JP2020521501A - 改善された治療薬物モニタリング - Google Patents
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Abstract
抗微生物物質の定量および機能測定のための方法および組成物が、本明細書で提供される。一局面において、抗微生物物質を定量するための方法は、抗微生物物質を受けている患者から生物学的サンプルを得る工程；上記生物学的サンプルを、参照微生物株および細胞損傷を検出するためのフルオロフォアとともに、インキュベートする工程；上記インキュベートした生物学的サンプルにおける蛍光強度の第１のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程；および上記第１のシグナルを、上記抗微生物物質に関して予め生成した較正曲線と比較し、それによって、上記生物学的サンプルに存在する上記抗微生物物質を定量する工程を包含する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月２日に出願された米国仮出願第６２／５１４，３２３号の便益および優先権を主張し、この仮出願の開示全体が、参考として本明細書に援用される。
本出願は、２０１７年６月２日に出願された米国仮出願第６２／５１４，３２３号の便益および優先権を主張し、この仮出願の開示全体が、参考として本明細書に援用される。
発明の分野
本開示は一般に、抗微生物物質の定量および機能測定のための方法および組成物に関する。
本開示は一般に、抗微生物物質の定量および機能測定のための方法および組成物に関する。
背景
重篤な感染症を処置するための抗微生物物質（抗生物質および抗真菌剤）の適切なタイプおよび投与量の処方は、非常に重要である。不運なことに、抗微生物物質の投与量は、万人に適合する原則（ｏｎｅ−ｓｉｚｅ−ｆｉｔｓ−ａｌｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に従わず、同じ薬物量を受けている患者における抗生物質の血中レベルは、１００〜１０００倍まで変動し得る［Ｚａｎｄｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｎｇｅ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ， ２０１６． ２０： ｐ． ７９．］。この高い変動性は、腎クリアランス、肝機能、および併存症のような患者特性の差異によって引き起こされる。結果として、抗微生物物質の血中レベルは、感染症と戦うには不十分であるか、または毒性を発生させるほどに高いかのいずれかであり得る。処置有効性を最大化しかつ有害な副作用を最小化するために、投与量は、抗微生物物質の実際の血中レベルの測定（治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）といわれるプロセス）に基づいて調節されなければならない。理想的には、それは、その特定の感染症を処置するための抗微生物物質有効性のインビトロ決定、すなわち、抗微生物物質感受性検査（ＡＳＴ）に従うべきである。
重篤な感染症を処置するための抗微生物物質（抗生物質および抗真菌剤）の適切なタイプおよび投与量の処方は、非常に重要である。不運なことに、抗微生物物質の投与量は、万人に適合する原則（ｏｎｅ−ｓｉｚｅ−ｆｉｔｓ−ａｌｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に従わず、同じ薬物量を受けている患者における抗生物質の血中レベルは、１００〜１０００倍まで変動し得る［Ｚａｎｄｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｎｇｅ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ， ２０１６． ２０： ｐ． ７９．］。この高い変動性は、腎クリアランス、肝機能、および併存症のような患者特性の差異によって引き起こされる。結果として、抗微生物物質の血中レベルは、感染症と戦うには不十分であるか、または毒性を発生させるほどに高いかのいずれかであり得る。処置有効性を最大化しかつ有害な副作用を最小化するために、投与量は、抗微生物物質の実際の血中レベルの測定（治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）といわれるプロセス）に基づいて調節されなければならない。理想的には、それは、その特定の感染症を処置するための抗微生物物質有効性のインビトロ決定、すなわち、抗微生物物質感受性検査（ＡＳＴ）に従うべきである。
