JP2020524688A - 第viii因子亜種の精製 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、第VIII因子(FVIII)亜種を、FVIIIを含む組成物から精製するための方法であって、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、サイズ排除クロマトグラフィーステップ、および濃縮ステップを含む方法に関する。本発明は、精製されたFVIII亜種を含む組成物にも関する。
止血は、傷害または組織損傷が生じた後の失血を止めるための全ての反応を包含するプロセスである。止血は以下の3つの主要なステップを伴う:
1.血管収縮。これは、血流を減少させ、それにより、急性失血を減少させるための、周囲の筋線維の収縮による罹患血管の狭小化を意味する。
2.損傷を受けた血管壁を一時的に塞ぐための血小板血栓の形成。これは、傷害後の最初の1分以内に起こり、下にある結合組織のコラーゲンとのフォン・ヴィルブランド因子により媒介される接触に主に起因する(Clemetson, 2012)。
3.凝固。これは、血液凝固因子の活性化、および最終的に、トロンビンの活性化、フィブリンの形成、ならびにそれによる血栓安定化である。活性化は、カスケード様、増幅様式で起こり、それにより、下流に続く凝固因子のそれぞれの活性が増強される。
1.フォン・ヴィルブランド病は、フォン・ヴィルブランド因子の欠乏によって引き起こされる。結果として、vWFによって媒介される血小板接着が適正に働かない。
2.血友病Aは、血液凝固第VIII因子欠乏症に起因して生じる。一過性血小板接着および凝固の開始期は機能的であるが、凝固の伝播期における大規模トロンビン形成が進行できない。
3.血友病Bは、第IX因子欠乏症であり、血友病Aと同様の症状が生じる。内因性テナーゼ複合体を形成することができず、それにより、因子FXが大部分不活性のままになり、その結果、トロンビン活性化が非効率的になり、フィブリン生成が不十分になる。
1.十分な量の各FVIII亜種をもたらすこと。
2.最終製剤中の十分なFVIII亜種タンパク質濃度をもたらすこと。
3.例えば、その後の免疫学的研究において信頼できる結果をもたらすことができるように、不純物とみなされる他のFVIII亜種の量が十分に低い最終製剤をもたらすこと。最終生成物は、無菌かつ生物学的夾雑物を含まないものであるべきである。
4.最終的なFVIII亜種画分は、定義されたマトリックス、例えば、定義されたpHで塩ならびに界面活性物質を含めたバッファー成分を含有するマトリックス中に提供される。
5.さらに、本発明において有用であると評価されたプロセスのステップは、十分な量の生成物の生成を確実にするために分取スケールに容易にアップグレード可能である。
本発明は、上記の必要性を満たし、当技術分野における上記の問題を、下記の実施形態を提供することによって解決する。
(1)FVIIIを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(2)前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(3)前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
(0)組成物中に含まれるFVIIIをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目1から13までのいずれか1つに記載の方法。
(0’)FVIIIを含む組成物を、孔径が約0.2μmのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目14または15に記載の方法。
(2)前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップ
で置き換える、項目1から23までのいずれか1つに記載の方法。
(1’)ステップ(1)の溶出液に含まれるFVIII亜種をフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目24に記載の方法。
(1’’)前記FVIII亜種を含む溶出液を、孔径が約0.2μmのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目25または26に記載の方法。
(1)タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を収集するステップと、
(2)前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ(1)の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を収集するステップと、
(3)前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ(2)の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
(0)組成物に含まれるタンパク質またはタンパク質のサブユニットをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目47から54までのいずれか1つに記載の方法。
(0’)タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物を、孔径が約0.2μmのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目55または56に記載の方法。
(2)前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ(1)の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップ
で置き換える、項目47から63までのいずれか1つに記載の方法。
(1’)ステップ(1)の溶出液に含まれるタンパク質またはタンパク質のサブユニットをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目64に記載の方法。
(1’’)前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を、孔径が約0.2μmのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目65または66に記載の方法。
以下で特に定義されていなければ、本発明において使用される用語は、当業者に公知のそれらの一般的な意味に従って理解されるものとする。
略語 完全な文脈/説明
AIEX アニオン交換クロマトグラフィー
ALP アルカリホスファターゼ
AS FVIII標準物質
B14390000−30 SourceS由来の出発材料
B20/B70/B100−rFVIII Bドメインを20%/70%/100%含有するヒト組換え第VIII因子
BDD−rFVIII ヒトBドメイン欠失組換え第VIII因子
BDS バルク原薬
C18 炭素原子18個を含有する直鎖アルカン(n−オクタデカン)を用いた逆相HPLC固定相
C4 炭素原子4個を含有する直鎖アルカン(n−ブタン)を用いた逆相HPLC固定相
CHO チャイニーズハムスター卵巣
CIEX カチオン交換クロマトグラフィー
CL4B 架橋アガロースベースマトリックス
Crillet4HP ポリソルベート80の商品名
CV カラム体積
Cys2 シスチン
DLS 動的光散乱
DTT ジチオスレイトール
E1 溶出液プール1
E2 溶出液プール2
EG エチレングリコール
ELISA 酵素結合免疫吸着検定法
EtOH エタノール
ExPASy Swiss Institute of Bioinformatics Bioinformatics Resource Portal
F8_AD2_90kDa SourceQおよびMonoQの実行により得られた90kDaの亜種が濃縮された出発材料
F8A 血液凝固第VIII因子をコードする遺伝子座
Fc 結晶化可能断片
FIX 血液凝固第IX因子
FIXa 活性化された血液凝固第IX因子
FL−rFVIII (好ましくはヒト)全長組換え第VIII因子
FPLC 高速タンパク質液体クロマトグラフィー
Frac 画分収集器具
FT フロースルー
FV 血液凝固第V因子
FVa 活性化された血液凝固第V因子
FVII 血液凝固第VII因子
FVIIa 活性化された血液凝固第VII因子
FVIII 血液凝固第VIII因子
FVIIIa 活性化された血液凝固第VIIIa因子
FX 血液凝固第X因子
FXa 活性化された血液凝固第X因子
FXI 血液凝固第XI因子
FXIa 活性化された血液凝固第XI因子
FXII 血液凝固第XII因子
FXIII 血液凝固第XIII因子
FXIIIa 活性化された血液凝固第XIII因子
HAc 酢酸
HDX−MS 水素/重水素交換質量分析
HEPES 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸
HIC 疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HPLC−SEC 高性能サイズ排除クロマトグラフィー
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
IgG 免疫グロブリンG
IPA イソプロピルアルコール
IU 国際単位
kDa キロダルトン
L ロード
LDS ドデシル硫酸リチウム
M 分子量マーカー
M モル濃度
mAB モノクローナル抗体
MES 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸
