CN105648078A - 一种山核桃嫁接过程中小rna测序分析方法 - Google Patents

一种山核桃嫁接过程中小rna测序分析方法 Download PDF

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徐栋斌
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Abstract

本发明公开了一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，包括如下步骤：材料准备、枝条嫁接、提取总RNA、miRNA文库构建和小RNA？Solexa测序分析。本发明一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，通过对山核桃中三个小RNA文库的数据进行生物信息学分析能够确认21个保守miRNA是属于13个miRNA家族，而10个新miRNA和8个潜在的新miRNA是属于15个miRNA家族。通过分析发现，保守miRNA在山核桃嫁接过程中都具有明显的差异性，并且2/3都是下调的。同样利用qRT-PCR对14个miRNA进行表达分析，发现表达的趋势与Solexa测序数据分析结果相吻合。另外还预测了保守miRNA基因的89个靶基因和新的miRNA基因的26个靶基因，对山核桃的嫁接理论知识有进一步指导作用，能更好的在山核桃高产、高效、生态和安全实践中指导生产。

Description

一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法
【技术领域】
本发明涉及山核桃无性繁殖栽培技术的领域，特别涉及一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法。
【背景技术】
山核桃是胡桃科山核桃属的一种油料木本树种，主要生长于浙西，是该地区的一种具有特色的干果，它的经济价值比较高，由于山核桃具有童期较长，不容易采收以及园艺栽培困难等问题，阻碍了山核桃的产业发展。但是植物嫁接手段无性繁殖里面比较重要阻碍了山核桃的产业发展。但是植物嫁接手段无性繁殖里面比较重要栽培技术，是解决山核桃采收困难和园艺化栽培的重要手段。
小RNA是一种长度大约为21-24nt的非编码RNA分子，以往的研究表明小RNA在基因表达、基因组表观遗传修饰等方面起着十分重要的调控作用。一般来说，小RNA分子是由双链RNA或者分子内双链RNA这两种形式的转录前体产生的。目前已知的小RNA主要分为两大类，也就是miRNA(microRNA)和siRNA(smallinterferingRNA)，这些小RNA对植物的生长发育，维持基因组的稳定性以及适应外界环境的各种胁迫等方面都有着至关重要的作用。
在植物中miRNA的靶基因是可以编码调控蛋白的一种转录因子，我们由此可知在植物中miRNA主要是一种调控因子，对基因表达调控中起着重要作用。根据目前已有的研究，miRNA在植物信号转导、器官的形态建成、生长发育及外界环境胁迫应答等生物学过程都起着重要的作用。因此，分析小RNA的组成以及分布情况在山核桃嫁接过程中所起的功能作用具有重要意义，为了提高山核桃在嫁接过程中的嫁接成功率，有必要提出一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法。
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其旨在解决现有技术中对小RNA的组成以及分布情况在山核桃嫁接过程中所起的功能作用探索和分析较少的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，包括如下步骤：
步骤一、材料准备：选取山核桃的嫁接枝条，选取砧木为两年生的实生苗，而接穗则是留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生的苗，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用；
步骤二、枝条嫁接：将经过步骤一选取的山核桃砧木和接穗进行嫁接；
步骤三、提取总RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天对山核桃茎进行采样，将采集的样品迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用，并提取样品的总RNA，总RNA的提取步骤如下：
1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4mlCTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；
2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min；
3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
4)重复第三步，直至中间层消失；
5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20℃冰箱中静置30min～1h；
6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
7)在沉淀中加入600ul裂解液RTLPlus，4℃，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
8)将混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置1min，13000rpm离心30s，将废液倒掉；
10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；
12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ulddH2O，室温下放置1min，12000rpm，离心1min，获得溶解好的RNA；
步骤四、miRNA文库构建：将经过步骤三提取的三个时期的总RNA样本分别标记为G0、G7、G14，G0设为对照组，miRNA文库的构建具体过程如下