ＴＤＭは、患者の中で薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）が変化され得るその患者にとって特に価値あるものである。これは、腎不全または肝不全に苦しんでいる重症患者、重篤な体液状態の変化もしくは低アルブミンレベルを有する者、または腎代替療法を受けている患者では、ほとんどの場合にあてはまる。重症患者はしばしば、重篤な感染症に罹患しており、迅速かつ標的化された抗生物質処置を必要とする。しかし、変化したＰＫ／ＰＤプロフィールに起因して、通常の投与レジメンはしばしば十分ではないか、または過剰なこともある。例えば、腎クリアランスが低い場合、薬物排泄は障害されており、抗生物質血中レベルは、毒性になることがある。
抗生物質に関して現在利用可能なＴＤＭ法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはイムノアッセイに基づき、両者は多くの制限を共有している。第１に、それらは、狭い選択範囲の抗生物質に関してのみ利用可能である（主に、アミノグリコシド（例えば、アミカシンおよびゲンタマイシン）ならびにバンコマイシン）。第２に、これらの方法は、臨床微生物検査室においてほとんど利用可能でなく、非常に高価である。そして第３に、これらの方法は、定義上、血液に関するデータを与えるに過ぎず、化学的決定に関する。すなわち、それらは、抗微生物活性（これは、何らかの理由から、例えば、細菌酵素によって、または何らかの他の相互作用もしくは宿主要因によってその抗生物質がインビボで不活性化された場合には異なり得る）を評価しない。
従って、抗微生物物質処置を受けている患者から得られた生物学的サンプルに存在し得る、広いパネルの抗微生物物質を迅速かつ安価に定量し得、そして、その有効な抗微生物活性を決定し得る新しい技術が必要である。
従って、抗微生物物質処置を受けている患者から得られた生物学的サンプルに存在し得る、広いパネルの抗微生物物質を迅速かつ安価に定量し得、そして、その有効な抗微生物活性を決定し得る新しい技術が必要である。
Ｚａｎｄｅｒ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｎｇｅ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ， ２０１６． ２０： ｐ． ７９．
発明の概要
最も適切な臨床抗微生物薬物に関する治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）のための、改善された方法、組成物およびキットが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーが使用され得る。その薬物の抗微生物物質レベルは、血液、尿、脳脊髄液のような種々の体液において定量され得、迅速に、例えば、２時間以内に、標的化された個別化処置の確立を可能にする。これは、いくつかの併存症（例えば、腎機能不全および／または肝機能不全）を有する重症患者にとっては特に重要である。
最も適切な臨床抗微生物薬物に関する治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）のための、改善された方法、組成物およびキットが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーが使用され得る。その薬物の抗微生物物質レベルは、血液、尿、脳脊髄液のような種々の体液において定量され得、迅速に、例えば、２時間以内に、標的化された個別化処置の確立を可能にする。これは、いくつかの併存症（例えば、腎機能不全および／または肝機能不全）を有する重症患者にとっては特に重要である。
一局面において、生物学的サンプルにおいて抗微生物物質を定量するための方法が本明細書で提供され、上記方法は、
ａ．抗微生物物質を受けている患者から生物学的サンプルを得る工程；
ｂ．上記生物学的サンプルを、参照微生物株および細胞損傷を検出するためのフルオロフォアとともにインキュベートする工程；
ｃ．上記インキュベートした生物学的サンプルにおける蛍光強度の第１のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程；ならびに
ｄ．上記第１のシグナルと、上記抗微生物物質に関して予め生成した較正曲線とを比較し、それによって上記生物学的サンプルに存在する上記抗微生物物質を定量する工程、
を包含する。
ａ．抗微生物物質を受けている患者から生物学的サンプルを得る工程；
ｂ．上記生物学的サンプルを、参照微生物株および細胞損傷を検出するためのフルオロフォアとともにインキュベートする工程；
ｃ．上記インキュベートした生物学的サンプルにおける蛍光強度の第１のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程；ならびに