MilliQ 超純水1型
NaCl 塩化ナトリウム
NaOH 水酸化ナトリウム
NE 溶出後液
OC1 アルカリ性平衡化バッファー
Out1〜7 出口弁1〜7
P1 生成物プール1
P2 生成物プール2
pdFVIII(好ましくはヒト)血漿由来第VIII因子
PE 溶出後液
PETG ポリエチレンテレフタレート
ポリソルベート80 非イオン性界面活性物質
ProtParam タンパク質の種々の物理的および化学的パラメータを算出するためのツール
PVDF ポリビニルジスルホン
QA1 AIEX平衡化バッファー
QB1 AIEX溶出バッファー1
QB2 AIEX溶出バッファー2
Rel.Abs. 相対吸光度
rFVIII 組換え血液凝固第VIII因子
RP 逆相
S/D 溶媒/界面活性剤
SA3 CIEX平衡化バッファー
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SDS−Page ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
SOP 標準操作手順
SOS−E SourceS溶出液
TFA トリフルオロ酢酸
TFPI 組織因子経路インヒビター
ThT チオフラビンT
TNBP リン酸トリブチル
Tris トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン
Triton X100 4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)フェニル−ポリエチレングリコール
Trp トリプトファン
TWA 1Mの塩化ナトリウム溶液
Tween 80 ポリソルベート80の商品名
Tyr チロシン
UV 紫外線
v/v 体積/体積
VE 溶出前液
vWF フォン・ヴィルブランド因子
W1〜3 洗浄相1〜3
本発明による第VIII因子亜種を精製するための方法では、第1のクロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィーステップである。本発明者らは、驚いたことに、その分解能が高いことにより、高い分離能がもたらされることを見出した。
本発明による方法の第2のステップにおいてスモールスケールクロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第2のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。本発明の方法の第2のクロマトグラフィーステップとしてのサイズ排除クロマトグラフィーは、MonoQカラムでアニオン交換クロマトグラフィーによって生成した溶出液をさらに精製するためのプロセスのステップとしての機能を果たす。これは、軽微な不純物を取り除くための最終精製ステップとも称することができる。サイズ排除クロマトグラフィーの一般的な手順の展開は、ベッド高が30cmであり、おおよそのカラム体積が23.5mLの予め充填されたSuperdex Increaese 200カラムで実現することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、分子が出入りできるゲル体積がその分子のサイズに応じて異なることに基づく。したがって、SEC樹脂は標的タンパク質に結合するまたはそれを保持するいかなる官能基も有さない。したがって、特定の平衡化または溶出バッファーを有する必要はなく、そうではなく、平衡化、試料適用および溶出相の間にランニングバッファーとしての機能を果たすバッファーを有する。大まかに300mMの塩化ナトリウムを得るために、SECランニングバッファーは20%QA1バッファーおよび80%QB2バッファーで構成されることが好ましい。これは、生成物をMonoQ樹脂から溶出することが好ましい塩濃度と同じ範囲内である。一般的なクロマトグラフィースキームは表3に見出すことができる。第1の平衡化相を使用して、カラムを通常保管する20%エタノールを取り除く。したがって、1.5カラム体積のMilliQは、滞留時間90分に対応する20.0cm/hで流すことができる。次いで、カラムをSECランニングバッファー中、2カラム体積に対して直線流速45.0cm/hで平衡化することができる。これがカラム保管以外の全てのステップについてのデフォルト流速であってもよい。より高い流速を試験したが、高圧条件が時に引き起こされるので不適切であることが分かった。満足のいく分離結果を得るためには、推奨される試料体積は25μLから500μLまでにわたる。そのような小さな試料体積は、キャピラリーループを使用して適用することができる。分離が実際に起こる溶出相の間に試料を1.5カラム体積のランニングバッファーで洗い流すことができる。この体積は、画分収集器具を使用して小画分中に収集する。その後、カラムを、2カラム体積の0.5Mの水酸化ナトリウム溶液および2カラム体積の超純水を含む短い再生相にデフォルト流速で供することができる。最終的に、保管のために、カラムに2カラム体積の20%エタノールを低下させた直線流速20.0cm/hで流すことができる。
本発明の方法による濃縮ステップでは、濃縮のためにアニオン交換クロマトグラフィーを実施することができる。アニオン交換樹脂SourceQは、MonoQ樹脂と同様である。官能基は同一であるが、SourceQ粒子はMonoQ粒子の3倍の大きさである−したがって、SourceQ樹脂での分解能は低下する。SourceQアニオン交換体は、本発明では、FVIII亜種の分取精製の最終ステップとして使用され得る。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーから生じる溶出液をさらに精製する代わりに、このステップを濃縮のために使用することができる。MonoQ溶出液は分取サイズ排除クロマトグラフィーの間に著しく希釈され、これにより、濃縮ステップが必要になる。一般的な手順は、カラム平衡化、試料適用、総タンパク質含量の小さな体積での迅速な溶出を目的とする急なステップ溶出相、ならびに最終的に、カラム再生および保管を含む。SEC溶出液を濃縮するために利用可能なSourceQカラムが2つ存在する。SourceQ樹脂の結合能は、非常に高い結合能を有するMonoQ樹脂と同等であるので、ほとんどの場合、カラム体積およそ3mLの小さなSourceQカラムの使用で十分である。表6に示されている好ましいクロマトグラフィースキームは、小さなSourceQカラムを指す。しかし、いくつかの生成物プールはタンパク質濃度が高いので、それらにはカラム体積7mLのより大きなSourceQカラムを使用することが必要になり得る。より大きなカラムのためのクロマトグラフィースキームは、原理上は表6に示されているものと同様である。それぞれのカラムの性質に応じて、滞留時間が一定に保たれるように直線流速をスケールアップする。
A=ε・l・c
は、タンパク質濃度c(M)、セル行路の長さ1(cm)および吸光係数ε(M−1cm−1)の一次関数である、測定される吸光度Aである。タンパク質溶液の280nmにおける吸光度に関する根本原理は、芳香族アミノ酸であるトリプトファンおよびチロシン、ならびに、総吸光度により少ない程度に寄与するシスチン、すなわち、ジスルフィド結合の含有量である。フェニルアラニンは、低波長においてのみ吸光度に寄与し、したがって、280nmにおけるUV測定には関連しない。水溶液からタンパク質濃度を観察できるようにするために、アミノ酸組成ならびに芳香族アミノ酸およびシスチンの存在量に主に依存する特定のタンパク質についての吸光係数を決定する必要がある。組換えFVIIIの組成は不均一であるので(上記を参照されたい)、精製された亜種画分についてタンパク質濃度を算出するために、各FVIII亜種に特異的な吸光係数が必要である。タンパク質濃度1mg/mLにおけるこれらの亜種に特異的な吸光係数の算出を以下に見出すことができる。これらの亜種に特異的な吸光係数に基づく換算係数を算出して、タンパク質濃度の算出をさらに単純化した。測定自体を、試料と同一のバッファー組成を含有するブランク溶液に対して実施する。吸収の度合いを、上記の方程式を使用してそれぞれのタンパク質濃度に変換することができる。この方法の標的値としてのタンパク質濃度を、例えば、クロマトグラフィー濃縮ステップがどのくらい有効に働くかの尺度として使用する。
・遅延時間[分]:凝固時間、トロンビン生成の開始を表す
・ピークまでの時間[分]:最大量のトロンビンが生成するまでの時間
・トロンビンピーク[nM]:形成される最大トロンビン濃度
・内在性トロンビン潜在性(ETP)[nM 分]:生成されるトロンビンの総量を表すトロンビン生成曲線下面積。
ε=N(Tyr)・ε(Tyr)+N(Trp)・ε(Trp)+N(Cys2)・ε(Cys2)
ε総=ω重鎖・ε重鎖+ω軽鎖・ε軽鎖
ε総=0.65・1.066M−1cm−1+0.35・1.617M−1cm−1=1.26M−1cm−1
FVIII亜種を精製するための出発材料
以下の精製実験はほとんど全て、B14390000−30と称されるFL−rFVIIIを含有するSourceS溶出液(SOS−E)を用いて実施する。SOS−EはADVATE BDSとして生成されるが、最終的な精製ステップを欠く。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第1のクロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィーの一般的な型−MonoQ樹脂を使用したアニオン交換クロマトグラフィーまたはSuperdex 200樹脂でのサイズ排除クロマトグラフィー−に関係なく、以下のスモールスケール実験の間にもたらされた結果を分取精製ステップのラージスケールプロセスに使用する。結果は、それぞれのクロマトグラフィー手順の構成に重要である。