1)先用1％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Aligent2100RNA6000NanoKit来检测RNA整齐度；
2)接着用15％的聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收的试剂盒来回收并且纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头来进行反转录合成；
3)最终进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；
步骤五、小RNASolexa测序分析：用IlluminaHiSeqTM2000平台来进行测序分析，预测分析包括保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析、山核桃miRNA差异表达分析和miRNA与靶基因qRT-PCR检测。
作为优选，所述的步骤三的2)中利用涡旋仪混匀的混匀时间为1min，上下颠倒混匀间隔时间为10min。
作为优选，所述的步骤四的2)中5’为5’-RACE-ReadycDNA，3’为3’-RACE-ReadycDNA。
作为优选，所述的步骤五中保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析方法为：将所有数据合并过滤后将小RNA序列比对到该基因组，允许一个mismatch，采用比对软件SOAP。为了更好的配对和后续的数据分析，将3个样本中的cleanreads分别比对到NCBI和Rfam数据库并允许一个错配。然后过滤掉rRNAs(核糖体RNA)，tRNAs(转运RNA)，scRNAs(细胞质内小RNA)，snRNAs(核内小RNA)和snoRNAs(核仁小分子RNA)，将3个样本的数据合并比对到所有植物非冗余成熟miRNA序列中，允许两个错配。将获得的序列使用RNAfoldsoftware来预测其二级结构来确定是否保守，来获得保守miRNA的数目及家族分布。而剩余的miRNA，我们将用Mireap软件进行新的miRNA预测。
作为优选，所述的NCBI数据库网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，所述的Rfam数据库网址为http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam。
作为优选，所述的步骤五中山核桃miRNA差异表达分析的方法为：计算G0，G7和G14这三个小RNA文库中miRNA的表达量，所述的miRNA表达量通过RPM值来计算，基于卡方检验分别筛选3样本中的每2个样本之间的差异表达miRNA，筛选条件为Pvalue≤0.05且差异倍数在两倍以上的基因。
作为优选，所述的RPM即每百万reads中来自于某基因的reads，所述的RPM值的计算公式为：RPM＝mappedreads×1000000/totalreads，所述的Mappedreads为比对上的reads数，所述的totalreads为统计得到的总reads数。
作为优选，所述的步骤五中miRNA与靶基因qRT-PCR检测方法为：用5.8srRNA作为内参基因，qRT-PCR利用SYBRGreenReal-TimePCRMasterMix和ABIPrism7000SequenceDetector试剂盒来检测miRNA的转录表达水平，PCR反应条件为94℃5min；94℃15s，60℃30s，共40个循环。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，通过对山核桃中三个小RNA文库的数据进行生物信息学分析能够确认21个保守miRNA是属于13个miRNA家族，而10个新miRNA和8个潜在的新miRNA是属于15个miRNA家族。在这些miRNAs中，选取12个保守miRNA进行表达分析，发现在山核桃嫁接过程中都具有明显的差异性，并且2/3都是下调的。同样利用qRT-PCR对14个miRNA进行表达分析，发现表达的趋势与Solexa测序数据分析结果相吻合。另外还预测了保守miRNA基因的89个靶基因和新的miRNA基因的26个靶基因，对山核桃的嫁接理论知识有进一步的指导作用，也可以更好的在山核桃高产、高效、生态和安全实践中指导生产实际。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是在山核桃中G0，G7以及G14三个sRNA文库中的不同种类sRNAreads的分布情况图；
图2是山核桃sRNAreads的大小分布情况图；
图3是山核桃嫁接0、7、14天后砧木和接穗中miRNA表达量分析及其qRT-PCR验证分析图。
【具体实施方式】
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明实施例提供一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，包括如下步骤：
步骤一、材料准备：选取山核桃的嫁接枝条，选取砧木为两年生的实生苗，而接穗则是留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生的苗，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用；
步骤二、枝条嫁接：将经过步骤一选取的山核桃砧木和接穗进行嫁接；
步骤三、提取总RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天对山核桃茎进行采样，将采集的样品迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用，并提取样品的总RNA，总RNA的提取步骤如下：
1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4mlCTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；
2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min，其中，涡旋仪混匀时间为1min，上下颠倒混匀间隔时间为10min；