ｄ．上記第１のシグナルと、上記抗微生物物質に関して予め生成した較正曲線とを比較し、それによって上記生物学的サンプルに存在する上記抗微生物物質を定量する工程、
を包含する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記生物学的サンプルの別個のアリコートを、同じ患者から単離または回収されたかまたは得られた微生物株および上記フルオロフォアとともにインキュベートする工程、ならびに上記別個のアリコートにおける蛍光強度の第２のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程をさらに包含し得る。ある種の実施形態において、上記抗微生物物質は、抗生物質または抗真菌剤であり得る。上記生物学的サンプルは、血清、血漿、尿、髄液、腹水および気管支分泌物または気管支洗浄物のうちの１またはこれより多くであり得る。上記フルオロフォアは、ＤｉＢＡＣ４オキソノール（例えば、ＤｉＢＡＣ４（３） （ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール））、ＤｉＯＣオキサカルボシアニン（例えば、ＤｉＯＣ１８（３） （３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロレート））、ＤＨＲ（ジヒドロローダミン）、ヨウ化プロピジウム、またはフルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）（例えば、Ｃ−ＦＤＡ（５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテート））から選択され得る。当該分野で公知の他のフルオロフォアがまた、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記較正曲線は、上記参照微生物株とともに、または検査中の同じ患者から単離された微生物株とともにインキュベートされる種々の濃度の上記抗微生物物質を使用して生成され得る。
詳細な説明
参照細菌株もしくは参照真菌株および／または利用可能な場合は常に、患者由来の特定の細菌／真菌培養物を使用して、患者の生物学的サンプルにおいて抗微生物物質レベルおよびその有効性の両方を測定する、改善された治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）アッセイ、ならびに関連する組成物およびキットが、本明細書で開示される。その改善されたＴＤＭ投与アッセイおよびキットは、いくつかの実施形態においては、フローサイトメトリーに基づき、結果を迅速かつ正確に、例えば、２時間以内またはより早く提供し得る。これは、従来のＴＤＭ法と比較して、顕著に有利である。
参照細菌株もしくは参照真菌株および／または利用可能な場合は常に、患者由来の特定の細菌／真菌培養物を使用して、患者の生物学的サンプルにおいて抗微生物物質レベルおよびその有効性の両方を測定する、改善された治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）アッセイ、ならびに関連する組成物およびキットが、本明細書で開示される。その改善されたＴＤＭ投与アッセイおよびキットは、いくつかの実施形態においては、フローサイトメトリーに基づき、結果を迅速かつ正確に、例えば、２時間以内またはより早く提供し得る。これは、従来のＴＤＭ法と比較して、顕著に有利である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される改善されたＴＤＭは、生物学的サンプル（例えば、血液または他の体液）において利用可能な、抗微生物物質（例えば、細菌の場合には抗生物質および／または真菌の場合には抗真菌剤）のパネルの細胞効果を測定し得る。これらの表現型変化は、細菌増殖に対する効果（これは、従来法のリードアウトである）が明白になる十分前に測定され得る。表現型変化（例えば、形態機能変化（ｍｏｒｐｈｏｆｕｎｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ）、膜電位、特定の膜損傷またはＤＮＡ量）は、フローサイトメトリーによって評価され得、抗微生物薬物有効性は、従って、迅速に検出および定量され得る。これらの具体的な変化は、蛍光プローブ（例えば、膜電位感受性であるＤｉＢＡＣ４およびＤＩＯＣ；ヨウ化プロピジウム（細胞膜の完全性を評価するプローブ）；または代謝的な細胞状態を評価するＣ−ＦＤＡ、ＤＨＲもしくはＦＵＮ−１）を使用して測定され得る。これらのプローブは、細菌および真菌に対する抗生物質効果の簡便で迅速かつ正確なリードアウトを提供することが示されている。
