JP2020522244A - 糖原病ｉｉｉ型のための治療薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するための一連の翻訳可能なポリヌクレオチドおよびオリゴマー分子を提供する。ポリヌクレオチドおよびオリゴマー分子は、ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能である。分子は、細胞または対象において活性ポリペプチドまたはタンパク質を発現するための活性薬剤として使用されることができる。この薬剤は、対象においてアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する疾患または状態を改善、予防、発症遅延、または治療するための方法において使用されることができる。
【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／５１３，３５０号の優先権を主張するものであり、この仮出願は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、分子生物学および遺伝学の分野、ならびに翻訳可能な分子から生成される生物製剤および治療薬に関する。より具体的には、本発明は、インビボにおいて、および治療薬として使用するための、活性ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される能力を有する分子についての方法、構造、および組成物に関する。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式コピー（ファイル名：ＵＬＰＩ＿０４１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１８年５月３０日、ファイルサイズ：２２６キロバイト）。

糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤＩＩＩまたはＣｏｒｉ病としても知られている）は、アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）として知られるグリコーゲン脱分岐酵素の欠損によって引き起こされるグリコーゲン代謝の稀な（発生率１：１００，０００）先天異常である。この常染色体劣性代謝障害は、さまざまな肝臓、心筋、および骨格筋の関与により特徴付けられる。

欠損酵素であるＡＧＬの組織発現の違いに基づいて、ＧＳＤＩＩＩには４つのサブタイプがある。ＧＳＤＩＩＩａは、全ＧＳＤＩＩＩの約８５％を占め、肝臓および筋肉の両方における酵素欠損に起因して、肝臓および筋肉の病変を呈する。ＧＳＤＩＩＩｂは約１５％を占め、通常、肝臓のみにおける酵素欠損に起因して、肝臓の病変のみを呈する。一方、ＧＳＤＩＩＩｃとＧＳＤＩＩＩｄは両方とも非常に稀（ｒａｔｅ）であり、ＧＳＤＩＩＩｃは、グルコシダーゼ脱分岐活性の欠損に起因すると考えられ、ＧＳＤＩＩＩｄは、トランスフェラーゼ脱分岐活性の欠損に起因すると考えられている。

乳児期および小児期早期では、肝病変は、ケトン性低血糖、肝腫大、高脂血症、および肝トランスアミナーゼ上昇として現れる。青年期および成人期では、肝疾患は目立たなくなる。肥大型心筋症は、通常小児期に、ＧＳＤＩＩＩａ患者の大部分で発症する。大多数においては無症状であるが、重度の心機能障害、うっ血性心不全、そしてまれに突然死にまで至り、その臨床的意義には幅がある。衰弱として現れる骨格筋ミオパシーは、通常小児期には明らかではないが、ゆっくりと進行し、通常は成人で顕著となる。

影響を受ける臓器と一致して、ＧＳＤＩＩＩ患者の血清には、高いアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、および／またはクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）活性が頻繁に存在する。

上記のように、ＧＳＤＩＩＩは、ＡＧＬの欠損によって引き起こされる。この欠損は一般に、ＡＧＬ遺伝子の遺伝性変異（複数可）に起因すると考えられ、ＧＳＤＩＩＩに罹患した対象においてＡＧＬ酵素活性の部分的または完全な消失をもたらす。ＧＳＤＩＩＩ患者におけるＡＧＬタンパク質の分子解析は、いくつかの民族集団で実施されており、１００を超える異なるＡＧＬ変異が報告されている。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、２０１０、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１２：４２４−４３０を参照されたい。Ｓｅｎｔｎｅｒら、２０１３、ＪＩＭＤ Ｒｅｐ．７：１９−２６も参照されたい。

現在、ＧＳＤＩＩＩには効果的な治療法がない。多くの場合、夜間の経胃点滴栄養補給またはコーンスターチサプリメントを使用することにより、炭水化物を多く含む食事を頻繁に摂取して低血糖をコントロールする試みが行われている。一方、ミオパシーの患者は、日中の高タンパク食に加えて、夜間は経腸注入を行うことにより、治療されている。症状の一時的な改善は少数の患者で報告されているが、高タンパク食が進行性ミオパシーを予防または治療することを実証する長期データはない。Ｃｈｅｎ ＹＴ、Ｂｕｒｃｈｅｌｌ Ａ，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＲ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ、Ｓｌｙ ＷＳ、Ｖａｌｌｅ Ｄ、Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、１９９５：９３５−６５を参照されたい。進行性ミオパシーおよび／または心筋症は、成人の罹患率の主な原因であり、進行性肝硬変および肝癌を呈する患者が報告されている。したがって、この疾患の根底にある原因、すなわちＡＧＬ酵素活性の欠損に対処することができる治療が緊急に必要とされている。

現在まで、ＧＳＤＩＩＩにおけるＡＧＬなどの、おそらく細胞膜を介して外因性酵素を細胞質へと送達する効率的かつ特異的な細胞取り込み機序の欠失に起因して細胞質ゾルに欠損酵素が存在する疾患では、酵素置換は探求されてこなかった。

本発明は、ＧＳＤＩＩＩなどのＡＧＬ欠損に関連する疾患または状態を改善、予防、または治療することができる、活性ＡＧＬを提供するために細胞質で翻訳される能力を有する分子、構造、および組成物を提供することにより、上記の必要性に対処する。

本発明は、１又は２以上の活性ポリペプチドおよびタンパク質、またはその断片を提供するために使用され得る、翻訳される能力を有する新規分子を含む組成物を提供する。本発明はさらに、さまざまな障害の予防または治療のための新規分子を含むこれらの組成物の使用方法を提供する。より具体的には、本発明の実施形態は、活性アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）を提供する翻訳可能な分子を含む組成物、およびＧＳＤＩＩＩの治療のための組成物の使用方法を提供する。

本発明の翻訳可能な分子は、ＡＧＬポリペプチドまたはタンパク質を産生するための機能的な細胞質内活性を有し得る。ペプチドおよびタンパク質は、治療モダリティのために活性があり得る。

本発明の翻訳可能な分子は、特に細胞の細胞質において長い半減期を有し得る。翻訳可能な分子は、ＡＧＬ欠損に関連する疾患または状態を改善、予防、または治療するために活性がある製品を提供するように発現可能であり得る。

本開示は、ＡＧＬポリペプチドまたはタンパク質を産生するための翻訳可能な分子についての一連の構造を提供する。いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、翻訳される能力の増大、および／または天然ｍＲＮＡよりも長い半減期を有することができる。

本発明の翻訳可能な分子は、医薬品において、ならびに活性ポリペプチドおよびタンパク質を産生および送達するための方法および組成物において、使用することができる。本発明の翻訳可能な分子を使用して、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでポリペプチドまたはタンパク質を提供することができる。

本開示の実施形態は、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するための一連の新規のポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドおよび化学修飾ヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能であり得る。

さらなる態様では、本発明は、ヒトアミロアルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）、またはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するように１又は２以上のロックされていない核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＵＮＡ）モノマーを含む一連の新規な翻訳可能なオリゴマーを提供する。翻訳可能なオリゴマーは、天然ヌクレオチドおよび化学修飾ヌクレオチドと共に、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含むことができる。１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む翻訳可能なオリゴマーは、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能であり得る。

特定の態様では、本発明の翻訳可能な分子は、ポリペプチドまたはタンパク質、またはその断片の高効率な発現を提供することができる。発現は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の分子は、同じポリペプチドまたはタンパク質をコードする天然の成熟ｍＲＮＡよりも増大した細胞質半減期を有し得る。本発明の分子および組成物は、天然の成熟ｍＲＮＡに対して増大した機能的細胞活性を提供することができる。

さらなる態様では、本発明の翻訳可能な分子は、天然の成熟ｍＲＮＡと比較して、ペプチドまたはタンパク質産物を提供する薬剤としての増大した活性を提供することができる。本発明の翻訳可能な分子は、効果的な治療に必要とされる用量レベルを軽減し得る。

本発明の実施形態は以下を含む。

本発明の翻訳可能な分子を使用した、インビトロにおけるヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ、ＮＭ＿００００２８）の発現の結果を示す。図１は、参照分子５３４に対して正規化されたＡＭＬ１２およびＣ２Ｃ１２細胞におけるＡＧＬの相対的発現を示す。縦軸は、参照に対する倍率増大を反映しており、例えば、１０は、参照より１０倍増大している。参照分子を含む分子は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲおよびアフリカツメガエルゼノパスベータグロビン（ＸＢＧ）３’ＵＴＲを含む。分子は転写中にキャップされ、Ｎ^ｌメチルプソイドウリジンを用いて合成されたため、ウリジンの１００％がＮ^ｌメチルプソイドウリジンで置換された。ＡＧＬをコードする翻訳可能な分子は、２つの細胞株（ＡＭＬ１２、Ｃ２Ｃ１２）でトランスフェクトされた。細胞を溶解し、トランスフェクション後６時間で回収した。ＡＧＬに特異的な抗体（ａｂ１３３７２０、ウサギ）を使用してＡＧＬを検出するために、定量的ウエスタンブロットを実施した。 本発明の翻訳可能な分子を使用した、インビトロにおけるヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ、ＮＭ＿００００２８）の発現の結果を示す。図２は、参照分子５３４に対して正規化されたＡＭＬ１２およびＣ２Ｃ１２細胞におけるＡＧＬの相対的発現を示す。縦軸は、参照に対する倍率増大を反映しており、例えば、１０は、参照より１０倍増大している。参照分子を含む分子は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲおよびアフリカツメガエルベータグロビン（ＸＢＧ）３’ＵＴＲを含む。分子は転写中にキャップされ、Ｎ^ｌメチルプソイドウリジンを用いて合成されたため、ウリジンの１００％がＮ^ｌメチルプソイドウリジンで置換された。ＡＧＬをコードする翻訳可能な分子は、２つの細胞株（ＡＭＬ１２、Ｃ２Ｃ１２）でトランスフェクトされた。細胞を溶解し、トランスフェクション後２４時間で回収した。ＡＧＬに特異的な抗体（ａｂ１３３７２０、ウサギ）を使用してＡＧＬを検出するために、定量的ウエスタンブロットを実施した。 本発明の翻訳可能な分子を使用した、インビボにおけるヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ、ＮＭ＿００００２８）の発現の結果を示す。図３は、２４時間および４８時間の時点での翻訳可能な分子５２８および５３４（参照）についてのＷＴマウスにおけるＡＧＬの相対的発現を示す。分子は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲおよびアフリカツメガエルベータグロビン（ＸＢＧ）３’ＵＴＲを含む。分子は転写中にキャップされ、Ｎ^ｌメチルプソイドウリジンを用いて合成されたため、ウリジンの１００％がＮ^ｌメチルプソイドウリジンで置換された。ＡＧＬをコードする翻訳可能な分子は、それぞれ脂質ナノ粒子製剤中で調製され、１０ｍｇ／ｋｇでＷＴマウスに静脈内注射された。マウスの肝臓を２４時間と４８時間で採取し、ＡＧＬに特異的な抗体（ａｂ１３３７２０、ウサギ）を使用してＡＧＬを検出するために、定量的ウエスタンブロットを実施した。 本発明の翻訳可能な分子を使用した、インビボにおけるヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ、ＮＭ＿００００２８）の発現の結果を示す。図４は、ベースラインＰＢＳ（１００）と比較した、翻訳可能な分子５２５、５２７、５２８、５２９、および５４６の投与後のＷＴマウスにおけるＡＧＬの相対的肝臓発現を示す。ＡＧＬをコードする合成された翻訳可能な分子５２５、５２７、５２８、５２９、および５４６は、脂質ナノ粒子製剤中で調製され、ＷＴマウスにＩＰを介して注射された。注入された用量は１０ｍｐｋであり、さらなる分析のために６時間目に肝臓を採取した。ＡＧＬに特異的な抗体（ａｂ１３３７２０、ウサギ）を使用してＡＧＬを検出するために、定量的ウエスタンブロットを実施した。 ３つの翻訳可能な分子：５４６、１７８３、および１７８４からのヒトＡＧＬの発現の結果を示す。ヒト初代肝細胞にコドン最適化したｍＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクションの６、２４、４８、７２時間後にＩｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）によりＡＧＬタンパク質発現を測定した。ｍＲＮＡ配列の発現を未処理の対照（「ｕｎｔ」）と比較した。 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける脂質ナノ粒子と共に製剤化されたさまざまなｍＲＮＡ分子からのヒトＡＧＬの発現を示す。肝生検試料からのホモジネート中のｍＲＮＡ分子から発現した外因性ヒトＡＧＬのタンパク質濃度（ｎｇ／ｍｇ）は、多重反応モニタリングアッセイにより決定された。グラフ中５４６．１、７３６．１、７３８．１、７３７．１、７３１．１、および１７８３．１として示されている翻訳可能な分子は、実施例２で記載されるように、それぞれ５４６、７３６、７３８、７３７、７３１、および１７８３と同じである。一方、翻訳可能な分子５４６．７は、実施例２に記載されている５４６と同じ核酸塩基配列を有するが、翻訳可能な分子５４６を合成するために使用されたＮ^１−メチルプソイドウリジンではなく、ウリジンの代わりに５−メトキシウリジンを用いて合成された。 脂質ナノ粒子を用いて製剤化されたさまざまなｍＲＮＡ分子で処理した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける内因性マウスＡＧＬの発現を示す。肝生検試料からのホモジネート中で発現した内因性マウスＡＧＬのタンパク質濃度（ｎｇ／ｍｇ）は、多重反応モニタリングアッセイによって決定された。グラフ中５４６．１、７３６．１、７３８．１、７３７．１、７３１．１、および１７８３．１として示されている翻訳可能な分子は、実施例２で記載されるように、それぞれ５４６、７３６、７３８、７３７、７３１、および１７８３と同じである。一方、翻訳可能な分子５４６．７は、実施例２に記載されている５４６と同じ核酸塩基配列を有するが、翻訳可能な分子５４６を合成するために使用されたＮ^１−メチルプソイドウリジンではなく、ウリジンの代わりに５−メトキシウリジンを用いて合成された。 ビヒクル（「ＶＥＨ」）で処理したＡＧＬノックアウトマウスからの肝臓の組織病理学を示す。顕著ないし重度の肝細胞の空胞化、および中程度ないし顕著なグリコーゲン蓄積における増大が、ビヒクルで処理した肝細胞内で観察された。 ＡＴＸ２脂質ナノ粒子を用いて製剤化された翻訳可能な分子５４６で処理したＡＧＬノックアウトマウスからの肝臓の組織病理学を示す。軽度ないし中程度の肝細胞の空胞化のみ、および軽度ないし中程度の肝細胞内のグリコーゲン蓄積における増大のみが、ＡＴＸ２脂質ナノ粒子を用いて製剤化された翻訳可能な分子５４６で処理した肝細胞内で観察された。

本発明は、治療用途に使用される一連の新規薬剤および組成物を提供する。本発明の分子および組成物は、対象においてＧＳＤＩＩＩおよび／またはアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の存在または機能の低下に関連した疾患を改善、予防、または治療するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼを発現するための、合成の、精製された、翻訳可能なポリヌクレオチド分子を包含する。分子は、天然および化学修飾ヌクレオチドを含み、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）、またはＡＧＬ活性を有するその断片をコードし得る。

特定の実施形態では、本開示は、ヒトアミロアルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）、またはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するための１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む、合成の、精製された、翻訳可能なオリゴマー分子を含む。翻訳可能なオリゴマーは、１又は２以上のＵＮＡモノマー、ならびに天然ヌクレオチドおよび化学修飾ヌクレオチドを含むことができる。１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む翻訳可能なオリゴマーは、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能であり得る。