3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
4)重复第三步，直至中间层消失；
5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20℃冰箱中静置30min～1h；
6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
7)在沉淀中加入600ul裂解液RTLPlus，4℃，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
8)将混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置1min，13000rpm离心30s，将废液倒掉；
10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；
12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ulddH2O，室温下放置1min，12000rpm，离心1min，获得溶解好的RNA；
步骤四、miRNA文库构建：将经过步骤三提取的三个时期的总RNA样本分别标记为G0、G7、G14，G0设为对照组，miRNA文库的构建具体过程如下：
1)先用1％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Aligent2100RNA6000NanoKit来检测RNA整齐度；
2)接着用15％的聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收的试剂盒来回收并且纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头来进行反转录合成，其中，5’为5’-RACE-ReadycDNA，3’为3’-RACE-ReadycDNA；
3)最终进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；
步骤五、小RNASolexa测序分析：用IlluminaHiSeqTM2000平台来进行测序分析，预测分析包括保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析、山核桃miRNA差异表达分析和miRNA与靶基因qRT-PCR检测。
进一步地，所述的步骤五中保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析方法为：将所有数据合并过滤后将小RNA序列比对到该基因组，允许一个mismatch，采用比对软件SOAP。为了更好的配对和后续的数据分析，将3个样本中的cleanreads分别比对到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)和Rfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam)数据库并允许一个错配。然后过滤掉rRNAs(核糖体RNA)，tRNAs(转运RNA)，scRNAs(细胞质内小RNA)，snRNAs(核内小RNA)和snoRNAs(核仁小分子RNA)，将3个样本的数据合并比对到所有植物非冗余成熟miRNA序列中，允许两个错配。将获得的序列使用RNAfoldsoftware来预测其二级结构来确定是否保守，来获得保守miRNA的数目及家族分布。而剩余的miRNA，我们将用Mireap软件进行新的miRNA预测。
进一步地，所述的步骤五中山核桃miRNA差异表达分析的方法为：计算G0，G7和G14这三个小RNA文库中miRNA的表达量，所述的miRNA表达量通过RPM值来计算，所述的RPM即每百万reads中来自于某基因的reads，所述的RPM值的计算公式为：RPM＝mappedreads×1000000/totalreads，所述的Mappedreads为比对上的reads数，所述的totalreads为统计得到的总reads数，基于卡方检验分别筛选3样本中的每2个样本之间的差异表达miRNA，筛选条件为Pvalue≤0.05且差异倍数在两倍以上的基因。
进一步地，所述的步骤五中miRNA与靶基因qRT-PCR检测方法为：用5.8srRNA作为内参基因，qRT-PCR利用SYBRGreenReal-TimePCRMasterMix和ABIPrism7000SequenceDetector试剂盒来检测miRNA的转录表达水平，PCR反应条件为94℃5min；94℃15s，60℃30s，共40个循环。
本发明一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，采用高通量Solexa测序技术对山核桃嫁接后三个不同时期的小RNA文库进行测序，这三个时期分别为：嫁接后0天、7天和14天(G0，G7和G14)的嫁接茎。参阅表1，G0，G7和G14通过小RNASolexa测序，质量预处理后，获得原始reads分别为24178692(G0)，210532149(G7)和25985000(G14)条，经过滤后每个样本的cleanreads分别含有23920471(G0)，20784923(G7)和25440366(G14)条。随后这些保留下来的序列通过与山核桃454基因组测序结果、miRBase18.0、theNCBIGenBank以及Rfam数据库进一步进行比对，参阅图1，结果表明它们分别属于已知的小RNA(knownmiRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小分子RNA(snoRNA)和未知小RNA(unknownsRNA)。
表1山核桃嫁接后三个不同时期的小RNA文库统计分析表
Total sRNAs Unique sRNAs
G0 library
Raw reads 24,178,692
clean reads* 23,920,471 5,677,759
Mapped to genomic 5,008,672 285,487
Match known miRNAs 2,299,835 40,896
The unknown sRNAs 17,562,958 5,522,235
G7library
Raw reads 21,053,214