1.違うように荷電した重鎖亜種のバリアント、主に180kDaの全長断片、単鎖FVIIIおよび伸長型軽鎖と他の亜種の異なる組合せ
2.全長重鎖(180kDa)
3.部分的なBドメイン短縮を伴う重鎖(150kDa)
4.部分的なBドメイン短縮を伴う重鎖(110kDa)
5.Bドメイン枯渇重鎖(90kDa)
FVIII亜種のスモールスケール精製−第1のクロマトグラフィーステップにおけるグラジエントの長さの最適化
強力な溶出液のパーセンテージ上昇はより遅いことに起因して、グラジエントがより平らであることは、分離がより良好であることと等しい。図6は、2つの異なる実現可能性実験のオーバーレイを示し、一方は、8カラム体積のグラジエントで動作し、UVシグナルについては実線で示され、電気伝導率については破線で示されており、他方は、16カラム体積のグラジエント溶出で実施され、UVシグナルについては点線で示され、対応する電気伝導率シグナルについては断続線で示されている。8カラム体積での溶出と比較して16カラム体積での溶出の間では電気伝導率の上昇がはるかに遅いことが明白に目に見える。それぞれのUVシグナルは、それらの全体的なパターンに関しては高い類似性を共有するが、溶出挙動は明らかに異なる。16カラム体積での溶出のUVシグナルを表す点線の曲線は、8カラム体積でのUV曲線と比較して広がっており、また、150kDaの亜種を表す小さな肩がよりよく目に見える。溶出相が収集される体積は16カラム体積での溶出については8カラム体積での溶出の2倍であるので、これらの構造の一部が別々の画分に収集され得る可能性もある。最も突出した差異は、通常、150kDaのBドメイン短縮型亜種がカラムから溶出する傾向がある領域において見ることができる。この領域は、8カラム体積の溶出相において幾分短い。これは、180kDaの完全重鎖シグナルの強度が急速に低下し、次いで、110kDaの亜種の溶出が起こったことに起因して再度上昇するかのように思われる。16カラム体積の溶出相では、対照的に、150kDaの亜種の溶出が分解される。分離の成功は全く満たされない可能性があるが、180kDaの全長重鎖ピークの下降側において、小さな肩が認識できる。これは、着実に上昇する電気伝導率条件下では、180kDaの完全重鎖が溶出するが150kDaのBドメイン短縮型鎖はなお結合しているある点がより長い期間にわたって保持されるからである。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第1のクロマトグラフィーステップ前のフューリンプロテアーゼ処理
フューリンプロテアーゼは、FVIIIの細胞内プロセシングに関与するタンパク質分解酵素である。FVIII配列全体を通して、フューリンが付着し、その基質を切断することができる種々の位置が存在する。FVIIIは、組換え供給源に由来するものであっても、完全にはプロセシングされないので、高度の不均一性が存在する。不均一性に寄与するのはBドメインだけではない。異なる型のグリコシル化も、溶出の間のある特定のFVIII分子の挙動の仕方に影響を及ぼす可能性がある。これは、180kDaの全長重鎖に関して特に妥当である。この亜種はBドメイン全体をなお含有し、高度にグリコシル化されている(Pipe et al. (1998))。タンパク質表面の異なる種類のグリコシル化、したがって、違うように荷電した領域が、全長重鎖が単一のピークとして溶出しないだけでなく、2つの別個のピークとして溶出する理由であると思われる。
1.FVIII亜種の不均一性を低下させるため、および全体的な分離の成功を改善するために、試料適用前に試料を>100IU/mLフューリンプロテアーゼで処理する。
2.リニアグラジエント溶出の長さを4倍に増大させて32カラム体積にする。溶出の後半における亜種特異的ピークの広がりの増大により、画分希釈の影響が克服されると思われる。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第2のクロマトグラフィーステップ
サイズ排除クロマトグラフィーを、すでに所望の生成物を高い純度で含有するプールから軽微な不純物を取り除くための最終精製ステップとして使用する。サイズ排除クロマトグラフィーは、FVIII分子亜種についての、MonoQアニオン交換クロマトグラフィーステップの後の第2の精製ステップとしても適切である。したがって、サイズ排除によって精製される予定の各試料は、当初はアニオン交換クロマトグラフィーによって導き出され、その後、所望の亜種を含有する画分をプールすることによって得られる。120kDaの伸長型軽鎖はフューリン成熟化の過程で完全に取り除かれていると仮定すると、それぞれの試料中に存在する各重鎖バリアントは、80kDaの軽鎖に排他的に結合するはずである。したがって、全ての亜種間の分子量の平均差異は、およそ50kDaであり、これは、満足のいく結果を得るために十分であるはずである。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第2のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片の精製
図13の右側は、前のMonoQアニオン交換クロマトグラフィー実行のSDS pageゲル電気泳動の一部を示す。画分G4、G5およびG6は、十分な純度の110kDa重鎖を示し、これらをサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製のためにプールし、使用した。大多数の画分の対応するクロマトグラムならびに銀染色ゲル電気泳動をそれぞれ図12および図13の左側において見ることができる。4つの重鎖亜種全てが試料中に明らかに存在するが、これらは、分子量およびサイズが異なるので、別個の時点でカラムから溶出する。全長重鎖(180kDa)は、全FVIIIバリアントの中で最も大きい。したがって、全長重鎖(180kDa)は、全ての亜種のなかでアクセスできる体積が最も少なく、最初に溶出する。これは、ゲルの画分C4〜C7において見ることができる。第2のピークは、画分C9〜C11において目に見え、これは、150kDaの短縮型重鎖種によって引き起こされる。最も突出したピークは予測通り110kDaの短縮型重鎖断片であり、これは、画分D1で溶出し始め画分D9まで進む。150kDaの断片および110kDaの断片は互いと明白に分離されるが、画分D5およびその後の画分ではBドメイン枯渇90kDa重鎖の痕跡が混入していることも目に見える。110kDaの亜種と90kDaの亜種はどちらも同様の細孔体積に浸透することができると思われ、これは、それらの分子量の差異がたったの20kDaであることから、驚くことではない。しかし、Bドメイン枯渇90kDaの亜種の強度は110kDaの標的タンパク質と比較して非常に低く、画分D2、D3およびD4は絶対的に純粋であると思われる。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第2のクロマトグラフィーステップにおける全長重鎖の精製
アニオン交換クロマトグラフィー溶出液は、全長重鎖断片のさらなる精製および最終精製の出発材料としての機能を果たす。図15に示されている画分F4、F5およびF6は、主に180kDaの亜種で構成される。軽微な不純物は短縮型重鎖種(110kDa)およびBドメイン枯渇重鎖断片(90kDa)から生じるが、より低い程度で150kDaの短縮型重鎖バリアントからも生じる。これらの画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーに適用した。それぞれのクロマトグラムを図14において見ることができ、対応するSDS pageゲル電気泳動を図15の左側において見ることができる。この実験におけるタンパク質濃度は、一般に、110kDaの短縮型重鎖断片の精製結果と比較して高い。したがって、吸光度がより高く、SDS pageゲル電気泳動でのシグナルがより強い。すでに上記されている通り、180kDaの全長断片が最初にカラムから溶出する亜種である。180kDaの全長断片は、クロマトグラムで画分C4〜D1における吸光度がおよそ70mAUの大きなピークとして現れる。適当な銀染色SDS pageにより、このピークが排他的に180kDaの全長重鎖を起源とするものであることが明白に示されるが、画分C10〜D1では150kDaの短縮型重鎖の混入が存在する。それでも、ピークの前半(画分C4〜C9)は、明確に純粋であると思われる。150kDaの短縮型重鎖は、電気泳動ゲルにおいてのみ目に見え、クロマトグラムでは目に見えず、これは、180kDaの全長断片がなお溶出している時点で少量が溶出することが原因だと思われる。110kDaの短縮型重鎖断片、ならびにBドメイン枯渇重鎖断片は、強度が極めて低い特定のピークとして認められ得る。どちらもSDS pageにおいてそれぞれ画分D3〜D8およびD6〜D9として明らかである。実施例6においてすでに見られたように、150kDa種と110kDa種は十分に分離されている。全長重鎖および150kDa重鎖は十分には分離されず、純粋な生成物プールを得るために必要な画分を慎重に考えた上でプールする。同じことが110kDa種と90kDaのBドメインを有さない重鎖にも当てはまる。これらは、群を抜いて全く完全には分離されず、ここでも同様に慎重に考えてプールすることが必要になる。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第2のクロマトグラフィーステップにおける疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー手法を、アニオン交換クロマトグラフィーでは挙動が同様であり、それにより分離が極めて難しい全長重鎖(180kDa)と短縮型重鎖断片(150kDa)を区分するための可能性のある代替法としてスモールスケール相で試験した。