本明細書で使用されるとき、「翻訳可能な」という用語は、「発現可能な」という用語と互換的に使用されてもよく、ポリヌクレオチドまたはその一部が宿主細胞によってポリペプチドに変換される能力を指す。当技術分野で理解されているように、翻訳は、細胞の細胞質内のリボソームがポリペプチドを作成するプロセスである。翻訳では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、リボソーム複合体中、ｔＲＮＡによってデコードされ、特定のアミノ酸鎖またはポリペプチドを産生する。さらに、本明細書でオリゴマーに関して使用されるとき、「翻訳可能な」という用語は、オリゴマーの少なくとも一部、例えば、オリゴマー配列のコード領域（コード配列またはＣＤＳとしても知られる）がタンパク質またはその断片に変換されることが可能であることを意味する。

本明細書で使用されるとき、「モノマー」という用語は、同じまたは異なる種類の別の分子と結合してオリゴマーを形成することができる、単一の単位、例えば、単一の核酸を指す。いくつかの実施形態では、モノマーは、ロックされていない核酸、すなわち、ＵＮＡモノマーであってもよい。

一方、「オリゴマー」という用語は、「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、少なくとも２つのモノマーを含む分子を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡモノマーおよび／またはロックされていない核酸（ＵＮＡ）モノマーを含有するオリゴマーの場合、本発明のオリゴマーは、コード配列（ＣＤＳ）に加えて配列を含有することができる。これらの追加の配列は、非翻訳配列、すなわち、宿主細胞によってタンパク質に変換されない配列であり得る。これらの非翻訳配列は、５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、およびポリＡテール領域などのテール領域を含むことができる。本明細書でさらに詳細に説明されるように、これらの非翻訳配列のいずれもが、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含んでもよく、これらのＵＮＡモノマーは、宿主細胞の機構によって翻訳されることができない。本発明の文脈において、「翻訳可能なオリゴマー」、「翻訳可能な分子」、「翻訳可能なポリヌクレオチド」、または「翻訳可能な化合物」は、タンパク質またはその断片、例えば、ヒトＡＧＬタンパク質またはその断片に変換されることが可能である、ＲＮＡのコード領域（例えば、ヒトＡＧＬのコード配列またはそのコドン最適化バージョン）などの領域を含む配列を指す。

本明細書で使用されるとき、「コドン最適化」という用語は、タンパク質発現レベルを増大させるコードされたタンパク質アミノ酸配列を変更することなく異なるコドンを選択することにより再設計された天然（または天然の意図的に設計された変異体）コード配列を意味する（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６−５３）。高コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＣＡＩ）、ＬｏｗＵ法、ｍＲＮＡ二次構造、シス調節配列、ＧＣ含有量、および他の多くの類似変数などの変数は、タンパク質発現レベルと多少相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら、Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．２００６、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５）。高ＣＡＩ（コドン適応指数）法は、全タンパク質コード配列について最も頻繁に使用される同義のコドンを選択する。各アミノ酸のために最も頻繁に使用されるコドンは、ヒトゲノムの７４２１８個のタンパク質コード遺伝子から推定される。ＬｏｗＵ法は、Ｕ部分がより少ない同義のコドンに置換されることができるＵを含有するコドンのみを標的とする。置換にいくつかの選択肢がある場合、より頻繁に使用されるコドンが選択され得る。配列内の残りのコドンは、ＬｏｗＵ法によって変更されない。この方法は、５−メトキシウリジンを用いて合成されるコード配列を設計するために、開示されたｍＲＮＡと組み合わせて使用され得る。

本開示を備えた当業者には理解されるように、本発明の翻訳可能な分子は、対象においてアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する（例えば、濃度、存在、および／または機能の低下に起因する）任意の疾患または障害を改善、予防、または治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子は、ＧＳＤＩＩＩａ、ＧＳＤＩＩＩｂ、ＧＳＤＩＩＩｃ、およびＧＳＤＩＩＩｄ（本明細書では集合的にまたは個別に「ＧＳＤＩＩＩ」または「糖原病ＩＩＩ型」と称される）のうちの１又は２以上を改善、予防、または治療するための方法において使用されることができる。本明細書で治療される疾患または障害（例えば、ＧＳＤＩＩＩａ、ＧＳＤＩＩＩｂ、ＧＳＤＩＩＩｃ、またはＧＳＤＩＩＩｄ）は、低血糖（低血糖症）、肝臓の肥大（肝腫大）、血液中の過剰な脂肪量（高脂血症）、肝酵素の血中濃度の上昇、慢性肝疾患（肝硬変）、肝不全、低成長、低身長、良性腫瘍（腺腫）、肥大型心筋症、心機能障害、うっ血性心不全、骨格筋ミオパシー、および／または不十分な筋緊張（筋緊張低下）に関連してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を使用して、これらの前述の症状のいずれかまたは全てを改善、予防、または治療することができる。

当業者には理解されるように、ＧＳＤＩＩＩは、ＡＧＬ欠損症、Ｃｏｒｉ病、コリ病、脱分岐欠損症、Ｆｏｒｂｅｓ病、グリコーゲン脱分岐欠損症、ＧＳＤ３、または限界デキストリン症（細胞質ゾル内の限界デキストリン様構造に起因する）を含むが、これらに限定されない、当技術分野での任意の数の代替的な名称によって参照されることができる。したがって、ＧＳＤＩＩＩは、本明細書、実施例、図面、および特許請求の範囲でのこれらの代替的な名称のいずれかと互換的に使用することができる。

機能的ＡＧＬ部分をコードする本発明の翻訳可能な分子は、それを必要とする患者（例えば、ＧＳＤＩＩＩ患者）の肝臓、特に肝細胞に送達されることができ、患者の活性ＡＧＬレベルを上昇させることができる。翻訳可能な分子は、患者におけるＧＳＤＩＩＩの症状を予防、治療、改善、または逆転させるために使用されることができる。

さらなる態様では、本発明の翻訳可能な分子はまた、疾患を制御するために特定の食事へのＧＳＤＩＩＩ患者の依存を軽減するために使用することができる。例えば、本発明の翻訳可能な分子を使用して、頻繁な高炭水化物の食事および／またはタンパク質が異常に多い食事へのＧＳＤＩＩＩ患者の依存を軽減することができる。

本発明の実施形態はさらに、ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）を発現するように翻訳可能な分子を作製するためのプロセスを包含する。プロセスには、天然および化学修飾ヌクレオシド三リン酸の存在下でインビトロでＡＧＬ ＤＮＡ鋳型を転写して生成物混合物を形成することと、生成物混合物を精製して翻訳可能な分子を単離することと、が含まれる。翻訳可能な分子はまた、当技術分野で既知の方法によって作製されてもよい。

本発明の分子は、ＲＮＡおよび／またはＵＮＡモノマーを含有する翻訳可能な分子であり得る。これらの翻訳可能な分子は、特に細胞質において長い半減期を有し得る。長期間翻訳可能な分子は、対象においてアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する（例えば、濃度、存在、および／または機能の低下に起因する）疾患または障害を改善、予防、または治療するために使用され得る。

本発明の翻訳可能な分子の特性は、それらの分子構造に従って生じ、その全体の分子の構造は、全体として、それらの特性に基づいて顕著な利益を提供することができる。本発明の実施形態は、タンパク質濃度の増大またはタンパク質活性の増大を有利に提供する１又は２以上の特性を有する翻訳可能な分子を提供することができる。本発明の分子および組成物は、対象においてアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する（例えば、濃度、存在、および／または機能の低下に起因する）任意の疾患または障害を改善、予防、または治療するための治療剤を含む製剤を提供することができる。

本発明は、インビトロ、エクスビボ、およびインビボにおいて活性ポリペプチドまたはタンパク質を提供するために驚くほど翻訳可能な一連の翻訳可能な分子を提供する。

本発明の翻訳可能な分子は、１又は２以上の活性ポリペプチドまたはタンパク質、またはその断片を提供するように発現可能である。

翻訳可能な構造および組成物は、増大した翻訳活性または細胞質半減期を有し得る。これらの実施形態では、翻訳可能な構造および組成物は、天然のｍＲＮＡと比較して、哺乳動物細胞の細胞質内で機能的半減期を延長させることができる。

本明細書で使用されるとき、「半減期」という用語は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、期間の開始時に測定された値の半分に低下するのに必要とされる時間である。

本明細書では、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有するオリゴマーを含む、本発明の翻訳可能な分子についての一連の構造が提供される。１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有するオリゴマーには、特殊なリンカー基を組み込むことができる。リンカー基は、翻訳可能な分子の鎖に結合することができる。各リンカー基は核酸塩基に結合することもできる。

いくつかの態様では、リンカー基はモノマーであり得る。モノマーを結合して、鎖分子を形成することができる。本発明の鎖分子において、リンカー基モノマーは、鎖の任意の点で結合することができる。

特定の態様では、リンカー基モノマーは、本発明の鎖分子に結合することができ、その結果、リンカー基モノマーは、鎖の末端付近または鎖の任意の位置に存在する。

さらなる態様では、鎖分子のリンカー基はそれぞれ核酸塩基に結合することができる。鎖分子内の核酸塩基の存在は、鎖分子内の核酸塩基の配列を提供することができる。

特定の実施形態では、本発明は、特定の天然ヌクレオチド、または非天然ヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドと共に、リンカー基モノマーの新規な組み合わせを組み込む鎖構造を有する翻訳可能なオリゴマー分子を提供する。

本発明のオリゴマー分子は、核酸塩基の配列を表示することができ、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいてポリペプチドまたはタンパク質を発現するように設計することができる。発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、自然、天然または野生型ｍＲＮＡから発現されたタンパク質に対応する活性、またはネガティブまたはドミナントネガティブタンパク質に対応する活性を含む、さまざまな形態の活性を有し得る。

いくつかの態様では、本発明は、細胞の天然核酸分子の少なくとも一断片と同一の塩基配列を有する、活性のある翻訳可能なオリゴマー分子を提供することができる。

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞であり得る。

本発明は、リンカー基モノマーを組み込む翻訳可能なオリゴマー剤についての構造、方法、および組成物を提供する。本発明のオリゴマー分子は、治療用製剤中の活性剤として使用することができる。

本発明は、対象の細胞内でポリペプチドまたはタンパク質として発現される能力があるため、治療効果を提供するために有用な一連の翻訳可能な分子を提供する。

特定の実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーから構成されるオリゴマーとして構造化され得る。本発明のオリゴマー構造は、特定のヌクレオチドと共に、１又は２以上のリンカー基モノマーを含有してもよい。

特定の実施形態では、翻訳可能な分子は核酸塩基配列を含むことができ、一部は天然ポリヌクレオチド配列と十分な相同性を有することにより、任意のアイソフォームのペプチドまたはタンパク質を発現するように設計することができる。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、長さが約２００〜約１２，０００個、またはそれ以上のモノマーであり得る。特定の実施形態では、翻訳可能な分子は、長さが１，０００〜９，０００個のモノマー、長さが３，０００〜７，０００個のモノマー、または長さが４，０００〜６，０００個のモノマーであり得る。例示的な一実施形態では、翻訳可能な分子は、長さが４，５００〜５，５００個のモノマーである。さらなる例示的な一実施形態では、翻訳可能な分子は、長さが約５，０００個のモノマーである。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、１〜約８００個のＵＮＡモノマーを含有することができる。特定の実施形態では、翻訳可能な分子は、１〜６００個のＵＮＡモノマー、または１〜１００個のＵＮＡモノマー、または１〜１２個のＵＮＡモノマーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、１〜約８００個のロックド核酸（ＬＮＡ）モノマーを含むことができる。特定の実施形態では、翻訳可能な分子は、１〜６００個のＬＮＡモノマー、または１〜１００個のＬＮＡモノマー、または１〜１２個のＬＮＡモノマーを含有することができる。

本発明の翻訳可能な分子は、５’キャップ、モノマーの５’非翻訳領域、モノマーのコード領域、モノマーの３’非翻訳領域、およびモノマーのテール領域を含み得る。

本発明の翻訳可能な分子は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有するモノマーの３’非翻訳領域を含み得る。

本発明の翻訳可能な分子は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有するモノマーのテール領域を含み得る。

本発明の翻訳可能な分子は、細胞内での翻訳のために動作可能な、または例えば、５’キャップ、５’非翻訳領域、コード領域、３’非翻訳領域、およびポリＡテールを含むｍＲＮＡの領域の機能を有する、配列または構造の領域を含むことができる。

本発明はさらに、１又は２以上の翻訳可能な分子を含む１又は２以上のベクターを細胞に送達する方法を企図する。さらなる実施形態では、本発明はまた、１又は２以上の翻訳可能な分子を細胞へ送達することを企図する。

いくつかの実施形態では、１又は２以上の翻訳可能な分子は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に送達され得る。当技術分野で知られているウイルスおよび非ウイルスの導入方法を使用して、哺乳動物細胞に翻訳可能な分子を導入することができる。翻訳可能な分子は、薬学的に許容されるビヒクルを用いて、または例えば、ナノ粒子またはリポソームを用いて送達することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な構造および組成物は、天然の組成物を利用する場合と比較して、培養物における細胞運命操作に必要なトランスフェクションの数および頻度を軽減することができる。

さらなる態様では、本発明は、天然ｍＲＮＡを利用する場合と比較して、活性剤としての翻訳可能な分子の活性増大を提供する。

いくつかの態様では、本発明は、天然の核酸、ポリペプチド、またはタンパク質により誘導されるものと比較して、細胞の自然免疫応答を低下させ得る翻訳可能な分子を提供することができる。

本発明は、天然分子と比較して、デアデニル化に対して不応性である合成翻訳可能な分子を提供することができる。

特定の実施形態では、本発明は、天然分子と比較して、比活性が増大し、機能的半減期がより長い、合成翻訳可能分子を提供することができる。本発明の合成翻訳可能分子は、異所性タンパク質発現のレベル増大を提供することができる。ベクターを使用して翻訳可能な分子を発現させる場合、細胞への送達レベルが増大し、細胞傷害性の自然免疫反応が抑制され、より高いレベルの異所性タンパク質発現が到達され得る。本発明の翻訳可能な分子は、天然ｍＲＮＡよりも増大した比活性およびより長い機能的半減期を有し得る。

特定の態様では、翻訳可能な分子は、天然ｍＲＮＡと比較して多くの突然変異を有し得る。

さらなる態様では、本発明は、３’末端および／または５’末端に結合した切断可能な送達および標的化部分を有する翻訳可能な分子を提供することができる。

一般に、トランスフェクションによって送達された合成翻訳可能分子の比活性は、単位時間あたりの送達された転写物あたりの発現されたタンパク質分子の数として見ることができる。

本明細書で使用されるとき、翻訳効率とは、インビトロまたはインビボにおける翻訳可能な分子の翻訳によるタンパク質またはポリペプチドの産生の尺度を指す。

本発明は、１又は２以上のＵＮＡモノマー、および多数の核酸モノマーを含有することができる一連の翻訳可能なオリゴマー分子を提供し、この翻訳可能な分子は、ポリペプチドまたはタンパク質を提供するように発現可能である。

いくつかの実施形態では、本発明は、１又は２以上の非翻訳領域に１又は２以上のＵＮＡモノマー、および多数の核酸モノマーを含有することができる一連の翻訳可能なオリゴマー分子を含み、この翻訳可能な分子は、ポリペプチドまたはタンパク質を提供するように発現可能である。

いくつかの実施形態では、本発明は、テール領域に１又は２以上のＵＮＡモノマー、および多数の核酸モノマーを含有する一連の翻訳可能な分子を含み、この翻訳可能な分子は、ポリペプチドまたはタンパク質を提供するように発現可能である。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、修飾された５’キャップを含有することができる。

さらなる実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーの翻訳促進５’非翻訳領域を含有することができる。

追加の実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーの翻訳促進３’非翻訳領域を含有することができる。

追加の実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーの３’非翻訳領域に１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有することができる。

さらなる実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーのテール領域に１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有することができる。

