｐ／Ａペプチドは無水有機溶媒（例えば、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）中に保管される。
定義
次の定義は、特に他の意味が指定されない限り、本明細書の全体で適用される。
「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシ基との間に形成されるアミド結合を介して連結されている２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸は、アミノ酸残基とも呼ばれ、これは、２０種の標準タンパク質原性のα−アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）から選択することができるが、非タンパク質原性のおよび／または非標準のα−アミノ酸（例えば、オルニチン、シトルリン、ホモリシン、ピロリシン、４−ヒドロキシプロリン、α−メチルアラニン（すなわち、２−アミノイソ酪酸）、ノルバリン、ノルロイシン、テルロイシン（ｔｅｒｔ−ロイシン）、ラビオニン、または側鎖の位置で環式基（例えば、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基）で置換されているアラニンまたはグリシン、例えば、シクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、またはフェニルグリシンなど）ならびにβ−アミノ酸（例えば、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例えば、γ−アミノ酪酸、イソグルタミン、またはスタチン）およびδ−アミノ酸からも選択することができる。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸残基は、α−アミノ酸から選択され、より好ましくは２０種の標準タンパク質原性のα−アミノ酸（Ｌ−異性体またはＤ−異性体として存在することができ、好ましくは全部がＬ−異性体として存在する）から選択される。ペプチドまたはタンパク質は、無修飾でもよく、または例えば、そのＮ末端で、そのＣ末端で、および／またはそのアミノ酸残基のうちいずれかの側鎖中の官能基で（特に、１個または複数個のＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、および／またはＡｒｇの各残基の側鎖官能基で）修飾されていてもよい。そのような修飾には、例えば、Wuts PGM, Greene's protective groups in organic synthesis, 5thedition, John Wiley & Sons, 2014の中で、対応する官能基について記載されている保護基のうちいずれかの付着を含めてもよい。そのような修飾にはまた、例えば、１つまたは複数の脂肪酸でのグリコシル化および／またはアシル化（例えば、１つまたは複数のＣ８〜３０アルカン酸またはアルケン酸で、脂肪酸アシル化されたペプチドまたはタンパク質を形成）を含めることもできる。ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸残基は、例えば、直鎖状分子鎖（直鎖状のペプチドまたはタンパク質を形成）として存在してもよく、１つもしくは複数の環（環式のペプチドまたはタンパク質に相当）または分枝構造を形成してもよい。ペプチドまたはタンパク質はまた、２つ以上の同一のまたは異なる分子からなるオリゴマーを形成することもできる。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、特に、２０種の標準タンパク質原性のα−アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ（イミノ酸とも呼ばれる）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ）のうちいずれか１つを指すが、非タンパク質原性のおよび／もしくは非標準のα−アミノ酸（例えば、オルニチン、シトルリン、ホモリシン、ピロリシン、４−ヒドロキシプロリン、α−メチルアラニン（すなわち、２−アミノイソ酪酸）、ノルバリン、ノルロイシン、テルロイシン（ｔｅｒｔ−ロイシン）、ラビオニン、または側鎖の位置で環式基（例えば、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基）で置換されているアラニンまたはグリシン、例えば、シクロペンチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、またはフェニルグリシンなど）、もしくはβ−アミノ酸（例えば、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例えば、γ−アミノ酪酸、イソグルタミン、またはスタチン）もしくはδ−アミノ酸、または少なくとも１つのカルボン酸基および少なくとも１つのアミノ基を含む任意の他の化合物も指す。他に定義されていない限り、「アミノ酸」という用語は、好ましくはα−アミノ酸を指し、より好ましくは、２０種の標準タンパク質原性のα−アミノ酸（Ｌ−異性体またはＤ−異性体の形態とすることができるが、好ましくはＬ−異性体の形態である）のうちいずれか１つを指す。
「炭化水素基」という用語は、炭素原子および水素原子からなる基を指す。
「脂環式」という用語は、環式基に関して使用され、対応する環式基が非芳香族であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「ヒドロカルビル」という用語は、非環式（すなわち、環式でない）でも環式でもよい一価の炭化水素基を指し、または非環式基／サブユニットと環式基／サブユニットとの両方から構成されていてもよい。非環式ヒドロカルビルまたはヒドロカルビルの非環式サブユニットは、直鎖状でも分枝状でもよく、さらに飽和でも不飽和でもよい。環式ヒドロカルビルまたはヒドロカルビルの環式サブユニットは、飽和でも、部分的不飽和（すなわち、不飽和であるが芳香族ではない）でも、芳香族でもよい。「Ｃ２〜１２ヒドロカルビル」は、２個〜１２個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を意味する。代表的なヒドロカルビル基としては、とりわけ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または上記の基のうち２つ以上から構成される複合基（例えば、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルケニル、アルキルアリールアルケニル、アリールアルキル、またはアルキニルアリールなど）が挙げられる。上記にかかわらず、当然のことながら、例えば、Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨ残基の場合のように、ヒドロカルビル基が親部分に付着しており、さらに置換されている場合、この残基中の対応するヒドロカルビル基は、二価と考えることもできる。
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、直鎖状でも分枝状でもよい、一価の飽和非環式（すなわち、環式でない）炭化水素基を指す。したがって、「アルキル」基は、炭素−炭素二重結合も炭素−炭素三重結合も含まない。「Ｃ１〜４アルキル」は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。好ましい代表的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えば、ｎ−プロピルまたはイソプロピル）、またはブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）である。他に定義されていない限り、「アルキル」という用語は、好ましくはＣ１〜４アルキルを指す。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、直鎖状でも分枝状でもよく、１つまたは複数の（例えば、１つまたは２つの）炭素−炭素二重結合を含むが、炭素−炭素三重結合を含まない、一価の不飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ２〜４アルケニル」という用語は、２個〜４個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。好ましい代表的なアルケニル基は、エテニル、プロペニル（例えば、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、またはプロパ−２−エン−１−イル）、ブテニル、またはブタジエニル（例えば、ブタ−１，３−ジエン−１−イルまたはブタ−１，３−ジエン−２−イル）である。他に定義されていない限り、「アルケニル」という用語は、好ましくはＣ２〜４アルケニルを指す。
本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は、直鎖状でも分枝状でもよく、１つまたは複数の（例えば、１つまたは２つの）炭素−炭素三重結合を含み、任意選択により、１つまたは複数の（例えば、１つまたは２つの）炭素−炭素二重結合を含む、一価の不飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ２〜４アルキニル」という用語は、２個〜４個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。好ましい代表的なアルキニル基は、エチニル、プロピニル（例えばプロパルギル）、またはブチニルである。他に定義されていない限り、「アルキニル」という用語は、好ましくはＣ２〜４アルキニルを指す。
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、単環式芳香環、ならびに少なくとも１つの芳香環を含有する架橋環系および／または縮合環系（例えば、２つまたは３つの縮合環から構成され、これらの縮合環のうち少なくとも１つが芳香族である環系；または２つもしくは３つの環から構成される架橋環系であり、これらの架橋環のうち少なくとも１つが芳香族である架橋環系）を含む、芳香族炭化水素環基を指す。「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、ジアリニル（すなわち、１，２−ジヒドロナフチル）、テトラリニル（すなわち、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）、インダニル、インデニル（例えば、１Ｈ−インデニル）、アントラセニル、フェナントレニル、９Ｈ−フルオレニル、またはアズレニルを指すことができる。他に定義されていない限り、「アリール」は、好ましくは６個〜１４個の環原子を有し、より好ましくは６個〜１０個の環原子を有し、より一層好ましくはフェニルまたはナフチルを指し、最も好ましくはフェニルを指す。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、単環式芳香環、ならびに少なくとも１つの芳香環を含有する架橋環系および／または縮合環系（例えば、２つまたは３つの縮合環から構成され、これらの縮合環のうち少なくとも１つが芳香族である環系；または２つもしくは３つの環から構成される架橋環系であり、これらの架橋環のうち少なくとも１つが芳香族である架橋環系）を含む芳香環基であって、前記芳香環基は１個または複数個の（例えば、１個、２個、３個または４個などの）Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１個もしくは複数個のＳ環原子（存在する場合）および／または１個もしくは複数個のＮ環原子（存在する場合）は、任意選択により酸化されていてもよく、さらに１個または複数個の炭素の環原子は、任意選択により酸化されていてもよい（すなわち、オキソ基を形成している）芳香環基を指す。例えば、前記芳香環基に含まれる各ヘテロ原子を含有する環は、１個もしくは２個のＯ原子および／または１個もしくは２個のＳ原子（任意選択により酸化されていてもよい）および／または１個、２個、３個もしくは４個のＮ原子（任意選択により酸化されていてもよい）を含有していてもよいが、但し、対応するヘテロ原子を含有する環のヘテロ原子の総数は１個〜４個であり、対応するヘテロ原子を含有する環に少なくとも１個の炭素の環原子（任意選択により酸化されていてもよい）がある。