FVIII亜種のスモールスケール精製−第2のクロマトグラフィーステップにおけるネガティブモード疎水性相互作用クロマトグラフィー
ネガティブモードクロマトグラフィー手法は、ブレークスルーおよび洗浄相の間に150kDaの短縮型重鎖断片を洗い出すことを目的とし、一方で他の亜種はカラムに結合したままであると考えられる。この亜種は、移動相を通過する移動だけで自然に結合解除することができるほど弱く結合することが想定される。150kDaの亜種が富化されたMonoQ溶出液プールがロードとしての機能を果たし、カラムへの結合のためにその電気伝導率を上昇させる。この理由から元の洗浄相が著しく持続する。図21は、画分A9付近のどこかでカラムの能力を超えること示す。この時点でブレークスルーが起こり、UVシグナルの増加が導かれる。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製
FVIII亜種の分取スケール精製は、所望の重鎖断片を富化するための最初のMonoQアニオン交換クロマトグラフィーステップ、その後の、不純物とみなされる他の亜種を分離する分離能が十分であるラージスケールサイズ排除クロマトグラフィーカラムでの最終精製ステップを伴う。Bドメイン枯渇重鎖断片(90kDa)についてはサイズ排除ステップがスキップされるので、この亜種は例外である。この亜種は、MonoQ AIEXステップによってすでに満足のいく程度まで精製されており、さらなる最終精製が必要ない。4つの異なる亜種の全てについての最終ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーの間に大きく希釈されることに起因する濃縮である。これは、SourceQアニオン交換樹脂での別のAIEXステップによって実施する。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製−第1のクロマトグラフィーステップ
アニオン交換クロマトグラフィーはFVIII分子亜種の精製の一次ステップであり、適切な画分をさらなる精製のためにプールすることができるように、4つの所望の重鎖断片の全ての大まかな分離を実現する。図24は、ラージスケールMonoQカラムでのAIEXステップの溶出相の第1のクロマトグラムを示す。出発材料B14390000−30を上記の改変された標準手順に従って分離し、特有の溶出パターンを示し、これは、スモールスケール実験からすでに分かっている。溶出相を8つの生成物プールにプールし、そのそれぞれが、精製され、富化された形態のある特定の重鎖断片を含有する。溶出の前半は、大体分離されたピークで溶出する、違うようにグリコシル化された全長重鎖バリアントが優位を占めることが分かっている。隣のものと明白に区別することができるピークを個々の生成物プールのために使用するが、さらには評価しない。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製−第2および第3のクロマトグラフィーステップにおける全長重鎖(180kDa)の精製および濃縮
図23のプロセスフロー図に示されている通り、全長重鎖の精製は真の精製ステップとしてAIEXおよびSEC、ならびに濃縮のための別のAIEXステップの3つのステップで構成される。第1のAIEX精製のSDS pageゲル電気泳動の評価に基づいて、高タンパク質含有量ならびに低分率の不純物の両方を示す最も有望な画分を選択し、プールし、分取SECカラムに適用する。サイズ排除クロマトグラフィーから収集されたアウトプットをSourceQカラムにさらに適用し、ステップ溶出によって最終的に濃縮する。それに応じた結果を以下に論じる。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製−第2および第3のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片(150kDa)の精製および濃縮
150kDaの短縮型重鎖断片を精製するための手順は、前の節に記載されている全長重鎖の精製に使用したものと原理上は同様である。150kDaの亜種として通常現れる典型的な肩により十分な純度のはるかに少ない画分が示されるので、この型のFVIII亜種の適切な総量を精製することはどちらかというと難しい。必要な実行の数および最後の各亜種の総量によって示される通り、図43は、同じ数の実行により、短縮型重鎖断片(6.74mg)が全長重鎖(62.97mg)と比較して約10分の1しかもたらされないことを示す。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製−第2および第3のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片(110kDa)の精製および濃縮
分子量が110kDaである短縮型重鎖亜種を、180kDaおよび150kDaのFVIII亜種に対してすでに使用された標準手順に従って精製する。第1のAIEXステップおよびサイズ排除クロマトグラフィーのどちらにおいても所望の断片のピークが隣のピークからはるかに良好に分離されるので、都合のよい画分を選択し、プールすることがはるかに容易であると思われる。結果を以下の2つの節に示す。
FVIII亜種のラージスケール(分取)精製−第3のクロマトグラフィーステップにおけるBドメイン枯渇重鎖(90kDa)断片の濃度
Bドメイン枯渇重鎖断片は、出発材料B1439000−30中に最少に存在するFVIII亜種である。満足のいく量のこの亜種を得るためには莫大な数のAIEX精製を実行することが必要になり、これには、どちらかというと利用可能性が限られているこの出発材料の大きな体積が必要になる。その結果として、約38%の90kDaの亜種という適当な含有量を有するF8_AD2_90kDaと称される第2の出発材料をこの目的のために使用する。その供給源とは無関係に、サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製ステップをスキップし、溶液をSourceQカラムに直接濃縮する。2つの異なるサイズの2つのカラムが利用可能である−どちらの出発材料の体積および総タンパク質含有量もスモールスケールSourceQカラムの容量を超えるので、カラム体積が7.0mLであるより大きなカラムを代わりに使用する。以下は、B14390000−30由来Bドメイン枯渇重鎖種の精製の結果に限定される。
ラージスケール(分取)精製の要約
FVIII亜種の分取精製プロセスは、最初の分離のためのMonoQでのAIEXステップ、最終精製のためのSuperdex 200樹脂でのSECステップ、および最終的に、アニオン交換樹脂Source30Qでの濃縮ステップを包含する。全長鎖ならびに2つの短縮型断片は、妥当な精製成功のためにはこれらの3つのステップを通過しなければならない。Bドメイン枯渇断片は精製が容易な例外であり、これは、最終精製ステップをスキップし、アニオン交換ステップに単に適用される。図43は、本発明の間に駆動される完全な精製プログラムの概要を示す。違うようにグリコシル化されたバリアント全てを含めた、分子量180kDaの全長重鎖には、総数で4回のAIEX精製実行、3回のSEC実行および濃縮のために3回のAIEX実行が必要であった。これにより、全ての全長重鎖バリアント、ならびに両方の軽鎖バリアントを含む標的タンパク質62.97mgがもたらされた。不純物のパーセンテージは、6.84%である、または言い換えれば、最終生成物プールは93.16%の純度を示し、タンパク質の量および純度に関する目標が実現される。不純物は主に2つの短縮型重鎖種から生じる。150kDaの短縮型重鎖断片は、精製が最も困難なものの1つである。短縮型重鎖種(150kDa)および両方の軽鎖バリアントを含むどちらかというと少量の標的タンパク質6.74mgをもたらすために総数で4回のMonoQでのAIEX実行、4回のSEC最終精製実行および濃縮のための2回のAIEX実行が必要であった。ほぼ排他的に全長重鎖から生じる不純物のパーセンテージは10%(8.04%)よりも下に保つことができ、これは、目標に見合う。110kDaの短縮型重鎖種を、5回のAIEX精製実行、その後の5回のSEC最終精製実行、および最終的に、2回のAIEX濃縮実行によって精製した。最終的な110kDaの短縮型重鎖断片8.57mgは、6.31%の不純物を示し、これは、他の亜種の全てによって引き起こされる。Bドメイン枯渇重鎖断片では、7回のAIEX実行およびラージスケールSource30Qカラムでの2回のAIEX濃縮実行が必要であった。この精製プロセスにより、90kDaの亜種バリアントの両方と2つの軽鎖バリアントの組合せを含むタンパク質総量15.31mgがもたらされた。不純物のパーセンテージは正確に5.00%であり、これは、全ての亜種の中で最低の不純物のパーセンテージ数であるが、中間の最終精製ステップは実施されていない。したがって、Bドメイン枯渇重鎖断片に関しては両方の目標が実現される。結論として、不純物が<10%という限界に関する目標は全ての亜種について実現することができた。タンパク質の総量は、全長重鎖断片については、出発材料中の存在量が多いことに起因して非常に満足のいくものであるが、Bドメイン枯渇重鎖断片についての結果も適正な範囲内に入る。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−材料および方法