さらなる実施形態では、翻訳可能な分子は、ポリＡテールに１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有することができる。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、モノマーの３’非翻訳領域またはモノマーのテール領域、例えば、ポリＡテールに１又は２以上のＬＮＡモノマーを含有することができる。

別の態様では、本発明の翻訳可能な分子は、同じ翻訳産物をコードする天然のｍＲＮＡと比較して、インビボで少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍の翻訳効率の増大を示し得る。

さらなる態様では、翻訳可能な分子は、同じポリペプチドまたはタンパク質をコードする天然のｍＲＮＡと比較して、インビボで少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍増大したポリペプチドまたはタンパク質レベルを産生することができる。

特定の実施形態では、翻訳可能な分子は、同じポリペプチドまたはタンパク質をコードする天然のｍＲＮＡと比較して、インビボでポリペプチドまたはタンパク質のレベル増大を提供することができる。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のレベルは、１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、またはそれ以上増大されることができる。

さらなる実施形態では、本発明は、本発明の翻訳可能な分子を含有する組成物を対象に投与することにより、対象の疾患または状態を治療するための方法を提供する。

本発明の翻訳可能な分子は、対象においてアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する（例えば、濃度、存在、および／または機能の低下に起因する）疾患または障害などの疾患または障害を改善、予防、または治療するために使用され得る。これらの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与して、対象におけるＡＧＬ酵素の濃度または有効性を調節、調整、または増大させることができる。いくつかの態様では、酵素は、患者が異常な量を有する未修飾の天然酵素であり得る（例えば、ＡＧＬ活性を部分的または完全に無効とするＡＧＬの変異バージョンを有する患者）。いくつかの態様では、酵素は、ＡＧＬの変異バージョンを保有する患者を治療するために使用することができる未修飾の天然ＡＧＬ酵素であり得る。例示的な実施形態では、本発明の翻訳可能な分子は、ＧＳＤＩＩＩを改善、予防、または治療するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、細胞または対象に送達され、翻訳されて、細胞または対象におけるＡＧＬレベルを増大させることができる。

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者であり得、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に提示しているヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書では「個人」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害を患っているか、または疾患または障害に感受性があり得るが、疾患または障害の症状を示しても示さなくてもよい。

例示的な一実施形態では、本発明の対象は、アミロアルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性が低下した（例えば、濃度、存在、および／または機能の低下に起因する）対象である。さらなる例示的な一実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与すると、治療対象の肝臓ＡＧＬタンパク質レベルが増大する可能性がある。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与すると、治療前の対象のベースラインＡＧＬタンパク質レベルに対して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の肝臓ＡＧＬタンパク質レベルにおける増大がもたらされる。例示的な一実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与すると、治療前の対象のベースライン肝臓ＡＧＬレベルに対して、肝臓ＡＧＬレベルの増大がもたらされる。いくつかの実施形態では、肝臓ＡＧＬレベルの増大は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子から発現されるＡＧＬタンパク質は、肝臓、血清、血漿、腎臓、心臓、筋肉、脳、脳脊髄液、またはリンパ節で検出可能である。例示的な実施形態では、ＡＧＬタンパク質は、肝臓の細胞、例えば、治療対象の肝細胞で発現される。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与すると、治療対象の肝臓の総タンパク質１ｍｇあたり、約１０ｎｇ／ｍｇ、約２０ｎｇ／ｍｇ、約５０ｎｇ／ｍｇ、約１００ｎｇ／ｍｇ、約１５０ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約２５０ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約３５０ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約４５０ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇ、または約１５００ｎｇ／ｍｇ、またはそれを上回る天然の非変異ヒトＡＧＬ（すなわち、異常または変異ＡＧＬとは対照的に、正常または野生型ＡＧＬ）タンパク質レベルの発現がもたらされる。

本明細書で使用されるとき、目的とする１又は２以上の値に適用される「約」または「およそ」という用語は、述べられた参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別のことが明記されない限り、または文脈から別のことが明らかな場合を除き、言及された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る一連の値（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）を指す。

いくつかの態様では、天然の非変異ヒトＡＧＬタンパク質の発現は、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の投与の６、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、および／または７２時間後に検出可能である。いくつかの態様では、天然の非変異ヒトＡＧＬタンパク質の発現は、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、および／または７日後に検出可能である。いくつかの実施形態では、天然の非変異ヒトＡＧＬタンパク質の発現は、投与の１週間、２週間、３週間、および／または４週間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、天然の非変異ヒトＡＧＬタンパク質の発現は、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の投与後に検出可能である。いくつかの実施形態では、天然の非変異ヒトＡＧＬタンパク質の発現は、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の投与後、肝臓、例えば肝細胞で検出可能である。

翻訳可能な分子を作製するための変異体鋳型
本明細書に記載のさまざまな実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、ＡＧＬをコードするｍＲＮＡを含んでもよく、ＡＧＬをコードするｍＲＮＡはコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ＡＧＬは、ヒトＡＧＬ（すなわち、ｈＡＧＬ）である。いくつかの実施形態では、ヒトＡＧＬは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡＧＬは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、変異体ＤＮＡ鋳型を利用して、ＡＧＬをコードすることができる翻訳可能な分子を作製することができる。本開示の変異体ＤＮＡ鋳型は、翻訳可能な分子を作製するプロセスおよび翻訳可能な分子の効率において利点を示し得る。鋳型のバリエーションを利用して、本発明の翻訳可能な分子における修飾ヌクレオチドまたはモノマーの組み込みを強化することができる。特定の態様では、鋳型のバリエーションを利用して、翻訳可能な分子の構造的特徴を強化することができる。翻訳可能な分子の強化された構造的特徴は、ポリペプチドまたはタンパク質産物を提供するための翻訳効率を含む、予想外にも有利な特性を提供することができる。

本発明のいくつかの態様では、鋳型のバリエーションは、鋳型鎖中の特定のヌクレオチドの存在または出現頻度の軽減を含み得る。特定のヌクレオチドの存在を軽減することにより、本開示の構造およびプロセスを変更して、ＡＧＬをコードする翻訳可能なＲＮＡ産物の驚くほど改善された特性を達成する非天然型を提供することができる。

本発明の態様は、翻訳可能な分子を作製するためのプロセスにおいて変異体ＤＮＡ鋳型を必要としてもよい。ＤＮＡ分子は、転写されてＡＧＬをコードする標的翻訳可能な分子を提供することができるヌクレオチドの非コード鋳型鎖を有することができる。

標的の翻訳可能な分子は、天然または修飾、合成または天然源に由来するかどうかにかかわらず、任意のＲＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、コドン割り当てを保持しながら、鋳型鎖のオープンリーディングフレームが代替形態に変換される変異体ＤＮＡ鋳型を使用することができる。

特定の実施形態では、代替コドン最適化および／または配列縮重に基づいて代替ヌクレオチドが使用されるＤＮＡ鋳型を使用することができる。

さらなる実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、コドン割り当てを保存しながら、特定のヌクレオチドを代替ヌクレオチドで置換してもよい。

本発明の実施形態は、ＡＧＬをコードする翻訳可能な分子を作製するためのプロセスで使用される本発明のＤＮＡ鋳型において代替コドンを有利に利用する。本発明のＤＮＡ鋳型において達成され得るバリエーションは、多くのプロセスにおいて好ましいコドンを必要とする可能性がある細胞および生物の場合よりも範囲がはるかに大きくなり得る。本発明において、翻訳可能な分子を転写するためのＤＮＡ鋳型において、広範囲の代替コドンおよび位置を使用することができる。

本発明のさらなる態様では、鋳型のバリエーションは、鋳型鎖中の特定のヌクレオチドの存在または出現頻度の軽減を含み得る。例えば、鋳型内のヌクレオチドの存在は、鋳型内のヌクレオチドの２５％未満のレベルに軽減され得る。さらなる例では、鋳型内のヌクレオチドの存在は、鋳型内のヌクレオチドの２０％未満のレベルに軽減され得る。いくつかの例では、鋳型内のヌクレオチドの存在は、鋳型内のヌクレオチドの１６％未満のレベルに軽減され得る。特定の例では、鋳型内のヌクレオチドの存在は、鋳型内のヌクレオチドの１２％未満のレベルまで軽減され得る。

ヒトＡＧＬ
ヒトＡＧＬ遺伝子は、およそ１７４．８ｋＤａの分子量を伴う、１５３２個のアミノ酸タンパク質をコードする。ＡＧＬは、グリコーゲン分解において１，４−アルファ−Ｄ−グルカン：１，４−アルファ−Ｄ−グルカン−４−アルファ−Ｄ−グリコシルトランスフェラーゼおよびアミロ−１，６−グルコシダーゼとして作用する多機能酵素である。上記のように、正常なＡＧＬ活性の遺伝的欠損は糖原病ＩＩＩを引き起こす。

コンセンサスヒトＡＧＬコード配列は、配列番号１に示される４，５９９個の核酸塩基のＲＮＡ配列を有する。

ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００００１９．２にて見出されるコンセンサスヒトＡＧＬコード配列は、配列番号２に翻訳される。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、ｈＡＧＬの天然ｍＲＮＡと比較して有利に増大した翻訳効率で、ヒトアミロアルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ｈＡＧＬ）を発現するように、作製および使用することができる。ｈＡＧＬを発現する翻訳可能な分子は、疾患を改善、予防、または治療するための方法における使用に好適な活性を示し得る。いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含み得る。

いくつかの態様では、翻訳可能な分子は、５’キャップ、５’ＵＴＲ、翻訳開始配列、例えば、コザック配列、ヒトＡＧＬ ＣＤＳ、３’ＵＴＲ、および／またはテール領域を含み得る。例示的な実施形態では、翻訳可能な分子は、５’キャップ（ｍ７ＧｐｐｐＧｍ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ、コザック配列、ヒトＡＧＬ ＣＤＳ、アフリカツメガエルベータグロビンの３’ＵＴＲ、およびテール領域を含み得る。さらなる例示的な実施形態では、ヒトＡＧＬ ＣＤＳは、以下にさらに詳細に記載される配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５のコドン最適化配列を含み得る。本明細書に記載されるこれらおよび他の実施形態のいずれにおいても、翻訳可能な分子は１又は２以上のＵＮＡモノマーを含んでもよい。本明細書に記載されるこれらおよび他の実施形態のいずれにおいても、翻訳可能な分子は１又は２以上のＬＮＡモノマーを含んでもよい。

ＡＧＬの天然ｍＲＮＡと比較して、分子の翻訳効率を増大させることができる。特に、４８時間後、分子の翻訳効率は、ＡＧＬの天然ｍＲＮＡと比較して２倍超になり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＡＧＬタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む。天然に存在するヒトＡＧＬタンパク質の配列は、配列番号２に示される。

いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＡＧＬの相同体または変異体をコードするｍＲＮＡ配列であり得る。本明細書で使用する場合、ヒトＡＧＬタンパク質の相同体または変異体は、実質的なＡＧＬタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＡＧＬタンパク質と比較して１又は２以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含有する、修飾ヒトＡＧＬタンパク質であり得る。いくつかの態様では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＧＬタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＧＬタンパク質の断片または一部をコードする。

いくつかの態様では、本発明に好適なｍＲＮＡは、ヒトＡＧＬタンパク質の断片または部分をコードし、タンパク質の断片または部分は、野生型タンパク質のものと同様のＡＧＬ活性を依然として維持している。

いくつかの態様では、本発明に好適なｍＲＮＡは、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるコード配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるコード配列を含む翻訳可能なオリゴマー分子は、５’キャップ、５’ＵＴＲ、翻訳開始配列、３’ＵＴＲ、およびテール領域から選択される１又は２以上の配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＡＧＬタンパク質を発現する。例示的な実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＡＧＬタンパク質を発現する。別の例示的な実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＡＧＬタンパク質を発現し、このコード配列は、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択された配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である。さらに別の例示的な実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＡＧＬタンパク質を発現し、このコード配列は、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される配列に対して少なくとも９５％同一である。さらに別の例示的な実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＡＧＬタンパク質を発現し、このコード配列は、配列番号１９、配列番号３１、または配列番号４５から選択される配列に対して少なくとも９５％同一である。したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドであって、このヒトＡＧＬコード配列が、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択された配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、本出願は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドであって、このヒトＡＧＬコード配列が、配列番号１９、配列番号３１、または配列番号４５から選択される配列に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本出願は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、このヒトＡＧＬコード配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチドを提供する。別の特定の実施形態では、本出願は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、このヒトＡＧＬコード配列が、配列番号３１に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチドを提供する。別の特定の実施形態では、本出願は、配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、このヒトＡＧＬコード配列が、配列番号４５に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、別の配列に融合されたＡＧＬタンパク質の全長、断片または部分を含む融合タンパク質をコードする（例えば、ＮまたはＣ末端融合）。いくつかの実施形態では、ＮまたはＣ末端配列は、シグナル配列または細胞標的化配列である。

ＵＮＡモノマーおよびオリゴマー
いくつかの実施形態では、リンカー基モノマーは、以下に示されるようなプロパン−１，２，３−トリ−イル−トリソキシ構造に基づく小さな有機分子である、ロックされていないヌクレオモノマー（ＵＮＡモノマー）であり得る：
式中、Ｒ^１およびＲ^２はＨであり、Ｒ^１およびＲ^２はホスホジエステル結合であり得、塩基は核酸塩基であり得、Ｒ^３は以下に記載される官能基である。

別の観点では、ＵＮＡモノマーの主な原子は、以下のようにＩＵＰＡＣ表記法で描画することができる；
ここで、オリゴマー鎖の進行方向は、プロパン残基の１末端から３末端の方向である。

核酸塩基の例には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ならびに天然および非天然の核酸塩基類似体が含まれる。

核酸塩基の例には、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル（ｍ１Ψ）、すなわち、Ｎ^１−メチルプソイドウラシル、および５−メトキシウラシルが含まれる。

一般に、ヌクレオチドではないＵＮＡモノマーは、オリゴマー内の内部リンカーモノマーとなり得る。オリゴマー内の内部ＵＮＡモノマーの両側には、他のモノマーが隣接している。

例えば、オリゴマーが複合体または二重鎖を形成し、複合体または二重鎖中に核酸塩基を持つ他のモノマーが存在する場合、ＵＮＡモノマーは塩基対合に関与することができる。

Ｒ^３が−ＯＨである、プロパン−１−イルの位置とプロパン−３−イルの位置の両方で隣接する内部モノマーとしてのＵＮＡモノマーの例を以下に示す。

ＵＮＡモノマーは、オリゴマーの末端モノマーであることができ、ＵＮＡモノマーは、プロパン−１−イルの位置またはプロパン−３−イルの位置のいずれかで１つのモノマーのみに結合する。ＵＮＡモノマーはヌクレオチドとは異なり、柔軟な有機構造であるため、末端ＵＮＡモノマーはオリゴマーの柔軟なターミネーターとなることができる。

プロパン−３−イルの位置で結合した末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーの例を以下に示す。

ＵＮＡモノマーは柔軟な分子になり得るため、末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーは、大きく異なる立体構造をとることができる。プロパン−３−イルの位置で結合した末端モノマーとしてのエネルギーが最小化されたＵＮＡモノマーの立体構造の一例を以下に示す。

とりわけ、ＵＮＡモノマーの構造により、ＵＮＡモノマーは天然に存在するヌクレオチドに結合することが可能となる。

ＵＮＡオリゴマーは、ＵＮＡモノマーからなる鎖、ならびに天然に存在するヌクレオシドに基づき得るさまざまなヌクレオチドであり得る。

いくつかの実施形態では、ＵＮＡモノマーの官能基Ｒ^３は、−ＯＲ^４、−ＳＲ^４、−ＮＲ^４ _２、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^４、モルホリノ、モルホリン−１−イル、ピペラジン−１−イル、または４−アルカノイル−ピペラジン−１−イルであり得、Ｒ^４は、存在ごとに同じであるかまたは異なり、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸、またはポリペプチドであり得る。