タイプ参照株（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からの）および連続する抗微生物物質濃度を使用して、各薬物の用量−効果曲線（較正曲線）の作成後に、望ましいアプローチが、標準化薬物濃度測定のために使用され得る。特に、患者から得られた血清サンプル（または他の体液サンプル）中の未知の濃度の特定の抗微生物物質の効果は、その相当する較正曲線と比較され得、それにより、その患者の生物学的サンプルに存在する有効な抗微生物物質濃度を定量するために迅速かつ容易な方法を提供する。並行して、その同じ手順が、標準的な臨床微生物学手順を使用してその同じ患者から得られた細菌または真菌の単離物で、行われ得る。このようなアプローチは、その患者に特異的な細菌株または真菌株に対して、このような株によって示される細胞損傷を評価および定量することによって、その患者サンプルにおいて利用可能な有効な抗微生物物質濃度を確立するために使用され得る。
ある種の実施形態において、種々の生物学的サンプルは、感染した患者から集められ得る（例えば、血液培養物からの血液、髄液、心膜液、胸膜液または腹腔液、尿、気管支分泌物または気管支洗浄物）。抗微生物物質処置は、後に、抗微生物物質感受性検査（ＡＳＴ）の後に開始され得る。ＡＳＴ結果に基づいて、その抗微生物物質治療は開始され得る。その薬物に対するインビトロ感受性にも拘わらず臨床転帰が思わしくない場合、特に、その患者が腎機能不全または肝機能不全を示す場合には、血清または他の液体サンプルが集められ、特定の感染部位において利用可能である有効な抗微生物物質の量が定量され、その抗微生物物質がその感染部位において十分なレベルで存在するかが決定され得る。存在しなければ、異なる（例えば、増大した）量の抗微生物物質または異なる抗微生物物質が投与され得る。
その生物学的サンプルは、種々の希釈後に、あるタイプ微生物株または参照微生物株とともにインキュベートされ得、その微生物に生じた損傷は、フローサイトメトリーによって定量され得る。標準曲線との比較後に、その生物学的サンプルに対して利用可能な、活性な抗微生物薬剤の量が、決定され得る。
微生物単離物がその同じ患者から回収されている場合、そのＴＤＭは、参照株の代わりに、この微生物単離物で行われ得る。インビトロで抗微生物物質感受性検査（ＡＳＴ）において得られる抗微生物効果は、生物学的サンプル中の異なる濃度の同じ抗微生物物質の効果と比較され得る。これは、治療ストラテジーの選択において顕著な利点を表し得る。例えば、その抗微生物物質の血清レベルが、その想定された治療有効レベルより下である（例えば、治療値が達成不可能である患者において）が、にも拘わらず最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値より高い場合、その抗微生物物質は、その患者に感染している微生物に重篤な損傷をなお引き起こすはずである；その場合、治療は、中断されるまたは代えられる必要はない。
臨床医は、患者に処方した抗微生物物質の濃度が治療間隔を上回るまたは下回ることを知らされ得、臨床医が必要な調節を行うことを可能にする。
この改善されたＴＤＭ法は、患者の生物学的サンプルにおいて抗微生物薬物定量のための微生物学的に機能的な方法である。それは機能アッセイであり、その薬物の化学的存在だけでなく、その薬物の活性の測定を可能にする。さらに、本明細書で開示されるＴＤＭはフローサイトメトリーアッセイに基づき、微生物が増殖する能力の研究には基づかないことから、これは非常に迅速で再現性が高くかつ正確な方法である。この改善されたＴＤＭ法は、抗生物質の投与量を個別化して、重篤な感染症を処置するための、安価で、簡潔かつ迅速な方法の喫緊の必要性を考慮して、従来の方法を上回る顕著な利点を提供する。これは、いくつかの理由に起因する：
（１）抗生物質の血中レベルは、同じ用量を使用する場合に、患者間で１００〜１０００倍変動し得る；
（２）重症患者、特に、変化したＰＫ／ＰＤ特性を示す者は、迅速かつ個別化された処置を要する；
（３）投与量は、抗生物質の血中レベルおよびそれらの活性が正確に知られている場合にのみ、個別化され得る；
（４）従来法は、僅かな抗微生物物質に制限され、非常に扱いにくく、その薬物の抗微生物活性を測定しない。なぜならそれらは、その薬物の化学的存在を評価するに過ぎないからである；
（５）重症患者は、治療の選択肢および好ましい転帰の可能性を減らす薬物耐性微生物に感染するという、遙かに大きな機会を有する；ならびに
（６）薬物耐性微生物、特に細菌および真菌による感染は、欧州および米国においてますます増大する脅威を象徴し、個別化された投与の必要性を特に喫緊のかつ必須のものにしている。
（１）抗生物質の血中レベルは、同じ用量を使用する場合に、患者間で１００〜１０００倍変動し得る；
（２）重症患者、特に、変化したＰＫ／ＰＤ特性を示す者は、迅速かつ個別化された処置を要する；
（３）投与量は、抗生物質の血中レベルおよびそれらの活性が正確に知られている場合にのみ、個別化され得る；