以下に、「精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け」に関する全ての実施例について実験の詳細を示す。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)において産生されたFL−rFVIII(市販のFL−rFVIII製品のプロセス中間材料、0.23mg/ml)、FL−rFVIIIの歴史的ロット、および市販の凍結乾燥した血漿FVIII製品は、Shire、Vienna、Austriaによって提供された。化学物質は、Sigma Aldrich、MO、USAから購入した。別段の指定のない限り、FL−rFVIIIはヒトFL−rFVIIIを指し、pdFVIIIはヒトpdFVIIIを指す。
vWFを含まないpdFVIIIを市販の凍結乾燥した血漿FVIII製品から精製した。多数のバイアルの再構成をバッファー溶液で実施し、その後、プールして均一な出発材料を実現した。vWFおよびFVIIIの分離を化学的手段によって誘導した。FVIIIの捕捉を抗FVIIIアフィニティーカラムで実施した。vWFのさらなる枯渇を強力なカチオン交換クロマトグラフィーによって実現した。最終的に、バッファー交換および濃縮のために強力なアニオン交換樹脂での追加的な最終精製ステップを実施した。
SDS−PAGEを、Novex NuPAGE SDS−PAGE system(ThermoFisher Scientific、MA、USA)を使用して行った。試料(各50μl)を0.5Mのヨードアセトアミド20μlと混合し、37℃で30分インキュベートした。その後、脱イオン水15μl、NuPAGE LDS サンプルバッファー25μlおよびNuPAGE還元剤10μlを反応混合物に添加し、37℃で30分にわたってインキュベーションを継続した。各試料10μl(30ng)およびprecision plus unstained protein standard(Bio−Rad、CA、USA)2μlをNuPAGE 7%Tris−酢酸ミニゲルにローディングした。電気泳動を150Vで90分にわたって実行した。タンパク質バンドをSilverQuest銀染色キット(ThermoFisher Scientific)を用いて可視化した。
Bドメインの平均疎水性親水性指標を算出するために、Vector NTI Advance 11からのBioAnnotatorツールを使用した。
rFVIIIの構造モチーフを特徴付けるために、水素/重水素交換質量分析(HDX−MS)を実施した。タンパク質構築物の局所アミドHDXカイネティクスを3秒、10秒、30秒、2分、10分、60分、3時間および3日間のインキュベート時間後に追跡した。HDX反応は、3秒のインキュベーション反応を6℃で行った以外は全て、室温(22℃)で実施した。rFVIII分子種B70−rFVIIを重水素化バッファー(50mMのTrisバッファー、pH6.7、5mMのCaCl2および260mMのNaClを含有する)と混合することによってHDX標識付け反応を開始した。100mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンおよび3.3Mの尿素を含有する氷冷100mMリン酸バッファー、pH2.3を添加することによって反応を停止させ、その後、液体窒素で瞬間凍結した。重水素化された試料を、ブタ胃粘膜由来のペプシン−アガロース(Sigma−Aldrich)を充填し、2×10mmのC18プレカラム(ACE)で脱塩したHPLCカラム(2.1×30mm)(ACE、Aberdeen、UK)を使用して消化した。消化ペプチドを、2×50mmのHALO C18/1.8μmカラム(AMT、DE、USA)を使用した、MS(LC−MS)とカップリングした液体クロマトグラフィーに供した。アセトニトリルグラジエントによってペプチドを溶出し、Orbitrap XL質量分析計(m/z400で60,000分解能)(ThermoFisher Scientific)で分析した。重水素化されていないタンパク質試料の、重水素化された試料と同じ手順を使用した3回の独立したLC−MS/MS分析によって消化ペプチド同定を実施した。
FVIII活性測定を、市販のFVIII発色活性アッセイキット(Siemens Healthcare、Erlangen、Germany)に従い、自動凝固分析機器(BCS XP)(Siemens Healthcare)で実施した。簡単に述べると、未知量の機能的FVIIIを含有する試料を、トロンビン、活性化された凝固第IX因子(FIXa)、リン脂質、凝固第X因子(FX)およびカルシウムを含有するバッファーからなる反応混合物に添加した。トロンビンによる切断後、FVIIIaはリン脂質、FIXaおよびカルシウムと複合体と形成し、その結果、FXが活性化される。活性化されたFX(FXa)を、FXaに特異的な発色性p−ニトロアニリン基質の切断を通じて光度測定により測定し、これは試料中に存在する機能的FVIIIの量と正比例した。標準品はWHO国際標準に対して較正された市販のFL−rFVIII(Shire)であった。
全てのFVIII試料を、0.9mMのCaCl2および0.5mMのMgCl2を含有するPBS(PBS++)に対して透析し、タンパク質濃度が0.122μM、0.244μMまたは0.61μMのいずれかになるまで希釈した。再現性を確実にするために、全ての実験を少なくとも2回実施した。
タンパク質濃度が高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPLC−SEC)分析のために0.122μMであるか、または動的光散乱(DLS)分析のために0.61μMであるFVIII試料を全て、Synergy H4 Hybrid Reader(BioTek、VT、USA)中プレートシーラーで覆ったポリスチレン96ウェルマイクロプレート(Corning、NY、USA)中、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃または50℃のいずれかで20時間、10分ごとに20秒間培地を振とうしながらインキュベートした。その後、試料を−80℃で凍結させ、DLSおよびHPLC−SEC分析時まで置いた。
全てのFVIII試料(0.122μM)を、PST−60HL plusサーモシェーカー(Biosan、MI、USA)中、プレートシーラーで覆ったポリスチレン96ウェルマイクロプレート(Corning)中、45℃で24時間インキュベートした。試料を種々の時間間隔後に抜き取り、−80℃で直ちに凍結させ、HPLC−SECによる試験まで置いた。
シードを調製するために、FVIII試料(0.122μM)をPST−60HL plusサーモシェーカー(Biosan)中、プレートシーラーで覆ったポリスチレン96ウェルマイクロプレート(Corning)中、45℃で2、5、8または18時間インキュベートした。ネイティブなFVIII試料(0.122μM)をそれらの対応するシードと1:1で混合し、45℃における時間依存性凝集を実施した。試料をHPLC−SEC分析まで−80℃で保管した。
タンパク質濃度0.244μMのFVIII溶液を使い捨てOmnifixシリンジ(Braun、Melsungen、Germany)中で、手動で10分間撹拌した。溶液をTerumo Europe、Belgiumからの「Winged infusion sets with needle protection」(23G×3/4’’;L=35cm、V=0.25mL)によって注入することによってずり応力を誘導した。この十分に制御されたストレス条件は、再構成および適用の間のrFVIII製品の潜在的な取り扱いミスを表すことを意図している。ストレス条件への曝露後の全ての試料をフローサイトメトリーに基づく粒子分析まで−80℃で保管した。
Malvern NanoZetasizer ZSP(Malvern Instruments、Malvern、UK)を使用してDLSを実施した。全ての試料(0.244μM)を10,000rpmで5分間遠心分離し(Centrifuge 5415C)(Eppendorf、Vienna、Austria)、試料60μLをZEN0040使い捨てマイクロキュベットに充填した。操作温度を25℃に設定し、平衡化時間を2分間とした。角度を173°後方散乱に設定して、タンパク質の流体力学的直径を決定した。このパラメータを、DLSによってタンパク質の有効なサイズを分析するために使用した。試料当たり最低3回の実行を測定して平均結果を得た。
HPLC−SECを、室温で、HPLC 1260 infinity system(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)とカップリングしたTSKgel G4000SWxlカラム(7.8×300mm)(Tosoh Bioscience、Tokio、Japan)およびTSKガードカラム(6×40mm)(Tosoh Bioscience)を使用して実施した。SECを、50mMのTris−HCl、5mMのCaCl2、400mMのNaClおよび0.05%NaN3、pH7.0からなる水性バッファーを使用し、定組成条件下、流速0.3ml/分で行った。試料体積100μl(タンパク質濃度0.122μM)を1mMのチオフラビンT(ThT)3μlと混合し、その後、カラムにローディングした。蛍光検出を用いてタンパク質の溶出をモニタリングするために、励起および放出波長をそれぞれ280nmおよびゼロ次に設定した。ThT蛍光を440nm励起およびゼロ次放出を用いてモニタリングした。空隙容量(保持時間18.0〜21.2分)、保持時間21.2〜27.0分および27.0〜43.0分を用いたピーク溶出を、それぞれ可溶性タンパク質凝集体、オリゴマーおよび単量体と名付けた。凝集体、オリゴマーおよび単量体の量をクロマトグラムにおける全てのピークの総面積に対するパーセンテージとして算出した。ThT結合をThT蛍光シグナルと内因性タンパク質蛍光シグナルの比として算出した。タンパク質に基づくゲル濾過標準物質(Bio−Rad)を試料の間に分析して、最適なカラム性能をモニタリングした。全ての試料を順不同で分析した。