ＵＮＡモノマーは、有機分子である。ＵＮＡモノマーは、核酸モノマーまたはヌクレオチドではなく、天然に存在するヌクレオシドまたは修飾された天然に存在するヌクレオシドでもない。

本発明のＵＮＡオリゴマーは、合成鎖分子である。

いくつかの実施形態では、上に示すように、ＵＮＡモノマーは、ＵＮＡ−Ａ（Ａと指定）、ＵＮＡ−Ｕ（Ｕと指定）、ＵＮＡ−Ｃ（Ｃと指定）、およびＵＮＡ−Ｇ（Ｇと指定）であり得る。

本明細書で使用でき得る名称には、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドを指す、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、およびｍＵが含まれる。

本明細書で使用でき得る名称には、２’−デオキシＴヌクレオチドを指す、ｄＴが含まれる。

本明細書で使用される場合、オリゴマー配列の文脈において、記号Ｎは、任意の天然ヌクレオチドモノマー、または任意の修飾ヌクレオチドモノマーを表すことができる。

本明細書で使用される場合、オリゴマー配列の文脈において、記号Ｑは、非天然、修飾、または化学修飾ヌクレオチドモノマーを表す。

本明細書で使用される場合、オリゴマー配列の文脈において、記号Ｘは、ＵＮＡモノマーを表すために使用され得る。

修飾および化学修飾ヌクレオチド
本明細書の修飾または化学修飾ヌクレオチドの例では、アルキル、シクロアルキル、またはフェニル置換基は非置換であり得るか、または１又は２以上のアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、またはニトロ置換基でさらに置換され得る。

核酸モノマーの例には、当技術分野で知られているそのような任意のヌクレオチドを含む、非天然、修飾、および化学修飾ヌクレオチドが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５−ヒドロキシシチジン、５−アルキルシチジン、５−ヒドロキシアルキルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−アルコキシシチジン、５−アルキニルシチジン、５−ハロシチジン、２−チオシチジン、Ｎ^４−アルキルシチジン、Ｎ^４−アミノシチジン、Ｎ^４−アセチルシチジン、およびＮ^４，Ｎ^４−ジアルキルシチジンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−メトキシシチジン、５−プロピニルシチジン、５−ブロモシチジン、５−ヨードシチジン、２−チオシチジン；Ｎ^４−メチルシチジン、Ｎ^４−アミノシチジン、Ｎ^４−アセチルシチジン、およびＮ^４，Ｎ^４−ジメチルシチジンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５−ヒドロキシウリジン、５−アルキルウリジン、５−ヒドロキシアルキルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシアルキルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−アルコキシウリジン、５−アルキニルウリジン、５−ハロウリジン、２−チオウリジン、および６−アルキルウリジンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシメチルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−メトキシウリジン、５−プロピニルウリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、２−チオウリジン、および６−メチルウリジンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−タウリノメチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−チオ−２’Ｏ−メチルウリジン、および３，２’−Ｏ−ジメチルウリジンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、Ｎ^６−メチルアデノシン、２−アミノアデノシン、３−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、７−デアザアデノシン、８−オキソアデノシン、８−ブロモアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−メチルアデノシン、Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ^６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６−メチル−Ｎ^６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６−ジメチルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６−アセチル−アデノシン、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、アルファ−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、Ｎ^６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン、２−アミノ−Ｎ^６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ^６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、Ｎ^ｌ−アルキルグアノシン、Ｎ^２−アルキルグアノシン、チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、８−ブロモグアノシン、Ｏ^６−アルキルグアノシン、キサントシン、イノシン、およびＮ^ｌ−アルキルイノシンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、Ｎ^ｌ−メチルグアノシン、Ｎ^２−メチルグアノシン、チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、８−ブロモグアノシン、Ｏ^６−メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、およびＮ^ｌ−メチルイノシンが含まれる。

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、プソイドウリジンが含まれる。プソイドウリジンの例には、Ｎ^ｌ−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−シクロアルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−フェニルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−フェニルアルキルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アミノアルキルプソイドウリジン、Ｎ^３−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−アルコキシプソイドウリジン、Ｎ^６−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^６−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−モルホリノプソイドウリジン、Ｎ^６−フェニルプソイドウリジン、およびＮ^６−ハロプソイドウリジンが含まれる。プソイドウリジンの例には、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−アルコキシプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−モルホリノプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−フェニルプソイドウリジン、およびＮ^ｌ−アルキル−Ｎ^６−ハロプソイドウリジンが含まれる。これらの例では、アルキル、シクロアルキル、およびフェニル置換基は非置換であってもよく、またはアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、またはニトロ置換基でさらに置換されてもよい。

プソイドウリジンの例には、Ｎ^ｌ−メチルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−エチルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−プロピルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−シクロプロピルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−フェニルプソイドウリジン、Ｎ^ｌ−アミノメチルプソイドウリジン、Ｎ^３−メチルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン、およびＮ^１−ヒドロキシメチルプソイドウリジンが含まれる。

核酸モノマーの例には、当技術分野で知られているそのような任意のヌクレオチドを含む、修飾および化学修飾ヌクレオチドが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、当技術分野で既知の任意のヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチル−ヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基モノマー残基が含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、３’−末端安定化ヌクレオチド、３’−グリセリルヌクレオチド、３’−逆脱塩基ヌクレオチド、および３’−逆チミジンが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、ロックされた核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。例示的な一実施形態では、修飾モノマーはロックされた核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）である。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、２′，４′−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）および２’−Ｏ−エチル（ｃＥｔ）修飾ＤＮＡが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノヌクレオチド、２’−Ｃ−アリルヌクレオチド、および２’−Ｏ−アリルヌクレオチドが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、Ｎ^６メチルアデノシンヌクレオチドが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、修飾塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジン、５−（２−メルカプト）エチルウリジン、５−ブロモウリジン；８−ブロモグアノシン、または７−デアザアデノシンを伴うヌクレオチドモノマーが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例には、２’−Ｏ−アミノプロピル置換ヌクレオチドが含まれる。

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、ヌクレオチドの２’−ＯＨ基を２’−Ｒ、２’−ＯＲ、２’−ハロゲン、２’−ＳＲ、または２’−アミノ（式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る）で置換することを含む。

修飾ヌクレオチドのいくつかの例は、Ｓａｅｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８４にて提供される。

上記の塩基修飾の例は、糖修飾および結合修飾を含むヌクレオシドまたはヌクレオチド構造のさらなる修飾と組み合わせることができる。

特定の修飾または化学修飾ヌクレオチドモノマーは、天然に見出される場合がある。

１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有する翻訳可能な分子
本発明の態様は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有するオリゴマー化合物である翻訳可能な分子についての構造および組成物を提供する。翻訳可能なオリゴマーは、薬学的組成物のための活性剤であり得る。いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、ヒトＡＧＬまたはその変異体をコードする。

本発明のオリゴマー翻訳可能な分子は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有してもよい。本発明のオリゴマー分子は、ペプチドおよびタンパク質治療薬を供給するための製剤中の活性剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、ヒトＡＧＬまたはその変異体をコードする。

いくつかの実施形態では、本発明は、特定の天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドと共に、ＵＮＡモノマーの新規な組み合わせを組み込む構造を有する翻訳可能なオリゴマー化合物を提供する。

本発明の翻訳可能なオリゴマー化合物は、約２００〜約１２，０００塩基長の長さを有することができる。本発明の翻訳可能なオリゴマー化合物は、約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または約９０００塩基の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー化合物は、約４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、または約５５００塩基の長さを有することができる。 例示的な一実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー化合物は、約５０００塩基の長さを有する。

さらなる態様では、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む本発明のオリゴマーの翻訳可能な化合物は、薬理学的に活性な分子であり得る。翻訳可能なオリゴマー分子は、インビトロ、インビボ、またはエクソビボにおいてペプチドまたはタンパク質活性剤を生成するための薬学的有効成分として使用することができる。例示的な一実施形態では、本発明の翻訳可能なオリゴマー化合物は、ヒトＡＧＬまたはその変異体をコードする。

本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、式Ｉの構造を有することができる：
式中、Ｌ^１は結合であり、ｎは２００〜１２，０００であり、存在ごとにＬ^２は式−Ｃ^１−Ｃ^２−Ｃ^３−を有するＵＮＡリンカー基であり、ＲはＣ^２に結合し、式−ＯＣＨ（ＣＨ_２Ｒ^３）Ｒ^５を有し、Ｒ^３ｉは−ＯＲ^４、−ＳＲ^４、−ＮＲ^４ _２、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^４、モルホリノ、モルホリン−１−イル、ピペラジン−１−イル、または４−アルカノイル−ピペラジン−１−イルであり、Ｒ^４は、存在ごとに同じであるかまたは異なり、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸、もしくはポリペプチドであり、Ｒ^５は核酸塩基であり、またはＬ^２（Ｒ）は、リボースなどの糖であり、Ｒは核酸塩基であり、またはＬ^２は、修飾リボースなどの修飾された糖であり、Ｒは核酸塩基である。特定の実施形態では、核酸塩基は、修飾された核酸塩基であり得る。Ｌ^１は、ホスホジエステル結合であり得る。

翻訳可能なオリゴマー分子の塩基配列は、核酸塩基の任意の配列であり得る。

いくつかの態様では、本発明の翻訳可能なオリゴマー分子は、任意のモノマー間の位置に任意の数のホスホロチオエートインターモノマー結合を有することができる。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマー分子のインターモノマー結合のいずれか１又は２以上は、ホスホジエステル、ジチオエートを含むホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、および他の化学修飾形態であり得る。

翻訳可能なオリゴマー分子がＵＮＡモノマーで終わる場合、上記の位置番号付けに従って、末端位置は１末端となるか、または末端位置は３末端となる。

強化された翻訳
本発明の翻訳可能な分子は、分子の翻訳効率を高める領域を組み込むことができる。

一般に、当技術分野で知られている翻訳エンハンサー領域を翻訳可能な分子の構造に組み込んで、ペプチドまたはタンパク質の収量を増大させることができる。

翻訳エンハンサー領域を含有する翻訳可能な分子は、ペプチドまたはタンパク質の産生の増大を提供することができる。

いくつかの実施形態では、翻訳エンハンサー領域は、翻訳可能な分子の５’または３’非翻訳領域を含むか、またはそれに位置することができる。

翻訳エンハンサー領域の例には、ＴＥＶ ５’ＵＴＲおよびアフリカツメガエルベータグロビン３’ＵＴＲに由来する天然に存在するエンハンサー領域が含まれる。

分子構造および配列
翻訳可能な分子は、標的ペプチドまたはタンパク質を発現するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ペプチドまたはタンパク質は、対象の状態または疾患に関連し得る。

いくつかの態様では、翻訳可能な分子の塩基配列は、ｍＲＮＡの塩基配列の少なくとも有効な部分またはドメインと同一の部分を含むことができ、有効な部分は、翻訳可能な分子の翻訳産物に治療活性を付与するのに十分である。

いくつかの態様では、本発明は、細胞の天然核酸分子の少なくとも一断片と同一の塩基配列を有する、活性のある翻訳可能な分子を提供する。

特定の実施形態では、翻訳可能な分子の塩基配列は、１又は２以上の塩基変異を除いて、ｍＲＮＡの塩基配列と同一の部分を含むことができる。翻訳可能な分子の変異の数は、ｍＲＮＡよりも実質的に低い活性を有する翻訳可能な分子の翻訳産物を産生する量を超えてはならない。

本発明の翻訳可能なオリゴマーＵＮＡ分子は、核酸塩基の配列を表示することができ、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいてペプチドまたはタンパク質を発現するように設計することができる。発現されたペプチドまたはタンパク質は、天然または自然ｍＲＮＡから発現されたタンパク質に対応する活性を含む、さまざまな形態の活性を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子は、約４００〜１５，０００モノマーの鎖長を有してもよく、ここで、ＵＮＡモノマーではない任意のモノマーは、ＮまたはＱモノマーであり得る。

分子キャップ構造
本発明の翻訳可能な分子は、当技術分野で知られているように、さまざまな基およびそれらの類似体でキャップされた５’末端を有し得る。例示的な実施形態では、５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャップであってもよい。さらなる実施形態では、５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、およびそれらのテトラホスフェート誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ、Ｊら、ＲＮＡ ９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）から選択され得る。他の実施形態では、５’キャップは、ＡＲＣＡキャップ（３’−ＯＭｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ）であってもよい。５’キャップは、ｍＣＡＰ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，Ｎ^７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン）であってもよい。５’キャップは、加水分解に耐性があり得る。

５’キャップ構造のいくつかの例は、ＷＯ２０１５／０５１１６９Ａ２、ＷＯ／２０１５／０６１４９１、および米国特許第８，０９３，３６７号および同第８，３０４，５２９号で提供される。

テール領域
いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たすことができるテール領域を含む。いくつかの実施形態では、テール領域はポリＡテールであり得る。

ポリＡテールは、例えば、合成またはインビトロ転写ＲＮＡにテールを追加するためにポリＡポリメラーゼを使用するなど、当技術分野で知られているさまざまな方法を使用して追加されることができる。他の方法は、ポリＡテールをコードする転写ベクターの使用、またはリガーゼの使用（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよび／またはＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用したスプリント連結による）を含み、ポリＡはセンスＲＮＡの３’末端に連結され得る。いくつかの実施形態では、上記の方法のいずれかの組み合わせが利用される。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、３’ポリＡテール構造を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールの長さは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００個のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、３’ポリＡテールは、約５〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約３０〜２５０個のアデノシンヌクレオチド、約６０〜２２０個のアデノシンヌクレオチド、約８０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約９０〜約１５０個のアデノシンヌクレオチド、または約１００〜約１２０個のアデノシンヌクレオチド）を含有する。例示的な一実施形態では、３’ポリＡテールは、約１００個のヌクレオチド長である。別の例示的な実施形態では、３’ポリＡテールは、約１１５個のヌクレオチド長である。別の例示的な実施形態では、３’ポリＡテールは、約２５０個のヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、３’ポリＡテールは、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態では、３’ポリＡテールは、２、３、４、５、１０、１５、２０、またはそれ以上のＵＮＡモノマーを含有する。例示的な一実施形態では、３’ポリＡテールは、２つのＵＮＡモノマーを含有する。さらなる例示的な一実施形態では、３’ポリＡテールは、連続して、すなわち３’ポリＡテール中で互いに隣接して見出される２つのＵＮＡモノマーを含有する。

例示的な一実施形態では、３’ポリＡテールは、配列番号６に示される配列を含むか、またはそれからなる。別の例示的な実施形態では、３’ポリＡテールは、配列番号３８に示される配列を含むか、またはそれからなる。さらに別の例示的な実施形態では、３’ポリＡテールは、配列番号３９に示される配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、３’ポリＣテール構造を含む。いくつかの実施形態では、ポリＣテールの長さは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００個のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、３’ポリＣテールは、約５〜３００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約３０〜２５０個のシトシンヌクレオチド、約６０〜２２０個のシトシンヌクレオチド、約８０〜２００個のシトシンヌクレオチド、約９０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、または約１００〜約１２０個のシトシンヌクレオチド）を含有する。例示的な一実施形態では、３’ポリＣテールは、約１００個のヌクレオチド長である。別の例示的な実施形態では、３’ポリＣテールは、約１１５個のヌクレオチド長である。ポリＣテールは、ポリＡテールに追加されてもよく、またはポリＡテールの代替となってもよい。ポリＣテールは、ポリＡテールの５’末端またはポリＡテールの３’末端に追加されてもよい。

いくつかの実施形態では、ポリＡおよび／またはポリＣテールの長さは、本発明の修飾された翻訳可能なオリゴマー分子の安定性、したがってタンパク質の転写を制御するために調整される。例えば、ポリＡテールの長さは翻訳可能な分子の半減期に影響を与える可能性があるため、ポリＡテールの長さを調整してｍＲＮＡのヌクレアーゼ耐性レベルを修飾し、それによってポリヌクレオチド発現および／または標的細胞におけるポリペプチド産生の時間経過を制御することができる。