「ヘテロアリール」は、例えば、チエニル（すなわち、チオフェニル）、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル（すなわち、フラニル）、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル（例えば、２Ｈ−１−ベンゾピラニルまたは４Ｈ−１−ベンゾピラニル）、イソクロメニル（例えば、１Ｈ−２−ベンゾピラニル）、クロモニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、ピロリル（例えば、１Ｈ−ピロリル）、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル（すなわち、ピリジニル；例えば、２−ピリジル、３−ピリジル、または４−ピリジル）、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル（例えば、３Ｈ−インドリル）、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、プリニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル（例えば、［１，１０］フェナントロリニル、［１，７］フェナントロリニル、または［４，７］フェナントロリニル）、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル（すなわち、フラザニル）、または１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例えば、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、または１，３，４−チアジアゾリル）、フェノキサジニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジニル（例えば、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）、１，２−ベンゾイソオキサゾール−３−イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル（すなわち、ベンゾチエニル）、トリアゾリル（例えば、１Ｈ−１，２，３−トリアゾリル、２Ｈ−１，２，３−トリアゾリル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、または４Ｈ−１，２，４−トリアゾリル）、ベンゾトリアゾリル、１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル、トリアジニル（例えば、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、または１，３，５−トリアジニル）、フロ［２，３−ｃ］ピリジニル、ジヒドロフロピリジニル（例えば、２，３−ジヒドロフロ［２，３−ｃ］ピリジニルまたは１，３−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］ピリジニル）、イミダゾピリジニル（例えば、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニルまたはイミダゾ［３，２−ａ］ピリジニル）、キナゾリニル、チエノピリジニル、テトラヒドロチエノピリジニル（例えば、４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［３，２−ｃ］ピリジニル）、ジベンゾフラニル、１，３−ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル（例えば、１，３−ベンゾジオキサニルまたは１，４−ベンゾジオキサニル）、またはクマリニルを指すことができる。他に定義されていない限り、「ヘテロアリール」という用語は、好ましくは、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個または複数個の（例えば、１個、２個、３個または４個の）環ヘテロ原子を含む５員〜１４員の（より好ましくは５員〜１０員の）単環式環または縮合環系であって、１個もしくは複数個のＳ環原子（存在する場合）および／または１個もしくは複数個のＮ環原子（存在する場合）は、任意選択により酸化されており、１個または複数個の炭素の環原子は、任意選択により酸化されている、単環式環または縮合環系を指し；より一層好ましくは、「ヘテロアリール」は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個または複数個の（例えば、１個、２個または３個の）環ヘテロ原子を含む５員または６員の単環式環であって、１個もしくは複数個のＳ環原子（存在する場合）および／または１個もしくは複数個のＮ環原子（存在する場合）は、任意選択により酸化されており、１個または複数個の炭素の環原子は、任意選択により酸化されている、単環式環を指す。さらに、他に定義されていない限り、「ヘテロアリール」の特に好ましい例としては、ピリジニル（例えば、２−ピリジル、３−ピリジル、または４−ピリジル）、イミダゾリル、チアゾリル、１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル、チエニル（すなわち、チオフェニル）、またはピリミジニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、単環式環、ならびに架橋環系、スピロ環系および／または縮合環系（例えば、２つまたは３つの環から構成されていてもよく、例えば、２つまたは３つの縮合環から構成される縮合環系などである）を含む飽和炭化水素環基を指す。「シクロアルキル」は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニル（すなわち、デカヒドロナフチル）、またはアダマンチルを指すことができる。他に定義されていない限り、「シクロアルキル」は、好ましくはＣ３〜１１シクロアルキルを指し、より好ましくはＣ３〜７シクロアルキルを指す。特に好ましい「シクロアルキル」は、３〜７の環員を有する単環式飽和炭化水素環である。さらに、他に定義されていない限り、「シクロアルキル」の特に好ましい例はシクロヘキシルである。
本明細書で使用する場合、「シクロアルケニル」という用語は、単環式環、ならびに架橋環系、スピロ環系および／または縮合環系（例えば、２つまたは３つの環から構成されていてもよく、例えば、２つまたは３つの縮合環から構成される縮合環系などである）を含む不飽和脂環式（非芳香族）炭化水素環基であって、１つまたは複数の（例えば、１つまたは２つの）炭素−炭素二重結合を含み、炭素−炭素三重結合を含まない、炭化水素環基を指す。「シクロアルケニル」は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロへプテニル、またはシクロヘプタジエニルを指すことができる。他に定義されていない限り、「シクロアルケニル」は、好ましくはＣ３〜１１シクロアルケニルを指し、より好ましくはＣ３〜７シクロアルケニルを指す。特に好ましい「シクロアルケニル」は、３〜７の環員を有し、１つまたは複数の（例えば、１つまたは２つの、好ましくは１つの）炭素−炭素二重結合を含有する単環式不飽和脂環式炭化水素環である。
本明細書で使用する場合、「ハロゲン」という用語は、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、またはヨード（−Ｉ）を指す。
本明細書で使用する場合、「任意選択の」、「任意選択により」および「〜してもよい（may）」という用語は、指定した特徴が存在してもよいが、存在しなくてもまたよいことを意味する。「任意選択の」「任意選択により」または「〜してもよい（may）」という用語が使用される場合は常に、本発明は、特に、両方の可能性、すなわち、対応する特徴が存在するという可能性、または代替として、対応する特徴が存在しないという可能性の両方に関する。例えば、「Ｘは任意選択によりＹで置換されている」（または「ＸはＹで置換されていてもよい」）という表現は、ＸがＹで置換されているか、または非置換であることを意味する。同様に、組成物の構成成分が「任意選択」であると指定されている場合、本発明は、特に、両方の可能性、すなわち、対応する構成成分が存在する（組成物中に含有されている）という可能性、または対応する構成成分が組成物に存在しないという可能性の両方に関する。
本明細書では、様々な基が「任意選択により置換されている」と書かれている。一般に、これらの基は、１つまたは複数の置換基、例えば、１つ、２つ、３つまたは４つなどの置換基を担持していてもよい。当然のことながら、置換基の最大数は、置換される部分の利用可能な付着部位の数によって制限される。他に定義されていない限り、本明細書に書かれている「任意選択により置換されている」基は、好ましくは２つ以下の置換基を担持し、特に、１つの置換基のみを担持していてもよい。さらに、他に定義されていない限り、任意選択の置換基は存在しない、すなわち対応する基は非置換であるのが好ましい。
本明細書で使用する場合、「遊離アミノ基」という用語は、特に、第一級アミノ基（−ＮＨ２または−ＮＨ３ ＋）を指す。
本明細書で使用され、文脈によって明らかに他の指定も否定もされない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つ」と互換的に使用される。したがって、例えば、本発明の「ａ」コンジュゲートを含む組成物は、本発明の「１つまたは複数の」コンジュゲートを含む組成物を指すものと解釈することができる。
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、好ましくは示された数値の±１０％を指し、より好ましくは示された数値の±５％を指し、特に、示された厳密な数値を指す。「約」という用語が範囲の両端に関して使用される場合、好ましくは、その示された数値の下端−１０％からその示された数値の上端＋１０％までの範囲を指し、より好ましくは、下端−５％から上端＋５％までの範囲を指し、より一層好ましくは、下端および上端の厳密な数値により定義される範囲を指す。「約」という用語がオープンエンドの範囲の端点に関して使用される場合、好ましくは、下端−１０％から始まる、または上端＋１０％から始まる、対応する範囲を指し、より好ましくは、下端−５％から始まる、または上端＋５％から始まる範囲を指し、より一層好ましくは、対応する端点の厳密な数値により定義されるオープンエンドの範囲を指す。「約」という用語が、タンパク質中のアミノ酸残基の数など、整数で数量化されるパラメーターに関して使用される場合、示された数値の±１０％または±５％に対応する数は最も近い整数に丸められることになる（タイブレークルール「０．５は切り上げ（round half up）」を使用）。
本明細書で使用する場合、「含んでいる（comprising）」（または「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」もしくは「含有している（containing）」）という用語は、文脈によって明らかに他の指定も否定もされない限り、「とりわけ、含有する」、すなわち、「さらなる任意選択の要素、〜の中で、含有する」という意味を有する。それに加えて、この用語はまた、「から実質的になる」および「からなる」という、より狭い意味も含む。例えば、「ＢおよびＣを含むＡ」という用語は「とりわけ、ＢおよびＣを含有するＡ」という意味を有し、Ａはさらなる任意選択の要素を含有していてもよい（例えば、「Ｂ、ＣおよびＤを含有するＡ」も包含され得る）が、この用語はまた、「ＢおよびＣから実質的になるＡ」の意味および「ＢおよびＣからなるＡ」（すなわち、ＢおよびＣ以外の構成成分はＡに含まれない）の意味も含む。
本明細書で使用する場合の、障害または疾患の「処置」という用語は、当技術分野において周知である。障害または疾患の「処置」とは、患者／対象において、障害または疾患が疑われる、または診断されたことを意味する。障害または疾患が疑われる、またはそれらに罹患している患者／対象は、通常、特定の病的状態に起因すると当業者が考える（すなわち、障害または疾患を診断する）ことが容易にできる、特定の臨床症状および／または病的症状を示している。
障害または疾患の「処置」は、例えば、障害または疾患の進行の停止（例えば、症状の無増悪）または障害もしくは疾患の進行の遅延（進行の停止が単に一過性の性質である場合）をもたらす場合がある。障害または疾患の「処置」が、障害または疾患に罹患している対象／患者の部分応答（例えば症状の改善）または完全応答（例えば症状の消失）をもたらす場合もある。したがって、障害または疾患の「処置」はまた、例えば、障害または疾患の進行の停止、または障害もしくは疾患の進行の遅延をもたらす場合のある、障害または疾患の改善を指すこともできる。このような部分応答または完全応答があっても、後に再発する場合がある。当然のことながら、対象／患者は、処置に対して広範な応答（本明細書の上記の例示的な応答など）をする場合がある。障害または疾患の処置には、とりわけ、治療的処置（好ましくは、完全応答、および最終的に障害または疾患の治癒をもたらす）および対症的処置（症状軽減を含む）を含めることができる。
本明細書で使用する場合の、障害または疾患の「予防」という用語もまた、当技術分野において周知である。例えば、障害または疾患に罹患する傾向にあると疑われる患者／対象は、特にその障害または疾患の予防によって利益を得ることができる。対象／患者には、障害または疾患に感受性または素因（遺伝的素因を含むがこれに限定されない）がある場合がある。そのような素因は、標準的な方法またはアッセイにより、例えば、遺伝子マーカーまたは表現型の指標またはバイオマーカーを使用して判定することができる。当然のことながら、本発明に従って予防される障害または疾患は、患者／対象において診断されておらず、診断することもできない（例えば、患者／対象は、臨床症状または病的症状を全く示していない）。したがって、「予防」という用語は、主治医によって、何らかの臨床症状および／または病的症状が診断もしくは判断される前に、またはそれらを診断もしくは判断することができる前に、本発明のコンジュゲートを使用することを含む。