曲線あてはめをGraphPad Prism6によってコンピュータ処理した。オリゴマー形成についてのカイネティクス速度定数(koligo[h−1])を、方程式:y=y0+(プラトー−y0)*[1−exp(−koligo*x)];y=オリゴマー量[%];x=時間[h];y0=xがゼロである場合のy値;プラトー=無限時間でのy値である)に従ってデータを一相会合モデルにあてはめることによって導き出した。凝集体の形成速度(kagg[h−1])を、方程式:y=ymin+(ymax−ymin)/(1+exp[(x1/2−x)/(1/kagg)];y=凝集体量[%];ymin=停滞期のy;ymax=凝集終了後のy;x=時間[h];x1/2=yが最大半量になる時間(Uversky et al., 2001)に従ってデータをBoltzmann S字モデルにあてはめることによって導き出した。
肉眼では見えない粒子を検出し、特徴付けるためのフローサイトメトリーに基づく粒子分析方法を使用した。フローサイトメトリーに基づく方法では、肉眼では見えない粒子を特徴付けるために、サイズ較正用ビーズ(Fluoresbrite(登録商標)YG Carboxylate Size Range beads)(Polyscience Inc.、PA、USA)、計数用ビーズ(CountBright(商標)Absolute Counting Beads)(Invitrogen Corp.、CA、USA)および蛍光プローブの組合せを使用する。タンパク質およびタンパク質を含有する粒子を肉眼では見えない非タンパク質粒子と区別するために、試料を蛍光色素4,4’−ジアニリノ−1,1’−ビナフチル−5,5’−ジスルホン酸二カリウム塩(Bis−ANS)で染色した。この方法は刊行物(Lubich et al., 2015)に詳細に記載されている。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−pdFVIIIとFL−rFVIIIの類似した不均一性
以下の実験において、目的は、Bドメイン、ならびにFL−rFVIIIおよび血漿由来(pd)FVIIIにBドメインが存在することに起因する天然の不均一性の、タンパク質安定性および凝集に対する影響を調査することであった。Bドメインの構造特性を試験し、可変Bドメイン含有量を有するFL−rFVIII、pdFVIIIおよび精製されたrFVIII分子種の物理的ストレスに抵抗する能力を比較し、それらの凝集挙動を探求した。観察に基づいて、FL−rFVIIIおよびBDD−rFVIII凝集の図式モデルを構築し、FVIII分子の安定性を確実にすることにおけるBドメインおよび分子不均一性の新しい役割が示唆された。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−rFVIII分子種の精製および特徴付け
単一のFVIII分子種をCHO由来FL−rFVIIIから、サイズ排除クロマトグラフィー法およびイオン交換クロマトグラフィー法を適用することによって精製した。BDD−rFVIII、B20−rFVIIIおよびB70−rFVIIIを、それぞれC4 HPLC分析に基づいて95%、94%および92%の純度まで単離した(データは示していない)。それぞれの種のLCについては75kDaの一定の見かけの分子量バンドが観察されたが、B70−rFVIII、B20−rFVIIIおよびBDD−rFVIIIのHCでは、様々な量のBドメインに起因して、それぞれSDS−PAGEゲルで150、110および90kDaの見かけの分子量が示された(図44の左側の画像、レーン3〜5)。精製されたrFVIII種の完全性をHPLC−SECによってさらに実証した(図51)。B100−FVIIIは以下では使用しない。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−Bドメイン構造特性
Bドメインは、全体的な疎水性が低いアミノ酸配列を有する。KyteおよびDoolittle(Kyte et al., 1982)による疎水性親水性指標の平均は総Bドメインアミノ酸配列について0.751と算出された。低疎水性のクラスターはBドメイン配列の中で一様に分布する。B100−rFVIII、B70−rFVIIIおよびB20−rFVIIIのBドメイン配列は、それぞれ−0.779、−0.741および−0.896の同様の平均疎水性親水性指標値を示す。低疎水性は、一般には、Uversky(Uversky et al., 2002)によって詳細に検討されている通り、ネイティブにアンフォールディングされたタンパク質を特徴付ける。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−温度の上昇におけるFL−rFVIIIおよびrFVIII分子種の凝集挙動
FL−rFVIII、B70−rFVIII、B20−rFVIIIおよびBDD−rFVIIIの温度依存性凝集挙動を調査した。試料を温度の上昇(25〜50℃)に曝露し、DLSおよびHPLC−SECによって分析した(図45)。強度で重み付けられたタンパク質凝集体の流体力学的直径の平均を記載するZ平均はFL−rFVIIIおよびrFVIII種について25から35℃では変化しなかった。試験品目全てについて40℃から始まってZ平均の増加が観察されたが、rFVIII試料間で明白な差異があった。他方では、25〜50℃で観察された凝集体平均サイズの増大倍率は、BDD−rFVIIIについては9.2、およびB20−rFVIIIについては6.4であり、B70−rFVIIIについては3.4、およびFL−rFVIIIについては2.5にしか達しなかった。45℃および50℃で20時間インキュベートした後に検出されたBDD−rFVIII凝集体は、それぞれ、FL−rFVIII凝集体と比較してサイズが2.5倍および3.1倍であった。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−FVIII凝集経路は分子不均一性およびBドメイン含有量に依存する
詳細な時間依存性凝集分析を、FVIII分子におけるコンフォメーションの変化の開始が報告された温度である45℃で実施した(Grillo et al., 2001、Ramani et al., 2005a)。45℃における凝集カイネティクス、その後のHPLC−SECにより、rFVIII分子種とFL−rFVIIIの間で凝集体の経路およびオリゴマー形成に明白な差異が明らかになった(図46)。使用するカラムの排除限界に基づいて、凝集体を、空隙容量で溶出する50〜100nmのサイズ範囲の可溶性タンパク質凝集体と定義した。オリゴマー(保持時間:21.2〜27.0分)を、サイズ排除カラムによって遅延するがタンパク質単量体よりも前に溶出する10〜50nmのサイズ範囲のタンパク質構造と定義した(保持時間:27.0〜43.0)。全てのFVIII試料のオリゴマー形成が一相会合曲線に従ったが、分析された分子が含有するBドメインが少ないほど、より急速にオリゴマーが形成された(図46A)。FL−rFVIII、B70−rFVIII、B20−rFVIIIおよびBDD−rFVIIIのオリゴマー形成の速度定数(koligo)は、それぞれ0.13±0.02、0.12±0.05、0.35±0.24および0.70±0.24h−1と算出された。凝集曲線はS字形状を示し、凝集体の形成率(kagg)は、重ねて、明白にBドメイン含有量応じて変動する(図46B)。Bドメインの不在下では、凝集体はより急速かつ過剰に形成された;kagg(FL−rFVIII)=0.11±0.00h−1、kagg(B70−rFVIII)=0.18±0.02h−1、kagg(B20−rFVIII)=0.21±0.07h−1、kagg(BDD−rFVIII)=0.21±0.08h−1。BDD−rFVIIIのオリゴマーの量は8時間後に最大22%まで増加し、その後連続的に減少したが、BDD−rFVIIIの凝集体の数量は、24時間インキュベートした後、1hの停滞期で48%まで過剰に増加した(図46D)。B20−rFVIIIオリゴマー含有量の最高値(31%)が17時間後に観察され、B20−rFVIII凝集体濃度(31%)は24時間後に同じであった。22〜24時間後に33%のB70−rFVIIIおよび44%のFL−rFVIIIオリゴマーがプラトーレベルで形成されたが、インキュベート時間の最後に、B70−rFVIIIおよびFL−rFVIIIについてそれぞれ17%および11%というほんの少しの凝集体含有量が観察された。FL−rFVIIIおよびBDD−rFVIIIの凝集経路は、それぞれ図46CおよびDに示されている通り、非常に好ましくなかった。pdFVIIIの凝集(図46E)は、FL−rFVIIIと非常に類似した経路に従い、速度定数koligo(pdFVIII)=0.24±0.04およびkagg(pdFVIII)=0.15±0.03h−1であった。オリゴマーおよび凝集体の形成速度と一致して、BDD−rFVIIIの単量体の消失はFL−rFVIIIおよびpdFVIIIと比較してより速かった(図46F)。試験した試料それぞれのFVIII活性は、単量体濃度の低下に応じて低下した(データは示していない)。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−凝集体の構造的差異によって誘発される凝集経路の分岐