５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）
いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域を含み得る。当技術分野で理解されているように、５’および／または３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を与え得る。例示的な一実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００個のヌクレオチドである５’ＵＴＲを含み得る。いくつかの態様では、５’ＵＴＲは、約５０〜３００個のヌクレオチド（例えば、約７５〜２５０個のヌクレオチド、約１００〜２００個のヌクレオチド、約１２０〜１５０個のヌクレオチド、または約１３５個のヌクレオチド）を含有する。例示的な一実施形態では、５’ＵＴＲは、約１３５個のヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、翻訳可能なオリゴマーの安定性を高めるために、比較的安定であることが当技術分野で知られているｍＲＮＡ分子（例えば、ヒストン、チューブリン、グロビン、ＧＡＰＤＨ、アクチン、またはクエン酸回路酵素）に由来する。他の実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列を含み得る。５’ＵＴＲ配列の例は、米国特許第９，１４９，５０６号にて見出され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ヒトＩＬ−６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトトランスサイレチン、ヒトハプトグロビン、ヒトアルファ−１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビン、ヒトアルファ−１−アンチトリプシン、ヒトアルブミン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、ＳｙｎＫ、ＡＴ１Ｇ５８４２０、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、およびタバコエッチウイルス、または前述のいずれかの断片の５’ＵＴＲから選択される配列を含む。例示的な一実施形態では、５’ＵＴＲは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）に由来する。さらなる例示的な一実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３に示される配列を含むか、またはそれからなる。さらに別の例示的な実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３に示される配列の断片、例えば、配列番号３の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１２５個の連続したヌクレオチドの断片である。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマー分子は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。当技術分野で理解されているように、ＩＲＥＳは、末端非依存的な様式で翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。例示的な実施形態では、ＩＲＥＳは、５’ＵＴＲ内にある。他の実施形態では、ＩＲＥＳは、５’ＵＴＲの外側にあってもよい。

いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、または５００個のヌクレオチドである３’ＵＴＲを含み得る。いくつかの態様では、３’ＵＴＲは、約５０〜３００個のヌクレオチド（例えば、約７５〜２５０個のヌクレオチド、約１００〜２００個のヌクレオチド、約１４０〜１７５個のヌクレオチド、または約１６０個のヌクレオチド）を含有する。例示的な一実施形態では、３’ＵＴＲは、約１６０個のヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、２、３、４、５、１０、１５、２０、またはそれ以上のＵＮＡモノマーを含有する。

３’ＵＴＲ配列の例は、米国特許第９，１４９，５０６号にて見出され得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖、ヒトハプトグロビン、ヒトアンチトロンビン、ヒトアルファグロビン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト成長因子、ヒトヘプシジン、ＭＡＬＡＴ−１、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、およびアフリカツメガエルベータグロビン、または前述のいずれかの断片の３’ＵＴＲから選択される配列を含む。例示的な実施形態では、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータグロビンに由来する。別の例示的な実施形態では、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータグロビンに由来し、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有する。さらなる例示的な一実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号５および３３〜３７に示される配列を含むか、またはそれからなる。さらに別の例示的な実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号５および３３〜３７に示される配列の断片、例えば、配列番号５および３３〜３７の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０個の連続したヌクレオチドの断片である。

特定の例示的な実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、配列番号３の５’ＵＴＲ配列と、配列番号５および３３〜３７から選択される３’ＵＴＲ配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、配列番号６、配列番号３８、または配列番号３９に示されるポリＡテールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＧＬのｍＲＮＡコード配列は、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される配列を含む。

トリプル停止コドン
いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、トリプル停止コドンを作り出すＣＤＳのすぐ下流の配列を含み得る。翻訳の効率を高めるために、トリプル停止コドンを組み込むことができる。いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５に例示されるように、本明細書に記載のＰＡＨ ＣＤＳのすぐ下流の配列ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ（配列番号４０）を含み得る。

翻訳開始部位
いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、翻訳開始部位を含み得る。そのような配列は当技術分野で知られており、コザック配列を含む。例えば、Ｋｏｚａｋ、Ｍａｒｉｌｙｎ（１９８８） Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８：２７３７−２７４４；Ｋｏｚａｋ、Ｍａｒｉｌｙｎ（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１９８６７−１９８７０；Ｋｏｚａｋ、Ｍａｒｉｌｙｎ（１９９０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：８３０１−８３０５；およびＫｏｚａｋ、Ｍａｒｉｌｙｎ（１９８９） Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０８：２２９−２４１、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。当技術分野で理解されているように、コザック配列は、真核生物ｍＲＮＡの翻訳開始部位あたりを中心とする短いコンセンサス配列であり、ｍＲＮＡの翻訳の効率的な開始を可能にする。リボソーム翻訳機構は、コザック配列の文脈でＡＵＧ開始コドンを認識する。

いくつかの実施形態では、翻訳開始部位、例えば、コザック配列は、ＡＧＬのコード配列の上流に挿入される。いくつかの実施形態では、翻訳開始部位は、５’ＵＴＲの下流に挿入される。特定の例示的な実施形態では、翻訳開始部位は、ＡＧＬのコード配列の上流および５’ＵＴＲの下流に挿入される。

当技術分野で理解されているように、コザック配列の長さはさまざまであり得る。一般的に、リーダー配列の長さを増やすと翻訳が強化される。

いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、配列番号４の配列を有するコザック配列を含む。特定の例示的な実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、配列番号４の配列を有するコザック配列を含み、このコザック配列は、５’ＵＴＲのすぐ下流およびＡＧＬのコード配列のすぐ上流にある。

合成方法
さまざまな態様では、本発明は、翻訳可能なメッセンジャー分子の合成方法を提供する。

本発明の翻訳可能な分子は、本明細書に開示される方法、ならびに当技術分野で既知の任意の関連技術を使用して合成および単離されることができる。

核酸を調製するためのいくつかの方法は、例えば、Ｍｅｒｉｎｏ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、（２０１３）；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８４）；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２８８（２００５）にて提供される。

いくつかの実施形態では、翻訳可能な分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応によって作製することができる。ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物は、Ｔ７試薬を使用して重合されて、例えば、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを産生することができる。ＤＮＡ鋳型は、ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを用いて分解でき、ＲＮＡはカラム分離される。

いくつかの実施形態では、リガーゼを使用して、合成オリゴマーをＲＮＡ分子またはＲＮＡ転写物の３’末端に連結して、翻訳可能な分子を形成することができる。３’末端に連結される合成オリゴマーは、ポリＡテールの機能性を提供でき、有利には、３’−エキソリボヌクレアーゼによるその除去に対する耐性を提供することができる。連結された産物の翻訳可能な分子は、増大した比活性を有することができ、異所性タンパク質発現のレベルの増大を提供することができる。

特定の実施形態では、本発明の翻訳可能な分子の連結産物は、天然の特異性を有するＲＮＡ転写物を用いて作製され得る。連結産物は、天然の特異性との適合性を確保するために、５’末端でＲＮＡ転写物の構造を保持する合成分子であり得る。

さらなる実施形態では、本発明の翻訳可能な分子の連結産物は、外因性ＲＮＡ転写物または非天然ＲＮＡを用いて作製され得る。連結産物は、ＲＮＡの構造を保持する合成分子であり得る。

理論に縛られることを望まないが、細胞内の標準的なｍＲＮＡ分解経路には、以下の工程が含まれる：（ｉ）ポリＡテールは、３’エキソヌクレアーゼによって徐々に断片に切り戻され、効率的な翻訳に必要なループ相互作用を閉鎖し、キャップを攻撃に対して開かれた状態にする；（ｉｉ）複合体のキャップ除去は、５’キャップを除去する；（ｉｉｉ）転写物の保護されておらず翻訳的に機能しない残留物は、５’および３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。

本発明の実施形態は、天然の転写物よりも高い翻訳活性を有することができる新しい翻訳可能な構造を含む。とりわけ、本明細書の翻訳可能な分子は、脱アデニル化の過程でエキソヌクレアーゼがポリＡテールを切り戻すのを防ぐことができる。

本発明の実施形態は、翻訳可能な分子の構造、組成物、および方法を提供する。本発明の実施形態は、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含有し、かつ機能的半減期が増大した翻訳可能な分子を提供することができる。

驚くべきことに、ｍＲＮＡ転写物のライゲーション生成物への高い変換により、ｍＲＮＡ転写物の３’末端への合成オリゴマーのライゲーションを達成できることが見出された。

本明細書で使用するポリＡテールおよびポリＡオリゴマーという用語は、モノマーのオリゴマーを指し、モノマーは、アデニンに基づくヌクレオチド、ＵＮＡモノマー、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含むことができる。

ＲＮＡの３’末端へのライゲーションのためのオリゴマーは、長さが２〜１２０個のモノマー、長さが３〜１２０個のモノマー、長さが４〜１２０個のモノマー、長さが５〜１２０個のモノマー、またはそれ以上であってもよい。例示的な実施形態では、ライゲーションのためのオリゴマーは、長さが約３０個のモノマーである。

脂質に基づく製剤
脂質に基づく製剤は、それらの生体適合性と大規模生産の容易さから、ＲＮＡの最も有望な送達系の１つとしてますます認識されてきた。カチオン性脂質は、ＲＮＡ送達のための合成材料として広く研究されてきた。一緒に混合した後、核酸をカチオン性脂質によって凝縮し、リポプレックスとして知られる脂質／核酸複合体を形成する。これらの脂質複合体は、遺伝物質をヌクレアーゼの作用から保護し、負に帯電した細胞膜と相互作用することにより細胞内に送達することができる。リポプレックスは、生理的ｐＨで正に荷電した脂質と負に荷電した核酸を直接混合することにより調製することができる。

従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、または中性の（リン）脂質とコレステロールで構成することができる脂質二重層で構成されており、水性コアを封入している。脂質二重層と水性空間の両方に、それぞれ疎水性または親水性化合物を組み込むことができる。インビボにおけるリポソームの特性および挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソーム表面に追加して、立体安定化を付与することにより修飾することができる。さらに、リポソームは、リガンド（抗体、ペプチド、炭水化物など）をその表面または結合したＰＥＧ鎖の末端部に結合することにより、特定の標的化に使用することができる（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５ Ｄｅｃ １；６：２８６）。

リポソームは、水性区画を囲むリン脂質二重層で構成されるコロイド状脂質に基づく、および界面活性剤に基づく送達系である。それらは球状の小胞として存在してもよく、サイズは２０ｎｍ〜数ミクロンの範囲となり得る。カチオン性脂質に基づくリポソームは、静電相互作用を介して負に帯電した核酸と複合体を形成することができ、生体適合性、低毒性、インビボ臨床応用に必要な大規模生産の可能性を提供する複合体をもたらす。リポソームは、取り込みのために細胞膜と融合することができる；細胞内に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介して処理され、次いで、遺伝物質はエンドソーム／担体から細胞質に放出される。リポソームは基本的に生体膜の類似体であり、天然および合成リン脂質の両方から調製することができることを考慮して、その優れた生体適合性のため、リポソームは薬物送達ビヒクルとして長い間認められてきた（Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：１８３３−１８４３）。

カチオン性リポソームは、伝統的に、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、およびｓｉＲＮＡ／スモールヘアピンＲ Ａ−ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのための最も一般的に使用される非ウイルス送達系であってきた。ＤＯＴＡＰ、（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）およびＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）などのカチオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合体またはリポプレックスを形成し、静電相互作用によりナノ粒子を形成し、インビトロでの高いトランスフェクション効率を提供する。さらに、中性１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）に基づくナノリポソームとしてのＲＮＡ送達のための中性脂質に基づくナノリポソームが開発された（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１４ Ｆｅｂ；６６：１１０−１１６）。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の発現可能なポリヌクレオチドおよび異種ｍＲＮＡ構築物は、脂質製剤化される。脂質製剤は、リポソーム、リポプレックス、ＰＬＧＡなどのコポリマー、および脂質ナノ粒子から選択されることが好ましいが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は以下を含む：
（ａ）核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）凝集低減剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質など）、
（ｄ）場合により非カチオン性脂質（中性脂質など）、および
（ｅ）場合により、ステロール。

一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ脂質のモル比の、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質；（ｉｉｉ）コレステロールなどのステロール；および（ｉｖ）ＰＥＧ脂質からなる。

チオカルバメートおよびカルバメート含有脂質製剤
本発明の活性分子の送達のための脂質および脂質組成物のいくつかの例は、ＷＯ／２０１５／０７４０８５およびＵＳＳＮ １５／３８７，０６７に示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、脂質は以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒ_１およびＲ_２は両方とも、１〜１４個の炭素からなる直鎖アルキル、または２〜１４個の炭素からなるアルケニルまたはアルキニルからなり、
Ｌ_１およびＬ_２は両方とも、５〜１８個の炭素からなるか、またはＮと複素環を形成する、直鎖アルキレンまたはアルケニレンからなり、
ＸはＳであり、
Ｌ_３は、結合、または１〜６個の炭素からなるか、もしくはＮと複素環を形成する、直鎖アルキレンからなり、
Ｒ_３は、１〜６個の炭素からなる直鎖または分岐アルキレンからなり、
Ｒ_４およびＲ_５は同じであるかまたは異なり、それぞれ水素、または１〜６個の炭素からなる直鎖または分岐アルキルからなるか、
または、その薬学的に許容される塩からなる。

脂質製剤は、以下のうちから選択される１又は２以上のイオン化可能なカチオン性脂質を含んでもよい：

カチオン性脂質
脂質ナノ粒子は、好ましくは、脂質ナノ粒子を形成するのに好適なカチオン性脂質を含む。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理的ｐＨで正の正味荷電を保有する。

カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ） （Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドおよびｌ，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても知られている）、Ｎ−（ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ｌ，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ｌ，２−ジ−ｙ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、ｌ，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、ｌ，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、ｌ，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、ｌ，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、ｌ−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、ｌ，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．ＣＩ）、ｌ，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．ＣＩ）、ｌ，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−ｌ，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−ｌ，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、ｌ，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭ Ａ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［ｌ，３］ジオキソール−５−アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−へプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＭＣ３）、ｌ，ｌ’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−ｌ−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｃ１２−２００）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８ ３１−テトラエン−１９−イル ４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−ｌ−アミン（ＭＣ３エーテル）、４−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−ｌ−アミン（ＭＣ４エーテル）、または前述のいずれかの任意の組み合わせであり得る。他のカチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｉ）、Ｎ−（ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、ｌ，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、および２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を含むが、これらに限定されない。さらに、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などのカチオン性脂質の市販の調製物を使用することができる。

他の好適なカチオン性脂質は、国際公開第ＷＯ０９／０８６５５８号、同第ＷＯ０９／１２７０６０号、同第ＷＯ１０／０４８５３６号、同第ＷＯ１０／０５４４０６号、同第ＷＯ１０／０８８５３７号、同第ＷＯ１０／１２９７０９号、および同第ＷＯ２０１１／１５３４９３号；米国特許公開第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０１２８７６０号、および同第２０１２／００２７８０３号；米国特許第８，１５８，６０１号；およびＬｏｖｅら、ＰＮＡＳ、１０７（５）、１８６４−６９、２０１０において開示されている。他の好適なアミノ脂質は、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、およびＮ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−）を含む、代替脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するものを含む。一般に、特にフィルター滅菌の目的のために複合体を約０．３ミクロン未満のサイズにする必要がある場合、より低い飽和度のアシル鎖を有するアミノ脂質が、より容易にサイズ決めされる。Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を持つ不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質を使用してもよい。他の足場を使用して、アミノ基とアミノ脂質の脂肪酸または脂肪アルキル部分とを分離することもできる。

