JP2020519256A - 配列データの正規化のための新規のspike inオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
a)5’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と相補的ではない少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾、任意選択で2’−O−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の一本鎖の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットを、提供する。
a)5’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して配列が2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾、任意選択で2’−O−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットが、提供される。
a)5’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾、任意選択で2’−O−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットが、提供される。
a.本発明のセットを上記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を入手することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
b.上記ライブラリーをライゲートし、任意選択で増幅するステップと、
c.上記核酸分子からのRNA配列の読み取りをもたらす、上記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
d.上記セットおよび上記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法を包有する。
p−(N)m(x)n(N)m−2’−O−メチル
により記載されるオリゴヌクレオチドを提供する:
(式中、
Nは、A、U、G、C、またはA、T、G、Cのいずれかのランダムなヌクレオチドであり;
Xは、A、U、G、Cのいずれかを含み、標的配列と比較して2つ以上のミスマッチを含む、コアヌクレオチド配列であり;
mは、3、4、または5であり;
nは、8〜67の範囲の整数であり;
pはリン酸塩である)。
本明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
p−(N)m(X)(N)n2’−O−メチル
により特徴づけられ得る:
(式中、
pはリン酸塩であり、
Nは、A、U、G、C、またはA、T、G、Cのいずれかのランダムなヌクレオチドであり、
Xは、A、U、G、C;またはA、T、G、Cのいずれかを含む、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67の長さを有する、標的配列と比較して2つ以上の核酸塩基のミスマッチを配列が含むコア配列であり、
m、nは、3、4、または5である)。
a)5’末端にリン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して配列が少なくとも2つのミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
方法およびセットを提供する。
p−(N)m(x)n(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは、3、4、または5であり
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、3、4、または5であり
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは、4であり
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、4であり
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)mXXXXXXXXXXXXX(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは4である)。
p−(N)mXXXXXXXXXXXXX(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、一リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、4である)。
p−(N)m(x)n(N)m−OH
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは、3、4、または5であり、
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−OH
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、3、4、または5であり、
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−OH
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは、4であり、
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)m(x)n(N)m−OH
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、4であり、
nは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である)。
p−(N)mXXXXXXXXXXXXX(N)m−OH
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、U、G、Cのいずれかであり、
mは、4である)。
p−(N)mXXXXXXXXXXXXX(N)m−2’−O−メチル
の核酸分子を含む:
(式中、
pは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Nは、A、T、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、互いに独立して、A、T、G、Cのいずれかであり、
mは、4である)。
a)5’末端にリン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
a)5’末端にリン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して配列が2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
a)5’末端にリン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾と
からなり、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
標的配列の混合物に、付記項1〜18のいずれか1項に記載のセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
前記ライブラリーにアダプターをライゲートするステップと、
任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
ヌクレオチドのシーケンシング法を行うステップと、
参照値として各サブセットの核酸分子の量を決定するステップと
を含む、方法。
a)付記項1〜18のいずれか1項に記載のセットを、前記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を得ることにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
b)前記ライブラリーを増幅するステップと、
c)前記核酸分子からRNA配列の読み取りをもたらす、前記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
d)前記セットおよび前記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法。
p−(N)m(x)(N)m−2’−O−メチル
により記載されるオリゴヌクレオチド:
(式中、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、標的配列と比較して、1つ以上のミスマッチを含み、A、U、G、Cのいずれかを含む8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド長を有する、コア配列であり、
mは、3、4、または5である)。
方法
植物の材料