検出された凝集挙動の差異の原因を調査するために、45℃で24時間インキュベートした後のrFVIII分子種、FL−rFVIIIおよびpdFVIIIのオリゴマーおよび凝集体に結合した際のThT蛍光をHPLC−SECによって分析した。ThTは、一般に使用される蛍光色素であり、クロスβシートリッチ構造に結合すると、蛍光の増強を示す(Biancalana et al., 2010)。ThTの凝集したFVIIIタンパク質構造への結合能力を、ThT蛍光と内因性タンパク質蛍光の比として表した(図47)。BDD−rFVIIIのオリゴマーへのThT結合の増加が、Bドメインを含有する種(B20−rFVIIIおよびB70rFVIII)のBドメインのオリゴマーと、ならびにFL−rFVIIIおよびpdFVIIIと比較して観察された。BDD−rFVIIIの凝集体では、FL−rFVIIIおよびpdFVIIIと比較してThT結合能力の3倍を超える増強が示された。さらに、B20−rFVIII凝集体のThT蛍光は、B70−rFVIII凝集体について観察されたものよりも大きかった。FL−rFVIIIおよびpdFVIIIのオリゴマーおよび凝集体へのThT結合の際に測定された蛍光は非常に類似していた(図47)。ThT蛍光と280nmにおけるタンパク質吸収シグナルの比により、試験したFVIII試料間で、ThT/内因性タンパク質蛍光比と比較して同じThT結合の差異が示された。いずれの分析したFVIII試料でも単量体へのThT結合は検出されなかった。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−FVIII凝集の均一シーディング
凝集体を含有するクロスβシートは、ストレス条件に際してさらなるタンパク質凝集の核となるシードとして機能することが公知である(Gsponer et al., 2006、Jarrett et al, 1993)。凝集したBDD−rFVIII、B70−rFVIIIおよびFL−rFVIII(45℃で2、5、8または18時間)のそれぞれの試料の凝集プロセスにシーディングする能力を探求した。図48は、50%の予め形成されたシードを含有するFVIII試料の、シーディングされていないFVIII試料と比較した時間依存性オリゴマーおよび凝集体の形成を示す。B70−rFVIIIおよび不均一FL−rFVIIIの均一シーディング(それぞれ図48BおよびC)では、オリゴマー形成および凝集挙動は変更されなかった。Bドメインを欠くrFVIII分子種は異なる機構を示す。BDD−rFVIIIの最初の迅速なオリゴマー形成後、均一なシードの添加と共に曲線は平らになり、最終的に、10%のオリゴマー飽和濃度に達した。BDD−rFVIII凝集体の形成の停滞期は添加されるシードの型に応じて短縮した。45℃で8または18時間にわたってインキュベートすることによって生成したシードの添加後、BDD−rFVIII凝集曲線の停滞期は完全に消失した(図48A)。停滞期の短縮は、生物学的治療薬(biotherapeutic)であるインスリンを含めたいくつかのタンパク質に関して以前に記載されている核生成依存性重合の典型的な特性である(Arosio et al., 2015、Surmacz-Chwedoruk et al., 2014)。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−撹拌およびずり応力下での肉眼では見えないFVIII粒子の形成
臨床的に関連するストレス条件をFL−rFVIII、pdFVIIIおよびrFVIII分子種に対して撹拌およびずり応力を適用することによってシミュレートした。0.75〜70μmのサイズの誘導された肉眼では見えないタンパク質含有粒子は、HPLC−SECの分析範囲を超え、フローサイトメトリーに基づく方法によって検出された(Lubich et al., 2015、Nishi et al., 2014)。撹拌およびずり応力への曝露後の、肉眼では見えないタンパク質含有粒子の検出濃度はFL−rFVIIIおよびpdFVIIIにおいて同様のレベルに達し、2.4〜4.2×106計数/mlの範囲であった(それぞれ平均値3.1×106計数/mlおよび3.2×106計数/ml)。BDD−rFVIIIにおいて有意に高い濃度が検出された(平均値6.0×106計数/ml;4.9〜6.9×106計数/mlの範囲)。Bドメイン短縮型分子種の肉眼では見えないタンパク質含有粒子濃度は、それぞれの種のBドメイン含有量に依存し、B20−rFVIII(平均値5.5×106計数/ml)ではB70−rFVIII(平均値3.9×106計数/ml)よりも高かった(図49)。ストレスを与えていない試料は、0.4〜4.6×104計数/mlの範囲の肉眼では見えないタンパク質粒子濃度を示した。
精製されたFVIII亜種の機能的特徴付け−結果の考察
前の実施例において、CHO細胞において発現させたヒトFL−rFVIIIの不均一性、安定性および凝集挙動を調査し、高度に精製されたヒトpdFVIII、可変量のBドメインを含有する精製されたrFVIII分子種と比較した。Bドメインの構造特性を探究し、FVIII分子の安定化におけるそれらの潜在的な役割に取り組む。
FVIII種のタンパク質濃度の決定
FVIII種のタンパク質濃度をどのように決定することができるかの例を以下に示す。
アミノ酸配列に基づき、全てのシステインがジスルフィド結合していると仮定して、280nmにおける吸収係数を算出した。チロシン硫酸化は算出に含めなかった。
280nmにおけるFVIII試料の吸収を分光光度により決定した。濃度を
濃度(mg/ml)=測定された吸収/280nmにおける吸収係数
に従って算出した。
精製された組換えFVIII種およびそれらの混合物の活性
精製された組換えFVIII(rFVIII)種およびそれらの混合物の活性を測定し、FL−rFVIII(SOS−E)および血漿由来(pd)FVIIIの活性と比較した。
・発色活性アッセイ
・一段凝固アッセイ
・較正された自動トロンボグラフィーによる組織因子誘発性トロンビン生成アッセイ
によって測定した。
・精製されたrFVIII種(90kDa、110kDa、150kDa、180kDa)
・混合物:90kDa種、110kDa種、150kDa種および180kDa種のAdvate(C4クロマトグラフィー分析データに基づく)に存在するモル比での混合物
・SOS−E:FL−rFVIII、種精製の出発材料
・pdFVIII
FVIII試料 濃度(μg/ml)
90kDa 40
110kDa 42
150kDa 46
180kDa 55
混合物 52
SOS−E 52
pdFVIII 52
一段凝固アッセイ
一段凝固アッセイによるFVIII活性を、市販のaPTT試薬、アクチンFSL(Siemens、Germany)を用いて自動凝固分析機器(BCS XP、Siemens、Germany)で実施した。未知量の機能的FVIIIを含有する試料をヒトFVIII欠乏血漿および活性化因子と混合する。+37℃でインキュベートした後、塩化カルシウムを添加することによって凝固を開始させ、血餅形成までの時間を記録する。凝固時間は、試料中のFVIII濃度に間接的に比例する。結果をIU FVIII/mL、参照曲線からの読み取りで示す。標準品はWHO国際標準に帰することができる全長rFVIIIであった。
FVIII活性アッセイを、市販の試薬(Siemens、Germany)を用い、自動凝固分析機器(BCS XP、Siemens)で実施した。発色アッセイの第1のステップでは、未知量の機能的FVIIIを含有する試料を、トロンビン、活性化されたFIX(FIXa)、リン脂質、FXおよびカルシウムを含有するバッファーからなる反応混合物に添加する。FVIIIがトロンビンによって活性化される。活性化されたFVIII(FVIIIa)はリン脂質、FIXaおよびカルシウムと複合体を形成し、その結果、第X因子(FXa)が活性化される。発色アッセイの第2のステップでは、FXaをFXaに特異的なペプチドニトロアニリド基質の切断を通じて測定する。P−ニトロアニリンが生成し、それにより、405nmにおける吸光度によって光度測定で測定することができる色がもたらされる。生じる色は、試料中に存在する機能的FVIIIの量に正比例する。標準品はWHO国際標準に対して較正された全長FVIIIであった。
トロンビン生成アッセイ(TGA)の一種である較正された自動トロンボグラフィー(CAT)は、ex vivoにおける有効性パラメータとして、および研究ツールとして臨床研究における使用が増加している包括的止血アッセイである。トロンボグラムは、凝固血漿中のトロンビンの濃度を記載するものであり、したがって、生理的条件に近いところでの止血系の機能試験である。当該アッセイは、組織因子による凝固の開始時から経時的な、トロンビンによる蛍光発生基質Z−G−G−R−AMCの切断によって生じる蛍光の測定に基づく。当該アッセイは、96ウェルプレート蛍光光度計であるThrombograph(商標)で実施され、また、内部フィルター効果、血漿の色のドナー間の変動性、基質枯渇および機器による差異を補正するために必要なトロンビン較正物質を使用する。
・遅延時間[分]:凝固時間、トロンビン生成の開始を表す
・ピークまでの時間[分]:最大量のトロンビンが生成するまでの時間
・トロンビンピーク[nM]:形成される最大トロンビン濃度
・内在性トロンビン潜在性(ETP)[nM 分]:生成されるトロンビンの総量を表すトロンビン生成曲線下面積。
濃度0.244mMにおけるFVIII試料の一段凝固活性を図54Aに示し、比較している。濃度0.244mMにおけるFVIII試料の発色活性を図54Bに示し、比較している。FVIII試料の濃度0.25mM、0.5mMおよび1mMでのトロンビンピークおよび遅延時間を図55に示し、比較している。これらの結果から、精製されたrFVIII種およびそれらの混合物の全てで発色性および一段凝固FVIII活性アッセイにおいてSOS−Eと比較して活性の増大が示されたことが示される。pdFVIIIは発色活性アッセイではSOS−Eと同様の活性が示したが、一段凝固アッセイでは活性の増大を示した。精製されたrFVIII種、それらの混合物およびpdFVIIIの全てで、TF誘発性トロンビン生成アッセイにおいてSOS−Eと比較してトロンビンピークの増大が示された。試験した試料の全てでSOS−Eと比較して遅延時間の短縮が示された。