さらに好ましい一実施形態では、ＬＮＰは、特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６号による式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質を含む。この文脈において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６の開示も参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本発明のアミノまたはカチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能な、または脱プロトン化可能な基を有し、その結果、脂質は生理的ｐＨ以下のｐＨ（例えばｐＨ７．４）では正に荷電し、第２のｐＨ、好ましくは、生理的ｐＨ以上では、中性である。もちろん、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡プロセスであり、荷電脂質または中性脂質への言及は主な種の性質を指し、脂質の全てが荷電または中性形態で存在することを必要としないことが理解されよう。２つ以上のプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有する脂質、または双性イオン性の脂質は、本発明における使用から除外されない。特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質は、約４〜約１１の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａ、例えば、約５〜約７のｐＫａを有する。

カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約７０もしくは７５ｍｏｌ％、または約４５〜約６５ｍｏｌ％、または約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または約７０ｍｏｌ％を構成する。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質のモル基準で約２５％〜約７５％、例えば、モル基準で（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル１００％に基づいて）、約２０〜約７０％、約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、または約４０％を含む。一実施形態では、カチオン性脂質の核酸に対する比は、約３〜約１５、例えば、約５〜約１３、または約７〜約１１などである。

薬学的組成物
いくつかの態様では、本発明は、翻訳可能な化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。

薬学的組成物は、局所投与または全身投与が可能であり得る。いくつかの態様では、薬学的組成物は、任意の投与モダリティが可能であり得る。特定の態様では、投与は、静脈内、皮下、経肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、吸入、または経鼻投与を含む、任意の経路によるものであり得る。

本発明の実施形態は、脂質製剤中に翻訳可能な化合物を含有する薬学的組成物を含む。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質、および前述の任意の組み合わせから選択される１又は２以上の脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、翻訳可能な化合物を含有する薬学的組成物は、カチオン性脂質、リン脂質、コレステロール、およびペグ化脂質を含む。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、リポソームを実質的に含まなくてもよい。

さらなる実施形態では、薬学的組成物は、ナノ粒子を含むことができる。

本発明の活性分子の送達のための脂質および脂質組成物のいくつかの例は、ＷＯ／２０１５／０７４０８５に示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩの化合物を含む：
式中、Ｒ_１およびＲ_２は同じまたは異なり、それぞれ直鎖または分岐アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｌ_１およびＬ_２は同じであるかまたは異なり、それぞれ少なくとも５個の炭素原子を有する直鎖アルキルであるか、またはＮと複素環を形成し、Ｘ_１は結合、または−−ＣＯ−−Ｏ−−であり、それによりＬ_２−ＣＯ−−Ｏ−−Ｒ_２が形成され、Ｘ_２はＳまたはＯであり、Ｌ_３は結合または低級アルキルであり、Ｒ_３は低級アルキルであり、Ｒ_４およびＲ_５は同じであるかまたは異なり、それぞれ低級アルキルである。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３が存在せず、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも７個の炭素原子からなり、Ｒ_３がエチレンまたはｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がメチルまたはエチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも５個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３が存在せず、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも７個の炭素原子からなり、Ｒ_３がエチレンまたはｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がメチルまたはエチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも５個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３が存在せず、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも９個の炭素原子のアルケニルからなり、Ｒ_３がエチレンまたはｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がメチルまたはエチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも５個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３がメチレンであり、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも７個の炭素原子からなり、Ｒ_３がエチレンまたはｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がメチルまたはエチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも５個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３がメチレンであり、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも９個の炭素原子からなり、Ｒ_３がエチレンまたはｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がそれぞれメチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも７個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３がメチレンであり、Ｒ_１が、少なくとも９個の炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ_２が少なくとも７個の炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ_３がｎ−プロピレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がそれぞれメチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも７個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。また、本明細書に記載されるのは、式中、Ｌ_３がメチレンであり、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ少なくとも９個の炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ_３がエチレンであり、Ｒ_４およびＲ_５がそれぞれメチルであり、Ｌ_１およびＬ_２がそれぞれ、少なくとも７個の炭素原子を有する直鎖アルキルからなる、式ＩＩの化合物である。

例示的な実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＴＸ−００１、ＡＴＸ−００２、ＡＴＸ−００３、ＡＴＸ−００４、ＡＴＸ−００５、ＡＴＸ−００６、ＡＴＸ−００７、ＡＴＸ−００８、ＡＴＸ−００９、ＡＴＸ−０１０、ＡＴＸ−０１１、ＡＴＸ−０１２、ＡＴＸ−０１３、ＡＴＸ−０１４、ＡＴＸ−０１５、ＡＴＸ−０１６、ＡＴＸ−０１７、ＡＴＸ−０１８、ＡＴＸ−０１９、ＡＴＸ−０２０、ＡＴＸ−０２１、ＡＴＸ−０２２、ＡＴＸ−０２３、ＡＴＸ−０２４、ＡＴＸ−０２５、ＡＴＸ−０２６、ＡＴＸ−０２７、ＡＴＸ−０２８、ＡＴＸ−０２９、ＡＴＸ−０３０、ＡＴＸ−０３１、ＡＴＸ−０３２、ＡＴＸ−０８１、ＡＴＸ−０９５、およびＡＴＸ−１２６、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物を含む。

特定の例示的な実施形態では、カチオン性脂質は、ＡＴＸ−００２、ＡＴＸ−０８１、ＡＴＸ−０９５、またはＡＴＸ−１２６を含む。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩は、ナノ粒子または脂質分子の二重層を含む脂質組成物で提示されてもよい。脂質二重層は、好ましくは中性脂質またはポリマーをさらに含む。脂質組成物は、液体媒体を含むことが好ましい。組成物は、本発明の翻訳可能な化合物をさらにカプセル化することが好ましい。脂質組成物は、好ましくは、本発明の翻訳可能な化合物および中性脂質またはポリマーをさらに含む。脂質組成物は、翻訳可能な化合物をカプセル化することが好ましい。

さらなる実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩＩの化合物を含む：
式中、Ｒ_１およびＲ_２は同じであるかまたは異なり、それぞれ１〜９個の炭素からなる直鎖または分岐アルキル、２〜１１個の炭素からなるアルケニルもしくはアルキニル、またはコレステリルであり、Ｌ_１およびＬ_２は同じであるかまたは異なり、それぞれ５〜１８個の炭素からなる直鎖アルキレンまたはアルケニレンでありＸ_１は−−ＣＯ−−Ｏ−−であり、これにより−Ｌ_２−ＣＯ−−Ｏ−−Ｒ_２が形成され、Ｘ_２はＳまたはＯであり、Ｘ_３は−−ＣＯ−−Ｏ−−であり、これにより−Ｌ_１−ＣＯ−−Ｏ−−Ｒ_１が形成され、Ｌ_３は結合であり、Ｒ_３は１〜６個の炭素からなる直鎖または分岐アルキレンであり、Ｒ_４およびＲ_５は同じであるかまたは異なり、それぞれ水素、または１〜６個の炭素からなる直鎖もしくは分岐アルキルであるか、またはその薬学的に許容される塩である一実施形態では、Ｘ_２はＳである。別の実施形態では、Ｒ_３は、エチレン、ｎ−プロピレン、またはイソブチレンから選択される。さらに別の実施形態では、Ｒ_４およびＲ_５は、別々にメチル、エチル、またはイソプロピルである。さらに別の実施形態では、Ｌ_１およびＬ_２は同じである。さらに別の実施形態では、Ｌ_１およびＬ_２は異なる。さらに別の実施形態では、Ｌ_１またはＬ_２は、７個の炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに別の実施形態では、Ｌ_１またはＬ_２は、９個の炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２は同じである。さらに別の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２は異なる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれアルケニルからなる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれアルキルからなる。さらに別の実施形態では、アルケニルは、単一の二重結合からなる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１またはＲ_２は９個の炭素からなる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１またはＲ_２は１１個の炭素からなる。さらに別の実施形態では、Ｒ_１またはＲ_２は７個の炭素からなる。さらに別の実施形態では、Ｌ_３は結合であり、Ｒ_３はエチレンであり、Ｘ_２はＳであり、Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれメチルである。さらに別の実施形態では、Ｌ_３は結合であり、Ｒ_３はｎ−プロピレンであり、Ｘ_２はＳであり、Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれメチルである。さらに別の実施形態では、Ｌ_３は結合であり、Ｒ_３はエチレンであり、Ｘ_２はＳであり、Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれエチルである。

当業者には理解されるように、式ＩＩおよびＩＩＩの化合物は、本開示の範囲内でもある塩を形成する。本明細書における式ＩＩおよびＩＩＩの化合物への言及は、他に示されない限り、その塩への言及を含むと理解される。本明細書で使用されるとき、「塩（複数可）」という用語は、無機酸および／または有機酸で形成される酸性塩、ならびに無機塩基および／または有機塩基で形成される塩基性塩を意味する。さらに、式ＩＩまたはＩＩＩの化合物が、ピリジンまたはイミダゾールなどの、しかしこれらに限定されない塩基性部分と、カルボン酸などの、しかしこれらに限定されない酸性部分との両方を含有する場合、双性イオン（「内部塩」）が形成されてもよく、これは、本明細書で使用されるとき、「塩（複数可）」という用語の中に含まれる。塩は、薬学的に許容される（すなわち、非毒性、生理学的に許容される）塩であり得るが、他の塩も有用である。式ＩＩまたはＩＩＩの化合物の塩は、塩が沈殿する培地などの培地中、または水性培地中で、例えば、式ＩＩまたはＩＩＩの化合物を、等量などの酸または塩基の一定量と反応させることにより形成されてもよく、次いで、凍結乾燥される。

例示的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、ピロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩（本明細書に記載のものなど）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩（トシレートとしても知られる）、ウンデカン酸塩などが含まれる。さらに、塩基性薬学的化合物からの薬学的に有用な塩の形成のために好適であると一般に考えられている酸は、例えば、Ｓ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７） ６６（１）１−１９；Ｐ．Ｇｏｕｌｄ、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９８６） ３３ ２０１−２１７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＴｈｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｂｏｏｋ（Ｆｏｏｄ ＆ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．それらのウェブサイトにて）により考察されている。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、例えば、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンと形成される）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミン、およびアルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩が含まれる。塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルの塩化物、臭化物、ヨウ化物）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、ジアミル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、ステアリルの塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ハロゲン化アリールアルキル（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）等などの物質を用いて、第四級化され得る。

そのような全ての酸および塩基の塩は、本開示の範囲内で薬学的に許容される塩であることが意図され、全ての酸および塩基の塩は、本開示の目的のために対応する化合物の遊離形態と同等であると見なされる。式ＩＩまたはＩＩＩの化合物は、水和形態を含む非溶媒和形態および溶媒和形態で存在し得る。一般に、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態は、本開示の目的のための非溶媒和形態と同等である。式ＩＩまたはＩＩＩの化合物およびその塩、溶媒和物は、それらの互変異性形態で（例えば、アミドまたはイミノエーテルとして）存在し得る。そのような互変異性体は全て、本開示の一部として本明細書で企図されている。

本明細書に記載のカチオン性脂質化合物は、本発明の翻訳可能な化合物と組み合わされて、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成することができる。粒子、リポソーム、またはミセルによって送達される本発明の翻訳可能な化合物は、気体、液体、または固体の形態であってもよい。カチオン性脂質化合物および翻訳可能な化合物は、他のカチオン性脂質化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わされて、粒子を形成してもよい。次いで、これらの粒子は、場合により、薬学的賦形剤と組み合わされて、薬学的組成物を形成することができる。

特定の実施形態では、カチオン性脂質化合物は、相対的に細胞非毒性である。カチオン性脂質化合物は、生体適合性および生分解性であり得る。カチオン性脂質は、約５．５〜約７．５、より好ましくは、約６．０〜約７．０の範囲のｐＫａを有し得る。それは、約３．０〜約９．０、または約５．０〜約８．０の望ましいｐＫａを持つように設計されてもよい。

カチオン性脂質化合物を含有する組成物は、３０〜７０％のカチオン性脂質化合物、０〜６０％のコレステロール、０〜３０％のリン脂質、および１〜１０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。好ましくは、組成物は、３０〜４０％のカチオン性脂質化合物、４０〜５０％のコレステロール、および１０〜２０％のＰＥＧである。他の好ましい実施形態では、組成物は、５０〜７５％のカチオン性脂質化合物、２０〜４０％のコレステロール、および５〜１０％のリン脂質、および１〜１０％のＰＥＧである。組成物は、６０〜７０％のカチオン性脂質化合物、２５〜３５％のコレステロール、および５〜１０％のＰＥＧを含有し得る。組成物は、最大９０％のカチオン性脂質化合物、および２〜１５％のヘルパー脂質を含んでもよい。製剤は、例えば、８〜３０％の化合物、５〜３０％のヘルパー脂質、および０〜２０％のコレステロール；４〜２５％のカチオン性脂質、４〜２５％のヘルパー脂質、２〜２５％のコレステロール、１０〜３５％のコレステロール−ＰＥＧ、および５％のコレステロール−アミン；または２〜３０％のカチオン性脂質、２〜３０％のヘルパー脂質、１〜１５％のコレステロール、２〜３５％のコレステロール−ＰＥＧ、および１〜２０％のコレステロール−アミン；または最大９０％のカチオン性脂質、および２〜１０％のヘルパー脂質、またはさらには１００％のカチオン性脂質、を含有する脂質粒子製剤であり得る。

いくつかの実施形態では、１又は２以上のコレステロールに基づく脂質は、コレステロール、ＰＥＧ化コレステロール、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、および１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンから選択される。例示的な一実施形態では、コレステロールに基づく脂質は、コレステロールである。

いくつかの態様では、１又は２以上のペグ化脂質、すなわち、ＰＥＧ修飾脂質。いくつかの実施形態では、１又は２以上のＰＥＧ修飾された脂質は、Ｃ_６−Ｃ_２０の長さのアルキル鎖（複数可）で脂質に共有結合した、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾された脂質は、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］などの誘導体化セラミドである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化された脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）−ＰＥＧ−２Ｋである。例示的な一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ化コレステロールである。

追加の実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスまたは細菌ベクター内にオリゴマー化合物を含有することができる。

本開示の薬学的組成物は、当技術分野で知られている担体、希釈剤、または賦形剤を含んでもよい。薬学的組成物および方法の例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．１９８５）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に記載されている。

薬学的組成物のための賦形剤の例には、抗酸化剤、懸濁剤、分散剤、防腐剤、緩衝剤、張性剤、および界面活性剤が含まれる。

本発明の薬剤または薬学的製剤の有効用量は、細胞内で翻訳可能な分子の翻訳を引き起こすのに十分な量であり得る。

治療有効用量は、治療効果を引き起こすのに十分な薬剤または製剤の量であり得る。治療的有効用量は、１回以上の別々の投与で、かつ異なる経路により、投与することができる。当技術分野で理解されるように、治療有効用量または治療的有効量は、本発明の薬学的組成物に含まれる治療剤の総量に基づいて主に決定される。一般に、治療的有効量は、対象に有意な利益を達成するのに十分である（例えば、ＧＳＤＩＩＩを治療する、調節する、治癒する、予防する、および／または改善する）。例えば、治療的有効量は、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに十分な量であり得る。一般に、治療剤を必要とする対象に投与される治療剤（例えば、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマー）の量は、対象の特徴に依存するであろう。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全般的な健康状態、年齢、性別、および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な投与量を容易に決定することができるであろう。さらに、客観的アッセイと主観的アッセイの両方を任意で使用して、最適な用量範囲を特定することができる。