（４）従来法は、僅かな抗微生物物質に制限され、非常に扱いにくく、その薬物の抗微生物活性を測定しない。なぜならそれらは、その薬物の化学的存在を評価するに過ぎないからである；
（５）重症患者は、治療の選択肢および好ましい転帰の可能性を減らす薬物耐性微生物に感染するという、遙かに大きな機会を有する；ならびに
（６）薬物耐性微生物、特に細菌および真菌による感染は、欧州および米国においてますます増大する脅威を象徴し、個別化された投与の必要性を特に喫緊のかつ必須のものにしている。
さらに、本明細書で開示される方法および組成物はまた、以下のような他の適用において使用され得る：
（１）環境モニタリング／生物的環境浄化目的での水中の抗微生物物質投与；
（２）抗微生物薬物の品質コントロール（例えば、種々の供給業者および／または種々のロット間でのバリエーション）；
（３）食品安全性を担保するための、禁止された薬物の抗微生物物質モニタリング；生の食品（食肉、植物）抽出物または動物の体液における適用；
（４）獣医学において、ヒトの臨床医学に記載される上記と同じ目的で。
（１）環境モニタリング／生物的環境浄化目的での水中の抗微生物物質投与；
（２）抗微生物薬物の品質コントロール（例えば、種々の供給業者および／または種々のロット間でのバリエーション）；
（３）食品安全性を担保するための、禁止された薬物の抗微生物物質モニタリング；生の食品（食肉、植物）抽出物または動物の体液における適用；
（４）獣医学において、ヒトの臨床医学に記載される上記と同じ目的で。
本開示のさらなる特徴は、以下の非限定的な実施例において記載される。しかし、これらの実施例が、本開示の局面を例示する目的のためにのみ含まれることは、理解されるべきである。それらは、如何様にしても、上記で示されるとおりの本開示の広い記載の制限として理解されるべきではない。
実施例１：コリスチンの抗微生物活性の定量および測定
コリスチンは、多剤耐性桿菌による感染症のためのレスキュー処置としてますます処方されている。コリスチンは、古い抗微生物物質であるが、現在では、カルバペネマーゼを生成するもののようなスーパーバグ株（ｓｕｐｅｒｂｕｇ ｓｔｒａｉｎ）、ならびに多剤耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する唯一の選択肢である。その薬物動態は未だよく知られていないので、コリスチンを受けている各個々の患者におけるその抗細菌活性を測定する可能性があることは、非常に有用である。しばしば、腎毒性、およびより少ない程度には神経毒性が、全身性のコリスチン治療の間に起こり得る；このような有害な副作用は、過去にコリスチンの使用をひどく制限してきた。しかし、これらの効果は、大抵は可逆的であり、精密な薬物モニタリングを通じて管理され得る。本発明者らは、コリスチンを含め、種々の抗微生物薬物によってもたらされる抗微生物効果を、フローサイトメトリーを使用して定量するために、微生物学的アッセイを開発した。
コリスチンは、多剤耐性桿菌による感染症のためのレスキュー処置としてますます処方されている。コリスチンは、古い抗微生物物質であるが、現在では、カルバペネマーゼを生成するもののようなスーパーバグ株（ｓｕｐｅｒｂｕｇ ｓｔｒａｉｎ）、ならびに多剤耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する唯一の選択肢である。その薬物動態は未だよく知られていないので、コリスチンを受けている各個々の患者におけるその抗細菌活性を測定する可能性があることは、非常に有用である。しばしば、腎毒性、およびより少ない程度には神経毒性が、全身性のコリスチン治療の間に起こり得る；このような有害な副作用は、過去にコリスチンの使用をひどく制限してきた。しかし、これらの効果は、大抵は可逆的であり、精密な薬物モニタリングを通じて管理され得る。本発明者らは、コリスチンを含め、種々の抗微生物薬物によってもたらされる抗微生物効果を、フローサイトメトリーを使用して定量するために、微生物学的アッセイを開発した。
この実施例の目的は、フローサイトメトリーを使用した、患者の血液中のコリスチンの抗微生物活性の測定を最適化することであった。
コリスチン（Ｓｉｇｍａ）の連続希釈物（０．００８〜２μｇ／ｍｌの間の範囲に及ぶ）を、ヒト血漿（コリスチンを含まない）中に接種し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２とともに６０分間インキュベートし、その後、蛍光色素で染色し、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ， ＢＤ）において以前に最適化されたプロトコルを使用して分析した（図３）：細胞分析のフローサイトメーターテンプレートを、その細菌集団の大部分を含むために定義した。少なくとも２０，０００個の細胞をサイズ、複雑性および種々の蛍光チャネルに対する蛍光の強度に従って分析する。