clean reads* 20,784,923 4,626,678
Mapped to genomic 5,916,530 285,847
Match known miRNAs 2,284,689 46,774
The unknown sRNAs 13,918,918 4,428,827
G14 library
Raw reads 25,985,000
clean reads* 25,440,366 5,156,299
Mapped to genomic 8,241,439 307,679
Match known miRNAs 3,657,771 47,645
The unknown sRNAs 15,699,933 4,913,829
从图1中可知，在G0，G7和G14这3个样本中，未注释的小RNA占大多数，在注释的miRNA中，核糖体RNA(rRNA)占大部分，依次是已知的miRNA，tRNA，但是snoRNA和snRNA的数量很少，这与植物体内miRNA的分布情况是一致的。并且从图上可以看出已知的miRNA和rRNAreads的百分比都是随着嫁接后时间的延长而逐渐上升的，已知的miRNAreads由10.23％提高到19.40％，然后升到28.16％，而rRNAreads由13.22％到24.78％，最后升到30.17％，这表明在整个嫁接生长过程中已知的miRNA和rRNA可能起着重要的作用。然而，从图中可以发现随着嫁接后时间的延长，那些未注释的miRNA的百分比逐渐下降，表明可能在整个嫁接生长过程中有一些未注释的miRNA在逐渐减少。
参阅表1，在这些序列中，每个样本唯一的(unique)序列分别含有5677759(G0)，4626678(G7)和5156299(G14)条。同样可以从表1中看到这些未注释的miRNA在这3个样本中分别含有17562958(G0)，13918918(G7)和15699933(G14)条，这些未注释的miRNA都能够被预测成新miRNAs，这表明在山核桃基因组中还有大量的新miRNAs有待于进一步被确认。
根据目前已有报道所知有功能的小RNA的长度大约为20～24nt，因此本发明中分析了长度为18～30nt的山核桃小RNA。参阅图2，结果表明sRNA在G0，G7和G14中的长度分布趋势是基本上相同的，其中24nt所占的比例最大，其次就是21nt，这与前人研究结果也是相符合的，长度为24nt的sRNA在不同时期所占的比例分别为44.06％(G0)，40.42％(G7)和36.31％(G14)；而长度为21nt的sRNA在三个时期基本一致，大概都占20％。然而，21nt的sRNA的数量在随着嫁接后时间的延长慢慢增加，而24nt的sRNA则刚好相反，从G0，G7再到G14逐渐下降，这说明21nt和24nt的sRNA在山核桃嫁接过程中起着不同的调控功能作用。
参阅图3，为了验证在山核桃嫁接0，7和14天后保守miRNAs和新miRNAs的表达水平差异，从中选取了14个miRNAs来进行qRT-PCR，这14个miRNAs包含7个保守miRNAs和7个新miRNAs，并且这7个保守的miRNAs的表达差异很明显。qRT-PCR的结果显示，在山核桃嫁接后7和14天(以0天为对照)，除了其中三个小RNAcca-miRS4，cca-miRS5和cca-miRS6与Solexa测序表达结果不一致，其余11个miRNAs都显示出与Solexa测序结果具有相同的表达趋势。
但是两者之间的表达量也还是有一点差异的。根据测序数据，miR397的G14/G0的比值为0.28，但是依据qRT-PCR的结果发现为0.72；cca-miRS4仅仅只存在于G7这个sRNA文库中，cca-miRS5和cca-miRS6只在G7和G14两个sRNA文库中被检测到，通过qRT-PCR发现这三个miRNA在G0，G7和G14三个文库中都有表达，但这些miRNA的表达都比较低。这可能是因为这些低水平表达的miRNA在Solexa深度测序文库里不能够充分的表现出来。另外，不论是qRT-PCR还是Solexa测序，都发现山核桃嫁接后从0天到7天再到14天，cca-miR159a-b，cca-miR172a-b，cca-miR390b和cca-miR397随着时间的推移表达量逐渐下降，而cca-miR156a-b和cca-miR160则随着时间的推移逐渐上升，不过cca-miR482d则是先上升后下降。
通过山核桃嫁接过程中保守miRNA和新miRNA的分析、山核桃嫁接不同时期miRNA的差异性表达分析、山核桃miRNA靶基因预测以及表达模式的实验结果表明：保守的miRNAs、潜在的新miRNAs以及新miRNAs在山核桃嫁接过程中起着重要的调控作用，miRNAs与其相关的靶基因之间是逆表达调控机制，这一结果也进一步验证了有关miRNAs的Solexa测序结果的可靠性。把miRNAs的表达与其靶基因结合起来研究，更加有助于我们了解山核桃嫁接过程中的调控机制。通过本发明提出的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，能更深入地了解和确定与山核桃嫁接过程有关的miRNAs，将会有助于进一步了解树木嫁接过程中miRNAs的调控机制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、材料准备：选取山核桃的嫁接枝条，选取砧木为两年生的实生苗，而接穗则是留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生的苗，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用；
步骤二、枝条嫁接：将经过步骤一选取的山核桃砧木和接穗进行嫁接；
步骤三、提取总RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天对山核桃茎进行采样，将采集的样品迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放-70℃环境中备用，并提取样品的总RNA，总RNA的提取步骤如下：
1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4mlCTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；