当然のことながら、本発明は、特に、全般的なおよび／または好ましい特徴／実施形態の任意の組合せを含む、本明細書に記載されている特徴および実施形態のすべての組合せに関する。特に、本発明は、本発明によるＰ／Ａペプチドおよびコンジュゲートに含まれる種々の基および可変要素についての意味（全般的なおよび／または好ましい意味を含む）の各々の組合せに特に関する。
本明細書において、特許、特許出願および科学文献を含む複数の文献が引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性には関連性が考えられず、その内容全体が参照によって本明細書に援用される。より具体的には、個々の文献が具体的かつ個別に参照によって援用されるように指定されたかのような場合と同程度に、すべての参考文献が参照によって援用される。
いかなる従来の刊行物（またはそこから得られる情報）も、本明細書でそれを参照することは、その対応する従来の刊行物（またはそこから得られる情報）が、本明細書が関与する技術分野において共通一般知識の一部を形成するという承諾とも、容認とも、いかなる形の示唆とも解釈されず、またそのように解釈されてはならない。
本発明はまた、以下の実例となる図面によっても説明される。添付の図面は以下を示す。
リシン残基を介してＰ／Ａペプチドをタンパク質にカップリングする反応スキーム。 非求核塩基Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、ヒューニッヒ塩基）の存在下で、ＤＭＳＯを溶媒として用いて、Ｎ末端で保護されたＰ／Ａペプチド（例えばアセチル−Ｐ／Ａ＃１（４０））を、そのＣ末端を介して、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）で活性化する。得られたペプチドのヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステルを次に使用して、タンパク質のアミノ基（リシン残基のε−アミノ基またはＮ末端α−アミノ基）を、Ｐ／Ａペプチドとともに、ペプチド結合またはイソペプチド結合の形成によって選択的に誘導体化し、同時に遊離ＨＯＢｔを放出させる。このカップリングステップは、有機溶媒の含量が≦３０％の水性溶液（例えばＰＢＳ緩衝液）中で実施される。Ｐ／Ａ−タンパク質コンジュゲートは、残留Ｐ／Ａペプチド／カップリング試薬から、透析法および／またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー）によって精製してもよい。 Ａｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）ペプチドとコンジュゲートしたＲＮアーゼＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 実施例１で説明しているように、ウシ膵臓由来のＲＮアーゼＡを、Ａｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）（配列番号：１）とコンジュゲートした（ＲＮアーゼＡの１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド１０ｍｇ）。残留ＴＢＴＵをモル過剰のグリシンで反応停止した後に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを、無修飾のＲＮアーゼＡ（レーン１および２にそれぞれ２μｇまたは８μｇ）、およびＡｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−ＲＮアーゼＡコンジュゲート（レーン３および４にそれぞれ２μｇまたは８μｇ）の両方とともに充填した。コンジュゲートは、明らかな高分子量の３つの個別のバンドとして現れた。個々のバンドは、カップリングされたＰ／Ａペプチド１つずつによって変動するタンパク質コンジュゲートに対応する。カップリング反応の後に、無修飾のＲＮアーゼＡは検出不能であった。レーンＭ：Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの化学構造。 すべてが固相ペプチド合成によって得られた、Ｃ末端のリンカーアミノ酸が異なるＰ／Ａ（２０）ペプチド：Ａ、グリシン（参考例）；Ｂ、なし（Ｐ／Ａ（２０）ペプチド配列のＬ−アラニンに対応）；Ｃ、Ｄ−アラニン；Ｄ、β−アラニン；Ｅ、Ｌ−プロリン；Ｆ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；Ｇ、５−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｈ、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）；Ｉ、８−アミノオクタン酸（Ａｏａ）；Ｊ、４−アミノシクロヘキサンカルボン酸（ＡＣＨＡ）；Ｋ、４−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）。これらの例では、Ｃ末端を化学的に活性化したときにペプチドが重合するのを回避するために、Ｎ末端をピログルタモイル（Ｐｇａ）残基で保護した。 Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−ＡｈｘペプチドとコンジュゲートしたＲＮアーゼＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 実施例２で説明しているように、ウシ膵臓由来のＲＮアーゼＡを、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（配列番号：９）とコンジュゲートした。カップリング反応中の、タンパク質に対するＰ／Ａペプチドの比は、ＲＮアーゼＡの１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド０．５ｍｇ〜１５ｍｇと変動があった。各カップリング反応で得られたコンジュゲートしたＲＮアーゼＡ７μｇとともに、ゲルを充填した。さらに、非コンジュゲートのＲＮアーゼＡをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レーン「０」）の上に充填した。非コンジュゲートのＲＮアーゼＡから始まる連続的なはしごの中のバンドをカウントすることで判定される、カップリングされたＰ／Ａペプチドの数は、右に記録されている。レーン「Ｍ」：Ｐｉｅｒｃｅ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｃ末端のアミノ酸が異なるＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドとコンジュゲートした、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 組換えバチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼを、Ｐ／Ａ部分とタンパク質との間のリンカーとして作用するＣ末端のアミノ酸が異なる（図３を参照）様々なＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチド（配列番号：２〜１２）とコンジュゲートした。実施例２で説明しているようにカップリングを実施した。カップリング反応中の、タンパク質に対するＰ／Ａペプチドの比は、ウリカーゼ１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド０．５ｍｇ〜１０ｍｇと変動があった。各カップリング反応で得られたコンジュゲートしたウリカーゼ７μｇとともに、ゲルを充填した。さらに、非コンジュゲートのウリカーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの上に充填した（矢印）。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をレーン「Ｍ」に適用した。 コンジュゲートされたＰ／Ａ（２０）ペプチドのＣ末端の（リンカー）アミノ酸に依存する、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼのカップリング効率。 Ｃ末端のリンカーアミノ酸が異なる（図３を参照）Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）ペプチドにコンジュゲートしたウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５を参照）を濃度測定の面から評価し、対応するバンド強度（Ｐ）について重み付けした、カップリングされたペプチドの数の算術平均を、カップリング反応中に得られたペプチドとタンパク質との間の質量比（Ｒ）に対してプロットした。飽和関数を使用してデータをあてはめ、最大カップリング比（Ｐｍａｘ）および最大半量質量比（Ｒ１／２）を、対応する曲線から外挿した（表２に記載、実施例３を参照）。 ウリカーゼ／Ｐｇａ−ＰＡ（２０）−ＡｈｘコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 組換えバチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、質量比が２倍のＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘとコンジュゲートした（レーン３）。無修飾のウリカーゼ（レーン１）、および質量比が０．５倍のＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘとコンジュゲートしたウリカーゼ（レーン２）を適用することにより、非コンジュゲートのタンパク質から始まる連続的なはしごの中のバンドのカウントを可能にした。したがって、カップリングされたＰ／Ａペプチドの数は、正確に判定することが可能であった（右に示している）。レーン「Ｍ」：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 ウリカーゼ／Ｐｇａ−ＰＡ（２０）−Ａｈｘコンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィー。 （Ａ）Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘにコンジュゲートした組換えバチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼ（実施例４に記載、図７を参照）および無修飾のウリカーゼ（点線）の溶出プロファイルの重ね描き。精製したタンパク質１５０μＬを、濃度１ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ２００ １０／３００ＧＬカラムに入れた。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィー分析のピークを１００％に正規化した。（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ２００ １０／３００ＧＬカラムを使用する（Ａ）のクロマトグラムの較正曲線。マーカータンパク質（オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；アルコールデヒドロゲナーゼ、１５０ｋＤａ、β−アミラーゼ、２００ｋＤａ、アポ−フェリチン、４４０ｋＤａ）の分子量の対数を、それらの溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線によってあてはめた。四量体のウリカーゼおよびそのＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘペプチドコンジュゲート（黒四角）の溶出体積を観測し、そこから、見かけの分子サイズを次のように決定した。ウリカーゼ、１３２ｋＤａ（真の質量１４２ｋＤａ）；ウリカーゼ／Ｐｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘコンジュゲート、４０８ｋＤａ（真の質量：約１９７ｋＤａ）。これらのデータから、化学的にコンジュゲートしたＰ／Ａペプチドは、流体力学的容積が大幅に増大していることが示されている。 Ｐ／Ａ＃１（２０）活性エステルのＥＳＩ−ＭＳ解析。 Ｐ／Ａ＃１（２０）活性エステルのＥＳＩ−ＭＳ解析。 Ｐ／Ａ＃１（２０）活性エステルのＥＳＩ−ＭＳ解析。 Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチドと、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ａ）、４−ニトロフェニル（Ｂ）またはペンタフルオロフェニル（Ｃ）との活性エステルを、実施例５で説明しているように調製し、ｍ／ｚスペクトルを、ＥＳＩ−ＭＳにより、正イオンモードを使用して測定した。無修飾のＰ／Ａペプチドまたは活性化Ｐ／Ａペプチドのいずれか、および検出可能なこれらのペプチドへの単一水分子の付加体に対応する質量のピークを、質量予測値および質量測定値とともに表示している。 様々なＰ／Ａ（２０）活性エステルとコンジュゲートしたウリカーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチドの、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステル、４−ニトロフェニル（ｐＮＰ）活性エステルおよびペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）活性エステルを、実施例５で説明しているように調製し、バチルス−ファスティディオスス（Bacillus fastidiosus）ウリカーゼにカップリングした。ＨＯＢｔ活性エステルとのカップリングでは、カップリング反応中の、タンパク質に対するＰ／Ａペプチドの比は、ウリカーゼ１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド１ｍｇ〜１０ｍｇと変動があった。ｐＮＰ活性エステルとのカップリング、およびＰＦＰ活性エステルとのカップリングでは、得られたＰ／Ａペプチド対ウリカーゼの質量比は６：１であった。レーン「０」：非コンジュゲートのウリカーゼ。レーン「Ｍ」：ＰＡＧＥＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、次にクーマシーで染色した。 様々なＰ／Ａ（４０）ペプチドとコンジュゲートしたアルコールデヒドロゲナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 実施例６で説明しているように、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を、（Ａ）Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘ（配列番号：１８）と、または（Ｂ）Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘ（配列番号：１９）とコンジュゲートした。カップリング反応中の、タンパク質に対するＰ／Ａペプチドの比は、１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド１ｍｇ〜１０ｍｇと変動があった。ＰＢＳに対して透析した後に、各カップリング混合物５μｇずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。コンジュゲートは、カップリングされたＰ／Ａペプチド１つずつによって異なる分子量が大きくなるにつれて、個別のバンドのはしごとして現れる。レーン「０」：非コンジュゲートのＡＤＨ。レーンＭ：ＰＡＧＥ ｒｕｌｅｒ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 様々なＰ／Ａ（４０）ペプチドとコンジュゲートしたアデノシンデアミナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 実施例７で説明しているように、ウシ（Bos taurus）由来のアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘ（配列番号：１８）と、またはＰｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘ（配列番号：１９）とコンジュゲートした。カップリング反応中の、タンパク質に対するＰ／Ａペプチドの比は、タンパク質１ｍｇ当たりＰ／Ａペプチド１ｍｇ〜１０ｍｇと変動があった。ＰＢＳに対して透析した後に、各カップリング混合物５μｇずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。コンジュゲートは、カップリングされたＰ／Ａペプチド１つずつによって異なる分子量が大きくなるにつれて、個別のバンドのはしごとして現れる。レーン「０」：非コンジュゲートのＡＤＡ。レーンＭ：ＰＡＧＥ ｒｕｌｅｒ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。 Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−ＡｈｘペプチドとコンジュゲートしたＲＮアーゼＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 実施例８で説明しているように、ウシ膵臓由来のＲＮアーゼＡを、Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）（配列番号：２２）とコンジュゲートした（ＲＮアーゼＡの１ｍｇ当たりＰＡＳペプチド４ｍｇ）。残留ＴＢＴＵをモル過剰のグリシンで反応停止した後に、Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−Ａｈｘ−ＲＮアーゼＡコンジュゲートを様々な量でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に充填した（レーン１、２、３および４にそれぞれ０．５μｇ、１μｇ、２μｇまたは１０μｇ）。コンジュゲートは、明らかな高分子量の４つの個別のバンドとして現れた。個々のバンドは、カップリングされたＰＡＳペプチド１つずつによって変動するタンパク質コンジュゲートに対応する。カップリング反応の後に、残った無修飾のＲＮアーゼＡはもはや検出不能であった。レーンＭ：ＰＡＧＥ ｒｕｌｅｒ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＭＷ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
本発明は、以下に、単に説明のためのものであり、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない以下の実施例に言及することによって説明される。
[実施例１]：アセチル−Ｐ／Ａ（４０）−ＲＮアーゼＡコンジュゲートの調製
Ａｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）ペプチド（配列番号：１）（ＴＦＡ塩、純度９８％；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）３５ｍｇを、無水ＤＭＳＯ（９９．９％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１２６８μＬに溶解した。Ｐ／Ａペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化を実現するために、５００ｍＭ ＴＢＴＵ（ＣＡＳ＃１２５７００−６７−６；Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＭＳＯ溶液２１４μＬを添加し、混合した後に、ＤＩＰＥＡ（９９．５％、ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｒａｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１８μＬを添加した。全混合物を短時間ボルテックスし、２５℃で２０分間インキュベートした（図１を参照）。この設定において、ペプチド濃度は７．１４ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとＴＢＴＵとＡｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）との間のモル比は１０：１０：１であった。
ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８３８３１、配列番号：１６）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４および１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に溶解してタンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬを得、氷上で冷却した。ＲＮアーゼＡ溶液３．５ｍＬを活性ペプチドの溶液（１．５ｍＬ）と混合した結果、Ａｃ−Ｐ／Ａ＃１（４０）とタンパク質との間の質量比が５：１となり、室温で３０分間インキュベートしてカップリングさせた。残留ＴＢＴＵを反応停止するために、グリシン（ｐＨ８、トリス塩基で調整）をタンパク質試料に添加（最終グリシン濃度：２５０ｍＭ）してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に試料を加熱した（図２に示したとおり）。得られたコンジュゲートは、明らかな高分子量の３つの個別のバンドを現した。個々のバンドは、カップリングされたＰ／Ａペプチドの数によって異なるタンパク質コンジュゲートの分布に対応する。無修飾のＲＮアーゼＡは検出不能であった。
[実施例２]：ピログルタモイル−Ｐ／Ａ−（２０）−アミノヘキサノイル−ＲＮアーゼＡの調製のためのカップリング比の最適化
Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（ＴＦＡ塩、純度９８％；Ａｌｍａｃ Ｇｒｏｕｐ、Ｃｒａｉｇａｖｏｎ、ＵＫ）（配列番号：９）３ｍｇを、４３５ｍＭ ＴＢＴＵのＤＭＳＯ溶液３７．３μｌに溶解した。Ｐ／Ａペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化は、ＤＩＰＥＡ２．７μＬをペプチドの溶液に添加し、ボルテックスすることによって開始した。この設定において、ペプチドの濃度は４０．６ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとＴＢＴＵとＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘとの間のモル比は１０：１０：１であった。２５℃で１０分インキュベートした後に、表１に従って、混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに入れ、ＤＭＳＯで希釈した。各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブは、最終的に１５μＬの体積の希釈ペプチド溶液を含有していた。
ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８３８３１）の濃度２ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した。このタンパク質溶液３５μＬを、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブにピペットで移し、ピペット操作の反復およびボルテックスによって混合した。カップリング反応を、２５℃で３０分間行った。グリシン（ｐＨ８．０、トリス塩基で調整）を添加して反応を停止し、最終濃度を２５０ｍＭにした。コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析が、図４に示されている。個々のバンドは、カップリングされたＰ／Ａペプチド１つずつによって変動するタンパク質コンジュゲートに対応する。ペプチドとタンパク質との間の比が低いカップリング反応を適用することで、非コンジュゲートのタンパク質から始まる連続的なはしごの中のバンドのカウントが可能になり、したがって、カップリングされたＰ／Ａペプチドの数の正確な判定が可能になった。ＲＮアーゼＡの１ｍｇ当たり、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド３ｍｇのカップリング比は、すべてのアミノ基（１０個のリシン残基およびＮ末端）のカップリングを実現するのに十分であった。この場合、カップリングされたＰ／Ａ＃１（２０）ペプチド中のアミノ酸残基と酵素（ＲＮアーゼＡ）中のアミノ酸残基との比は１．７７であった。
[実施例３]：様々なリンカーを有するＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−ウリカーゼコンジュゲートの調製
凍結乾燥した組換えバチルス−ファスティディオスス（Bacillus fastidiosus）ウリカーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９４３１０、配列番号：１７）をＰＢＳに溶解し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（ＭＷＣＯ １０．０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、４℃で終夜ＰＢＳに対して透析し、低分子量夾雑物を除去した。
グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、β−アラニン、Ｌ−プロリン、４−アミノブタン酸（ＧＡＢＡ）、５−アミノペンタン酸（Ａｖａ）、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、８−アミノオクタン酸（Ａｏａ）、４−アミノ安息香酸（Ａｂｚ）または４−アミノシクロヘキサンカルボン酸（ＡＣＨＡ）のいずれかをＣ末端のアミノ酸Ｒｃとして有するＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）ペプチドの各々３ｍｇずつ（図３を参照；ＴＦＡ塩、純度９８％、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、実施例２でＲＮアーゼＡについて説明している方法と同様に、ウリカーゼ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）にコンジュゲートした。各コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析が図５に示されている。カップリングされたＰ／Ａペプチドの平均数を定量して、カップリング反応中に得られたタンパク質に対する各ペプチドの比を求めるために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色してからＰｅｒｆｅｃｔｉｏｎ Ｖ７００ Ｐｈｏｔｏ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｅｐｓｏｎ、Ｍｅｅｒｂｕｓｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でスキャンし、Ｑｕａｎｔ ｖ１２．２ソフトウェア（ＴｏｔａｌＬａｂ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を使用して濃度測定の面から評価した。各バンドについて、カップリングされたＰ／Ａペプチドの数（すなわち、モル比またはタンパク質に対するペプチドの化学量論量）を、非コンジュゲートのウリカーゼから始まるバンドのカウントによって指定した。次いで、ＳＤＳ−Ｐａｇｅに見られる対応するバンド強度（Ｐ）について重み付けし、カップリングされたペプチドの数の算術平均として計算した、酵素当たりのカップリングされたペプチドの平均数を、カップリング反応中に得られた質量比（Ｒ）に対してプロットした（図６を参照）。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ｖ４．１ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、データを次の飽和関数にあてはめた。
Ｐ（Ｒ）＝Ｐｍａｘ×Ｒ／（Ｒ１／２＋Ｒ）
Ｐｍａｘはカップリングされたペプチドの最大（漸近）平均数に相当し、Ｒ１／２は、カップリングされたペプチドの最大半量数のカップリング比に相当する。
試験したペプチドの各々について決定されたＰｍａｘ値およびＲ１／２値は、表２に記載している。試験したＰ／ＡペプチドのＣ末端のアミノ酸ＲｃがＲ１／２に及ぼす影響はわずかでしかないが、このリンカー基は、カップリングされたペプチドの最大数（Ｐｍａｘ）には顕著な影響を示した。すべてのウリカーゼアミノ基（各サブユニットの１６個のリシン残基およびＮ末端）の飽和は、Ｐｍａｘ値≧１７で示されるように、リンカーアミノ酸としてＡｈｘまたはＡｖａを有する場合に実現された。Ｃ末端にグリシンを有するＰ／Ａペプチドは、Ｐｍａｘ値が３．５と最低であった。Ｐｍａｘ値が６．９〜９．９の範囲の、中程度のカップリング効率は、Ｃ末端にアラニンおよびプロリンを有する場合に実現された。脂肪族のリンカーアミノ酸が長くなると、カップリング効率が高くなり（Ｐｍａｘにより示されるとおり）、Ｃ５アミノ酸Ａｖａで最高に達した。
脂肪族リンカーと芳香族Ｃ６環式リンカーの両者とも、直鎖状６−アミノヘキサン酸リンカーと同様に高いＰｍａｘ値を示した。
[実施例４]：Ｐ／Ａ２０−ウリカーゼコンジュゲートの特性評価
凍結乾燥した組換えバチルス−ファスティディオスス（Bacillus fastidiosus）ウリカーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９４３１０、配列番号：１７）をＰＢＳに溶解し、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で四量体として精製した。
実施例３で説明しているように、ＤＭＳＯに溶解したＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）＃１−Ａｈｘペプチド１ｍｇをＴＢＴＵおよびＤＩＰＥＡで活性化し、精製したウリカーゼ０．５ｍｇ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。反応混合物を２５℃で３０分間インキュベートし、次いで、再生セルロース膜透析チューブ（ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ＡＥＸ緩衝液（２５ｍＭホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５Ｌに対して４℃で終夜透析した。未反応のカップリング試薬を除去するために、透析した酵素コンジュゲートに１ｍＬ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。カラムをＡＥＸ緩衝液で平衡化し、タンパク質コンジュゲートを３０カラム体積にＮａＣｌの直線濃度勾配０〜３００ｍＭを使用して溶出した。
ウリカーゼｍｇ当たりペプチド０．５ｍｇという低い比で行ったカップリング反応に加えて、溶出した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用することで、前段落に記載した分取設定で観測されたカップリング比の決定が可能になり、このようにしてウリカーゼ単量体当たり６個〜９個のＰＡペプチドが得られた（図７を参照）。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、流速０．５ｍＬ／分で、ＰＢＳをランニング緩衝液としてＡｋｔａ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ウリカーゼ−Ｐ／Ａ（２０）コンジュゲートおよび無修飾のウリカーゼの各試料１５０μＬずつをそれぞれカラムに適用し、クロマトグラフィープロファイルを重ねた（図８Ａを参照）。タンパク質の溶出は両方とも単一の均質なピークになった。
カラムの較正のために（図８Ｂを参照）、以下の球状タンパク質（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の適切な混合物１５０μＬを、０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でＰＢＳに適用した：シトクロムｃ、１２．４ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；アルコールデヒドロゲナーゼ、１５０ｋＤａ；β−アミラーゼ、２００ｋＤａ；アポ−フェリチン、４４０ｋＤａ；チログロブリン、６６０ｋＤａ。
結果として、化学的にコンジュゲートしたウリカーゼ製剤は、ＳＥＣの間に、対応する同じ分子量の球状タンパク質より大幅に大きいサイズを示した。ウリカーゼ−Ｐ／Ａ（２０）ｎの見かけのサイズ増大は、無修飾のウリカーゼと比較して３．１倍であったが、コンジュゲートの真の質量は１．３〜１．５倍大きいに過ぎなかった。この所見は、本発明によるＰｒｏ／Ａｌａペプチドとのコンジュゲートによって、生物学的に活性なウリカーゼ酵素に付与された流体力学的容積が大幅に増加していることを明確に示している。
ウリカーゼ−Ｐ／Ａ（２０）コンジュゲートと、無修飾のウリカーゼの両者の尿酸オキシダーゼ活性を、尿酸のアラントインへの酸化に起因する、２９３ｎｍでの吸光度の減少によって判定した。簡単に言うと、酵素溶液１０μＬを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭホウ酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ９．２）中の３００μＭ尿酸溶液（ナトリウム塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μＬと混合し、３０℃で５分間インキュベートした。この溶液の２９３ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）２５０マイクロウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して測定した。尿酸の希釈系列から得られた較正曲線を使用して、吸光度の減少から活性を計算した。結果が表３にまとめられている。
[実施例５]：様々なＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘ活性エステルの合成、単離およびコンジュゲート
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４−ニトロフェニル（ｐＮＰ）またはペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）のいずれかでエステルとして活性化されたＰｇａ−Ｐ／Ａ（２０）−Ａｈｘペプチドを調製するために、それぞれの活性化用に、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘペプチド（ＴＦＡ塩、純度９８％；Ａｌｍａｃ Ｇｒｏｕｐ、Ｃｒａｉｇａｖｏｎ、ＵＫ）（配列番号：９）１０ｍｇを、１５０ｍＭ ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液３６０μｌに溶解した。次いで、Ｐ／Ａペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化は、ＴＢＴＵ、４−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の、ＤＭＦ中１５０ｍＭ溶液３６０μｌを、それぞれペプチド／ＤＩＰＥＡ溶液に添加し、ボルテックスすることによって開始した。この設定において、ペプチドの濃度は７．５ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとカップリング試薬とＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘとの間のモル比は１０：１０：１であった。ｐＮＰ活性エステルの形成は、５０ｍＭ ４−（ジメチルアミノ）ピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のＤＭＦ溶液２２μｌの添加によって促進された。２５℃で２０分インキュベートした後に、各混合物の７２μｌのアリコートを取り出した。ジエチルエーテル５００μｌを添加して活性ペプチドを沈殿させた。遠心分離（１３．５００×ｇ、４℃）した後に、上清を除去し、沈降物をジエチルエーテル５００μｌで洗浄し、真空エバポレーター（ＳｐｅｅｄｙＤｒｙ ＲＶＣ２−１８ ＣＤｐｌｕｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｃｒｉｓｔ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して乾燥し、−２０℃で、例えば１４日間保管した。
ＥＳＩ−ＭＳ解析のために、様々なＰ／Ａ（２０）活性エステルの各々の乾燥したアリコートをアセトニトリル／水（１：１）１０ｍＬに溶解し、正イオンモードを使用するｍａＸｉｓ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注入した。Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘ−ＨＯＢｔ活性エステル、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘ−ｐＮＰ活性エステル、およびＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘ−ＰＦＰ活性エステルの未加工のｍ／ｚスペクトルが、図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに、それぞれ示されている。調製したすべての活性エステルについて、検出した主な質量種は、それぞれのＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−Ａｈｘ活性エステルの質量計算値／予測値の単一水付加体に対応していた。
バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼと、単離した／予め形成したＰ／ＡペプチドのＨＯＢｔ活性エステルとのカップリングを実現するために、乾燥アリコート（活性化前のＰ／Ａペプチドの約１ｍｇに相当）を、２ｍｇ／ｍｌの酵素の１００ｍＭホウ酸Ｎａ（ｐＨ９）中溶液５００μｌ、２５０μｌ、１６７μｌ、８３．３μｌまたは５０μｌに、ボルテックスすることによって溶解した。これらはＰ／Ａ活性エステル：ウリカーゼの質量比がそれぞれ１：１、２：１、３：１、６：１または１０：１に相当するものであった。溶液を室温で１時間インキュベートして、カップリングさせた。同様に、Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（２０）−ＡｈｘペプチドのｐＮＰ活性エステルおよびＰＦＰ活性エステルを、バチルス−ファスティディオスス（B. fastidiosus）ウリカーゼにカップリングして、Ｐ／Ａ活性エステル：ウリカーゼの質量比１：６を得た。カップリングされた酵素試料を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ミニ透析カセット（ＭＷＣＯ １０．０００、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＰＢＳ（４℃）に対して透析した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で実施した（図１０を参照）。このようにして、ウリカーゼとＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートが、有利に高いカップリング比で得られたことが示された。さらに、本発明による活性化Ｐ／Ａペプチドは簡便に調製することができ、ウリカーゼなどのタンパク質薬物に後でカップリングするために長期間保管（乾燥／固体状態でも）することができることが実証された。
[実施例６]：異なる組成のＰｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘペプチドとのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）コンジュゲートの調製
Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘペプチド（Ａｌｍａｃ Ｇｒｏｕｐ、Ｃｒａｉｇａｖｏｎ、ＵＫ）（配列番号：１８）またはＰｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（配列番号：１９）の各々３．２ｍｇずつをＤＭＳＯ３．５μｌに溶解し、５００ｍＭ ＴＢＴＵのＤＭＳＯ溶液１８．５μｌを添加した。Ｐ／Ａペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化は、ＤＩＰＥＡ１．６μＬをペプチドの溶液に添加し、ボルテックスすることによって開始した。この設定において、ペプチドの濃度は１７．３５ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとＴＢＴＵとＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘ（またはＰｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘ）との間のモル比は１０：１０：１であった。実施例２と同様に、２５℃で１０分インキュベートした後に、混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに入れ、ＤＭＳＯで希釈して、酵素：ペプチドの質量比、１：１、１：３、１：６および１：１０を実現した。各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブは、最終的に２５μＬの体積の希釈した活性ペプチド溶液を含有していた。
凍結乾燥したアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（配列番号：２０）をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対してさらに透析した後に、濃度２ｍｇ／ｍｌに調整した。このタンパク質溶液７５μＬを、上記のペプチドとともに各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブにピペットで移し、ピペット操作の反復およびボルテックスによって混合した。カップリング反応を、２５℃で３０分間進行させた。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ミニ透析カセット（ＭＷＣＯ １０．０００、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、カップリングされた酵素試料をＰＢＳに対して４℃で透析した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（図１１を参照）。このようにして、図１１にも示しているように、アルコールデヒドロゲナーゼとＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートが、高いカップリング比で得られた。
[実施例７]：異なる組成のＰｇａ−Ｐ／Ａ（４０）−Ａｈｘペプチドとのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）コンジュゲートの調製
Ｐｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘペプチド（Ａｌｍａｃ Ｇｒｏｕｐ、Ｃｒａｉｇａｖｏｎ、ＵＫ）（配列番号：１８）またはＰｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（配列番号：１９）の各々３．２ｍｇずつをＤＭＳＯ３．５μｌに溶解し、５００ｍＭ ＴＢＴＵのＤＭＳＯ溶液１８．５μｌを添加した。Ｐ／Ａペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化は、ＤＩＰＥＡ１．６μＬをペプチドの溶液に添加し、ボルテックスすることによって開始した。この設定において、ペプチドの濃度は１７．３５ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとＴＢＴＵとＰｇａ−Ｐ／Ａ＃１（４０）−Ａｈｘ（またはＰｇａ−Ｐ／Ａ＃３（４０）−Ａｈｘ）との間のモル比は１０：１０：１であった。実施例２と同様に、２５℃で１０分インキュベートした後に、混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに入れ、ＤＭＳＯで希釈して、酵素：ペプチドの質量比、１：１、１：３、１：６および１：１０を実現した。各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブは、最終的に２５μＬの体積の希釈した活性ペプチド溶液を含有していた。
凍結乾燥したアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ、ウシ（Bos taurus）由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（配列番号：２１）をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対してさらに透析した後に、濃度２ｍｇ／ｍｌに調整した。このタンパク質溶液７５μＬを、上記のペプチドとともに各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブにピペットで移し、ピペット操作の反復およびボルテックスによって混合した。カップリング反応を、２５℃で３０分間進行させた。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ミニ透析カセット（ＭＷＣＯ １０．０００、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、カップリングされた酵素試料をＰＢＳに対して４℃で透析した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（図１２を参照）。このようにして、アデノシンデアミナーゼとＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートが、高いカップリング比で得られたことが示された。
[実施例８]：Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−ＡｈｘとのＲＮアーゼコンジュゲートの調製
Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−Ａｈｘペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（配列番号：２２）２ｍｇを１３２ｍＭ ＤＩＰＥＡのＤＭＳＯ溶液４４μｌに溶解した。ＰＡＳペプチドの、その末端のカルボン酸基を介しての化学的活性化は、５００ｍＭ ＴＢＴＵのＤＭＳＯ溶液１１．６μＬを添加し、ボルテックスすることによって開始した。この設定において、ペプチドの濃度は１０．４ｍＭであり、ＤＩＰＥＡとＴＢＴＵとＰｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−Ａｈｘとの間のモル比は１０：１０：１であった。全混合物を短時間ボルテックスし、２５℃で１０分間インキュベートした。
ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８３８３１、配列番号：１６）をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対して透析した後に、濃度２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＲＮアーゼＡ溶液１６６．７μＬを活性ペプチドの溶液（５５．６μＬ）と混合した結果、Ｐｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−Ａｈｘとタンパク質との間の質量比が４：１となり、室温で３０分間インキュベートしてカップリングさせた。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ミニ透析カセット（ＭＷＣＯ １０．０００、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、カップリングされたＲＮアーゼ試料をＰＢＳに対して４℃で透析した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（図１３を参照）。このようにして、セリンを含有するＰｇａ−ＰＡＳ＃１（４０）−Ａｈｘペプチドとでさえも、ＲＮアーゼＡとのコンジュゲートは高いカップリング比で得られたことが示された。
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Claims (48)

  1. タンパク質薬物と２つ以上のＰ／Ａペプチドとのコンジュゲートであって、
    各Ｐ／Ａペプチドは、独立に、ペプチドＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣであり、
    （Ｐ／Ａ）は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
    ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基であるか、またはＲＮは存在せず、
    ＲＣは、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とそのカルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基であり、
    各Ｐ／Ａペプチドは、前記Ｐ／ＡペプチドのＣ末端アミノ酸残基ＲＣのカルボキシ基と前記タンパク質薬物の遊離アミノ基とから形成されるアミド結合を介して、前記タンパク質薬物にコンジュゲートしており、
    Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている前記遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、前記タンパク質薬物のＮ末端α−アミノ基ではない、
    コンジュゲート。
  2. （Ｐ／Ａ）は、約８個〜約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. （Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択される、１０個〜６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