連続漸増濃度のコリスチンへの曝露後の細菌細胞集団に関して形態変化は明白であった（図４、パネルＡ）。蛍光の強度に関しては、０．０６〜１μｇ／ｍＬの間のコリスチンの濃度において線形効果が生じた（図４、パネルＢ）。より高いコリスチン濃度の効果は、その血清を希釈した後に確認できた。
従って、感度が高くかつ正確な方法が開発された。これは、短時間（６０分間）で、コリスチンで障害された細胞の数を定量し、その活性薬物の血清濃度の結論を出すことを可能にする。このプロトコルは、臨床的改善が低いまたは全くない、コリスチンを受けている救命救急ケア患者にとって非常に適切である。このアッセイに関しては、品質コントロール株、または可能な場合は常に、患者自身の単離物が、標準的用量−効果曲線のデザインのために使用され得る。
実施例２：バンコマイシンの抗微生物活性の定量および測定
バンコマイシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのペニシリナーゼ生成株を阻害するために、ペニシリンの代替としておよそ５０年間にわって臨床的に使用されてきた糖ペプチド抗生物質である。組織浸透が不十分である、抗細菌効果が比較的遅い、および潜在的に毒性であるという制限にも拘わらず、バンコマイシンは、そのコストの低さおよび臨床応答が確立されていることから、ＭＲＳＡ感染症の抗生物質処置の至適基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）と見做されている。バンコマイシンの薬物動態の複雑性およびその高い毒性に起因して、治療の成功を得るために、血中レベルのモニタリングが推奨される。本発明者らの研究グループは、フローサイトメトリーを使用して、バンコマイシンに対するものを含め、細菌のインビトロ感受性プロフィールを大いに成功裡に評価している。
バンコマイシンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのペニシリナーゼ生成株を阻害するために、ペニシリンの代替としておよそ５０年間にわって臨床的に使用されてきた糖ペプチド抗生物質である。組織浸透が不十分である、抗細菌効果が比較的遅い、および潜在的に毒性であるという制限にも拘わらず、バンコマイシンは、そのコストの低さおよび臨床応答が確立されていることから、ＭＲＳＡ感染症の抗生物質処置の至適基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）と見做されている。バンコマイシンの薬物動態の複雑性およびその高い毒性に起因して、治療の成功を得るために、血中レベルのモニタリングが推奨される。本発明者らの研究グループは、フローサイトメトリーを使用して、バンコマイシンに対するものを含め、細菌のインビトロ感受性プロフィールを大いに成功裡に評価している。
この研究の目的は、フローサイトメトリーを使用した、患者の血液中のバンコマイシンの活性の微生物学的測定を最適化することであった。
材料および方法。 Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３を、１時間にわたって、ドナーの薬物を含まないヒト血清中で連続濃度（４μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌ）のバンコマイシンとともにインキュベートし、適切な蛍光色素で染色した。蛍光の強度、および細菌集団の散布図における変化を、フローサイトメトリー分析後に記録した。バンコマイシンを受けている患者から集めた２０の血清サンプルを、生化学検査室から得た。そのバンコマイシン薬物濃度を、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉ１０００ ＳＲ分析器（Ａｂｂｏｔｔ）を使用してＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ（Ａｂｂｏｔｔ）によって分析した。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉＶａｎｃｏｍｙｃｉｎは、ヒトの血清または血漿中のバンコマイシンの定量的測定のための、インビトロ化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）である。並行して、血清サンプルを、１０連続希釈（１：２）後にＳ．ａｕｒｅｕｓコントロール株とともにインキュベートし、実施例１に記載されるプロトコルに従ってフローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｙ， ＢＤ）によって分析した。細胞分析のフローサイトメトリーテンプレートを、その細菌集団の大部分を含めるために定義した。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ法で得られた濃度と新たなフローサイトメトリー法で得られた濃度との比較を、スチューデントＴ検定を使用して行った。
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（低濃度に感受性）を漸増濃度のバンコマイシンとともにインキュベートした後に、用量効果細胞損傷は、以下によって明白である：細胞密度プロットの減少（Ｐ１上での細胞のパーセンテージ、図５Ａ）および蛍光の強度の増大（図５Ｂ）（両方の事実は、細胞損傷を示す）。
フローサイトメトリーによって得られるコントロール用量曲線効果は、１〜０．０３μｇ／ｍｌの間で線形効果を示し、相関係数が計算された（図６Ａ）。患者の血清サンプル濃度を、コントロール曲線から得られた線形回帰式を使用して計算した。具体的には、患者の血清サンプル中のバンコマイシンの濃度を、線形性の範囲内にある図６Ｂで得られる生細胞の％（赤い四角形）を使用し、血清希釈率を考慮することによって、決定した。両方の方法の間で優れた相関関係が得られ、患者の血清中のバンコマイシン濃度の変動は、±５μｇ／ｍｌであった。
結論。 生物学的サンプルにおいてバンコマイシン活性を定量するための新たな、簡潔で便利かつ迅速な方法が得られ、これは、薬物抗微生物活性を反映する迅速かつ機能的な方法であるという利点を有した。
本開示の記載される方法および組成物の改変およびバリエーションは、本開示の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本開示が具体的実施形態と関連して記載されてきたが、特許請求されるとおりの開示が、このような具体的実施形態に過度に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、本開示を実施するための記載される態様の種々の改変は、意図され、以下の請求項によって示されるとおりの開示の範囲内にあることが、本開示が存在する関連分野の当業者によって理解される。
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、各独立した特許および刊行物が、参考として援用されることを具体的にかつ個々に示されるのと同程度に、本明細書に参考として援用される。
Claims (9)
- 生物学的サンプルにおいて抗微生物物質を定量するための方法であって、該方法は、
ａ．抗微生物物質を受けている患者から生物学的サンプルを得る工程；
ｂ．該生物学的サンプルを、参照微生物株および細胞損傷を検出するためのフルオロフォアとともに、インキュベートする工程；
ｃ．該インキュベートした生物学的サンプルにおける蛍光強度の第１のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程；ならびに
ｄ．該第１のシグナルと、該抗微生物物質に関して予め生成した較正曲線とを比較し、それによって該生物学的サンプルに存在する該抗微生物物質を定量する工程、
を包含する方法。 - 前記生物学的サンプルは、血清、血漿、尿、髄液、気管支分泌物もしくは気管支洗浄物または任意の他の体液のうちの１またはこれより多くである、請求項１に記載の方法。
- 前記患者は、感染症を有する、請求項１または２に記載の方法。
- 前記抗微生物物質は、抗生物質または抗真菌剤である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記参照微生物株は、Ｅ．ｃｏｌｉ株またはＳ．ａｕｒｅｕｓ株である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記フルオロフォアは、ＤｉＢＡＣ４、ＤＩＯＣ、ヨウ化プロピジウム、ＤＨＲ、Ｃ−ＦＤＡまたはＦＵＮ−１から選択される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記較正曲線は、前記参照微生物株とともにインキュベートされる種々の濃度の前記抗微生物物質を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルの別個のアリコートを、前記患者から単離された微生物株および前記フルオロフォアとともにインキュベートする工程、ならびに該別個のアリコートにおける蛍光強度の第２のシグナルを、フローサイトメトリーを使用して測定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記較正曲線は、前記患者から単離された前記微生物株とともにインキュベートされる種々の濃度の前記抗微生物物質を使用して生成される、請求項８に記載の方法。
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