2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min；
3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；
4)重复第三步，直至中间层消失；
5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20℃冰箱中静置30min～1h；
6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；
7)在沉淀中加入600ul裂解液RTLPlus，4℃，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
8)将混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；
9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置1min，13000rpm离心30s，将废液倒掉；
10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；
11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；
12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ulddH2O，室温下放置1min，12000rpm，离心1min，获得溶解好的RNA；
步骤四、miRNA文库构建：将经过步骤三提取的三个时期的总RNA样本分别标记为G0、G7、G14，G0设为对照组，miRNA文库的构建具体过程如下：
1)先用1％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Aligent2100RNA6000NanoKit来检测RNA整齐度；
2)接着用15％的聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收的试剂盒来回收并且纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头来进行反转录合成；
3)最终进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；
步骤五、小RNASolexa测序分析：用IlluminaHiSeqTM2000平台来进行测序分析，预测分析包括保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析、山核桃miRNA差异表达分析和miRNA与靶基因qRT-PCR检测。
2.如权利要求1所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的步骤三的2)中利用涡旋仪混匀的混匀时间为1min，上下颠倒混匀间隔时间为10min。
3.如权利要求1所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的步骤四的2)中5’为5’-RACE-ReadycDNA，3’为3’-RACE-ReadycDNA。
4.如权利要求1所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的步骤五中保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析方法为：将所有数据合并过滤后将小RNA序列比对到该基因组，允许一个mismatch，采用比对软件SOAP。为了更好的配对和后续的数据分析，将3个样本中的cleanreads分别比对到NCBI和Rfam数据库并允许一个错配。然后过滤掉rRNAs(核糖体RNA)，tRNAs(转运RNA)，scRNAs(细胞质内小RNA)，snRNAs(核内小RNA)和snoRNAs(核仁小分子RNA)，将3个样本的数据合并比对到所有植物非冗余成熟miRNA序列中，允许两个错配。将获得的序列使用RNAfoldsoftware来预测其二级结构来确定是否保守，来获得保守miRNA的数目及家族分布。而剩余的miRNA，我们将用Mireap软件进行新的miRNA预测。
5.如权利要求4所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的NCBI数据库网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，所述的Rfam数据库网址为http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam。
6.如权利要求1所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的步骤五中山核桃miRNA差异表达分析的方法为：计算G0，G7和G14这三个小RNA文库中miRNA的表达量，所述的miRNA表达量通过RPM值来计算，基于卡方检验分别筛选3样本中的每2个样本之间的差异表达miRNA，筛选条件为Pvalue≤0.05且差异倍数在两倍以上的基因。
7.如权利要求6所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的RPM即每百万reads中来自于某基因的reads，所述的RPM值的计算公式为：RPM＝mappedreads×1000000/totalreads，所述的Mappedreads为比对上的reads数，所述的totalreads为统计得到的总reads数。
8.如权利要求1所述的一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：所述的步骤五中miRNA与靶基因qRT-PCR检测方法为：用5.8srRNA作为内参基因，qRT-PCR利用SYBRGreenReal-TimePCRMasterMix和ABIPrism7000SequenceDetector试剂盒来检测miRNA的转录表达水平，PCR反应条件为94℃5min；94℃15s，60℃30s，共40个循环。
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