ADVATE BDSおよび中間体のフューリン成熟化
驚いたことに、図56は、単鎖FVIIIが種々の市販のFVIII製品中に存在することを示す。したがって、フューリン成熟化によりFL−rFVIIIの活性の増大が導かれるかどうかを試験した。試料およびそれらの調製を以下に記載する:
SOS−E:最終精製ステップを伴わないAdvateプロセス中間体
ADVATE BDS
バッファー:陰性対照
A:ネイティブな試料
B:ネイティブな試料+フューリンストック100μl+Milli−Q 22.4μl
C:ネイティブな試料+フューリンバッファー100μl+Milli−Q 22.4μl
D:ネイティブな試料+フューリンストック100μl+阻害剤ストック22.4μl
E:ネイティブな試料+フューリンバッファー100μl+阻害剤ストック22.4μl
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(項目1)
第VIII因子(FVIII)亜種を、FVIIIを含む組成物から精製するための方法であって、
(1)前記FVIIIを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(2)前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(3)前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記濃縮ステップ(3)が、前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップである、項目1に記載の方法。
(項目3)
FVIIIが組換えFVIII(rFVIII)であり、FVIII亜種が組換えFVIII(rFVIII)亜種である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記FVIII亜種が、FVIII軽鎖と会合したFVIII重鎖である、項目1から3までのいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
ステップ(1)において、ビーズサイズが20μm未満の高分解能Q−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目1から4までのいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
ステップ(2)において、分解能が10000Da〜60000Daにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、項目1から5までのいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
ステップ(1)の前に、以下のステップ(0):
(0)前記組成物中に含まれるFVIIIをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目1から6までのいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
ステップ(1)の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施し、前記リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが、少なくとも約16カラム体積、少なくとも約24カラム体積、または少なくとも約32カラム体積である、項目1から7までのいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
ステップ(2)を、
(2)前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーがネガティブモードクロマトグラフィーである、ステップ
で置き換える、項目1から8までのいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記FVIII亜種が、FVIII軽鎖と会合したFVIII 90kDa重鎖であり、方法のステップ(2)を省略し、ステップ(3)において、前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液で前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液を置き換える、項目1から9までのいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
項目1から10までのいずれか一項に従って入手可能な精製されたFVIII亜種を含む組成物。
(項目12)
血友病Aなどの出血性障害の処置に使用するための、項目11に記載の組成物。
(項目13)
組換え第VIII因子(rFVIII)をフューリンプロテアーゼ処理に供する方法。
(項目14)
rFVIIIの活性を増大させるためのものである、項目13に記載の方法。
(項目15)
血友病Aなどの出血性障害の処置に使用するための、rFVIIIを含む組成物であって、前記rFVIIIが、項目13または14に従って入手可能である、組成物。
Claims (15)
- 第VIII因子(FVIII)亜種を、FVIIIを含む組成物から精製するための方法であって、前記FVIII亜種が、FVIII軽鎖と会合したFVIII重鎖であり、前記方法が、
(1)前記FVIIIを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(2)前記FVIII亜種を含むステップ(1)の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップと、
(3)前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液を濃縮するステップと
を含む、方法。 - ステップ(1)の前に以下のステップ(0)
(0)前記組成物中に含まれるFVIIIをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記FVIII軽鎖が、FVIII 80kDa軽鎖である、請求項2に記載の方法。
- 前記濃縮ステップ(3)が、前記FVIII亜種を含むステップ(2)の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記FVIII亜種を含む溶出液を収集するステップである、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(3)において、SourceQ樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、請求項4に記載の方法。
- FVIIIが組換えFVIII(rFVIII)であり、FVIII亜種が組換えFVIII(rFVIII)亜種である、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記FVIII亜種が、FVIII軽鎖と会合したFVIII 180kDa重鎖、またはFVIII軽鎖と会合したFVIII 150kDa重鎖、またはFVIII軽鎖と会合したFVIII 110kDa重鎖、またはFVIII軽鎖と会合したFVIII 90kDa重鎖である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)において、ビーズサイズが20μm未満の高分解能Q−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(2)において、分解能が10000Da〜60000Daにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施し、前記リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが、少なくとも約16カラム体積、少なくとも約24カラム体積、または少なくとも約32カラム体積である、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- 精製された第VIII因子(FVIII)亜種を含む組成物であって、前記FVIII亜種が、FVIII軽鎖と会合したFVIII重鎖である、組成物。
- 前記組成物中の前記精製されたFVIII亜種の前記組成物中の他の全てのFVIII亜種に対する重量比が、少なくとも9、または少なくとも8である、請求項11に記載の組成物。
- 前記精製されたFVIII亜種の濃度が、少なくとも0.1mg/mL、または少なくとも0.3mg/mLである、請求項11または12に記載の組成物。
- 出血性障害の処置に使用するための、請求項11から13までのいずれか一項に記載の組成物。
- 血友病Aの処置に使用するための、請求項11から14までのいずれか一項に記載の組成物。
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JP2022096408A JP2022123035A (ja) | 2017-06-23 | 2022-06-15 | 第viii因子亜種の精製 |
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