本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の治療有効用量の翻訳可能な化合物（例えば、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマー）の単回投与および複数回投与を企図する。ＡＧＬをコードする翻訳可能な化合物を含む薬学的組成物は、対象の状態の性質、重症度、および程度（例えば、対象のＧＳＤＩＩＩ疾患状態およびＧＳＤＩＩＩの関連症状の重症度、および／または対象のＡＧＬ活性レベル）に応じて、通常の間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、治療有効用量の本発明の翻訳可能な化合物（例えば、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマー）は、通常の間隔で（例えば、１年に１回、６ヶ月に１回、４ヶ月に１回、３ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回）、隔週、毎週、毎日、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、または連続的に、定期的に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、そこに含まれるＡＧＬをコードする翻訳可能な化合物の持続放出に適するように製剤化される。そのような持続放出組成物は、延長された投与間隔で対象に都合よく投与され得る。例えば、一実施形態では、本発明の薬学的組成物は、対象に１日２回、毎日、または１日おきに投与される。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、対象に、週に２回、週に１回、１０日ごと、２週間ごと、２８日ごと、毎月、６週間ごと、８週間ごと、隔月ごと、３ヶ月ごと、４ヶ月ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと、または１年に１回投与される。また、本明細書では、長期にわたってＡＧＬをコードする翻訳可能な化合物を送達または放出するためのデポ投与（例えば、皮下、筋肉内）用に製剤化された薬学的組成物も企図される。好ましくは、使用される持続放出手段は、安定性を高めるために、ＡＧＬをコードする翻訳可能な化合物に加えられた修飾と組み合わされる。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、投与時に、１〜１０００ｐｇ／ｍｌ、または１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または１〜１０００μｇ／ｍｌ、またはそれ以上のＡＧＬの血清または血漿レベルをもたらし得る。

いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療対象の肝臓ＡＧＬタンパク質レベルが増大する可能性がある。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物を投与すると、治療前の対象のベースラインＡＧＬタンパク質レベルに対して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の肝臓ＡＧＬタンパク質レベルにおける増大がもたらされる。特定の実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前の対象のベースライン肝臓ＡＧＬレベルに対して、肝臓ＡＧＬレベルの増大がもたらされる。いくつかの実施形態では、ベースライン肝臓ＡＧＬレベルに対する肝臓ＡＧＬレベルの増大は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上である。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインレベルと比較して肝臓でのＡＧＬの発現の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療対象の肝臓の総タンパク質１ｍｇあたり、約１０ｎｇ／ｍｇ、約２０ｎｇ／ｍｇ、約５０ｎｇ／ｍｇ、約１００ｎｇ／ｍｇ、約１５０ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約２５０ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約３５０ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約４５０ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇ、または約１５００ｎｇ／ｍｇ、またはそれを上回るＡＧＬタンパク質レベルの発現がもたらされる。

いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーを含む組成物の治療有効用量を投与すると、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、グリコーゲン、および限界デキストリン（つまり、グリコーゲンの加水分解によって産生される低分子炭水化物）から選択される１又は２以上のマーカーのレベルの低下がもたらされる。

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、生体試料中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、および／またはＣＰＫレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースラインＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、および／またはＣＰＫレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％だけ、生体試料（例えば、血漿または血清試料）中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、および／またはＣＰＫレベルの低下がもたらされる。いくつかの実施形態では、生体試料は、血漿、血清、全血、尿、または脳脊髄液から選択される。

特定の例示的な実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、例えば、ＡＬＴ活性／リットル（Ｕ／ｌ）の単位で測定されるような、血清または血漿試料中のＡＬＴレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースラインＡＬＴレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％だけ、生体試料（例えば、血漿または血清試料）中のＡＬＴレベルの低下がもたらされる。例示的な一実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースラインＡＬＴレベルと比較して、少なくとも約５０％だけ、生体試料（例えば、血漿または血清試料）中のＡＬＴレベルの低下がもたらされる。さらなる例示的な一実施形態では、ＡＬＴレベルは、絶食後、例えば、絶食の６、８、１０、１２、１８、または２４時間後に測定される。

他の例示的な実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、例えば、ＡＳＴ活性／リットル（Ｕ／ｌ）の単位で測定されるような、血清または血漿試料中のＡＳＴレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースラインＡＳＴレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％だけ、生体試料（例えば、血漿または血清試料）中のＡＳＴレベルの低下がもたらされる。例示的な一実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースラインＡＳＴレベルと比較して、少なくとも約５０％だけ、生体試料（例えば、血漿または血清試料）中のＡＳＴレベルの低下がもたらされる。さらなる例示的な一実施形態では、ＡＳＴレベルは、絶食後、例えば、絶食の６、８、１０、１２、１８、または２４時間後に測定される。

ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、および／またはＣＰＫレベルの測定は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、例えば、Ｌｉｕら、２０１４、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １１１：４６７−７６に記載されているようなＦｕｊｉ Ｄｒｉ−Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＦＤＣ ３５００を使用して、実施することができる。

他の例示的な実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、生体試料中のグリコーゲンレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースライングリコーゲンレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％だけ、生体試料（例えば、肝臓試料）中のグリコーゲン蓄積の軽減がもたらされる。いくつかの実施形態では、生体試料は、肝臓、心臓、横隔膜、大腿四頭筋、および腓腹筋から選択される器官の一部である。例示的な一実施形態では、生体試料は、肝臓切片、例えば、肝細胞の切片である。

他の例示的な実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、生体試料中の限界デキストリンレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の翻訳可能な分子を含む組成物の治療有効用量を投与すると、治療前のベースライン限界デキストリンレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％だけ、生体試料（例えば、肝臓試料）中の限界デキストリン蓄積の軽減がもたらされる。いくつかの実施形態では、生体試料は、肝臓、心臓、横隔膜、大腿四頭筋、および腓腹筋から選択される器官の一部である。例示的な一実施形態では、生体試料は、肝臓切片、例えば、肝細胞の切片である。さらなる例示的な一実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、治療前のベースライン限界デキストリンレベルと比較して、肝臓試料中の限界デキストリンレベルの少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％の軽減をもたらす。

さらなる実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、治療対象の肝線維症の発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、定期的に投与された場合、ＧＳＤＩＩＩを患っている対象において肝線維症の発症を緩慢化させるか、肝線維症の量を軽減させる。

インビボでの活性剤薬剤（例えば、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマー）の治療有効用量は、約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量であり得る。例えば、治療有効用量は、約０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１０〜１００ｍｇ ｋｇであってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．５〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４．５ｍｇ／ｋｇ、または約２〜約４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で提供される。

インビボでの活性薬剤（例えば、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマー）の治療有効用量は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上の用量であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＧＬをコードする翻訳可能なオリゴマーは、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または約６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で提供される。

本明細書に示される核酸塩基配列は、特に明記しない限り、左から右に、５’〜３’である。

トランスフェクション
一部の実験では、翻訳可能なメッセンジャー分子を９６ウェルプレート中ののＨｅｐａ１−６またはＡＭＬ１２細胞にトランスフェクトした。全ててのトランスフェクションについて、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元指示書に従って使用した。他の適切な細胞株には、ＨＥＫ２９３およびＨｅｐ３Ｂ細胞が含まれる。

インビトロでのトランスフェクションプロトコルの一例は、以下のとおりである：

トランスフェクションの少なくとも８時間前に、肝細胞Ｈｅｐａ１−６細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり５０００細胞でプレーティングする。

１０％のＦＢＳおよび非必須アミノ酸を含有する９０μＬのＤＭＥＭ培地に代え、トランスフェクション実験を開始する直前に９６ウェルプレートの各ウェルに９０μＬを加える。

製造元の指示に従って、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の翻訳可能な分子複合体を調製する。

９６ウェルプレート中の細胞を含有するウェルに複合体の１０μＬを移す。

目的の時点の後に培地を採取し、各ウェルに１００μＬの新鮮な培地を追加する。標準的な製造元のプロトコルを使用して、ＡＧＬについてのＥＬＩＳＡアッセイが実行されるまで、培地は−８０℃で保たれる。

インビボでのトランスフェクションプロトコルの一例は、次のとおりである：

翻訳可能な分子は、ナノ粒子を用いて製剤化される。

ナノ粒子製剤化された翻訳可能な分子（１ｍｇ／ｋｇ）をＢＬ５７ＢＬ／ｃマウス（４〜６週齢）に、外側尾静脈への標準的なｉｖ注射により注射する。

注射後の適切な時間に、ヘパリンでコーティングされた微量遠心管中の約５０μＬの血液を採取する。

４℃で３，０００Ｘｇで１０分間遠心分離する。

上清（血漿）を新しい微量遠心管に移す。標準的な製造元のプロトコルを使用して、ＡＧＬについてのＥＬＩＳＡアッセイが実行されるまで、血漿は−８０℃で保たれる。

ナノ粒子製剤
ｍＲＮＡを含有するエタノール／水性緩衝液中の脂質を適切な容量で使用して、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を調製することができる。Ｎａｎｏｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体デバイスをこの目的のために使用し、その後、下流の処理を行うことができる。例えば、ナノ粒子を調製するために、所望の量の標的ｍＲＮＡを５ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解してもよい。脂質は適切なモル比でエタノール中で溶解されることができる。構成脂質のモルパーセント比は、例えば、５０％のイオン化可能な脂質、７％のＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、４０％のコレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、および３％のＤＭＧ−ＰＥＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ鎖の分子量：２０００；ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり得る。次に、脂質とｍＲＮＡ溶液をマイクロ流体デバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）中で１：３（エタノール：水相）の流量比で組み合わせることができる。合わせた合計流速は１２ｍＬ／分であり得る。脂質ナノ粒子を形成し、その後、透析装置（Ｆｌｏａｔ−ａ−ｌｙｚｅｒ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）でリン酸緩衝液を使用して一晩透析し、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮することにより、精製することができる。粒子サイズは、動的光散乱（ＺＥＮ３６００、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって決定することができる。「カプセル化」効率は、ＬＮＰスラリー（Ｆｉ）にＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を添加した際の蛍光によって測定されるカプセル化されていないｍＲＮＡ含量を決定し、次に、この値をＬＮＰの１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｆｔ）による溶解時に得られる総ｍＲＮＡ含量と比較することにより、計算することができ、ここで、「カプセル化」のパーセンテージ＝（Ｆｔ−Ｆｉ）／Ｆｔ×１００である。カプセル化とは、形態に関係なく、ナノ粒子中にｍＲＮＡを含めることを指す。

Ｉｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ
９６ウェルコラーゲンプレートを使用して、ＤＭＥＭ／ＦＢＳ培養培地中に適切な密度で細胞を播種した。最適なコンフルエンスで、細胞をトランスフェクション試薬ミックス（ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘおよびＯｐｔｉ−ＭＥＭ）で希釈した標的ｍＲＮＡでトランスフェクトした。細胞をＣＯ２インキュベーター内に置き、成長させた。所望の時点で、培地を除去し、細胞を４％の新鮮なＰＦＡで２０分間固定した。その後、固定液を除去し、細胞をＴＢＳＴで５分間数回透過処理した。透過処理洗浄が完了すると、細胞をブロッキングバッファーで４５分間インキュベートした。次に、一次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＴＢＳＴで数回洗浄し、次いで、ブロッキングバッファーで希釈したＣｅｌｌＴａｇ ７００染色液を含有する二次抗体と共に１時間インキュベートした。最後に、細胞をＴＢＳＴで数回洗浄し、続いてＴＢＳで最後に洗浄した。次に、プレートをＬｉｃｏｒ検出システムを使用して画像化し、ＣｅｌｌＴａｇ ７００で標識した細胞の総数に対してデータを正規化した。

テールＰＣＲ産物の生成
各ｍＲＮＡ発現コンストラクトを含有するプラスミドＤＮＡ（１０ｎｇ）を使用して、製造元の指示に従って、２Ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲミックス（ＫＲ０３７０）を使用した５０μｌのＰＣＲ反応においてポリＡテール１２０ＰＣＲ産物を生成することができる。この産物は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの２％のゲル上で確認され、低分子量ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１００６８−０１３）の強度に基づいておおよそ定量化され、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで洗浄して、５０ｕｌの水中に再懸濁することができる。

合成のためのインビトロ転写（ＩＶＴ）
以下のプロトコルは、ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ試薬を使用した２００μｌのＩＶＴ反応についてのものであり、約１ｍｇのＲＮＡが得られるはずである。必要に応じて、個々の１００ｍＭのＮＴＰストック（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰヌクレオチド、または化学修飾された対応物）を解凍し、それらを一緒にプールすることにより、２．５ＸＮＴＰミックスを調製した。ＩＶＴ反応では、約２〜４μｇの鋳型を２００μｌの反応に使用した。１０倍のＩＶＴ反応バッファー、２．５倍のｄＮＴＰミックス、鋳型ＤＮＡ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをピペッティングによりよく混合し、３７℃で４時間インキュベートする。ＤＮＡ鋳型を分解するために、ＩＶＴ反応液を７００ｕｌのヌクレアーゼ不含水で希釈し、１０倍のＤＮａｓｅＩバッファーとＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅＩの２０ｕｌをＩＶＴミックスに加え、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、（１ｍｌに）希釈され、かつＤＮａｓｅ処理された反応物は、製造元の指示に従って、最終的にＲＮａｓｅ不含水で溶出することにより、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉカラムにより精製される。次いで、使用した再懸濁バッファーに応じて、Ａ２６０／Ａ２８０が約１．８〜２．２になるはずのＵＶ吸光度によって、精製されたＲＮＡを定量化する。

ＩＶＴ ＲＮＡの酵素的キャッピング
酵素的キャッピングのために、最大１ｍｇのＩＶＴ転写物の処理に適した、ＮＥＢのワンステップキャッピングおよび２’Ｏ−メチル化反応の５０倍にスケールアップしたバージョンを使用することができる。転写物の長さは１００ｎｔほど短いという仮定に基づいて、２０μｌの反応で１０μｇのＲＮＡが推奨される。ただし、転写物について、反応に対する基質の容量をより大きくすることは許容されるが、転写物の長さは一般により長くなる（約３００〜６００ｎｔ）。キャッピング反応を開始する前に、ＲＮＡを６５℃で５分間変性させ、次いで、急冷して、二次構造を緩和させる。合計１ｍｌのキャッピング反応では、１００μｌ（１０倍）のキャッピングバッファーと共に７００μｌのヌクレアーゼ不含水中の１ｍｇの変性ＲＮＡを使用し、５０μｌ（１０ｍＭ）ＧＴＰ、５０μｌ（４ｍＭ）のＳＡＭ、５０μｌの（１０Ｕ／μｌ）ワクシニアキャッピング酵素、および５０μｌのｍＲＮＡキャップ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを５０Ｕ／μｌで合わせ、３７℃で１時間インキュベートする。得られたキャップされたｍＲＮＡは、ＲＮａｓｅ不含水を使用して溶出され、ＲＮｅａｓｙカラム上で再精製され、ナノドロップにより定量化される。ｍＲＮＡは、二次構造を除去するために変性および急冷した後、変性ゲルにレーンあたり５００ｎｇの精製産物を流すことにより、ゲル上でも可視化される。

実施例１：参照用の翻訳可能な分子５３４。
この実施例では、参照用の翻訳可能な分子５３４が作製され、ヒトＷＴアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の発現に使用された。翻訳可能な分子は、５’キャップ（７ｍＧｐｐｐＧ）、ＴＥＶの５’ＵＴＲ、コザック配列、ＷＴ ＡＧＬ ＣＤＳ（配列番号１）、アフリカツメガエルβ−グロビンの３’ＵＴＲ、および１１４個のＡからなるポリ（Ａ）テール領域（すなわち、「ポリ（Ａ）１１４テール領域」）を含んだ。参照用の翻訳可能な分子はさらに、ＡＧＬ ＣＤＳのすぐ下流に配列番号４０の配列を含んだ。この参照用の翻訳可能な分子は、ウリジンの代わりにＮ^１メチルプソイドウリジンを用いて合成された。

この参照用翻訳可能な分子の構造の詳細は以下のとおりである：配列番号３のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ、配列番号４のコザック配列、配列番号５のアフリカツメガエルベータグロビン（ＸＢＧ）３’ＵＴＲ、および配列番号６のポリ（Ａ）１１４テール。