dcl234変異体は、以前に記述されているように、dcl2−1、dcl3−1、およびdcl4−2tのアレルから構成されていた17。植物は、16時間の明期/8時間の暗期で、20℃〜22℃に制御された成長チャンバーの中で成長させた。Col−0の葉のサンプルは、ロゼットに由来するものであり、茎生葉を、4〜6週齢の植物から単離した。開花していない花芽を、葉のサンプルと同じ植物(Col−0の花)または同一条件下で成長させたdcl234の植物(dcl234の花)から、回収した。
上位50の、最も豊富なmiRNAの5〜17位(miRNAの5’末端から計測)のmiRNAに関する塩基同一性の割合からなるマトリックスを作製し、1000個の13nt配列をセミランダムに選択するために使用した。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のCol−0のゲノムに完全にアライメントしなかった252の配列をさらに考察し、256個の可能性のある全ての4塩基の組み合わせを、5’末端および3’末端の両方に付加し、セットあたり65,536の総配列を作製した。65,356の配列の252セットの中の全ての21ntのRNA最小自由エネルギーを、RNAfoldを使用して決定した25。次に、最小自由エネルギーの分布を試験し、注釈が付されたmiRNAに類似の分布を有する21ntのRNA配列の8つのセットを、合成に選択し、Integrated DNA Technologies(IDT)から注文した。この混合比は、注釈が付されたArabidopsisのmiRNAの動的な範囲に及ぶように組み立てられた。
図1aで示されるsRNA spike inの混合物を、2倍に希釈し、500ngの総RNAに添加した後、ポリアクリルアミドゲルのサイズセレクション、次いでNEBnext smallRNA library prep kit for Illumina(NEB)を使用してsRNAクローニングを行った。ERCC spike−in mix(LifeTech)を200倍に希釈し、1μlを、500ngの総RNAに添加した。10ngの総RNAを使用して、Picelli et alらが記載する通り26mRNA−Seqライブラリーを作製した。サンプルを、Illumina Hi−Seq 2500のシーケンシング機において、シングルリード50bp(sRNA−Seq)モードまたはペアエンドリード50bp(mRNA−Seq)モードのいずれかでシーケンシングを行った。
アダプター配列を除去した後に、sRNA−Seqの読み取りを、完全な一致を必要とし、読み取りあたり最大100のアライメントを可能にするBowtie short−read aligner27を使用して、sRNA spike−inを伴うシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)Col−0のゲノム(TAIR10)にアライメントした(表1および2)。次に、共通する13nt配列のsRNA spike−inを含む読み取りを、さらなる解析のためまとめてグループ分けした。
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Claims (15)
- 一本鎖核酸分子の少なくとも2つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、5’から3’への方向に、
a)5’末端にリン酸塩と、
b)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
c)標的配列と比較して配列が2つ以上のミスマッチを含む少なくとも8つのヌクレオチドのコア配列と、
d)少なくとも3つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
e)3’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
前記各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。 - 前記複数の核酸分子が、A、C、G、U、またはA、C、G、Tの全ての4つのヌクレオチドの組み合わせを含むランダム化したヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のセット。
- 前記核酸分子が、RNA分子、特には、特にsiRNA、tasiRNA、snRNA、miRNA、snoRNA、piRNA、およびtRNA、ならびにそれらのいずれかの前駆体からなる群から選択される、smallRNAを特異的に模倣したRNA分子である、請求項1〜2のいずれか1項に記載のセット。
- 前記コアヌクレオチド配列が、8〜25個のヌクレオチド、好ましくは10〜20個のヌクレオチド、好ましくは12〜18個のヌクレオチド、好ましくは13個のヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のセット。
- 前記ランダム化したヌクレオチドの配列が、3〜7個のヌクレオチド、好ましくは3〜5個のヌクレオチド、好ましくは4個のヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のセット。
- 5’末端のリン酸塩が、一リン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩の群から選択され、3’末端の修飾が、2’−O−メチル化[2’−O−メチル基]およびヒドロキシル化[ヒドロキシル基]からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のセット。
- 前記サブセットが、1〜10000amol、好ましくは10〜5000amolの量で存在し、特に、各サブセットで異なる量を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のセット。
- 前記標的配列が、目的のいずれかの配列、特に、生物のゲノムまたはトランスクリプトーム、ウイルス、細菌、動物、植物から生じる配列とすることができ、特に、RNA、smallRNA、動的なsmallRNAの集合である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のセット。
- シーケンシングデータを正規化するためのspike inプローブとしての、請求項1〜8のいずれか1項に記載のセットの使用。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のセットを使用して、サンプル、特に細胞、組織、または臓器のサンプルにおける1つ以上の標的配列の絶対量を決定するための方法。
- ヌクレオチドシーケンシングにおける参照値を決定するための方法であって、
標的配列の混合物に、請求項1〜9のいずれか1項に記載のセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
前記ライブラリーにアダプターをライゲートするステップと、
任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
ヌクレオチドのシーケンシング法を行うステップと、
参照値として各サブセットの核酸分子の量を決定するステップと
を含む、方法。 - 異なる細胞種由来のsmallRNA分子の複製数を比較する、請求項11に記載の方法。
- サンプルにおける核酸分子の数を決定するための方法であって、
a)請求項1〜9のいずれか1項に記載のセットを前記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を得ることにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
b)任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
c)前記核酸分子からRNA配列の読み取りをもたらす、前記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
d)前記セットおよび前記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法。 - sRNAライブラリーの調製の間に起こるクローニングのバイアスを評価するための、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 一般式:p−(N)m(x)(N)m−2’−O−メチル
のオリゴヌクレオチド:
(式中、
pは、リン酸塩であり、
Nは、A、U、G、Cのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Xは、A、U、G、Cのいずれかを含む8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18のヌクレオチド長を有する、標的配列と比較して少なくとも2つのミスマッチを含むコア配列であり、
mは、3、4、または5である)。
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