  4. （Ｐ／Ａ）は、プロリンおよびアラニンから独立に選択される１５個〜４５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. （Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数の、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数に対する割合は、≧１０％かつ≦７０％であり、好ましくは≧２０％かつ≦５０％であり、より好ましくは≧２５％かつ≦４０％である、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）ＡＡＰＡおよびＡＰＡＰから独立に選択される２つ以上の部分配列、および（ｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなる、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）１つまたは複数の部分配列ＡＡＰＡＡＰＡＰ、（ｉｉ）任意選択により、１つまたは２つの部分配列ＡＡＰＡ、および（ｉｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなる、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ、（ｉｉ）配列ＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳＡ、（ｉｉｉ）配列ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ、（ｉｖ）前記配列のうちのいずれかの断片、または（ｖ）前記配列の２つ以上の組合せからなる、請求項１に記載のコンジュゲート。
  9. ＲＮは、ホルミル、−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）、ピログルタモイルおよびホモピログルタモイルから選択され、前記−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）に含まれるアルキル部分は、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜４アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）（Ｃ１〜４アルキル）および−ＣＯＯＨから独立に選択される１つまたは２つの基で任意選択により置換されているか、またはＲＮは存在しない、請求項１から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  10. ＲＮは、ホルミル、アセチル、ヒドロキシアセチル、メトキシアセチル、エトキシアセチル、プロポキシアセチル、マロニル、プロピオニル、２−ヒドロキシプロピオニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−メトキシプロピオニル、３−メトキシプロピオニル、２−エトキシプロピオニル、３−エトキシプロピオニル、スクシニル、ブチリル、２−ヒドロキシブチリル、３−ヒドロキシブチリル、４−ヒドロキシブチリル、２−メトキシブチリル、３−メトキシブチリル、４−メトキシブチリル、グリシンベタイニル、グルタリル、ピログルタモイル、およびホモピログルタモイルから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  11. ＲＮは存在しない、請求項１から９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨであり、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３〜１０−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−フェニル−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−シクロヘキシル−ＣＯＯＨから選択されるのが好ましく、ＲＣは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）８−ＣＯＯＨ、
    から選択されるのがより好ましい、請求項１から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. ＲＣはアラニンまたはプロリンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. 前記コンジュゲートに含まれる前記Ｐ／Ａペプチドは、ランダムコイルコンフォメーションをとる、請求項１から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  15. 前記コンジュゲートに含まれる前記Ｐ／Ａペプチドの全部が同じである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  16. 前記Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている前記遊離アミノ基のうち少なくとも１個は、前記タンパク質薬物のリシン残基のε−アミノ基である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  17. 前記Ｐ／Ａペプチドがコンジュゲートしている前記遊離アミノ基は、前記タンパク質薬物の任意のリシン残基のε−アミノ基、前記タンパク質薬物または前記タンパク質薬物の任意のサブユニットのＮ末端α−アミノ基、およびそれらの任意の組合せから選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  18. 前記コンジュゲートは、前記タンパク質薬物と前記Ｐ／Ａペプチドとから、０．１〜５０の値を取る比ｍ（Ｐ／Ａペプチド）／ｍ（タンパク質薬物）で構成され、ｍ（Ｐ／Ａペプチド）は、前記コンジュゲートに含まれる全Ｐ／Ａペプチドの（Ｐ／Ａ）部分中のアミノ酸残基を合わせた総数であり、ｍ（タンパク質薬物）は、前記コンジュゲートに含まれる前記タンパク質薬物中のアミノ酸残基の総数である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  19. 前記比ｍ（Ｐ／Ａペプチド）／ｍ（タンパク質薬物）は、０．５〜５の値を取る、請求項１８に記載のコンジュゲート。
  20. 前記タンパク質薬物は酵素である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  21. 前記タンパク質薬物は、尿酸オキシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、Ｌ−フェニルアラニン分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、抗酸化酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ロダネーゼ、有機ホスフェート分解酵素、ホスホトリエステラーゼ、有機リンアンヒドロラーゼ、アルコール酸化酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アセトアルデヒド分解酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン分解酵素、グルタミナーゼ、Ｌ−アルギニン分解酵素、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、プラスミノーゲン活性化酵素、組織プラスミノーゲン活性化因子、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、フィブリノーゲン溶解酵素、アンクロド、バトロキソビン、シスタチオニン−β−シンターゼ、ホモシステインチオラクトン分解酵素、パラオキソナーゼ１、ブレオマイシンヒドロラーゼ、ヒト血清ＨＴアーゼ、ヒトビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質、メチオニン分解酵素、メチオニナーゼ、メチオニン特異性について改変されたシスタチオニン−γ−リアーゼ、ホモシステイン分解酵素、システイン分解酵素、シスチン分解酵素、ヒアルロニダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、グルコセレブロシダーゼ、イミグルセラーゼ、Ｐ／Ａペプチドに対する活性のない広域スペクトルプロテアーゼ、アナナイン、コモサイン、オクリプラスミン、アセチルコリン分解酵素、ブチリルコリンエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コカイン分解酵素、コカインエステラーゼ、コンドロイチナーゼ、コラゲナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ポルホビリノーゲン、ＤＮアーゼ、ドルナーゼα、オキサレート分解酵素、オキサレートデカルボキシラーゼ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、アセチルＣｏＡα−グルコサニミドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−α−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ、凝固第ＩＸ因子、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＶＩＩａ因子、凝固第Ｘａ因子、凝固第ＩＶ因子、凝固第ＸＩＩＩ因子、補体経路のタンパク質に特異性のあるプロテアーゼ、因子Ｃ３特異性について改変された型の膜タイプセリンプロテアーゼ１、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に特異性のあるプロテアーゼ、改変された型の膜タイプセリンプロテアーゼ１、ヒトアンジオテンシン変換酵素２、ＲＮアーゼ、オンコナーゼ（onconase）、ランピルナーゼ、ウシ精液ＲＮアーゼ、ＲＮアーゼＴ１、α−サルシン、ＲＮアーゼＰ、アクチビンド（actibind）、ＲＮアーゼＴ２、アルカリホスファターゼ、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ、アスホターゼアルファ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アスパルトアシラーゼ、α−マンノシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１、グランザイムＢ、溶菌素、エンドリシン、エクトリシン（ectolysin）、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、Ｌ−アラノイル−Ｄ−グルタメートエンドペプチダーゼ、システイン／ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ、リソスタフィン、ファージ尾部関連壁溶解酵素、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のファージ−Ｋ由来の尾部関連壁溶解酵素触媒ドメインとリソスタフィンの細胞−壁−結合ＳＨ３ｂドメインとからなる融合タンパク質、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ−１、エンド−β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２、免疫グロブリン分解酵素、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）のＩｄｅＳ、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）のＩｇＡプロテアーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アリールスルファターゼＡ、サイクリン依存性キナーゼ様５タンパク質、グリアジンペプチダーゼ、キヌレニン−分解酵素、キヌレニナーゼ、ミオチューブラリン、および触媒抗体またはその機能性断片から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
  23. 医薬品として使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 請求項１から２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを調製するプロセスであって、
    （ａ）式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔ［式中、ＲＣ−ａｃｔは、ＲＣのカルボキシ活性化形態であり、ＲＣおよび（Ｐ／Ａ）は、調製される前記コンジュゲートにおいて定義されるとおりであり、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基である］の活性化Ｐ／Ａペプチドを、タンパク質薬物とカップリングして、前記タンパク質薬物と、ＲＮが保護基である前記Ｐ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ、および
    （ｂ）任意選択により、ステップ（ａ）において得られた前記コンジュゲートに含有されている前記Ｐ／Ａペプチドから前記保護基ＲＮを除去して、前記タンパク質薬物と、ＲＮが存在しない前記Ｐ／Ａペプチドとのコンジュゲートを得るステップ
    を含む、プロセス。
  25. 前記活性化Ｐ／Ａペプチド中のアミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、活性エステル基であり、
    前記活性エステル基は、好ましくは次の基：
    のいずれか１つから選択され、
    前記活性エステル基は、より好ましくは次式：
    の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル基である、
    請求項２４に記載のプロセス。
  26. 前記活性化Ｐ／Ａペプチド中のアミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、無水物基であり、
    前記無水物基は、好ましくは、（ｉ）次式：
    のプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）基、
    または（ｉｉ）次式：
    の基などの混合炭酸無水物基である、
    請求項２４に記載のプロセス。
  27. 前記活性化Ｐ／Ａペプチド中のアミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、ハロゲン化アシル基であり、前記ハロゲン化アシル基は、好ましくは−ＣＯ−Ｃｌまたは−ＣＯ−Ｆである、請求項２４に記載のプロセス。
  28. ステップ（ａ）の前に、式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ［式中、ＲＣおよび（Ｐ／Ａ）は、調製される前記コンジュゲートにおいて定義されるとおりであり、ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基である］のＰ／Ａペプチドを前記活性化Ｐ／Ａペプチドに変換するさらなるステップを含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のプロセス。
  29. 前記活性化Ｐ／Ａペプチド中のアミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの活性化カルボキシ基は、次式
    を有する１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル基であり、
    前記Ｐ／Ａペプチドを前記活性化Ｐ／Ａペプチドに変換する前記ステップは、塩基の存在下で、前記Ｐ／Ａペプチドを、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのホスホニウム、ウロニウムまたはインモニウムエステルの塩と反応させることによって行われ、
    １−ヒドロキシベンゾトリアゾールのホスホニウム、ウロニウムまたはインモニウム誘導体の塩は、好ましくは、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＢＤＰ、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＢＣＣ、ＴＤＢＴＵ、ＢＯＭＩおよびＢＤＭＰから選択され、より好ましくはＴＢＴＵである、
    請求項２８に記載のプロセス。
  30. 式ＲＮ−（Ｐ／Ａ）−ＲＣ−ａｃｔの活性化Ｐ／Ａペプチドであって、
    ＲＮは、（Ｐ／Ａ）のＮ末端のアミノ基に付着している保護基であり、
    （Ｐ／Ａ）は、約７個〜約１２００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８０％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含み、
    ＲＣ−ａｃｔは、活性化カルボキシ基を有し、そのアミノ基を介して（Ｐ／Ａ）のＣ末端のカルボキシ基に結合し、そのアミノ基とその活性化カルボキシ基との間に少なくとも２個の炭素原子を含むアミノ酸残基である、
    活性化Ｐ／Ａペプチド。
  31. 前記アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの前記活性化カルボキシ基は、活性エステル基であり、
    前記活性エステル基は、好ましくは次の基：
    のいずれか１つから選択され、
    前記活性エステル基は、より好ましくは次式：
    の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステル基である、
    請求項３０に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  32. 前記アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの前記活性化カルボキシ基は、無水物基であり、
    前記無水物基は、好ましくは、（ｉ）次式：
    のプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）基、
    または（ｉｉ）次式：
    の基などの混合炭酸無水物基である、
    請求項３０に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  33. 前記アミノ酸残基ＲＣ−ａｃｔの前記活性化カルボキシ基は、ハロゲン化アシル基であり、前記ハロゲン化アシル基は、好ましくは−ＣＯ−Ｃｌまたは−ＣＯ−Ｆである、請求項３０に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  34. （Ｐ／Ａ）は、約８個〜約４００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも８５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  35. （Ｐ／Ａ）は、プロリン、アラニン、グリシンおよびセリンから独立に選択される、１０個〜６０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）中のアミノ酸残基の数の少なくとも９５％は、プロリンおよびアラニンから独立に選択され、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  36. （Ｐ／Ａ）は、プロリンおよびアラニンから独立に選択される１５個〜４５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、（Ｐ／Ａ）は、少なくとも１個のプロリン残基および少なくとも１個のアラニン残基を含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  37. （Ｐ／Ａ）に含まれるプロリン残基の数の、（Ｐ／Ａ）に含まれるアミノ酸残基の総数に対する割合は、≧１０％かつ≦７０％であり、好ましくは≧２０％かつ≦５０％であり、より好ましくは≧２５％かつ≦４０％である、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  38. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）ＡＡＰＡおよびＡＰＡＰから独立に選択される２つ以上の部分配列、および（ｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなる、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  39. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）１つまたは複数の部分配列ＡＡＰＡＡＰＡＰ、（ｉｉ）任意選択により、１つまたは２つの部分配列ＡＡＰＡ、および（ｉｉｉ）任意選択により、プロリンおよびアラニンから独立に選択される、さらに１個、２個または３個のアミノ酸残基からなる、請求項３０から３８のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  40. （Ｐ／Ａ）は、（ｉ）配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ、（ｉｉ）配列ＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳＡ、（ｉｉｉ）配列ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ、（ｉｖ）前記配列のうちのいずれかの断片、または（ｖ）前記配列の２つ以上の組合せからなる、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  41. ＲＮは、ホルミル、−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）、ピログルタモイルおよびホモピログルタモイルから選択され、前記−ＣＯ（Ｃ１〜４アルキル）に含まれるアルキル部分は、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜４アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）（Ｃ１〜４アルキル）および−ＣＯＯＨから独立に選択される１つまたは２つの基で任意選択により置換されている、請求項３０から４０のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  42. ＲＮは、ホルミル、アセチル、ヒドロキシアセチル、メトキシアセチル、エトキシアセチル、プロポキシアセチル、マロニル、プロピオニル、２−ヒドロキシプロピオニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−メトキシプロピオニル、３−メトキシプロピオニル、２−エトキシプロピオニル、３−エトキシプロピオニル、スクシニル、ブチリル、２−ヒドロキシブチリル、３−ヒドロキシブチリル、４−ヒドロキシブチリル、２−メトキシブチリル、３−メトキシブチリル、４−メトキシブチリル、グリシンベタイニル、グルタリル、ピログルタモイル、およびホモピログルタモイルから選択される、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  43. ＲＣ−ａｃｔは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨであり、前記Ｈ２Ｎ−（Ｃ２〜１２ヒドロカルビル）−ＣＯＯＨの−ＣＯＯＨ基は、活性化カルボキシ基の形態である、請求項３０から４２のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  44. ＲＣ−ａｃｔは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３〜１０−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−フェニル−ＣＯＯＨ、およびＨ２Ｎ−シクロヘキシル−ＣＯＯＨから選択され、前記ＲＣ−ａｃｔ基の各々の−ＣＯＯＨ基は、活性化カルボキシ基の形態である、請求項３０から４３のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  45. ＲＣ−ａｃｔは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）８−ＣＯＯＨ、
    から選択され、前記ＲＣ−ａｃｔ基の各々の−ＣＯＯＨ基は、活性化カルボキシ基の形態である、請求項３０から４４のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  46. ＲＣ−ａｃｔは、活性化カルボキシ基を有するアラニンであるか、またはＲＣ−ａｃｔは、活性化カルボキシ基を有するプロリンである、請求項３０から４２のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  47. ランダムコイルコンフォメーションをとる、請求項３０から４６のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチド。
  48. 請求項１から２１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを調製するための、請求項３０から４７のいずれか一項に記載の活性化Ｐ／Ａペプチドの使用。
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