以下の実施例の翻訳可能な分子は、ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャップである５’キャップを用いて合成することができる。以下の実施例の翻訳可能な分子は、５’−ＵＴＲ（例えば、ＴＥＶの５’ＵＴＲ（配列番号３））、翻訳開始配列（例えば、配列番号４のコザック配列）、配列番号４０の配列、３’ＵＴＲ（例えば、アフリカツメガエルベータグロビンの３’ＵＴＲ（配列番号５））、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号６、配列番号３８、または配列番号３９のポリＡテール）を含有することができる。

実施例２：ＡＧＬをコードする翻訳可能な分子。
この実施例では、翻訳可能な分子５２２〜５３３、５４６、７３０〜７４０、および１７８３〜１７８４を作製し、有利にも増大した翻訳効率を伴ってヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）を発現させるために使用した。ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）を発現するこれらの翻訳可能な分子は、ＧＳＤＩＩＩを改善または治療するための方法での使用に好適な活性を示した。これらの翻訳可能な分子は、５’キャップ（７ｍＧｐｐｐＧ）、ＴＥＶの５’ＵＴＲ、コザック配列、ＡＧＬ ＣＤＳ、およびアフリカツメガエルベータグロビンの３’ＵＴＲを含んだ。翻訳可能な分子５２２〜５３３、５４６、および１７８３〜１７８４は、ポリ（Ａ）１１４テール領域をさらに含む。翻訳可能な分子７３０は、ポリ（Ａ）１００テール領域をさらに含み、一方、翻訳可能な分子７３１〜７４０は、ポリ（Ａ）１１０テール領域をさらに含む。翻訳可能な分子５２２〜５３３、５４６、７３０〜７４０、および１７８３〜１７８４は、ＡＧＬ ＣＤＳのすぐ下流に配列番号４０の配列をさらに含む。ポリ（Ａ）１１４テール領域ではなく、ポリ（Ａ）１００テール領域を含有することを除いて、それぞれ５４６および１７８３と同一である、２つの追加の翻訳可能な分子、２２５８および２２５９が開発された。１７８３および２２５９のコード配列は、配列番号４５に反映されるように、１２個のヌクレオチドの違いを含むように任意に修飾されてもよい。この実施例で記載される翻訳可能な分子は、ウリジンの代わりにＮ^１−メチルプソイドウリジンを用いて合成された。

翻訳可能な分子の各々のＡＧＬ ＣＤＳは、以下の配列で構成される：

この実施例の翻訳可能な分子は、ＡＭＬ１２およびＣ２Ｃ１２細胞で翻訳され、ヒトＡＧＬを産生した。

実施例３：アフリカツメガエルベータ−グロビン３’ＵＴＲに基づく翻訳エンハンサー。
この実施例では、翻訳可能な分子の翻訳効率を高めるのに使用するための３’ＵＴＲ配列の構造が示される。

配列番号３３〜３７に示される塩基配列は、機能的にアフリカツメガエルベータグロビンの３’−ＵＴＲに対応し得る翻訳可能な分子の部分である。完全な翻訳可能な分子は、５’キャップ（ｍ７ＧｐｐｐＧｍ）、５’−ＵＴＲ、および下の配列の上流のコード領域（ＣＤＳ）、および下の配列の下流のポリＡテールを含み、そのそれぞれが天然ヒトｍＲＮＡの構造に対応する。上記のように、場合によりコザック配列が使用されてもよい。したがって、以下の断片を組み込んだ翻訳可能な分子は、翻訳効率を高めることが可能である。アフリカツメガエルベータグロビン遺伝子配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１０９６３４７．１で示される。

実施例４：ヒト初代肝細胞におけるＡＧＬ発現
この実施例では、ヒト初代肝細胞に、コドン最適化したｍＲＮＡ分子５４６、１７８３、および１７８４をトランスフェクトした。ＡＧＬタンパク質の発現は、トランスフェクションの６、２４、４８、および７２時間後にＩｎ−Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）により測定した。未処理の対照（「ｕｎｔ」）と比較したｍＲＮＡ配列の発現を図５に示す。

実施例５：野生型マウスにおけるＡＧＬタンパク質発現のインビボ分析
この実施例では、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、脂質ナノ粒子と共に製剤化されたヒトＡＧＬ ｍＲＮＡを注射した。注射の６時間後にマウスを犠牲にした。肝生検試料をマウスから採取し、肝臓ホモジネートにおけるヒトおよびマウスＡＧＬタンパク質発現を分析した。図６は、さまざまなｍＲＮＡ分子からのヒトＡＧＬタンパク質の異所性発現を示す。図７は、マウスＡＧＬタンパク質レベルを示し、処理されたマウスにわたってマウスＡＧＬタンパク質の内因性発現の同様のレベルを示す。図６および７に示されるように、翻訳可能な分子５４６．７は、翻訳可能な分子５４６と同一の核酸塩基配列を有するが、ウリジンの代わりにＮ^１−メチルプソイドウリジンではなく５−メトキシウリジンを用いて合成された。

実施例６：ｍＲＮＡ処理はＧＳＤ３マウスにおけるグリコーゲン蓄積を軽減する
この実施例では、ＡＧＬノックアウトマウスを、ビヒクル、またはＡＴＸ２脂質ナノ粒子で製剤化された翻訳可能な分子５４６で処置した。ビヒクル（「ＶＥＨ」）で処置したノックアウトマウスからの肝臓は、顕著ないし重度の肝細胞の空胞化、および中程度ないし顕著な肝細胞内のグリコーゲン蓄積を示した（図８）。対照的に、ＡＴＸ２脂質ナノ粒子で製剤化した翻訳可能な分子５４６で処置したノックアウトマウスからの肝臓は、軽度ないし中程度のみの肝細胞の空胞化、および軽度ないし中程度のみの肝細胞内のグリコーゲン蓄積を有した（図９）。この実施例に示されている組織病理学の結果に基づくと、ビヒクルで処置されたＫＯマウスと比較して、ｍＲＮＡで処置されたノックアウトマウスからの肝臓における肝細胞の空胞化および肝臓内のグリコーゲン蓄積の重症度が軽減されたようにみえる。

実施例７：ＡＧＬを発現する追加の翻訳可能な分子
４つの追加の翻訳可能な分子−１９７０、１９８７、ＳＤ１、およびＳＤ２−は、それぞれ配列番号４１、４２、４３、および４４に示された、さらに修飾されたコドン最適化ヒトＡＧＬコード配列を用いて設計された。翻訳可能な分子１９７０、１９８７、ＳＤ１、およびＳＤ２は、５’キャップ（７ｍＧｐｐｐＧ）、ＴＥＶの５’ＵＴＲ、コザック配列、コード配列のすぐ下流の配列番号４０の配列、アフリカツメガエルベータグロビンの３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）テール領域（例えば、ポリ（Ａ）１００、１１０、または１１４テール領域）をさらに含む。これらの翻訳可能な分子は、ウリジンの代わりにＮ^１−メチルプソイドウリジンまたは５−メトキシウリジンのいずれかを用いて任意に合成することができる。

本明細書に具体的に記載されている全ての刊行物、特許、および文献は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。

本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、材料、および試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１又は２以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。また、「含む」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、互換的に使用することができることも留意される。

さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形であれ本開示の残りの部分を限定するものではない。

本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示される各々の特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。

Claims (65)

1. ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはその断片を発現するためのポリヌクレオチドであって、天然および化学修飾ヌクレオチドを含み、前記ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能である、前記ポリヌクレオチド。
2. 前記ポリヌクレオチドが、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較してコドン最適化されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記化学修飾ヌクレオチドが、
   ５−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−メトキシシチジン、５−プロピニルシチジン、２−チオシチジン；
   ５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５，６−ジヒドロ−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、４−チオウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシメチルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−メトキシウリジン、５−プロピニルウリジン、５−ブロモウリジン、５−ヨードウリジン、５−フルオロウリジン；
   プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^１−メチルプソイドウリジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ^１−メチルプソイドウリジン、Ｎ^１−エチルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシメチルプソイドウリジン、およびアラウリジン；
   Ｎ^６−メチルアデノシン、２−アミノアデノシン、３−メチルアデノシン、７−デアザアデノシン、８−オキソアデノシン、イノシン；
   チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、および６−Ｏ−メチルグアニン、から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記化学修飾ヌクレオチドが、Ｎ^１−メチルプソイドウリジンである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記化学修飾ヌクレオチドが、５−メトキシウリジンである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記化学修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジンとＮ^１−メチルプソイドウリジンとの組み合わせである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記化学修飾ヌクレオチドが、５−メチルシチジンとＮ^１−メチルプソイドウリジンとの組み合わせである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記化学修飾ヌクレオチドが、５−メトキシウリジンとＮ^１−メチルプソイドウリジンとの組み合わせである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
9. 前記化学修飾ヌクレオチドが、５−メトキシウリジンと、５−メチルシチジンと、Ｎ^１−メチルプソイドウリジンとの組み合わせである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記ポリヌクレオチドの翻訳効率が、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して少なくとも５０％増大している、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記ポリヌクレオチドの翻訳効率が、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して少なくとも３倍増大している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
12. 前記ポリヌクレオチドが、２００〜１２，０００個のヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
13. 化学修飾ヌクレオチドが前記ヌクレオチドの１〜９９％を構成する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
14. 化学修飾ヌクレオチドが前記ヌクレオチドの５０〜９９％を構成する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
15. 前記ポリヌクレオチドが、５’キャップ、５’非翻訳領域、コード領域、３’非翻訳領域、およびテール領域を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
16. 前記ポリヌクレオチドが翻訳エンハンサーを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
17. 前記ポリヌクレオチドが、前記ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するように哺乳動物細胞において翻訳可能である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
18. 前記ポリヌクレオチドが、前記ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するように対象においてインビボで翻訳可能である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
19. 前記ポリヌクレオチドの翻訳産物が、活性ヒトＡＧＬまたはＡＧＬ活性を有するその断片である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
20. 前記ポリヌクレオチドが、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して低減された免疫原性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
21. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
22. ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはその断片を発現するための翻訳可能なオリゴマーであって、天然および化学修飾ヌクレオチド、１又は２以上のＵＮＡモノマーを含み、前記ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を提供するように発現可能である、オリゴマー。
23. 前記オリゴマーが、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較してコドン最適化されている、請求項２２に記載のオリゴマー。
24. 前記オリゴマーの翻訳効率が、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して少なくとも５０％増大している、請求項２２に記載のオリゴマー。
25. 前記オリゴマーの翻訳効率が、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して少なくとも３倍増大している、請求項２２に記載のオリゴマー。
26. 前記化学修飾ヌクレオチドが、
    ５−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−メトキシシチジン、５−プロピニルシチジン、２−チオシチジン；
    ５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシメチルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−メトキシウリジン、５−プロピニルウリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、５，６−ジヒドロ−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン；
    プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^１−メチルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシメチルプソイドウリジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ^１−メチルプソイドウリジン、Ｎ^１−エチルプソイドウリジン、アラウリジン；
    Ｎ^６−メチルアデノシン、２−アミノアデノシン、３−メチルアデノシン、７−デアザアデノシン、８−オキソアデノシン、イノシン；
    チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、および６−Ｏ−メチルグアニン、から選択される、請求項２２に記載のオリゴマー。
27. 前記化学修飾ヌクレオチドが前記ヌクレオチドの１〜９９％を構成する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
28. 前記オリゴマーが、５’キャップ、５’非翻訳領域、コード領域、３’非翻訳領域、およびテール領域を含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のオリゴマー。
29. 前記オリゴマーが翻訳エンハンサーを含む、請求項２２に記載のオリゴマー。
30. 前記オリゴマーが、前記ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）またはＡＧＬ活性を有するその断片を発現するように哺乳動物細胞において翻訳可能である、請求項２２に記載のオリゴマー。
31. 前記オリゴマーの翻訳産物が、活性ヒトアミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼまたはＡＧＬ活性を有するその断片である、請求項２２に記載のオリゴマー。
32. 前記オリゴマーが、ヒトＡＧＬ野生型ｍＲＮＡと比較して低減された免疫原性を有する、請求項２２に記載のオリゴマー。
33. 前記オリゴマーが、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基配列を含む、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のオリゴマー。
34. 配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基配列と少なくとも９０％同一である核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
35. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基配列と少なくとも９５％同一である核酸塩基配列を含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
36. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基配列と少なくとも９９％同一である核酸塩基配列を含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
37. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択される核酸塩基を含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
38. 請求項１〜２１または請求項３４〜３７のいずれかに記載の１又は２以上のポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
39. 請求項２２〜３３のいずれかに記載の１又は２以上のオリゴマー、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
40. 請求項１〜２１または請求項３４〜３７のいずれかに記載の１又は２以上のポリヌクレオチド、請求項２２〜３３のいずれかに記載の１又は２以上のオリゴマー、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
41. 前記担体が、トランスフェクション試薬、ナノ粒子、またはリポソームを含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
42. 医学療法で使用するための請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
43. ヒトまたは動物の体の治療に使用するための請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
44. アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延、または治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬を調製または製造するための、請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物の使用。
45. 前記疾患が糖原病ＩＩＩ型である、請求項４４に記載の使用。
46. 前記糖原病ＩＩＩ型が、糖原病ＩＩＩａ型、糖原病ＩＩＩｂ型、糖原病ＩＩＩｃ型、および糖原病ＩＩＩｄ型から選択される、請求項４５に記載の使用。
47. アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＡＧＬ）の活性低下に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延、または治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記対象に請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法。
48. 前記疾患が糖原病ＩＩＩ型である、請求項４７に記載の方法。
49. 前記糖原病ＩＩＩ型が、糖原病ＩＩＩａ型、糖原病ＩＩＩｂ型、糖原病ＩＩＩｃ型、および糖原病ＩＩＩｄ型から選択される、請求項４８に記載の方法。
50. 前記投与が、静脈内、皮下、経肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、経鼻、または吸入である、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
51. 前記投与が、毎日、毎週、隔週、または毎月１回である、請求項４７〜５０のいずれかに記載の方法。
52. 前記投与が、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの有効量を含む、請求項４７〜５１のいずれかに記載の方法。
53. 前記投与が、前記対象の肝臓、血清、血漿、腎臓、心臓、筋肉、脳、脳脊髄液、またはリンパ節におけるＡＧＬの発現を増大させる、請求項４７〜５２のいずれかに記載の方法。
54. 投与後、前記対象の肝臓における前記ＡＧＬのレベルが、１０〜１５００ｎｇ／ｍｇの総肝臓タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
55. 投与後、前記対象の肝臓における前記ＡＧＬのレベルが、２０〜１５０ｎｇ／ｍｇの総肝臓タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
56. インビボでヒトＡＧＬを発現させるためのキットであって、０．１〜５００ｍｇの用量の請求項１〜２１または請求項３４〜３７のいずれかに記載の１又は２以上のポリヌクレオチド、または請求項２２〜３３のいずれかに記載の１又は２以上のオリゴマー、および前記用量を投与するためのデバイスを含む、キット。
57. 前記デバイスが、注射針、静脈内針、または吸入用デバイスである、請求項５６に記載のキット。
58. 配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヒトＡＧＬコード配列が、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択された配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である、ポリヌクレオチド。
59. 配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ヒトＡＧＬコード配列が、配列番号７〜３２または配列番号４１〜４５から選択された配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である、ポリヌクレオチド。
60. 配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヒトＡＧＬコード配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
61. 配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヒトＡＧＬコード配列が、配列番号３１に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
62. 配列番号１の全長ヒトＡＧＬコード配列にわたって野生型ヒトＡＧＬコード配列に対して８０％未満同一である核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヒトＡＧＬコード配列が、配列番号４５に対して少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
63. 配列番号１９の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチド。
64. 配列番号３１の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチド。
65. 配列番号４５の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチド。